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Tierärztliche Hochschule Hannover Physiologisches Institut Bedeutung von Kalium und Insulin für die Motilität der Labmagenmuskulatur INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Gesche Türck, geb. Onken aus Hamburg Hannover 2009

Tierärztliche Hochschule Hannover Physiologisches Institut ... · 2.1.3 Glatte Muskelzellen ( Textus muscularis nonstriatus ) Die glatte Muskulatur erhielt ihren Namen durch das

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Physiologisches Institut

Bedeutung von Kalium und Insulin für die Motilität der

Labmagenmuskulatur

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Gesche Türck, geb. Onken

aus Hamburg

Hannover 2009

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. S. Leonhard-Marek

1. Gutachter: PD Dr. S. Leonhard-Marek

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Rehage

Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2009

Diese Arbeit wurde mit finanziellen Mitteln der H. Wilhelm Schaumann Stiftung (Gesche Türck) und

der Deutschen Forschungsgemeinschaft (LE 824/4 und 5) durchgeführt.

Für Nils, Matti und die Hühner

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung........................................................................................................... 11

2 Literaturübersicht............................................................................................... 13

2.1 Der Labmagen ........................................................................................... 13

2.1.1 Anatomie des Labmagens .................................................................. 13

2.1.2 Enterisches Nervensystem ................................................................. 14

2.1.3 Glatte Muskelzellen (Textus muscularis nonstriatus) .......................... 14

2.1.4 Kontraktionsmechanismus .................................................................. 15

2.1.5 Labmagenmotilität............................................................................... 16

2.1.5.1 Physiologie der Labmagenmotilität .............................................. 16

2.1.5.2 Labmagenverlagerung ................................................................. 17

2.2 Kalium ........................................................................................................ 18

2.2.1 Kaliumhomöostase.............................................................................. 18

2.2.1.1 Aufnahme und Elimination ........................................................... 19

2.2.1.2 Verteilung zwischen Intra- und Extrazellulärraum........................ 20

2.2.1.3 Imbalancen im Kaliumhaushalt .................................................... 21

2.2.1.3.1 Hypokaliämie ............................................................................ 21

2.2.1.3.2 Hyperkaliämie ........................................................................... 22

2.2.2 Regulation des Kaliumhaushaltes....................................................... 23

2.3 Insulin......................................................................................................... 25

2.3.1 Insulinhomöostase .............................................................................. 25

2.3.1.1 Struktur und Biosynthese von Insulin........................................... 26

2.3.1.2 Sekretion und Abbau von Insulin ................................................. 27

2.3.1.3 Signaltransduktion am Erfolgsorgan ............................................ 29

2.3.2 Insulinresistenzphänomen .................................................................. 30

2.3.3 Beeinflussung der Labmagenmotilität durch Insulin ............................ 36

2.4 Hypothese .................................................................................................. 37

Inhaltsverzeichnis

3 Material und Methoden...................................................................................... 38

3.1 In-vitro-Motilitätsmessung der Labmagenmuskulatur ................................. 38

3.1.1 Versuchstiere ...................................................................................... 38

3.1.2 Entnahme der Muskelstreifen.............................................................. 38

3.1.3 Präparation der Zirkulär- und Längsmuskelstreifen............................. 38

3.1.4 Messung der mechanischen Aktivität der Muskelstreifen.................... 39

3.1.4.1 Versuchsvorrichtung .................................................................... 39

3.1.4.2 Versuchsschemata ...................................................................... 40

3.1.4.3 Motilitätsparameter ...................................................................... 41

3.2 In-vivo-Versuch: Bestimmung des Labmageneffluxes bei intravenöser

Applikation von Insulin und Kalium ....................................................................... 41

3.2.1 Versuchstiere ...................................................................................... 41

3.2.2 Versuchsaufbau .................................................................................. 43

3.2.2.1 Vorbereitung der Versuchstiere ................................................... 43

3.2.2.2 Vorbereitung der Infusionslösungen ............................................ 43

3.2.2.3 Ablauf des hyperinsulinämischen, euglykämischen Clamptests mit

gleichzeitiger Labmageneffluxmessung......................................................... 44

3.2.3 Analysen ............................................................................................. 45

3.2.3.1 Insulin........................................................................................... 45

3.2.3.2 Kalium.......................................................................................... 46

3.2.3.3 Chrom .......................................................................................... 46

3.2.3.4 Berechnung des Labmageneffluxes............................................. 47

3.3 Statistik....................................................................................................... 49

4 Ergebnisse ........................................................................................................ 50

4.1 In-vitro-Versuch.......................................................................................... 50

4.1.1 Aktivität der circulären Corpusmuskulatur........................................... 50

4.1.1.1 Basale Aktivität der circulären Corpusmuskulatur........................ 50

4.1.1.2 Wirkung steigender Kaliumgaben auf die circuläre

Corpusmuskulatur.......................................................................................... 53

4.1.1.3 Wirkung steigender Insulingaben auf die circuläre

Corpusmuskulatur.......................................................................................... 62

Inhaltsverzeichnis

4.1.1.4 Wirkung von Insulin bei steigenden Kaliumgaben auf die circuläre

Corpusmuskulatur.......................................................................................... 67

4.1.1.5 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Barium ......................... 71

4.1.1.6 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Glybenclamid ............... 74

4.1.1.7 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Ouabain ....................... 76

4.1.2 Aktivität der circulären Pylorusmuskulatur .......................................... 78

4.1.2.1 Basale Aktivität der circulären Pylorusmuskulatur ....................... 78

4.1.2.2 Wirkung steigender Kaliumgaben auf die circuläre

Pylorusmuskulatur ......................................................................................... 81

4.1.2.3 Wirkung steigender Insulingaben auf die circuläre

Pylorusmuskulatur ......................................................................................... 89

4.1.3 Aktivität der longitudinalen Corpusmuskulatur .................................... 97

4.1.3.1 Wirkung steigender Insulingaben auf die longitudinale

Corpusmuskulatur.......................................................................................... 97

4.2 In-vivo-Versuch .......................................................................................... 99

4.2.1 Insulinkonzentrationen ...................................................................... 100

4.2.2 Kaliumkonzentrationen...................................................................... 101

4.2.3 Labmagenefflux................................................................................. 104

5 Diskussion ....................................................................................................... 107

5.1 In-vitro-Versuch........................................................................................ 107

5.1.1 Reaktionen isolierter Labmagenmuskulatur auf Änderungen der

extrazellulären Kaliumkonzentration................................................................ 108

5.1.2 Reaktionen isolierter Labmagenmuskulatur auf Änderungen der

extrazellulären Insulinkonzentration ................................................................ 110

5.1.2.1 Keine Reaktion der Muskulatur auf Insulingaben....................... 111

5.1.2.2 Stimulation der Muskulatur durch Insulingaben ......................... 111

5.1.2.3 Hemmung der Muskulatur durch Insulingaben........................... 111

5.1.2.4 Mechanismen der Insulinhemmung ........................................... 113

5.1.2.4.1 Wirkung von Kalium in Anwesenheit von Insulin..................... 113

5.1.2.4.2 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Barium .................... 114

5.1.2.4.3 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Glybenclamid.......... 115

Inhaltsverzeichnis

5.1.2.4.4 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Ouabain .................. 116

5.1.2.4.5 Zusammenfassung der möglichen Mechanismen................... 116

5.2 In-vivo-Versuch ........................................................................................ 117

5.2.1 Insulinkonzentrationen ...................................................................... 118

5.2.2 Kaliumkonzentrationen...................................................................... 119

5.2.3 Efflux ................................................................................................. 121

5.2.3.1 Diskussion der Methode............................................................. 121

5.2.3.2 Diskussion der Ergebnisse......................................................... 121

6 Schlussfolgerungen......................................................................................... 124

7 Zusammenfassung.......................................................................................... 126

8 Summary ......................................................................................................... 129

9 Literaturverzeichnis ......................................................................................... 131

10 Anhang............................................................................................................ 168

10.1 Versuchsschemata................................................................................... 168

10.1.1 Kalium ............................................................................................... 168

10.1.2 Insulin................................................................................................ 169

10.1.3 Weiterführende Untersuchungen ...................................................... 170

10.2 Verlauf der Blutglukosekonzentration im In-vivo-Versuch ........................ 172

10.3 Verwendete Substanzen .......................................................................... 172

10.3.1 In-vitro-Versuch................................................................................. 172

10.3.2 In-vivo-Versuch ................................................................................. 173

11 Danksagung .................................................................................................... 175

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celcius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µU Mikrounits

a. p. ante partum

ATP Adenosin 5'-Triphosphat

C Kohlenstoff

Ca2+ Kalzium

CaCl2 Kalziumchlorid

Cl- Chlor

cm Zentimeter

CO2 Kohlenstoffdioxid

Cr3+ Chrom

CrCl3 Chromchlorid

d Tag

dest. destilliert

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ENS Enterisches Nervensystem

g Gramm

GLUT Glucosetransporter

Glyb. Glybenclamid

ICC Interstitielle Zellen nach Cajal

Ins. Insulin

h Stunde

h2 Heritabilität

H2SO4 Schwefelsäure

HCl Salzsäure

HCO3- Bicarbonat

I. E. Internationale Einheiten

Abkürzungsverzeichnis

K+ Kalium

KCl Kaliumchlorid

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

l Liter

LMV Labmagenverlagerung

MgCl2 Magnesiumchlorid

min Minute

ml Milliliter

mM Millimolar

mmol Millimol

mN Millinewton

mU Milliunits

Na+ Natrium

NaCl Natriumchlorid

NaHCO3 Natriumbicarbonat

NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat

NEFA Non esterified fatty acid

Ouab. Ouabain

O2 Sauerstoff

p.p. post partum

rpm rounds per minute

SGK 1 serum and glucocorticoid-inducible kinase

SSIK steady-state Insulinkonzentration

U Units

VIP Vasoaktives Intestinales Polypeptid

ZNS Zentralnervensystem

Einleitung 11

1 Einleitung

Die Labmagenverlagerung ist eine der häufigsten und bedeutsamsten Erkrankungen

hochleistender Milchkühe in der Frühlaktation. Aufgrund von Tierarztkosten,

Milcheinbußen, Fruchtbarkeitsstörungen und Tierverlusten entstehen zum Teil

erhebliche wirtschaftliche Schäden (GEISHAUSER et al. 2000). Die Pathogenese

dieser Erkrankung ist bislang nur unzureichend geklärt. Neben verschiedenen

anderen Faktoren wird eine Beteiligung von Imbalancen in der Kalium- und

Insulinhomöostase an der Entstehung der Labmagenverlagerung diskutiert.

Kalium wird mit der Nahrung aufgenommen und v. a. über die Niere, aber auch über

die Milch abgegeben. Es spielt eine wichtige Rolle in der Entstehung und

Aufrechterhaltung des Ruhemembranpotentials und ist somit maßgeblich an der

Erregbarkeit von Muskeln und Nerven beteiligt. Während hohe

Kaliumkonzentrationen schnell zum Tod des Tieres führen, kommt es durch lang

andauernde niedrige Kaliumwerte im Blut zu einer schlechten Entwicklung und einer

geringen Leistungsbereitschaft, ohne dass bereits die typischen Symptome einer

Hypokaliämie, wie z. B. Muskellähmungen auftreten (ROBERTS u. OMER 1965;

TELLE et al. 1964). Niedrige Blutkaliumspiegel stellen sich v. a. bei reduzierter oder

absolut eingestellter Futteraufnahme ein (RABINOWITZ et al. 1988), was u. a.

infolge von Labmagenverlagerungen beobachtet wird, treten aber auch im

Zusammenhang mit hohen Insulinkonzentrationen im Blut auf, da Insulin die

Aufnahme von Kalium in die Körperzellen fördert (VAN MEIRHAEGHE 1988).

Hyperinsulinämien werden sehr häufig im Zusammenhang mit

Labmagenverlagerungen beobachtet (OK et al. 2000). Ob die Insulinwerte allerdings

bereits vor der Labmagenverlagerung ansteigen oder dies eine Folge der Erkrankung

ist, ist noch nicht abschließend geklärt. Fest steht jedoch, dass Insulin nicht nur einen

hemmenden Einfluss auf den Labmagenefflux hat (HOLTENIUS et al. 2000),

sondern dass es auch bei Kühen mit anhaltend hohen Insulinspiegeln post

operationem zu verlängerten Motilitätsstörungen des Labmagens kommt

(PRAVETTONI et al. 2004).

12 Einleitung

Aufgrund der postpartalen und in besonderem Maße mit Labmagenverlagerungen

beobachteten Kalium- und Insulinimbalancen und der gegenseitigen Beeinflussung

dieser Faktoren ist es das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von Insulin und Kalium auf

die Motilität der Labmagenmuskulatur durch Untersuchungen in-vitro und in-vivo

darzustellen und zu klären, inwiefern eine mögliche hemmende Wirkung des Insulins

auf veränderte Kaliumgradienten an der glatten Muskulatur zurückzuführen ist.

Literaturübersicht 13

2 Literaturübersicht

2.1 Der Labmagen

2.1.1 Anatomie des Labmagens

Der rechts vom Pansen gelegene Labmagen besteht aus drei Teilen: Fundus,

Corpus und Pars pylorica. Während sich der dilatierte Fundus nahezu in der

Medianen direkt kaudal der Haube befindet, schiebt sich das eher konische Corpus

hinter und unter den Blättermagen und wendet sich nach rechts. Die Pars pylorica

zieht im Bereich des rechten Rippenbogens nach dorsal und geht schließlich am

Musculus sphincter pylori in das Duodenum über (VOLLMERHAUS u. ROOS 1999).

Über das Omentum minus ist der Labmagen mit der ventralen, über das Omentum

majus mit der dorsalen Bauchwand verbunden (KÖNIG et al. 1999). Die

Labmagenwand besteht aus fünf verschiedenen Schichten:

• Tunica serosa

• Tela subserosa

• Tunica muscularis

- Longitudinale Muskulatur

- Zirkuläre Muskulatur

• Tela submucosa

• Tunica mucosa (LIEBICH 1999).

Die Tunica muscularis besteht aus zwei Lagen glatter Muskulatur. Die äußere

Längsmuskulatur zieht vom Blättermagen her den gesamten Labmagen entlang, wird

in der Pars pylorica kräftiger und geht letztlich nahtlos ins Duodenum über. Auch die

innere Ringmuskulatur ist Bestandteil aller drei Labmagenabschnitte und bildet,

bevor auch sie in den Dünndarm übergeht, den Musculus sphincter pylori

(VOLLMERHAUS u. ROOS 1999). Die Innervation des Labmagens ist vegetativ. Der

Plexus coeliacus entlässt sympathische Fasern, die u. a. den Plexus gastricus

bilden, der die sympathische Versorgung des Labmagens übernimmt. Die

parasympathischen Äste entstammen dem Nervus vagus und zwar sowohl aus dem

dorsalen als auch aus dem ventralen Truncus vagalis (KÖNIG et al. 1999).

14 Literaturübersicht

2.1.2 Enterisches Nervensystem

Das in der Wand des Magen-Darmtrakts lokalisierte enterische Nervensystem

verfügt über eigene sensorische Neurone, Interneurone und Motoneurone, so dass

es in der Lage ist, Reflexe (wie z. B. den Transport des Chymus durch Kontraktion

oral gelegener Muskulatur bei gleichzeitiger aboraler Relaxation) unabhängig vom

ZNS oder dem vegetativen Nervensystem zu vermitteln (GERSHON et al. 1994).

Sensorische Neurone registrieren über Chemo- oder Mechanorezeptoren

verschiedene Stimuli wie Nährstoffgehalt, Osmolarität oder pH-Wert bzw.

Wandspannung, intraluminale Drücke, Scherreize oder Volumenänderungen (WOOD

1994). Vermutlich kodieren dabei afferente Nervenzellen lediglich die sensorischen

Stimuli, während die Aufgabe der eigentlichen Sensorfunktion anderen Zellen, z. B.

enterochromaffinen Zellen, obliegt (SCHEMANN 2000). Interneurone stellen die

Kommunikation innerhalb des enterischen Nervensystems sicher (WOOD 1994). Die

hemmenden und erregenden Motoneurone schließlich modulieren Effektoren, wie die

glatte Muskulatur (vor allem über ICC, interstitielle Zellen nach Cajal), sekretorische

Zellen oder Blutgefäße (WOOD 1994). Bis heute sind über 20 Neurotransmitter und

noch mehr Neuromodulatoren identifiziert, die an der Vermittlung der synaptischen

Vorgänge im enterischen Nervensystem beteiligt sind (MC CONALOGUE u.

FURNESS 1994).

2.1.3 Glatte Muskelzellen (Textus muscularis nonstriatus)

Die glatte Muskulatur erhielt ihren Namen durch das Fehlen einer erkennbaren

geordneten Myofibrillenstruktur. Bei den in der Labmagenwand vorkommenden

glatten Muskelzellen handelt es sich um den „Single-unit“-Muskeltyp, bei dem die

Zellen über sogenannte Nexus (gap junctions) in direkter Verbindung stehen

(LIEBICH 1999).

Der Zellkern befindet sich stets zentral im Sarkoplasma, das neben zahlreichen

Sarkosomen auch ein unterschiedlich stark ausgebildetes sarkoplasmatisches

Retikulum enthält, das als Kalziumspeicher dient (LIEBICH 1999). Nicht kontraktile

intermediäre Mikrofilamente (Desmin) bilden das Zytoskelett der Zelle. Die

Myofilamente (Aktin-, Myosin- und Intermediärfilamente) verlaufen netzartig ohne

Literaturübersicht 15

erkennbare regelmäßige Anordnung. Während die Aktin- und Intermediärfilamente

an sogenannten Haftplatten inserieren, bestehen die Myosinfilamente aus löslichen

Proteinen, die sich während der Kontraktion verdichten, so dass die Aktinfilamente

über sie hinweggleiten können (RÜEGG 2000). Auf der Oberfläche der glatten

Muskelzelle befindet sich ein Netz aus überwiegend Kollagen- und Retikulinfasern, in

dem auch Fasern des ENS verlaufen. Diese ziehen direkt an das Plasmalemm der

Muskelzelle, die auf der Zelloberfläche eine Vielzahl von adrenergen und cholinergen

Rezeptoren aufweist.

2.1.4 Kontraktionsmechanismus

Bei einer Erregung der glatten Muskelzelle erhöht sich die intrazelluläre

Kalziumkonzentration einerseits transient durch einen Einstrom von Kalzium über

rezeptorgesteuerte Kanäle und durch eine IP3-vermittelte Freisetzung von

Kalziumionen aus dem sarkoplasmatischen Retikulum und andererseits langfristig

durch Öffnen spannungsabhängiger Kalziumkanäle. Kalmodulin bindet das Kalzium

und kann nun zum einen die Myosin-Kinase, die ihrerseits durch Phosphorylierung

der Myosinfilamente die Myosin-ATPase aktiviert, und zum anderen eine

Proteinkinase aktivieren, die das Hemmprotein Caldesmon der Myosinbindungsstelle

des Aktins phosphoryliert und somit eine Bindung an den Kalzium-Kalmodulin-

Komplex ermöglicht (RÜEGG 2000). In der Folge kommt es zu einer Interaktion

zwischen Aktin und Myosin, wobei die so gebildeten Myosinquerbrücken unter ATP-

Spaltung zyklisch tätig sind. Die Trennung der Filamente erfolgt durch Abkopplung

der an das Myosin angehängten Phosphatgruppen durch die Myosinphosphatase.

Bei der Muskelrelaxation wird Kalzium in das sarkoplasmatische Retikulum

zurückgepumpt und durch ATP-getriebene Kalziumpumpen und Na+/Ca2+-

Austauscher in den Extrazellulärraum befördert (SOMLYO u. SOMLYO 1994).

Bei den glatten Muskelzellen vom single-unit-Typ entstehen die zur Kontraktion

führenden Aktionspotentiale nicht neurogen sondern myogen in sogenannten

Schrittmacherzellen, den interstitiellen Zellen nach Cajal (ICC) (SANDER 1996). Man

unterscheidet zwei ICC-Typen: ICC-MY, die zwischen Zirkulär- und Längsmuskulatur

anzutreffen sind, und die ICC-IM, die innerhalb der Muskelbündel liegen (BURNS et

al. 1995). ICC haben kein gleichbleibendes Ruhepotential sondern weisen langsame

16 Literaturübersicht

rhythmische Schwankungen auf (SANDER 1996). Verantwortlich für die Entstehung

dieser sogenannten slow waves ist die Erhöhung der intrazellulären

Kalziumkonzentration, die u. a. auf einer Freisetzung aus den Mitochondrien beruht,

da eine Hemmung mitochondrialer Aktivität die Frequenz der slow waves reduziert

(SUZUKI et al. 2006). Slow waves führen bei den ICC zu schnellen Depolarisationen

mit anschließender Plateauphase, aber nicht zwangsläufig zu Kontraktionen der

glatten Muskelzellen. Allerdings konnte eine positive Korrelation zwischen der

Amplitudenhöhe der slow waves und dem Auftreten von Kontraktionen der zirkulären

Muskelschicht festgestellt werden (THUNEBERG 1989). Kommt es jedoch

Acetylcholin-vermittelt zu einem extrazellulären Kalziumeintritt in die

Schrittmacherzelle, folgt eine Depolarisation mit einem weiteren Einstrom von

Kalzium durch potentialgesteuerte Kanäle, was zu einer Erhöhung und Verbreiterung

des Plateaus führt. Die Dauer des Plateaus bestimmt die Dauer der Kontraktion

(EHRLEIN 2000).

Über die gap junctions (Nexus) genannten niederohmigen Zellkontakte kann sich die

Depolarisation einer bereits erregten Zelle elektrotonisch auf benachbarte

Muskelzellen übertragen (KOMURO et al. 1999). Sobald deren Membran durch den

lokal über die gap junctions fließenden Strom bis zur Schwelle der

spannungsabhängigen Kalziumkanäle depolarisiert ist, erfolgt ein Aktionspotential,

das daraufhin weitere elektrotonisch gekoppelte Muskelzellen erregt (RÜEGG 2000).

2.1.5 Labmagenmotilität

2.1.5.1 Physiologie der Labmagenmotilität

Unter dem Aspekt der motorischen Funktion wird am Labmagen ein Magenspeicher

und eine Magenpumpe unterschieden. Die Motorik des Labmagens besteht aus

Spannungsänderungen des Magenspeichers und peristaltischen Wellen, die am

Magenkörper beginnen und zum Pylorus hin verlaufen. Im Bereich des

Magenspeichers sind sie jedoch nur schwach an der Oberfläche bemerkbar, an der

Magenpumpe hingegen werden sie zu stärkeren Einschnürungen, die sich in Ringen

auf den Pylorus zubewegen (PFEFFER 1987). Bei dem Entleerungsmechanismus

der Magenpumpe können drei Phasen unterschieden werden:

Literaturübersicht 17

1. Phase des Vorschubs: während des Ablaufs der peristaltischen Wellen über

die proximale Magenpumpe erschlafft der zuvor kontrahierte distale Abschnitt

(EHRLEIN 2000).

2. Phase der Entleerung und Durchmischung: Erreichen die Wellen die Mitte der

Magenpumpe, öffnet der M. sphincter pylori reflektorisch, während er sich bei

Ankunft der Kontraktionen am Sphincter bereits verschlossen hat (HILL 1969),

der Mageninhalt wird also nicht in den Darm gepresst, sondern gespült.

3. Phase der Rücktreibung und Zerkleinerung: durch den nicht vollständigen

Verschluss am mittleren Abschnitt der Magenpumpe, kommt es zu einem

Rückfluss von Chymus in den proximalen Teil (EHRLEIN 2000).

Diese Phasen treten aufgrund der den peristaltischen Wellen zu Grunde liegenden

slow waves zwar im Allgemeinen zyklisch ein, werden jedoch in erster Linie durch

vago-vagale Reflexschaltkreise moduliert (COTTRELL u. STANLEY 1992;

COTTRELL 1994). Die abomasale Effluxmenge ist durch Auslösung dieser Reflexe

u. a. abhängig von der Relaxation des Magenspeichers, der Einschnürungstiefe der

peristaltischen Wellen, der Weite des Pylorus, der rezeptiven Erschlaffung des

Duodenums, der Art der Duodenalkontraktionen und der Intensität der Fütterung

(MALBER u. RUCKEBUSCH 1991; LESTER u. BOLTON 1994). Zu einem

verzögerten Übertritt von Chymus ins Duodenum kommt es z. B. durch eine

langandauernde Erschlaffung des Magenspeichers, eine geringe Einschnürungstiefe

der Kontraktionen, eine ungenügende Relaxation von M. sphincter pylori oder

Duodenum und eine geringe Aktivität der duodenalen Muskelkontraktionen, die den

Chymus von oral nach aboral transportieren (EHRLEIN 2000). Neben der Aktivität

der Muskulatur des Magens selber ist also auch die des Dünndarms von Bedeutung

für die Entleerung des Magens (VAUPEL 2000).

2.1.5.2 Labmagenverlagerung

Das Krankheitsbild der Labmagenverlagerung wurde 1950 das erste Mal an einem

sechs Jahre alten Shorthorn-Rind (FORD 1950) beschrieben und tritt seither

zunehmend häufiger vor allem bei hochleistenden Milchrindern in den ersten

Wochen nach der Abkalbung auf (CONSTABLE et al. 1992). Als wesentliche, die

Entstehung der Labmagenverlagerung bedingende Voraussetzung gilt eine

18 Literaturübersicht

abomasale Gasansammlung in Kombination mit einer Atonie der

Labmagenmuskulatur bei ausreichendem abdominalen Platzangebot (z. B.

großrahmige Tiere) (GEISHAUSER 1995; STÖBER u. SARATSIS 1974). Die

ursächlichen Faktoren für die Entstehung von Gas und verminderter Motorik sind

jedoch bislang nur unzureichend geklärt, vermutet wird ein multifaktorielles

Geschehen. Als mögliche Auslöser der Atonien der Labmagenmuskulatur werden

neben hohen Plasmakonzentrationen an kurzkettigen Fettsäuren (LE BLANC et al.

2005; ZADNIK 2003), Ketonkörpern (ROHRBACH et al. 1999), Hypokalzämien

(DANIEL 1983), Endotoxinen (ROHRBACH et al. 1999; VLAMINCK et al. 1985),

Alkalosen (POULSEN 1976) und Hyperglykämien (HOLTENIUS et al. 2000) auch

hohe Insulinkonzentrationen im Zuge von Insulinresistenzen diskutiert (VAN

MEIRHAEGHE et al. 1988 a). Außerdem werden im Zusammenhang mit

Labmagenverlagerungen häufig niedrige Kaliumkonzentration im Blut nachgewiesen

(ESPERSEN u. SIMENSEN 1961), die durch reduzierte Nahrungsaufnahme

(RABINOWITZ et al. 1988), hohe Insulinkonzentrationen (VAN MEIRHAEGHE 1988)

und/oder abomasalen Reflux mit folgender Alkalose bedingt sein können (ROSSOW

1995).

Die Rollen von Kalium und Insulin im Stoffwechselgeschehen mit Hinblick auf eine

mögliche Beteiligung an der Pathogenese der Labmagenverlagerung werden im

Folgenden ausgeführt.

2.2 Kalium

2.2.1 Kaliumhomöostase

Kalium ist ein starker Elektrolyt, der in wässriger Lösung vollständig ionisiert vorliegt

und aufgrund seiner geringen Tendenz, Komplexe zu bilden, im Körper vorwiegend

dem Transport von Ladungen dient. Als monovalentes Kation spielt es eine

bedeutende Rolle in der Entstehung und Aufrechterhaltung des

Ruhemembranpotentials und somit in der neuromuskulären Erregbarkeit (PETRIDES

1997).

Die Referenzwerte der Plasma-Kaliumkonzentrationen beim Rind werden mit 3,5 bis

5,0 mmol/l (VETMEDLABOR 2007; SEJERSTED u. SJOGAARD 2000), bzw. mit 4,0

Literaturübersicht 19

bis 5,0 mmol/l (STÖBER u. GRÜNDER 1990) angegeben. Allerdings befinden sich

nur ca. zwei Prozent des Kaliums in der extrazellulären Flüssigkeit, so dass die

Kaliumwerte im Plasma nicht unbedingt die Gesamtsituation im

Stoffwechselgeschehen wiederspiegeln (BROBST 1986). Die große Mehrheit des

Kaliumgehaltes im Körper befindet sich im intrazellulären Bereich, vor allem in den

Skelettmuskelzellen, wo Kalium in Konzentrationen von ungefähr 120 – 140 mmol/l

vorliegt (SEJERSTED u. SJOGAARD 2000). Demzufolge können Diffusionsprozesse

den Kaliumgehalt im Plasma grundsätzlich beeinflussen. Die Konzentration von

Kalium im Plasma wird also durch zwei Komponenten bestimmt: die äußere (die

Differenz zwischen Aufnahme und Elimination) und die innere Kaliumbalance (die

Verlagerung der Ionen zwischen Intra- und Extrazellulärflüssigkeit) (BROBST 1986).

2.2.1.1 Aufnahme und Elimination

Kalium wird mit der Nahrung aufgenommen, wobei der Gehalt im Futter bei

laktierenden Kühen 0,8 % und bei güsten Tieren 0,5 % in der Trockenmasse

betragen sollte. Bei Nicht-Wiederkäuern wird über 85 % des mit der Nahrung

aufgenommenen Kaliums resorbiert, vorwiegend im Dünndarm und parazellulär

mittels solvent drag aufgrund der großen Durchlässigkeit der Zonulae occludentes

(FROMM u. HIERHOLZER 2000). Auch bei Kühen werden zwischen 72 und 97 %

des aufgenommenen Kaliums resorbiert (KHORASANI et al 1997; BANNINK et al.

1999), wobei bei hohem Kaliumangebot im Futter auch präduodenale Bereiche zur

Resorption beitragen können. Kalium wird bei laktierenden Kühen zu 75 % mit dem

Urin, zu 13 % mit dem Kot und zu 12 % mit der Milch ausgeschieden (WARD 1966),

bei nicht laktierenden Schafen werden 90 % des aufgenommenen Kaliums über die

Nieren ausgeschieden (DEWHURST et al. 1968). Die Höhe der Kaliumexkretion

steht in engem Zusammenhang mit der Nahrungsaufnahme. RABINOWITZ et

al. (1988) konnten zeigen, dass es bei Schafen nach der Fütterung zu einer

gesteigerten Kaliumausscheidung kam, wobei die Kaliumkonzentration im Urin umso

größer war, je mehr Kalium mit dem Futter aufgenommen wurde. An Tagen, an

denen die Tiere nicht gefüttert wurden, blieb der Peak in der Kaliumexkretion aus.

In der Niere wird Kalium in den Glomerula filtriert und der größte Teil im proximalen

Tubulus und der Henle-Schleife wieder resorbiert, um schließlich in die Lumina der

20 Literaturübersicht

distalen Tubuli und der Sammelgänge sezerniert zu werden. Die Exkretion ist ein

aktiver ATP-abhängiger Austausch gegen Natrium bzw. Wasserstoff (SWEENEY

1999).

2.2.1.2 Verteilung zwischen Intra- und Extrazellulärraum

Eine wichtige Voraussetzung für alle Lebensvorgänge ist die Aufrechterhaltung einer

hohen extrazellulären Natrium- sowie einer hohen intrazellulären

Kaliumkonzentration. Da die Zellmembran für geladene Ionen nur schwer permeabel

ist, wird diese Ionenverteilung durch die Aktivität der Na+/K+-ATPase erreicht, die den

aktiven Transport von drei Natrium- und zwei Kaliumionen durch die Zellmembran

katalysiert. Bei dieser Ionenpumpe handelt es sich um ein tetrameres Protein mit

zwei α- und zwei β-Untereinheiten. Erstere enthalten die Bindungsstelle für Natrium,

Kalium und ATP (STRYER 1999). Da sowohl die α- als auch die β-Untereinheiten in

drei Subtypen vorkommen, entsteht eine Familie von Isoenzymen, die sich

unterscheiden durch:

- ihre Affinität zu Natriumionen

- ihre hormonelle Regulierbarkeit (z. B. durch Schilddrüsenhormone, Insulin

oder Glucocorticoide) und

- ihre zelluläre Lokalisation (PETRIDES 1997).

Aus dem Zellinneren kann Kalium über verschiedene Kanäle in den

Extrazellularraum diffundieren. Kaliumkanäle stellen Homo- oder Heterotetramere

dar. Die Monomeruntereinheiten werden von mindestens zehn Genen kodiert, von

denen einzelne zusätzlich durch Spleißing unterschiedliche Domänenstrukruren

hervorrufen können. Durch vielfältige Kombinationen dieser unterschiedlichen

Genprodukte entsteht eine Vielzahl verschiedener Kaliumkanal-Isoformen (STRYER

1999). Damit ist die lokale Verteilung von Kaliumionen abhängig von der Anflutung

mit dem Blut, der Aktivität der Na+/K+-ATPase und der Offenwahrscheinlichkeit und

Leitfähigkeit der vorhandenen Kaliumkanäle.

Literaturübersicht 21

2.2.1.3 Imbalancen im Kaliumhaushalt

Störungen im Kalium-Gleichgewicht zwischen Aufnahme und Elimination und

zwischen Intra- und Extrazellulärraum können zu Hypo- und Hyperkaliämien führen,

ohne dass der absolute Kaliumgehalt im Körper stark verändert ist. Insbesondere

Störungen des Säure-Basen-Haushaltes und Hunger beeinflussen die

Kaliumhomöostase (BROBST 1986; LUNN u. MC GUIRK 1990). Abbildung 1 gibt

dazu eine Übersicht.

2.2.1.3.1 Hypokaliämie

Hypokaliämien durch Imbalancen im extrazellulären Raum können zum einen durch

eine verminderte Kaliumaufnahme und zum anderen durch eine forcierte

Ausscheidung entstehen. Eine zu geringe Kaliumkonzentration im Futter ist sehr

selten und kann lediglich bei hochleistenden Milchkühen vorkommen, die

überwiegend konzentratreiche Nahrung erhalten (WARD 1966). Weit häufiger sind

niedrige Blutkaliumwerte im Zusammenhang mit unzureichender Futteraufnahme

(z. B. durch Krankheit) zu beobachten. Insbesondere Tiere, die an kaliumreiche

Nahrung adaptiert sind, können bei plötzlich ausbleibender Kaliumaufnahme die

Ausscheidung nicht schnell und weit genug herunterregulieren, so dass es zur

Entstehung von Hypokaliämien kommt. Diese sind allerdings in der Regel nicht so

K+ K+

K+

Intracellular Potassium Extracellular Potassium Acidosis Excretion

Alkalosis

Dietary intake

Abbildung 1: Faktoren, die das intra- und extrazell uläre Kalium-Gleichgewicht

beeinflussen (SWEENEY 1999)

22 Literaturübersicht

stark ausgeprägt, dass sie zu klinischen Symptomen führen (SWEENEY 1999).

Passagestörungen im Magendarmtrakt, wie sie unter anderem bei

Labmagenverlagerungen auftreten, ziehen ebenfalls durch eine verminderte

Resorptionsrate im Dünndarm geringe Blutkaliumspiegel nach sich (DELGADO-

LECAROZ et al. 2000; TAGUCHI 1995).

Auch Gaben von Diuretika oder Niereninsuffizienzen können durch eine

unzureichende Rückresorption des in der Niere filtrierten Kaliums zu einer

Hypokaliämie führen (vermehrte Ausscheidung) (BROBST 1986; LUNN u. MC

GUIRK 1990). Im Zuge von metabolischen Alkalosen kommt es ebenfalls zu einem

Absinken der Kaliumspiegel im Blut (WARD et al. 1994) durch eine verstärkte

Aufnahme von Kalium in die Zelle. Wasserstoff wird dabei im Antiport gegen Natrium

aus der Zelle transportiert, welches wiederum über die Na+/K+-ATPase die Zellen

verlässt. Auf gleichem Wege entsteht im Nierenepithel der distalen Tubuli zusätzlich

ein größerer Diffusionsgradient für Kalium. Durch die zusätzlich verminderte Aktivität

des K+/H+-Antiporters, um die Sekretion der H+-Ionen zu reduzieren, kommt es

schließlich zu einer erhöhten Kaliumausscheidung (LUNN u. MC GUIRK 1990; MC

GUIRK u. BUTLER 1980).

Auf zellulärer Ebene haben geringe Kaliumspiegel im Plasma und der extrazellulären

Flüssigkeit ein vermehrtes Ausströmen von Kalium aus der Zelle über die

verschiedenen Kaliumkanäle zur Folge, so dass die Zelle hyperpolarisiert. Ein

Erreichen des Schwellenwertes zur Öffnung spannungsabhängiger Natrium-

(Nerven- und Skelettmuskelzelle) oder Kalziumkanäle (glatte Muskelzelle), das zur

Auslösung von Aktionspotentialen und Muskelkontraktionen führt, ist damit seltener

(PETRIDES 1997).

Klinisch äußert sich eine Hypokaliämie demzufolge in erster Linie in

Herzrhythmusstörungen und Skelettmuskelschwäche, die letztlich zu Festliegen in

autauskultatorischer Haltung führt (SIELMAN et al. 1997).

2.2.1.3.2 Hyperkaliämie

Bei ausreichender Wasseraufnahme und funktionstüchtigen Nieren ist der

Wiederkäuerstoffwechsel vor einer Hyperkaliämie durch eine schnell

anpassungsfähige renale Kaliumausscheidung gut geschützt (SWEENEY 1999).

Literaturübersicht 23

Daher liegen in den meisten Fällen hoher Kaliumkonzentrationen im Blut eine

eingeschränkte Nierentätigkeit oder eine verminderte Aufnahme von Kalium in die

Zellen vor. Azidosen z. B. werden im Körper unter anderem dadurch abgepuffert,

dass bei hohen H+-Konzentrationen im Blut die Aktivität der Na+/H+-Transporter und

im weiteren Verlauf auch die der Na+/K+-ATPasen reduziert ist, so dass weniger

Kalium in die Zellen aufgenommen wird (TREMBLAY 1990).

Generell ist bei hohen Kaliumkonzentrationen in der extrazellulären Flüssigkeit die

Diffusion von Kalium aus der Zelle durch die Kaliumkanäle vermindert. Das

Zellinnere und damit das Membranpotential wird aufgrund dessen positiver, so dass

das Schwellenpotential eher erreicht wird (PETRIDES 1997). Da jedoch die

spannungsabhängigen Natrium- bzw. Kalziumkanäle nach ihrer Öffnung und

zeitabhängigen Schließung zunächst refraktär sind, haben Hyperkaliämien im

Endeffekt ähnliche klinische Symptome zur Folge wie Hypokaliämien, bradykarde

Herzrhythmusstörungen stehen allerdings zunächst im Vordergrund (SWEENEY

1999). Bei Kühen führte eine experimentelle orale Applikation von 650 g KCl zum

Tod der Tiere (DENNIS u. HARBAUGH 1948).

2.2.2 Regulation des Kaliumhaushaltes

Zur Vermeidung starker, ggf. lebensbedrohlicher Schwankungen der Blutkaliumwerte

wird der (extrazelluläre) Kaliumhaushalt streng reguliert, insbesondere und primär

über die Niere. Dabei scheint es zusätzlich zum klassischen Feedback-System bei

der Regulation der Kaliumhomöostase einen weiteren Mechanismus zu geben, der

einen Anstieg des Blutkaliums nach einer Mahlzeit verhindert: Postprandial kommt es

zu einem Anstieg der renalen Kaliumexkretion, wobei genau die Menge

ausgeschieden wird, die zuvor mit der Nahrung aufgenommen wurde (YOUN u.

MCDONOUGH 2009). Wie dieses „Feedforward-System“ genau funktioniert, ist

ungeklärt. Denkbar wären Sensoren im Magendarmtrakt, die die resorbierte

Kaliummenge registrieren und in entsprechendem Maße die renale Exkretion

verstärken (YOUN u. MCDONOUGH 2009), nicht aber die Ausscheidungsmenge mit

dem Kot verändern (ANDERSON u. PICKERING 1962; DEWHURST et al. 1968).

Wahrscheinlich ist diese stimulierte Ausscheidung über die Niere nicht auf das

Mineralocorticoid Aldosteron zurückzuführen (GREEN u. RABINOWITZ 1979;

24 Literaturübersicht

RABINOWITZ et al. 1984 a; RABINOWITZ u. SARASON 1980; RABINOWITZ,

SARASON u. YAMAUCHI 1981). Zwar verstärkt Aldosteron im distalen Tubulus die

Kaliumsekretion durch Stimulation der Na+/K+-ATPase (SWEENEY 1999), und auch

RABINOWITZ et al. (1985) zeigten einen potenten kaliuretischen Effekt des

Aldosterons am Schaf bei hohen Plasmakaliumwerten. Allerdings waren diese Werte

nur durch KCl-Infusionen zu erzielen und konnten nicht im Zuge der

Nahrungsaufnahme beobachtet werden.

Auch eine Beteiligung von HCO3- und Glukagon an der postprandialen

Kaliumexkretion ist unwahrscheinlich, da beides zumindest bei Schafen nicht bzw.

erst in pharmakologischen Dosen zu einer vermehrten Ausscheidung von Kalium

über die Nieren führte (RABINOWITZ et al. 1984 b). Hingegen konnten

RABINOWITZ et al. (1984 b) mit intravenösen Infusionen von Propionat und Acetat

sowohl sinkende Kaliumspiegel im Plasma als auch eine verstärkte (Aldosteron-

unabhängige) Kaliumexkretion erzielen. Eine mögliche Erklärung sehen die Autoren

darin, dass die vermehrte Bereitstellung von Energie zu einer stärkeren (ATP-

abhängigen) Kaliumsekretion in der Niere führen könnte. Propionat könnte allerdings

auch über eine erhöhte Freisetzung von Insulin auf den Kaliumhaushalt wirken (DE

JONG 1982).

Darüber hinaus ist die Kaliumexkretion vom Urinvolumen abhängig: eine forcierte

Diurese erhöht die Kaliumausscheidung und umgekehrt wird sie durch eine geringe

Urinmenge gehemmt (BROBST 1986; LUNN u. MC GUIRK 1990).

Zwar ist auch Insulin vermutlich nicht die Ursache der vermehrten postprandialen

Kaliumausscheidung (RABINOWITZ et al. 1984 b), trägt aber dennoch maßgeblich

zur Senkung der Kaliumkonzentration im Blut bei, indem es dessen Aufnahme in die

Zellen verstärkt, so dass unter dem Einfluss von Insulin die intrazellulären

Kaliumgehalte in der Leber, im Fettgewebe und in der Muskulatur ansteigen (VAN

MEIRHAEGHE 1988; SWEENEY 1999). Es wurde z. B. gezeigt, dass Insulin den

intrazellulären Kaliumgehalt im Zwerchfell von Ratten (KAMMINGA et al. 1950;

CREESE u. NORTHOVER 1961; CREESE 1968) im Musculus soleus von Ratten

(CLAUSEN u. KOHN 1977; FLATMAN u. CLAUSEN 1965) und in der

Froschmuskulatur (MANERY et al. 1950, 1977; SMILLIE u. MANERY 1960;

Literaturübersicht 25

GOURLEY 1965) erhöht. Damit verhindert postprandial ausgeschüttetes Insulin

gleichfalls im Sinne einer Feedforward Reaktion das übermäßige Ansteigen der

Kaliumkonzentration im Plasma.

Diese durch Insulin bedingte erhöhte Kaliumaufnahme in die Muskelzellen konnte

durch Ouabain, einem Hemmer der Na+/K+-ATPase, aufgehoben werden (CLAUSEN

u. KOHN 1977; GOURLEY 1965; MANERY et al. 1977; ZEMKOVA et al. 1982).

Gleichzeitig reduziert Insulin den Natriumgehalt der Muskelzellen über eine Ouabain-

sensitive Steigerung des Natriumeffluxes (CLAUSEN u. KOHN 1977; CREESE u.

NORTHOVER 1961; CREESE et al. 1968; CHINET u. CLAUSEN 1984; MOORE

1973; ERLIJ u. GRINSTEIN 1976; KITASATO et al. 1980a, b, c; ERLIJ 1984).

Zudem zeigten CLAUSEN und HANSEN (1977), dass Insulin die Ouabain-

Bindungsrate steigerte, was, laut Autoren, für eine höhere Turnover-Rate der Na+/K+-

ATPase sprechen würde. Die Stimulation der Na+/K+-ATPase bietet also eine

mögliche Erklärung dafür, wie es zu einer vermehrten Aufnahme von Kalium in die

Zellen kommt.

Im Gegensatz dazu ist Insulin allerdings auch in der Lage, die Aktivität (BERWECK

et al. 1993) bzw. die Offenwahrscheinlichkeit (YASUI et al. 2007) von Kaliumkanälen

zu erhöhen, so dass es in einigen Geweben im Endeffekt in Anwesenheit von Insulin

zu einem Ausstrom von Kalium kommt.

2.3 Insulin

2.3.1 Insulinhomöostase

Für die physiologische Insulinkonzentration im Plasma von Rindern liegen keine

offiziellen Referenzwerte vor. In verschiedenen Untersuchungen konnte gezeigt

werden, dass die Insulinkonzentrationen im Plasma starken Schwankungen

unterliegen. Die Angaben der Autoren über die Insulinwerte gesunder,

trockenstehender, tragender Tiere variieren zwischen 8,9 (±2,4) µU/ml (KRÄFT

2004) und 27 (±3) µU/ml (SANO et al. 1993 b). Innerhalb eines Tages schwanken die

basalen Insulinwerte zudem abhängig von der Fütterung: 2 - 4 h nach der letzten

Mahlzeit steigen die Insulinwerte an und sinken dann wieder ab mit Erreichen des

Minimums 12 – 16 h nach der letzten Fütterung. Eine Kuh im Zeitraum 17 bis 11

26 Literaturübersicht

Wochen vor der Abkalbung weist deshalb an einem Tag Insulinwerte zwischen ca.

10 und 40 µU/ml auf (STAUFENBIEL et al. 1992). So erscheint nur ein Vergleich der

Insulinwerte innerhalb einer Studie und nicht zwischen den einzelnen

Untersuchungen sinnvoll.

Als anaboles Hormon stellt Insulin die Nährstoffversorgung (insulinabhängiger)

Gewebe sicher. Am Ende der Trächtigkeit kommt es im mütterlichen Metabolismus

jedoch allmählich zu einer Verschiebung der verschiedenen Metabolite zwischen

dem Eutergewebe und den übrigen Körpergeweben, die u. a. auf veränderte

Insulinspiegel im Blut zurückzuführen ist (MERSMANN 1987). Milchkühe in der

Spätträchtigkeit und Frühlaktation haben daher in der Regel niedrigere

Insulinkonzentrationen im Plasma als Tiere in der Mittel- und Spätlaktation und der

Trockenstehzeit (GRIZARD et al. 1986; MALVEN et al. 1987; BAUMANN u. CURRIE

1980; BLUM et al. 1972). Außerdem treten Hypoinsulinämien im Hungerzustand auf

(HOVE 1978 b; PETTERSON et al. 1994).

Hyperinsulinämien hingegen werden bei adipösen Tieren (MC CANN und REIMERS

1985; MC CANN et al. 1986), bei Tieren mit Laminitis, Mastitis oder Metritis

(HOLTENIUS u. HOLTENIUS 1996) und bei Kühen mit Labmagenverlagerung

beobachtet (OK et al. 2000; SEN et al. 2006).

2.3.1.1 Struktur und Biosynthese von Insulin

Das Proteohormon Insulin besteht aus zwei Peptidketten, einer sauren (A) und einer

basischen (B), die an verschiedenen Positionen über Disulphidbrücken miteinander

verbunden sind (siehe Abbildung 2).

S S

A-Kette

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

5 10 15 21

S

S

B-Kette

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala

5 10 15 20 25 30

Abbildung 2: Die Aminosäuresequenz von Rinderinsuli n (STRYER 1999)

Literaturübersicht 27

Insulin wird in den β-Zellen des Langerhansschen Inselapparates gebildet und

gespeichert (MARTIN u. CRUMP 2003): Nach Transkription der mRNA im Zellkern

und Translation im rauen endoplasmatischen Retikulum wird zunächst ein

Insulinvorläufer, das Präproinsulin, gebildet, bei dem die A- und B-Kette über ein

sogenanntes „connecting peptide“ (C-Peptid) miteinander verbunden sind. Dieses C-

Peptid ist in seiner Aminosäurenzusammensetzung, im Gegensatz zum restlichen

Protein, bei den verschiedenen Säugetieren höchst variabel. Es folgt die Spaltung

von Arginin-Arginin und Lysin-Arginin-Resten am C-Peptid durch Trypsin-like und

Carboxypeptidase-like Enzyme sowie die Bildung von Disulphidbrücken zwischen

der A- und B-Kette. Das daraus entstehende Proinsulin wird vom rauen

endoplasmatischen Retikulum in den Golgi-Apparat überführt. Es wird in

zytosolischen Granula bis zur Freisetzung gespeichert. Die definitive Überführung

des Proinsulins in Insulin erfolgt durch Abspaltung der die beiden Kettenenden

verbindenden Brücke (MARTIN u. CRUMP 2003).

2.3.1.2 Sekretion und Abbau von Insulin

Faktoren, die die Insulinsekretion stimulieren, sind Nährstoffe (z. B. Glukose,

Galaktose, Mannose, Arginin, Lysin, Leucin, Alanin, Fettsäuren, Kalium und

Kalzium), gastrointestinale Hormone (z. B. Glukagon, Sekretin und Cholezystokinin)

und parasympathische oder β-adrenerge Stimuli. Auslöser für eine Hemmung der

Insulinsekretion sind u. a. Fasten, Aufregung, Hypokalzämien, α-adrenerge Aktivität

und gastrointestinale Hormone (z. B. Galanin und Somatostatin) (MARTIN u.

CRUMP 2003).

Beim Monogastrier gilt ein Anstieg des Blutzuckerspiegels als wichtigster Auslöser

für den Mechanismus der Insulinfreisetzung. Mit der steigenden Konzentration im

Blut wird vermehrt Glukose in die β-Zellen aufgenommen. Durch eine unmittelbare

Metabolisierung der Glukose (durch eine hohe Glukokinaseaktivität), steigt die

zytosolische ATP-Konzentration, die eine Reduktion der Offenwahrscheinlichkeit

ATP-abhängiger Kaliumkanäle bedingt. Durch die verminderte Kaliumleitfähigkeit

kommt es zu einer Anhebung des Ruhemembranpotentials und damit zu einer

erhöhten Öffnungsrate spannungsabhängiger Kalziumkanäle. Der folgende

28 Literaturübersicht

Kalziumeinstrom führt zu einer gesteigerten Exozytose der Insulingranula und damit

zur Sekretion in die Blutbahn (LÖFFLER u. PETRIDES 1997).

Auch beim Wiederkäuer liegen verschiedene Untersuchungen über die Faktoren vor,

die auf die Insulinsekretion Einfluss nehmen:

TRENKLE (1971) konnte zeigen, dass sowohl die basalen Insulinspiegel als auch die

Insulinsekretionsrate bei gefütterten Schafen signifikant höher waren als die

fastender Tiere, wohingegen sich bei der Eliminationsrate keine Unterschiede

ergaben. Zumindest prepartum ist die Menge der Insulinsekretion nach

Glukoseinfusionen dabei abhängig von der Fütterungsintensität: Sie nahm mit der

Intensität der Fütterung zu (bei 71 MJ umsetzbarer Energie geringere

Insulinsekretion als bei 177 MJ) (HOLTENIUS et al. 2003). Verschiedene Autoren

konnten nachweisen, dass die Insulinsekretion vor allem von der

Propionatkonzentration im Portalblut und einem prandial erhöhten Vagotonus

abhängig ist (MANNS u. BODA 1967; MANNS et al. 1967; BLOOM u. EDWARDS

1981; SARTIN et al. 1985; MINEO et al. 1990; WEEKES 1991; GRIINARI et al.

1997). Darüber hinaus wurde in verschiedenen Studien die Insulinsekretion nach

Infusion unterschiedlicher Substanzen überprüft. So konnte durch intravenöse.

Glukoseapplikationen bei Milchkühen der Insulingehalt im Blut erhöht werden

(GIESECKE 1986), wobei SAKAI et al. (1996) eine stärkere Insulinantwort durch

Xylitolgaben erzielten (Xylitol ist ein intermediär vorkommendes Pentose-Derivat, das

keine Erhöhung des Blutzuckerspiegels bewirkt und daher auch „Diabetiker-Zucker“

genannt). Auch Fettsäureninfusionen, neben Propionat auch n-Butyrat und n-Valerat

(nicht hingegen Acetat), hatten ansteigende Insulinkonzentrationen im Blut zur Folge

(DE JONG 1982). Auch HORINO et al. (1968) zeigten einen Anstieg der

Plasmainsulinspiegel durch Infusion von Fettsäuren mit drei bis acht C-Atomen.

Interessant dabei war, dass es zu keiner Erhöhung der Glukosekonzentration im Blut

kam, die Fettsäuren also direkt und nicht etwa über eine Stimulierung der

Glukoneogese die Insulinsekretion verstärkte. Die Autoren ziehen aus ihrer Studie

den Schluss, dass Fettsäuren mit oben genannter Länge bei Wiederkäuern potentere

Stimulatoren der Insulinsekretion sind als Glukose. Im Gegensatz dazu zeigten

KNOWLTON et al. (1998) eine tendenziell stärkere Insulinantwort auf eine

Literaturübersicht 29

abomasale als auf eine ruminale Stärkeinfusion. Des Weiteren konnten ODA et al.

(1986) an Ziegen den Nachweis erbringen, dass durch β-adrenerge Substanzen eine

Insulinsekretion ausgelöst wird. Auch intravenöse Glukagonapplikationen erhöhen

den Insulingehalt im Plasma (HOLTENIUS u. TRAVEN 1990).

Nach Stimulation der Insulinsekretion kommt es zu einem biphasischen Anstieg der

Plasmakonzentration, der vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass zunächst eine

Ausschüttung der Reserven erfolgt und dann eine Neuproduktion mit anschließender

Freisetzung; bei hungernden Kühen ist nur ein monophasischer Anstieg des

Insulingehaltes im Plasma festzustellen (HOVE 1978 b).

Neben reduzierten Insulinspiegeln im Hungerzustand (HOVE 1978 b) wurde nach

Gabe von α-Adrenergika (ODA et al. 1986) eine Hemmung der Insulinfreisetzung

beobachtet. Diese binden an α2-Rezeptoren der Plasmamembran der β-Zellen im

Pankreas und hemmen den Kalziumeinstrom in die Zelle und damit die Freisetzung

von Insulin (BROCKMAN 1986). In diesem Zusammenhang ist auch die mit

Hypokalzämien (GOFF 1999) einhergehende verminderte Insulinsekretion zu sehen.

Zudem konnte Somatostatin bei Ziegen eine Glukose-induzierte Insulinsekretion

kurzzeitig verhindern (MAGLAD et al. 1983), indem es Kaliumkanäle aktiviert und

damit eine Depolarisation der β-Zellen verhindert (BROCKMAN 1986).

Abgebaut wird das in der Blutbahn zirkulierende Insulin enzymatisch in der Leber. Es

hat im Serum eine Halbwertszeit von 10-15 Minuten. Bei der Bindung des Insulins an

die Insulinrezeptoren der Zielzellen kommt es im Zuge der Signaltransduktion zu

einer Internalisierung des Komplexes und zu einem anschließenden Abbau durch

lysosomale Enzyme. Dabei werden die Disulphidbrücken durch die Glutathion-

Insulin-Transhydrogenase gespalten und die entstandenen Ketten proteolytisch

abgebaut (LÖFFLER u. PETRIDES 1997).

2.3.1.3 Signaltransduktion am Erfolgsorgan

Bei der Signaltransduktion werden drei Stadien unterschieden: Phosphorylierung des

Insulinrezeptors, intrazelluläre Signalkaskade über second messenger und

Translokation z. B. der Glukosetransporter.

30 Literaturübersicht

Der Insulinrezeptor ist ein dimeres Molekül aus jeweils zwei gleichen α- und β-

Untereinheiten, die über eine Disulphidbrücke miteinander verknüpft sind. Während

die α-Untereinheiten auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, befinden sich die β-

Anteile v. a. im Zellinneren, haben allerdings auch transmembranäre und

extrazelluläre Anteile (TORNQUIST u. AVRUCH 1988; TAYLOR 1991; LÖFFLER u.

PETRIDES 1997). Sie sind zudem mit einer Tyrosinkinase-Domäne ausgestattet

(KAHN 1994). Die Bindung von Insulin an die α-Untereinheit führt zu einer

Konformationsänderung der Untereinheiten und im Zuge dessen zu einem Wegfall

der Hemmwirkung der α-Untereinheit auf die Tyrosinkinase der β-Untereinheit. Im

weiteren Verlauf kommt es zu einer Autophosphorylierung einiger Tyrosylreste an

der β-Untereinheit und in der Folge zu einer Internalisierung des Insulin-Rezeptor-

Komplexes. Dieser Prozess löst durch sich intrazellulär ausbreitende second

messenger-Systeme eine Kaskade an Phosphorylierungen und

Dephosphorylierungen aus. Die entstehenden Botenstoffe sind in ihrer Wirkung auf

das Endergebnis spezifisch. Die Phosphorylierung des Insulinrezeptorsubstrates

stimuliert beispielsweise die Glykogensynthese, die des Guanosintriphosphats

fördert Wachstum und Genexpression und die der Phosphoinositolphosphat-Kinase

die Lipogenese, Proteinsynthese und die Translokation von Glukosetransportern

(KAHN 1994).

2.3.2 Insulinresistenzphänomen

KAHN (1978) beschreibt die Insulinresistenz als einen Zustand, in dem die

physiologische Insulinkonzentration eine verminderte Antwort erzeugt. BERSON und

YALOW (1970) sehen in ihr eine Situation, in der eine größere Insulinmenge benötigt

wird, um eine normale Reaktion hervorzurufen. Man spricht in diesem Fall von einer

verminderten Insulinsensitivität, bei der eine höhere Insulinkonzentration nötig ist, um

einen halbmaximalen biologischen Effekt (km-Wert) zu erzielen. Die Höhe des

maximalen biologischen Effektes bleibt unverändert. Bei einer reduzierten Insulin-

Response, die auch einer Insulinresistenz zugrunde liegen kann, ist hingegen der

maximale Effekt des Insulins bei unverändertem km-Wert vermindert (RIZZA et al.

1981; SANO et al. 1991).

Literaturübersicht 31

Auf molekularer Ebene können Abweichungen der Insulinwirkung im Körper an drei

verschiedenen Lokalisationen ihren Ursprung nehmen:

1. Im Prärezeptor-Level (Insulinsekretionsrate reduziert)

2. Im Rezeptor-Level (verminderte Dichte oder Ansprechbarkeit der Rezeptoren)

3. Im Postrezeptor-Level (intrazelluläre Signalkaskade unterbrochen) (VERNON

u. SASAKI 1991)

Ein Defekt im Prärezeptor-Level bedingt in der Regel eine Hypoinsulinämie. Eine

herabgesetzte Insulin-Response nimmt im Allgemeinen ihren Ursprung im Rezeptor-

Level, während eine fehlerhafte Signalübertragung im Postrezeptor-Level Ursache

einer reduzierten Insulin-Sensitivität ist.

HOLTENIUS und HOLTENIUS (1996) beschreiben bei der hochleistenden Milchkuh

zwei verschiedene Diabetesformen:

1. Typ-I-Diabetes: Hypoinsulinämische und –glykämische Tiere (in der

Frühlaktation bei negativer Energiebalance)

2. Typ-II-Diabetes: Hyperinsulinämische und –glykämische Tiere (häufig mit

Krankheit wie Metritis, Mastitis oder Laminitis einhergehend)

Zur Prüfung der Insulin-Resistenzlage werden euglykämische Insulinclamps oder

Glukosetoleranztests (GTT) durchgeführt. Im GTT, bei der Glukose intravenös

verabreicht wird, können z. B. basale und maximale Plasmainsulinkonzentrationen,

Glukose-Clearance, Verhältnis von Plasma-Glukose zu Plasma-Insulin und die Zeit

bis zum Wiedererreichen normaler Glukosewerte bestimmt werden (HAYIRLI et al.

2001). Beim euglykämischen Clamp wird eine bestimmte Menge an Insulin infundiert

und dabei der Glukosespiegel konstant gehalten. Aus verbrauchter Glukosemenge

und infundierter Insulinkonzentration kann der biologische Effekt abgeleitet werden

(SANO et al. 1991, 1993 a).

Die Entwicklung einer Insulinresistenz ist ein multikausales Geschehen. Im

Folgenden sind einige Faktoren aufgeführt.

Reproduktionsstadium:

Insulinresistenzen werden häufig im Zusammenhang mit fortgeschrittenen

Trächtigkeiten und einsetzender Laktation beobachtet (PRIOR u. CHRISTENSON

1978; DEBRASS et al. 1989; FAULKNER u. POLLOCK 1990; PETTERSON et al.

32 Literaturübersicht

1994). Der Nährstoffbedarf des wachsenden Fetus und später die einsetzende

Laktation fordern einen flexiblen mütterlichen Metabolismus. Bei Schafen beträgt die

fetale Glukoseaufnahme 42-50 % der mütterlichen Glukoseproduktion bzw. wird die

uterine Glukoseaufnahme mit 18 mg/kg Fetus/min angegeben (PRIOR u.

CHRISTENSON 1978). Der Glukosetransport in der Plazenta, die uterine

Glukoseaufnahme sowie die Glukosesekretion ins Euter sind dabei (anders als der

Transfer von Glukose in das mütterliche Muskel- oder Fettgewebe) weitestgehend

insulinunabhängig (HOVE 1978 a; HAY et al. 1984). Die Umverteilung dieser

Nährstoffe in Richtung Plazenta und Euter wird daher vor allem über eine geringere

Insulinsekretion und eine geringere Ansprechbarkeit des Körpergewebes auf Insulin

erzielt. STAUFENBIEL et al. (1992) haben die Insulin- und Glukoseregulation bei der

Milchkuh mittels Tagesprofilen im Zeitraum von 17 Wochen ante partum bis 52

Wochen post partum beurteilt. Dabei wurden die niedrigsten Insulinwerte im

Tagesprofil in der 23. Woche p.p. gemessen bei einer generellen Abnahme ab der 7.

Woche a. p.. Auch SANO et al. (1993 b) erbrachten den Nachweis, dass bei

laktierenden Kühen die Insulinsekretion nach Infusion von Glukose geringer ist als

bei Tockenstehern (23 vs. 102 µU/ml). Hingegen konnten sie im Glukoseverbrauch

bei hyperinsulinämischen Clamps keinen Unterschied zwischen laktierenden und

trockenstehenden Tieren feststellen. GIESECKE (1986) hat die Insulinantwort nach

einer Glukoseinfusion gemessen. Zu sehen war eine deutliche Abnahme der

Insulinspiegel 6 Wochen ante partum bis 6 Wochen post partum, was der Autor auf

eine verminderte Sekretion zurückführte. In einer weiteren Untersuchung zeigte er im

gleichen Zeitfenster zusätzlich an Erythrocyten eine Affinitätsabnahme für Insulin.

Vorausgesetzt, dass sich die an den Erythrocyten gewonnenen Erkenntnisse auf

andere Gewebe übertragen lassen, bedeutet das, dass neben reduzierten

Insulinspiegeln im Blut peripartal außerdem eine verminderte Ansprechbarkeit der

Gewebe auf Insulin vorliegen könnte.

KRÄFT (2004) hingegen demonstrierte, dass Milchkühe in der Frühlaktation im

Gegensatz zu trockenstehenden Kühen eine hohe Insulin-Sensitivität und -Response

aufweisen, was einer Unterversorgung extramammärer Gewebe bei niedrigen

Insulinspiegeln entgegen wirkt. So besteht eine grundsätzliche Übereinstimmung

Literaturübersicht 33

hinsichtlich der verminderten Insulinsekretion nach Glukoseapplikation in der

Spätträchtigkeit und Frühlaktation, wohingegen es gegenläufige Ergebnisse in Bezug

auf die Ansprechbarkeit der Gewebe auf Insulin in diesem Zeitraum gibt.

Der Effekt von Insulin auf den Fettstoffwechsel während der Trächtigkeit und der

Frühlaktation wurde von GUESNET et al. (1991) am Schaf untersucht. In den ersten

drei Monaten der Trächtigkeit konnten die Autoren eine verstärkte Lipogenese, eine

reduzierte Reaktion auf einen ß-lipolytischen Stimulus mittels Isoproterenol und eine

erhöhte Anzahl von Insulinrezeptoren mit hoher Affinität feststellen. Im letzten Drittel

der Trächtigkeit und in der Laktation kam es zu einem umgekehrten Bild. V. a. in der

Laktation war die Anzahl der Insulinrezeptoren vermindert und die Insulin-stimulierte

Lipogenese wurde unzureichend. Analysen von Dosiswirkungskurven im Zuge von

Insulininfusionen bei tragenden und nicht-tragenden Schafen zeigten, dass die

maximale Insulin-vermittelte Reduzierung von NEFAs und Glycerol im Plasma bei

tragenden Schafen signifikant geringer ist als bei den nicht-tragenden Tieren. Das

bedeutet, dass es bei Schafen während der Trächtigkeit zu einer verminderten

Ansprechbarkeit des Fettgewebes auf Insulin kommt (PETTERSON et al. 1994).

Während der späten Trächtigkeit sind u. a. die Konzentrationen von Progesteron,

Cortisol und Prolaktin im Plasma erhöht. RYAN und ENNS (1988) haben den Effekt

dieser Hormone auf die Insulinwirkung (maximale Insulinbindung und

Glukosetransportrate) an isolierten Fettgewebszellen von Ratten untersucht. Dabei

stellten sie fest, dass die Gabe von Prolactin den Glukosetransport hemmte und

Progesteron und Cortisol beides reduzierten. Das vor allem zu Beginn der Laktation

ebenfalls erhöhte Estradiol erzeugte hingegen eine gesteigerte maximale

Insulinbindung.

Ernährungszustand:

In einer Vielzahl von Untersuchungen an Wiederkäuern und Monogastriern konnte

gezeigt werden, dass mit Adipositas häufig Stoffwechselstörungen vergesellschaftet

sind. Erhöhte Konzentrationen an NEFAs im Blut korrelieren mit einer gestörten

intrazellulären Signalkaskade (ZIERATH et al. 1998; LE MARCHAND-BRUSTEL et

al. 1999), einer reduzierten Anzahl an GLUT-4-Transportern (VAN EPPS-FUNG et

al. 1997) und einer Hemmung der Insulin-stimulierten Glukoseaufnahme des

34 Literaturübersicht

peripheren Gewebes (KOOPMANS et al. 1996). GRIZARD und SZCZYGIEL (1983)

konnten an Schafen eine mit steigendem Körpergewicht abnehmende Insulinbindung

an Hepatocyten nachweisen. Es kommt im Zusammenhang mit Fettleibigkeit auch zu

Insulinresistenzen, die mit Hyperinsulinämien einhergehen. MC CANN und

REIMERS (1985) und MC CANN et al. (1986) konnten zeigen, dass es sowohl bei

adipösen Schafen als auch bei fettleibigen Färsen im Vergleich zu normal

konditionierten Tieren zu einer Reduktion der Glukoseregulation und zu erhöhten

Insulinspiegeln kam. Allerdings beschreiben z. B. HAYIRLI et al. (2002),

GARNSWORTHY und TOPPS (1982) und TREACHER et al. (1986) bei obesen

Wiederkäuern im Gegensatz zu monogastrischen Tieren einen verminderten Appetit.

HAYIRLI (2006) folgert daraus, dass Adipositas bei Nicht-Wiederkäuern mit

Hyperglykämie und –insulinämie und bei Wiederkäuern mit Hypoglykämie und –

insulinämie vergesellschaftet ist.

Eine moderate, kurzfristige Unterernährung hatte bei Schafen keine Auswirkungen

auf die Insulin-vermittelte Reduktion von NEFAs und Glycerol im Blut (PETTERSON

et al. 1994). Eine andere Untersuchung hingegen zeigt, dass bei gesunden Kühen

nach Infusion von Glukose höhere Insulinspiegel erzielt wurden als bei hungernden

Tieren (HOVE 1978 b). Die Autoren erklären dies zum einen mit einem durch HALSE

(1960) an Milchkühen dokumentierten Abfall der Plasma-Kalziumspiegel um 20 %

nach 48 Stunden Fasten. Zum anderen halten die Autoren den beim fastenden

Menschen nachgewiesenen Norepinephrin-Anstieg für einen möglichen hemmenden

Faktor. Zusätzlich bietet sich eine weitere Erklärungsmöglichkeit in dem durch die

reduzierte Futteraufnahme verminderten Propionatspiegel sowie der dadurch

bedingten Hypoglykämie (HERDT 2000; OSTERGAARD u. GRÖHN 1999).

Mineralstoffimbalancen:

In verschiedenen Untersuchungen konnte ein Zusammenhang zwischen

Hypokalzämien und verminderter Insulinsekretion nachgewiesen werden

(LITTLEDIKE et al. 1968; GOFF 1999). Beim Schaf ist bei bestehender

Hypokalzämie zusätzlich zur herabgesetzten Sekretion auch eine Hemmung der

Insulin-Clearance nachgewiesen (SCHLUMBOHM et al. 1997).

Literaturübersicht 35

Eine Hypokaliämie kann ähnlich hemmende Auswirkungen auf die Insulinsekretion

haben, da es bei niedrigen Kaliumspiegeln allgemein zu einem vermehrten Ausstrom

von Kalium aus der Zelle kommt. Dadurch wird deren Ruhemembranpotential

negativer und als Konsequenz kann die Zelle nicht mehr so leicht depolarisiert

werden. Dies ist allerdings die Voraussetzung dafür, dass die potentialabhängigen

Kalziumkanäle öffnen. Im Endeffekt wird also die Insulinsekretion gehemmt

(PETRIDES 1997). In die gleiche Richtung zielen Beobachtungen bei diabetischen

Menschen mit gleichzeitig bestehender Hypokaliämie, bei denen die Glukosetoleranz

durch Anhebung der Kaliumspiegel verbessert werden konnte (TOURNIAIRE et al.

1988).

Labmagenverlagerung und Ketose:

Auch verschiedene Erkrankungen bei Milchkühen können mit Insulinresistenzen

zusammen auftreten. Bei ketotischen Tieren kommt es bei unveränderten (VAN

MEIRHAEGHE et al. 1988 b) oder verminderten (BROCKMAN 1979; KRÄFT 2004)

basalen Insulinspiegeln zu einer geringeren Insulinsekretion als Antwort auf

Glukoseinfusionen verglichen mit gesunden Tieren im gleichen Laktationsstadium.

Auch HOVE (1978 b) erzielte in gesunden Kühen nach Infusion von Glukose höhere

Insulinspiegel als in ketotischen. Den geringen Anstieg der Insulinspiegel der

ketotischen Tiere erklärten die Autoren mit einer verminderten sekretorischen

Kapazität der ß-Zellen, herrührend von der Tage oder Wochen andauernden Phase

der die Ketose begleitenden Hypoglykämie. SAKAI et al. (1996) erzielten ähnliche

Ergebnisse: bei gesunden Kühen war nach Infusion von 500 ml einer 50 %igen

Glukoselösung die Insulinkonzentration im Plasma 7 mal, bei ketotischen Tieren nur

3 mal höher. Jedoch zeigte die Infusion von Xylitol ein anderes Bild: bei gesunden

Kühen war nach der Infusion von 1000 ml einer 25 %iger Xylitollösung die

Insulinkonzentration 9 mal, bei ketotischen Tieren hingegen 12 mal höher. Die

Autoren erklären diesen Insulinanstieg entweder mit einem verminderten Abbau von

Insulin, da die Diffusion von Xylitol ins periphere Gewebe Insulin unabhängig verläuft,

oder aber mit einer gesteigerten Synthese und Freisetzung. BECK et al. (1983)

erbrachten außerdem den Nachweis, dass ketotische Kühe neben einer

verminderten Insulinsekretion auch eine reduzierte Insulin-Sensitivität aufweisen.

36 Literaturübersicht

Tiere mit bestehender Labmagenverlagerung hingegen weisen signifikant höhere

Insulin- und Glukosewerte auf als gesunde Kühe. Auch auf eine Glukoseinfusion

reagieren erstere mit einer langanhaltenden erhöhten Insulinsekretion (VAN

MEIRHAEGHE et al. 1988 b; HOLTENIUS u. TRAVEN 1990). Tiere, die sowohl

ketotisch sind als auch an einer Labmagenverlagerung leiden, reagierten in dieser

Studie überwiegend mit einer starken Insulinantwort (VAN MEIRHAEGHE et al. 1988

b). OK et al. (2000) zeigten zudem, dass Kühe mit rechtsseitiger

Labmagenverlagerung noch höhere Insulinspiegel haben als solche mit linksseitiger.

2.3.3 Beeinflussung der Labmagenmotilität durch Insulin

Verschiedene Studien belegen, dass Insulin einen hemmenden Einfluss auf den

Labmagen hat. VAN MEIRHAEGE et al. (1988 a) demonstrierten eine Reduktion des

abomasalen Effluxes nach einer Insulin-Injektion von 0,2 U/kg KGW, obwohl der

hypoglykämische Effekt durch Gaben von Glukose oder Adrenalin abgepuffert

wurde. Insulin wirkt also unabhängig vom Blutglukosespiegel. Auch SUSTRONCK

(2000) und HOLTENIUS et al. (2000) konnten eine klare Korrelation zwischen

bestehender Hyperinsulinämie und verzögerter Labmagenentleerung zeigen, die

Glukose-unabhängig war.

Es blieb allerdings unklar, ob und inwiefern es sich bei der Hemmung um eine

Beeinflussung der Labmagenmuskulatur oder um einen sekundären Effekt

(beispielsweise durch verminderten Vorschub aus dem Pansen) handelte. Zu diesem

Zweck setzten PRAVETTONI et al. (2004, 2007) Kühen bei der Labmagenoperation

abomaso-duodenale Elektroden ein. Untersucht wurden Kühe mit

Labmagenverlagerung zu Beginn ihrer Laktation. Alle Tiere wiesen dabei erhöhte

Insulinspiegel auf. Nach der chirurgischen Korrektur sanken die Blutspiegel ab, was

eine langsame Erhöhung der abomaso-duodenalen myogenen Aktivität nach sich

zog. Aufgrund der unterschiedlich hohen Insulinspiegel nach der Operation wurden

die Tiere zudem in zwei gleich große Gruppen geteilt: Tiere mit hohen und solche mit

niedrigen Insulinspiegeln. Kühe mit hohen Plasmakonzentrationen zeigten sieben

Tage nach der Operation eine signifikant niedrigere myogene Aktivität als die Tiere

mit niedrigen Plasmainsulinwerten (PRAVETTONI et al. 2004).

Literaturübersicht 37

2.4 Hypothese

Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob und auf welche Weise Insulin und

Kalium einzeln oder in Kombination auf isolierte Labmagenmuskulatur wirken und

inwieweit sich die daraus gewonnenen Ergebnisse in In-vivo-Untersuchungen

bestätigen lassen.

Gesichert ist, dass experimentelle Insulininfusionen unter normoglykämischen

Bedingungen den Efflux von Ingesta aus dem Labmagen vermindern (HOLTENIUS

et al. 2004). Dies könnte bedeuten, dass Insulin direkt, also Glucose-unabhängig, auf

die Labmagenmotilität wirkt. Zudem wurde eine Korrelation zwischen verlängerter

postoperativer Labmagenatonie und hohen Insulinspiegeln festgestellt

(PRAVETTONI et al. 2004).

Ferner ist bewiesen, dass Insulin nach Futteraufnahme zu einer erhöhten Aufnahme

von Kalium in Zellen der Skelettmuskulatur führt. Insulin ist also in der Lage,

Kaliumgradienten über Zellmembranen zu beeinflussen. Ob die Insulinwirkung an der

Muskulatur des Labmagens über lokale Änderungen von Kaliumgradienten zustande

kommt, ist bisher nicht untersucht. Denkbar wäre eine Insulin-bedingte Stimulation

der Na+/K+-ATPase in Analogie zu den Vorgängen an der Skelettmuskelzelle oder

eine Aktivierung von Kaliumkanälen, wie es an Pericyten retinaler Kapillaren

(BERWECK et al. 1993) und glatten Muskelzellen der thorakalen Aorta von

Rattenembryonen (YASUI et al. 2007) nachgewiesen werden konnte.

Daraus ergeben sich folgende Fragestellungen:

1. Wie reagiert isolierte Labmagenmuskulatur auf Veränderungen der

extrazellulären Kalium-Konzentration?

2. Wie reagiert sie auf steigende Insulingaben?

3. Gibt es Hinweise für eine Beteiligung der Kalium-Leitfähigkeit oder der Na+/K+-

ATPase an dem Insulineffekt auf die Labmagenmuskulatur?

4. Lassen sich die Ergebnisse auf Untersuchungen in-vivo übertragen?

38 Material und Methoden

3 Material und Methoden

3.1 In-vitro-Motilitätsmessung der Labmagenmuskulat ur

3.1.1 Versuchstiere

Das Probenmaterial stammte einerseits von 22 gleichaltrigen, definiert gehaltenen

und gefütterten Ziegenböcken, die im Rahmen eines anderen Versuches am

hiesigen Institut geschlachtet wurden. Andererseits wurde Labmagenmaterial von 74

nichttragenden schwarzbunten Milchkühen aus dem Schlachthof in

Gleidingen/Laatzen gewonnen. Ihre Schlachtkörper und Innereien wiesen keinerlei

Veränderungen auf.

3.1.2 Entnahme der Muskelstreifen

Die Tiere wurden mittels Bolzenschuss betäubt und durch Entbluten getötet. Die

Entnahme des Probenmaterials erfolgte ca. 15 Minuten (Ziegen) bzw. 30 Minuten

(Kühe) nach der Tötung. Dabei wurden 5 x 5 cm große Präparate der

Labmagenwand aus dem proximalen Drittel der Magenpumpe (Corpus) und dem

Pylorus entnommen, mit erwärmter (37 °C) Pufferlösu ng gespült und schließlich

darin inkubiert.

Die Lösung hatte folgende Zusammensetzung:

NaCl: 117,0 mmol/l; KCl: 4,7 mmol/l; MgCl2: 1,2 mmol/l; NaH2PO4: 1,2 mmol/l; CaCl2:

2,5 mmol/l; NaHCO3: 25,0 mmol/l; Glukose: 11,0 mmol/l; pH-Wert 7,4 bei Begasung

mit O2/CO2 95/5 %.

3.1.3 Präparation der Zirkulär- und Längsmuskelstreifen

Die Präparation der Muskelstreifen erfolgte 10 Minuten (Ziegen) bzw. 60 Minuten

(Kühe) nach der Entnahme. Zu diesem Zweck wurden die Gewebe frisch

angeschnitten und mit der mukosalen Seite nach oben in einer mit Sylgard

beschichteten und mit Pufferlösung befüllten Petrischale mit Präpariernadeln

aufgespannt. Mit Hilfe von Pinzette und Präparierschere wurden Mukosa und

Submukosa unter dem Mikroskop (SZ40, Olympus, Hamburg) bei 10facher

Vergrößerung entfernt, 0,5 cm x 1,0 cm große Muskelstreifen parallel zur benötigten

Material und Methoden 39

Faserrichtung (zirkulär bzw. longitudinal) festgepinnt und geschnitten. Danach wurde

an beiden Enden der Muskelstreifen Nähgarn zur Befestigung an der

Messvorrichtung angeknotet.

Bei den Ziegen wurden neben zirkulärer Pylorus- und zirkulärer Corpusmuskulatur im

Gegensatz zu den Kühen auch longitudinale Corpusmuskulatur untersucht.

3.1.4 Messung der mechanischen Aktivität der Muskelstreifen

3.1.4.1 Versuchsvorrichtung

Die Apparatur zur Messung der mechanischen Aktivität der Muskelstreifen bestand

aus:

- 8 doppelwandigen Kammern, deren äußerer Bereich mit dem Wasserbad

verbunden war und deren innerer Bereich (in den die Einsätze mit den

fixierten Muskelstücken eingebracht werden) mit einem verschließbaren

Abfluss und der Möglichkeit zur Carbogenbegasung versehen war

- 8 isometrische Kraftaufnehmer, die zum Zwecke der Vordehnung

höhenverstellbar waren

- einer Messbrücke, die an einen analogen Digital-Wandler (Spider 8, Holtinger

Baldwin Messtechnik) und an ein computergestütztes Analysesystem

(catman®Easy Version 1.0, HBM Software) angeschlossen waren

Die präparierten Muskelstücke wurden mit Hilfe der Einsätze in die mit 10 ml 37 °C

warmer Pufferlösung befüllten Kammern verbracht und mit dem Faden des freien

Endes mit dem Haken des isometrischen Kraftaufnehmers verbunden. Zur Messung

der kontraktilen Aktivität wurden die eingespannten Muskelstreifen auf 20 mN

vorgedehnt.

Die Kraftaufnehmer dienten zur Umwandlung der mechanischen Aktivität in

elektrische Signale, die über die Messbrücke verstärkt und auf einem Monitor mit

Hilfe eines Analog-Digital-Wandlers und eines computergestützten Analysesystems

dargestellt wurden. Die Aktivität der Muskelstreifen wurde kontinuierlich mit 20 Hz

aufgezeichnet.

Nach einer Adaptationsphase von 90 Minuten wurden die Wirkungen verschiedener

Substanzen, die direkt in die Kammer gegeben wurden, getestet.

40 Material und Methoden

3.1.4.2 Versuchsschemata

Es wurde sowohl die Wirkung von Kalium auf die glatte Labmagenmuskulatur

getestet als auch die von Insulin.

- Kalium: Der Einfluss von Kalium auf isolierte Muskelpräparate wurde anhand

einer Dosiswirkungskurve von 1 bis 10 mmol/l überprüft. Dazu wurde zu 10 ml

Pufferlösung mit einem Kaliumgehalt von 1 mmol/l entsprechende Mengen (10

bzw. 20 µl) einer 1 molaren Kaliumlösung gegeben. Equimolare NaCl-Gaben

dienten dabei als Zeit- und osmotische Kontrolle.

- Insulin: Auch der Einfluss von Insulin auf isolierte Labmagenmuskulatur wurde

mit Hilfe einer Dosiswirkungskurve (0 bis 120 mU Insulin/l) ermittelt. Dies

erfolgte zum Einen im Vergleich zu einer Zeitkontrolle und zum Anderen in

Anwesenheit verschiedener Kaliumkonzentrationen (3 und 5 mmol/l). Dazu

wurde eine Insulinlösung mit einer Konzentration von 7 U/l hergestellt, so dass

eine Zugabe von 10 µl zu 10 ml Pufferlösung zu einer

Konzentrationserhöhung um 7 mU Insulin/l führten. Bei der Kuh wurden

zusätzlich am Pylorus die Wirkung von verschiedenen Insulinkonzentrationen

(0, 40, 120, 200 mU/l) über die Zeit, d.h. ohne weitere Zugaben, gemessen.

- Weiterführende Untersuchungen an der zirkulären Corpusmuskulatur:

o Wirkung von 7 und 40 mU Insulin/l auf den Verlauf einer

Kaliumdosiswirkungskurve

o Wirkung von 80 mU Insulin/l in Anwesenheit des Kaliumkanalblockers

Barium (3 mmol/l)

o Wirkung von 80 mU Insulin/l in Anwesenheit des ATP-sensitive

Kaliumkanäle blockierenden Glybenclamids (0,05 mmol/l)

o Wirkung von 80 mU Insulin/l in Anwesenheit von 0,001 mmol Ouabain/l

(Hemmer der Na+/K+-ATPase)

Die genauen Versuchsschemata sind dem Anhang 10.1 zu entnehmen

Material und Methoden 41

3.1.4.3 Motilitätsparameter

Die Bestimmung der Motlitätsparameter erfolgte jeweils über 2 Minuten vor der

nächsten Zugabe und nach Wirkungseintritt der zugegebenen Substanz. Dabei

wurden folgende Parameter zur Analyse herangezogen:

Mittlere Kontraktionsamplituden [mN]: Die mittlere Kontraktionsamplitude wurde

durch die Summe der Delta zwischen den einzelnen Minima und Maxima geteilt

durch die Frequenz während der auszuwertenden Periode ermittelt.

Kontraktionsfrequenz [1/min]: Die Kontraktionsfrequenz entsprach der Anzahl der

Kontraktionen pro Minute.

Kontraktionsaktivität [mN/min]: Die Kontraktionsaktivität wurde durch Multiplikation

der mittleren Kontraktionsamplitude und der Kontraktionsfrequenz errechet.

Miteinander verglichen wurden gleiche Muskelpräparate einer Tierart.

3.2 In-vivo-Versuch: Bestimmung des Labmageneffluxe s bei intravenöser

Applikation von Insulin und Kalium

3.2.1 Versuchstiere

Bei den Versuchstieren handelte es sich um sechs Kühe der Rasse Holstein-Frisian

der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig, die sowohl im

Pansen wie auch im Duodenum fistuliert waren. Die Kühe waren klinisch gesund,

durchschnittlich 7 Jahre alt und in unterschiedlichen Laktationsstadien (4 in Laktion

-davon 2 tragend- und 2 trocken stehende Kühe –davon eine tragend). Alle Tiere

wurden in Anbindehaltung gehalten, morgens und nachmittags gemolken und mit

einer leistungsgerechten Menge an Maissilage und Kraftfutter versorgt.

Futtermittelproben ergaben folgende Zusammensetzung in der Trockensubstanz:

42 Material und Methoden

Tabelle 1: Futtermittelanalyse

Inhaltsstoffe in g/kg Maissilage Stroh Kraftfutterpellets

Rohasche 26,51 50,4 51,3

Rohprotein 43,4 39,1 175

Rohfett 13,94 381 30,7

Rohfaser 84,67 220 73,8

N-freie Extraktstoffe 217,71 544

Kalzium 1,94 2,87 6,16

Phosphor 1,28 0,63 5,02

Natrium 0,14 <0,11 2,47

Kalium 7,04 5,88 6,25

zusätzlich Minerallecksteine

Die genauen Daten der Tiere sind der Tabelle 2 zu entnehmen.

Tabelle 2: Leistungsdaten der Kühe an den Versuchst agen

Versuchstage Name Gewicht Letzte

Abkalbung

Trächtigkeit Milchleistung Ration

Silage

KF

16.-18.04.08 Reike 577 kg 28.09.07 tragend 16 l 26 kg

5 kg

21.-23.04.08 Stella 570 kg 17.12.06 tragend trocken 28 kg

28.-30.04.08 Wolke 560 kg 14.12.07 nicht

tragend

23 l 26 kg

5 kg

05.-07.05.08 Lotte 540 kg 13.11.07 tragend 19 l 30 kg

5 kg

07.-09.05.08 Inka 520 kg 31.03.08 nicht

tragend

13 l 20 kg + 2 kg

Stroh

13.-15.05.08 Ambra 705 kg 28.12.06 nicht

tragend

trocken 24 kg

Material und Methoden 43

Das Versuchsvorhaben wurde gemäß § 8 TSchG angemeldet und genehmigt.

3.2.2 Versuchsaufbau

3.2.2.1 Vorbereitung der Versuchstiere

Am Vortag des dreitägigen Versuches wurden die Tiere auf einer Viehwaage

gewogen und klinisch allgemein untersucht. Am Morgen der Versuchstage wurden

die Tiere gemolken und gefüttert, eventuell vorhandene minimale Futterreste wurden

aber vor Beginn des Versuches entfernt.

Am Morgen des ersten Versuchstages wurden zwei venöse Zugänge in beide Vv.

jugulares externae gelegt. Zu diesem Zweck wurde das obere Halsdrittel im Bereich

der Drosselrinne großflächig rasiert, mit Ethanol (96 %) entfettet und anschließend

jodiert (alkoholische Jodlösung, 10 % w/v). Ein Venenverweilkatheter (1,1 x 1,7 mm,

Länge 45 cm) wurde herzwärts geschoben und mittels zweier Hauthefte sowie mit

Klebeband fixiert. An beiden Kathetern wurde eine Heidelberger Verlängerung (140

cm) angebracht, die auf der einen Halsseite auf 15 cm gekürzt wurde und so einer

erleichterten Blutentnahme diente. Auf der anderen Seite wurde ein Dreiwegehahn

befestigt, an den einerseits die Insulininfusionspumpe und andererseits die

Glukoseinfusion (G40 % ad us. vet) angeschlossen wurde. Der Katheter wurde nach

jeder Blutentnahme mit physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9 %) gespült.

3.2.2.2 Vorbereitung der Infusionslösungen

Zunächst wurde eine Insulinstammlösung (7175 U Insulin/l) hergestellt, die dann,

individuell auf das Gewicht der Tiere abgestimmt, verdünnt werden konnte. Für die

Stammlösung wurde das Insulinpulver (Insulin from bovine pancreas) mit 500 ml

sterilem Aqua bidest. vermischt und durch Ansäuern mit 1 n HCl in Lösung gebracht.

Die Einstellung des pH-Wertes auf 4,5 erfolgte mittels eines Puffergemisches aus 0,1

n Kaliumhydrogenphosphat und 0,1 n Natronlauge (Mischverhältnis von 3,17:1, pH

6,5). Die Lösung wurde mit sterilem Aqua bidest. auf 1 l aufgefüllt, in 10 Portionen a

100 ml aufgeteilt und im Kühlschrank bei +2 °C in s terilen Glasflaschen aufbewahrt.

Entsprechend des Körpergewichtes der Tiere wurde am Abend des ersten

Versuchstages die Insulininfusionslösung in einer solchen Konzentration hergestellt,

44 Material und Methoden

dass den Tieren bei einer Infusionsmenge von 1 ml/min 1 mU/kgKGW/min infundiert

wurde. Der Lösung des dritten Versuchstages wurden 120 mmol Kaliumchlorid/l

zugesetzt, so dass die infundierte Kaliummenge 0,5 mmol/Tier/min betrug.

Zur Herstellung der Chrom-EDTA-Lösung wurden zunächst 143,88 g CrCl3 * 6H2O in

1l Aqua dest. unter Rühren mit einem Glasstab und 201 g Na2-EDTA * 2H2O in 1,5 l

Aqua dest. mit Zusatz von einigen Glasperlen unter Erwärmen gelöst. Anschließend

wurden beide Lösungen zusammengegossen und eine Stunde unter Rühren

gekocht. Nach Abkühlung und Lösen von 5,88 g CaCl2 * 2H2O wurde der pH-Wert

mit Hilfe von 10 n NaOH auf 6,0 eingestellt und die Lösung auf 3 l aufgefüllt.

Für die Herstellung der initialen Infusionslösung wurden 230 ml der Chrom-EDTA-

Lösung mit 770 ml Aqua dest. und für die folgenden Zugaben 90 ml Chrom-EDTA-

Lösung mit 510 ml Aqua dest. verdünnt.

3.2.2.3 Ablauf des hyperinsulinämischen, euglykämischen Clamptests mit

gleichzeitiger Labmageneffluxmessung

Ein Versuchsabschnitt dauerte drei Tage. Zu Beginn der Versuchstage wurde jeweils

eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt.

Tag 1: Um 6 Uhr wurde der erste Venenverweilkatheter für die Blutentnahme gelegt

und fixiert. Kurz vor 7 Uhr wurde eine erste Duodenalsaftprobe entnommen (100 ml)

und der pH-Wert gemessen (dieser lag stets zwischen 2,14 und 2,98), bevor um 7

Uhr die initiale Chrom-EDTA-Lösung und im Folgenden alle 10 Minuten 20 ml der

verdünnten Lösung in den Pansen gegeben wurde. Des weiteren wurden alle 20

Minuten bis 12 Uhr weitere Duodenalchymusproben genommen. Ab 7 Uhr 30

erfolgte zusätzlich alle 10 Minuten eine Blutentnahme mittels einer 2 ml Spritze zur

Bestimmung von Glucose im Vollblut bzw. mittels Serumröhrchen zur Bestimmung

von Kalium und Insulin im Serum. Nach Gerinnung wurden die Serumproben 10

Minuten bei 4000 U/min zentrifugiert und das Serum anschließend mit Hilfe von

Transferpipetten in Eppendorfgefäße (1 ml) überführt. Die Glukosewerte konnten

unmittelbar nach der Beprobung mit Hilfe eines Blutzuckermessgerätes bestimmt

werden. Nach Entnahme der Blutproben wurden die Katheter jeweils mit 10 ml

physiologischer Kochsalzlösung gespült und nach der letzten Probe mit dem

zugehörigen Inlet/Platzhalter versehen.

Material und Methoden 45

Um 12 Uhr 15 wurde der zweite Venenverweilkatheter gelegt und das Versuchstier

antibiotisch mit Procain-Penicillin (30.000 I.E./kg) versorgt. Gegen 15 Uhr wurden die

Chymusproben 15 Minuten bei 19000 U/min mit einem Sorvall SS-34-Rotor

zentrifugiert und der Überstand in Szintillationsgefäße pipettiert. Die Serum- und

zentrifugierten Chymusproben wurden bei –20 °C eing efroren und zu späteren

Zeitpunkten jeweils in kleinen Portionen für die weiteren Analysen aufgetaut.

Tag 2 und 3: Zusätzlich zum Ablauf des ersten Tages wurden von 8 Uhr bis 12 Uhr

die Insulinpumpe und die Glukoseinfusionsflasche mittels Infusionsbesteck am

Dreiwegehahn angeschlossen. Erstere wurde auf eine Infusionsrate von 1 ml/min

eingestellt, die Glukoseinfusion je nach Blutglukosewerten korrigiert. Um eine

genaue Infusionsmenge zu garantieren, wurde das Gewicht der Insulinlösung vor

und nach der Infusion bestimmt. Zusätzlich wurde eine Probe der

Insulininfusionslösung in Eppendorf-Cups pipettiert und bis zur Insulinbestimmung

zusammen mit den Chymus- und Serumproben bei –20 °C aufbewahrt.

Nach der vierstündigen Insulininfusionsperiode schloss sich eine eineinhalbstündige

Phase der Nachkontrolle an, in der zunächst Glukose über eine halbe Stunde weiter

infundiert und schließlich noch über eine weitere Stunde der Blutglukosespiegel

kontrolliert wurde.

Am letzten Versuchstag wurden gegen 14 Uhr die Katheter entfernt und die Tiere

abschließend untersucht.

3.2.3 Analysen

3.2.3.1 Insulin

Die Bestimmung der Insulinkonzentration im Serum erfolgte mittels eines für bovines

Insulin spezifischen ELISAs, einem „solid phase two-site enzyme immunoassay“.

Das bei Raumtemperatur aufgetaute Probandenserum (25 µl) wurde im

Doppelansatz auf eine mit monoklonalen, gegen Rinderinsulin gerichteten

Antikörpern beschichtete Mikrotiterplatte pipettiert und mit 100 µl einer Lösung

überschichtet, die monoklonale Peroxidase-konjugierte, gegen Rinderinsulin

gerichtete Antikörper enthielt. Nach einer Inkubationszeit von 2 h auf einem ELISA-

Schüttler (700 rpm) wurden in einem sechsfachen Waschvorgang ungebundene

46 Material und Methoden

Peroxidase-konjugierte Antikörper entfernt und die gebundenen mit Hilfe von 3,3´-

5,5´-tetramethylbenzidin (200 µl) dargestellt (Blaufärbung). Nach 15 Minuten wurde

die Reaktion mit 50 µl einer 0,5 molaren H2SO4-Lösung gestoppt (Gelbfärbung) und

innerhalb der nächsten halben Stunde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge

von 450 nm gemessen.

Mit den im Test enthaltenen Standards aus bovinem Insulin (0,05; 0,15; 0,5; 1,5 und

3 µg/l) und einem Nullstandard wurden an jedem Messtag Eichkurven erstellt.

Der Standardbereich des Tests lag bei 0,05-3,0 µg/l bei einer analytischen

Sensitivität von 0,025 µg/l. Für den Variationskoeffizienten der eigenen Proben

wurde 8,15 % ermittelt.

3.2.3.2 Kalium

Die Bestimmung von Kalium im Serum erfolgte gegen 15 Uhr des selben

Versuchstages. Das Probandenserum wurde im Labor der Klinik für Rinder,

Tierärztliche Hochschule, mittels einer ionensensitiven Elektrode (614 Na+/K+

Analyser) analysiert.

3.2.3.3 Chrom

Die Chromkonzentration im Duodenalchymus wurde mittels

Atomabsorptionsspektrometrie (UNICAM 969) im Institut für Tierernährung,

Tierärztliche Hochschule Hannover, bestimmt. Dazu wurden die Proben vor dem

Einfrieren und nach dem Auftauen mit 19000 rpm zentrifugiert.

Ein Flammen-Atomabsorptionsspektrometer besteht aus einer Lichtquelle

(Hohlkathodenlampe), der Absorptionszelle (Flamme), dem Monochromator (zur

Trennung der Resonanzlinie von anderen Spektrallinien) und dem Detektor

(Photomultiplier). Freie Metallatome werden durch Atomisierungsquellen erzeugt; die

Atomisierung kann dabei in der Flamme (Luft/Acetylen) erfolgen.

Das Prinzip der Atomabsorptionsspektrometrie beruht auf dem Lambert-Beer-

Gesetz:

Material und Methoden 47

Io

A= ----- = k * d * c Id

Io: Intensität des eingestrahlten Lichts, Id: Intensität des durchgestrahlten Lichts, k:

Konstante, c: Konzentration des Chroms, d: Schichtdicke

Die Absorption ist also proportional der durchstrahlten Schichtdicke und der

Konzentration des absorbierenden Stoffes, umgekehrt lässt die gemessene

Absorption Rückschlüsse auf die Konzentration des zu messenden Stoffes im

Untersuchungsmaterial zu.

3.2.3.4 Berechnung des Labmageneffluxes

Bei der im Folgenden beschriebenen Methode zur Berechnung des

Labmageneffluxes liegt die Annahme zugrunde, dass dieser mit dem Duodenalfluss

übereinstimmt, da die Berechnung des Labmageneffluxes mit Hilfe der gemessenen

„steady state“-Chromkonzentration im Duodenal- und nicht im Labmagenchymus

erfolgte. Dieser „steady state“ war dann erreicht, wenn sich das Chrom gleichmäßig

auf Vormägen und Labmagen verteilt hatte und die in den Pansen gegebene

Chrommenge der aus dem Labmagen abfließenden entsprach. Vorversuche, die an

drei Kühen zur Überprüfung der Methode zur Bestimmung des Effluxes durchgeführt

wurden, ergaben, dass dieser Zustand nach drei bis vier Stunden erreicht war

(Abbildung 3).

48 Material und Methoden

0

500

1000

1500

2000

120 180 240

min nach der ersten Chromzugabe

erre

chne

te E

fflux

men

ge in

m

l/min

Abbildung 3: Effluxmessungen während der Vorversuch e mit Erreichen des steady states nach

ca. drei bis vier Stunden

Der Efflux wurde dabei anhand der Chromwerte im Duodenalchymus und der pro

Minute zugegebenen Menge Chrom in den Pansen nach folgender Formel

berechnet:

Zugegebene Menge Chrom in mg/min

--------------------------------------------------------------- = l/min gemessene Chromkonzentration in mg/l Da allerdings an Tag 2 und 3 zum Zeitpunkt 0 die Chromwerte noch erhöht waren

von den Gaben am Vortag, mussten diese von den für die Effluxmessung genutzten

Werten subtrahiert werden. Jedoch ist in den verbleibenden vier Stunden vom

Zeitpunkt 0 bis zum steady state ein weiteres Abnehmen der verbliebenen

Chromkonzentration des Vortags anzunehmen. Diese Abnahme erfolgt exponentiell:

t = t0*e-yx

t0 = letzter Chromwert am Vortag; y = Chromeliminationsrate;

x = aktueller Messzeitpunkt

Material und Methoden 49

So konnte aus dem letzten Chromwert des Vortags und den ersten des aktuellen

Versuchstages, an denen das neu zugegebene Chrom das Duodenum noch nicht

erreicht hatte, der zu subtrahierende Chromwert kalkuliert werden.

3.3 Statistik

Die statistische Auswertung wurde unter Verwendung des Statistikprogrames SAS

Version 9.1 durchgeführt. Die Erstellung der Graphiken erfolgte mit dem Programm

Microsoft® EXCEL des Programmpaketes Office XP Professional 2003.

Zur Auswertung der Ergebnisse des In-vitro-Versuches wurden die Medianwerte der

Motilitätsparameter mit den jeweiligen Minima und Maxima errechnet, da in der

überwiegenden Anzahl die Daten nicht normal verteilt waren. Die Normalverteilung

wurde mit dem Test nach Kolmogorov-Smirnov überprüft.

Die angegebenen n-Zahlen entsprechen der Anzahl der Versuchstiere. Der Einfluss

der Testsubstanzen wurde zunächst mit der einfaktoriellen Varianzanalyse überprüft;

der Vergleich zweier Medianwerte sowohl zwischen den einzelnen Konzentrationen

als auch zwischen Versuchs- und Kontrollkurve erfolgte anschließend mittels signed-

rank-Test für verbundene Stichproben.

Im In-vivo-Versuch wurden die Mittelwerte für Kalium, Insulin und den

Labmagenefflux mit Hilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse für verbundene

Stichproben verglichen.

Alle Tests wurden auf einem Signifikanzniveau von p<0,05 durchgeführt.

50 Ergebnisse

4 Ergebnisse

4.1 In-vitro-Versuch

4.1.1 Aktivität der circulären Corpusmuskulatur

4.1.1.1 Basale Aktivität der circulären Corpusmuskulatur

Um den Einfluss der Zeit auf die Vorgänge an der isolierten Muskulatur unter Kalium-

oder Insulingaben einschätzen zu können, wurde zunächst das

Kontraktionsverhalten über einen Zeitraum von 2,5 h unter normokaliämischen

Bedingungen getestet. Präparate der circulären Corpusmuskulatur der Ziege zeigten

über die gemessene Zeit von 2,5 Stunden bei einer extrazellulären

Kaliumkonzentration von 4,7 mmol/l einen Anstieg der mittleren Amplitude bei in

etwa gleichbleibender Frequenz (Tabelle 3). Daraus ergab sich auch für die

Kontraktionsaktivität (Abbildung 4) eine signifikante Zunahme von 11,13 (3,97;58,27)

auf 48,49 (26,09;193,65) mN/min.

Tabelle 3: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n Corpusmuskulatur der Ziege unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

Zeitpunkt

(h nach Versuchsbeginn)

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

0 2,6 (0,9;10,6)a 5 (3;7)

0,5 2,1 (0,8;13,7)a,b 6 (3;6)

1 3,1 (1,2;16,9)b,c 6 (3;8)

1,5 7,5 (1,1;15,5)b,c 7 (3;12)

2 9,0 (2,1;14,5)c 9 (3;9)

2,5 10,1 (3,7;27,7)c 7 (3;8)

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte ein Einfluss

der Zeit auf die Amplitude circulärer Corpusmuskula tur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Zeitpunkten sind

mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

Ergebnisse 51

0 0,5 1 1,5 2 2,50

10

20

30

40

50

60

Zeit (min)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 4: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur der Ziege unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte ein Einfluss

der Zeit auf die Kontraktionsaktivität circulärer C orpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Zeitpunkten sind

mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

Im Gegensatz zur Ziege zeigten die Präparate der bovinen circulären

Corpusmuskulatur vom Rind bei 4,7 mmol Kalium/l über die Zeit eine Abnahme der

Amplitude bei zunächst zunehmender, nach einer Stunde dann aber abnehmender

Kontraktionsaktivität (von 24,72 (6,87;246,23) auf 39,14 (7,06;161,03) auf 23,54

(7,65;150,29) mN/min) und unveränderter Frequenz (Tabelle 4; Abbildung 5).

a a

a,b

a,b b b

52 Ergebnisse

Tabelle 4: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n Corpusmuskulatur des Rindes unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

Zeitpunkt

(h nach Versuchsbeginn)

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

0 19,4 (2,0;55,1)a 3 (1;5)

0,5 15,0 (2,6;70,3)a 3 (1;6)

1 13,9 (2,7;100,3)a,b 4 (1;5)

1,5 10,7 (2,4;90,4)a,b 4 (1;6)

2 9,1 (2,1;113,9)a,b 4 (1;5)

2,5 8,4 (2,6;97,8)b 4 (1;5)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbunde ne Stichproben konnte ein Einfluss

der Zeit auf die Amplitude circulärer Corpusmuskula tur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Zeitpunkten sind

mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

Ergebnisse 53

0 0,5 1 1,5 2 2,50

100

200

300

Zeit (h)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 5: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur des Rindes unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte kein Einfluss

der Zeit auf die Kontraktionsaktivität circulärer C orpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Zeitpunkten sind

mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

4.1.1.2 Wirkung steigender Kaliumgaben auf die circuläre Corpusmuskulatur

Die Wirkung von Kalium auf die isolierte Labmagenmuskulatur wurde anhand einer

Kalium-Dosiswirkungskurve getestet. Equimolare Zugaben von NaCl zu

benachbarten Gewebestücken dienten dabei als Kontrolle für Zeit- und osmotische

Effekte (Tabelle 5). Zusätzlich wurden am selben Präparat NaCl- und KCl-Zugaben

nach zwischenzeitlichem Washout getestet.

a,b b

a,b a,b a,b

a

54 Ergebnisse

Tabelle 5: Versuchsschema zur Überprüfung der Kaliu mwirkung auf isolierte

Labmagenmuskulatur der Ziege

Kammer 1 Kammer 2

KCl (DWK-1) NaCl

Washout

Zeitvergleich

KCl (DWK-2)

Kammervergleich

DWK = Dosiswirkungskurve

Die circuläre Corpusmuskulatur der Ziege reagierte auf steigende Zugaben von KCl

mit einer Zunahme der Amplitude und auch der Kontraktionsaktivität (von 7,28

(0;54,25) auf 90,07 (33,87;228,08) mN/min) bei gleichbleibender Frequenz. In der

Kontrolle mit steigenden NaCl-Gaben kam es zu geringeren Zunahmen von

Amplitude und Kontraktionsaktivität 8,58 (0;58,86) auf 35,73 (10,84;167,60) mN/min)

bei ebenfalls unbeeinflusster Frequenz (Abbildung 6 und Tabelle 6). Beim Vergleich

der NaCl- und KCl-Effekte am selben Präparat zeigten sich deutliche Zeiteffekte, da

die später im Versuch applizierten Kaliummengen zu geringeren Reaktionen der

Muskelstreifen führte (Abbildung 7). Bei wiederum unveränderter Frequenz fiel die

Zunahme der Amplitude signifikant geringer aus. Daraus resultierte ein Anstieg der

Kontraktionsaktivität von lediglich 13,10 (0;62,54) auf 55,77 (7,50;105,16) mN/ min

bei 7 mmol/l bzw. 48,83 (10,30;85,45) mN/min bei 10 mmol Kalium/l. Beim Vergleich

der beiden Kalium-Dosiswirkungskurven, die um ca. 3 h zeitversetzt liegen, ist die

Abnahme der Parameter erkennbar (Abbildung 8).

Ergebnisse 55

Tabelle 6: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Frequenz und Amplitude an der circuläre n

Corpusmuskulatur der Ziege unter dem Einfluss steig ender Kaliumkonzentrationen

[K+] in

mmol/l

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

K+-DWK-1 Kontrolle

(NaCl)

K+-DWK-2 K+-

DWK-1

Kon-

trolle

K+-

DWK-2

4,7 3,4

(0;28,4)a,c,d

5,6

(1,5;18,7)a

5

(0;12)

6

(4;7)

1 1,1

(0;7,9)b

1,5

(0;7,4)b

2,5

(0;8,3)a

4

(0;7)

5

(0;8)

6

(0;8)

3 3,8

(0,35,0)a

2,6

(0;6,3)b

3,6

(0;9,9)a

5

(0;13)

4

(0;12)

4

(0;8)

4 6,2

(0;35,9)c

3,0

(0;6,7)b

3,8

(2,5;11,6)b

5

(0;14)

5

(0;13)

4

(2;8)

5 6,4

(0,9;41,2)d

3,6

(0;8,0)b

5,6

(2,2;14,7)b

6

(3;13)

6

(0;14)

5

(3;8)

6 9,5

(1,7;54,0)e * 4,4

(0,7;14,2)a,b * 8,1

(2,0;18,8)c

6

(3;12)

6

(4;10)

5

(3;9)

7 11,0

(1,7;54,0)e * 6,5

(0,8;15,7)a

8,4

(1,7;19,5)c

6

(3;12)

6

(4;9)

5

(3;8)

10 12,5

(3,7;76,5)e * 7,0

(1,7;19,7)a

8,3

(2,4;23,1)b,c

6

(3;16)

6

(5;9)

5

(3;7)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Amplitude circulärer Corpusmusku latur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert. Die Amp lituden von K +-DWK-1 und K +-DWK-2

unterscheiden sich bei einer Kalium - Konzentration von 10 mmol/l.

DWK = Kalium-Dosiswirkungskurve zu Beginn (K +-DWK-1) und im Anschluss an die NaCl-

Zugaben (K +-DWK-2)

56 Ergebnisse

4,7 1 3 4 5 6 7 100

50

100

150

200

250

K-DWK-1 Kontrolle

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 6: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur

der Ziege unter dem Einfluss steigender KCl-Gaben ( Kammervergleich)

Bei Kontrollgeweben wurden gleichzeitig equimolare Mengen NaCl zugegeben.

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Kontraktionsaktivität circulärer Corpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

a b a,c,d c d e e e

b b b b a,b a a a

* *

Ergebnisse 57

1 3 4 5 6 7 100

100

200

KontrolleK-DWK-2

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 7: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur

der Ziege unter dem Einfluss steigender KCl-Gaben ( Zeitvergleich)

Bei Kontrollgeweben wurden gleichzeitig equimolare Mengen NaCl zugegeben.

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Kontraktionsaktivität circulärer Corpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben ergaben sich nicht.

a a a a b a,b b

a a b b c c b,c

58 Ergebnisse

1 3 4 5 6 7 100

50

100

150

200

250

K-DWK-1 K-DWK-2

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 8: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur

der Ziege unter dem Einfluss von Kalium-Dosiswirkun gskurven an unterschiedlichen

Präparaten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten

n = 10; signed rank – Test: signifikante Unterschie de zwischen den beiden Kurven sind mit *

markiert.

Ähnliche Verhältnisse fanden sich an der circulären Corpusmuskulatur des Rindes

wieder: Auch hier äußerte sich der K+-Effekt in einer signifikanten Erhöhung der

Amplitude und demzufolge der Kontraktionsaktivität von 9,36 (0;78,38) auf 29,87

(0;157,73) mN/min (jeweils mit p<0,05) ohne Einflussnahme auf die Frequenz. In der

NaCl-Kontrolle sank sowohl die Frequenz als auch die Kontraktionsaktivität (von 7,85

(0;48,56) auf 2,89 (0;21,19) mN/min) bei unveränderter Amplitude ab (Abbildung 9).

Allerdings war, wie Abbildung 10 und Tabelle 8 zeigen, auch beim Rind eine

zusätzliche Abnahme der Parameter über die Zeit nachweisbar: Stiegen bei zwei

aufeinander folgenden Kalium- Dosiswirkungskurven bei gleichbleibender Frequenz

Amplitude und Kontraktionsaktivität zunächst noch von 9,25 (0;100,36) auf 34,43

(0;178,05) mN/min bei 6 mmol Kalium/l bzw. 29,72 (0;145,68) mN/min bei 10 mmol

Kalium/l an, so kam es bei der Wiederholung zu geringeren Veränderungen.

* *

Ergebnisse 59

Tabelle 7: Versuchsschema zur Überprüfung der Kaliu mwirkung auf isolierte

Labmagenmuskulatur vom Rind

DWK = Dosiswirkungskurve

Kammer 1 Kammer 2

Kontrolle (NaCl) KCl (K+-DWK-1)

Washout

Zeitvergleich

KCl (K+-DWK) KCl (K+-DWK-2)

Kammervergleich

60 Ergebnisse

Tabelle 8: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Frequenz und Amplitude an der circuläre n

Corpusmuskulatur des Rindes unter dem Einfluss stei gender Kaliumkonzentrationen

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

Kammervergleich Zeitvergleich Kammervergleich Zeitvergleich

[K+]

in

mM Kontrolle

(NaCl)

K+-DWK K+-

DWK-1

K+-

DWK-2

Kontrolle

(NaCl)

K+-

DWK

K+-

DWK-

1

K+-

DWK-

2

4,7 8,6

(0,7;24,6)a

9,0

(0;42,2)a

4

(1;9)a

4

(0;10)a

1 3,2

(0;7,6)b

2,6

(0,25,4)b

2,6

(0;18,2)a

3,0

(0;14,3)a

2

(0;9)a

3

(0;7)a

4

(0;7)

2

(0;6) 3 2,4

(0;7,6)b

3,1

(0;23,5)b

4,2

(0;35,7)b

2,8

(0;6,5)a

2

(0;9)a

4

(0;9)a

5

(0;6)

2

(0;7) 4 1,8

(0;5,3)b

4,2

(0;26,6)b,c

5,3

(0;42,3)b

2,6

(0;8)a

2

(0;10)a

4

(0;9)a

5

(0;7)

3

(0;6) 5 2,9

(0;7,3)b

4,5

(0;40,6)c

5,5

(0;42,2)b

* 2,7

(0;15,6)a

2

(0;10)a

3

(0;9)a

5

(0;8)

5

(0;6) 6 2,6

(0;6,0)b

* 5,0

(0;52,6)c

5,9

(0;35,6)b

4,0

(0;17,3)a

1

(0;4)b

3

(0;7)a

5

(0;7)

3

(0;7) 7 2,3

(0;8,9)b

* 6,1

(0;53,1)c

5,5

(0;37,9)b

4,8

(0;18,4)a

1

(0;3)b

3

(0;6)a

5

(0;7)

4

(0;6) 10 2,6

(0;10,6)b

* 6,3

(0;64,8)c

7,0

(0;32,4)b

5,0

(0;22,2)a

1

(0;2)b

2

(0;7)b

4

(0;6)

4

(0;9)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Amplitude circulärer Corpusmusku latur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

Ergebnisse 61

4,7 1 3 4 5 6 7 100

100

200

K-DWK Kontrolle

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 9: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur

des Rindes unter dem Einfluss steigender KCl-Gaben (Kammervergleich)

Bei Kontrollgeweben wurden gleichzeitig equimolare Mengen NaCl zugegeben.

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Kontraktionsaktivität circulärer Corpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

a b b b c c c c

a b b b,c b,c c c c

* * * * *

62 Ergebnisse

1 3 4 5 6 7 100

100

200

300

K-DWK-1 K-DWK-2

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 10: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur

des Rindes unter Einfluss von zwei nacheinander dur chgeführten Kalium-

Dosiswirkungskurven an demselben Präparat (Zeitverg leich)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Kontraktionsaktivität circulärer Corpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

4.1.1.3 Wirkung steigender Insulingaben auf die circuläre Corpusmuskulatur

Die Wirkung von Insulin wurde ebenfalls in Form einer Dosiswirkungskurve

gemessen und zwar zum einen bei 4,7 mmol KCl/l mit einer Zeitkontrolle und zum

anderen im direkten Vergleich der Kurven bei 3 bzw. 5 mmol KCl/l. Es kam dabei

unter dem Einfluss von Insulin an der circulären Corpusmuskulatur der Ziege im

Vergleich zur Zeitkontrolle bei unveränderter Frequenz zu einer signifikant

geringeren Zunahme von Amplitude und Kontraktionsaktivität: Letztere stieg in

Anwesenheit von Insulin lediglich von 57,3 (0;35,61) auf 27,76 (0;68,87) mN/min, die

Zeitkontrolle hingegen von 11,13 (3,97;58,27) auf 48,49 (26,09;193,65) mN/min

a a a

a a,b a,b a,b b

b b b b b a

* *

Ergebnisse 63

(Abbildung 11). Durch abschließende Erhöhung der Kaliumkonzentration von 4,7 auf

10 mmol/l konnte sowohl mit als auch ohne Insulin nur eine nominelle Steigerung von

Amplitude und Kontraktionsaktivität (auf 29,48 (0;93,59) mN/min mit bzw. 55,67

(29,43;208,36) mN/min ohne Insulin) erzielt werden (Tabelle 9).

Zudem konnten bei Insulin-Dosiswirkungskurven in Anwesenheit unterschiedlicher

Kaliumkonzentrationen (3 und 5 mmol/l KCl) keine Unterschiede in Amplitude,

Frequenz und Kontraktionsaktivität zwischen den beiden Kaliumkonzentrationen

festgestellt werden (Tabelle 10).

Tabelle 9: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n

Corpusmuskulatur der Ziege unter Einfluss einer Ins ulin-Dosiswirkungskurve mit Zeitkontrolle

(4,7 mmol Kalium/l)

[Insulin] in mU/l

bei 4,7 mmol KCl/l

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

Insulin-DWK Zeitkontrolle Insulin-

DWK

Zeitkontrolle

0 1,4 (0;6,5)a 2,6 (0,9;10,6)a 4 (0;6) 5 (3;7)

7 2,1 (0;7,7)a 2,1 (0,8;13,7)a 5 (0;7) 6 (3;6)

21 3,2 (0;10,4)a,b 3,1 (1,2;16,9)a,b 5 (0;7) 6 (3;8)

42 4,1 (0;13,8)b 7,5 (1,1;15,5)a,b 5 (0;10) 7 (3;12)

80 4,3 0;12,1)b * 9,0 (2,1;14,5)b 5 (0;9) 7 (3;9)

120 3,8 (0;19,8)b * 10,1 (3,7;27,7)b 5 (0;12) 7 (3;8)

120 bei 10 mmol KCl/l 5,9 (0,21,2)b * 11,8 (4,2;34,7)b 4 (0;6) 6 (3;8)

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Insulin auf die Amplitude circulärer Corpusmusk ulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

64 Ergebnisse

0 7 21 42 80 1200

10

20

30

40

50

60

70

mit Insulin ohne Insulin

Insulinkonzentration (mU/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 11: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur

der Ziege unter Einfluss einer Insulin-Dosiswirkung skurve mit Zeitkontrolle (4,7 mmol Kalium/l)

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Insulin auf die Kontraktionsaktivität circuläre r Corpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

a a a,b b b b

a a,b b b ba

* *

Ergebnisse 65

Tabelle 10: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude, Frequenz und Kontraktionsakt ivität an der

circulären Corpusmuskulatur der Ziege unter Einflus s einer Insulin-Dosiswirkungskurve in

Anwesenheit von 3 bzw. 5 mmol KCl/l

[Insulin]

in mU/l

Amplitude (mN) Frequenz

(1/min)

Kontraktions-

aktivität (mN/min)

3 mmol

KCl/l

5 mmol

KCl/l

3

mmol

KCl/l

5

mmol

KCl/l

3 mmol

KCl/l

5 mmol

KCl/l

0 7,5

(0;12,4)

6,1

(0;10,2)

6

(0;7)

5

(0;9)

45,32

(0;70,63)

35,44

(0;75,88)

7 9,1

(0;16,1)

8,2

(0;39,3)

6

(0;13)

5

(0;13)

51,65

(0;172;17)

40,4

(0;196,69)

21 12,3

(1,5;21,4)

9,6

(0,6;64,7)

6

(3;7)

5

(1;16)

75,81

(4,66;106,93)

58,35

(0,63;323,73)

42 13,6

(1,9;40,8)

9,5

(0;73,6)

6

(3;7)

5

(0;13)

65,96

(4,66;244,86)

54,98

(0;367,88)

80 13,7

(2,3;36,4)

10,5

(0,6;46,6)

5

(1;7)

6

(2;14)

60,10

(5,64;181,98)

43,07

(1,18;279,59)

120 13,0

(0;15,2)

11,3

(0;37,9)

5

(1;6)

6

(0;7)

68,20

(0;91,23)

58,69

(0;208,27)

+10

mmol

KCl

14,3

(1,5;41,3)

10,9

(0;33,3)

5

(2;7)

5

(0;7)

88,73

(2,21;165,20)

60,39

(0;183,45)

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

An den Isolaten der bovinen circulären Corpusmuskulatur konnte im Gegensatz zur

Zeitkontrolle unter dem Einfluss steigender Insulinkonzentrationen im

normoinsulinämischen Bereich (7 mU Insulin/l) zunächst ein nomineller Anstieg der

Amplitude, unter hyperinsulinämischen Bedingungen jedoch eine signifikante

66 Ergebnisse

Abnahme von Amplitude und Kontraktionsaktivität verzeichnet werden. Letztere

sank von 34,53 (3,48;186,39) auf 12,01 (4,41;78,97) mN/min bei 120 mU Insulin/l

(Abbildung 12 und Tabelle 11).

Tabelle 11: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n

Corpusmuskulatur des Rindes unter Einfluss einer In sulin-Dosiswirkungskurve mit

Zeitkontrolle (4,7 mmol Kalium/l)

[Insulin] in mU/l

bei 4,7 mmol KCl/l

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

Insulin-DWK Zeitkontrolle Insulin-

DWK

Zeitkontrolle

0 22,2 (2,0;115,1)a 19,4 (2,0;55,1)a 3 (1;5) 3 (1;5)

7 25,1 (1,4;147,5)a,b 15,0 (2,6;70,3)a 3 (1;6) 3 (1;6)

21 13,3 (1,6;98,6)b,c 13,9 (2,7;100,3)a,b 3 (1;6) 4 (1;5)

42 14,1 (1,6;97,1)c 10,7 (2,4;90,4)a,b 3 (3;5) 4 (1;6)

80 5,4 (1,7;83,4)d * 9,1 (2,1;113,9)b 3 (1;5) 4 (1;5)

120 6,13 (1,8;65,7)d * 8,4 (2,6;97,8)b 3 (1;5) 4 (1;5)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbunde ne Stichproben konnte ein Einfluss

von Insulin auf die Amplitude circulärer Corpusmusk ulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

Ergebnisse 67

0 7 21 42 80 1200

100

200

300

mit Insulin ohne Insulin

Insulin (mU/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 12: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur

des Rindes unter Einfluss einer Insulin-Dosiswirkun gskurve mit Zeitkontrolle (4,7 mmol

Kalium/l)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Insulin auf die Kontraktionsaktivität circuläre r Corpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

4.1.1.4 Wirkung von Insulin bei steigenden Kaliumgaben auf die circuläre

Corpusmuskulatur

In einem nächsten Schritt wurde geprüft, inwiefern normo- (7 mU Insulin) bzw.

hyperinsuliämische (42 mU Insulin) Bedingungen die Antwort der isolierten

Muskulatur auf eine Kalium-Dosiswirkungskurve beeinflussen. Getestet wurde dies

zeitgleich an drei Präparaten in Anwesenheit von 0, 7 und 40 mU Insulin/l. Dabei

ergaben sich keine Unterschiede zwischen den drei Gruppen (Abbildung 13 und

Tabelle 12).

a a,b a b,c c,d d

a a,b a,b a,b a,b b

* * *

68 Ergebnisse

Tabelle 12: In-vitro-Motilitätsmessung an isolierter Labmagenmu skulatur zur Einflussnahme

verschiedener Insulinkonzentrationen auf den Verlau f einer Kalium-Dosiswirkungskurve:

Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n Corpusmuskulatur der Ziege unter

Einfluss von Kalium-Dosiswirkungskurven bei verschi edenen Insulinkonzentrationen

[Kalium]

in mmol/l

Amplitude (mN)

0 mU

Insulin/l

7 mU

Insulin/l

42 mU

Insulin/l

1 2,5 (0;8,3) 2,8 (0;15,5) 2,7 (0;12,1)

3 3,6 (0;9,9) 3,2 (1,5;23,5) 7,5 (0;11,5)

4 6,2 (2,5;11,6) 6,5 (2,1;20,6) 7,9 (0;12,2)

5 6,4 (2,2;14,7) 7,1 (1,3;22,5) 9,0 (1,2;14,8)

6 9,5 (2,0;18,8) 7,5 (1,7;24,0) 9,7 (1,1;16,4)

7 11,0 (1,7;19,5) 6,6 (1,3;25,6) 9,6 (0,7;18,1)

10 8,3 (2,4;23,1) 8,5 (1,4;16,9) 7,2 (1,0;21,4)

Frequenz (1/min)

1 6 (0;8) 5 (0;7) 6 (0;8)

3 4 (0;8) 6 (5;7) 5 (0;7)

4 4 (2;8) 5 (3;7) 5 (0;7)

5 5 (3;8) 6 (4;8) 6 (5;7)

6 5 (3;9) 6 (4;7) 5 (5;7)

7 5 (3;8) 6 (4;7) 5 (3;7)

10 5 (3;7) 5 (3;6) 5 (4;6)

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

Ergebnisse 69

1 2 3 4 5 6 70

50

100

150

7 mU Insulin/l 42 mU Insulin/l 0 mU Insulin/l

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 13: In-vitro-Motilitätsmessung an isolierter Labmagenmu skulatur zur Einflussnahme

verschiedener Insulinkonzentrationen auf den Verlau f einer Kalium-Dosiswirkungskurve:

Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur der Ziege unter Einfluss

einer Kalium-Dosiswirkungskurve bei verschiedenen I nsulinkonzentrationen

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

Auch an der circulären Corpusmuskulatur der Rinder konnten bei der Kalium-

Dosiswirkungskurve keine Unterschiede zwischen normo-, hypo- und

hyperinsuliämischen Bedingungen festgestellt werden (Abbildung 14 und Tabelle

13).

70 Ergebnisse

Tabelle 13: In-vitro-Motilitätsmessung an isolierter Labmagenmu skulatur zur Einflussnahme

verschiedener Insulinkonzentrationen auf den Verlau f einer Kalium-Dosiswirkungskurve:

Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n Corpusmuskulatur des Rindes unter

Einfluss von Kalium-Dosiswirkungskurven bei verschi edenen Insulinkonzentrationen

[Kalium] in

mmol/l

Amplitude (mN)

0 mU

Insulin/l

7 mU

Insulin/l

42 mU

Insulin/l

1 3,0 (0;14,3) 3,6 (0;6,6) 4,3 (0;21,7)

3 2,8 (0;6,5) 2,1 (0;6,3) 2,5 (0,5;22,6)

4 2,6 (0;8,0) 2,0 (0,5;5,6) 2,1 (0;18,0)

5 2,7 (0;15,6) 2,8 (0;5,1) 3,7 (0,5;16,9)

6 4,0 (0;17,3) 3,4 (0;5,8) 5,1 (0;17,7)

7 4,8 (0;18,4) 2,7 (0;5,2) 3,7 (0;16,8)

10 5,0 (0;22,2) 3,3 (2,7;5,4) 5,6 (0;20,0)

Frequenz (1/min)

1 2 (0;6) 2 (0;5) 2 (0;4)

3 2 (0;7) 2 (0;4) 2 (1;4)

4 3 (0;6) 3 (1;5) 3 (0;4)

5 5 (0;6) 3 (0;5) 3 (1;6)

6 3 (0;7) 3 (0;5) 3 (0;8)

7 4 (0;6) 4 (0;6) 3 (0;6)

10 4 (0;9) 4 (1;8) 3 (0;6)

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

Ergebnisse 71

1 2 3 4 5 6 70

50

100

150

7 mU Insulin/l42 mU Insulin/l0 mU Insulin/l

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 14: In-vitro-Motilitätsmessung an isolierter Labmagenmu skulatur zur Einflussnahme

verschiedener Insulinkonzentrationen auf den Verlau f einer Kalium-Dosiswirkungskurve:

Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Corpusmuskulatur des Rindes unter

Einfluss einer Kalium-Dosiswirkungskurve bei versch iedenen Insulinkonzentrationen.

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

4.1.1.5 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Barium

Aufgrund der möglichen Wirkung von Insulin über eine veränderte

Membranleitfähigkeit von Kalium wurde in einem nächsten Schritt der Effekt von

Insulin in Anwesenheit des unspezifischen Kaliumkanalblockers Barium (3 mmol/l)

getestet. Nach Zugabe dieses Stoffes nahm die Amplitude bei unveränderter

Frequenz zu. Dadurch stieg die Kontraktionsaktivität von 29,03 (2,55;763,22) vor der

Zugabe auf 278,97 (1,57;1077,63) mN/min) 30 Minuten nach der Zugabe. Die Gabe

von 80 mU Insulin/l verringerte in diesen Versuchen Amplitude und

Kontraktionsaktivität (von 30,80 (5,89;583,60) auf 14,71 (2,94;212,19) mN/min) bei

ebenfalls unbeeinflusster Frequenz. In Anwesenheit von Insulin konnte die Wirkung

von Barium auf Amplitude und Kontraktionsaktivität nur nominell verstärkt werden.

Die Kontraktionsaktivität erhöhte sich durch Barium nach der Insulinhemmung von

14,71 (2,94;212,19) auf 238,97 (1,57;1077,63) mN/min. Umgekehrt hatte Insulin

72 Ergebnisse

nach vorheriger Blockade der Kaliumkanäle durch 3 mmol Barium/l keinen Einfluss

mehr auf die Muskulatur (Abbildung 15 und Tabelle 14).

Tabelle 14: In-vitro-Motilitätsmessung zur Einflussnahme von Ba rium auf die Wirkung von

Insulin auf isolierte Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplituden und Frequenzen an der

circulären Corpusmuskulatur des Rindes unter der Wi rkung von Insulin in Anwesenheit von

Barium

Amplitude (mN) Frequenz (1/min) t (min

nach

Ver-

suchs-

beginn)

Insulin (bei t =

2 min) + Ba++

(bei t = 32)

3 mmol Ba++/l

(bei t =

17 min)

Ba++ (bei t = 17

min) + Insulin

(bei t = 92)

Insulin+

Ba++

3 mmol

Ba++/l

Ba++ +

Insulin

0 7,7

(2,4;129,7) a

7,7

(1,3;152,6) a

9,6

(0,5;94,4) a

4 (3;5) 4 (2;5) 4 (2;5)

15 6,0

(2,4;83,6) a,b

13,0

(2,0;158,0) a

16,3

(0,8;96,0) a

3 (2;5) 4 (2;5) 3 (1;5)

30 5,3

(1,2;64,3) b

52,2

(1,7;190,4) b

15,1

(2,5;161,9) a

3 (2;4) 4 (2;5) 3 (1;4)

45 43,7

(3,8;242,5) c

73,5

(0,8;215,5) b

15,4

(2,3;135,4) a

3 (3;5) 4 (2;5) 3 (2;4)

60 74,0

(7,3;310,2) c

68,0

(1,0;223,6) b

19,5

(2,6;137,3) a

3 (2;4) 4 (2;5) 3 (2;4)

75 55,2

(4,7;323,0) c

59,7

(1,1;211,8) b

29,5

(10,3;241,3) a

3 (2;4) 4 (2;5) 3 (1;4)

90 52,7

(4,8;305,7) c

57,9

(1,2;218,4) b

32,0

(11,3;246,3) b

3 (1;5) 4 (2;5) 3 (2;5)

105 43,6

(6,4;308,5) c

57,3

(1,2;219,5) b

31,0

(10,1;239,4) b

3 (1;4) 4 (2;5) 3 (2;5)

120 39,5

(2,2;288,3) c

54,2

(0,9;210,9) b

27,8

(8,8;237,6) b

3 (1;5) 4 (2;5) 2 (2;4)

Ergebnisse 73

135 45,8

(0,9;298,3) c

56,7

(1,1;201,1) b

26,3

(8,1;247,7) b

3 (1;5) 4 (2;5) 2 (2;5)

150 57,0

(1,1;283,5) c

57,5

(1,2;218,2) b

28,8

(6,7;246,4) b

3 (1;5) 4 (2;5) 2 (2;4)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Barium auf die Amplitude circulärer Corpusmusku latur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

in der Wirkung von Barium auf den Verlauf von Ampli tude und Frequenz der drei Kurven

konnten nicht festgestellt werden.

60 1350

250

500

750

1000

1250 Insulin + Barium

Barium

Barium + Insulin

Zeit (min)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 15: In-vitro-Motilitätsmessung zur Einflussnahme von Ba rium auf die Wirkung von

Insulin auf isolierte Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivitäten an der circulär en

Corpusmuskulatur des Rindes unter der Wirkung von I nsulin in Anwesenheit von Barium

1 = Zugabe von 80 mU Insulin/l (nach 2 min bei Ins. + Ba.; nach 92 min bei Ba. + Ins.)

2 = Zugabe von 3 mmol Barium/l (nach 17 min bei Ba. und Ba. + Ins.; nach 32 min bei Ins. + Ba.)

Signifikante Unterschiede (p<0,05) der Kontraktions aktivität entsprechen den in Tabelle 14 in

der Spalte „Amplitude“ dargestellten Signifikanzen. Signifikante Unterschiede in der Wirkung

von Barium auf den Verlauf der Kontraktionsaktivitä t der drei Kurven konnten nicht festgestellt

werden.

1 2 2

1

74 Ergebnisse

4.1.1.6 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Glybenclamid

Um die wahrscheinlich vorhandene Insulinwirkung auf die Kaliumkanäle zu

spezifizieren, wurden mittels 0,05 mmol Glybenclamid/l ATP-sensitive Kanäle

geblockt. Durch die Glybenclamidgabe nahmen bei unveränderter Frequenz sowohl

Amplitude als auch Kontraktionsaktivität (von 12,04 (1,96;32,62) auf 18,88 (121,55)

mN/min) unmittelbar nach der Zugabe zu. Die Gabe von 80 mU Insulin/l verringerte

bei ebenfalls unbeeinflusster Frequenz Amplitude und Kontraktionsaktivität.

In Anwesenheit von Insulin kam es nach der Zugabe von Glybenclamid zwar

ebenfalls zu einer Erhöhung von Amplitude und Kontraktionsaktivität (von 5,96

(0;12,65) auf 31,78 (1,77;60,33) mN/min, jedoch konnte kein signifikanter

Unterschied zu dem Anstieg der beiden Parameter ohne Insulin festgestellt werden.

Umgekehrt hatte Insulin nach vorheriger Glybenclamidgabe keinen Einfluss mehr auf

die Muskulatur (Abbildung 16 und Tabelle 15).

Ergebnisse 75

Tabelle 15: In-vitro-Motilitätsmessung zur Einflussnahme von Gl ybenclamid auf die Wirkung

von Insulin auf isolierte Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplituden und Frequenzen an der

circulären Corpusmuskulatur des Rindes unter der Wi rkung von Insulin in Anwesenheit von

Glybenclamid

Amplitude (mN) Frequenz (1/min) t

(min nach

Versuchs-

beginn)

Insulin (bei t = 2

min) + Glyb.

(bei t = 17 min)

0,05 mmol

Glyb./l (bei t

= 2 min)

Glyb. (bei t = 2

min) + Insulin

(bei t = 62 min)

Ins.+

Glyb.

0,05

mmol

Glyb./l

Gyb.

+ Ins.

0 4,3

(1,7;6,0) a

4,3

(1,0;13,0) a

2,8

(1,5;8,8) a

3 (2;4) 3 (2;4) 3 (1;3)

15 3,6

(1,2;6,1) b

5,4

(1,0;16,4) a

4,5

(2,0;11,0) a,b

2 (0;3) 3 (2;4) 3 (1;3)

30 5,2

(1,8;6,7) a

5,2

(2,1;22,3) a,b

4,3

(1,5;14,9) a,b

3 (2;4) 3 (1;4) 4 (1;4)

45 6,9

(1,0;10,2) c

5,4

(1,9;34,7) a,b

4,9

(1,4;21,2) a,b

3 (2;4) 3 (1;4) 3 (1;4)

60 7,5

(0,9;11,7) c

6,4

(1,8;39,7) b

6,1

(1,0;23,9) b

3 (2;4) 3 (1;4) 3 (1;4)

75 8,5

(0,7;13,9) c

7,6

(1,3;40,3) b

5,6

(1,3;24,5) b

3 (2;4) 3 (2;4) 3 (2;4)

90 9,0

(0,8;17,4) c,d

6,3

(1,5;46,3) b

6,6

(1,3;28,6) b

3 (2;4) 3 (2;4) 3 (2;4)

105 10,6

(1,2;20,1) d

7,8

(1,7;45,0) b

7,3

(1,3;30,0) b

3 (2;4) 3 (1;4) 3 (1;4)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Glybenclamid auf die Amplitude circulärer Corpu smuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

in der Wirkung von Glybenclamid auf den Verlauf von Amplitude und Frequenz der drei Kurven

konnten nicht festgestellt werden.

76 Ergebnisse

0 15 30 45 60 75 90 1050

100

200

Insulin + Glybenclamid

Glybenclamid

Insulin + Glybenclamid

Zeit (min)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 16: In-vitro-Motilitätsmessung zur Einflussnahme von Gl ybenclamid auf die Wirkung

von Insulin auf isolierte Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivitäten an der

circulären Corpusmuskulatur des Rindes unter der Wi rkung von Insulin in Anwesenheit von

Glybenclamid

1 = Zugabe von 80 mU Insulin/l bzw. 0,05 mmol Glybe nclamid/l (nach 2 min)

2 = Zugabe von 0,05 mmol Glybenclamid/l (nach 17 mi n bei Insulin + Glybenclamid)

3 = Zugabe von 80 mU Insulin/l (nach 62 min bei Gly benclamid + Insulin)

Signifikante Unterschiede (p<0,05) der Kontraktions aktivität entsprechen den in Tabelle 15 in

der Spalte „Amplitude“ dargestellten Signifikanzen. Signifikante Unterschiede in der Wirkung

von Glybenclamid auf den Verlauf der Kontraktionsak tivität der drei Kurven konnten nicht

festgestellt werden.

4.1.1.7 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Ouabain

Aufgrund der in der Literatur beschriebenen Insulin-bedingten Stimulation der

Na+/K+-ATPase wurde in einem nächsten Schritt die Wirkung von Insulin in

Anwesenheit von 0,001 mmol Ouabain/l getestet.

Die Gabe dieses Hemmers der Na+/K+-ATPase führte bei unveränderter Frequenz

zunächst zu einem nominellen Anstieg von Amplitude und Kontraktionsaktivität (von

10,15 (2,55;47,82) auf 24,03 (0;127,53) mN/min) unmittelbar nach der Zugabe und

1

3

2

Ergebnisse 77

nach ca. 30 Minuten zu einem Abfall der beiden Parameter. Die Kontraktionsaktivität

verringerte sich im Zuge dessen auf 1,84 (0;28,25) mN/min. Die Gabe von 80 mU

Insulin/l verringerte bei ebenfalls unbeeinflusster Frequenz Amplitude und

Kontraktionsaktivität in diesem Versuch nur nominell.

Die Anwesenheit von Insulin hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Wirkung des

Ouabains. Umgekehrt hatte Insulin nach vorheriger Ouabaingabe auch in diesem

Fall keinen Einfluss mehr auf die Muskulatur (Abbildung 17 und Tabelle 16).

Tabelle 16: In-vitro-Motilitätsmessung zur Einflussnahme von Ou abain auf die Wirkung von

Insulin auf isolierte Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplituden und Frequenzen an der

circulären Corpusmuskulatur des Rindes unter der Wi rkung von Insulin in Anwesenheit von

Ouabain

Amplitude (mN) Frequenz (1/min) t

(min

nach

Ver-

suchs-

beginn)

Ins. (bei t =

2 min) +

Ouabain (bei t

= 32 min)

Ouabain (bei t

= 2 min)

Ouabain (bei t

= 2 min) + Ins.

(bei t =

32 min)

Ins.+

Oua-

bain

Oua-

bain

Oua-

bain +

Ins.

0 3,4 (0,9;28,7) a 3,4 (1,1;19,1) a,b 2,4 (0;32,8) a,b 3 (2;5) 3 (2;5) 3 (0;4)

15 3,0 (1,8;28,9) a 4,4 (1,5;20,2) a,b 3,0 (1,0;36,2) a,b 3 (2;4) 3 (2;4) 3 (2;4)

30 2,7 (0;29,2) a 5,2 (0,9;22,3) a 3,1 (1,5;86,3) a 3 (0;3) 3 (2;8) 3 (2;4)

45 3,2 (0;24,8) a 7,2 (0;31,9) a 4,2 (1,3;75,5) a 3 (0;6) 3 (0;8) 3 (2;4)

60 5,3 (0,8;36,7) a 2,0 (0;7,2) b 1,4 (0;14,7) b 3 (2;7) 3 (0;8) 3 (0;4)

75 3,3 (0;12,8) a,b 1,7 (0;8,4) b 1,2 (0;23,6) b 3 (0;9) 3 (0;9) 3 (0;8)

90 1,3 (0;17,3) a,b 1,1 (0;4,3) b 0,7 (0;19,7) b 3 (0;9) 3 (0;8) 2 (0;9)

105 0,8 (0;9,5) b 0,7 (0;3,6) b 0,8 (0;19,9) b 2 (0;9) 3 (0;9) 2 (0;9)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Ouabain auf die Amplitude circulärer Corpusmusk ulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

in der Wirkung von Ouabain auf den Verlauf von Ampl itude und Frequenz der drei Kurven

konnten nicht festgestellt werden.

78 Ergebnisse

0 15 30 45 60 75 90 1050

50

100

150

200

250

Insulin + Ouabain

Ouabain

Ouabain + Insulin

Zeit (min)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 17: In-vitro-Motilitätsmessung zur Einflussnahme von Ou abain auf die Wirkung von

Insulin auf isolierte Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivitäten an der circulär en

Corpusmuskulatur des Rindes unter der Wirkung von I nsulin in Anwesenheit von Ouabain

1 = 1. Zugabe von 80 mU Insulin/l bzw. 0,001 mmol O uabain/l (nach 2 min)

2 = 2. Zugabe von 80 mU Insulin/l bzw. 0,001 mmol O uabain/l (nach 32 min)

Signifikante Unterschiede (p<0,05) der Kontraktions aktivität entsprechen den in Tabelle 16 in

der Spalte „Amplitude“ dargestellten Signifikanzen. Signifikante Unterschiede in der Wirkung

von Ouabain auf den Verlauf der Kontraktionsaktivit ät der drei Kurven konnten nicht

festgestellt werden.

4.1.2 Aktivität der circulären Pylorusmuskulatur

4.1.2.1 Basale Aktivität der circulären Pylorusmuskulatur

Bei den Präparaten der circulären Pylorusmuskulatur der Ziege blieben über die

gemessene Zeit von 2,5 Stunden unter Standardbedingungen (bei 4,7 mmol KCl/l)

Frequenz, Amplitude und Kontraktionsaktivität weitestgehend konstant (Abbildung 18

und Tabelle 17).

1 2

Ergebnisse 79

Tabelle 17: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n Pylorusmuskulatur der Ziege unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

Zeitpunkt (h nach Versuchsbeginn) Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

0 0 (0;0,5) 0 (0;2)

0,5 0 (0;1,9) 0 (0;3)

1 0 (0;4,8) 0 (0;3)

1,5 0 (0;4,0) 0 (0;3)

2 0 (0;3,7) 0 (0;3)

2,5 0,2 (0;2,9) 2 (0;6)

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte kein Einfluss

der Zeit auf Amplitude und Frequenz der circulären Pylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten

festgestellt werden.

0 0,5 1 1,5 2 2,50

25

50

75

100

125

Zeit (min)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 18: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur der Ziege unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte kein Einfluss

der Zeit auf die Kontraktionsaktivität circulärer P ylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten

festgestellt werden.

80 Ergebnisse

An der bovinen Pylorusmuskulatur kam es über 2,5 h unter normokaliämischen

Bedingungen bei gleichbleibender Frequenz zu einem Anstieg von Amplitude und

Kontraktionsaktivität von 10,66 (4,17;17,17) auf 20,63 (4,12;35,02) mN/min

(Abbildung 19 und Tabelle 18).

Tabelle 18: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n Pylorusmuskulatur des Rindes unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

Zeitpunkt

(h nach Versuchsbeginn)

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

0 3,7 (1,7;7,6) a 3 (2;4)

0,5 4,9 (1,5;11,8) a,b 3 (2;5)

1 4,7 (1,6;10,1) a,b 4 (3;5)

1,5 5,7 (1,2;11,5) a,b 4 (3;4)

2 6,5 (1,4;10,5) b 4 (3;5)

2,5 6,2 (1,4;10,0) b 4 (3;5)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

der Zeit auf die Amplitude circulärer Pylorusmuskul atur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Zeitpunkten sind

mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

Ergebnisse 81

0 0,5 1 1,5 2 2,505

1015202530354045

Zeit (h)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 19: In-vitro-Motilitätsmessung zur basalen Aktivität is olierter Labmagenmuskulatur:

Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur des Rindes unter

normokaliämischen Bedingungen (4,7 mmol Kalium/l)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

der Zeit auf die Kontraktionsaktivität circulärer P ylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Zeitpunkten sind

mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

4.1.2.2 Wirkung steigender Kaliumgaben auf die circuläre Pylorusmuskulatur

Die circuläre Pylorusmuskulatur der Ziege reagierte unter steigenden Zugaben von

KCl zunächst mit einer Zunahme von Frequenz, Amplitude und demzufolge auch der

Kontraktionsaktivität. Bei einer Konzentration von 10 mmol Kalium/l kam es jedoch

zu einem Abfall aller drei Parameter, so dass die Kontraktionsaktivität nach dem

Anstieg von 0 (0;62,49) auf 14,47 (0;306,46) mN/min auf 3,75 (0;125,57) mN/min

absank. Allerdings konnten auch im Zuge steigender NaCl-Gaben ein ähnliches

Verhalten aller drei Parameter verzeichnet werden (Abbildung 20 und Tabelle 20). Im

Gegensatz zur circulären Corpusmuskulatur kam es allerdings nicht zu einer

Abnahme der Ansprechbarkeit des Muskels bei zwei hintereinander geschalteten

Dosiswirkungskurven am selben Präparat (Abbildungen 21 und 22).

a

a,b

a,b

b b

a,b

82 Ergebnisse

Tabelle 19: Versuchsschema zur Überprüfung der Kali umwirkung auf isolierte

Labmagenmuskulatur der Ziege

DWK = Dosis

wirkungskurve

Tabelle 20: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Frequenz und Amplitude an der circuläre n

Pylorusmuskulatur der Ziege unter dem Einfluss stei gender Kaliumkonzentrationen

[K+]

in

mM

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

K+-DWK 1 Kontrolle

(NaCl)

K+-DWK 2 K+-

DWK 1

Kon-

trolle

K+-

DWK 2

4,7 0,8 (0;31,9)a,b 0,6 (0;38,2)a,b 4 (0;8)a 2 (0;7)a

1 0 (0;18,0)a 0 (0;22,7)a 0,3 (0;7,2)a 0 (0;4)b 0 (0;5)b 1 (0;5)a

3 0,8 (0;26,0)a 0 (0;41,4)a 1,7 (0;116,3)c 2 (0;6)a 0 (0;6)a,b 2 (0;5)a

4 1,2 (0;25,0)a,b 0 (0;102,6)c 2,9 (0;102,5)c 3 (0;7)a 0 (0;6)a,b 2 (0;5)a

5 1,4 (0;33,2)a,b 0,7 (0;95,4)b * 5,4 (0;107,2)c 3 (0;7)a 1 (0;6)a,b 3 (0;6)a

6 1,5 (0;37,8)a,b 1,7 (0;100,2)b * 6,0 (0;117,9)c 4 (0;7)a 2 (0;6)a 3 (0;7)a

7 3,1 (0;38,2)b 1,7 (0;103,3)c 4,4 (0;120,7)c 4 (0;6)a 2 (0;6)a 3 (0;7)a

10 1,2 (0;39,0)a,b 1,0 (0;52,8)a,b 2,7 (0;52,0)a,c 2 (0;6)a 1 (0;5)a,b 2 (0;6)a

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Amplitude und die Frequenz circu lärer Pylorusmuskulatur nachgewiesen

werden; signed rank – Test: signifikante Unterschie de zwischen den verschiedenen

Konzentrationen einer Kurve sind mit unterschiedlic hen Buchstaben gekennzeichnet;

signifikante Unterschiede zu den Kontrollgeweben si nd mit * markiert. Die Amplituden von K +-

DWK-1 und K +-DWK-2 unterscheiden sich bei Kalium - Konzentratio nen von 5 und 6 mmol/l.

DWK = Kalium-Dosiswirkungskurve zu Beginn (K +-DWK-1) und im Anschluss an die NaCl-

Zugaben (K +-DWK-2)

Kammer 1 Kammer 2

KCl (DWK-1) NaCl

Washout

Zeitvergleich

KCl (DWK-2)

Kammervergleich

Ergebnisse 83

4,7 1 3 4 5 6 7 100

100

200

K-DWK-1 Kontrolle

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 20: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

der Ziege unter dem Einfluss steigender KCl-Gaben ( Kammervergleich)

Bei Kontrollgeweben wurden gleichzeitig equimolare Mengen NaCl zugegeben.

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Kontraktionsaktivität circulärer Pylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

a a

a a a a a a a a a,b a,b a,b a,b b a,b

*

84 Ergebnisse

1 3 4 5 6 7 100

100

200

300

400

KontrolleK-DWK-2

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 21: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

der Ziege unter dem Einfluss steigender KCl-Gaben ( Zeitvergleich)

Bei Kontrollgeweben wurden gleichzeitig equimolare Mengen NaCl zugegeben.

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Kontraktionsaktivität circulärer Pylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

a

a,b a a,b b b b a,b

a a a a a a

*

Ergebnisse 85

1 3 4 5 6 7 100

100

200

300

400

K-DWK-1 K-DWK-2

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 22: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

der Ziege unter Einfluss von Kalium-Dosiswirkungsku rven an unterschiedlichen Präparaten

und zu unterschiedlichen Zeitpunkten

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

An der circulären Pylorusmuskulatur des Rindes äußerte sich der K+-Effekt in einer

Erhöhung von Amplitude und Kontraktionsaktivität (von 3,53 (0;21,63) auf 33,55

(3,78;152,64) mN/min) bei gleichbleibender Frequenz. Dies unterschied sich deutlich

von den Kontrollgeweben, bei denen es unter NaCl-Gaben zu einer Abnahme der

Amplitude (Tabelle 22) und einer nominellen Reduktion der Kontraktionsaktivität (von

7,92 (0;38,06) auf 3,80 (0;10,89) mN/min) kam (Abbildung 23). Zudem war beim Rind

eine Abnahme der Parameter über die Zeit bei einer Hintereinanderschaltung von

zwei Kalium- Dosiswirkungskurven feststellbar, da eine Wiederholung nicht mehr zu

einem signifikanten Anstieg von Amplitude und Kontraktionsaktivität führte

(Abbildung 24).

86 Ergebnisse

Tabelle 21: Versuchsschema zur Überprüfung der Kali umwirkung auf isolierte

Labmagenmuskulatur vom Rind

DWK = Dosiswirkungskurve

Kammer 1 Kammer 2

Kontrolle (NaCl) KCl (K+-DWK-1)

Washout

Zeitvergleich

KCl (K+-DWK) KCl (K+-DWK-2)

Kammervergleich

Ergebnisse 87

Tabelle 22: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Frequenz und Amplitude an der circuläre n

Pylorusmuskulatur des Rindes unter dem Einfluss ste igender Kaliumkonzentrationen

Amplitude (mN) Frequenz (1/min) [K+]

in

mM

Kammervergleich Zeitvergleich Kammer-

vergleich

Zeit-vergleich

Kon-

trolle

K+-

DWK

K+-

DWK-1

K+-

DWK-2

Kon-

trolle

K+-

DWK

K+-

DWK-

1

K+-

DWK

-2

4,7 2,0

(0;6,2) a 1,8

(0;9,4) a

3

(0;9)

3

(0;9)

1 2,5

(0;9,5) a 1,5

(0;5,7) a

0,8

(0;3,5) a

1,3

(0;11,5)a

3

(0;9)

3

(0;9)

3

(0;4)

3

(0;4) 3 2,4

(0;7,6) a 1,7

(0;5,4) a

1,0

(0,4;3,3) a

1,2

(0;10,8) a

3

(0;9)

3

(0;9)

4

(3;7)

3

(0;4) 4 2,4

(0;4,3) a 2,1

(0;8,7) a

1,2

(0,4;3,9) a

1,5

(0;9,8) a

3

(0;9)

3

(0;9)

4

(3;5)

4

(0;4) 5 1,8

(0;3,6) a,b 2,8

(0,5;28,7) b

1,1

(0,5;8,8) a

2,4

(0;10,4) a

3

(0;9)

3

(2;9)

4

(3;7)

4

(0;6) 6 1,5

(0;3,0) b * 3,8

(1,1;36,0) b

1,7

(0,4;10,3) a

2,2

(0;11,7) a

3

(0;9)

4

(2;9)

4

(3;6)

4

(0;6) 7 1,2

(0;3,5) b * 4,5

(1,1;38,5) b

2,1

(0,7;13,9) a

2,6

(0;11,7) a

3

(0;9)

4

(3;9)

4

(3;5)

4

(0;7) 10 1,0

(0;3,0) b * 7,5

(1,1;38,2) b

4,2

(1,4;22,7) b

3,1

(0;19,5) a

4

(0;9)

4

(3;9)

4

(3;4)

4

(0;6)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Amplitude circulärer Pylorusmusk ulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

88 Ergebnisse

4,7 1 3 4 5 6 7 100

100

200

K-DWK Kontrolle

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 23: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

des Rindes unter dem Einfluss steigender KCl-Gaben (Kammervergleich)

Bei Kontrollgeweben wurden gleichzeitig equimolare Mengen NaCl zugegeben.

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbunde ne Stichproben konnte ein Einfluss

von Kalium auf die Kontraktionsaktivität circulärer Pylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

a a a a a,b b b b

a a a a a a a a

* * *

Ergebnisse 89

1 3 4 5 6 7 100

102030405060708090

K-DWK-2K-DWK-1

Kaliumkonzentration (mmol/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 24: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Kalium a uf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

des Rindes unter Einfluss von zwei nacheinander dur chgeführten Kalium-

Dosiswirkungskurven an demselben Präparat (Zeitverg leich)

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

4.1.2.3 Wirkung steigender Insulingaben auf die circuläre Pylorusmuskulatur

Bei den Ziegenpräparaten nahmen unter Einfluss steigender Insulingaben im

Gegensatz zur Zeitkontrolle sowohl Frequenz als auch Amplitude und

Kontraktionsaktivität zu. Letztere stieg dabei von 0 (0;33,11) auf 12,94 (0;105,56)

mN/min anstatt von 0 (0;0,88) auf 1,20 (0;10,30) mN/min bei der Zeitkontrolle. Die

Erhöhung der Kaliumkonzentration von 4,7 auf 10 mmol KCl/l hatte dabei keinen

Einfluss auf die Parameter weder bei der Zeitkontrolle noch in Anwesenheit von

Insulin (Abbildung 25 und Tabelle 23).

90 Ergebnisse

Tabelle 23: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n

Pylorusmuskulatur der Ziege unter Einfluss einer In sulin-Dosiswirkungskurve mit Zeitkontrolle

(4,7 mmol Kalium/l)

[Insulin] in mU/l

bei 4,7 mmol KCl/l

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

Insulin-DWK Zeitkontrolle Insulin-DWK Zeitkontrolle

0 0 (0;7,4)a 0 (0;0,6)a 0 (0;5)a,b 0 (0;2)a

7 0 (0;9,9)a 0 (0;1,9)a 0 (0;10)a,b 0 (0;3)a

21 0,3 (0;22,9)a,b 0 (0;4,8)a 1 (0;5)a,b 0 (0;3)a

42 0,8 (0;18,7)a,b 0 (0;4,0)a 2 (0;5)b,c 0 (0;3)a

80 1,8 (0;43,8)b * 0 (0;3,7)a 3 (0;6)c 0 (0;3)a,b

120 3,9 (0;37,8)b * 0,2 (0;2,9)a 3 (0;6)c 2 (0;6)b

120 bei 10 mmol KCl/l 2,0 (0;42,0)b * 0,7 (0;1,9)a 2 (0;5)b,c 1 (0;6)b

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Insulin auf die Amplitude und die Frequenz der circulären Pylorusmuskulatur

nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

Ergebnisse 91

0 7 21 42 80 1200

25

50

75

100

125

mit Insulinohne Insulin

Insulin (mU/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 25: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

der Ziege unter Einfluss einer Insulin-Dosiswirkung skurve mit Zeitkontrolle (4,7 mmol Kalium/l)

n = 6; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für v erbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Insulin auf die Kontraktionsaktivität circuläre r Pylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben sind mit * markiert.

In Anwesenheit geringer Kaliumkonzentrationen (3 mmol KCl/l) fiel im Vergleich mit

höheren Konzentrationen (5 mmol KCl/l) der Anstieg der Parameter unter

Insulineinfluss ähnlich aus. Auch hier konnte keine Reaktion der Muskulatur auf eine

Erhöhung der Kaliumkonzentration auf 10 mmol KCl/l gezeigt werden (Abbildung 26

und Tabelle 24).

a a a a a a

a a a,b a,b b b

* *

92 Ergebnisse

Tabelle 24: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n

Pylorusmuskulatur der Ziege unter Einfluss einer In sulin-Dosiswirkungskurve in Anwesenheit

von 3 bzw. 5 mmol KCl/l

[Insulin] in mU/l Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

3 mmol KCl/l 5 mmol KCl/l 3 mmol KCl/l 5 mmol/l KCl

0 0 (0;1,8) 0 (0;23,4) 0 (0;5) 0 (0;6)

7 1,4 (0;4,9) 0,7 (0;38,7) 1 (0;5) 1 (0;6)

21 0 (0;5,1) 2,8 (0;19,4) 0 (0;4) 2 (0;6)

42 0,6 (0;6,2) 3,4 (0;25,5) 1 (0;5) 2 (0;6)

80 0,3 (0;8,4) 2,9 (0;30,7) 1 (0;5) 2 (0;6)

120 0,6 (0;16,5) 1,7 (0;34,9) 3 (0;5) 3 (0;5)

120 (10 mmol KCl/l) 0,8 (0;24,5) 3,3 (0;57,8) 2 (0;6) 3 (0;6)

n = 6; signed rank – Test: zwischen den Kurven konn ten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

Ergebnisse 93

0 7 21 42 80 1200

50

100

150

5 mM KCL3 mM KCL

Insulin (mU/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 26: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

der Ziege unter Einfluss einer Insulin-Dosiswirkung skurve bei 3 und 5 mmol KCl/l

n = 6; signed rank – Test: zwischen den Kurven konn ten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

An der bovinen Pylorusmuskulatur konnte eine ähnliche Zunahme von Amplitude und

Kontraktionsaktivität unter dem Einfluss einer Insulin-Dosiswirkungskurve

verzeichnet werden wie bei den Präparaten der Ziege, allerdings trat in diesem Fall

der gleiche Effekt auch bei der Zeitkontrolle auf (Abbildung 27 und Tabelle 25).

94 Ergebnisse

Tabelle 25: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n

Pylorusmuskulatur des Rindes unter Einfluss einer I nsulin-Dosiswirkungskurve mit

Zeitkontrolle (4,7 mmol Kalium/l)

[Insulin] in mU/l

bei 4,7 mmol KCl/l

Amplitude (mN) Frequenz (1/min)

Insulin-DWK Zeitkontrolle Insulin-DWK Zeitkontrolle

0 3,1 (0,7;6,0) a 3,7 (1,7;7,6) a 3 (3;6) 3 (2;4)

7 3,0 (2,3;3,9) a,b 4,9 (1,5;11,8) a,b 3 (3;5) 3 (2;5)

21 4,8 (2,5;6,1) a,b 4,7 (1,6;10,1) a,b 4 (3;5) 4 (3;5)

42 5,7 (3,8;11,2) b 5,7 (1,2;11,5) a,b 4 (3;4) 4 (3;4)

80 5,4 (4,2;8,0) a,b 6,5 (1,4;10,0) b 4 (3;5) 4 (3;5)

120 6,2 (4,9;10,4) b 6,2 (1,4;10,0) b 4 (3;5) 4 (3;5)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte kein Einfluss

von Insulin auf die Amplitude und die Frequenz der circulären Pylorusmuskulatur

nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben ergaben sich nicht.

Ergebnisse 95

0 7 21 42 80 1200

10

20

30

40

50

mit Insulinohne Insulin

Insulin (mU/l)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 27: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

des Rindes unter Einfluss einer Insulin-Dosiswirkun gskurve mit Zeitkontrolle (4,7 mmol

Kalium/l)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte ein Einfluss

von Insulin auf die Kontraktionsaktivität circuläre r Pylorusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: signifikante Unterschiede zwisc hen den verschiedenen Konzentrationen

einer Kurve sind mit unterschiedlichen Buchstaben g ekennzeichnet; signifikante Unterschiede

zu den Kontrollgeweben ergaben sich nicht.

Um einen etwaigen Insulineffekt deutlicher von einem reinen Zeiteffekt abgrenzen zu

können, folgte ein weiterer Versuch mit langfristigen Inkubationen in Pufferlösungen

mit verschiedenen Insulinkonzentrationen (40, 120 und 200 mU Insulin/l). Auch hier

konnten gegenüber der Zeitkontrolle ohne Insulin keine signifikanten Veränderungen

festgestellt werden (Abbildung 28 und Tabelle 26).

a a,b a,b b b b

a a,b a,b a,b b b

96 Ergebnisse

Tabelle 26: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude und Frequenz an der circuläre n

Pylorusmuskulatur des Rindes unter Einfluss verschi edener Insulinkonzentrationen mit

Zeitkontrolle (4,7 mmol Kalium/l)

Zeitpunkt (t = min

nach Versuchsbeginn)

Amplitude (mN)

Zeitkontrolle 40 mU

Insulin/l

(bei t = 5 min)

120 mU

Insulin/l

(bei t = 5 min)

200 mU

Insulin/l

(bei t = 5 min)

0 2,9 (1,3;15,2) 1,2 (0,7;24,0) 2,9 (0,5;47,7) 1,9 (0,5;8,5)

30 2,8 (1,3;14,8) 1,5 (0,7;26,8) 3,0 (0;52,4) 2,3 (0,5;12,2)

60 4,7 (0,6;18,1) 2,0 (0,6;24,6) 3,8 (0;59,7) 2,6 (0;17,8)

90 5,1 (0,6;13,7) 2,0 (0,5;23,4) 5,0 (0;60,0) 3,1 (0;27,9)

120 6,8 (0,6;14,2) 2,3 (0,5;19,8) 5,6 (0,9;60,4) 3,1 (0,7;27,5)

150 6,7 (0,7;16,2) 2,7 (0,5;17,0) 6,1 (0,8;63,0) 3,0 (1,1;31,7)

Frequenz (1/min)

0 3 (1;4) 3 (2;3) 3 (1;3) 3 (2;3)

30 3 (2;4) 3 (2;3) 1 (0;3) 3 (2;3)

60 3 (2;4) 3 (2;4) 1 (0;4) 3 (0;4)

90 3 (2;4) 3 (2;4) 1 (1;4) 3 (0;4)

120 3 (2;4) 3 (2;4) 1 (1;4) 3 (2;4)

150 3 (2;4) 3 (2;4) 1 (1;4) 3 (2;4)

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

Ergebnisse 97

0 30 60 90 120 1500

100

200

ohne Insulin40mU

120mU 200mU

Zeit (min)

Kon

trak

tions

aktiv

ität

(mN

/min

)

Abbildung 28: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf der Kontraktionsaktivität an der circulären Pylorusmuskulatur

des Rindes unter Einfluss verschiedener Insulinkonz entrationen mit Zeitkontrolle (4,7 mmol

Kalium/l)

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

Insulinzugaben erfolgten nach 5 min.

4.1.3 Aktivität der longitudinalen Corpusmuskulatur

4.1.3.1 Wirkung steigender Insulingaben auf die longitudinale Corpusmuskulatur

An der longitudinalen Corpusmusksulatur konnten unter Einfluss einer Insulin-

Dosiswirkungskurve keine Veränderungen in Frequenz, Amplitude und

Kontraktionsaktivität nachgewiesen werden (Tabelle 27). Demzufolge zeigten sich

auch keine Unterschiede in den Reaktionen der isolierten Muskelstücke auf

steigende Insulingaben in Anwesenheit von unterschiedlichen Kaliumkonzentrationen

(3 und 5 mmol KCl/l) (Tabelle 28).

98 Ergebnisse

Tabelle 27: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude, Frequenz und Kontraktionsakt ivität an der

longitudinalen Corpusmuskulatur der Ziege unter Ein fluss einer Insulin-Dosiswirkungskurve

mit Zeitkontrolle (4,7 mmol Kalium/l)

[Insulin]

in mU/l

Amplitude (mN) Frequenz (1/min) Kontraktions-

Aktivität (mN/min)

Insulin-

DWK

Zeitkon-

tolle

Insulin-

DWK

Zeit-

kontrolle

Insulin-DWK Zeitkontolle

0 6,0

(0,7;27,9)

5,4

(0,5;17,1)

4 (2;6) 5 (2;7) 15,84

(2,40;139,30)

18,10

(4,71;131,11)

7 5,7

(0,6;30,1)

4,0

(0;20,0)

4 (2;7) 4 (2;7) 14,52

(1,77;135,53)

18,15

(2,55;99,66)

21 4,7

(0,5;28,4)

3,1

(0,5;16,6)

5 (2;7) 5 (1;7) 16,33

(1,96;155,93)

21,14

(2,35;101,24)

42 5,1

(0,7;26,7)

3,6

(0;28,6)

5 (2;6) 5 (2;7) 17,41

(2,40;146,76)

20,70

(2,35;114,58)

80 7,5

(0,7;25,6)

4,3

(0;37,9)

4 (2;7) 6 (2;7) 21,09

(2,06;128,02)

22,76

(2,75;91,18)

120 6,6

(0,5;22,7)

3,7

(0;24,9)

5 (2;7) 5 (2;7) 21,78

(2,45;101,97)

26,88

(2,16;100,06)

120 (10

mmol

KCl/l)

6,7

(0,7;31,3)

3,9

(0;29,1)

5 (2;6) 6 (2;6) 28,33

(3,43;187,76)

28,99

(1,57;102,42)

n = 10; mittels einfaktorieller Varianzanalyse für verbundene Stichproben konnte kein Einfluss

von Insulin auf die Amplitude, Frequenz und Kontrak tionsaktivität der longitudinalen

Corpusmuskulatur nachgewiesen werden;

signed rank – Test: zwischen den Kurven konnten kei ne signifikanten Unterschiede festgestellt

werden.

Ergebnisse 99

Tabelle 28: In-vitro-Motilitätsmessung zur Wirkung von Insulin auf isolierte

Labmagenmuskulatur: Verlauf von Amplitude, Frequenz und Kontraktionsakt ivität an der

longitudinalen Corpusmuskulatur der Ziege unter Ein fluss einer Insulin-Dosiswirkungskurve in

Anwesenheit von 3 bzw. 5 mmol KCl/l

[Insulin]

in mU/l

Amplitude (mN) Frequenz

(1/min)

Kontraktions-

Aktivität (mN/min)

3 mmol

KCl/l

5 mmol

KCl/l

3 mmol

KCl/l

5 mmol

KCl/l

3 mmol

KCl/l

5 mmol

KCl/l

0 0

(0;16,4)a

1,8

(0;13,5)a

0 (0;5) 3 (0;7) 0

(0;73,72)a

5,42

(0;60,92)a

7 0

(0;16,5)a

1,8

(0;17,1)a

0 (0;4) 3 (0;6) 0

(0;65,92)a,b

5,76

(0;85,35)a

21 0,2

(0;25,8)a,b

1,2

(0;15,4)a,b

2 (0;5) 3 (0;6) 0,98

(0;103,20)a,b

5,30

(0;53,91)a,b

42 0,3

(0;19,5)a,b

1,4

(0;16,4)a,b

2 (0;5) 3 (0;6) 1,18

(0;87,85)a,b

8,19

(0;57,29)a,b

80 0,5

(0;29,2)b

4,2

(1,3;19,5)b

3 (0;6) 4 (3;6) 1,81

(0;116,94)a,b

21,83

(3,2;58,57)a,b

120 0,4

(0;26,3)a,b

2,5

(0;22,2)a,b

2 (0;5) 3 (0;7) 1,96

(0;108,16)a,b

9,15

(0;68,33)a,b

120 (10

mmol KCl/l)

2,3

(0;34,8)b

3,1

(0;32,3)b

3 (0;4) 3 (0;6) 6,04

(0;130,30)b

11,53

(0;89,27)b

n = 10; signed rank – Test: zwischen den Kurven kon nten keine signifikanten Unterschiede

festgestellt werden.

4.2 In-vivo- Versuch

Ziel des In-vivo-Versuchs war es herauszufinden, ob sich die in-vitro gewonnen

Ergebnisse auch am lebenden Tier widerspiegeln; ob also Insulin in

pathophysiologischen Konzentrationen im Blut den Austritt von Ingesta aus dem

Labmagen vermindern kann und ob diese Reduzierung des Effluxes durch

100 Ergebnisse

gleichzeitige Kaliumgaben kompensiert werden kann. Der Versuch fand unter

normoglykämischen Bedingungen statt (10.2.1; Abbildung 33).

4.2.1 Insulinkonzentrationen

Wie die Abbildung 29 zeigt, konnte durch die Infusion von 1 mU Insulin/kg KGW/min

gegenüber den Basalwerten an Tag 1 im Mittel eine Steigerung der gemessenen

Insulinkonzentrationen im Blut von 0,68 (±0,59) µg/l auf 6,67 (±1,9) µg/l an Tag 2

bzw. auf 7,24 (±1,96) µg/l an Tag 3 erzielt werden. Der durch die Infusion bedingte

Anstieg der Insulinspiegel war bereits nach einer Stunde auf einem konstanten

Niveau. In Tabelle 29 sind die Einzeldaten der Versuchstiere an den drei

Versuchstagen aufgelistet. Wichtig ist, dass die vor Beginn der Infusionen an Tag 3

gemessenen Insulinwerte wieder alle im Normalbereich lagen.

0

2

4

6

8

10

keine Insulininfusion Insulininfusion von 1 mU/kgKGW/min

Insulininfusion von 1 mU/kgKGW/min mit

Kaliumsubstitution

Insu

linko

nz. i

n µg

/l

Abbildung 29: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Mittlere Insulinwerte an den drei Versuchstagen

n = 6; unterschiedliche Buchstaben (a,b) belegen st atistisch signifikante Unterschiede in der

einfaktoriellen Varianzanalyse mit einem Signifikan zniveau von p<0,05.

Bei den mittleren Insulinwerten handelt es sich an Tag 1 um den Mittelwert aller

Messzeitpunkte und an den Tagen 2 und 3 um die Mitt elwerte der Zeitpunkte von der 60. bis zur

240. Minute jeweils aller sechs Versuchstiere.

Die Standardabweichungen reflektieren die Streuung der jeweiligen Mittelwerte der 6

Versuchstiere.

a

b b

Ergebnisse 101

Tabelle 29: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Insulinwerte (in µµµµg/l) an den drei Versuchstagen zu unterschiedlichen

Zeitpunkten nach Beginn der Infusion

Tier 1 Tier 2 Tier 3 Tier 4 Tier 5 Tier 6

Tag 1, t = 0 min 0,21 1,03 0,51 1,61 0,02 0,80

Tag 1, t = 60 min 0,06 0,53 0,92 1,99 0,02 0,71

Tag 1, t = 120 min 0,02 0,25 0,61 1,75 0,01 0,85

Tag 1, t = 180 min 0,26 0,25 0,97 1,67 0,05 0,52

Tag 1, t = 240 min 0,29 0,46 0,78 1,64 0,05 0,52

Tag 2, t = 0 min 0,31 0,64 0,77 1,81 0,03 0,90

Tag 2, t = 60 min 6,16 7,01 4,89 8,98 10,13 4,81

Tag 2, t = 120 min 6,31 7,19 4,50 7,70 9,14 5,10

Tag 2, t = 180 min 4,42 8,56 4,28 7,74 6,54 5,05

Tag 2, t = 240 min 5,04 7,95 3,40 6,82 5,96 4,63

Tag 3, t = 0 min 0,69 0,83 1,04 2,11 0,04 0,63

Tag 3, t = 60 min 7,20 10,47 4,65 6,52 6,09 4,67

Tag 3, t = 120 min 9,42 8,20 4,31 9,49 7,61 5,23

Tag 3, t = 180 min 6,93 9,43 4,62 5,37 6,64 8,89

Tag 3, t = 240 min 5,83 9,64 4,66 8,59 8,00 9,45

n = 6; Beginn der Insulininfusion an Tag 2 und 3 je weils bei t = 2 min

4.2.2 Kaliumkonzentrationen

Durch die Insulininfusion konnten die Blutkaliumwerte im Mittel von 3,94 (±0,19)

mmol/l auf 3,51 (±0,25) mmol/l signifikant gesenkt werden. Erste Reaktionen traten

bereits innerhalb der ersten halben Stunde nach Beginn der Insulininfusionen auf.

Am dritten Versuchstag konnte die Substitution von 0,5 mmol KCl/min/Tier ein

signifikantes Absinken der Blutkaliumwerte verhindern: Im Mittel lagen diese an Tag

3 bei 3,83 (±0,19) mmol/l (Abbildungen 30 und 31). Die vor Beginn der Infusionen an

102 Ergebnisse

Tag 3 gemessenen Blutkaliumwerte lagen mit Ausnahme des zweiten Tieres alle im

normokaliämischen Bereich von 3,5 – 4,5 mmol/l (Tabelle 30).

3

3,5

4

4,5

keine Insulininfusion Insulininfusion von 1 mU/kgKGW/min

Insulininfusion von 1 mU/kgKGW/min mit

Kaliumsubstitution

[K] i

n m

mol

/l

Abbildung 30: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Mittlere Blutkaliumwerte an den drei Versuchstagen

n = 6; unterschiedliche Buchstaben (a,b) belegen st atistisch signifikante Unterschiede in der

zweifaktoriellen Varianzanalyse mit einem Signifika nzniveau von p<0,05.

Bei den mittleren Blutkaliumwerten handelt es sich an Tag 1 um den Mittelwert aller

Messzeitpunkte und an den Tagen 2 und 3 um die Mitt elwerte der Zeitpunkte von der 60. bis zur

240. Minute jeweils aller sechs Versuchstiere.

Die Standardabweichungen reflektieren die Streuung der jeweiligen Mittelwerte der 6

Versuchstiere.

a

b

a

Ergebnisse 103

3

3,2

3,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

4,6

0 60 120 180 240 0 60 120 180 240 300 30 90 150 210 270

Zeit in min

[K] i

n m

mol

/l

Abbildung 31: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Verlauf der Blutkaliumkonzentrationen aller Versuc hstiere an den drei

Versuchstagen

Die Pfeile markieren den Beginn der Insulininfusion .

Tabelle 30: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Blutkaliumwerte (in mmol/l) an den drei Versuchsta gen zu

unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Infus ion

Tier 1 Tier 2 Tier 3 Tier 4 Tier 5 Tier 6

Tag 1, 0 min 3,83 3,81 3,56 3,77 3,84 3,89

Tag 1, 30 min 3,75 3,81 3,77 3,97 3,92 4,23

Tag 1, 60 min 3,68 3,81 3,71 3,86 3,82 3,99

Tag 1, 90 min 3,72 3,87 3,87 4,06 3,93 4,12

Tag 1, 120 min 3,94 4,04 3,91 4,16 3,95 3,90

Tag 1, 150 min 3,79 4,20 3,57 3,98 3,73 3,97

Tag 1, 180 min 3,81 4,05 3,94 4,35 3,90 4,08

Tag 1, 210 min 3,78 4,36 3,88 4,36 3,89 4,28

Tag 1, 240 min 3,99 4,26 3,76 4,32 3,92 4,11

Tag 1, 270 min 3,86 4,23 3,76 4,20 4,20 3,92

Tag 1 Tag 2 Tag 3

Kontrolle Insulin Insulin + Kalium

104 Ergebnisse

Tag 2, 0 min 3,77 4,20 3,86 4,10 3,99 3,91

Tag 2, 30 min 3,36 3,27 3,42 3,81 3,88 3,81

Tag 2, 60 min 3,35 3,37 3,34 3,84 3,58 3,75

Tag 2, 90 min 3,07 3,16 3,19 3,64 3,52 3,58

Tag 2, 120 min 3,11 3,30 3,76 3,76 3,34 3,62

Tag 2, 150 min 3,25 3,27 3,55 3,63 3,44 3,61

Tag 2, 180 min 3,19 3,31 3,56 3,82 3,37 3,61

Tag 2, 210 min 3,17 3,24 3,70 3,95 3,36 3,53

Tag 2, 240 min 3,27 3,20 3,43 3,71 3,49 3,89

Tag 2, 270 min 3,38 3,29 3,68 3,88 3,47 3,48

Tag 2, 300 min 3,32 3,22 3,6 3,99 3,81 3,74

Tag 3, 0 min 3,52 3,44 3,86 3,86 4,14 4,28

Tag 3, 30 min 3,72 3,42 2,88 3,93 4,31 4,10

Tag 3, 60 min 3,41 3,55 3,71 3,79 4,04 4,10

Tag 3, 90 min 3,56 3,79 3,82 3,88 4,11 3,85

Tag 3, 120 min 3,47 3,86 3,32 3,95 4,03 3,66

Tag 3, 150 min 3,63 3,82 3,34 3,98 4,11 3,89

Tag 3, 180 min 3,67 3,92 3,52 3,85 3,99 3,74

Tag 3, 210 min 3,64 4,36 3,51 3,88 4,01 3,78

Tag 3, 240 min 3,59 4,16 3,92 3,83 4,24 3,76

Tag 3, 270 min 3,48 4,26 3,57 3,88 4,40 3,69

Tag 3, 300 min 3,62 3,99 3,99 3,99 4,53 3,92

n = 6; Beginn der Insulininfusion an Tag 2 und 3 je weils bei t = 2 min

4.2.3 Labmagenefflux

Der mittlere Efflux aus dem Labmagen ins Duodenum unterschied sich an den drei

Versuchstagen nicht signifikant voneinander (Abbildungen 32 und 33). Bei den

einzelnen Versuchstieren traten unterschiedliche Reaktionen auf die Insulininfusion

auf: Bei vier von sechs Tieren kam es an Tag 2 zu einer Reduktion des Effluxes,

davon war nur bei zwei Tieren ein erneuter Anstieg am dritten Versuchstag

Ergebnisse 105

nachweisbar. Bei den zwei Tieren, bei denen es an Tag 2 zu einer Steigerung der

Effluxrate kam, war bei einem Tier an Tag 3 eine weitere Erhöhung, bei dem anderen

Tier eine Reduktion der Effluxmenge feststellbar (Tabelle 31).

0

50

100

150

200

250

300

keine Insulininfusion Insulininfusion von 1 mU/kgKGW/min

Insulininfusion von 1 mU/kgKGW/min mit

Kaliumsubstitution

Effl

uxm

enge

in m

l/min

Abbildung 32: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Mittlere Effluxmengen aus dem Labmagen ins Duodenu m an den drei

Versuchstagen

n = 6; die Standardabweichungen reflektieren die St reuung der jeweiligen Mittelwerte der 6

Versuchstiere.

Tabelle 31: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Effluxmengen in ml/min aus dem Labmagen ins Duoden um aller

Versuchstiere an den drei Versuchstagen

Tier 1 Tier 2 Tier 3 Tier 4 Tier 5 Tier 6

Tag 1 150 (±18) 149 (±24) 180 (±8) 165 (±10) 333 (±78) 146 (±16)

Tag 2 142 (±26) 133 (±5) 258 (±32) 194 (±11) 194 (±11) 113 (±9)

Tag 3 140 (±2) 180 (±42) 176 (±6) 192 (±6) 192 (±6) 168 (±15)

Die Standardabweichungen reflektieren die Streuung der Effluxmengen im steady state .

106 Ergebnisse

Tabelle 32 gibt eine Übersicht über die Einzeldaten aller Tiere an den drei

Versuchstagen.

Tabelle 32: In-vivo-Versuch zur Messung des Labmageneffluxes un ter basalen (Tag 1),

hyperinsulinämisch-hypokaliämischen (Tag 2) und hyp erinsulinämisch-normokaliämischen

(Tag 3) Bedingungen: Übersicht der Mittelwerte der Insulin- und Kaliumw erte im Blut und des

vorherrschenden Labmageneffluxes der einzelnen Tier e an den drei Versuchstagen

Tag 1 Tag 2 Tag 3

Insulin

in µg/l

Kalium

in

mmol/l

Efflux

in

ml/min

Insulin

in µg/l

Kalium

in

mmol/l

Efflux

in

ml/min

Insulin

in µg/l

Kalium

in

mmol/l

Efflux

in

ml/min

Tier

1 0,17 3,82 150 5,49 3,25 142 7,34 3,58 140

Tier

2 0,50 4,05 149 7,68 3,26 133 9,43 3,91 180

Tier

3 0,76 3,73 180 4,27 3,54 258 4,56 3,56 176

Tier

4 1,73 4,10 165 7,81 3,80 194 7,49 3,90 192

Tier

5 0,04 3,91 333 7,94 3,53 266 7,16 4,18 183

Tier

6 0,68 4,05 146 4,90 3,66 113 7,06 3,85 168

Diskussion 107

5 Diskussion

Die Ergebnisse des In-vitro- und des In-vivo-Versuchs sollten Aufschluss darüber

geben, inwieweit die insbesondere bei Kühen im peripartalen Zeitraum zu

beobachtenden Veränderungen in der Kalium- und Insulinhomöostase Einfluss auf

die Motilität der Labmagenmuskulatur und damit auf den abomasalen Efflux nehmen.

5.1 In-vitro -Versuch

In diesem Teil der Studie wurden Muskelpräparate aus dem Labmagen von Ziegen

und Rindern isoliert, in einer Pufferlösung inkubiert und in eine Vorrichtung zur

Messung der Motilität eingespannt. Es wurde circuläre Corpus- und

Pylorusmuskulatur (sowie bei der Ziege z. T. noch longitudinale Corpusmuskulatur)

hinsichtlich ihrer Reaktion auf Kalium- und Insulingaben untersucht. Dabei konnten

schon unter basalen Bedingungen (d. h. ohne jegliche Zugaben) sowohl

Unterschiede in der Aktivität zwischen Corpus- und Pylorusmuskulatur als auch bei

den Präparaten aus einer Region des Labmagens gefunden werden. Während die

Pylorusmuskulatur grundsätzlich eine geringe Spontanaktivität zeigte, wies die der

Corpusisolate erhebliche Unterschiede nicht nur zwischen den Einzeltieren, sondern

sogar bei aus direkter Nachbarschaft entnommenen Muskelstücken auf. Diese sehr

große Variation in der Motilität spiegelt sich in den z. T. erheblichen Unterschieden

der Minima und Maxima.

Die Differenzen zwischen Corpus- und Pylorusmuskulatur lassen sich durch ihre

jeweilige Funktion in vivo erklären. Während die Magenpumpe wellenförmige

Kontraktionen aufweist, die die Ingesta nach aboral befördern, erschlafft und

kontrahiert die Muskulatur am Pylorus, um den Chymus abfließen zu lassen (HILL

1969; MALBERT u. RUCKEBUSCH 1988). Letztere weist also im Gegensatz zur

Corpusmuskulatur nur in sehr viel geringerem Ausmaß rhythmische, spontane

Kontraktionen auf.

Der Grund für die großen Unterschiede der Spontanaktivität zwischen den

Präparaten eines Abschnitts ist unklar. Die Behandlung der Muskeln vor und

während der Präparation erfolgte stets im gleichen zeitlichen und technischen Ablauf.

Fett- und Bindegewebsauflagerungen wurden abpräpariert, ohne die Muskulatur zu

108 Diskussion

verletzen oder zu strapazieren. Diese Aspekte können zudem nicht die Unterschiede

zwischen Isolaten erklären, die direkt nebeneinander liegen. Auch das Gewicht der

Muskelstückchen korrelierte nicht mit ihrer Aktivität. Denkbar wäre hingegen, dass

der funktionelle Komplex zwischen ICC und Muskelzellen bzw. deren

Quervernetzung durch die Präparation in den einzelnen Muskelstückchen

unterschiedlich stark unterbrochen wird, so dass der „Taktgeber“ der Kontraktionen

in einigen Bereichen eines Muskelstückes entfällt und damit die gesamte

Kontraktionsaktivität geringer ausfällt (DAVIES 1989).

In Folge der unterschiedlichen Spontanmotilität war eine kontinuierlich durchgeführte

Kontrolle unerlässlich.

Da es sich bei den Isolaten der bovinen Labmagenwand um Material von

Schlachthoftieren handelte und die Kühe somit weder gleich alt noch definiert

gehalten und gefüttert wurden, diente Labmagenmuskulatur von gleichaltrigen

Ziegen, die im Rahmen eines anderen Versuches am hiesigen Institut gehalten und

schließlich geschlachtet wurden, der Kontrolle. Hinsichtlich der Variationen der

Motilität konnten keine Unterschiede zwischen den Kühen und Ziegen festgestellt

werden.

5.1.1 Reaktionen isolierter Labmagenmuskulatur auf Änderungen der

extrazellulären Kaliumkonzentration

Untersucht wurden die Antworten isolierter Labmagenmuskulatur auf

unterschiedliche Kaliumkonzentrationen an circulärer Corpus- und Pylorusmuskulatur

von Ziege und Rind. Als Kontrolle der in Form von KCl zugegebenen Mengen

dienten dabei equimolare NaCl-Gaben. Mit Ausnahme der circulären

Pylorusmuskulatur der Ziege kam es dabei über die Zeit zu starken Veränderungen

der Motilitätsparameter. Aus diesem Grund sind nur zeitgleich durchgeführte

Versuche aussagekräftig. An den Präparaten der Labmagenmuskulatur konnte in

unterschiedlicher Ausprägung eine durch steigende Kaliumgaben bedingte Zunahme

von Amplitude und Kontraktionsaktivität bei unbeeinflusster Frequenz festgestellt

werden. Das gilt auch für den für die Pathophysiologie relevanten Bereich zwischen

1 und 5 mmol Kalium/l. An der Pylorusmuskulatur der Ziege war nur ein Anstieg der

Parameter bis zu einer Kaliumkonzentration von 7 mmol/l feststellbar. Bei 10 mmol/l

Diskussion 109

kam es hingegen zu einem Abfall. Ein ähnlicher Verlauf insbesondere der Amplitude

war allerdings auch durch Gaben von NaCl zu beobachten, so dass hier die

Kaliumwirkung nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, da sich lediglich für

eine Konzentration von 7 mmol Kalium/l signifikante Unterschiede zwischen den

beiden Kurven ergaben.

Am Dünndarm von Hunden wiesen HARA und SZURSZEWSKI (1986) den Einfluss

extrazellulären Kaliums auf das Membranpotential glatter Muskelzellen nach: Je

höher die Kaliumkonzentrationen waren, desto weniger negativ wurde das

Membranpotential und umgekehrt. Im Zuge von Hypokaliämien wird somit das

Schwellenpotential zur Öffnung spannungsabhängiger Kalziumkanäle seltener

erreicht (KOBAYASHI et al. 1985), so dass es zu einer Abnahme der

Kontraktionsbereitschaft der Muskulatur bis hin zu Paralysen kommt (PETRIDES

1997; SIELMAN et al. 1997). Die bei hohen extrazellulären Kaliumkonzentrationen zu

beobachtende Steigerung der Muskelaktivität ist zwar auch auf die Beeinflussung

des Membranpotentials zurückzuführen, allerdings konnten KATO et al. (2007) am

Kaninchendarm zusätzlich bei Kaliumkonzentrationen von 9 bis 27 mmol/l eine

Modulation inhibitorischer Neurone feststellen, die durch Freisetzung eines Suramin-

sensitiven Transmitters die Stimulation glatter Muskelzellen verstärken. Ob die

Reaktionen der Labmagenpräparate dieser Untersuchung auf eine myogene oder

neurogene Beeinflussung zurückzuführen sind, ist nicht mit Sicherheit zu bestimmen.

Die veränderten Amplituden lassen jedoch die Vermutung zu, dass die ICC von den

äußeren Kaliumbedingungen beeinflusst werden, da die Potentialschwankungen

dieser Schrittmacherzellen mit Auslösen von Aktionspotentialen Grundvoraussetzung

für die Entstehung von Kontraktionen sind und die Frequenz dieser Aktionspotentiale

positiv mit der Kontraktionsstärke (und damit der Amplitudenhöhe) der Muskulatur

korreliert sind (DAVIES 1989). In vielen Studien konnte der Nachweis verschiedener

Kaliumkanäle in ICC erbracht werden (FLYNN et al. 1999; HATTON et al. 2001), was

zugleich eine Abhängigkeit dieser Zellen von der extrazellulären Kaliumkonzentration

bedeutet. Darüber hinaus stellten KITO und SUZUKI (2007) am Dünndarm von

Mäusen bei einer Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration von 5 auf 8,25

mmol/l eine Depolarisation der Zellmembran der ICC und eine Verringerung der

110 Diskussion

Amplitude des Plateaus der slow waves fest. Bei 15,3 mmol KCl/l war zusätzlich die

Frequenz letzterer reduziert. Die ICC waren in diesem Fall also abhängig vom

vorherrschenden Kaliummilieu.

Die Reaktionen der einzelnen Labmagenabschnitte auf veränderte extrazelluläre

Kaliumbedingungen waren in der vorliegenden Arbeit unterschiedlich ausgeprägt:

Die Kontraktionsaktivität der circulären Corpusmuskulatur der Ziege stieg von 7,28

(0;54,25) bei 1 mmol/l auf 90,07 (33,87;228,08) mN/min bei 10 mmol/l, während sich

die des Rindes nur von 9,36 (0;78,38) auf 29,87 (0;157,73) mN/min erhöhte. Eine

mögliche Erklärung hierfür liefert eine Studie an boviner Trachealmuskulatur:

GOSENS et al. (2003) konnten zeigen, dass die Stärke der durch Kalium induzierten

Muskelkontraktionen phenotypabhängig war. Auf Kalium- und Methacholingaben

hyperkontraktil reagierende Myozyten wiesen eine veränderte Kalziumsensitivität der

Muskelzellen auf. Ein ähnlicher Mechanismus könnte auch in dieser Arbeit die

Unterschiede in der Kontraktionsbereitschaft erklären.

Warum die circuläre Pylorusmuskulatur der Ziege auf NaCl-Gaben reagierte, bleibt

unklar. Eine Beeinflussung des Membranpotentials ist aufgrund der im Verhältnis

geringen Änderung der NaCl-Konzentration in der Pufferlösung von 117 auf 127

mmol/l eher unwahrscheinlich.

In vitro können also niedrige Kaliumspiegel die Labmagenmuskulatur hemmen und

sind damit grundsätzlich in der Lage, Atonien des Labmagens auszulösen, die in der

Folge zu Labmagenverlagerungen führen könnten.

5.1.2 Reaktionen isolierter Labmagenmuskulatur auf Änderungen der

extrazellulären Insulinkonzentration

Untersucht wurden die Antworten isolierter Labmagenmuskulatur auf

unterschiedliche Insulinkonzentrationen an longitudinaler Corpusmuskulatur von

Ziege und circulärer Corpus- und Pylorusmuskulatur von Ziege und Rind. Während

die circuläre Corpusmuskulatur unter Insulinzugaben im Gegensatz zur Kontrolle bei

unveränderter Frequenz mit einer Abnahme (Rind) bzw. einer geringeren Zunahme

(Ziege) von Amplitude und Kontraktionsaktivität reagierte, kam es bei der

Pylorusmuskulatur der Ziege zu einer Zunahme aller drei Parameter. Die übrigen

Gewebe reagierten nicht auf Insulingaben.

Diskussion 111

5.1.2.1 Keine Reaktion der Muskulatur auf Insulingaben

Nicht alle Abschnitte des Gastrointestinaltraktes reagieren auf Insulingaben mit

veränderter Motilität. BUENO und RUCKEBUSCH (1976) untersuchten beim Schaf

an verschiedenen Dünndarmabschnitten Veränderungen in der Motilität durch

Insulin. Während sie am Jejunum Reaktionen auf Insulingaben nachwiesen, konnten

sie sowohl am Duodenum als auch am Ileum keine Aktivitätsänderungen der

Muskulatur feststellen. Der Grund hierfür bleibt allerdings unklar.

5.1.2.2 Stimulation der Muskulatur durch Insulingaben

Schon PAVEL und MILCOU (1932) wiesen bei unterernährten Menschen eine durch

über längere Zeit verabreichtes Insulin hervorgerufene Hypermotilität des Darmes

nach, die sie auf einen direkt die Muskulatur stimulierenden Effekt zurückführten. In

vitro konnte am Jejunum von Schafen ebenfalls eine durch Insulin bedingte

Stimulation der Muskulatur gezeigt werden (BUENO u. RUCKEBUSCH 1976). Und

auch hyperinsulinämische Ratten weisen eine stärkere Motilität des Colons auf als

gesunde Kontrolltiere (FORREST u. PARSON 2003). Als Ursache hierfür konnten

die Autoren eine Ausschaltung inhibitorischer Neurone ausschließen. Sie vermuten

hingegen eine gesteigerte myogene Erregbarkeit als Auslöser. Ferner steht der

glatten Muskulatur bei hohen Insulinkonzentrationen und gleichzeitig unveränderter

Sensitivität der Gewebe vermehrt Glukose zur Verfügung (ARNQVIST 1975), die der

Grund für eine erhöhte Muskelaktivität sein könnte.

5.1.2.3 Hemmung der Muskulatur durch Insulingaben

Verschiedene Studien konnten in vivo einen hemmenden Einfluss von Insulin auf den

Labmagenefflux (HOLTENIUS et al. 2000; SUSTRONCK 2000; VAN MEIRHAEGE et

al. 1988 a) bzw. auf die abomasalen Muskelkontraktionen nachweisen

(PRAVETTONI et al. 2004, 2007). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen,

dass Insulin in der Lage ist, die circuläre Corpusmuskulatur zu hemmen. Da die

Motilität der Muskulatur aber entscheidend ist für die Aktivität der Magenpumpe,

kann dies den abomasalen Efflux vermindern.

Eine mögliche Ursache für die Hemmung der glatten Muskulatur ist in der

Beeinflussung des intrazellulären Kaliumhaushaltes zu sehen.

112 Diskussion

Sowohl an isolierter Frosch- (MOORE u. RABOVSKY 1979) als auch an

Säugetiermuskulatur (ZIERLER 1959) wurde unter Einfluss von Insulin eine

Hyperpolarisation der Zellmembran festgestellt. IANNACCONE et al. (1989) zeigten

an Skelettmuskulatur von Ratten, dass das negativere Membranpotential auf eine

Aktivierung der Na+/K+-ATPase zurückzuführen ist. Den gleichen Beweis lieferten

auch MOORE (1973) und GAVRYCK et al. (1974) an Froschmuskulatur und im

Rattenhirn. Ebenfalls an der Skelettmuskulatur des Frosches konnte gezeigt werden,

dass die Muskelzellen zweierlei Arten von Pumpen besitzen: aktive und inaktive.

Indem Insulin letztere stimuliert, kommt es zwar zu einem Kaliumeinstrom, aber zu

einem Netto-Kationenausstrom mit folgender Hyperpolarisation (ERLIJ u.

GRINSTEIN 1975). Zusätzlich stimuliert Insulin v. a. in der Leber den Na+/K+/Cl--

Symporter und den Na+/H+-Antiporter, so dass durch die Aufnahme von Na+ der

Na+/K+-ATPase Substrat geliefert wird (LANG 2000).

Die Stimulation der Na+/K+-ATPase führt zu einem Nettokationenausstrom, da nur

zwei Kalium- im Austausch gegen drei Natriumionen in die Zelle aufgenommen

werden. Zusätzlich kann Kalium aufgrund der erhöhten intrazellulären

Konzentrationen durch die Kaliumkanäle aus der Zelle diffundieren. So wird im

Endeffekt das Membranpotential der Muskelzelle stärker negativ, also

hyperpolarisiert. Das Schwellenpotential zur Öffnung spannungsabhängiger

Kalziumkanäle wird seltener erreicht und die myogene Aktivität somit gehemmt.

LANTZ et al. (1980) hingegen demonstrierten an Aggregaten von embryonalen

Herzzellen eine durch Insulin hervorgerufene Hyperpolarisation, die nicht durch die

Gabe des die Na+/K+-ATPase blockierenden Ouabains aufgehoben werden konnte,

also nicht auf einer Stimulation selbiger beruhte. ECKEL u. REINAUER (1990)

führten das durch Insulin bedingte negativere Membranpotential von Ratten-

Herzmuskelzellen auf eine erhöhte Kaliumleitfähigkeit der Zellmembran zurück. Eine

Untersuchung an Pericyten retinaler Kapillaren zeigte eine Aktivierung Apamin-

sensitiver Ca2+-abhängiger Kaliumkanäle durch Insulin (BERWECK et al. 1993) und

an glatten Muskelzellen der thorakalen Aorta von Rattenembryonen konnte eine

erhöhte Offenwahrscheinlichkeit ATP-sensitiver Kaliumkanäle in Anwesenheit von

Insulin nachgewiesen werden (YASUI et al. 2007). Da die Anwesenheit von Insulin

Diskussion 113

zudem grundsätzlich zu einer erhöhten Aufnahme von Kalium in Muskel-, Fett- und

Lebergewebe führt (VAN MEIRHAEGHE 1988; SWEENEY 1999), kommt es so

infolge lokaler oder auch genereller Hypokaliämien und einer erhöhten

Kaliumleitfähigkeit zu einem vermehrten Ausstrom von Kalium aus der Zelle und

ebenfalls zu einer Hyperpolarisation der Membran.

5.1.2.4 Mechanismen der Insulinhemmung

Um zu evaluieren, ob für den hemmenden Einfluss des Insulins auf die circuläre

Corpusmuskulatur des Labmagens ähnliche Mechanismen zugrunde liegen, wurden

weitere Untersuchungen durchgeführt. Einerseits wurde die Einflussnahme von

Kalium auf die Insulinwirkung untersucht und andererseits Kaliumkanäle mittels

Barium und Glybenclamid bzw. die Na+/K+-ATPase durch Ouabain blockiert.

5.1.2.4.1 Wirkung von Kalium in Anwesenheit von Insulin

Weder bei der Ziege noch beim Rind konnten signifikante Unterschiede zwischen

einer Kalium-Dosiswirkungskurve in An- oder Abwesenheit von Insulin an der

circulären Corpusmuskulatur festgestellt werden. Gleichzeitig reagierten alle

Präparate nur schwach auf die steigende extrazelluläre Kaliumkonzentration.

Letzteres ist auf die Konzeption des Versuchsprotokolls zurückzuführen (Anhang

10.1.1), da die Aktivität und Ansprechbarkeit der Präparate auf äußere Reize über

die Zeit abnahm (Ergebnisse 4.1.2.2). Die Gründe für das Fehlen von Unterschieden

zwischen den Kurven könnten auf einem Zusammenspiel von Na+/K+-ATPase und

Kaliumleitfähigkeit beruhen.

Wie oben beschrieben ist Insulin in der Lage, Muskelzellen durch Stimulierung von

Na+/K+-ATPasen zu hyperpolarisieren. Sowohl die durch Insulin stimulierte Aktivität

(MARUNAKA u. KITASATO 1985; MARUNAKA et al. 1986 b) als auch die basale

Aktivität der Na+/K+-Pumpe (MARUNAKA u. KITASATO 1985; MARUNAKA et al.

1986 a; MARUNAKA 1988) erhöht sich mit steigenden extrazellulären

Kaliumkonzentrationen. Dies würde für sich betrachtet bedeuten, dass Kaliumgaben

die Hyperpolarisation der Zellmembran in Anwesenheit von Insulin nicht verändern

oder verstärken. Allerdings ist das Ausmaß dieser Insulin-bedingten

Hyperpolarisation bei hohen Kaliumspiegeln vermindert (MARUNAKA 1987). Dies ist

114 Diskussion

in erster Linie darauf zurückzuführen, dass Kalium über eine Vielzahl von Kanälen in

Abhängigkeit des elektro-chemischen Gradienten über die Zellmembran diffundieren

kann. Der Beitrag der Kaliumleitfähigkeit zur Aktivität der Muskulatur überdeckt also

den hemmenden Einfluss der möglicherweise vorhandenen Insulin-bedingten

Stimulierung der Na+/K+-ATPase.

Eine durch Insulin hervorgerufene erhöhte Aktivität oder Offenwahrscheinlichkeit von

Kaliumkanälen müsste die Muskelzelle sensitiver werden lassen, insbesondere

gegenüber niedrigen extrazellulären Kaliumkonzentrationen. Bei einer Vielzahl von

geöffneten Kanälen ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass lokale

Diffusionsgradienten für Kalium entstehen, es so vermehrt aus der Zelle austreten

kann und das Membranpotential (noch) negativer wird.

Dies spiegelt sich in den vorliegenden Ergebnissen nicht wider. Verschiedene

Gründe kommen dafür in Betracht. Zum Einen besteht die Möglichkeit, dass Insulin

weder die Na+/K+-ATPase noch die Kaliumkanäle beeinflusst, so dass keine

Unterschiede zwischen den Kurven festzustellen sind. Zum Anderen könnte es sein,

dass Insulin auf beide Komponenten einwirkt: Die Na+/K+-Pumpe erhöht und die

Aktivierung der Kanäle erniedrigt die intrazelluläre Kaliumkonzentration. Möglich ist

ferner, dass die Auswirkungen des Insulins auf die Muskulatur überlagert werden, da

auch die nervale Komponente und die ICC durch Kalium beeinflusst werden (s. 5.1).

5.1.2.4.2 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Barium

Durch die Gabe von Barium können die meisten Kaliumkanäle nicht-selektiv geblockt

werden (BERWECK et al. 1993). Im Zuge dessen kam es an der glatten Muskulatur

des Labmagens zu einer signifikanten Steigerung von Amplitude und

Kontraktionsaktivität, die nach ca. 30 Minuten ein neues Plateau erreichte. Diese

Aktivitätszunahme beruht auf einem Anstieg des Membranpotentials, das auf den

unterbundenen Kaliumausstrom zurückzuführen ist. Der Effekt auf die Muskulatur

war allerdings unterschiedlich stark ausgeprägt. Die Höhe des Plateaus der

einzelnen Präparate variierte dabei in etwa zwischen 2 und 1000 mN/min. Worauf

diese enormen Unterschiede in der Reaktionsstärke beruhen ist unklar. Denkbar

Diskussion 115

wären Unterschiede in der Ansprechbarkeit der Gewebe (s. 5.1) oder in der Anzahl

an Kaliumkanälen.

Nach Vorinkubation mit 80 mU Insulin/l, wodurch sich Amplitude und

Kontraktionsaktivität verringerten, kam es zu einer nominellen Verstärkung des

Bariumeffektes. Im Gegenzug hatte Insulin in Anwesenheit von Barium keinen

Einfluss mehr auf die Muskulatur. Diese Ergebnisse deuten auf eine Insulinwirkung

an den Kaliumkanälen hin. Auch BERWECK et al. (1993) konnten in ihrer Arbeit

zeigen, dass die durch Insulin induzierte Hyperpolarisation der Zellmembran boviner

retinaler Pericyten durch Bariumzugaben verhindert werden konnte und dass

umgekehrt Insulin in Anwesenheit des Kaliumkanalblockers keine Wirkung mehr

zeigte.

5.1.2.4.3 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Glybenclamid

Um die wahrscheinlich vorhandene Insulinwirkung auf die Kaliumkanäle zu

spezifizieren, wurden mittels 0,05 mmol Glybenclamid/l ATP-sensitive Kanäle

geblockt (BERWECK et al. 1993; TRICARICO et al. 1998; YASUI et al. 2007). Der

die myogene Kontraktion stimulierende Effekt war deutlich geringer ausgeprägt als

bei Barium, was auf die unvollständige Blockade der Kaliumkanalpopulation

zurückzuführen ist. Auch die Höhe der Plateaus variierte, vermutlich aufgrund

dessen, nicht so stark. Wie auch schon in Kombination mit Barium gezeigt, konnte

die Insulin-bedingte Hemmung von Amplitude und Kontraktionsaktivität durch

Glybenclamid aufgehoben werden. Insulin hatte zusätzlich in Anwesenheit von

Glybenclamid keinen Einfluss mehr auf die Muskulatur, was wiederum auf eine

mögliche Insulinwirkung an Glybenclamid-sensitiven Kaliumkanälen spricht.

Während BERWECK et al. (1993) die Insulin-induzierte Hyperpolarisation der Zellen

nicht durch Glybenclamid aufheben konnten, gelang dieses YASUI et al. (2007)

hingegen an Gefäßmuskelzellen von Rattenembryonen. Sie wiesen so erstmalig eine

Insulin-bedingte erhöhte Offenwahrscheinlichkeit ATP-abhängiger Kaliumkanäle

nach.

116 Diskussion

5.1.2.4.4 Wirkung von Insulin in Anwesenheit von Ouabain

In einem weiteren Ansatz wurde die Na+/K+-ATPase mittels 0,001 mmol Ouabain/l

gehemmt. Dabei kam es zunächst zu einem nominellen Anstieg, im weiteren Verlauf

jedoch zu einer Abnahme von Amplitude und Kontraktionsaktivität. VANHEEL und

BREYNE (2004) konnten am Endothel kleiner Magenarterien zeigen, dass es unter

Einwirkung von Ouabain initial durch Hemmung des Pumpenstroms zu einer

Depolarisation kam. Im Folgenden konnte jedoch eine Hyperpolarisation der

Muskelzellmembranen beobachtet werden. Diese könnte darauf zurückzuführen

sein, dass die bei der Blockade der Na+/K+-ATPase ansteigende intrazelluläre

Natriumkonzentration die Aktivität des Na+/Ca2+-Austauschers beeinflusst, so dass

sich Kalzium in der Zelle anreichert. Die Konsequenz daraus ist zum einen die

Kontraktion der Muskelzelle und zum anderen könnte es sein, dass Kalzium-

abhängige Kaliumkanäle öffnen (LEBRUN et al. 1993). Eine daraus entstehende

erhöhte Kaliumleitfähigkeit könnte die in der Arbeit von VANHEEL und BREYNE

(2004) gemessene Hyperpolarisation und die in der vorliegenden Arbeit gezeigte

sekundäre Abnahme der Motilitätsparameter erklären.

Durch die Gabe von 80 mU Insulin/l konnte in diesem Versuchsansatz keine

signifikante Abnahme von Amplitude und Kontraktionsaktivität festgestellt werden.

Die Gründe hierfür sind unklar, da die Insulinlösung aus derselben Charge stammte,

die auch in den vorherigen Versuchen eingesetzt wurde. Nach Vorinkubation mit

Insulin konnte zwar eine weniger ausgeprägte Ouabain-bedingte Stimulation der

Muskulatur nachgewiesen werden, die Unterschiede zu der Ouabainkontrolle waren

jedoch nicht signifikant. Nach Blockade der Na+/K+-ATPase hatte Insulin keine

Wirkung mehr auf die Labmagenpräparate. Die Insulinwirkung auf die circuläre

Corpusmuskulatur konnte somit durch Ouabain aufgehoben werden.

5.1.2.4.5 Zusammenfassung der möglichen Mechanismen

Die oben angeführten Ergebnisse weisen darauf hin, dass Insulin an der zirkulären

Corpusmuskulatur des Labmagens sowohl über eine erhöhte Kaliumleitfähigkeit als

auch über eine Stimulation der Aktivität der Na+/K+-ATPase wirken könnte. Da in der

vorliegenden Arbeit allerdings keine Membranpotentiale gemessen wurden, sondern

Diskussion 117

lediglich auf die Bewertung der Muskelreaktionen zurückgegriffen werden konnte, die

zudem erschwert wurde durch die starken Variationen der basalen und durch

Substratzugaben stimulierten Aktivität, könnte es sich bei den beobachteten

Änderungen auch um eine Überlagerung von Effekten und nicht um direkt

antagonistische Wirkungen handeln.

5.2 In-vivo -Versuch

In vitro konnte also gezeigt werden, dass Insulin Einfluss auf die Motilität der glatten

Labmagenmuskulatur nimmt und dass dieser Effekt unter Umständen auf veränderte

Kaliumtransportraten über die Zellmembran zurückzuführen ist. Ziel des In-vivo-

Versuchs war es deshalb zu untersuchen, ob sich diese Ergebnisse auch am

lebenden Tier widerspiegeln; ob also Insulin in pathophysiologischen

Konzentrationen im Blut den Austritt von Ingesta aus dem Labmagen vermindern

kann und ob diese Reduzierung des Effluxes durch gleichzeitige Kaliumgaben

kompensiert werden kann.

Bei den Versuchstieren handelte es sich um leistungsgerecht gefütterte, gesunde

Milchkühe der Rasse Holstein-Frisian in unterschiedlichen Reproduktionsstadien. Ein

Versuch dauerte drei Tage. Am ersten Tag wurden bei den Versuchstieren die

basalen Kalium-, Glukose- und Insulinwerte im Blut bestimmt und der normale, d.h.

nicht durch Kalium- oder Insulin beeinflusste Labmagenefflux gemessen. An den

folgenden Tagen wurde versucht, unter euglykämischen Bedingungen über eine

Infusion von Insulin (zweiter Versuchstag) die Kaliumkonzentration im Blut zu senken

bzw. diese durch zusätzliche Gabe von 0,5 mmol KCl/min/Tier konstant zu halten

(dritter Versuchstag) und dabei ggf. auftretende Änderungen des Effluxes zu

messen. Letzterer wurde mit Hilfe von kontinuierlichen intraruminalen Applikationen

von Chrom-EDTA ermittelt. Um das Erreichen des hierfür notwendigen steady states

nicht zu gefährden, wurde den Tieren die Futter- und Wasseraufnahme für die Dauer

des Versuchs (ca. fünf Stunden) verwehrt. Die Tiere haben die Versuchstage ohne

Komplikationen überstanden.

118 Diskussion

5.2.1 Insulinkonzentrationen

Durch die Infusion von 1 mU Insulin/kg KGW/min konnte gegenüber den Basalwerten

an Tag 1 im Mittel eine Steigerung der gemessenen Insulinwerte im Blut von 0,68

(±0,59) µg/l auf 6,67 (±1,9) µg/l an Tag 2 bzw. auf 7,24 (±1,96) µg/l an Tag 3 erzielt

werden. Die vor Beginn der Infusionen an Tag 3 gemessenen Insulinwerte

entsprachen alle den Basalwerten an Tag 1.

Insulininfusionen heben die basale Insulinkonzentration an, bis sich nach einer

gewissen Infusionsdauer ein Gleichgewicht zwischen Insulininfusion, pankreatischer

Insulinsekretion und Insulin-Clearance eingestellt hat und eine steady-state

Insulinkonzentration (SSIK) erreicht ist (BLUM et al. 1999). Dieser

Gleichgewichtszustand war in der vorliegenden Arbeit bereits nach einer Stunde

erreicht. Obwohl die Insulininfusion auf Basis der Körpergewichte für alle Tiere gleich

war, unterschieden sich die SSIKs bei den sechs Versuchstieren deutlich. Als

Ursache sind Unterschiede in der Plasma-Insulin-Clearance in den unterschiedlichen

Reproduktionsstadien zu vermuten (DEBRAS et al. 1989). Die Abnahme des

zirkulierenden Insulins ist z. B. bei laktierenden Schafen höher als bei

trockenstehenden. Dies sichert eine niedrige Insulinkonzentration im Plasma

während der Laktation, die für die Umverteilung der Nährstoffe hin zur Milchdrüse

wichtig ist (FAULKNER u. POLLOCK 1990). Vergleichbares wurde auch bei Ziegen

(GRIZARD et al. 1988), Kühen (HART et al. 1980) und Ratten (JONES et al. 1984)

beobachtet. Als weitere Möglichkeit wird die veränderte Insulinaufnahme durch die

Leber (LOMAX et al. 1979) während der Trächtigkeit und in der Laktation diskutiert

(SANO et al. 1991). So ist in der vorliegenden Studie bei den laktierenden Tieren

während der Insulininfusion zumindest an Tag 2 eine Abnahme der gemessenen

Plasmakonzentration trotz konstanter Infusionsrate zu verzeichnen.

Die Insulininfusionsrate von 1 mU/kg KGW/min wurde gewählt, da aus der Arbeit von

KRÄFT (2004) hervorging, dass mit dieser Menge Insulinkonzentrationen im Tier

erzielt werden, die auch pathophysiologischerweise noch vorkommen können. Sie

erzielte bei Infusionsraten von 0,5 mU Insulin/ kg KGW/ min im Plasma eine

Insulinkonzentration von ca. 27 mU/l, bei 2 mU Insulin/ kg KGW/ min hingegen schon

120-145 mU/l.

Diskussion 119

Die genaue Umrechnung der in µg/l gemessenen Insulinwerte in die sonst

verwendete Einheit mU/l ist nicht möglich, da Insulin mithilfe von Antikörpern

gemessen wurde und somit nicht bekannt ist, wie viel Prozent des Insulins

tatsächlich biologisch aktiv sind. In der Literatur wird diese Einheit jedoch auch z. T.

verwendet, so dass zumindest hinsichtlich der Basalwerte Vergleiche gezogen

werden können. HIPPEN et al. (1999) und BUTLER et al. (2004) geben hierfür

Konzentrationen zwischen 0,2 und 4,5 µg/l an, LEURY et al. (2003) zwischen 0,7 und

1,8 µg/l. Diese Angaben sind mit den Insulinspiegeln der vorliegenden Studie

vergleichbar. Nimmt man dann als Grundlage für die Bewertung anstelle absoluter

Werte die durch die Insulininfusion erzielte Steigerung der Plasmainsulinspiegel (in

dieser Arbeit im Schnitt um das Zehnfache), entspricht diese in etwa den

Konzentrationsunterschieden zwischen normo- und hyperinsulinämischen Kühen.

Erstere weisen je nach Laktationsstadium Werte zwischen 2,1 und 8,9 mU/l auf

(KRÄFT 2004) und letztere bis zu 42 mU/l (PRAVETTONI et al. 2007).

5.2.2 Kaliumkonzentrationen

Die Kaliumkonzentrationen im Plasma konnten durch die Insulininfusionen im Schnitt

signifikant von 3,94 (±0,19) mmol/l auf 3,51 (±0,25) mmol/l gesenkt werden. Die

Reduktion des Kaliumgehaltes erfolgte innerhalb der ersten halben Stunde nach

Beginn der Insulininfusion. Allerdings konnte nur bei 50 % der Tiere eine

Hypokaliämie mit Kaliumwerten von unter 3,5 mmol/l erzeugt werden. Durch die

Gabe von 0,5 mmol KCl/min/Tier konnte ein Absinken der Kaliumspiegel im Blut

verhindert werden. Im Mittel lagen die Werte dann bei 3,83 (±0,19) mmol/l und waren

damit signifikant höher als ohne Kaliumsubstitution und nicht mehr verschieden von

den Werten ohne Insulininfusion an Tag 1.

Entscheidend für die genaue Bestimmung des Kaliumgehaltes im Blut war die

unmittelbare Zentrifugation der Blutproben nach der Gerinnung und das Überführen

des Serums in Eppendorfgefäße, da durch die eintretende Hämolyse bei längerem

Stehen lassen der Proben der Kaliumgehalt des Plasmas steigt (VETMEDLABOR

2007).

120 Diskussion

Die Ergebnisse zeigen, dass Insulin in hyperinsulinämischen Konzentrationen beim

Rind in der Lage ist, den Kaliumgehalt der extrazellulären Flüssigkeit zu senken.

Dies steht mit den Aussagen von VAN MEIRHAEGHE (1988) und SWEENEY (1999)

im Einklang, die eine maßgebliche Beteiligung von Insulin an der Senkung der

Kaliumkonzentration im Blut durch eine verstärkte Aufnahme in Muskel-, Fettgewebs-

und Leberzellen feststellten. Allerdings treten starke Unterschiede zwischen den

Tieren auf: Während sich die Kaliumkonzentration im Plasma beispielsweise bei Tier

1 von 3,82 auf 3,25 mmol/l verringerte, reduzierte sie sich bei Tier 4 lediglich von

4,10 auf 3,80 mmol/l. Eine Korrelation zu der Höhe der im Tier erzielten

Insulinkonzentration bestand dabei nicht. Die während des Clamps infundierte

Glukosemenge zur Erhaltung euglykämischer Bedingungen unterschied sich bei den

Tieren nicht, so dass davon auszugehen ist, dass das verabreichte Insulin, das

zusätzlich aus einer Charge stammte, bei jedem Tier die gleiche biologische Aktivität

zeigte. Möglicherweise bestand bei einigen Versuchstieren eine Insulinresistenz bzw.

eine verminderte Insulin-Response hinsichtlich der Wirkung auf die

Kaliumhomöostase, wie es beim Menschen bereits gezeigt wurde (COHEN et al.

1991). Ebenfalls beim Menschen konnte z. B. auch eine selektive Insulinresistenz

des Proteinstoffwechsels (bei also unbeeinflusster Response des Glukose-, Kalium-

und Fettstoffwechsels) nachgewiesen werden (LUZI et al. 2008). In einer anderen

Studie traten hohe Insulinspiegel gemeinsam mit Hyperglykämien und

Hypokaliämien auf, so dass dort von einer verminderten Response des

Glukosestoffwechsels auszugehen ist (ZHAO et al. 2008). Bei Mäusen scheint

Insulin die SGK1 (serum and glucocorticoid-inducible kinase) in der Leber zu

aktivieren, die wiederum die Aktivität des Na+/H+-Austauschers, des Na+/K+/2Cl--Co-

Transporters und der Na+/K+-ATPase verstärkt und so letztlich den hypokaliämischen

Effekt von Insulin vermittelt (BOINI et al. 2008). Eine unterschiedliche Sensitivität

dieses Enzyms gegenüber Insulin in Geweben der Rinder könnte die von Tier zu Tier

unterschiedliche Abnahme der Kaliumkonzentrationen erklären.

Die Höhe der durch die Infusion erzielten Insulinkonzentration und die dadurch

bedingte Reduktion des Kaliumgehaltes im Blut erfüllen die Voraussetzung für eine

mögliche Übertragbarkeit der In-vitro-Ergebnisse auf das Tier.

Diskussion 121

5.2.3 Efflux

5.2.3.1 Diskussion der Methode

Der abomasale Efflux wurde mit Hilfe des Volumenmarkers Cr-EDTA in Anlehnung

an verschiedene am Pansen durchgeführte Untersuchungen gemessen (LOPEZ et

al. 1994; LOPEZ et al. 2003; VON ENGELHARDT et al. 2006). Cr-EDTA wurde zu

diesem Zweck über eine Fistel dem Pansen zugeführt und zwar in der Menge, die

dem aus dem Labmagen abfließenden Schätzwert entsprach. Die Berechnung des

Labmageneffluxes mithilfe der im Duodenalchymus gemessenen

Chromkonzentration erfolgte im steady state, also dann, wenn sich das Chrom

gleichmäßig auf Vormägen und Labmagen verteilt hatte. Vorversuche (n=3) ergaben,

dass dieser Zustand nach drei bis vier Stunden erreicht war (s. 3.2.3.4., Abbildung

3). Die mit dieser Methode bei den Vorversuchen gemessene basale Effluxmenge

aus dem Labmagen betrug im Mittel 150 ml/min. Dies entspricht auch den Werten

des ersten Versuchstages. Die hier verwandte Methode erweist sich also aufgrund

ihrer Reproduzierbarkeit für die Messung des abomasalen Effluxes als geeignet.

Allerdings ist es auch hier, ähnlich wie bei VAN MEIRHAEGE et al. (1988 a), nicht

möglich, den genauen Ursprung ggf. eintretender Veränderungen auszumachen, da

mit dieser Methode unklar bleibt, ob eine Beeinflussung des Effluxes auf einen

verminderten Vorschub aus dem Pansen oder auf einen direkten Effekt auf den

Labmagen zurückzuführen ist,

5.2.3.2 Diskussion der Ergebnisse

Im Schnitt war zwar bei den gemessenen Effluxmengen kein Unterschied zwischen

den Tagen feststellbar, allerdings ergaben sich zwischen den Versuchstieren

tendenzielle Abweichungen. Bei vier von sechs Versuchstieren kam es am zweiten

Versuchstag zu einer Abnahme, bei den übrigen zwei Tieren hingegen zu einem

Anstieg des Labmageneffluxes.

Dabei schien das Reproduktions- bzw. Trächtigkeitsstadium der Tiere keinen

Einfluss auf den Verlauf des Versuchs zu haben, und auch eine direkte Korrelation

zwischen der Höhe des Labmageneffluxes und der Höhe der Insulin- und

Kaliumkonzentrationen im Blut konnte nicht beobachtet werden. Allerdings fiel auf,

122 Diskussion

dass die Tiere, die am zweiten Versuchstag einen Anstieg des Effluxes zeigten, nur

geringgradige Unterschiede der Kaliumwerte zwischen den drei Versuchstagen

aufwiesen, die Beeinflussung des Kaliumhaushalts durch Insulin also geringer war,

als bei den übrigen Versuchstieren.

Reduktion des Effluxes unter Insulininfusion:

Der bei diesen Tieren nominell hemmende Einfluss des Insulins auf die

Labmagenentleerung entspricht früheren Untersuchungen anderer Autoren

(HOLTENIUS et al. 2000; PRAVETTONI et al. 2004, 2007; SUSTRONCK 2000; VAN

MEIRHAEGE et al. 1988 a), die allerdings z. T. Insulin in pharmakologischen Dosen

infundierten. Die vorliegende Studie zeigt mit Einschränkung, dass auch

pathophysiologische Konzentrationen den Efflux reduzieren könnten.

Der nominell hemmende Einfluss des Insulins war bei der Hälfte der Tiere (den

einzigen trockenstehenden Kühen) durch Kaliumgaben am dritten Versuchstag

kompensierbar, was zumindest bei diesen Kühen für eine mögliche Übertragbarkeit

der in vitro erzielten Ergebnisse auf Zustände in vivo spricht. Bei den Kühen, bei

denen der nominell hemmende Einfluss des Insulins auf den Labmagenefflux nicht

durch Kaliumgaben aufgehoben werden konnte, könnte Insulin nicht (nur) über

Änderungen der Kaliumhomöostase wirken. Denkbar wäre aber auch, dass die

lokalen Kaliumkonzentrationen an der Labmagenmuskulatur nicht den Plasmawerten

entsprechen und dass die substituierte Kaliummenge aus diesem Grund nicht

ausreichend ist, um einen Einfluss des Insulins zu kompensieren.

Die vorliegenden Verhältnisse könnten eine Begründung dafür liefern, weshalb es bei

nicht-laktierenden Kühen, bei denen Kalium die hemmende Insulinwirkung auf den

abomasalen Efflux offenbar kompensiert, nur in Ausnahmefällen zu

Labmagenverlagerungen kommt (DIRKSEN 1961; JUBB et al. 1991; DETILLEUX et

al. 1997).

Stimulation des Effluxes unter Insulininfusion:

Bei zwei der Tiere kam es unter Insulineinfluss zu einem nominell vermehrten

Ausfluss von Ingesta aus dem Labmagen. ARNQVIST (1975) geht davon aus, dass

Insulin der Labmagenmuskulatur über eine erhöhte Glukoseaufnahme in die Zellen

vermehrt Energie bereitstellt und auf diese Weise in der Lage ist, die Aktivität der

Diskussion 123

Myocyten indirekt zu steigern. Bei den beiden Kühen ist auffällig, dass der

Kaliumhaushalt von allen Versuchstieren am wenigsten durch die Insulininfusion

beeinflusst wurde: die Blutkaliumkonzentration sank lediglich um 0,2 bzw. 0,3 mmol/l,

bei den anderen vier Tieren um 0,4 bis 0,8 mmol/l. Damit war eine Insulin-bedingte

Änderung von Kaliumgradienten möglicherweise geringer ausgeprägt. Diese

abweichende Reaktion der Kühe könnte auf (genetischen) Unterschieden in der

Insulinsensitivität beruhen. Die Angaben zur Heritabilität von

Labmagenverlagerungen variieren zwar zwischen h2=0,04 (±0,017) (RICKEN 2003)

und h2=0,24 (GEISHAUSER et al. 1996), es besteht aber grundsätzlich

Übereinstimmung, dass genetische Unterschiede mehr oder weniger stark für die

unterschiedlichen Prädisposition der Kühe für eine Dislocatio abomasi verantwortlich

sein können.

124 Schlussfolgerungen

6 Schlussfolgerungen

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Insulin neben möglichen

sekundären Effekten auch einen direkten Einfluss auf die Motilität der glatten

Muskulatur des Labmagens hat.

Die in vitro gezeigte Hemmung der circulären Corpusmuskulatur könnte zu einem

verminderten Vorschub führen, der, bei gleichzeitig unbeeinflusster oder gar

stimulierter Pylorusmuskulatur, in einem reduzierten Labmagenefflux resultieren

würde. Dieser deutete sich in vivo bei vier von sechs Kühen an. Die Insulin-bedingten

Störungen der Labmagenmotilität könnten demnach ursächlich an der Entstehung

der Atonien, die im Zusammenhang mit Labmagenverlagerungen beobachtet

werden, beteiligt sein.

Aus den In-vitro-Versuche mit Barium, Glybenclamid und Ouabain ergeben sich

Hinweise auf eine mögliche Beteiligung von Kaliumkanälen und der Na+/K+-ATPase

an der Insulinwirkung auf die Labmagenmuskulatur des Rindes.

Um diese Hinweise zu bestätigen, könnten in weiteren Versuchen Messungen von

Membranpotentialen insbesondere an der circulären Corpusmuskulatur durchgeführt

werden. Auf diese Art und Weise könnte genauer geprüft werden, in welchem

Umfang Insulin über eine veränderte Kaliumleitfähigkeit und/oder eine Stimulation

der Na+/K+-ATPase das Membranpotential erniedrigt und damit das Öffnen von

spannungsabhängigen Kalziumkanälen mit nachfolgender Muskelkontraktion

erschwert.

Aufgrund der großen individuellen Unterschiede im In-vivo-Teil dieser Arbeit, wäre

eine Fortführung dieses Versuches an einer größeren Tierzahl sinnvoll, um

Folgendes zu evaluieren:

1. Bei wie vielen Kühen kommt es infolge euglykämischen hyperinsulinämischen

Clamps tatsächlich zu einer Reduktion des Labmageneffluxes?

2. Bei wie vielen Tieren ist dieser durch Ausgleich des Kaliumhaushaltes zu

kompensieren?

Schlussfolgerungen 125

3. Bestätigt sich der Verdacht, dass insbesondere trocken stehende Kühe

tatsächlich mit einem Wiederanstieg der Effluxmenge auf ausgleichende

Kaliumgaben reagieren?

4. Wie viele Kühe reagieren bei einer Insulininfusion von 1 mU/kg KGW/min mit

einer starken Abnahme der Kaliumkonzentration im Blut? Gibt es genetische

Unterschiede?

5. Bestätigt sich der Verdacht, dass die Höhe der Reduktion der Kaliumspiegel

entscheidend ist für den Verlauf der Effluxmessungen?

126 Zusammenfassung

7 Zusammenfassung

Gesche Türck: Bedeutung von Kalium und Insulin für die Motilität der

Labmagenmuskulatur

Die Labmagenverlagerung ist eine häufige Erkrankung hochleistender Milchkühe,

deren Pathogenese bislang nur teilweise geklärt ist. Hypokaliämien und

Insulinimbalancen werden oft im Zusammenhang mit gestörter Labmagenmotilität

beobachtet und könnten damit an der Entstehung der Verlagerung beteiligt sein. Ziel

dieser Arbeit war es herauszufinden, wie isolierte Labmagenmuskulatur einerseits

auf Veränderungen der extrazellulären Kalium-Konzentration und andererseits auf

steigende Insulingaben reagiert. Im Falle eines auftretenden Insulineffektes sollte

geklärt werden, inwieweit eine Insulin-bedingte Hemmung der Muskelaktivität auf

eine erhöhte Kalium-Leitfähigkeit und/oder eine Stimulation der Na+/K+-ATPase

zurückgeführt werden kann, wie es bereits in anderen Geweben nachgewiesen

werden konnte. In einem letzten Schritt wurde überprüft, inwieweit in vivo der

Labmagenefflux durch Insulininfusion reduziert werden kann und ob diese Reduktion

durch Kaliumsubstitution kompensierbar ist.

Im Zuge des In-vitro-Versuchs wurde von 22 Ziegenböcken und 74 nicht tragenden

Milchkühen der Rasse Holstein-Frisian bei der Schlachtung aus der Labmagenwand

zirkuläre Muskulatur aus Pylorus und Corpus isoliert und in einer Pufferlösung

inkubiert. Bei der Ziege wurde zusätzlich auch longitudinale Corpusmuskulatur zur

Überprüfung eines möglichen Insulineffektes untersucht. Mit Hilfe von

Kraftaufnehmern wurde die spontane isometrische Kraftentwicklung dieser

Muskelstreifen bei verschiedenen Zugaben von Kalium (1 bis 10 mmol/l) und Insulin

(0 bis 120 mU/l) gemessen. Ausgewertet wurden Frequenz (1/min) und Amplitude

(mN) der Muskelkontraktionen sowie die Kontraktionsaktivität (mN/min). Im Rahmen

des In-vivo-Versuchs wurde der Labmagenefflux von sechs fistulierten Kühen mithilfe

von Chrom-EDTA gemessen. Diese Versuche erfolgten unter euglykämischen

Bedingungen ohne Infusion (Tag 1), unter Infusion von Insulin (1 mU/kg KGW/min;

Zusammenfassung 127

(Tag 2) und unter Insulininfusion mit einer zusätzlichen Kaliumsupplementierung von

0,5 mmol/Tier/min (Tag 3).

In vitro konnte an allen Präparaten mit Ausnahme der Pylorusmuskulatur der Ziege in

unterschiedlicher Ausprägung eine durch steigende Kaliumgaben bedingte Zunahme

von Amplitude und Kontraktionsaktivität bei unbeeinflusster Frequenz festgestellt

werden.

Hinsichtlich der Wirkung von Insulin auf die isolierte Labmagenmuskulatur gab es

unterschiedliche Reaktionen. Während die circuläre Corpusmuskulatur unter

Insulinzugaben im Gegensatz zur Kontrolle bei unveränderter Frequenz mit einer

Abnahme (Rind) bzw. einer geringeren Zunahme (Ziege) von Amplitude und

Kontraktionsaktivität reagierte, kam es bei der Pylorusmuskulatur der Ziege zu einer

Zunahme aller drei Parameter. Die übrigen Gewebe reagierten nicht auf Insulin. Die

hemmende Wirkung des Insulins auf die zirkuläre Corpusmuskulatur des Rindes

konnte dabei durch Gaben von Kalium, Barium (3 mmol/l; Kaliumkanalblocker),

Glybenclamid (0,05 mmol/l; Blocker ATP-sensitiver Kaliumkanäle) und Ouabain

(0,001 mmol/l; Hemmer der Na+/K+-ATPase) aufgehoben werden.

In vivo konnte im Zuge der Insulininfusion zwar eine Absenkung der

Kaliumkonzentration im Blut an Tag 2 und durch die Kaliumsupplementierung ein

Wiederanstieg der Werte an Tag 3 erzielt werden, jedoch kam es nur bei vier von

sechs Tieren zu einem nominellen Abfall des Labmageneffluxes am zweiten und

davon nur bei zwei Tieren zu einem Wiederanstieg am dritten Versuchstag.

In vitro konnte also zum einen gezeigt werden, dass die extrazelluläre

Kaliumkonzentration in direktem Zusammenhang mit der Motilität der glatten

Muskulatur des Labmagens steht und damit in der Lage wäre, die Aktivität der

Magenpumpe und die Effluxmenge zu beeinflussen. Zum anderen konnten

Amplitude und Kontraktionsaktivität der zirkulären Corpusmuskulatur durch Insulin

gehemmt werden. Da diese Hemmung durch Gabe von Kalium, Barium,

Glybenclamid sowie Ouabain kompensierbar war, weisen die Ergebnisse der

Motilitätsmessung darauf hin, dass Insulin seine Wirkung an der zirkulären

Labmagenmuskulatur über eine Erhöhung der Kaliumleitfähigkeit und/oder eine

Erhöhung der Aktivität der Na+/K+-ATPase entfalten könnte.

128 Zusammenfassung

Bezüglich der Übertragbarkeit der in vitro gewonnenen Erkenntnisse auf

Bedingungen in vivo kann aufgrund der großen individuellen Unterschiede in der

Reaktion des Effluxes auf die Insulin- und Kaliuminfusionen keine abschließende

Aussage getroffen werden.

Summary 129

8 Summary

Gesche Türck: Effect of potassium and insulin on the abomasal smooth muscles

Abomasal displacement is a common disease of high-yielding dairy cows of which

the pathogenesis is only partly understood. Hypokalemia and insulin imbalances are

often observed in connection with disturbed abomasal motility, and might be involved

in the development of abomasal displacement.

Aim of the present study was to test the reaction of isolated abomasal smooth

muscle stripes to changes in the extracellular potassium-concentration and to

increasing doses of insulin. In case of an insulin-effect the contribution of an

enhanced potassium-conductance and a stimulation of the Na+/K+-pump to this effect

had to be tested, in analogy to insulin effects known from other tissues. At least we

investigated in vivo, if the abomasal outflow could be reduced by infusions of insulin

and if potassium –substitutions might be able to compensate a potential reduction.

Motility measurements in vitro were performed with circular smooth muscle stripes

isolated from abomasal pylorus and corpus of 22 male goats and 74 non-pregnant

Holstein-Frisian cows immediately after slaughter and incubated in buffer solution. A

potential insulin-effect was also tested with longitudinal smooth muscles from caprine

corpus abomasi. Spontaneous isometric contractions were measured in the presence

of increasing concentrations of potassium (1 to 10 mmol/l) and insulin (0 to 120

mU/l). Contractions were analysed for frequency (1/min), amplitude (mN) and

contraction-activity (mN/min). For the in-vivo part of the study, the abomasal outflow

of six fistulated cows was measures with Cr-EDTA. These experiments were

conducted under euglycemic conditions without infusions (day 1), with infusion of

insulin (1 mU/kg BW/min; day 2) and with infusion of insulin together with an

additional potassium-supplement of 0.5 mmol/cow/min (day 3).

All tissues with the exception of goat pylorus reacted to increasing potassium

concentrations with a distinct increase in amplitude and contraction-activity while the

frequency was not influenced. The effect of insulin on the isolated smooth muscle

stripes differed between the localisations. While circular muscles of the corpus

130 Summary

reacted with a decrease of amplitude and contraction-activity (in cows) or a less

pronounced increase of these parameters compared with control (in goats), the

caprine pylorus showed an increase in all three parameters. The remaining tissues

didn’t react to insulin. The inhibitory effect of insulin on the circular smooth muscles

of the corpus could be antagonized by potassium, barium (3 mmol/l; inhibitor of K+-

channels), glibenclamide (0.05 mmol/l; inhibitor of ATP-sensitive K+-channels) and

ouabain (0.001 mmol/l; inhibitor of the Na+/K+-pump).

The insulin infusion in the in vivo experiment induced a decrease in the blood

potassium-concentration (day 2) which could be overcome by the potassium-

supplements (on day 3). However only four of the six cows showed a nominally

reduction in abomasal outflow on day 2 and only two of them showed a re-increase in

the outflow on day 3.

In conclusion, the results of the in vitro experiments showed a direct effect of

extracellular potassium concentration on the motility of the abomasal smooth muscle.

Potassium may thus influence the activity of the stomach-pump and the abomasal

outflow. Insulin inhibited amplitude and contraction-activity of circular muscles from

abomasal corpus. Since this effect could be antagonized by the addition of

potassium, barium, glibenclamide or ouabain, these results point to an increase in

potassium-conductance and/or an increase in Na+/K+-pump activity as possible

mechanisms of insulin.

Due to the individual differences between cows concerning the changes in abomasal

outflow after the insulin- and potassium-infusions, it is not possible to draw a definite

conclusion to which extent these in-vitro-results would be applicable to the

circumstances in vivo.

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168 Anhang

10 Anhang

10.1 Versuchsschemata

Nach dem Einspannen der Muskelstreifen in die Apparatur wurde eine Stunde mit

dem Beginn des Versuches gewartet, um eine gleichmäßige Motilität der

Muskelstreifen zu erzielen. Aus diesem Grund erfolgten auch nach einem

Puffertausch für mindestens eine halbe Stunde keine weiteren

Konzentrationserhöhungen.

10.1.1 Kalium

Bei der Ziege wurde in die Kammern 1-3 circuläre, in die Kammern 4 und 5

longitudinale Corpusmuskulatur und in die Kammern 6-8 circuläre Pylorusmuskulatur

gespannt. Beim Rind hingegen wurde in den ersten vier Kammern circuläre Corpus-

und in den letzten vier circuläre Pylorusmuskulatur untersucht. Die Zugaben erfolgten

nach jeweils 15 Minuten.

Tabelle 33: Versuchsschema zur Überprüfung der Kali umwirkung an isolierter

Labmagenmuskulatur der Ziege

Kammer 1, 4 und 6 Kammer 2, 5 und 7 Kammer 3 und 8

4,7 mmol KCl/l 4,7 mmol KCl/l 4,7 mmol KCl/l

Puffertausch 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l

Zugaben +2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +3 mmol NaCl/l

Puffertausch 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l Insulin 7 mU Insulin/l 42 mU Insulin/l kein Insulin Zugaben +2 mmol KCl/l

+1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +3 mmol NaCl/l

Anhang 169

Tabelle 34: Versuchsschema zur Überprüfung der Kali umwirkung an isolierter

Labmagenmuskulatur des Rindes

Kammer 1 und 5 Kammer 2 und 6 Kammer 3 und 7 Kammer 4 und 8

4,7 mmol KCl/l 4,7 mmol KCl/l 4,7 mM KCl 4,7 mM KCl

Puffertausch 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l

Zugaben

+2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +3 mmol NaCl/l

Puffertausch 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l 1 mmol KCl/l

Insulin 7 mU Insulin/l 42 mU Insulin/l kein Insulin kein Insulin

Zugaben +2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +1 mmol KCl/l +3 mmol KCl/l

+2 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +1 mmol NaCl/l +3 mmol NaCl/l

10.1.2 Insulin

Die Aufteilung der Präparate auf die zur Verfügung stehenden Kammern entspricht

der unter 10.1.1 aufgeführten. Beim Rind wurde nur der Versuch mit der Zeitkontrolle

durchgeführt. Die Zugaben erfolgten nach jeweils 30 Minuten.

170 Anhang

Tabelle 35: Versuchsschema zur Überprüfung der Insu linwirkung an isolierter

Labmagenmuskulatur

Ziege:

Rind:

Kammer 1, 2, 4, 6 und 7

Kammer 1, 3, 5 und 7

Kammer 3, 5 und 8

Kammer 2, 4, 6 und 8

5 mmol KCl/l (nicht beim Rind);

4,7 mmol KCl/l

3 mmol KCl/l (nicht beim Rind);

4,7 mmol KCl/l ohne Insulinzugaben

Zugaben + 7 mU Insulin/l + 7 mU Insulin/l

+ 14 mU Insulin/l + 14 mU Insulin/l

+ 21 mU Insulin/l + 21 mU Insulin/l

+ 38 mU Insulin/l + 38 mU Insulin/l

+ 40 mU Insulin/l + 40 mU Insulin/l

Nur Ziege! auf 10 mM KCl auf 10 mM KCl

Aufgrund der fehlenden Insulinwirkung an der circulären Pylorusmuskulatur des

Rindes wurde ein weiterer Versuch durchgeführt.

Tabelle 36: Versuchsschema zur Überprüfung der Insu linwirkung an isolierter

Pylorusmuskulatur des Rindes

Kammer 1 und 5 Kammer 2 und 6 Kammer 3 und 7 Kammer 4 und 8

Zeit 4,7 mmol KCl/l 4,7 mmol KCl/l 4,7 mmol KCl/l 4,7 mmol KCl/l

0 h

0,5-2,5 h kein Insulin 40 mU Insulin/l 120 mU Insulin/l 200 mU Insulin/l

10.1.3 Weiterführende Untersuchungen

An der circulären Corpusmuskulatur des Rindes wurden weitergehende

Untersuchungen einerseits mit den Kaliumkanalblockern Barium und Glybenclamid

und andererseits mit Ouabain, einem Hemmer der Na+/K+-ATPase, vorgenommen.

Anhang 171

Tabelle 37: Versuchsschema zur Überprüfung der Insu linwirkung in Anwesenheit von Barium;

Gesamtversuchsdauer: 150 min

Zeitpunkt

(min nach Versuchsbeginn)

Kammer

2 und 6

Kammer

3 und 7

Kammer

4 und 8

0 80 mU

Insulin/l

3 mmol Barium/l 3 mmol Barium/l

30 3 mmol Barium/l

60

90 80 mU Insulin/l

Tabelle 38: Versuchsschema zur Überprüfung der Insu linwirkung in Anwesenheit von

Glybenclamid; Gesamtversuchsdauer: 105 min

Zeitpunkt

(min nach Versuchsbeginn)

Kammer

2 und 6

Kammer

3 und 7

Kammer

4 und 8

0 80 mU

Insulin/l

0,05 mmol

Glybenclamid/l

0,05 mmol

Glybenclamid/l

15 0,05 mmol

Glybenclamid/l

30

60 80 mU Insulin/l

Tabelle 39: Versuchsschema zur Überprüfung der Insu linwirkung in Anwesenheit von Ouabain;

Gesamtversuchsdauer: 105 min

Zeitpunkt

(min nach

Versuchsbeginn)

Kammer

2 und 6

Kammer

3 und 7

Kammer

4 und 8

0 80 mU Insulin/l 0,001 mmol Ouab./l 0,001 mmol Ouab./l

15

30 0,001 mmol Ouab./l 80 mU Insulin/l

172 Anhang

10.2 Verlauf der Blutglukosekonzentration im In-vivo- Versuch

Die Effluxmessungen fanden unter normoglykämischen Bedingungen statt. Durch

Intravenöse Gaben von Glukose konnten die Blutkonzentrationen während der

Insulininfusionen weitestgehend konstant gehalten werden (Abbildung 33).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 90 180 270 0 90 180 270 300 60 150 240 300

Zeit in min

[Glu

kose

] in

mg/

dl

Abbildung 33: Verlauf der Blutglukosekonzentratione n aller Versuchstiere an den drei

Versuchstagen

Die Pfeile markieren den Beginn der Insulininfusion .

10.3 Verwendete Substanzen

10.3.1 In-vitro-Versuch

Für die Pufferlösung:

NaCl: 117,0 mmol/l (Art. Nr. 1.06404.1000, Merck, Darmstadt)

KCl: 4,7 mmol/l (Art. Nr. 1.04936.0500, Merck, Darmstadt)

MgCl2: 1,2 mmol/l (Art. Nr. 1.05833.0250, Merck, Darmstadt)

NaH2PO4: 1,2 mmol/l (Art. Nr. S-5011, Sigma Aldrich, Steinheim)

CaCl2: 2,5 mmol/l (Art. Nr. 2381, Merck, Darmstadt)

NaHCO3: 25,0 mmol/l (Art. Nr. S-6014-1 KG, Sigma Aldrich, Steinheim)

Glukose: 11,0 mmol/l (Art. Nr. 1.08337.1000, Merck, Darmstadt)

Kontrolle Insulin + Kalium Insulin

Tag 2 Tag 3 Tag 1

Anhang 173

Als Zugaben:

Tabelle 40: Liste der für die in-vitro-Motilitätsme ssungen verwendeten Substanzen

Substanz Stammlösung Endkonzentration

im Organbad

Hersteller

NaCl 1 mol/l Aqua dest. 1/2/3/4/5/6/9 mmol/l Art. Nr. 1.06404.1000,

Merck, Darmstadt

KCl 1 mol/l Aqua dest. 1/3/4/5/6/7/10

mmol/l

Art. Nr. 1.04936.0500,

Merck, Darmstadt

Insulin 7/40 U/l Aqua dest. 7/21/40/80/120/200

mU/l

Art. Nr. I5500-250 MG,

Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Ouabain 0,001 mol/l Aqua

dest.

0,001 mmol/l Art. Nr. 0-3125, Sigma, St.

Louis, USA

Glybenclamid 0,05 mol/l Aqua

dest.

0,05 mmol/l Art. Nr. 233-570-6, Sigma,

St. Louis, USA

Bariumchlorid-

Dihydrat

3 mol/ l Aqua dest. 3 mmol/l Art. Nr. 1719, Merck,

Darmstadt

10.3.2 In-vivo-Versuch

- Venenverweilkatheter (1,1 x 1,7 mm, Länge 45 cm, Cavafix Certo, Braun,

Melsungen) Heidelberger Verlängerung (140 cm, Art. Nr. 97583, WDT,

Hannover)

- Dreiwegehahn (Art. Nr. 96819, WDT, Hannover)

- Insulininfusionspumpe (InfusomatfmS, Braun, Melsingen)

- Glukoseinfusion (G40 % ad us. vet., Braun, Melsungen)

- physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9 %, Braun, Tuttlingen)

- Insulinpulver (Insulin from bovine pancreas, I5500-250 MG; Sigma-Aldrich,

Taufheim)

- 143,88 g CrCl3 * 6H2O (Merck-Artikel-Nr.: 2487/250 g)

174 Anhang

- 201 g Na2-EDTA * 2H2O (Merck-Artikel-Nr.: 8421/1 kg)

- 5,88 g CaCl2 * 2H2O (Merck-Artikel-Nr.: 2381/250 g)

- 1 n NaOH (Merck-Artikel-Nr.: 6498)

- Tischzentrifuge (Labofuge 200, Heraeus Sepatech)

- Eppendorfgefäße (1 ml; Eppendorf, Hamburg)

- Blutzuckermessgerät (SensoCard, Art. Nr. 0197, WDT, Hannover)

- Messstreifen zur Blutzuckermessung

- Procain-Penicillin (30.000 I.E./kg; Art. Nr. 21762, WDT, Hannover)

- Zentrifuge (Sorvall RC-5C und Sorvall RC-5B, Du Pont, Willington)

- einen für bovines Insulin spezifischen ELISA (Mercodia Bovine Insulin ELISA,

Mercodia AB, Uppsala)

- 614 Na+/K+-Analyser (CIBA-CORNING)

- Atomabsorptionsspektrometer (UNICAM 969)

Danksagung 175

11 Danksagung

Frau PD Dr. Sabine Leonhard-Marek, Physiologisches Institut der Tierärztlichen

Hochschule Hannover, danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die

jederzeit gebotene freundliche Betreuung und Unterstützung sowie die kritische

Durchsicht meiner Dissertation.

Der Schaumann-Stiftung und der DFG danke ich für die großzügige finanzielle

Unterstützung.

Den wunderbaren Mitarbeiterinnen aus den verschiedenen Laboren (insbesondere

Marion Loh, Marion Burmester und Susanne Hoppe) danke ich für ihre Ideen und

ihre Hilfe bei anfallenden Reparaturen, beim Anrühren bunter Lösungen, beim

Finden verloren geglaubter Sachen und bei der Überwindung unlösbarer

Herausforderungen. Ihr hattet es wirklich nicht immer leicht.

Den Mitarbeitern der FAL Braunschweig (insbesondere Herrn Dr. Lebzien, Herrn

Badke und Herrn Mundstock) danke ich für ihre ausgesprochen freundliche und

hilfreiche Unterstützung bei meinen Versuchen.

Herrn Dr. Martin Beyerbach aus dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und

Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover danke ich für die

biometrische Beratung im Rahmen meiner Dissertation.

Herrn Prof. Dr. Kamphues und Frau Meyer danke ich für die Bestimmung der

Chromkonzentration und die Futtermittelanalyse.

Herrn Prof. Dr. Markus Pröpsting und seiner tollen Arbeitsgruppe danke ich für die

großartige Hilfe beim Messen der Insulinproben. Ihr Engagement hat mich nachhaltig

beeindruckt.

176 Danksagung

Herrn Prof. Dr. Jürgen Rehage und Marian Kusenda danke ich für ihre

Hilfsbereitschaft bei der Planung des In-vivo-Versuchs, der ohne ihre Kenntnisse und

Tipps sicher nicht so reibungslos abgelaufen wäre.

Herrn Dr. Martin Höltershinken und seinen Mitarbeitern danke ich für die Bestimmung

der Kaliumblutwerte und die Beratung hinsichtlich des Umgangs mit nicht

funktionierenden Kaliumelektroden.

Ein riesig großer Dank gilt natürlich auch den einzigartigen Mitstreitern:

Meike und Manu: Ihr habt mir in Leipzig das Leben gerettet

Margit: BS bleibt unvergessen, auch wenn Du noch immer auf versprochene

Ergebnisse wartest

Nina, Katha, Diana und die Schmuddelkinder: das lustigste Büro der Welt, das noch

immer keinen Anrufbeantworter für die Betriebsferien hat

Susi, Melanie und Jenny: die lustigsten Bürobesucher der Welt

1000 Dank auch an Sophie, Yasmin und Jan, die mir im ganzen letzten Jahr immer

wieder Unterschlupf, Verpflegung und Bespaßung boten – was hätte ich nur ohne

Euch gemacht?

Meinem wunderbaren Mann Nils und dem Rest unser kleinen Familie danke ich für

all das tägliche Chaos, ohne das mein Leben so langweilig wäre. Ich bin froh, dass

ich Euch habe.