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Aus dem Institut für experimentelle und klinische Pharmakologie
und Toxikologie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. P. Dominiak
Stickstoffmonoxidsynthase-Aktivität
in Gehirn und Nebennieren
spontan hypertensiver Ratten:
Beitrag zur Pathogenese der essentiellen Hypertonie
Inauguraldissertation
zurErlangung der Doktorwürdeder Universität zu Lübeck
- Aus der Medizinischen Fakultät -
vorgelegt vonThomas Arens
aus Dortmund
Lübeck 2005
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. P. Dominiak
2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. H. Pagel
Tag der mündlichen Prüfung: 12.12.2005
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den
gez. Prof. Dr. med. Wolfgang Jelkmann
- Dekan der Medizinischen Fakultät -
Meinen lieben Eltern
Inhaltsverzeichnis 1
InhaltsverzeichnisSeite
INHALTSVERZEICHNIS........................................................................................................................ 1
ABKÜRZUNGEN ..................................................................................................................................... 3
1. EINLEITUNG ....................................................................................................................................... 5
1.1 GRUNDLAGEN ........................................................................................................................................ 51.1.1 Stickstoffmonoxid................................................................................................................................ 51.1.2 Zentrale Wirkungen von NO................................................................................................................ 71.1.3 NO und die Nebenniere ....................................................................................................................... 91.1.4 SH-Ratten, das geeignete Rattenmodell für die essentielle Hypertonie................................................ 101.2 HYPOTHESE UND FRAGESTELLUNG ..................................................................................................... 111.2.1 NO im Gehirn ................................................................................................................................... 111.2.2 NO in der Nebenniere ....................................................................................................................... 12
2. MATERIAL UND METHODEN ........................................................................................................ 14
2.1 MATERIAL ......................................................................................................................................... 142.1.1 Tiere................................................................................................................................................. 142.1.2 Geräte .............................................................................................................................................. 142.1.3 Substanzen........................................................................................................................................ 152.1.4 Herstellung der Lösungen ................................................................................................................. 162.2 METHODEN........................................................................................................................................ 192.2.1 Bestimmung der NOS-Aktivität.......................................................................................................... 192.2.2 Western Blot Technik ........................................................................................................................ 212.2.3 Statistik............................................................................................................................................. 22
3. EXPERIMENTELLE PROTOKOLLE.............................................................................................. 23
3.1 BESTIMMUNG DER BASALEN NOS-AKTIVITÄT IN GEHIRN UND NEBENNIERE BEI SH-RATTEN ............... 233.2 BESTIMMUNG DER BASALEN NNOS-PROTEINMENGE IN GEHIRN UND NEBENNIERE BEI SH-RATTEN ...... 233.3 BESTIMMUNG DER NOS-AKTIVITÄT IN GEHIRN UND NEBENNIERE BEI SH-RATTEN NACH CHRON-
ISCHER ANTIHYPERTENSIVER THERAPIE .............................................................................................. 243.4 BESTIMMUNG DER NNOS-PROTEINMENGE IN GEHIRN UND NEBENNIERE BEI SH-RATTEN NACH
CHRONISCHER ANTIHYPERTENSIVER THERAPIE.................................................................................... 24
4. ERGEBNISSE ..................................................................................................................................... 25
4.1 BESTIMMUNG DER BASALEN NOS-AKTIVITÄT .................................................................................... 254.1.1 Prähypertensive Phase...................................................................................................................... 254.1.2 Manifestationsphase ......................................................................................................................... 274.1.3 Erhaltungsphase ............................................................................................................................... 294.1.4 Vergleich prähypertensive, Manifestations- und Erhaltungsphase...................................................... 304.2 BESTIMMUNG DER BASALEN NNOS-PROTEINMENGE IM GEHIRN BEI SH-RATTEN ................................. 314.3 BESTIMMUNG DER NOS-AKTIVITÄT IM GEHIRN BEI SH-RATTEN NACH CHRONISCHER BEHANDLUNG
MIT ANTIHYPERTENSIVA .................................................................................................................... 334.3.1 Physiologisches Profil....................................................................................................................... 334.3.2 NOS-Aktivität in Hypothalamus und Hirnstamm bei SH-Ratten nach chronischer Behandlung mit
Antihypertensiva................................................................................................................................ 344.4 BESTIMMUNG DER NNOS-PROTEINMENGE IN HYPOTHALAMUS UND HIRNSTAMM BEI SH-RATTEN
NACH CHRONISCHER BEHANDLUNG MIT ANTIHYPERTENSIVA............................................................... 364.5 BESTIMMUNG DER BASALEN NOS-AKTIVITÄT IN DER NEBENNIERE BEI SH-RATTEN ............................ 374.6 EINFLUß EINER CHRONISCHEN ANTIHYPERTENSIVEN THERAPIE AUF DIE NOS-AKTIVITÄT UND
NNOS-PROTEINMENGE BEI ADULTEN SH-RATTEN .............................................................................. 38
5. DISKUSSION ...................................................................................................................................... 40
5.1 NOS-AKTIVITÄT IM GEHIRN DER SH-RATTE UND DIE BEDEUTUNG IN DER PATHOGENESE DERGENETISCHEN HYPERTONIE ................................................................................................................ 40
5.2 NOS-AKTIVITÄT IN DER NEBENNIERE DER SH-RATTE UND DIE BEDEUTUNG IN DER PATHOGENESEDER GENETISCHEN HYPERTONIE ......................................................................................................... 44
5.3. AUSBLICK.......................................................................................................................................... 47
Inhaltsverzeichnis 2
6. ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................................... 48
7. LITERATUR....................................................................................................................................... 49
8. DANKSAGUNG .................................................................................................................................. 62
9. LEBENSLAUF .................................................................................................................................... 63
10. VERÖFFENTLICHUNGEN ZUM THEMA DER DISSERTATION ............................................. 65
10.1 ORIGINALMITTEILUNGEN .................................................................................................................... 6510.2 KONGRESSBEITRÄGE .......................................................................................................................... 65
Abkürzungen 3
Abkürzungen
7-NI 7-Nitroindazol
ACE Angiotensin Converting Enzyme
Ak Antikörper
AT1-Rezeptor Angiotensin II-Rezeptor, Typ 1
bpm beats per minute (Herz-Schläge pro Minute)
cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat
Cit. Citrullin
CVLM Caudale ventrolaterale Medulla
CysNO S-Nitro-L-Cystein
eNOS endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase
FAD Flavinadenindinukleotid
FMN Flavinmononucleotid
GSNO S-Nitroglutathion
iNOS induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase
KG Körpergewicht
L-NAME N-Nitro-L-Arginin Methylester
L-NIO N-iminoethyl-L-Ornithin
L-NMMA N-Monomethyl-L-Arginin
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NGS Normal Goat Serum (normales Ziegenserum)
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
nNOS neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase
NO Stickstoffmonoxid
NTS Nucleus tractus solitarii
Abkürzungen 4
PBS Phosphatpuffer
PFA Paraformaldehyd
PTCA Percutane transluminale coronare Angioplastie
PVN Nucleus paraventricularis
RAS Renin-Angiotensin-System
RVLM Rostrale ventrolaterale Medulla
SHR Spontan hypertensive Ratte
SON Nucleus supraopticus
U/Min. Umdrehungen pro Minute
WKY Wistar-Kyoto Ratte
ZNS Zentrales Nervensystem
1. Einleitung 5
1. Einleitung
1.1 Grundlagen
1.1.1 Stickstoffmonoxid
Stickstoffmonoxid (NO) ist erst seit relativ kurzer Zeit Gegenstand von intensiver
Forschung in der Medizin. Robert F. Furchgott entdeckte einen relaxierend auf periphere
Blutgefäße wirkenden Faktor, der von den Endothelzellen gebildet wird. Er nannte ihn
dementsprechend „endothelium derived relaxing factor (EDRF)“ (Furchgott und
Zawadzki, 1980). Sieben bis acht Jahre später fanden Ignarro und Moncada unabhängig
voneinander heraus, daß es sich bei dem EDRF um NO handelt (Ignarro et al., 1987;
Moncada et al., 1988). Von da an mehren sich die Erkenntnisse über die Vielfalt der
Wirkungen des einfachen Moleküls und Radikals NO.
Abbildung 1: NO-Synthese (nach Gold et al., 1989).
NO wird durch Oxidation von L-Arginin erzeugt. Diese Reaktion wird durch das Enzym
NO-Synthase (NOS) katalysiert (Abbildung 1). Bei der Oxdidation wird ein Guanidin-
+ O2
1. Einleitung 6
Stickstoff des Arginins zu NO oxidiert, die Aminosäure Citrullin bleibt bei der Reaktion
übrig. NO ist unter atmosphärischen Bedingungen gasförmig. Durch ein freies Elektron ist
es chemisch sehr reaktiv (Butler et al., 1995). NO ist extrem labil und sehr kurzlebig, die
Halbwertzeit liegt unter 10 Sekunden (Snyder und Bredt, 1992), dann wird es zu Nitrit und
Nitrat metabolisiert. Arginin, das Ausgangssubstrat für NO, zählt zu den nicht essentiellen
Aminosäuren für Erwachsene, lediglich für Säuglinge ist es essentiell.
Durch dessen Kurzlebigkeit ist die Syntheserate von NO in vivo schwer zu bestimmen. Sie
läßt sich indirekt anhand der NOS-Aktivitäten ermitteln. In vitro kann die Aktivität des
Enzyms mittels radioaktiv markiertem Citrullin gemessen werden, welches unter
Anwesenheit von NOS und NADPH aus L-Arginin gebildet wird. Direkt proportional
hierzu wird NO freigesetzt. Die NO-Synthase benötigt für die Umwandlung von L-Arginin
in L-Citrullin außer NADPH andere Kofaktoren, z.B. enzymgebundenes Häm, reduzierte
Thiole, FAD, FMN, Tetrahydrobiopterin sowie Calmodulin und Calcium (Michel und
Feron, 1997).
Es sind bis jetzt drei Isoformen der NOS bekannt. Die induzierbare NOS (iNOS) findet
sich hauptsächlich in Makrophagen und spielt eine wichtige Rolle in der Abwehr von
Mikroorganismen und Tumorzellen (Knowles et al., 1989). Die endotheliale NOS (eNOS)
kommt in erster Linie in den Endothelzellen vor, wo NO für die Gefäßrelaxation
verantwortlich ist (Dominicza und Bohr, 1995; Michel und Feron, 1997). Durch NO wird
eine tonische Vasodilatation ausgeübt (Moncada et al., 1991). Alle bekannten
Nitrovasodilatatoren setzen im Laufe ihrer metabolischen Umwandlung NO frei, welches
die lösliche Guanylatcyclase aktiviert. Im Zytosol bindet NO an das Eisen der Hämgruppe
der löslichen Guanylatcyclase, dadurch wird cGMP gebildet. Dieses wiederum stimuliert
eine Proteinkinase, die die leichte Kette des Myosins phosphoryliert, was zur Relaxation
der Muskelzelle führt (Bredt und Snyder, 1992).
In dieser Reaktion liegt ein Ansatzpunkt für therapeutische Interventionen. Sogenannte
Nitrovasodilatatoren sind organische Nitrate und Nitrite, die einer metabolischen
Umwandlung zu NO unterliegen. Sie erweitern die großen Koronargefäße und dilatieren
die Kollateralgefäße (Schütz, 1996). Im klinischen Einsatz sind Nitrovasodilatatoren bei
Angina pectoris, Herzinsuffizienz, pulmonaler Hypertension, Fibrinolyse, PTCA,
Komplikationen nach Koronarangiographien und bei der akuten respiratorischen
Insuffizienz etabliert (Moncada et al., 1991; Germann et al., 1998). Im Gegensatz zu den
1. Einleitung 7
Behandlungsstandards der 60er Jahre werden Nitrovasodilatatoren heute auch zur
Behandlung der hypertensiven Krise eingesetzt (Arens, 1968; Moncada et al., 1991).
In Nervenzellen ist die neuronale NOS (nNOS) nachgewiesen worden. NO wird im ZNS
als neuartiger Neurotransmitter bezeichnet, weil er offensichtlich Funktionen in der
Kommunikation zwischen den Neuronen hat, jedoch nicht die Kriterien der bekannten
Neurotransmitter erfüllt (Bredt und Snyder, 1992; Garthwaite und Boulton, 1995). NO ist
wasser- und fettlöslich und kann Zellmembranen einfach durch Diffusion überwinden
(Garthwaite, 1991). Dies ist auch der Grund dafür, daß NO nicht innerhalb der Zelle
gespeichert werden kann, was einen großen Unterschied zu den etablierten
Neurotransmittern ausmacht (Schmidt und Walter, 1994; Rodrigo et al., 1997). NO wird
auf Anforderung in einer bestimmten Zelle produziert, diffundiert zu einer umliegenden
Zelle, wo es an Eisen im aktiven Zentrum der löslichen Guanylatcyclase bindet und eine
Kaskade von Effekten wie z.B. eine Relaxation glatter Muskelzellen oder die Freisetzung
von anderen Neurotransmittern auslösen kann (Snyder und Bredt, 1992).
Immunhistochemische Untersuchungen haben nNOS in bestimmten Hirnregionen
nachgewiesen wie Bulbus olfactorius, Lamina tecti, Gyrus dentatus des Hippocampus,
Stria terminalis, diagonales Band von Broca, Hypophysenvorder- und -hinterlappen,
Retina, Cerebellum und Hypohalamus, dort insbesondere in den Nuclei supraopticus
(SON) und paraventricularis (PVN) (Vincent und Kimura, 1992; Reuss et al., 1995).
Darüber hinaus enthalten auch das Nebennierenmark und periphere Darmnerven nNOS,
letztere werden auch als „nitrerge Nerven“ bezeichnet (Bredt et al., 1990).
1.1.2 Zentrale Wirkungen von NO
Die peripheren Wirkungen des Sympathikus werden zentral geregelt, und NO ist an der
zentralen Regulation des Sympathikotonus beteiligt (Chan et al., 2001; Hirooka und
Takeshita, 2001). NO wirkt zentral depressiv auf den Sympathikotonus und verringert
dadurch den peripheren Blutdruck (Sakuma et al.; 1992; Plochocka-Zulinska und Krukoff,
1997). Die NO-Synthese kann durch verschiedene NOS-Inhibitoren blockiert werden. Bei
den verwendeten NOS-Inhibitoren handelt es sich um Analoga von L-Arginin, die die
NOS kompetitiv hemmen. Typische Vertreter dieser NOS-Inhibitoren sind N-
1. Einleitung 8
Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) und N-Nitro-L-Arginin Methylester (L-NAME)
(Moncada et al., 1997). L-NAME ist dabei ein spezifischer Inhibitor für nNOS und eNOS.
L-NMMA ist überwiegend für eNOS spezifisch. Ein spezifischer Inhibitor für nNOS ist 7-
Nitroindazol (7-NI). Der Inhibitor N-iminoethyl-L-Ornithin (L-NIO) ist spezifisch für
iNOS (Griffith und Kilbourn, 1996).
Bei SH-Ratten hat die Gabe eines NOS-Inhibitors (L-NAME, 7-NI) nach intraperitonealer
(ip) Applikation keinen signifikanten Effekt auf den Blutdruck. Jedoch verursacht die
gleiche Menge bei intracerebroventrikulärer (icv) Applikation einen Blutdruckanstieg und
eine abnehmende Barorezeptorreflex-Sensitivität im Vergleich zu normotensiven WKY-
Ratten (Qadri et al., 1999). Nach intracerebraler Gabe besteht also eine erhöhte Sensitivität
von NOS-Inhibitoren gegenüber einer systemischen Applikation. Schon geringe Mengen
eines NOS-Inhibitors können, wenn sie intracerebral verabreicht werden, systemische
Wirkungen auslösen.
Im experimentellen Gebrauch sind auch NO-Donatoren von großem Interesse. Am
häufigsten werden S-Nitro-L-Cystein (CysNO) und S-Nitroglutathion (GSNO) verwandt.
Die Infusion eines NO-Donators (CysNO) in das Ventrikelsystem des Rattengehirns
verursacht Blutdruckabfall und Bradykardie, die Applikation eines NOS-Inhibitors
Blutdruckanstieg sowie Tachykardie (Togashi et al., 1992; Cabrera und Bohr, 1995).
Durch systemische Gabe von L-Arginin kann der Effekt des kompetitiven NOS-Inhibitors
aufgehoben werden (Tseng et al., 1996). Diese Ergebnisse zeigen die Mitwirkung des
zentralen NO-Systems an der Blutdruckregulation, lassen aber an dieser Stelle keinen
genaueren Aufschluß darüber zu, in welchen Hirngebieten dieser Einfluß zu finden ist,
weil sich intracerebroventrikulär verabreichte Substanzen im gesamten Gehirn verteilen.
Es sind mehrere Hirngebiete bekannt, die nach icv-Gabe von NO-Donatoren bzw. NOS-
Inhibitoren aktiviert werden und die zentralen, kardiovaskulären Funktionen regulieren.
Diese sind der Nucleus paraventricularis (PVN) des Hypothalamus, der Nucleus tractus
solitarii (NTS), ein vagaler Komplex in der dorsomedialen Medulla, die rostrale
ventrolaterale Medulla (RVLM), die intermediolaterale Zellsäule des Thorakolumbalmarks
sowie sympathische Motoneurone (Zhang et al., 1997). Im PVN beginnen viele Efferenzen
des Sympathikus und enden im NTS. Eine elektrische oder chemische Reizung des PVN
bewirkt eine Blutdrucksteigerung (Zhang et al., 1997).
1. Einleitung 9
Es ist bekannt, daß der NTS eine Schlüsselrolle in der Regelung des Barorezeptorreflexes
spielt (Lewis et al., 1991; Harada et al., 1993). Dort laufen Afferenzen von Baro- und
Chemorezeptoren unter anderem aus dem Sinus caroticus zusammen. Durch Mikrodialyse-
Technik direkt im NTS appliziertes CysNO bewirkt einen Blutdruckabfall (Lewis et al.,
1991). Dieser Effekt kann inhibiert werden durch die Gabe von Methylenblau, welches die
lösliche Guanylatcyclase hemmt (Horn et al., 1994). Im NTS enden die vagalen
kardiopulmonalen Afferenzen. Eine Applikation von L-NAME in den NTS steigert den
Blutdruck und erhöht die Sympathikusaktivität (Kagiyama et al., 1998). Der NTS ist somit
eine zentrale Schaltstelle der Blutdruckhomöostase, die durch NO-abhängige Regulationen
beeinflußt wird.
Andere Afferenzen zum NTS kommen aus dem PVN des Hypothalamus, aus der
Amygdala und aus dem RVLM. Der PVN selbst ist ein wichtiger Ort der Regulation
neuroendokriner und autonomer Prozesse. Die RVLM enthält Regulationszentren für die
Sympathikusaktivät. Es bestehen vom NTS direkte Verbindungen zu anderen Kerngebieten
des Gehirns, die allesamt in die kardiovaskuläre Kontrolle involviert sind (Ohte et al.,
1993). Mikroinjektion von NOS-Inhibitoren in die RVLM bewirkt ebenfalls eine
Steigerung von Blutdruck und Sympathikusaktivität, und zwar sowohl bei SH- als auch bei
WKY-Ratten. Die Applikation von L-Arginin in die RVLM hat den gegenteiligen Effekt,
nämlich eine Senkung von Blutdruck und Sympathikusaktivität. Das zentrale NO-System
befindet sich bei adulten SH-Ratten offenbar in einem Zustand größerer Aktivität
gegenüber den WKY-Ratten. Denn die Steigerung des Blutdrucks nach Applikation von
NOS-Inhibitoren ist bei SH-Ratten kleiner, und die Senkung nach Gabe von L-Arginin
(NOS-Substrat) ist größer als bei den normotensiven WKY-Ratten (Cabrera et al., 1996;
Kagiayama et al., 1998). Diese Ergebnisse sprechen dafür, daß das zentrale NO-System
offenbar involviert ist in die Homöostase der kardiovaskulären Funktionen. Das NO-
System ist außerdem aktiviert in Zuständen physiologischer Stimulation, wie sie durch
Dehydratation, Hypoxie, Hypertonie oder Streß hervorgerufen werden (Nathan und Xie,
1994).
1.1.3 NO und die Nebenniere
Mit immunhistochemischen Untersuchungen konnte nNOS auch in der Nebenniere
nachgewiesen werden. Im Nebennierenmark ist nNOS in Ganglienzellen und Nervenfasern
1. Einleitung 10
enthalten, die mit chromaffinen, Katecholamin produzierenden Zellen in Kontakt stehen
(Snyder und Bredt, 1991, Iwai et al., 1995; Chou et al., 1998). Es ist belegt, daß nicht-
neuronale Mediatoren wie Endothelin-1, Prostaglandine oder NO den Sympathikotonus
beeinflussen. Mit in vitro Experimenten konnte an chromaffinen Zellen der Nebenniere
vom Rind demonstriert werden, daß diese über ein autokrines NO-cGMP-System verfügen,
welches die Freisetzung von Katecholaminen tonisch beeinflußt (Schwarz et al., 1998).
Ähnliche Ergebnisse konnten mit isolierten und perfundierten Nebennieren des
Kaninchens erzielt werden. Die Gabe des NOS-Inhibitors L-NMMA erhöhte dort die
basale Freisetzung von Noradrenalin, Adrenalin und Dopamin, wohingegen der Effekt von
L-NMMA durch Applikation von L-Arginin als NOS-Substrat aufgehoben werden konnte
(Ward et al., 1996). Daher wird vermutet, daß die basale NO-Synthese in der Nebenniere
die Freisetzung von Katecholaminen beeinflußt. Damit hätte NO eine bedeutende Rolle in
der Homöostase des Blutdrucks.
1.1.4 SH-Ratten, das geeignete Rattenmodell für die essentielle Hypertonie
Bei der Erforschung der essentiellen Hypertonie hat sich das Tiermodell der SH-Ratte
bewährt. Dieses Rattenmodell geht auf Okamoto und Aoki zurück, die 1960 durch gezielte
Inzucht von latent hypertensiven Tieren einer normotensiven Wistar-Ratten-Kolonie über
mehrere Generationen einen Stamm züchteten, dessen Tiere einen Hypertonus mit einem
Mitteldruck von mehr als 180 mm Hg entwickelten (Okamoto und Aoki, 1963). Diese
Ratten sind nicht von Geburt an hypertensiv, vielmehr entwickelt sich mit zunehmendem
Alter eine arterielle Hypertonie. Die Entwicklung der Hypertonie in diesen Tieren ist in 3
Phasen gegliedert. Als junge Tiere befinden sich die Ratten im Alter bis ca. 4 Wochen in
der prähypertensiven Phase, die Blutdruckwerte sind im Vergleich zu gleichaltrigen
normotensiven WKY-Ratten noch normal. Ab einem Alter von 7-8 Wochen steigt der
Blutdruck, es ist die Manifestationsphase. Etwa ab der 11. Woche postnatal ist ein
pathologisch erhöhter Blutdruck etabliert, die Ratte befindet sich in der Erhaltungsphase.
Durch den erhöhten Blutdruck entwickeln die Tiere typische Komplikationen, die auch bei
Menschen auftreten, wie z.B. zerebrale Infarkte, Blutungen, Herzinfarkte oder
Nephrosklerose. Die Lebenserwartung bei SH-Ratten beträgt ca. 18-20 Monate, bei WKY-
Ratten hingegen mindestens 24 Monate (Yamori und Lovenberg, 1987). Die Ursachen der
1. Einleitung 11
Hypertonie bei der SH-Ratten sind multifaktoriell. Es gibt kein einzelnes Gen, welches für
den Hypertonus verantwortlich gemacht werden kann. Mehrere exogene Faktoren wie z.B.
Streß, Salzaufnahme, Protein- und Lipidaufnahme beeinflussen den Blutdruck.
Hauptsächlich beruht die Entwicklung des Hypertonus bei SH-Ratten auf einem erhöhten
peripheren Gefäßwiderstand, der bereits bei noch normotensiven jungen SH-Ratten zu
beobachten ist. Dies wiederum produziert zunächst neurogene funktionale
Vasokonstriktion, später dann strukturelle Gewebeumbauten. Es kommt zu einem
veränderten Media-Lumen-Verhältnis zu Ungunsten des Lumens (Yamori und Lovenberg,
1987). Dem essentiellen Hypertonus des Menschen entspricht also am ehesten das
Rattenmodell der SH-Ratten (Tobian, 1991; Yamori, 1991). Als Kontrolltiere für SH-
Ratten dienen normotensive WKY-Ratten.
1.2 Hypothese und Fragestellung
1.2.1 NO im Gehirn
Hypothese 1:Es ist bekannt, daß die Blockade der nNOS im Gehirn den systemischen arteriellen
Blutdruck bei SH-Ratten erhöht, nicht jedoch bei WKY-Ratten (Qadri et al., 1999). Die
Arbeitshypothese ist daher: eine vermehrte Produktion von NO durch nNOS im Gehirn
von SH-Ratten stellt einen Gegenregulationsmechanismus zum erhöhten Blutdruck dar.
Die quantitative Messung von NO in vivo ist aufgrund der Kurzlebigkeit der Verbindung
nicht einfach. Der indirekte Nachweis der NO-Synthese kann durch die Bestimmung der
NOS-Aktivität erbracht werden. Die NOS-Aktivität verhält sich gleichsinnig zur Menge
von NO, d.h. eine hohe NOS-Aktivität bedeutet eine hohe Syntheserate von NO (Mitchell
et al., 1993).
Für die Validierung der Hypothese sollten in der vorliegenden Arbeit folgende Fragen
beantwortet werden:
1a. Gibt es Unterschiede in der basalen NOS-Aktivität in verschiedenen Hirnarealen bei
SH-Ratten in der prähypertensiven (3-4 Wochen postnatal), in der Manifestations- (7-
1. Einleitung 12
8 Wochen postnatal) und der Erhaltungsphase der Hypertonie (12-13 Wochen
postnatal)? Wie verhält sich die NOS-Aktivität in den verschiedenen Hirnarealen bei
jeweils gleichaltrigen, normotensiven WKY-Ratten?
1b. Bedeutet eine veränderte basale NOS-Aktivität in den verschiedenen Hirnarealen
gleichzeitig eine gleichsinnig veränderte NOS-Proteinmenge?
1c. Wie verändert sich die basale NOS-Aktivität im Hypothalamus und Hirnstamm bei
12-13 Wochen alten SH-Ratten in der Erhaltungsphase nach chronischer Behandlung
mit Antihypertensiva?
1d. Verändert sich die NOS-Proteinmenge nach chronischer Behandlung mit
Antihypertensiva in diesen Gebieten ebenfalls gleichsinnig?
Die NOS-Aktivität wurde in den Hirnarealen Hypothalamus, Hirnstamm, Cerebellum,
Cerebrocortex und Hippocampus bestimmt. Hypothalamus und Hirnstamm wurden
ausgewählt, weil hier wichtige kreislaufregulierende Zentren lokalisiert sind. Cerebellum,
Cerebrocortex und Hippocampus dienten als Kontrollareale, da sie nicht direkt in die
Homöostase des arteriellen Blutdrucks involviert sind.
Um zu klären, ob die Veränderung der NOS-Aktivität bei SH-Ratten im Stadium der
Erhaltungsphase (12-13 Wochen postnatal) durch den erhöhten Blutdruck verursacht
wurde, wurde der Effekt einer chronischen, antihypertensiven Therapie von adulten SH-
Ratten auf die NOS-Aktivität mit drei verschiedenen Antihypertensiva untersucht. Die
Blutdrucksenkung wurde mit Hydralazin, einem peripheren Vasodilatator, und zwei
Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) erreicht. Es wurden dabei der ACE-
Hemmer Enalapril und der AT1-Antagonist Losartan eingesetzt.
1.2.2 NO in der Nebenniere
Hypothese 2:Bei in vitro Experimenten wurde gezeigt, daß die Synthese von NO in der Nebenniere
sowohl die Freisetzung als auch die Synthese von Katecholaminen unterdrückt. Daraus
leitet sich die Hypothese ab, daß eine reduzierte NO-Produktion in der Nebenniere ein
1. Einleitung 13
ursächlicher Faktor für die Entstehung der genetischen Hypertonie der SH-Ratten ist. Um
die Hypothese zu verifizieren, wurde in der vorliegenden Arbeit die NOS-Aktivität als
Maß für die NO-Syntheserate in der Nebenniere der SH-Ratten in den verschiedenen
Entwicklungsstufen der genetischen Hypertonie untersucht und mit gleichaltrigen,
normotensiven WKY-Ratten verglichen.
Es sollten folgende Fragen beantwortet werden:
2a. Wie verhält sich die basale NOS-Aktivität in der Nebenniere bei SH-Ratten in der
prähypertensiven, Manifestations- und der Erhaltungsphase verglichen mit
gleichaltrigen, normotensiven WKY-Ratten?
2b. Bedeutet eine veränderte basale NOS-Aktivität in der Nebenniere gleichzeitig eine
gleichsinnig veränderte NOS-Proteinmenge?
2c. Hat eine antihypertensive Behandlung einen Einfluß auf die NOS-Aktivität und NOS-
Proteinmenge in der Nebenniere von adulten SH-Ratten?
2. Material und Methoden 14
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Tiere
Es wurden männliche, 3-4, 7-8 und 12–13 Wochen alte WKY-Ratten und SH-Ratten
verwendet. Sie wurden von der Firma Charles River (Sulzfeld) bezogen. Die Tiere wurden
in Gruppen von jeweils fünf Ratten in Makrolon-Typ-III-Käfigen gehalten, in denen sie
freien Zugang zu Futter und Leitungswasser hatten. Bei dem Futter handelte es sich um
eine Standarddiät Typ 1320 der Firma Altromin (Lage). Die Ratten waren einem
regelmäßigen Tag-Nacht-Rhythmus ausgesetzt (Licht: 7–19 Uhr). Die Experimente
wurden gemäß der Leitlinien für den Umgang und Gebrauch von Labortieren des
Ministeriums für Natur und Umwelt des Landes Schleswig-Holstein durchgeführt
(universitätsinterne Tierversuch-Nr. 9/v/97).
2.1.2 Geräte
Blotkammer (TypTE 77, SemiPhor) Hoefer Amersham
Elektrophoresegerät (Mini-PROTEAN® II Cell) BIO-RAD
Filmkassette (HypercassetteTM) Amersham
Film (HyperfilmTM ECLTM) Amersham
Heizplatte (Thermohaker Model TS-W) Schutron
PVDF-Membranen Millipore
Schlauchfolie (Polyethylen) neoLab
Schüttelgerät (Typ Reax 2000) Heidolph
Stromgerät (Typ EPS 600) Pharmacia Biotech
Wheaton-Mikro-Gewebe-Hand-Homogenisator neoLab
Wippschüttler (Biometra Typ WT 17) Biometra
2. Material und Methoden 15
2.1.3 Substanzen
3,3 Diaminobenzidin (DAB) Sigma
30%-Acrylamid-Lösung Life Technologies
Ammoniumpersulfat (APS) Life Technologies
Antikörper gegen nNOS, eNOS, iNOS Transduction
Antikörper gegen nNOS, eNOS, iNOS Calbiochem
Bromphenolblau Pharmacia Biotech
BSA, Albumin Bovine, Protease-frei Sigma
DAB-Kit Vector
di-Natriumhydrogenphoshpat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2H2O) Merck, Darmstadt
Dithiothreitol (DTT) Pharmacia Biotech
ECL-Western Blotting Detection Reagents, 2 x 250ml Amersham
Elite ABC Peroxidase-Kits Rabbit IgG Camon
Entwickler, GBX Developer (Kodak) Sigma
Ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA) Pharmacia Biotech
Fixierer, GBX Fixer (Kodak) Sigma
Folin-Ciocalteus Phenolreagenz (Folin) Merck, Darmstadt
Glycerol (CH2OH.CHOH.CH2OH) Life Technologies
Glycin (NH2CH2COOH) Pharmacia Biotech
Kaleidoscope Prestained Standards (Marker) BIO-RAD
Kaliumchlorid (KCL) Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphot (KH2PO4) Merck, Darmstadt
Kupfersulfat (CuSO4) Merck, Darmstadt
Mercaptoethanol (C2H60) Merck, Darmstadt
Methanol (MeOH) Baker, Holland
Milchpulver (Skim Milk Powder) Fluka
N,N,N`,N`-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Pharmacia Biotech
Natriumcarbonat (NaHCO3) Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCL) Merck, Darmstadt
Natriumdihydrogenphosphat Monohydrat (NaH2PO4 x H2O) Merck, Darmstadt
Natrium-K-Tartat (C4H4KNaO6) Merck, Darmstadt
Natronlauge (NaOH) Merck, Darmstadt
n-Butanol (CH3(CH2)3OH) Merck, Darmstadt
2. Material und Methoden 16
Normal Goat Serum (NGS) Vector-Laboratories
Paraformaldehyd 97% (PFA) EGA Chemie
Pentobarbital (NembutanR) Merck, Darmstadt
Polyexethylene Sorbitan Monolaurate (Tween-20) ICN
Saccharose Sigma
Salzsäure (HCL) Merck, Darmstadt
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Pharmacia Biotech
Succrose Sigma
Trasylol (Aprotinin) Bayer
Tris (Trizma Hydrochlorid) Sigma
Triton X-100 Serva, Heidelberg
Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck,Darmstadt
Xylol (Isomerengemisch reinst) Merck, Darmstadt
2.1.4 Herstellung der Lösungen
Für die Bestimmung der NOS-Aktivität
Homogenisationspuffer (10 ml):
50 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
150 mM NaCl
100 µM PMSF
1 mM Trasylol
10 mM Triton (0,1%)
Lowry-Mix: 2% Natriumcarbonat
100 mM Natriumkaliumtartrat (C4H4KNaO6)
40 mM Kupfersulfat (CuSO4)
Folin-Reagenz: 1 : 2 mit NaCl (0,9%) verdünnt
Hepes-Puffer: 10 mM Hepes in bid. H2O
pH 7,4
2. Material und Methoden 17
Arbeitslösung (Cocktail) für den NOS-Aktivitäts-Assay:
10 µM Arginin
3 µM BH4
30 nM Calmodulin
2 mM CaCl260 mM L-Valin
10 mM Hepes-Puffer
2.000 Bq [3H]-L-Arg
1 mM NADPH
Stopplösung für den NOS-Aktivitäts-Assay (500 ml):
20 mM Hepes
2 mM EGTA
2 mM EDTA
pH 5,5
Lösungen für die Western Blot Analyse
Trenngelpuffer 1,5 M:
36,3 g Tris
ad 150 ml bid. H2O
pH 8,8
ad 200 ml bid. H2O
Sammelgelpuffer 0,5 M:
3 g Tris
ad 40 ml bid. H2O
pH 6,8
ad 50 ml bid. H2O
Blockpuffer 5%: 5 g Milchpulver
ad 100 ml Waschpuffer
2. Material und Methoden 18
SDS-PAGE-Puffer (4x):
5 ml Tris-HCl, pH 6,8
0,8 g SDS
4 ml Glycerol
0,62 g DTT
4 mg Bromphenolblau
ad 10 ml bid. H2O
SDS 10%: 10 g SDS
ad 100 ml bid. H2O
Waschpuffer:
65 mM Na2HPO4
20 mM NaH2PO4
100 mM NaCl
0,1% Tween-20
ad bid. H2O, pH 7,5
Towbin-Blot-Puffer (1 l):
48 mM Tris
39 mM Glycin
0,037% SDS
20% MeOH
ad bid. H2O, pH 8,2 – 8,4
Elektrophorese-Puffer:
9,08 g Tris
43,2 g Glycin
3 g SDS
ad 3 l bid. H2O
APS 10%: 0,1 g APS
ad 1 ml bid. H2O
2. Material und Methoden 19
2.2 Methoden
2.2.1 Bestimmung der NOS-Aktivität
Die NOS-Aktivität wurde bestimmt durch die Messung der Umwandlung von [3H]-L-
Arginin in [3H]-L-Citrullin in der Gegenwart von Gewebehomogenat, Ca2+ und NADPH.
Dabei wurde eine früher beschriebene Vorgehensweise (Mitchell et al., 1993) mit geringen
Modifikationen übernommen, die im Folgenden erläutert werden.
Gewebeentnahme und Homogenisation
Die Ratten wurden mit Pentobarbital (Nembutal®, 80 mg/kg) i.p. getötet. Das Gehirn und
die Nebennieren wurden entnommen. Aus dem Gehirn wurden Blöcke jeweils aus
Cerebellum, Cerebrocortex, Hypothalamus, Hirnstamm und Hippocampus heraus-
geschnitten (Abbildung 2). Die Gewebe wurden unmittelbar nach der Präparation in
flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei –80 °C bis zur Analyse aufbewahrt.
Abbildung 2: Sagittalschnitt durch ein Rattengehirn (nach Qadri et al., 2003)
Die Gewebestücke wurden mit Homogenisationspuffer in einem Glas-Potter-Gefäß für 2-3
Minuten homogenisiert. Zu jeder Gewebeportion wurde die fünffache Menge des
Probengewichts an Homogenisationspuffer zugegeben. Die Proben wurden 1 Minute lang
Hypophyse
2. Material und Methoden 20
bei 4 °C und 14.000 U/min, entsprechend 16.883 x g, zentrifugiert. Der Überstand wurde
für die Gesamtprotein-Messungen verwendet.
Gesamt-Proteinbestimmung nach der Lowry-Methode
Das Homogenat wurde im Verhältnis 1:150 mit 0,9% NaCl-Lösung verdünnt. Es wurden 2
Standardreihen mit jeweils bekanntem Gehalt an Albumin (0, 20, 60, 100, 140, 180, 200,
240 und 300 µg auf 1 ml 0,9% NaCl-Lösung) mitgemessen. Zunächst wurden in alle
Meßgefäße 1,6 ml Lowry-Mix vorgelegt. Es wurden jeweils 400 µl der verdünnten Proben
bzw. der Standard-Albumin-Reihe zugegeben. Nach 10 Minuten Ruhezeit bei
Raumtemperatur wurden im Abstand von 15 Sekunden in alle Gefäße 100 µl Folin-
Reagenz pipettiert. Die Proben wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im
Abstand von 15 Sekunden wurden die Proben im Photometer bei einer Wellenlänge von
750 nm gemessen.
Radio-Enzym-Assay zur Bestimmung der NOS-Aktivität
Die NOS-Aktivität kann anhand der Umwandlung von markiertem [3H]-L-Arginin in [3H]-
L-Citrullin gemessen werden. Für diese Umwandlung sind NOS enthaltendes Gewebe und
NADPH erforderlich. Für die Messung der NOS-Aktivität wurden 200 µg Homogenat mit
50 µl Arbeitslösung (Cocktail) 20 Minuten lang bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Diese
Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml eisgekühlter Stopplösung beendet. Danach wurde
die Lösung auf eine Säule (Dowex 50W Na+) gegeben. Dabei blieb Arginin vollständig in
der Säule zurück. Anschließend wurde die Säule mit 1 ml Aqua bidest. gespült. In den
Szintillationsgefäßen wurde das entstandene [3H]-L-Citrullin aufgefangen. Alle
Szintillationsgefäße wurden mit 10 ml Hydroluma aufgefüllt, geschüttelt und in die
Zählkammer gebracht.
Für die quantitative Bestimmung der NOS-Aktivität wurde die Zählrate der Proben in der
Szintillations-Zählkammer gemessen. Gleichzeitig wurde ein Leerwert mitgemessen, d.h.
ein Szintillationsgefäß, welches bis auf Zugabe einer Probe gleichartig wie die übrigen
Probengefäße behandelt wurde. Die Zählrate des Leerwertes gab die basale Zählrate des
Versuchsaufbaus wieder. Der Probenwert ergab sich aus der Differenz von Zählrate der
2. Material und Methoden 21
Probe minus Zählrate des Leerwertes. Die Proben-Aktivität wurde in den Abbildungen in
pmol Cit./(mg Protein * min) angegeben.
2.2.2 Western Blot Technik
Mit der Western Blot Technik kann ein Gewebehomogenat elektrophoretisch in die darin
enthaltenen Proteine nach molekularem Gewicht aufgetrennt werden. Einzelne Proteine
können dann mit spezifischen Antikörpern versehen werden, die mittels
Chemolumineszenz sichtbar gemacht und quantitativ ausgewertet werden können.
Die Gewebeentnahme, Homogenisation und die Proteinbestimmung wurden entsprechend
der Beschreibung in Kapitel 2.2.1 (Seiten 19 ff.) durchgeführt. Die Proben für den Western
Blot wurden mit 40 µl SDS-Page (4x) und β-Mercaptoethanol gemischt. Nachdem die
Proben für 10 Minuten bei 98 °C erhitzt wurden, erfolgte eine weitere Zentrifugation bei
4f°C und 14.000 U/min, entsprechend 16.883 x g, für 30 Minuten. Zuletzt wurde der
Fettüberstand entfernt.
Für die Elektrophorese wurde ein zweigeteiltes Gel bestehend aus Sammel- und Trenngel
hergestellt. Es handelte sich dabei jeweils um ein 7,5 % Polyakrylamidgel. Obenauf befand
sich das Sammelgel, in dem einzelne Taschen für den Probenauftrag vorgesehen waren.
Darunter schloß sich das Trenngel zur Auftrennung der in der Probe enthaltenen Proteine
an. Die Geltaschen wurden mit dem Elektrophorese-Puffer gespült, dann wurden Marker,
Proben und eine Positiv-Kontrolle in die Taschen eingefüllt. Die Probenmenge betrug
30fμg Protein/10 µl. Vom Marker wurden 10 μl appliziert, ebensoviel von der Positiv-
Kontrolle. Der Marker bestand aus Proteinen mit verschiedenen Molekulargewichten von
10-250 kD (Precision protein standards, BIO-RAD).
Die Auftrennung der Proteine erfolgte während des Gellaufs. Der Gellauf wurde 30
Minuten lang in einer mit Elektrophoresepuffer gefüllten Kammer bei 200 V und 100 mA
durchgeführt. Bei diesem Schritt erfolgte die Auftrennung der Probe in die einzelnen
Proteine entsprechend des jeweiligen Molekulargewichts. Dann wurden die aufgetrennten
Proteine vom Gel auf eine PVDF-Membran (PVDF, Millipore) transferiert. Die PVDF-
Membran wurde 10 Minuten vor dem Transfer in Methanol eingelegt. Gel und Membran
wurden eingebettet zwischen Filterpapieren, die vorher in Towbin-Puffer eingelegt
2. Material und Methoden 22
wurden. Der Transfer dauerte drei Stunden.
Vor der Inkubation mit dem Primärantikörper wurden die unspezifischen Bindungsstellen
auf der Membran mit einer 5 % Milchpufferlösung blockiert. Dieser Vorgang dauerte 90
Minuten. Der 1. Antikörper (nNOS) wurde in einer Konzentration von 1:2000 zugegeben
und über Nacht auf dem Schüttler bei 4 °C inkubiert. Nach Waschen mit PBS-Tween
wurde der 2. Antikörper (AK) in einer Konzentration von 1:5000 zugegeben und
eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach erneutem
Waschen wurde die Membran 5 Minuten lang mit 10 ml Substrat ECL überschichtet. Der
Film wurde auf die Membran gelegt und 3-5 Minuten lang exponiert, dann entwickelt und
fixiert. Die resultierenden Banden wurden anhand der Intensität ausgewertet. Diese wurden
in Bezug gesetzt zu der Positiv-Kontrolle, woraus sich relative Intensitäten ergab. Diesen
Intensitäten wurden willkürliche Einheiten (relative Intensität) gegeben, um quantitative
Aussagen treffen zu können. Die quantitative Auswertung wurde mit dem Programm
„ScionImage“ (NIH, USA) durchgeführt.
2.2.3 Statistik
Die Daten für NOS-Aktivität und nNOS-Proteinmenge im ZNS und in der Nebenniere
wurden angegeben als Mittelwerte ± SEM. Die Unterschiede untereinander und zwischen
den einzelnen Gruppen wurden nach der Zwei-Weg und Ein-Weg ANOVA evaluiert,
gefolgt von einer Bonferroni-Prozedur. Die Unterschiede zwischen zwei Gruppen mit
einem p<0,05, p<0,01, p<0,005 oder p<0,001 wurden als signifikant gewertet.
3. Experimentelle Protokolle 23
3. Experimentelle Protokolle
3.1 Bestimmung der basalen NOS-Aktivität in Gehirn und Nebenniere
bei SH-Ratten
Es wurde die basale NOS-Aktivität bei 3-4 Wochen (prähypertensive Phase), 7-8 Wochen
(Manifestationsphase) und 12-13 Wochen (Erhaltungsphase) alten SH-Ratten untersucht
und mit gleichaltrigen WKY-Ratten verglichen (n = 10 pro Altersstufe pro Gruppe).
Nach Tötung der Tiere wurden das Gehirn und die Nebennieren entnommen. Vom Gehirn
wurden Cerebellum, Cerebrocortex, Hippocampus, Hypothalamus und Hirnstamm
entnommen. Die NOS-Aktivität wurde in vitro mittels Radio-Enzym-Assay bestimmt.
3.2 Bestimmung der basalen nNOS-Proteinmenge in Gehirn und
Nebenniere bei SH-Ratten
Es wurde die basale nNOS-Proteinmenge bei 3-4, 7-8 und 12-13 Wochen alten SH-Ratten
untersucht und mit gleichaltrigen WKY-Ratten verglichen (n = 5-6 pro Altersstufe pro
Gruppe). Nach Tötung der Tiere wurden das Gehirn und die Nebennieren entnommen. Die
nNOS-Proteinmenge wurde im Hypothalamus, im Hirnstamm und in der Nebenniere
mittels Western Blot Analyse ermittelt.
Die Auswertung der Proteinmenge erfolgte durch eine Densitometrie des belichteten
Filmes. Ausgewertet wurde die für nNOS typische Bande bei 155 kD. Die nNOS-
Proteinmenge wurde in willkürlich festgelegten Einheiten als relative Intensität angegeben.
3. Experimentelle Protokolle 24
3.3 Bestimmung der NOS-Aktivität in Gehirn und Nebenniere bei SH-
Ratten nach chronischer antihypertensiver Therapie
Untersucht wurde die NOS-Aktivität bei adulten, 12-13 Wochen alten SH-Ratten, die sich
in der Entwicklung des genetischen Hypertonus in der Erhaltungsphase befanden. Die
Tiere wurden in vier Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe wurde mit dem peripheren
Vasodilatator Hydralazin (3 mg/(kg KG * d) per os), die zweite Gruppe mit dem ACE-
Hemmer Enalapril (10 mg/(kg KG * d) per os) und die dritte Gruppe mit dem AT1-
Antagonisten Losartan (60 mg/(kg KG * d) per os) für 10 Tage behandelt. Die vierte
Gruppe wurde mit Wasser behandelt und diente als Kontrollgruppe (n = 10 pro Gruppe).
Die jeweilige Dosis des Antihypertensivums war durch Vorversuche so gewählt, daß nach
10 Tagen der Blutdruck in allen behandelten Gruppen um 21-30 mmHg gesenkt wurde.
Der systolische arterielle Blutdruck wurde zwei Tage vor Beginn der Behandlung und am
achten Tag während der Behandlung mittels Schwanzplethysmographie ermittelt. Am
zehnten Tag wurden nach Tötung der Tiere das Gehirn und die Nebennieren entnommen.
Vom Gehirn wurden Cerebellum, Hypothalamus und Hirnstamm en bloc entnommen und
bis zur Analyse bei –80 °C aufbewahrt.
3.4 Bestimmung der nNOS-Proteinmenge in Gehirn und Nebenniere
bei SH-Ratten nach chronischer antihypertensiver Therapie
Zwölf bis dreizehn Wochen alte SH-Ratten wurden in 4 Gruppen eingeteilt und wie oben
beschrieben mit Antihypertensiva behandelt (n = 5-6 pro Gruppe). Nach 10-tägiger
Behandlung wurden die Tiere getötet, und es wurden Gehirn und die Nebennieren zur
nNOS-Proteinbestimmung mittels Western Blot Analyse entnommen.
Die Auswertung der Proteinmenge erfolgte durch eine Densitometrie des belichteten
Filmes. Ausgewertet wurde die für nNOS typische Bande bei 155 kD. Die nNOS-
Proteinmenge wurde in willkürlich festgelegten Einheiten als relative Intensität angegeben.
4. Ergebnisse 25
4. Ergebnisse
4.1 Bestimmung der basalen NOS-Aktivität
4.1.1 Prähypertensive Phase
Bei den prähypertensiven, 3-4 Wochen alten Tieren wurden insgesamt 5 verschiedene
Gewebe auf die basale NOS-Aktivität hin untersucht. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse
von Cerebellum, Cerebrocortex und Hippocampus graphisch in der Übersicht. Signifikante
Unterschiede gab es nur im Cerebrocortex. Die NOS-Aktivität im Cerebrocortex war bei
prähypertensiven SH-Ratten signifikant erniedrigt im Vergleich zu gleichaltrigen WKY-
Ratten. Das Signifikanzniveau betrug p<0,01. In Cerebellum und Hippocampus zeigten
sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen WKY- und SH-Ratten.
Im Hirnstamm war die NOS-Aktivität bei prähypertensiven SH-Ratten signifikant
erniedrigt im Vergleich zu WKY-Ratten. Das Signifikanzniveau betrug dabei p<0,001. Im
Hypothalamus waren keine signifikanten Unterschiede zu beobachten. Die Ergebnisse sind
in Abbildung 4 graphisch aufgezeigt.
Die absolute NOS-Aktivität bei SH-Ratten war im Cerebellum am höchsten (10,15 ± 0,74
pmol Cit./(mg Protein * min)). Dann folgte der Cerebrocortex, in dem die NOS-Aktivität
noch höher war als im Hippocampus und Hypothalamus, die sich auf etwa einem
gleichhohen Stand befanden. Die niedrigste Aktivität wurde im Hirnstamm gemessen.
4. Ergebnisse 26
Cerebellum
0 1 202468
101214
0 1 20
1
2
3
4N
OS-
Akt
ivitä
tpm
ol C
it./(m
g Pr
otei
n *
min
)
Hippocampus
0 1 20,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Cerebrocortex
#
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
WKY SHR
WKY SHR
WKY SHR
Abbildung 3: Basale NOS-Aktivität bei prähypertensiven, 3-4 Wochen alten SH-Rattenund gleichaltrigen, normotensiven WKY-Ratten in Cerebellum,Cerebrocortex, und Hippocampus. n = 10 pro Gruppe. Die Werte sindMittelwerte ± SEM. #p<0,01 vs. WKY. Cit. = Citrullin.
Abbildung 4: Basale NOS-Aktivität bei prähypertensiven, 3-4 Wochen alten SH-Rattenund gleichaltrigen, normotensiven WKY-Ratten in Hypothalamus undHirnstamm. n = 10 pro Gruppe. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM.##p<0,001 vs. WKY. Cit. = Citrullin.
Hypothalamus
0 1 20,0
0,5
1,0
1,5
2,0 Hirnstamm
0 1 20,0
0,5
1,0
1,5
2,0
##
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
WKY SHR WKY SHR
4. Ergebnisse 27
4.1.2 Manifestationsphase
Bei den in der Entwicklungsphase der arteriellen Hypertonie befindlichen, 7-8 Wochen
alten SH- und gleichaltrigen WKY- Ratten wurden insgesamt 5 verschiedene Gewebe auf
die basale NOS-Aktivität hin untersucht. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse für Cerebellum,
Cerebrocortex und Hippocampus graphisch in der Übersicht.
Abbildung 5: Basale NOS-Aktivität bei in der Entwicklungsphase der Hypertoniebefindlichen, 7-8 Wochen alten SH-Ratten und gleichaltrigen WKY-Rattenin Cerebellum, Cerebrocortex und Hippocampus. n = 10 pro Gruppe. DieWerte sind Mittelwerte ± SEM. *p<0,05 vs. WKY. Cit. = Citrullin.
Wie in der prähypertensiven Phase zeigten sich im Cerebrocortex signifikante
Unterschiede. Die basale NOS-Aktivität im Cerebrocortex war bei den SH-Ratten
signifikant niedriger als bei WKY-Ratten (p<0,05). Die NOS-Aktivität bei SH-Ratten
betrug nur ca. 25 % der Aktivität bei WKY-Ratten. In Cerebellum und Hippocampus
Cerebellum
0 1 20
5
10
15
20
25
0 1 20
1
2
3
4
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
Hippocampus
0 1 20,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Cerebrocortex
*
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
WKY SHR
WKY SHR
WKY SHR
4. Ergebnisse 28
fanden sich keine signifikanten Unterschiede. Im Hippocampus wurden zwar bei SH-
Ratten höhere NOS-Aktivitäten gemessen als bei den gleichaltrigen WKY-Ratten, es
bestand diesbezüglich jedoch keine statistische Signifikanz. Die höchste NOS-Aktivität
wurde erneut im Cerebellum gemessen.
In der Abbildung 6 werden die Ergebnisse der in der Entwicklungsphase der arteriellen
Hypertonie befindlichen, 7-8 Wochen alten SH- und gleichaltrigen WKY- Ratten in
Hypothalamus und Hirnstamm graphisch dargestellt. In beiden Hirngeweben waren keine
statistisch signifikanten Unterschiede feststellbar.
Abbildung 6: Basale NOS-Aktivität bei in der Entwicklungsphase der Hypertoniebefindlichen, 7-8 Wochen alten SH-Ratten und gleichaltrigen,normotensiven WKY-Ratten in Hypothalamus und Hirnstamm. n = 10 proGruppe. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. Cit. = Citrullin.
Hypothalamus
0 1 20
2
4
6
8
10 Hirnstamm
0 1 20,0
0,5
1,0
1,5
2,0
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
WKY SHR WKY SHR
4. Ergebnisse 29
4.1.3 Erhaltungsphase
In der Gruppe der hypertonen, 12-13 Wochen alten Tieren wurden insgesamt 5
verschiedene Gewebe auf die basale NOS-Aktivität hin untersucht. Abbildung 7 zeigt die
Ergebnisse von Cerebellum, Hippocampus und Cerebrocortex graphisch in der Übersicht.
Bei diesen Geweben waren keine signifikanten Unterschiede zwischen SH-Ratten und
gleichaltrigen WKY-Ratten meßbar. Im Vergleich zu den in der Entwicklungsphase der
Hypertonie befindlichen, 7-8 Wochen alten SH- und WKY-Ratten war die basale NOS-
Aktivität im Cerebellum etwa gleich geblieben (Abbildung 5). Im Cerebrocortex und
Hippocampus waren bei den adulten SH- und WKY-Ratten die gemessenen Aktivitäten im
Vergleich zu den 7-8 Wochen alten Tieren um das Doppelte bis Achtfache erhöht.
Abbildung 7: Basale NOS-Aktivität bei hypertonen, 12-13 Wochen alten SH-Ratten undgleichaltrigen, normotensiven WKY-Ratten in Cerebellum, Cerebrocortexund Hippocampus. n = 10 pro Gruppe. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM.Cit. = Citrullin.
Cerebellum
WKY SHR0
5
10
15
20
25
Cerebrocortex
WKY SHR0
1
2
3
4
5
6
Hippocampus
WKY SHR0
1
2
3
4
5
6
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
WKY SHR
WKY SHR
WKY SHR
4. Ergebnisse 30
Hypothalamus
WKY SHR0
2
4
6
8
10
12
Hirnstamm
WKY SHR0
1
2
3
4
5
6
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
**
**
WKY SHR WKY SHR
Die Meßergebnisse der hypertonen 12-13 Wochen alten SH-Ratten und der gleichaltrigen,
normotensiven WKY-Ratten in Hypothalamus und Hirnstamm sind in Abbildung 8
dargestellt. In beiden Gewebeproben war die gemessene basale NOS-Aktivität bei SH-
Ratten mit einer Steigerung um ca. 80 % signifikant größer als bei WKY-Tieren (p<0,005).
Abbildung 8: Basale NOS-Aktivität bei hypertonen, 12-13 Wochen alten SH-Ratten undgleichaltrigen, normotensiven WKY-Ratten in Hypothalamus undHirnstamm. n = 10 pro Gruppe. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM.**p<0,005 vs. WKY. Cit. = Citrullin.
4.1.4 Vergleich prähypertensive, Manifestations- und Erhaltungsphase
Im Vergleich der gemessenen basalen NOS-Aktivitäten in den verschiedenen Altersstufen
der untersuchten SH- und WKY-Ratten fallen folgende Beobachtungen auf. Im
Cerebellum hat sich die Aktivität bei den in der Entwicklungsphase der Hypertonie
befindlichen 7-8 Wochen alten SH- und WKY-Ratten gegenüber der Gruppe der
prähypertensvien 3-4 Wochen alten Ratten verdoppelt. Sie betrug bei SH-Ratten 20,3 ± 0,5
pmol Cit./(mg Protein * min). Die absolute NOS-Aktivität im Hypothalamus ist bei beiden
Tiergruppen auf etwa das Fünffache gestiegen (von 1,3 ± 0,1 auf ca. 6,9 ± 0,6 pmol
Cit./(mg Protein * min)). Im Vergleich mit den 7-8 Wochen alten Tieren war die absolute
NOS-Aktivität im Hypothalamus bei WKY-Ratten nur leicht, bei SH-Ratten jedoch
deutlich gestiegen (von 7,4 ± 0,6 auf 9,7 ± 0,8 pmol Cit./(mg Protein * min)). Im
Hirnstamm war die Aktivität bei WKY-Ratten konstant geblieben, bei SH-Ratten zeigte
sich dagegen eine Verdoppelung von 1,4 ± 0,3 auf 2,9 ± 0,3 pmol Cit./(mg Protein * min).
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die basale NOS-Aktivität in beiden
4. Ergebnisse 31
untersuchten Tierstämmen in den untersuchten Hirnregionen mit zunehmendem Alter
angestiegen ist.
4.2 Bestimmung der basalen nNOS-Proteinmenge im Gehirn bei SH-
Ratten
Es wurde die basale nNOS-Proteinmenge im Hypothalamus und im Hirnstamm bei SH-
Ratten und WKY-Ratten in den drei Altersstufen 3-4, 7-8 und 12-13 Wochen bestimmt.
Hypothalamus und Hirnstamm wurden ausgewählt, weil beide Areale wichtige Zentren in
der zentralen Blutdruckregulation sind. Außerdem konnte in den vorausgegangenen
Untersuchungen gezeigt werden, daß bei den adulten SH-Ratten die NOS-Aktivität in
beiden Hirnregionen gegenüber gleichaltrigen WKY-Ratten signifikant erhöht war.
Abbildung 9 zeigt die Ergebnisse der nNOS-Messungen (relative Intensitäten) graphisch
für alle drei Altersstufen.
Bei den prähypertensiven, 3-4 Wochen alten SH-Ratten war die Menge an nNOS im
Hypothalamus um 45 % signifkant höher als bei WKY-Ratten. Dagegen waren im
Hirnstamm keine signifikanten Unterschiede zwischen SH-Ratten und gleichaltrigen
WKY-Ratten zu beobachten. Bei den in der Entwicklungsphase der arteriellen Hypertonie
befindlichen, 7-8 Wochen alten SH-Ratten konnten bezüglich der nNOS-Proteinmenge im
Hypothalamus und im Hirnstamm keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu
gleichaltrigen WKY-Ratten registriert werden.
Bei den hypertonen, 12-13 Wochen alten SH-Ratten war die Menge an nNOS um 15 %
signifkant höher als bei WKY-Ratten. Im Hirnstamm war ebenfalls die Proteinmenge von
nNOS bei SH-Ratten um 15 % signifikant erhöht gegenüber den WKY-Ratten.
Im Vergleich der drei Altersstufen hielten sich die Werte bei den WKY-Ratten in beiden
untersuchten Geweben in sehr engen Grenzen, nämlich zwischen 2,1 ± 0,4 und 2,5 ± 0,4
rel. Intensität im Hypothalamus und zwischen 2,3 ± 0,1 und 2,8 ± 0,1 rel. Intensität im
Hirnstamm. Bei den SH-Ratten schwankten die absoluten Werte für den Hirnstamm nur
minimal (zwischen 2,6 ± 0,1 und 2,9 ± 0,1 rel. Intensität). Im Hypothalamus war die
Bandbreite mit Werten von 2,6 ± 0,1 bis 3,1 ± 0,4 rel. Intensität ebenfalls gering, jedoch
war eine abnehmende, statistisch nicht signifikante Tendenz mit steigendem Alter zu
verzeichnen.
4. Ergebnisse 32
Abbildung 9: Basale nNOS-Proteinmenge, gemessen mittels Western Blot Technik beiSH- und WKY-Ratten in Hypothalamus [A] und Hirnstamm [B] im Altervon 3-4, 7-8 und 12-13 Wochen. n = 10 pro Gruppe. Die Werte sindMittelwerte ± SEM. *p<0,05 vs. WKY.
[A]
[B]
3-4 7-8 12-130
1
2
3
4
3-4 7-8 12-130
1
2
3
4
Hirnstamm(dorsale und ventrale Medulla)
Hypothalamus
nNO
S Pr
otei
nmen
ge(r
elat
ive
Inte
nsitä
t)
*
**
3-4 Wochen 12-13 Wochen7-8 Wochen
3-4 Wochen 12-13 Wochen7-8 Wochen
nNO
S Pr
otei
nmen
ge(r
elat
ive
Inte
nsitä
t)
WKYSHR
4. Ergebnisse 33
4.3 Bestimmung der NOS-Aktivität im Gehirn bei SH-Ratten nach
chronischer Behandlung mit Antihypertensiva
4.3.1 Physiologisches Profil
Es wurde in zwei Hirnregionen (Hypothalamus und Hirnstamm) die NOS-Aktivität nach
10-tägiger, oraler, antihypertensiver Therapie mit einem ACE-Hemmer (Enalapril), einem
AT1-Antagonisten (Losartan) und einem peripheren Vasodilatator (Hydralazin) untersucht.
Im Verlauf der Therapie wurde der Blutdruck bei den behandelten Ratten durch alle drei
verwendeten Pharmaka (Enalapril, Losartan und Hydralazin) signifikant um 21-30 mmHg
gesenkt. Das Körpergewicht der Ratten und die Herzfrequenz haben sich während der
antihypertensiven Therapie nicht signifikant verändert (Tabelle 1). Das Profil der WKY-
Ratten ist hier nicht aufgeführt, da es bei WKY-Ratten bekanntermaßen bezüglich
Körpergewicht, arteriellem Blutdruck und Herzfrequenz keine signifikanten Ver-
änderungen gibt. Die in Tabelle 1 genannten Kontrollen zeigen das physiologische Profil
der mit Wasser behandelten SH-Ratten, die in den folgenden Messungen von NOS-
Aktivität und NOS-Proteinmenge (siehe Abbildungen 10-13, 15) zum Vergleich dienten.
Gruppe Körpergewicht (g) Syst. art. Blutdruck
(mmHg)
Herzfrequenz (bpm) n
(a) (b) (a) (b) (a) (b)
Kontrolle 301 5 315 5 199 6 228 6* 382 11 375 9 10
Enalapril 286 4 302 5 213 9 192 6* 388 10 382 6 10
Losartan 287 4 298 4 208 7 179 3* 384 11 375 11 9
Kontrolle 288 3 312 4 202 7 223 6* 362 10 368 8 10
Hydralazin 284 5 300 2 207 8 177 7* 359 13 361 9 10
Die Werte sind Mittelwerte SEM , *p<0,05 vs. (a)
Tabelle 1: Körpergewicht (g), systolischer arterieller Blutdruck (mmHg), Herzfrequenz(bpm) und jeweilige Anzahl (n) der adulten, 12-13 Wochen alten SH-Rattenzwei Tage vor (a) und am achten Tag (b) der chronischen Behandlung mitEnalapril, Losartan und Hydralazin. (nach Qadri et al., 2001; 2003)
4. Ergebnisse 34
Die Versuche wurden zuerst mit Enalapril und Losartan durchgeführt, und zu einem
späteren Zeitpunkt mit Hydralazin. Daher gibt es zwei Kontrollgruppen (mit Wasser
behandelt), eine für die mit Enalapril und Losartan behandelten Ratten, und die zweite für
die mit Hydralazin behandelten Ratten. Aus ethischen Gründen wurde in den späteren
Versuchen mit Hydralazin auf eine erneute Untersuchung von WKY-Ratten verzichtet.
4.3.2 NOS-Aktivität in Hypothalamus und Hirnstamm bei SH-Ratten nach
chronischer Behandlung mit Antihypertensiva
Im Hypothalamus war die NOS-Aktivität in den mit Enalapril und Losartan behandelten
SH-Ratten signifikant erniedrigt (p<0,05) gegenüber der Kontrollgruppe, die mit dem
Vehikel Leitungswasser anstelle eines Antihypertensivums behandelt worden war
(Abbildung 10). Im Hirnstamm war die NOS-Aktivität in der mit Enalapril und Losartan
behandelten SH-Ratten-Gruppe ohne signifikante Veränderungen geblieben (Abbildung
11). Die Behandlung mit Hydralazin bewirkte weder im Hypothalamus noch im
Hirnstamm eine signifikante Veränderung der NOS-Aktivität (Abbildung 12).
Abbildung 10: Bestimmung der NOS-Aktivität im Hypothalamus von 12-13 Wochenalten SH-Ratten nach chronischer Behandlung mit Enalapril (10 mg/kgKG/Tag per os) oder Losartan (60 mg/kg KG/Tag per os). n = 9-10 proGruppe. Die Werte sind Mittelwerte SEM. *p<0,05 vs. Kontrolle.+p<0,05 vs. WKY. Cit. = Citrullin, KG = Körpergewicht. (nach Qadri etal., 2003)
WKY
Kontrolle
Enalapril
Losartan
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
0
1
2
3
4
* *
Hypothalamus
SHR
+
4. Ergebnisse 35
Abbildung 11: Bestimmung der NOS-Aktivität im Hirnstamm von 12-13 Wochen altenSH-Ratten nach chronischer Behandlung mit Enalapril (10 mg/(kg KG *d) per os) oder Losartan (60 mg/(kg KG * d) per os). n = 9-10 proGruppe. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. *p<0,05 vs. WKY. Cit. =Citrullin, KG = Körpergewicht. (nach Qadri et al., 2003)
Abbildung 12: Bestimmung der NOS-Aktivität im Hypothalamus und Hirnstamm von12-13 Wochen alten SH-Ratten nach chronischer Behandlung mitHydralazin, (3 mg/(kg KG * d) per os). n = 10 pro Gruppe. Die Wertesind Mittelwerte ± SEM. Cit. = Citrullin, Kontr. = Kontrolle, Hydr. =Hydralazin, KG = Körpergewicht. (nach Qadri et al., 2003)
WKY
Kontrolle
Enalapril
Losartan
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
0,0
0,5
1,0
1,5Hirnstamm
*
SHR
Control Hydralazin0
2
4
6
8
10
Control Hydralazin0
1
2
3
4
pmol
Cit.
/(m
g Pr
otei
n *
min
)
Kontr. Hydr. Kontr. Hydr.
Hypothalamus Hirnstamm
NO
S-A
ktiv
ität
4. Ergebnisse 36
4.4 Bestimmung der nNOS-Proteinmenge in Hypothalamus und
Hirnstamm bei SH-Ratten nach chronischer Behandlung mit
Antihypertensiva
Es wurden zwei Regionen des ZNS (Hypothalamus und Hirnstamm) auf den Gehalt des
nNOS Proteins nach 10-tägiger, oraler, antihypertensiver Therapie mit einem ACE-
Hemmer (Enalapril) und einem AT1-Antagonisten (Losartan) mittels Western Blot
untersucht. Im Verlauf der Therapie wurde der Blutdruck bei den behandelten Ratten durch
die beiden verwendeten Antihypertensiva signifikant um 21-30 mmHg gesenkt (Tabelle 1).
Die Ergebnisse der Messungen sind in Abbildung 13 für Hypothalamus [A] und
Hirnstamm [B] graphisch dargestellt. Bei beiden untersuchten Hirngebieten waren
zwischen den mit Enalapril und Losartan behandelten Ratten und der Kontroll-Gruppe der
SH-Ratten keine signifikanten Unterschiede feststellbar. Bezüglich der Kontroll-SH-Ratten
und der untersuchten WKY-Ratten war ein signifikanter Unterschied zu beobachten. Der
nNOS Proteingehalt im Hypothalamus und im Hirnstamm bei den Kontroll-SH-Ratten war
jeweils signifikant höher als bei den WKY-Ratten.
Abbildung 13 A: nNOS-Proteinmenge gemessen mittels Western Blot Technik inHypothalamus [A] von 12-13 Wochen alten WKY- und SH-Ratten nachchronischer Behandlung mit Enalapril (10 mg/(kg KG * d) per os) oderLosartan (60 mg/(kg KG * d) per os). Die Werte sind Mittelwerte ±SEM. *p<0,05 vs. WKY. n = 5 pro Gruppe. KG = Körpergewicht
WKY Control Enalapril Losartan0
1
2
3
nNO
S Pr
otei
nmen
ge(r
elat
ive
Inte
nsitä
t)
*
Hypothalamus
WKY Kontrolle Enalapril Losartan
SHR
[A]
4. Ergebnisse 37
Abbildung 13 B: nNOS-Proteinmenge gemessen mittels Western Blot Technik in undHirnstamm [B] von 12-13 Wochen alten WKY- und SH-Ratten nachchronischer Behandlung mit Enalapril (10 mg/(kg KG * d) per os) oderLosartan (60 mg/(kg KG * d) per os). Die Werte sind Mittelwerte ±SEM. *p<0,05 vs. WKY. n = 5 pro Gruppe. KG = Körpergewicht
4.5 Bestimmung der basalen NOS-Aktivität in der Nebenniere bei SH-
Ratten
Die NOS-Aktivität in der Nebenniere für alle drei Altersstufen ist in Abbildung 14
dargestellt. In allen Altersstufen war die NOS-Aktivität in der Nebenniere bei SH-Ratten
mit 40 – 70 % signifikant niedriger als bei den jeweils gleichalten WKY-Ratten. Die
absoluten Aktivitätswerte innerhalb der beiden Stämme zeigten nur leichte Schwankungen
im Verlauf des Alters, die nicht signifikant waren.
WKY Control Enalapril Losartan0
1
2
3
4 *
Hirnstamm
nNO
S Pr
otei
nmen
ge(r
elat
ive
Inte
nsitä
t)
WKY Kontrolle Enalapril Losartan
SHR
[B]
4. Ergebnisse 38
Abbildung 14: NOS-Aktivität bei WKY- und SH-Ratten in der Nebenniere im Alter von3-4, 7-8 und 12-13 Wochen. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM.##p<0,001 vs. gleichaltrige WKY. n = 10 pro Gruppe. (nach Qadri et al.,2001)
4.6 Einfluß einer chronischen antihypertensiven Therapie auf die
NOS-Aktivität und nNOS-Proteinmenge bei adulten SH-Ratten
In der Nebenniere war die NOS-Aktivität nach der antihypertensiven Therapie in den
beiden behandelten Gruppen signifikant (p<0,001) um 36 – 52 % gegenüber der
Kontrollgruppe angestiegen (Abbildung 15 A). In der Nebenniere war zunächst der
Proteingehalt von nNOS bei adulten SH-Ratten um 50 % signifikant (p<0,05) niedriger als
bei WKY-Ratten. Der nNOS Proteingehalt in den Nebennieren der beiden mit
Antihypertensiva behandelten Gruppen war um 180-240 % signifikant (p<0,05) größer als
bei der SH-Ratten Kontrollgruppe und WKY-Ratten. Zwischen den einzelnen mit
Antihypertensiva behandelten Gruppen gab es keine signifikanten Unterschiede
(Abbildung 15 B).
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/(mg
Prot
ein
* m
in)
0
1
2
3
4
5
######
WKYSHR
3-4 7-8 12-13Alter (Wochen)
4. Ergebnisse 39
Abbildung 15: Bestimmung der NOS-Aktivität [A] und der nNOS-Proteinmenge [B} inder Nebenniere von 12-13 Wochen alten WKY- und SH-Ratten nachchronischer Behandlung mit Enalapril (10 mg/(kg KG * d) per os) oderLosartan (60 mg/(kg KG * d) per os). Die Werte sind Mittelwerte ±SEM. ##p<0,001 und *p<0,05 vs. SH-Ratten-Kontrolle. +p<0,05 vs.WKY. n = 5-10 pro Gruppe. Cit. = Citrullin, KG = Körpergewicht. (nachQadri et al., 2001)
WKYKontrolle
EnalaprilLosartan
nNO
S-Pr
otei
nmen
ge(r
elat
ive
Inte
nsitä
t)
0
1
2
3
4
5
SHR
+
*
[B]
[A]
WKYKontrolle
EnalaprilLosartan
NO
S-A
ktiv
ität
pmol
Cit.
/( mg
Prot
ein
* m
in)
0
1
2
3
4
SHR
+
##
5. Diskussion 40
5. Diskussion
5.1 NOS-Aktivität im Gehirn der SH-Ratte und die Bedeutung in der
Pathogenese der genetischen Hypertonie
In der vorliegenden Arbeit wird NOS in verschiedener Ausprägung in einigen
Hirnregionen gefunden. Sowohl in SH-Ratten als auch in WKY-Ratten findet sich die
höchste basale NOS-Aktivität im Cerebellum, gefolgt von Hypothalamus, Cerebrocortex
und Hippocampus. Die niedrigste basale NOS-Aktivität wird im Hirnstamm gemessen.
Diese Ergebnisse stimmen mit Förstermann et al. (1990) überein, die durch Messung der
cGMP-Gehalt ähnliche Ergebnisse ermittelt haben.
Bei den vorliegenden Messungen steigt bei beiden Rattenstämmen und in allen
untersuchten Hirnregionen die NOS-Aktivität mit zunehmendem Alter allmählich an.
Signifikante Unterschiede zwischen SH- und WKY-Ratten finden sich vor allem in
solchen Hirnregionen, die an der zentralen Blutdruckkontrolle beteiligt sind wie z.B.
Hypothalamus und Hirnstamm. Die NOS-Aktivität in Cerebellum und Hippocampus haben
keine signifikanten Unterschiede zwischen SH- und WKY-Ratten gezeigt. Daher scheinen
diese Gebiete im Zusammenhang mit der Ätiologie der genetischen Hypertonie geringe
Bedeutung zu haben. Sie beinhalten bekanntermaßen keine primären Kerngebiete für die
Kontrolle der kardiovaskulären Funktionen. Die Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit
deuten darauf hin, daß bei den SH-Ratten die erhöhte NO-Synthese in Hypothalamus und
Hirnstamm eine Kompensation gegen den erhöhten Blutdruck darstellt. Es ist gezeigt
worden, daß eine Blockade von nNOS im Gehirn durch 7-Nitro-Indazol (7-NI), einem
spezifischen Inhibitor von nNOS, eine Blutdrucksteigerung nur bei adulten SH-Ratten
bewirkt, nicht jedoch bei WKY-Ratten (Qadri et al., 1999). Dies unterstützt unsere
Hypothese, daß sehr wahrscheinlich die gesteigerte NO-Synthese im Gehirn der SH-Ratten
eine Gegenregulation gegen den erhöhten Blutdruck darstellt.
Es darf als erwiesen angesehen werden, daß SH-Ratten in der prähypertensiven Phase im
Alter von 3-4 Wochen ein aktives sympathisches Nervensystem haben, obwohl die
Plasmakonzentrationen der Katecholamine keinen Unterschied zeigen zwischen SH- und
WKY-Ratten. Cabassi et al. (1998) haben gezeigt, daß die Noradrenalin-Konzentration
nicht im Plasma, sondern im Interstitium von gestreifter Muskulatur und subkutanem
5. Diskussion 41
Fettgewebe von prähypertensiven SH-Ratten im Gegensatz zu gleichalten WKY-Ratten
signifikant erhöht ist. Die 3-4 Wochen alten SH-Ratten haben also zwar noch keinen
erhöhten Blutdruck, aber sie haben dennoch lokal ein aktives sympathisches
Nervensystem. Dies kann ein frühes Zeichen des sich entwickelnden erhöhten Blutdrucks
sein. Zumindest kann das aktive sympathische Nervensystem an der Ätiologie der
arteriellen Hypertonie beteiligt sein.
Die nNOS Genexpression auf der mRNA- und Protein-Ebene im Hypothalamus von SH-
Ratten ist signifikant höher als bei gleichaltrigen WKY-Ratten (Häuser et al., 2002). Die
Ergebnisse zeigen, daß auch die Proteinmenge bei den prähypertensiven und den adulten
SH-Ratten gegenüber gleichaltrigen WKY-Ratten erhöht ist. Die NOS-Aktivität ist
allerdings nur bei den adulten SH-Ratten in der Erhaltungsphase erhöht. Das könnte ein
Beleg dafür sein, daß NO möglicherweise im Hypothalamus gegenregulatorisch gegen die
Hypertonie wirksam ist, und daß deshalb die Aktivität erst in der Erhaltungsphase erhöht
ist. Eine nNOS-Inhibition durch 7-Nitro-Indazol verursacht einen Blutdruckanstieg bei SH-
Ratten, wohingegen es bei WKY-Ratten keinen Effekt hat (Qadri et al., 1999). Dies ist ein
weiterer Hinweis für die Richtigkeit der Hypothese, daß bei SH-Ratten die erhöhte
hypothalamische nNOS vermittelte NO-Freisetzung einen physiologischen Gegen-
regulationsmechanismus darstellt.
Eine große Anzahl von NO produzierenden Neuronen wird im hypothalamischen PVN,
SON und verstreut im dorso-, ventromedialen und lateralen Hypothalamus gefunden
(Vincent und Kimura, 1992). Diese Neurone produzieren größtenteils Neurohormone wie
zum Beispiel Corticotropin-Releasing Faktor, Enkephalin, Vasopressin, Oxytocin, und
beeinflussen die Neurotransmitter wie Katecholamine (Swanson und Sawchenko, 1986). Es
ist naheliegend, daß die Synthese von NO und die Synthese und Freisetzung einer der oben
genannten Neurohormone und -transmitter miteinander in einer Wechselbeziehung stehen.
Pharmakologische und physiologische Studien haben gezeigt, daß NO im Hypothalamus
die endokrine und autonome Regulation der kardiovaskulären Funktionen moduliert (Oset-
Gasque et al., 1994). NO hat im PVN einen inhibitorischen Effekt auf den
Sympathikotonus (Horn et al., 1994; Gerova et al., 1995; Zhang und Patel, 1998), und es
reduziert die Freisetzung von Vasopressin in den Blutkreislauf (Yasin et al., 1993; Goyer
et al., 1994). Es wurde gezeigt, daß die Vasopressinmenge im Plasma bei SH-Ratten
vermindert ist, wenn die Hypertonie sich zu entwickeln beginnt (Morris et al., 1983;
5. Diskussion 42
Sladek et al., 1986). Ferner wurde demonstriert, daß auch umgekehrt die Vasopressin-
Freisetzung die NO-Produktion beeinflußt (Krukoff et al., 1997). Zusammen mit den
vorliegenden Ergebnissen muß man zu dem Schluß kommen, daß das hochregulierte,
aktivierte NO-System im Hypothalamus der SH-Ratten vermutlich einen
Gegenregulationsmechanismus darstellt, der kompensatorisch der Hypertonie
entgegenwirkt.
Gemäß der Verteilung der NO produzierenden Neurone im Hirnstamm enthalten der
Nucleus tractus solitarii (NTS), die rostrale ventrolaterale Medulla (RVLM) und die
caudale ventrolaterale Medulla (CVLM) die meisten dieser Neurone. Zum NTS laufen
Afferenzen mit viszerosensorischen Informationen einschließlich kardiovaskulären
Informationen aus der Peripherie (Torvik, 1956; Lewis et al., 1991). Es erfolgt eine weitere
Verschaltung der Informationen in verschiedene andere autonome Zentren, die im
Hirnstamm und im Vorderhirn lokalisiert sind (Ricardo und Koh, 1976). NO im NTS und
RVLM vermindert die Sympathikusaktivität und den arteriellen Blutdruck (Shapoval et al.,
1991; Tseng et al., 1996; Kagiyama et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit hat eine
Verminderung der NO-Aktivität und in der Folge wahrscheinlich eine verminderte
Produktion von NO in diesen Regionen bei prähypertensiven SH-Ratten, möglicherweise
von Geburt an, eine Überaktivierung des Sympathikus zur Folge. Trotzdem haben die
prähypertensiven SH-Ratten ebenso normale Blutdruckwerte wie die gleich alten WKY-
Ratten. Der Grund dafür sind möglicherweise Gegenregulationsmechanismen auf lokaler
Ebene, z.B. endotheliale Vasodilatatoren, oder auf systemischer Ebene, z.B. Barorezeptor
Modulation. Diese Mechanismen können in jungem Alter das hyperaktive sympathische
Nervensystem abpuffern, mit steigendem Alter jedoch erschöpfen sich dann auch diese
Effekte, weshalb sich wahrscheinlich dann die spontane Hypertonie entwickeln kann
(Cabassi et al., 1998).
Offenbar hat eine abnormale NO-Produktion von Geburt an einen Anteil an der
Pathogenese der Hypertonie in SH-Ratten. Obwohl prähypertensive SH-Ratten eine
erhöhte nNOS mRNA-Expression im Hirnstamm aufweisen (Häuser et al., 2002), ist die
NOS-Aktivität verringert. Welche Gründe hierfür verantwortlich sind, ist nicht klar. Ein
Mangel an NOS-Substrat L-Arginin ist dafür nicht ursächlich (Kagiyama et al., 2000),
möglicherweise könnte ein Defizit an Kofaktoren, die bei der NO-Synthese wichtig sind,
die Ursache für die beeinträchtigte NOS-Aktivität sein (Pearce et al., 1997; Cosentino et
5. Diskussion 43
al., 1998). Es sind weitere Untersuchungen nötig, um dies zu klären.
In Bezug auf die adulten, normotensiven Ratten wird beschrieben, daß die lokale NOS-
Inhibition im NTS und RVLM den Blutdruck und den Sympathikotonus steigert, was
reversibel sei durch Gabe von NO-Donatoren (Shapoval et al., 1991; Tseng et al., 1996).
Da NO bekanntermaßen im NTS und RVLM einen inhibitorischen Effekt auf die
Sympathikusaktivität und den Blutdruck ausübt, unterstreichen die Ergebnisse die Rolle
von NO in der Regulation der Sympathikusaktivität in diesen Kerngebieten des
Hirnstamms. Im Hirnstamm von adulten SH-Ratten, die sich bereits in der Erhaltungsphase
des Hypertonus befinden, sind sowohl die NOS mRNA-Genexpression als auch die NOS-
Proteinmenge (Häuser et al., 2002) und die NOS-Aktivität signifikant erhöht. Dies spricht
dafür, daß es sich bei dieser Steigerung um einen schützenden Kompensations-
mechanismus handeln könnte, der die Hypertension verhindern bzw. zurückführen soll.
Inwieweit die Gebiete Hypothalamus und Hirnstamm zusammenarbeiten oder sogar
synergistisch wirken, ist noch unklar. Sicher ist, daß das hochregulierte NO-System in
beiden Hirngebieten durch das sympathoneuronale und das neuroendokrine System gegen
den erhöhten Blutdruck gegenregulieren.
Das Renin-Angiotensin-System und NO
Es gibt zahlreiche Arbeiten über das Verhältnis von NO zum Renin-Angiotensin-System
(RAS). Es wurde vermutet, daß zwischen NO und Angiotensin II im Sinne zweier
Gegenspieler eine Balance bestehe (Nishiyama et al., 2001; Millat et al., 1999). Andere
Studien liefern Hinweise, daß NO ein direkter Modulator der ACE-Aktivität sein könnte,
und daß NO-Donatoren AT1-Rezeptoren herrunterregulieren (Cahill et al., 1995; Ichiki et
al., 1998). Angiotensin II kann die Barorezeptor-Sensitivität steigern (Dominiak et al.,
1989). Eine Verminderung von Angiotensin II durch ACE-Inhibition kann also zu einer
Absenkung der Barorezeptor-Sensitivität führen.
In der vorliegenden Arbeit bewirkte eine chronische Therapie von adulten SH-Ratten mit
RAS-Inhibitoren eine reduzierte NOS-Aktivität im Hypothalamus, wohingegen die
Aktivität im Hirnstamm unverändert blieb. Die verringerte NOS-Aktivität im
Hypothalamus ist dabei nicht auf eine reduzierte Proteinmenge zurückzuführen, denn die
NOS-Proteinmenge blieb durch die antihypertensive Therapie unverändert. Die
5. Diskussion 44
Anwesenheit von NOS im PVN und SON des Hypothalamus legt den Verdacht nahe, daß
NO im Hypothalamus eine Rolle spielt in der endokrinen und autonomen Regulation der
kardiovaskulären Funktionen, die unter anderem durch das RAS gesteuert werden. Da die
Behandlung mit Hydralazin, welches keine Wechselwirkungen mit dem zentralen RAS
hervorruft, keine signifikanten Veränderungen in der NOS-Aktivität in Hypothalamus und
Hirnstamm verursacht, kann man folgern, daß die Blutdrucksenkung als solche nicht für
die veränderte NOS-Aktivität im Gehirn verantwortlich ist. Die antihypertensiven Effekte
der RAS-Inhibitoren werden möglicherweise zentral durch das hypothalamische NO-
System moduliert. Bains und Ferguson (1994) belegen, daß die Kreislaufregulation im
PVN durch NO und Angiotensin moduliert wird.
Zusammenfassend steht fest, daß die NOS-Aktivität im ZNS von SH-Ratten gegenüber den
WKY-Ratten verändert ist. Die reduzierte NOS-Aktivität im Hirnstamm bei
prähypertensiven SH-Ratten kann ein bedeutender Faktor in der Pathogenese der
Hypertonie sein. Eine vermehrte NO-Produktion im Hypothalamus und Hirnstamm von
adulten SH-Ratten kann ein Epiphänomen sein und ein Gegenregulationsmechanismus, um
die Hypertonie zu bekämpfen. Desweiteren wirken möglicherweise RAS-Inhibitoren
antihypertensiv, indem sie die hypothalamische NO-Synthese stimulieren. Auf welchem
Weg RAS-Inhibitoren das NO-System im Hypothalamus direkt beeinflussen, daß es zur
Blutdrucksenkung kommt, ist noch unklar und wird Gegenstand zukünftiger Forschung
sein.
5.2 NOS-Aktivität in der Nebenniere der SH-Ratte und die Bedeutung
in der Pathogenese der genetischen Hypertonie
Die Untersuchungen haben gezeigt, daß die NOS-Aktivität in der Nebenniere der SH-
Ratten vermindert ist gegenüber derjenigen bei WKY-Ratten. Interessant dabei ist, daß
dies in allen drei Stadien der Entwicklung des Hypertonus der SH-Ratten gilt. Eine
Blockade der ACE- oder AT1-Rezeptoren bei adulten SH-Ratten führt zu einer Steigerung
sowohl der NOS-Aktivität als auch der nNOS-Proteinmenge.
Endogen produziertes NO reduziert die basale Katecholamin-Ausschüttung durch
periphere sympathische Nervenendigungen in der Nebenniere (Yamamoto et al., 1993;
Ward et al., 1996). Auf der anderen Seite wurde in einer einzelnen Arbeit gezeigt, daß eine
5. Diskussion 45
Verminderung von NO durch einen NOS-Inhibitor (L-NAME) eine signifikante Reduktion
der mRNA-Menge und Aktivität der Tyrosinhydroxylase im Nebennierenmark von WKY-
Ratten bewirkt, nicht aber bei SH-Ratten (Kumai et al., 1999). Eine Vielzahl von Studien
demonstriert, daß NO durch das NO-cGMP-System die spontane Freisetzung von
Katecholaminen aus der Nebenniere tonisch kontrolliert (McKinzie et al., 1996; Gaumann
und Yaksh, 1998). Schwartz et al. (1998) haben demonstriert, daß Katecholamin
produzierende chromaffine Zellen eine basale NOS-Aktivität besitzen, die in vitro durch
Acetylcholin stimuliert und durch L-NAME inhibiert werden kann. Man kann also folgern,
daß chromaffine Zellen einen autokrinen NO-cGMP-Stoffwechselweg besitzen, der
tonisch die Katecholamin-Freisetzung kontrolliert. Darüberhinaus ist NO in der Lage, die
biologische Aktivität von Katecholaminen zu inhibieren (Macarthur et al., 1995).
Es läßt sich also feststellen, daß die Kontrolle der Sympathikusfunktionen in der
Nebenniere durch NO einen bedeutenden Mechanismus der physiologischen
Blutdruckregulation darstellt. NO hat hierbei eine Schlüsselrolle. Daher ist eine
Mitwirkung von NO aus der Nebenniere in der Ätiologie der Hypertonie sehr naheliegend.
Die Tatsache, daß die NOS-Aktivität in der Nebenniere in allen Entwicklungsstufen der
Hypertonie der SH-Ratten gegenüber gleichaltrigen WKY-Ratten vermindert ist, spricht
für eine reduzierte Bildung von NO, wofür ein verminderter Gehalt des Enzyms nNOS in
der Nebenniere verantwortlich sein dürfte. Es kann spekuliert werden, daß dies von Geburt
an eine erhöhte Aktivität von Katecholaminen und in der Folge einen erhöhten Blutdruck
bewirkt. Donohue et al. (1988) haben Details über die Änderungen des Gehaltes an
Katecholaminen im Verlauf des Alters (2 Tage – 17 Wochen postnatal) in verschiedenen
Geweben von SH- und gleichaltrigen WKY-Ratten erforscht. Die Adrenalinmenge in der
Nebenniere war in allen Altersstufen etwa gleich bei SH- und WKY-Ratten. Allerdings
stiegen die Mengen von Noradrenalin in der Nebenniere bei SH-Ratten mit Ausbildung des
Hypertonus an. Bei den vorliegenden Ergebnissen ist die NO-Synthese bei jungen SH-
Ratten reduziert. Dies könnte eine fehlende Hemmung des Sympathikotonus darstellen,
was zusammen mit anderen Faktoren eine Erhöhung des Blutdrucks initiiert und im
Erwachsenenalter diesen erhöhten Blutdruck aufrechterhält. Der Effekt der reduzierten
NOS-Aktivität in der prähypertensiven Phase auf die Freisetzung von Katecholaminen
kann nicht erklärt werden, denn in diesem Alter sind bezüglich des Katecholamin-Gehalts
im Plasma keine Unterschiede zwischen SH-Ratten und gleichaltrigen WKY-Ratten
feststellbar (Donohue et al., 1988). Auf der anderen Seite gibt es Berichte darüber, daß in
5. Diskussion 46
diesem Alter das sympathische Nervensystem eine wichtige Rolle in der Entwicklung des
Hypertonus von SH-Ratten spielt. Eine Sympathektomie im jungen Alter schützt nämlich
vor der Ausbildung des Hypertonus im adulten Alter (McCathy et al., 1987; Zicha und
Kunes, 1999). Eine chronische Therapie mit ACE-Inhibitoren in der Phase der Hypertonie-
Entwicklung (6-10 Wochen postnatal) kann die Ausprägung des Hypertonus verhindern
(Unger und Rettig, 1990). In einer zusammenfassenden Betrachtung kann man
konstatieren, daß die reduzierte NO-Synthese in der Nebenniere von SH-Ratten kein
Epiphänomen der Hypertonie ist, sondern vielmehr ursächlich zu der Ausbildung der
spontanen Hypertonie beiträgt.
Eine Anzahl von Autoren haben eine entgegengesetzte Wechselbeziehung zwischen der
Aktivität von ACE und eNOS in den Blutgefäßen im Sinne eines Regelkreises beschrieben
(Fernández-Alfonso und González, 1999; Linz et al., 1999). Die ACE-Aktivität ist erhöht,
wenn eNOS vermindert ist (Takemoto et al., 1997). Es gibt allerdings nur wenige Daten
bezüglich einer Interaktion von AT1-Rezeptor-Antagonisten (Iwai et al., 1995), und
bislang gar keine Daten bezüglich ACE-Inhibitoren und nNOS. Bei den vorliegenden
Untersuchungen war die verringerte NOS-Aktivität in der Nebenniere von SH-Ratten
vergesellschaftet mit einer verminderten NOS-Proteinmenge. Eine chronische Behandlung
mit Inhibitoren des RAS erhöhte signifikant die nNOS-Proteinmenge und ebenfalls die
NOS-Aktivität in der Nebenniere. Diese Beobachtungen passen zu den Ergebnissen von
Iwai et al. (1995), daß eine chronische Behandlung mit Antihypertensiva einen Anstieg der
Expression von nNOS mRNA in der Nebenniere von SH-Ratten bewirkt. Bei der
vorliegenden Arbeit wurden bewußt nur Inhibitoren des RAS benutzt, weil z.B. Hydralazin
selbst die nNOS Genexpression beeinflußt (Iwai et al., 1995). Es hat den Anschein, daß die
Blutdruckreduktion durch RAS-Blocker bei adulten SH-Ratten die Expression von nNOS
mRNA triggert. Der exakte Mechanismus der Hochregulation von nNOS durch die RAS-
Blockade ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Anhand der Ergebnisse kann man jedoch
spekulieren, daß eine Abnahme des Blutdrucks durch ACE- oder AT1-Inhibitoren eine
Zunahme der nNOS-Proteinmenge induziert. Folglich wird mehr NO synthetisiert, und das
sympathoadrenale System wird inhibiert. Es ist bekannt, daß ACE- oder AT1-Inhibition die
Freisetzung von Katecholaminen beeinflussen (Dominiak, 1993; Häuser et al., 1998).
Die NOS-Aktivität in der Nebenniere bei SH-Ratten ist von Geburt an erniedrigt
gegenüber WKY-Ratten. Es ist davon auszugehen, daß es sich dabei nicht um die Folge
5. Diskussion 47
eines erhöhten Blutdrucks handelt, sondern daß vielmehr die erniedrigte NOS-Aktivität in
der Nebenniere von SH-Ratten eine ätiologisehe Bedeutung für die Entwicklung der
Hypertonie hat. Darüberhinaus könnte die Inhibition des RAS durch ACE- oder AT1-
Inhibitoren auch dadurch blutdrucksenkend wirken, daß das NO-System hochreguliert wird
und damit der Sympathikotonus vermindert wird.
Schlußfolgerung:
Die NO-Synthese ist in wichtigen kardiovaskulär regulierenden Kerngebieten im
Hirnstamm und Hypothalamus sowie in der Nebenniere, die ein Effektororgan des
Sympathikussystems ist, in prähypertensiven SH-Ratten gegenüber gleichaltrigen WKY-
Ratten verändert. Diese veränderte NO-Synthese kann eine Ursache der genetischen
Hypertonie bei SH-Ratten sein. Es ist möglich, daß die Veränderungen im ZNS zusammen
mit der Veränderung in der Nebenniere die Entstehung der genetischen Hypertonie
beeinflussen. Die Veränderungen in ZNS und Nebenniere können jedoch auch einzelne,
voneinander unabhängige Effekte sein.
5.3. Ausblick
Die vorliegenden Untersuchungen dokumentieren allesamt Ergebnisse, die mit
Rattenmodellen gewonnen wurden. Es gibt viele Parallelen zwischen der arteriellen
Hypertonie bei SH-Ratten und der essentiellen Hypertonie beim Menschen (Yamori, 1991).
Für die Zukunft heißt das Ziel, aus den tierexperimentell gewonnenen Erkenntnissen neue
Therapiemöglichkeiten für die essentielle Hypertonie beim Menschen zu entwickeln. Eine
wichtige Bedeutung in der Zukunft kann dabei die Gentherapie haben. Auch wenn nach
heutigen Erkenntnissen die Regulation des NO-cGMP-Systems sehr komplex ist (Sessa,
1994), so wird die Genforschung einen großen Beitrag im Sinne einer therapeutischen
Anwendbarkeit leisten können. Entgegen den etablierten Therapieformen mit oralen
Antihypertensiva, die symptomatisch den arteriellen Blutdruck senken, könnte eine
Gentherapie eine nachhaltige Behandlung der Ursache der Hypertonie darstellen. Es gibt
bereits positive Ergebnisse über Experimente, in denen ein Gentransfer von eNOS auf
Ratten und Schweine mittels eines Adenovirus erfolgte, woraufhin durch eine lokal erhöhte
NO-Produktion die Koronardurchblutung verbessert werden konnte (von der Leyen und
Dzau, 2001).
6. Zusammenfassung 48
6. Zusammenfassung
Die Blockade von nNOS im Gehirn bewirkt einen Blutdruckanstieg bei SH-Ratten. Daher
lautete unsere Hypothese, daß eine erhöhte NO-Synthese im Gehirn einen Gegenregula-
tionsmechanismus gegen den artiellen Hypertonus darstellt. Ferner ist es auch bewiesen,
daß NO in der Nebenniere tonisch die Freisetzung von sympathischen Neurotransmittern
moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst mittels Radio-Enzym-Assay die
basale NOS-Aktivität und mittels Westernblot-Analyse der nNOS-Proteingehalt in
verschiedenen Hirnarealen und zusätzlich in der Nebenniere der SH-Ratte während der
prähypertensiven, der Manifestations- und der Erhaltungsphase der Hypertonie untersucht
und mit gleichaltrigen, normotensiven WKY-Ratten verglichen. Anschließend wurde der
Einfluß einer antihypertensiven Therapie auf NOS-Aktivität und nNOS-Proteingehalt im
Gehirn sowie in der Nebenniere der SH-Ratten gemessen.
Die basale NOS-Aktivität im Cerebrocortex und Hirnstamm von prähypertensiven und in
der Manifestationsphase befindlichen SH-Ratten war vermindert. Dagegen war die NOS-
Aktivität in Hypothalamus und Hirnstamm von adulten SH-Ratten erhöht. Eine
antihypertensive Therapie von SH-Ratten mit RAS-Blockern (Enalapril oder Losartan)
reduzierte die NOS-Aktivität im Hypothalamus, nicht jedoch im Hirnstamm. Dagegen
hatte ein peripherer Vasodilatator (Hydralazin) keinen Einfluß auf die NOS-Aktivität. Der
nNOS-Proteingehalt blieb unter allen antihypertensiven Therapien unverändert. Die basale
NOS-Aktivität und der nNOS-Proteingehalt in der Nebenniere von SH-Ratten lag in jeder
Phase der Entwicklung der Hypertonie niedriger als bei WKY-Ratten. Die Therapie mit
oben genannten Antihypertensiva bewirkte eine signifikante Erhöhung von NOS-Aktivität
und nNOS-Proteinmenge in der Nebenniere von SH-Ratten gegenüber den Kontroll-SH-
Ratten.
Vermutlich ist eine verminderte NOS-Aktivität in Hirnstamm und Cerebrocortex der
prähypertensiven SH-Ratte an der Entwicklung der genetischen Hypertonie beteiligt. Im
Gegensatz dazu kann die erhöhte NOS-Aktivität in Hypothalamus und Hirnstamm von
adulten SH-Ratten einen Gegenregulationsmechanismus gegen den arteriellen Hypertonus
darstellen. Es scheint so, daß der antihypertensive Effekt der RAS-Inhibitoren über das
hypothalamische NO-System vermittelt wird. Anders als im Gehirn kann die reduzierte
NO-Synthese in der Nebenniere von Geburt an eine Ursache für die Entstehung der geneti-
schen Hypertonie sein. Möglicherweise tragen die veränderte NO-Synthese im Gehirn und
in der Nebenniere zusammen zur Entstehung der genetischen Hypertonie bei.
7. Literatur 49
7. Literatur
1. Arens KJ: Die Behandlung von Hochdruckkrisen
Med. Diss. Bonn, 1968
2. Bains JS, Ferguson AV: Angiotensin II neurotransmitter actions in paraventricular
nucleus are potentiated by a nitric oxide synthase inhibitor
Regulatory Peptides, 1994; 50: 53-59
3. Bourne JA: Handbuch I der Immunperoxidase Färbemethoden
DAKO Corporation (Santa Barbara, USA), 1992
4. Bredt DS, Hwang PM, Snyder SH: Localization of nitric oxide synthase indicating
a neural role for nitric oxide
Nature, 1990; 347: 768-770
5. Bredt DS, Snyder SH: Nitric oxide, a novel neuronal messenger
Neuron, 1992; 8: 3-11
6. Butler AR, Flitney FW, Williams DLH: NO, nitrosonium ions, nitroxide ions,
nitrosothiols and iron-nitrosyls in biology: a chemist’s perspective
Trends Pharmacol. Sci., 1995; 16: 18-22
7. Cabassi A, Vinci S, Calzolari M, Brushi G, Borghetti A: Regional sympathetic
activity in pre-hypertensive phase of spontaneously hypertensive rats
Life Sci., 1998; 62: 1111-1118
8. Cabrera CL, Bealer SL, Bohr DF: Central depressor action of nitric oxide is
deficient in genetic hypertension
Amer. J. Hypertens., 1996; 9: 237-241
9. Cabrera CL, Bohr D: The role of nitric oxide in the central control of blood pressure
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995; 206: 77-81
7. Literatur 50
10. Cahill PA, Redmond EM, Foster C, Sitzmann JV: Nitric oxide regulates
angiotensin II receptors in vascular smooth muscle cell
Eur. J. Pharmacol., 1995; 288: 219-229
11. Chan SH, Wang LL, Wang SH, Chan JY: Differential cardiovascular responses to
blockade of nNOS or iNOS in rostral ventrolateral medulla of the rat
Br. J. Pharmacol., 2001; 133: 606-614
12. Chou TC, Qen MH, Li CY, Ding YA: Alteration of nitric oxide synthase with aging
and hypertension in rat
Hypertension, 1998; 31: 643-648
13. Cosentino F, Patton S, d’Uscio LV, Werner ER, Werner-Felmayer G, Moreau P,
Malinski T, Lüscher TF: Tetrahydrobiopterin alters superoxide and nitric oxide
release in prehypertensive rats
J. Clin. Invest., 1998; 101: 1530-1537
14. Culman J, Unger T: Central mechanisms regulating blood pressure: Circuits and
transmitters
European Heart Journal, 1992; 13: 10-17
15. Dominiak P: Modulation of sympathetic control by ACE inhibitors
Eur. Heart J., 1993; 14: 169-172
16. Dominiak P, Blochl A, Permanetter B: Influence of baroreceptors on hypertension,
pharmacotherapy with conversion enzyme inhibitors
Z. Kardiol., 1989; 78: 187-192
17. Dominiczak AF, Bohr DF: Nitric oxide and its putative role in hypertension
Hypertension, 1995; 25: 1202-1211
18. Donohue SJ, Stitzel RE, Head RJ: Time course of change in the norepinephrine
content of tissues from spontaneously hypertensive and Wistar Kyoto rats
J. Pharmacol. Exp. Ther., 1988; 245: 24-31
7. Literatur 51
19. Fernández-Alfonso MS, González, C: Nitric oxide and the renin-angiotensin
system. Is there a physiological interplay between the systems?
J. Hypertens., 1999, 17: 1355-1361
20. Förstermann U, Gorsky LD, Pollock JS, Schmidt HHHW, Heller M, Murad F:
Regional distribution of EDRF/NO-synthesizing enzyme(s) in rat brain
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990; 168: 727-732
21. Furchgott RF, Zawadzki JV: The obligatory role of endothelial cells in the
relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine
Nature, 1980; 288: 373-376
22. Ganten D: Role of animal models in hypertension research
Hypertension, 1987; 9 (Suppl. 1): I-2-I-4
23. Garthwaite J: Glutamate, nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system
Trends Neurosci., 1991; 14: 60-67
24. Garthwaite J, Boulton CL: Nitric oxide signaling in the central nervous system
Annu. Rev. Physiol., 1995; 57: 683-706
25. Gaumann DM, Yaksh TL: Effects of hemorrhage and opiate antagonists on adrenal
release of neuropeptides in cats
Peptides, 1998; 9: 393-405
26. Germann P, Poschl G, Leitner C, Urak G, Ullrich R, Faryniak B, Roder G,
Kaider A, Sladen R: Additive effect of nitric oxide inhalation on the oxygenation
benefit of the prone position in the adult respiratory distress syndrome
Anesthesiology, 1998; 89: 1401-1406
27. Gerova M, Masanova C, Pavlasek J: Inhibition of NO synthase in the posterior
hypothalamus increases blood pressure in the rat
Physiol. Rev., 1995; 44: 131-134
7. Literatur 52
28. Gold ME, Wood KS, Buga GM, Byrns RE, Ignarro LJ: L-arginine causes whereas
L-argininosuccinic acid inhibits endothelium-dependent vascular smooth muscle
relaxation
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989; 161:536-43
29. Goyer M, Bui H, Chou L, Evans J, Keil LC, Reid IA: Effects of inhibition of nitric
oxide synthesis on vasopressin secretion in conscious rabbits
Am. J. Physiol., 1994; 266: H822-H828
30. Griffith OW, Kilbourn RG: Nitric oxide synthase inhibitors: Amino acids
Methods Enzymol, 1996; 268: 375-392
31. Häuser W, Dendorfer A, Nguyen T, Dominiak P: Effects of the AT1 antagonist HR
720 in comparison to losartan on stimulated sympathetic outflow, blood pressure and
heart rate in pithed spontaneously hypertensive rats
Kidney Blood Press. Res., 1998; 21: 29-35
32. Häuser W, Sassmann A, Qadri F, Jöhren O, Dominiak P: NOS-isoenzyme mRNA
is differentially expressed in the brain, pituitary and adrenal gland of spontaneously
hypertensive rats in relation to the development of hypertension
J. Hypertens., 2002; 20: 263
33. Harada S, Okunaga S, Momohara M, Masaki H, Tagawa T, Imaizumi T,
Takeshita A: Inhibition of nitric oxide formation in the nucleus tractus solitarius
increases renal sympathetic nerve activity in rabbits
Circ. Res., 1993; 72: 511-516
34. Hirooka Y, Takeshita A: Recent trends in studies of the etiology of hypertension:
Central nervous system and autonomic nervous system
Nippon Rinsho, 2001; 59: 860-866
7. Literatur 53
35. Horn TP, Smith PM, McLaughlin BE, Bauce L, Marks GS, Pittmann QJ,
Ferguson AV: Nitric oxide actions in paraventricular nucleus: cardiovascular and
neurochemical implications
Am. J. Physiol., 1994; 266: R306-R313
36. Ichiki T, Usui M, Kato M, Funkakoshi Y, Ito K, Egashira K, Takeshita A:
Downregulation of angiotensin II type 1 receptor gene transcription by nitric oxide
Hypertension, 1998; 31: 342-348
37. Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE, Chaudhuri G: Endothelium-derived
relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84: 9265-9269
38. Iwai N, Hanai K, Tooyama I, Kitamura Y, Kinoshita M: Regulation of neuronal
nitric oxide synthase in rat adrenal medulla
Hypertension, 1995; 25: 431 - 436
39. Johnson ML, Ely, DL, Turner ME: Genetic divergence between the Wistar-Kyoto
rat and the spontaneously hypertensive rat
Hypertension, 1992; 19: 425-427
40. Kagiyama S, Tsuchihashi T, Abe I, Fujishima M: Enhanced depressor response to
nitric oxide in the rostral ventrolateral medulla of spontaneously hypertensive rats
Hypertension, 1998; 31: 1030-1034
41. Kagiyama S, Tsuchihashi T, Abe I, Matsumura K, Fujishima M: Central infusion
of L-arginine or superoxide dismutase does not alter arterial pressure in SHR
Hypertens. Res., 2000; 23: 339-343
42. Knowles RG, Palacios M, Palmer RMJ, Moncada S: Formation of nitric oxide
from L-arginine in the central nervous system: A transduction mechanism for
stimulation of the soluble guanylate cyclase
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86: 5159-5162
7. Literatur 54
43. Koshland DE: The molecule of the year
Science, 1992; 258: 1861
44. Krukoff TL: Central regulation of autonomic function: No brakes?
Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 1998; 25: 474-478
45. Krukoff TL, Gehlen F, Ganten F, Wagner J: Gene expression of brain nitric oxide
synthase and soluble guanylyl cyclase in hypothalamus and medulla of two-kidney,
one-clip hypertensive rats
Hypertension, 1995; 26: 171-176
46. Krukoff TL, MacTavish D, Jhamandas JH: Activation by hypotension of neurons
in the hypothalamic paraventricular nucleus that project to the brainstem
J. Comp. Neurol., 1997; 385: 285-296
47. Kumai T, Asoh K, Tateishi T, Tanaka M, Watanabe M, Kobayashi S: Effects of
nitric oxide synthase on tyrosine hydroxylase mRNA in the adrenal medulla of
spontaneously hypertensive and Wistar Kyoto rats
Nitric Oxide, 1999; 3: 321-326
48. Lewis SJ, Ohta H, Machado B, Bates JN, Talman WT: Microinjection of s-
nitrosocysteine into the nucleus tractus solitarii decreases arterial pressure and heart
rate via activation of soluble guanylyl cyclase
Eur. J. Pharmacol., 1991; 202: 135-136
49. Leyen HE von der, Dzau VJ: Therapeutic potential of nitric oxide synthase gene
manipulation
Circulation, 2001; 103: 2760-2765
50. Lezin ES, Simonet L, Pravenec M, Kurtz TW: Hypertensive strains and
normotensive “control” strains
Hypertension, 1992; 19: 419-424
7. Literatur 55
51. Linz W, Wohlfart P, Schölkens BA, Malinski T, Wiemer G: Interactions among
ACE, kinins and NO
Cardiovasc. Res., 1999; 43: 549-561
52. Macarthour H, Mattammal MB, Westfall TC: A new perspective on the inhibitory
role of nitric oxide in sympathetic neurotransmission
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995; 216: 686-692
53. McCann SM, Karanth S, Kimura M, Yu WH, Rettori V: The role of nitric nxide
(NO) in control of hypothalamic-pituitary function
Rev. Brasil. Biol., 1996; 56 (Suppl. 1): 105-112
54. McCathy R, Kirby RF, Cierpial MA, Jenal TJ: Accelerated development of
cardiac sympathetic responses in spontaneously hypertensive (SHR) rats
Behav. Neural. Biol., 1987; 48: 321-333
55. McKinzie S, Tyce GM, Brimijoin S: Lowered norepinephrine turnover as a sign of
impaired ganglionic transmission after preganglionic lesioning by acetylcholine
esterase antibodies
J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996; 27: 817-822
56. Michel T, Feron O: Nitric oxide synthases: Which, where, how, and why?
J. Clin. Invest., 1997; 9: 2146-2152
57. Millat LJ, Abdel-Rahman EM, Siragy HM: Angiotensin II and nitric oxide: A
question of balance
Regulat. Pept., 1999; 81: 1-10
58. Mitchell JA, Kohlhaas KL, Sorrentino R, Warner TD, Murad F, Vane JR:
Induction by endotoxin of nitric oxide synthase in the rat mesentery: Lack of effect
on action of vasoconstrictors
Br. J. Pharmacol., 1993; 109: 265-270
7. Literatur 56
59. Moncada S, Higgs A, Furchgott R: XIV. International Union of Pharmacology
Nomenclature in Nitric Oxide Research
Pharmacol. Rev., 1997; 49: 137-142
60. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA: The discovery of nitric oxide as the
endogenous nitrovasodilator
Hypertension, 1988; 12: 365-372
61. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA: Nitric oxide: Physiology, pathophysiology
and pharmacology
Pharmacol. Rev., 1991; 43: 109-142
62. Morris M, Keller M, Sundberg DK: Changes in paraventricular vasopressin and
oxytocin during the development of spontaneous hypertension
Hypertension, 1983; 5: 476-781
63. Nathan C, Xie QW: Regulation of biosynthesis of nitric oxide
J. Biol. Chem., 1994; 269: 13725-13728
64. Nishiyama A, Fujisawa Y, Fukui T, Rahman M, Kondo N, Ogawa Y, Fanzhu L,
Guoxing Z, Kimura S, Abe Y: Role of nitric oxide in regional blood flow in
angiotensin II-induced hypertensive rats
Hypertens. Res., 2001; 24: 421-427
65. Ohte A, Takagi H, Matsui T, Hamai Y, Iida S, Esumi H: Localization of nitric
oxide synthase immunoreactive neurons in the solitäry nucleus and ventrolateral
medulla oblongata of the rat: Their relation to catecholaminergic neurons
Neurosci. Lett., 1993; 158: 33-35
66. Okamoto K, Aoki K: Development of a strain of spontaneously hypertensive rats
Jpn. Circ. J., 1963; 27: 282-293
7. Literatur 57
67. Oset-Gasque MJ, Parramon M, Hortelano S, Bosca L, Gonzalez MP: Nitric oxide
implication in the control of neurosecretion by chromaffin cells
J. Neurochem., 1994; 63: 1693-1700
68. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S: Nitric oxide release accounts for the
biological activity of endothelium-derived relaxing factor
Nature, 1987; 327: 524-526
69. Paxinos G, Watson C: The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates
Academic Press, New York, 1998
70. Pearce WJ, Tone B, Ashwal S: Maturation alters cerebral NOS kinetics in the
spontaneously hypertensive rat
Am. J. Physiol., 1997; 273: R1367-R1373
71. Plochocka-Zulinska D, Krukoff TL: Increased gene expression of neuronal nitric
oxide synthase in brain of adult spontaneously hypertensive rats
Mol. Brain Res., 1997; 48: 291-297
72. Qadri F, Arens T, Schwartz EC, Häuser W, Dendorfer A, Dominiak P: Brain
nitric oxide synthase activity in spontaneously hypertensive rats during the
development of hypertension
J. Hypertens., 2003; 21: 1687-1694
73. Qadri F, Arens T, Schwartz EC, Häuser W, Dominiak P: Angiotensin-converting
enzyme inhibitors and AT1-receptor antagonist restore nitric oxide synthase (NOS)
activity and neuronal NOS expression in the adrenal glands of spontaneously
hypertensive rats
Jpn. J. Pharmacol., 2001, 85: 365-369
74. Qadri F, Carretero OA, Scicli AG: Centrally produced neuronal nitric oxide in the
control of baroreceptor reflex sensitivity and blood pressure in normotensive and
spontaneously hypertensive rats
Jpn. J. Pharmacol., 1999; 81: 279-285
7. Literatur 58
75. Reuss S, Decker K, Rößeler L, Layes E, Schollmayer A, Spessert R: Nitric oxide
synthase in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: Evidence from
histochemistry, immunohistochemistry and Western blot; and colocalization with VIP
Brain. Res., 1995; 695: 257-262
76. Ricardo JA, Koh ET: Anatomical evidence of direct projections from the nucleus of
the solitary tract to hypothalamus, amygdala, and other forebrain structures in the rat
Brain Res., 1976; 153: 1-26
77. Rodrigo J, Riveros-Moreno V, Bentura ML, Uttenthal LO, Higgs EA, Fernandez
AP, Polak JM, Moncada S, Martinez-Murillo R: Subcellular localization of nitric
oxide synthase in the cerebral ventricular system, subfornical organ, area postrema,
and blood vessels in the rat brain
J. Comp. Neurol., 1997; 378: 522-534
78. Sakuma I, Togashi H, Yoshioka M, Saito H, Yanagida M, Tamura M,
Kobayashi T, Yasuda H, Gross SS, Levi R: NG-methyl-L-arginine, an inhibitor of
L-arginine-derived nitric oxide synthesis, stimulates renal sympathetic nerve activity
in vivo. A role for nitric oxide in the central regulation of sympathetic tone?
Circ. Res., 1992; 70: 607-611
79. Schmidt HHHW, Walter U: NO at work
Cell, 1994; 78: 919-925
80. Schütz, W: Pharmakologie des kardiovaskulären Systems: Das Herz
Forth W, Henschler D, Rummel W, Starke K: Allgemeine und spezielle
Pharmakologie und Toxikologie, 7. Aufl., 363-406, Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, 1996
81. Schwartz PM, Rodriguez-Pascual F, Koesling D, Torres M, Förstermann U:
Functional coupling of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in
controlling catecholamine secretion from bovine chromaffin cells
Neurosci., 1998; 82: 255-265
7. Literatur 59
82. Sessa WC: The nitric oxide synthase family of proteins
J. Vasc. Res., 1994; 31: 131-143
83. Shapoval LN, Sagach VF, Pobegailo LS: Nitric oxide influences ventrolateral
medullary mechanisms of vasomotor control of the cat
Neurosci. Lett., 1991; 132: 47-50
84. Sladek CD, Blaire ML, Chen YH, Rockhold RW: Vasopressin and renin response
to plasma volume loss in spontaneously hypertensive rats
Am. J. Physiol., 1986; 250: H443-H452
85. Snyder SH, Bredt DS: Biological roles of nitric oxide
Sci. Amer., 1992; 266 (5): 28-35
86. Snyder SH, Bredt DS: Nitric oxide as a neuronal messenger
Trends Pharmacol. Sci., 1991; 12: 125-128
87. Swanson LW, Sawchenko PE: Hypothalamic integration: Organization of the
paraventricular and supraoptic nuclei
Annu. Rev. Neurosci., 1996; 6: 269-324
88. Takemoto M, Egashira K, Usui M, Numaguchi K, Tomita H, Tsutsui H,
Shimokawa H, Sueishi K, Takeshita A: Important role of tissue angiotensin-
converting enzyme activity in the pathogenesis of coronary vascular and myocardial
structural changes induced by long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats
J. Clin. Invest., 1997; 99: 278-287
89. Tobian L: Salt and hypertension: Lessons from animal models that relate to human
hypertension
Hypertension, 1991; 13: 631-644
7. Literatur 60
90. Togashi H, Sakuma I, Yoshioka M, Kobayashi T, Yasuda H, Kitabatake A, Saito
H, Gross SS, Levi R: A central nervous system action of nitric oxide in blood
pressure regulation
J. Pharmocol. Exp. Ther., 1992; 262: 343-347
91. Torvik A: Afferent connections to the sensory trigeminal nuclei, the nucleus of the
solitary tract and adjacent structures
J. Comp. Neurol., 1956; 106: 51-131
92. Tseng CJ, Liu HY, Lin HC, Ger LP, Tung CS, Yen MH: Cardiovascular effects of
nitric oxide in the brain stem nuclei of rats
Hypertension, 1996; 27: 36-42
93. Unger T, Rettig R: Development of Genetic Hypertension: Is there a “Critical
Phase”?
Hypertension, 1990; 16: 615-616
94. Vidal MJ, Romero JC, Vanhoutte PM: Endothelium-derived relaxing factor
inhibits renin release
Eur. J. Pharmacol., 1988; 149: 401-402
95. Vincent SR, Kimura H: Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat
brain
Neuroscience, 1992; 46: 755-784
96. Ward LE, Hunter LW, Grabau CE, Tyce GM, Rorie DK: Nitric oxide reduces
basal efflux of catecholamines from perfused dog adrenal glands
J. Auton. Nerv. Syst., 1996; 61: 235-242
97. Yamamoto R, Wada A, Asada Y, Niina H, Sumiyoshi A: N-Nitro-L-arginine, an
inhibitor of nitric oxide synthesis, decreases noradrenaline outflow in rat isolated
perfused mesenteric vasculature
Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 1993; 347: 238-240
7. Literatur 61
98. Yamori Y: Overview: studies from spontaneous hypertension: Development from
animal models toward man
Clin. Exp. Hypertens., 1991; 13: 631-644
99. Yamori Y, Lovenberg W: Spontaneously hypertensive rats
Hypertension, 1987; 9 (Suppl. 1): I13-I14
100. Yasin S, Costa A, Trainer P, Windle R, Forsling ML, Grossman A: Nitric oxide
modulates the release of vasopressin from rat hypothalamic explants
Endocrinology, 1993; 133: 1466-1469
101. Zhang K, Mayhan WG, Patel KP: Nitric oxide within the paraventricular nucleus
mediates changes in renal sympathetic nerve activity
Am. J. Physiol., 1997; 273: R864-R872
102. Zhang K, Patel KP: Effects of nitric oxide within the paraventricular nucleus on
renal sympathetic nerve discharge: Role of GABA
Am. J. Physiol., 1998; 275: R728-R734
103. Zicha J, Kunes J: Ontogenetic aspects of hypertension development: Analysis in the
rat
Physiol. Rev., 1999; 79: 1227-1282
8. Danksagung 62
8. Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Peter Dominiak danke ich für die Überlassung des Themas der
Dissertation und für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe sowie für die wissenschaftliche
Unterstützung.
Ebenso bedanke ich mich ganz herzlich bei Frau Dr. Fatimunnisa Qadri für die optimale
und umfassende Betreuung, die konstruktiven Ratschläge und die experimentellen
Planungen sowie für die Hilfe bei Ausarbeitung und Gestaltung dieses Manuskriptes.
Bei allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Institutes für experimentelle und klinische
Pharmakologie und Toxikologie möchte ich mich für ihre kollegiale Zusammenarbeit
bedanken. Insbesondere danke ich Frau Antje Winter-Keil und Herrn Klaus Tempel für
ihre freundliche Unterstützung im Labor.
9. Lebenslauf 63
9. Lebenslauf
PERSÖNLICHE ANGABEN
Name: Thomas ArensFamilienstand: ledigStaatsangehörigkeit: deutschGeburtsdatum: 27.12.1974Geburtsort: DortmundEltern: Dr. med. Klaus-Joachim Arens, Internist
Eva-Maria Arens, Hausfrau
AUSBILDUNG
August 1985 – Juni 1994Stadtgymnasium Dortmund Abitur in den Fächern Physik, Mathematik, Italienisch und Sozial-
wissenschaften
Oktober 1994 – Oktober 2001Medizinische Universität zu Lübeck
September 1996: Physikum August 1997: 1. Staatsexamen April 2000: 2. Staatsexamen Mai 2001: 3. Staatsexamen Mai-Oktober 2001 Promotionssemester
BERUFSERFAHRUNG
Februar 1997 – März 1997Krankenhaus Lünen-Brambauer GmbH Famulatur, Chirurgie, Dr. med. F. W. Krause-Brennecke
Allgemeinchirurgische Abteilung
September 1997 – Oktober 1997Städtische Kliniken Dortmund Famulatur, Klinik für Innere Medizin, Prof. Dr. med. B. Angelkort
Fach-Station Endokrinologie, Diabetes-Einstellung
März 1998 – April 1998Medizinische Universität zu Lübeck Famulatur, Institut für klinische und experimentelle Pharmakologie
und Toxikologie, Prof. Dr. med. P. DominiakImmunhistochemie, Enzym-Assay, Western Blot
9. Lebenslauf 64
Juli 1999 – August 1999Gemeinschaftspraxis Dres. med. Kukulies, Erwe und Itter,Dortmund Famulatur, Diagnostische Radiologie
Digital-Röntgen, Sonographie, CT, MRT, PET, SPECT,Szintigraphie
April 2000 – Juni 2000Medizinische Universität zu Lübeck PJ, Chirurgie, Prof. Dr. med. H.-P. Bruch
Abteilung Viszeral-Chirurgie, Stationsorganisation, OP-Assistenz
Juni 2000 – August 2000Louisiana State University, New Orleans, USA PJ, Chirurgie, Prof. Dr. med. J. P. O’Leary
Unfallchirurgie, Plastische Chirurgie
August 2000 – November 2000Kantonsspital Glarus, Schweiz PJ, Innere Medizin, Prof. Dr. med. K. Rhyner
Selbstständige Patientenversorgung und Dokumentation,Wochenenddienste
November 2000 – März 2001Medizinische Universität zu Lübeck PJ, Radiologie, Prof. Dr. med. H. D. Weiss
Röntgen, Sonographie, CT, MRT,Kolloquien in Neuro- und Kinderradiologie
November 2001 – April 2003St.-Franziskus-Hospital, Köln Arzt im Praktikum, Innere Medizin, Prof. Dr. med. Sawicki
Stationsversorgung, Nacht- und Wochenenddienste, Mitglied derEBM-Arbeitsgruppe
seit Mai 2003Lukaskrankenhaus GmbH, Neuss Assistenzarzt, Radiologie und Nuklearmedizin, Prof. Dr. med.
KösterWeiterbildung zum Facharzt für Diagnostische Radiologie
SprachkenntnisseDeutsch MutterspracheEnglisch fließendItalienisch fließendLatein LatinumAlt-Griechisch Graecum
10. Veröffentlichungen zum Thema der Dissertation 65
10. Veröffentlichungen zum Thema der Dissertation
10.1 Originalmitteilungen
1. Qadri F., Arens T., Schwartz E.-C., Häuser W., Dominiak P.:
Angiotensin-converting enzyme inhibitors and AT1-receptor antagonist restore nitric
oxide synthase (NOS) activity and neuronal NOS expression in the adrenal glands of
spontaneously hypertensive rats
Jpn. J. Pharmacol., 2001; 85: 365 – 369
2. Qadri F., Arens T., Schwartz E.-C., Häuser W., Dendorfer A., Dominiak P.:
Brain nitric oxide synthase activity in spontaneously hypertensive rats during
development of hypertension
J. Hypertens., 2003; 21: 1687-1694
10.2 Kongressbeiträge
1. Posterpräsentation, „15. International Conference on Kinins“ in Nara (Japan),1998:
F. Qadri, L. Bäurle, E.-C. Schwartz, T. Arens and P. Dominiak:
Differential distribution of bradykinin and angiotensin-induced expression of c-fos
gene in the brain of wistar-kyoto (WKY) rats
2. Posterpräsentation, Jahrestagung der Deutschen Liga zur Bekämpfung deshohen Blutdrucks in Karlsruhe, 1999:
T. Arens, F. Qadri, E.-C. Schwartz, W. Häuser und P. Dominiak:
Effekt von Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Systems auf die Aktivität der Stickoxid
Synthase im Gehirn von spontan hypertensiven Ratten
3. Posterpräsentation, Jahrestagung der Deutschen Liga zur Bekämpfung deshohen Blutdrucks in Heidelberg, 2000:
F. Qadri, T. Arens, E.-C. Schwartz, W. Häuser und P. Dominiak:
Impaired synthesis of nitric oxide in the adrenal gland may cause hypertension in
spontaneously hypertensive rats
10. Veröffentlichungen zum Thema der Dissertation 66
4. Posterpräsentation, Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Pharmakologieund Toxikologie in Mainz, 2000:
F. Qadri, T. Arens, E.-C. Schwartz, W. Häuser und P. Dominiak:
Impaired synthesis of nitric oxide in the adrenal gland may cause hypertension in
spontaneously hypertensive rats
5. Posterpräsentation, Kongreß ISH in Chicago (USA), 2000:
F. Qadri, T. Arens, E.-C. Schwartz, W. Häuser und P. Dominiak:
Impaired synthesis of nitric oxide in the adrenal gland may cause hypertension in
spontaneously hypertensive rats
