Tierversuche und Tierschutz Invertebrate Versuchstiere: 1 ... ?· Daphnia magna als Modellorganismus…

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  • Invertebrate Versuchstiere: 1. Rahmenbedingungen und Akklimation

    2. Betäubung und Tötung Bettina Zeis, Benedikt Fels, Verena Blome

    Institut für Zoophysiologie Westfälische Wilhelms-Universität Münster

    NADH

    ATP

    Tierversuche und Tierschutz

  • Beispiele für Tierversuche

    - Grundlagenforschung: Physiologie des Geruchssinnes

    - Pharmakologie: Wirkung eines potentiellen Medikamentes

    - Toxikologie: Überprüfung der Schadwirkung einer Substanz

    - Biomonitoring: Gewässerüberwachung, Indikatororganismen

    Vorteile des Einsatzes von Invertebraten:

    - hohe Individuenzahlen (Statistik)

    - kurze Generationsdauer / schnelle Entwicklung

    - nur anzeigepflichtig nach Tierschutzgesetz

  • Daphnia magna als Modellorganismus

    - hohe Individuenzahlen (Statistik)

    - kurze Generationsdauer / schnelle Entwicklung

    - nur anzeigepflichtig nach Tierschutzgesetz

    - Transparenz: nicht-invasiven Untersuchungen leicht zugänglich

    -Wichtige Position im Nahrungsnetz / hohe ökologische Bedeutung

  • Einsatz von Daphnia magna:

    - Grundlagenforschung (Hypoxiebedingte Hämoglobininduktion)

    - Pharmakologie (Test von Herz-Kreislauf-Medikamenten)

    - Toxikologie (Test von Waschmittelinhaltsstoffen)

    - Biomonitoring (Gewässerüberwachung)

  • dynamischer Daphnientest nach Knie

    Der dynamische Daphnientest nach Knie (1986, DIN 38412 L11 und L30)

    Bundesanstalt für Gewässerkunde

  • Gewässerüberwachungsstationen in NRW

  • Zeit [sec]

    E xt

    in kt

    io n

    0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

    0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

    Bewegungsindex: 23,197

    Bewegungsindex: 1,686

    Ex tin

    kt io

    n

    0 200 400 600

    Einfluss eines Toxins

  • Elementare Voraussetzungen für aussagekräftige Tierversuchsergebnisse:

    - optimale Rahmenbedingungen:

    - geeignete Kontrollversuche!

    - mehrmalige Wiederholung

    Einflüsse anderer Faktoren müssen auszuschließen sein

    Eindeutige Ursache-Wirkungs-Beziehung

  • 1. Akklimation/ Rahmenbedingungen

    Faktoren, die Versuchsergebnisse beeinflussen können:

    -Stress durch äußere Reize: Temperatur, Lichtverhältnisse, Geräusche

    mechanische Einflüsse (Versuchstierhandhabung, Injektion)

    - Alter der Tiere / Entwicklungszustand, Geschlecht

    - Ernährungsbedingungen

    - Krankheiten, Parasitenbefall

    - Biorhythmus (Tageszeit, Jahreszeit)

    - Sozialverhalten der Tiere Optimal

  • Das Toleranzfenster

    Optimum

    PessimumPessimum

    Pejus Pejus

    Temperatur Schwerdtfeger, 1977, Ökologie der Tiere, Parey

    Pörtner, 2002, Comp Biochem Physiol A 132:739

    Physiologische Fitness

  • time [min] 0 5 10 15 20

    E

    0,00

    0,25

    0,50

    0,75

    time [min] 0 5 10 15 20

    E

    0,00

    0,25

    0,50

    0,75

    acclimation temperature 20°C, measuring temperature 20 °C - activity index 0.10

    acclimation temperature 20°C, measuring temperature 10 °C - activity index 0.06

    Einfluss der Temperaturakklimation auf die Schwimmaktivität von Daphnia magna

  • measuring temperature [°C]

    0 10 20 30 40

    sw im

    m in

    g ac

    tiv ity

    in de

    x

    0,00

    0,05

    0,10

    0,15

    0,20 10 °C acclimation 20 °C acclimation 30 °C acclimation

    Schwimmaktivität als Funktion der Temperatur

  • temperature [°C]

    0 10 20 30 40

    th or

    ai c

    lim b

    m ov

    em en

    ts [m

    in -1

    ]

    0

    100

    200

    300

    400

    500

    600

    700

    temperature [°C]

    0 10 20 30 40 he

    ar t b

    ea tin

    g ra

    te [m

    in -1

    ] 0

    100

    200

    300

    400

    500

    600

    Einfluss der Temperaturakklimation

    Ventilation Perfusion

    (Atmung) (Herztätigkeit)

    Lamkemeyer et al (2003) Can J Zool 81:237-249

    10 °C akklimiert

    20 °C akklimiert

    30 °C akklimiert

  • measuring temperature [°C] 0 10 20 30 40

    0

    3

    6

    9

    12

    15

    L- la

    ct at

    e [µ

    m ol

    g -1

    F W

    h -1

    ]

    Temperatur, Sauerstoff und anaerober Stoffwechsel

  • wavelength [nm]

    200 400 600 800 1000

    sw im

    m in

    g ac

    tiv ity

    in de

    x

    0,00

    0,04

    0,08

    0,12

    0,16

    UV-Licht als Stressfaktor

  • Einfluss von Nahrung auf physiologische

    Parameter

    Pirow & Buchen, 2004

  • Einfluss des Sozialverhaltens auf das Versuchsergebnis

    time [min]

    0 50 100 150 200 250 300

    Po 2 [

    kP a]

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    0 50 100 150 200 250 300

    Präferenzverhalten von Daphnia magna im Sauerstoffgradienten nach O2-Akklimierung

    Akklimatisation bei Hyperoxie

    Akklimatisation bei Hypoxie

  • Rahmenbedingungen

    - Hälterung der Tiere unter Versuchsbedingungen

    - Einsatz von gesunden Tieren gleichen Alters

    - Akklimationsphase vor Versuchsbeginn (Gewöhnung an den Messplatz)

    - Konstanz aller Versuchsbedingungen (Festlegung, Kontrolle und Dokumentation)

    - Kontrollversuch unter gleichen Bedingungen

  • Beispiel 1

    Bei 10 Individuen der Art Daphnia magna wurde die Herzfrequenz gemessen. Dann wurde ihnen 10 µl Substanz X injiziert. Die erneute Messung der Herzfrequenz ergab einen um 18 ± 7 % verminderten Wert.

    Rahmenbedingungen?

    Kontrollversuch?

  • Beispiel 2 Ca. 100 Tiere der Art Caenorhabditis elegans wurden mit Bakterien gefüttert, die doppelsträngige RNA des Gens XY herstellen. Vier Tage später wurden 20 Tiere vermessen. Diese waren durchschnittlich 0,8 mm lang. Die Kulturplatte wies ca. 350 Eier und 120 Jungtiere des Larvenstadiums L1 auf.

    Rahmenbedingungen?

    Kontrollansatz?

  • Betäubung / Narkose: reaktionsloser Zustand

    1. Unempfindlichkeit gegenüber äußeren Reizen und Schmerzen das Tier leidet nicht (Tierschutzaspekt)

    2. Relaxation der peripheren Muskeln erleichtert die Präparation bzw. den Versuch

    2. Betäubung

    a. Reversibel

    b. Vorbereitung zum Töten

  • Betäubungsmittel 1. Kälte

    2. Kohlendioxid/Kohlensäure

    3. Magnesiumchlorid

    4. Alkohol (Ethanol)

    5. Ether (Essigsäureethylether)

    6. Chloroform (Trichlorkohlenstoff)

    7. Chloralhydrat

    8. Urethan (Ethylcarbamat)

    9. MS 222 (Sandoz, ein m-Aminobenzoesäureethylester)

  • Weitere Betäubungsmittel:

    - Alkaloide (Cocain u. verwandte Substanzen)

    - Barbiturate (u. verwandte Substanzen)

    Beachtung des Betäubungsmittelrechts:

    Anzeige/Genehmigung/Dokumentation

  • Narkosewirkung Faktoren, die Eintritt, Stärke und

    Dauer einer Narkose beeinflussen:

    - Alter

    - Ernährungszustand

    - Erregungszustand

    - Umgebungstemperatur

    - Konzentration des Narkotikums

  • Dosiseffekte

    Geringe Konzentration: anregende Wirkung, Rauschzustand

    starke Muskelkontraktion, beschleunigter Herzschlag

    Mittlere Konzentration: reversible Betäubung, Toleranzzustand

    (optimale Konz.) erschlaffte periphere Muskulatur, ruhige Herz- und Atemfrequenz

    Hohe Konzentration: Tod des Tieres

    (letale Dosis) Lähmung der Atemmuskulatur und des Herzens

  • Applikation

    Aquatische Tiere: Zusatz ins Wasser

    Terrestrische Tiere: Inhalation (flüchtige Narkotika)

    Injektion

    Dosis und Einwirkzeit beachten, ggf. in Vorversuchen experimentell optimieren

    Überprüfung der Narkosewirkung (z.B. mechanische Reizung mit Präpariernadel)

  • Beispiele

    CO2-Zusatz Wärmestarre

    Aschelminthes

    10 %iger Alkohol 7 %iges Magnesiumchlorid Urethan 1 % MS-222 (1 : 100 bis 1 : 10000)

    Plathelminthes

    5-10 %iger Alkohol 7 %iges Magnesiumchlorid Kohlendioxid-Wasser

    Coelenterata

    Urethan 1 %Porifera

    Urethan 1 %Protozoa

    BetäubungsmethodenTierstamm

    Quelle: Adam H & Czihak G (1964): Arbeitsmethoden der makroskopischen und mikroskopischen Anatomie. Fischer Verlag, Jena

  • Methyl- oder Äthylakohol 7 %iges Magnesiumchlorid

    Bryozoa

    Magnesiumchlorid 5-10 %iger Alkohol Chloralhydrat

    Mollusca

    Kohlensäure Äther, Chloroform

    Insecta

    5-10 %iger Alkohol 7 %iges Magnesiumchlorid Urethan 1 % MS-222 (1:1000 bis 1 : 5000)

    Crustacea

    Injektion Alkohol, Äther, Chloralhydrat 7 %iges Magnesiumchlorid MS-222 (1:100 bis 1 : 10000) Urethan 1 %

    Annelida

    BetäubungsmethodenTierstamm

    Quelle: Adam H & Czihak G (