Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen ... · Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. W. Solbach

______________________________________________________

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

- Aus der Sektion Medizin -

vorgelegt von

Clarissa Bahr

aus München

Lübeck 2015

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Johannes Knobloch

2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Sebastian Schmid

Tag der mündlichen Prüfung: 19.1.2016

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 19.1.2016

- Promotionskommission der Sektion Medizin -

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Inhaltsverzeichnis

I

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS ................................................................................................. I

TABELLENVERZEICHNIS .......................................................................................... IV

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................... VI

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS UND DEFINITIONEN .............................................. VII

1 EINLEITUNG ............................................................................................................1

1.1 Zusammensetzung der kommensalen Hautflora....................................................1

1.2 Staphylokokken-Taxonomie ................................................................................2

1.3 Koagulase-negative Staphylokokken ....................................................................3

1.3.1 Klinische Bedeutung der KNS und S. epidermidis.........................................3

1.3.2 Molekulare Mechanismen der Biofilmbildung durch KNS ............................7

1.3.3 Molekulare Mechanismen der Oxacillinresistenz bei KNS .......................... 11

1.3.4 Abgrenzende Betrachtung von S. haemolyticus ........................................... 12

1.4 Diversität der Spezies S. epidermidis mittels MLST-Typisierung ....................... 13

1.5 Fragestellung ..................................................................................................... 15

2 MATERIAL UND METHODEN.............................................................................. 16

2.1 Material ............................................................................................................. 16

2.1.1 Chemikalien................................................................................................ 16

2.1.2 Nährmedien ................................................................................................ 17

2.1.3 Puffer und Lösungen ................................................................................... 17

2.1.4 Einwegartikel und Hilfsmittel ..................................................................... 18

2.1.5 Geräte ......................................................................................................... 19

2.1.6 Organismen ................................................................................................ 20

2.1.7 PCR und Gelelektrophorese ........................................................................ 20

2.1.8 Primer ......................................................................................................... 20

2.1.9 Datenbanken und Programme ..................................................................... 21

2.2 Methoden ........................................................................................................... 22

2.2.1 Struktur der Untersuchungsgruppe und Vergleichsgruppe ........................... 22

2.2.2 Probengewinnung ....................................................................................... 22

2.2.3 Kultivierung der Mikroorganismen auf Blutagar und TS-Agar .................... 23

2.2.4 Identifikation der Einzelkolonien mittels MALDI-TOF ............................... 23

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Inhaltsverzeichnis

II

2.2.5 Auswahlverfahren zur Phänotypisierung und Erstellung von Vorkulturen ... 24

2.2.6 Screening der Proteaseaktivität und Oxacillinresistenz ................................ 25

2.2.7 Screening und Bestätigung der Biofilmbildung ........................................... 25

2.2.8 Einfrieren und Auftauen der 96-Deepwell-Platte ......................................... 27

2.2.9 DNA-Isolation ............................................................................................ 27

2.2.10 Polymerasekettenreaktion ........................................................................... 28

2.2.11 Gelelektrophorese ....................................................................................... 29

2.2.12 Sanger-Sequenzierung ................................................................................ 30

2.2.13 Statistische Auswertung .............................................................................. 30

3 ERGEBNISSE .......................................................................................................... 32

3.1 Epidemiologie der Staphylococcus spp............................................................... 32

3.2 Vielfalt der Staphylococcus spp. ........................................................................ 35

3.3 Prävalenz der phänotypischen Oxacillinresistenz der Staphylococcus spp. ......... 37

3.4 Prävalenz der Biofilmbildung von S. epidermidis ............................................... 39

3.5 Molekulargenetische Untersuchung mittels MLST ............................................. 40

3.5.1 Pärchenanalyse der mecA-positiven Isolate von S. epidermidis .................... 40

3.5.2 Untersuchung der Verwandtschaftsgrade der detektierten Sequenztypen ..... 42

4 DISKUSSION .......................................................................................................... 45

5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................... 56

6 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................... 57

ANHANG ........................................................................................................................ 67

I Epidemiologie der Nicht-Staphylokokken .................................................................. 67

II Staphylokokken-Vielfalt ........................................................................................... 70

III Oxacillinresistenz .................................................................................................... 76

IV Biofilmbildung ........................................................................................................ 79

V Phänotypdifferenzierung ........................................................................................... 80

DANKSAGUNG ............................................................................................................. 85

LEBENSLAUF ................................................................................................................ 86

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Tabellenverzeichnis

IV

TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 1: Verwendete Chemikalien ................................................................................. 16

Tabelle 2: Verwendete Nährmedien und ihre Zusammensetzung ...................................... 17

Tabelle 3: Verwendete Puffer und Lösungen und ihre Zusammensetzung ........................ 17

Tabelle 4: Verwendete Einwegartikel und Hilfsmittel ...................................................... 18

Tabelle 5: Verwendete Geräte .......................................................................................... 19

Tabelle 6: Verwendete Organismen.................................................................................. 20

Tabelle 7: Verwendete Substanzen für die Polymerase-Ketten-Reaktion und

Gelelektrophorese ............................................................................................ 20

Tabelle 8: Verwendete Primer .......................................................................................... 20

Tabelle 9: Verwendete Datenbanken und Programme ...................................................... 21

Tabelle 10: Zusammensetzung des Mastermixes für eine DNA-PCR ................................ 28

Tabelle 11: Phasen der PCR für mecA .............................................................................. 28

Tabelle 12: Phasen der PCR für icaA ............................................................................... 29

Tabelle 13: Phasen der PCR für MLST ............................................................................ 29

Tabelle 14: Pärchenanalyse der Isolate von S. epidermidis mittels MLST ......................... 42

Tabelle 15: Epidemiologie der Nicht-Staphylokokken zum Zeitpunkt t1 .......................... 67

Tabelle 16: Epidemiologie der Nicht-Staphylokokken zum Zeitpunkt t2+3 ...................... 68

Tabelle 17: Epidemiologie der Nicht-Staphylokokken in der Vergleichsgruppe................ 69

Tabelle 18: Staphylokokken-Vielfalt zum Zeitpunkt t1 .................................................... 70

Tabelle 19: Staphylokokken-Vielfalt zum Zeitpunkt t2+3 ................................................ 71

Tabelle 20: Staphylokokken-Vielfalt in der Vergleichsgruppe .......................................... 72

Tabelle 21: Vorkommen der Staphylokokkenspezies in Bezug auf die Probandinnen

zum Zeitpunkt t1............................................................................................ 73


zum Zeitpunkt t2+3 ....................................................................................... 74

Tabelle 23: Vorkommen der Staphylokokkenspezies in Bezug auf die Probandinnen der

Vergleichsgruppe ........................................................................................... 75

Tabelle 24: Phänotypische Oxacillinresistenz der Isolate von S. epidermidis zum

Zeitpunkt t1 und t2+3 ..................................................................................... 76

Tabelle 25: Phänotypische Oxacillinresistenz der Isolate von S. haemolyticus zum

Zeitpunkt t1 und t2+3 .................................................................................... 77

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Tabellenverzeichnis

V

Tabelle 26: Phänotypische Oxacillinresistenz der Staphylokokken Isolate unter

Ausschluss von S. epidermidis und S. haemolyticus zum Zeitpunkt t1 und

t2+3 ................................................................................................................ 78

Tabelle 27: Anzahl der biofilmbildenden und nicht-biofilmbildenden Isolate von

S. epidermidis in der Untersuchungsgruppe.................................................... 79


S. epidermidis in der Vergleichsgruppe .......................................................... 79

Tabelle 29: Relative Anteile der Oxacillin-resistenten Isolate von S. epidermidis ............. 80

Tabelle 30: Phänotpyische Differenzierung der Oxacillin-resistenten Isolate von

S. epidermidis ................................................................................................ 81

Tabelle 31: Sequenztypen und Identifikation des icaA-Genortes der phänotypischen

Pärchen von S. epidermidis ............................................................................ 84

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Abbildungsverzeichnis

VI

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 1: Fraktionen der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t1 ............................ 33

Abbildung 2: Fraktionen der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t2+3 ........................ 33

Abbildung 3: Fraktionen der Staphylokokkenspezies in der Vergleichsgruppe ................. 34

Abbildung 4: Anzahl der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t1 ................................. 36

Abbildung 5: Anzahl der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t2+3 ............................. 36

Abbildung 6: Anzahl der Staphylokokkenspezies der Vergleichsgruppe ........................... 37

Abbildung 7: Oxacillinresistenz der Isolate von S. epidermidis zum Zeitpunkt t1 und

t2+3 ............................................................................................................. 38

Abbildung 8: Oxacillinresistenz der Isolate von S. haemolyticus zum Zeitpunkt t1 und

t2+3 ............................................................................................................. 38

Abbildung 9: Oxacillinresistenz der Staphylococcus spp. unter Ausschluss von

S. epidermidis und S. haemolyticus zum Zeitpunkt t1 und t2+3 .................... 39

Abbildung 10: Phänotypische Ausprägung der Biofilmbildung der Isolate von

S. epidermidis .............................................................................................. 40

Abbildung 11: Anwendung des eBURST-Algorithmus. .................................................... 44

Abbildung 12: Darstellung der phänotypischen Charakterisierung Oxacillin-resistenter

Isolate von S. epidermidis. ........................................................................... 83

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Abkürzungsverzeichnis und Definitionen

VII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS UND DEFINITIONEN

agr accessory gene regulator

AtlE Autolysin E

Bap /Bhp Biofilm-associated protein

CA community acquired

CC Clonal complex

DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTPs desoxy-Nukleosidtriphosphate

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

et al. et alii

EtOH Ethanol

ica intercellular adhesion gene cluster

KNS Koagulase-negative Staphylokokken

MALDI-

TOF-MS

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass

spectrometry

MIC minimal inhibitory concentration

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

MLST Multi Locus Sequence Typing

MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus

MRSE Methicillin-resistenter Staphylococcus epidermidis

MSCRAMM microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules

N.D. Nicht eindeutig definierte Spezies

NICU Neonatal intensive care unit

OD optische Dichte

PBP Penicillin-bindendes Protein

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR Polymerase Chain Reaction

PFGE Pulsfeldgelelektrophorese

PIA Polysaccharide intercellular adhesin

PNAG poly-ß-(1→6)-N-acetylglucosamin

PS/A Capsular polysaccharide adhesin

PSM phenol-soluble modulin

SCCmec Staphylococcus cassette chromosome mec

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Abkürzungsverzeichnis und Definitionen

VIII

Sdr Serine-aspartate repeat

SLV Single locus variant

Ssp Staphylococcal surface protein

ST Sequenztyp

t1 Abstrichzeitpunkt vor dem Dienst bei der Untersuchungsgruppe bzw.

einmaliger Abstrichzeitpunkt in der Vergleichsgruppe

t2+3 Zusammengefasste Zeitpunkte (und damit Untersuchungsmaterial) der

beiden Dienstabstriche der Untersuchungsgruppe

TBE Tris-Borsäure-EDTA

TFA Trifluoressigsäure

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

TSB Tryptic Soy Broth

TSBEtOH TSB versetzt mit 3% Ethanol

upm Umdrehungen pro Minute

(vol/vol) volume per volume

(w/v) weight per volume

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Einleitung

1

1 EINLEITUNG

1.1 Zusammensetzung der kommensalen Hautflora

Die bakteriellen Spezies Acinetobacter spp., Corynebacterium spp., Enterobacter spp.,

Klebsiella spp., Micrococcus spp., Propionibacterium spp., Proteus spp.,

Pseudomonas spp., Staphylococcus spp. sowie die Pilze Pityrosporum bzw. Malassezia

werden als Bestandteile der allgemeinen menschlichen Mikroflora angesehen (Madigan

und Martinko, 2006).

Die konkrete Zusammensetzung der Flora zeigt sich in Untersuchungen als abhängig von

der untersuchten Körperregion und unterscheidet sich zwischen verschiedenen Menschen

in hohem Maße, wobei sie individuell über die Zeit relativ konstant bleibt. Interindividuell

vergleichbar ist jedoch die hohe Diversität der Organismen unter anderem der Handflächen

und Zeigefinger. (Costello et al., 2009)

Die Mikroorganismen der Hautflora werden in transiente und residente Populationen

unterteilt. Die Weltgesundheitsorganisation definiert die residente Flora als

Mikroorganismen, welche unter den oberflächlichen Zellen des Stratum corneum der Haut

hausen und ebenso auf der Oberfläche der Haut gefunden werden können. Die transiente

Flora umfasst Mikroorganismen, welche die oberflächlichen Schichten der Haut

kolonisieren und zugänglicher für die Abtragung durch Handwäsche sind. (World Health

Organization, 2009)

Transiente Mikroorganismen können in dem definierten Habitat der Haut nicht langfristig

überleben und sich dort nicht regelhaft vermehren - im Unterschied zu residenten

Mikroorganismen. Diese können nicht nur in diesem Milieu überleben, sondern sich dort

auch regelhaft vermehren. Die residente Flora zeichnet sich deshalb durch eine hohe

Konstanz der Population aus. Eine Zunahme der Hauttemperatur und Hautfeuchtigkeit

sowie eine reduzierte Elimination durch Hygienemaßnahmen begünstigen eine ansteigende

Populationsdichte der Flora. (Madigan und Martinko, 2006)

Die residente Flora lebt als einheimische Flora in den Öffnungen von Haarfollikeln und

Talgdrüsen und der Tiefe der Hautspalten, sodass ein gewisser Anteil weder durch

Abstriche erfasst, noch durch Desinfektionsmittel erreicht werden kann. Das Vorkommen

und die Verteilung der Bakterien der residenten Flora wird beeinflusst durch das Alter der

Person, der lokalen Hautbeschaffenheit, dem gesundheitlichen Zustand,

Medikamentenkontakt, Hautfeuchtigkeit und Temperatur. (Reybrouck, 1983) Außerdem


2

wird die Vielfalt der Handflora im Generellen durch das Geschlecht und die Größe der

Zeitspanne seit der letzten Handwäsche geprägt (Fierer et al., 2008).

Die transiente Flora gelangt durch Übertragung von der Umwelt auf die Haut. Sie

unterscheidet sich interindividuell in hohem Maße bezüglich Anzahl und

Zusammensetzung der Organismen, abhängig vom Ausmaß des Kontaktes mit der Umwelt

(Reybrouck, 1983). Entsprechend sind jedoch auch Gemeinsamkeiten in geteilten

Lebensräumen vorstellbar.

Neben der Beseitigung durch mechanische Maßnahmen wie Handwäsche und chemische

Mittel, wie bei der Händedesinfektion, wird die Überlebensrate der transienten

Mikroorganismen durch die selbstreinigenden Mechanismen des Ökosystems auf der Haut

begrenzt. Eine Kolonisierung der Haut durch diese Bakterien kann jedoch unter

veränderten Voraussetzungen, wie Hautschäden oder starker Feuchtigkeit, begünstigt

werden. (Reybrouck, 1983) In einer Untersuchung der Handflora von Pflegepersonal zeigte

sich konkret, dass die Verwendung von Seife mit Hautschäden verbunden sein kann und

diese eine Fehlbesiedlung der Hände mit nosokomialen Antibiotika-resistenten

Mikroorganismen begünstigt, hierbei wurde jedoch nicht zwischen transienten und

residenten Kolonisationsformen unterschieden (Cook et al., 2007).

Herausforderungen, im Besonderen für transiente Mikroorganismen, sind der geringe

Feuchtigkeitsgehalt der Haut und der schwach saure pH-Wert von vier bis sechs, welcher

durch die organischen Säuren der menschlichen Sekrete aufrechterhalten wird (Madigan

und Martinko, 2006). Im Rahmen der Mechanismen der körpereigenen unspezifischen

Immunabwehr spielen Defensine mit ihrer hochgradigen Diversität aus der Gruppe der

antimikrobiellen Peptide eine bedeutsame Rolle in der Elimination gramnegativer und auch

grampositiver Bakterien (Lehrer und Lu, 2012; Zhao und Lu, 2014).

Eine strikte Trennung zwischen transienter und residenter Hautflora ist jedoch aufgrund

fließender Übergänge und des ständigen Austausches mit der Umwelt nur artifiziell

möglich (Reybrouck, 1983). Die Detektionshäufigkeit kann einen Hinweis auf die

Regelmäßigkeit der Besiedlung der Haut durch bestimmte Spezies geben (Kloos und

Musselwhite, 1975).

1.2 Staphylokokken-Taxonomie

Die Familie der Staphylococcaceae umfasst nach derzeitiger Kenntnis 6 Gattungen:

Staphylococcus (Vos et al., 2009), Gemella (incertae sedis) (Vos et al., 2009),


3

Nosocomiicoccus (Alves et al., 2008), Jeotgalicoccus (Yoon et al., 2003), Macrococcus

(Kloos et al., 1998) und Salinicoccus (Aslam et al., 2007).

Zum Zeitpunkt des Entstehens dieser Arbeit wurden 79 Spezies und Subspezies dem

Genus Staphylococcus zugeordnet. Dies konnte der Datenbank „Bacterial Nomenclature

Up-to-Date“ des Leibniz-Instituts DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

und Zellkulturen GmbH – entnommen werden. (www.dsmz.de, Zugriff am 13.06.2015)

Bei den bakteriellen Mikroorganismen der Gattung Staphylococcus handelt es sich um

grampositive, fakultativ anaerobe, unbewegliche, nichtsporenbildende, 0,8-1,0 µm große,

meist pigmentierte Haufenkokken, welche auch trockenes Milieu und hohen Salzgehalt

relativ gut tolerieren. Allen Staphylokokken gemein ist die Katalase, welche

Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff spaltet. Dies ist vor allem diagnostisch

relevant, da der Katalasetest eine Abgrenzung gegenüber weiteren Gattungen

grampositiver Kokken wie z. B. Streptococcus ermöglicht. (Madigan und Martinko, 2006)

Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) unterscheiden sich von der koagulasepositiven

Spezies S. aureus durch das Fehlen des freien Enzyms Koagulase (Rogers et al., 2009),

welches das Fibrinogen des Blutes aktiviert und dadurch die Gerinnung auslöst.

Fibrinfasern lagern sich um die Kokken und schützen sie vor der Phagozytose durch die

Abwehrzellen des Wirtes. (Madigan und Martinko, 2006)

Die in dieser Dissertation vorrangig untersuchte Spezies S. epidermidis ist den KNS

zuzuordnen, ebenso alle weiteren genannten Staphylococcus species mit Ausnahme der

erwähnten Spezies S. aureus.

1.3 Koagulase-negative Staphylokokken

1.3.1 Klinische Bedeutung der KNS und S. epidermidis

KNS wurden lange Zeit lediglich als Kommensale der humanen Hautflora betrachtet und

ihre wachsende pathogenetische Bedeutung unterschätzt, zumal eine Unterscheidung zu

Kontaminationen diagnostischer Nährmedien durch ihr weit verbreitetes Vorkommen

erschwert sein kann (Huebner und Goldmann, 1999). Bei positivem Nachweis in einer

Blutkultur können evaluierte klinische Parameter einer Infektion zur Einschätzung der

tatsächlichen Wahrscheinlichkeit einer zugrunde liegenden Infektion herangezogen werden

(Bates et al., 1990; Bates und Lee, 1992). Zwischenzeitlich konnten KNS mit 36% als


4

Hauptverursacher von Septitiden auf Intensivstationen in den U.S.A. ausgemacht werden

(Richards et al., 1999).

Die Inzidenz primärer Bakteriämien durch grampositive Bakterien, so auch durch KNS

und im Besonderen durch S. epidermidis, stieg mittlerweile signifikant an (Goldmann und

Pier, 1993). So zeigte sich in dem früheren Zeitraum von 1980 bis 1989 in

Lehrkrankenhäusern der USA ein Inzidenzanstieg der Bakteriämien durch KNS von bis zu

754% (Banerjee et al., 1991). Ursache dieser Entwicklung ist die vermehrte Verwendung

implantierter medizinischer Materialien als geeignetes Habitat dieser Mikroorganismen

(Kozitskaya et al., 2005). So entstehen sogenannte Fremdkörper-assoziierte Infektionen bei

der Verwendung intravaskulärer Kunststoffkatheter (Gaynes et al., 1991; Schaberg et al.,

1991). Pathogenetisch ursächlich ist die spezifische Affinität der Mikroorganismen zu

diesen medizinischen Materialien (Huebner und Goldmann, 1999). Neben der Besiedlung

von beispielsweise Kunststoffkathetern entlang der Einstichstelle sind sekundäre

Besiedlungen von Fremdkörpern über hämatogene Streuung der Mikroorganismen von

einer entfernt lokalisierten Infektion ebenfalls vorstellbar (O’Grady et al., 2002).

Die Unterscheidung zwischen Virulenzfaktoren und für den Menschen ungefährlichen

Eigenschaften im Bezug auf die saprophytische Lebensweise der Staphylokokken wird

jedoch als nicht eindeutig angesehen. Spezifische molekulare Mechanismen, welche der

Gewährleistung der kommensalen Lebensform dienen, können insofern auch die

Grundlage für das Entkommen von der Wirtsimmunabwehr und die Chronifizierung von

Infektionen bilden. Die Expression von Molekülen zur Anhaftung an der Haut, auf welcher

die Organismen mechanischen Kräften ausgesetzt sind, erscheint dabei als durchaus

logischer Mechanismus. (Otto, 2009)

Im Rahmen der Ausbildung eines solchen Biofilms erfolgen eine Umstellung der

bakteriellen Genexpression zur Form eines verringerten Metabolismus und ein Wechsel

von oxidativem zu fermentativem Stoffwechsel. Mit hoher Wahrscheinlichkeit sind diese

Mechanismen auf die verringerten Konzentrationen von Sauerstoff und Nährstoffen in

tieferen Schichten zurückzuführen. Die Verringerung der Wachstumsrate wird als

Grundlage für die herabgesetzte Antibiotika-Empfindlichkeit und Resistenz gegenüber

antibakteriellen Peptiden und Zytokinen der Wirtabwehr angesehen, da die Wirkung

selbiger vor allem in aktiven Zellprozessen angreift. (Yao et al., 2005)

Die bakterielle Polymermatrix erzeugt im theoretischen Modell zudem einen

unterschiedlich ausgeprägten abschwächenden Effekt auf die Durchdringung mittels

antimikrobieller Substanzen. Dabei besteht eine Abhängigkeit von den Stoffeigenschaften


5

des Antibiotikums und dessen Penetration des Biofilms durch Diffusion, Adsorption und

/oder Reaktion (Stewart, 1996). Untersuchungen zeigten, dass die Penetrationsfähigkeit der

Betalaktam- und Glykopeptidantibiotika signifikant reduziert ist, während Aminoglykoside

und Fluorchinolone unbeeinflusst bleiben (Singh et al., 2010).

Studien deuteten geno- und phänotypische Unterschiede zwischen Stämmen von

S. epidermidis, die Polymer-assoziierte Septitiden erzeugen können, und Isolaten von Haut

und Schleimhaut gesunder Probanden an. Der Biofilm-assoziierte Genort ica (intercellular

adhesion gene cluster) wurde bei 85% der Blutkulturen im Vergleich zu 6% der als

Saprophyten eingeschätzten Mikroorganismen nachgewiesen. Der Unterschied zwischen

pathogenen und kommensalen Stämmen bestätigte sich in der quantitativen

Unterscheidung der phänotypisch untersuchten Adhärenz: 87% der Blutkulturisolate

gegenüber 11% der Saprophyten-Stämme hafteten an Kunststoff. (Ziebuhr et al., 1997)

Untersuchungen über die Prävalenz der Biofilmbildung in einem Kollektiv klonal

unabhängiger Stämme von S. epidermidis, assoziiert mit Kunstgelenk-assoziierten

Infektionen, wiesen eine Biofilmbildung in 69,2% dieser Isolate auf (Rohde et al., 2007).

In einer weiteren Studie wurden Isolate von S. epidermidis, welche infolge Katheter-

assoziierter Infektionen detektiert wurden, auf Biofilmbildung und die Ausstattung mit den

Biofilm-assoziierten Genorten icaA und icaD untersucht. Ein Anteil von 49% der Stämme

war für beides positiv (Arciola et al., 2001). Es zeigte sich bereits, dass die Expression des

Biofilm-assoziierten Genortes icaADBC aufgrund des hohen Energieaufwandes bei

Abwesenheit von Selektionsbedigungen einen nachteiligen Effekt auf die Kolonisierung

der menschlichen Haut ausüben könnte und daher vornehmlich im spezifischen

nosokomialem Umfeld von Vorteil zu sein scheint (Rogers et al., 2008). Studien zeigten

eine Steigerung der icaADBC-determinierten PIA-Synthese von S. epidermidis und damit

auch der Biofilmbildung bei Ethanolsupplementation des TSB-Nährmediums. Eine

naheliegende Begründung ist, dass es sich bei Ethanol um einen Stressfaktor für die

Population handelt, welcher Schutzmechanismen wie die Biofilmbildung aktiviert.

(Knobloch et al., 2001) Am ausgeprägtesten ist dieser Effekt bei einer

Ethanolkonzentration von 2% (v/v) im Vergleich zu 5, 10 und 15% (Chaieb et al., 2007).

Die icaA-Genexpression in diesem Zusammenhang geht mit einer verringerten

Transkription des hemmenden Locus icaR einher (Conlon et al., 2002). In der Literatur

wurde bereits die Vermutung geäußert, dass im Bezug auf nosokomiale Infektionen durch

S. epidermidis alkoholbasierte Desinfektionsmittel deshalb problembehaftet sein könnten

(Chaieb et al., 2007). Untersuchungen der Wirkung solcher Händehygienemaßnahmen mit


6

den bakteriziden Substanzen n-Propanol, Isopropanol oder Ethanol bezeugten, dass diese

von der Konzentration des Alkohols und der Einwirkungszeit abhängt. In einem

Konzentrationsbereich von 60-80% zeigen sie letztlich eine gute Wirkung gegen

Bakterien, Mykobakterien, Hefen, Dermatophyten und umhüllte Viren, wobei kein Risiko

für eine sich entwickelnde bakterielle Resistenz besteht. (Kampf und Kramer, 2004)

Es konnte bereits im Vorfeld im Verlaufe von Krankenhausaufenthalten einzelner

Patienten ein Anstieg des Nachweises der biofilmbildenden Spezies verzeichnet werden

(Rupp und Archer, 1992), diese Ergebnisse bewiesen zudem eine Dynamik in der

Kolonisation und in der Abhängigkeit von der Umgebung. Eine positive Korrelation

zwischen Biofilmbildung und Resistenz von S. epidermidis gegenüber dem Antibiotikum

Oxacillin wurde ebenfalls herausgestellt. (Rupp und Archer, 1992)

Andere Ergebnisse zeigten, dass in den U.S.A. 71,5%, in Lateinamerika 68,4% und in

Kanada 65,5% Oxacillin-resistente Organismen (MIC > 0,25µg/ml) innerhalb der

Bakteriämie-assoziierten KNS identifiziert werden konnten. In allen drei Regionen war

S. epidermidis mit einer Resistenzrate von 59,5% in Kanada, 75,3% in den U.S.A und

80,7% in Lateinamerika die häufigste Spezies der KNS. (Pfaller et al., 1999)

Die Fähigkeit zur Biofimbildung und die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Oxacillin

gelten als definitiv bedeutsam zur Erzeugung Fremdkörper-assoziierter Infektionen, da sie

das Überleben der Stämme in der nosokomialen Umgebung gewährleisten (Rohde et al.,

2004).

Im Gegensatz zu der These, dass Infektionen durch Stämme der Hautflora als endogen zu

betrachten sind, konnte die Möglichkeit der Genotypisierung beweisen, dass bestimmte

Klone der KNS über zehn Jahre endemisch auf Stationen wie einer Neugeborenen-

Intensivstation auftreten und nachweislich Bakteriämien erzeugen. Die Übertragung dieser

im Krankenhaus endemischen Stämme auf die Patienten könnte einen kausalen

Zusammenhang für diese Infektionen darstellen (Huebner et al., 1994; Huebner und

Goldmann, 1999)

Im Jahr 2005 konnte mittels genotypisierenden Vergleichs ica-positiver und -negativer

Stämme durch die Methode Multilocus sequence typing (MLST) herausgestellt werden,

dass ein bestimmter Sequenztyp ausschließlich ica-positive Klone von S. epidermidis

beinhaltete. Bei nachgewiesener Kolonisation des Krankenhauspersonals weitreichend in

den deutschen Krankenhäusern verbreitet, könnte dieser für die Mehrzahl der Kunststoff-

assoziierten Infektionen verantwortlich gewesen sein und sich aufgrund seiner


7

vermutlichen Adaptation an das klinische Milieu von den Klonen außerhalb des

Krankenhauses unterscheiden. (Kozitskaya et al., 2005)

So wurde bereits der genetische Zusammenhang gezeigt, dass die Mehrzahl der Stämme

der Spezies S. epidermidis, welche mit Infektionen von Neugeborenen auf Neonatal

intensive care units NICU assoziiert waren, ebenfalls von den Händen des Pflegepersonals

isoliert werden konnte. Die Übertragungsrichtung sei dabei unklar, sie könnte von den

Neugeborenen auf das Personal oder vice versa oder durch eine dritte Quelle auf beide

erfolgen. (Milisavljevic et al., 2005)

Eine Eradikation von S. epidermidis, einem etablierten Bestandteil der Hautflora, könnte

sich als problematisch erweisen. Einerseits würde eine Übertragung der Flora anderer

Menschen rasch zur Rekolonisation führen, andererseits könnten freie Flächen zugunsten

der Besiedlung durch bedrohlichere Organismen auf der Haut entstehen. (Otto, 2009)

Zudem ist durch die Tatsache, dass in Studien pathogene S. epidermidis Stämme nach

Handreinigung als vermeintlich residente Flora identifiziert wurden, zu vermuten, dass die

Eradikation dieser Stämme durch Händehygienemaßnahmen per definitionem

grundsätzlich erschwert ist und zur Infektionsprävention alleine nicht ausreichend ist

(Milisavljevic et al., 2005).

Die Resistenzlevel der Organismen auf den Händen des Pflegepersonals persistierten trotz

der verstärkten Anwendung von Händehygienemaßnahmen in den letzten Jahren (Aiello et

al., 2003). Dies legt zusätzlich nahe, dass derartige Maßnahmen alleine nicht ausreichend

sind, um die Aneignung der resistenten Stämme zu verhindern (Aiello et al., 2003). Zudem

könnte sich das Immunsystem des Menschen im Rahmen der Evolution gegenüber

kolonisierenden Bakterien weniger stark ausgebildet haben. (Otto, 2009)

1.3.2 Molekulare Mechanismen der Biofilmbildung durch KNS

Ein Biofilm wird als eine Bakterienpopulation, die in eine Matrix eingebettet ist, definiert

und ist durch Mechanismen der Zell-Zell-Adhäsion und der Anhaftung an Oberflächen

geprägt (Costerton et al., 1995). Die Biofilmbildung der KNS wurde bisher am

weitreichendsten für S. epidermidis untersucht, der vorrangigen Spezies der KNS im

Bezug auf Infektionen des Menschen (Mack et al., 2006). Es wird vermutet, dass es sich

bei den spezifischen Mechanismen der Biofilmbildung durch die einzelnen

Staphylokokkenspezies der KNS um dieselben grundlegenden Vorhänge handelt (Otto,

2008).


8

Nach einem artifiziellen Modell kann die Entwicklung des bakteriellen Biofilms in vier

Phasen unterteilt werden. Diese umfassen die erste Anlagerung der Zellen, die

mehrschichtige Anreicherung der Bakterien in Form von Mikrokolonien, die

Biofilmreifung und die Lösung der einzelnen Zellen aus dem Biofilm (Costerton et al.,

1999).

1. Anlagerung

Die Hydrophobizität der Zelloberfläche von S. epidermidis wird durch

Zelloberflächenproteine und deren molekularen Reste gewährleistet und vermittelt unter

begrenzten antagonisierenden Scherkräften die unspezifische Anlagerung an hydrophobes

Polyethylen, einem Beispiel fester Oberflächen (Vacheethasanee et al., 1998). Das

Adhäsin und Autolysin AtlE (Heilmann et al., 1997) und das biofilm-associated protein

Bap bzw. Bhp, welches die Fähigkeit zur Bildung eines von icaADBC (siehe unten)

unabhängigen Biofilms verleiht (Tormo et al., 2005), tragen zu den hydrophoben

Eigenschaften bei. (Otto, 2009) Weitere Materialeigenschaften, welche die primäre

Anlagerung von Staphylokokken begünstigen, sind eine geringe Oberflächenspannung und

positive Ladung. (Ludwicka et al., 1984)

Implantierte Fremdkörper werden rasch von humanen Matrixmolekülen beschichtet. Diese

bilden den Angriffspunkt sogenannter MSCRAMMs (Microbial surface components

recognizing adhesive matrix molecules), welche den Überbegriff einer heterogenen Gruppe

mikrobieller Adhäsine (Bowden et al., 2002; Heilmann et al., 2003; Mack et al., 2006)

bilden (Patti et al., 1994). Zum Einen können sie kovalent an die bakterielle Oberfläche

gebunden sein (Mazmanian et al., 1999; Otto, 2009), zum Anderen können sie in nicht-

kovalente Wechselwirkungen mit bakterieller oberflächlicher Lipoteichonsäure treten

(Navarre und Schneewind, 1999; Otto, 2009). Weitere Proteine, welche die Bindung an

Bestandteile der extrazellulären Matrix des Wirts vermitteln, umfassen die Familie der

serine-aspartate repeat (Sdr) Proteine (McCrea et al., 2000; Hartford et al., 2001;

Arrecubieta et al., 2007) und das Fibronectin-bindende Protein Embp (Williams et al.,

2002).

Das Zellwandassoziierte Staphylococcal surface protein Ssp1 ist auf der Zelloberfläche

und fimbrienähnlichen Strukturen lokalisiert und vermittelt ebenfalls die Anlagerung von

S. epidermidis an Kunststoffoberflächen (Timmerman et al., 1991; Veenstra et al., 1996).

Durch dessen Proteolyse entsteht Ssp2, wodurch die adhäsiven Eigenschaften wiederum

verringert werden (Veenstra et al., 1996).


9

Bezüglich des Capsular polysaccharid adhesin PS/A besteht die Diskussion, dass es sich

bei PS/A und PIA (siehe unten) um dieselbe chemische Struktur PNAG poly-ß-(1→6)-N-

acetylglucosamine handelt, mit zweierlei Funktionen: Anlagerung an Oberflächen in der

frühen Phase und nachfolgende Einbettung der Bakterienzellen in einer

Polysaccharidmatrix (Sadovskaya et al., 2005).

2. Bildung mehrschichtiger Mikrokolonien in extrazellulärer Biofilmmatrix

Die Synthese des Exopolysaccharids Polysaccharide intercellular adhesin (PIA), auch

poly-ß-(1→6)-N-acetylglucosamine (PNAG) genannt, ist auf dem intercellular adhesion

(ica) -Gencluster determiniert (Heilmann et al., 1996). Dieses icaADBC Operon dient der

Produktion von IcaA und IcaD, welche ein N-Acetylglucosamin-Oligomer synthetisieren,

welches durch das Protein IcaC verlängert wird (Gerke et al., 1998). Dem zugleich

erfolgenden Export durch IcaC folgt die Deacetylierung einzelner Reste des PIA-

Vorläufermoleküls poly-N-acetylglucosamine durch IcaB auf der äußeren Oberfläche der

Bakterienzelle. (Otto, 2009)

PIA liegt in zweierlei unverzweigten Formen vor. Polysaccharid I repräsentiert einen

Anteil von 80%, Polysaccharid II unter 20%. Letzteres ähnelt Polysaccharid I, ist jedoch in

geringerem Maße deacetyliert und beinhaltet Phosphat und Succinat, welche ihm einen

anionischen Charakter verleihen. Die unverzweigte Form der Polysaccharide könnte

weitreichende Verbindungen zu benachbarten Polysacchariden und Zellwänden

begünstigen. Grundlegende Mechanismen sind van-der-Waals-Kräfte,

Wasserstoffbrückenbindungen und nicht zuletzt elektrostatische Wechselwirkungen der

positiv und negativ geladenen Kettenreste. (Mack et al., 1996)

Die prozessierte Form des PIA zu einem Homopolymer mit ß-(1→6)-gebundenen

N-acetylglucosamine (GlcNAc) –Resten begünstigt durch die kationischen Eigenschaften

nicht nur die Bindung an Oberflächen, zwischen den Zellen und die Anreicherung des

Biofilms per se (Mack et al., 1996), sondern schützt zudem vor Komponenten des

angeborenen Immunsystems des Menschen. Letzteres zeigte sich in einer erhöhten

Eliminationsrate durch humane Leukozyten bei Abwesenheit von PIA sowie einer

erhöhten Empfindlichkeit dieser PIA-negativen Mutanten gegenüber humanen dermalen

antibakteriellen Peptiden (Vuong et al., 2004c).


10

3. Biofilmreifung

Biofilme sind gekennzeichnet durch eine strukurelle Heterogenität und die Fähigkeit zum

internen Gütertransport (Habash und Reid, 1999). Grundlage ist die Bildung pilzartiger

Konglomerate, welche durch flüssigkeitsgefüllte Räume voneinander abgegrenzt werden

(Lawrence et al., 1991). Diese dienen dem Nährstoff- und Sauerstofftransport und der

Aufnahme metabolischer Restsubstanzen (Habash und Reid, 1999). Die Einbettung der

Population in eine Glykokalyx stabilisiert den Biofilm und erschwert die Eradikation durch

Sterilisation (Dunne Jr, 2002).

Ein beeinflussender Mechanismus auf das Verhalten der Mikroorganismen innerhalb einer

biofilmbildenden Gemeinschaft ist die Kommunikation über das quorum sensing (Mack et

al., 2006). Über diese Strategie wird auch die Lösung der Verbindung zu einzelnen Zellen

durch das accessory gene regulator (agr) -quorum-sensing-System gesteuert, welches für

die Regulation des Peptidkomplexes phenol-soluble modulin (PSM) von Bedeutung zu sein

scheint (Vuong et al., 2004a; Otto, 2009). Diesen surfactant-ähnlichen Peptiden, im

Besonderen der Beta-Untergruppe der PSMs, wird eine Schlüsselfunktion in der

Strukturbildung des Biofilms und Ablösung der Zellen zugesprochen (Wang et al., 2011).

4. Ablösung der Zellen

Die Ablösung einzelner Bakterienzellen aus der Gemeinschaft des Biofilms schafft die

Voraussetzung, durch Streuung andernorts Wachstumspopulationen in Form eines

Biofilms beginnen zu können (Yao et al., 2005).

Theoretisch könnten zweierlei Mechanismen der Lösung von Zellen möglich sein (Otto,

2009):

Der enzymatische Abbau der Exopolymere per se wurde bei S. epidermidis noch nicht

nachgewiesen, wenngleich Exoproteasen geringer Substratspezifität Oberflächenproteine

spalten können (Teufel und Götz, 1993; Dubin et al., 2001; Ohara-Nemoto et al., 2002).

Die Trennung von nicht-kovalenten Bindungen wie elektrostatischen und hydrophoben

Wechselwirkungen, sowie eine Senkung der Oberflächenspannung kann durch Moleküle

mit detergenzähnlicher Wirkung erfolgen (Vuong et al., 2004b). Die Substanzklasse des

bakteriell erzeugten amphipathischen phenol-soluble modulins (PSM) wirkt auf diese

Weise (Kong et al., 2006).


11

1.3.3 Molekulare Mechanismen der Oxacillinresistenz bei KNS

Der Begriff und der Mechanismus der Methicillinresistenz schließt die Resistenz gegen

alle Substanzmitglieder der Gruppe der Betalaktamantibiotika ein, einschließlich des in

dieser Arbeit verwendeten Oxacillins. (Kayser et al., 2005) Diese Substanzen hemmen die

Peptidoglykan-Biosynthese der Zellwand, indem sie an die Domäne der Transpeptidase

des Penicillin-bindenden Proteins (PBP) binden. Sie beugen dadurch der Peptidbindung

und indirekt der Initiation der Zellteilung vor. (Giesbrecht et al., 1998)

Die Oxacillinresistenz in Staphylokokken wird durch das mecA-kodierte Penicllin-

bindende Protein PBP2a vermittelt. Dieses ist auf einem mobilen genetischen Element

lokalisiert, welches SCCmec (Staphylococcus cassette chromosome mec) genannt wird.

Das Produkt der Transkription und Translation von mecA weist eine herabgesetzte

Affinität zu Betalaktamantibiotika auf. (Hiramatsu et al., 2001)

Während die nativen PBP eine höhere Enzymaktivität in der Verknüpfung des

Peptidoglykans zeigen, scheint PBP2a eher eine schwache Transpeptidase zu sein, welche

im Wesentlichen durch abnorme Muropeptiddimere zur Zellwandsynthese beiträgt, wenn

die nativen PBP durch die irreversiblen Bindungen an Betalaktamantibiotika gesättigt sind.

(de Jonge und Tomasz, 1993)

Es gibt Grund zu der Annahme, dass die Oxacillinresistenz über den horizontalen Transfer

von mecA bzw. SCCmec zwischen verschiedenen Spezies der Staphylokokken in vivo

übertragen werden kann (Miragaia et al., 2005). In diesem Zusammenhang könnte den

kommensalen KNS eine Reservoirfunktion für Resistenz-determinierende DNA-

Sequenzen zukommen (Archer et al., 1994). Konkret wird mittlerweile eine

Reservoirfunktion von gesellschaftlich verbreiteten, krankenhausunabhängigen

Methicillin-resistenten S. epidermidis (MRSE) mit SCCmec IVa für CA-MRSA diskutiert

(Barbier et al., 2010).

In einem beispielhaften Fall erfolgte die Übertragung der Resistenz-determinierenden

DNA-Sequenz von einem S. epidermidis Stamm auf einen zuvor mecA-negativen Stamm

der Spezies S. aureus. Auf diese Weise könnten oftmals mecA-positive MRSA entstehen

und die Entwicklung von multiresistenten Klonen könnte durch den Selektionsdruck unter

Applikation von Betalaktamantibiotika gefördert werden. (Wielders et al., 2001)

Im Rahmen von Untersuchungen der genotypisierten Sequenztypen nosokomialer Isolate

von S. epidermidis stellte sich heraus, dass verschiedene SCCmec Kassetten bei denselben

Sequenztypen vorlagen. Dies unterstütze die Annahme, dass wiederholte, voneinander


12

unabhängige Übertragungen von SCCmec-DNA in das Genom erfolgen können und zeigte

die Fähigkeit der Staphylokokken an, genetisches Material auszutauschen. (Kozitskaya et

al., 2005; Miragaia et al., 2007)

1.3.4 Abgrenzende Betrachtung von S. haemolyticus

Die Spezies S. haemolyticus ist die am zweithäufigsten isolierte Spezies der KNS, die bei

Patienten mit nosokomialen Infektionen detektiert wird (Sanches et al., 2000; Falcone et

al., 2006).

Biofilmuntersuchungen klinischer Isolate zeigten bei 74% diverser S. haemolyticus-Isolate

eine Biofilmbildung in Kulturmedien mit TSB und Glukose, sodass von davon

ausgegangen wurde, dass die Fähigkeit zur Biofilmbildung bei Stämmen von

S. haemolyticus weit verbreitet ist. Das icaADBC-Operon wurde lediglich in drei von 72

Isolaten nachgewiesen, sodass von einer weitgehend PIA-unabhängigen Biofilmstruktur

ausgegangen werden kann. Die bedeutsame Rolle extrazellulärer DNA in der reifen

Biofilmmatrix von S. haemolyticus ist eine Besonderheit innerhalb der KNS. Die genauen

Bestandteile des Biofilms dieser Spezies sind jedoch größtenteils noch unerforscht.

(Fredheim et al., 2009)

In der Studie von Fredheim et al. (2009) wurde neben der Biofilmbildung von

S. haemolyticus auch die Prävalenz der Resistenz-determinierenden Genorte mecA gegen

Betalaktam-Antibiotika und [aac(6‘)-Ie-aph(2‘‘)] gegen Aminoglykoside untersucht. Ein

positives Ergebnis wurde bei 89% bzw. 85% der Isolate detektiert, wobei 82% der Stämme

beide Genloci besaßen.

Bereits im Jahr 1997 konnte das Vorkommen der Resistenzen von S. haemolyticus

gegenüber unterschiedlichen Antibiotika bei einer Gruppe von Neugeborenen im

nosokomialen Umfeld mit ergänzender Untersuchung der Mütter und des Pflegepersonals

bestätigt werden. Es bestanden Resistenzen gegenüber Penicillin, Oxacillin, Gentamicin,

Erythromycin, Chloramphenicol und Tetrazyklin. Die unter den infizierten und nicht-

infizierten ProbandInnen verbreiteten Stämme von S. haemolyticus zeigten kombinierte

Resistenzeigenschaften. In der Zusammenschau zeigte diese Spezies sogar eine höhere

Resistenzrate als S. epidermidis in demselben Umfeld. (Mehta und Kumari, 1997)


13

1.4 Diversität der Spezies S. epidermidis mittels MLST-Typisierung

Das Prinzip epidemiologischer Analysen im Generellen beruht auf der Annahme, dass sich

apathogene sowie infektiöse Isolate von einem Ursprungsstamm durch Punktmutationen,

Rekombination und Zugewinn bzw. Deletion mobiler Elemente entwickelt haben

(Miragaia et al., 2008).

Eine gängige Typisierungsmethode ist die Pulsfeldgelelektrophorese, eine Methode zur

Längenbestimmung chromosomaler Fragmente (Miragaia et al., 2002). Nachteil dieser

Methode in der Erforschung internationaler Stammbäume ist die begrenzte

Reproduziertbarkeit der Ergebnisse zwischen den Forschungsgruppen. Dies schränkt

übergreifende Kooperationen ein und standardisierte Verfahren sind anzustreben.

(Miragaia et al., 2008)

Ebenso können genetische Verwandtschaften über die sequenzierende Analyse

beispielsweise der SCCmec-Struktur bei entsprechend nachweisbarem Genlocus der zu

untersuchenden Staphylokokken untersucht werden (Miragaia et al., 2008). Bedingung ist

das Vorliegen dieses Genotyps, Verwandtschaften darüber hinaus können durch diese

Einzelmethode nicht erschlossen werden.

Diese Verfahren sind nicht redundant, sondern können in Kombination der Ergebnisse

weitere Verwandtschaftsgrade aufschlüsseln als die jeweilige Einzelmethode es vermag.

Dabei stellte sich heraus, dass die Kombination der Ergebnisse der PFGE mit denen der

SCCmec-Typisierung in der Erstellung von Stammbäumen die am ehesten vergleichbare

Aussagekraft mit den Ergbnissen der im nachfolgenden beschriebenen Methode des

Multilocus sequence typing (MLST) hat. (Miragaia et al., 2008)

MLST basiert auf der Sequenzierung der eindeutigen Nucleotid-Folgen von konservierten

housekeeping Genen eines Mikroorganismus (Miragaia et al., 2007). Der Vergleich der

Sequenzen wird zur Entschlüsselung von Verwandtschaften und ursprünglichen Genotypen

unabhängig von bestimmten pathogenitätsassoziierten genetischen Merkmalen verwendet

(Ziebuhr et al., 2006). Im Umkehrschluss ist durch die Einzelmethode MLST ein Wandel

der Virulenz durch die zu Beginn des Kapitels genannten genetischen Veränderungen nicht

untersuchbar.

Dieses Verfahren gilt als unzweideutig und erlaubt eine gute Reproduzierbarkeit der

Ergebnisse durch unterschiedliche Forschungsgruppen, wobei der Kostenaufwand groß ist

(Boers et al., 2012).


14

Im Jahr 2007 wurden die sieben Genloci für S. epidermidis definiert, welche

Abgrenzungen bzw. Verwandtschaftsbestimmungen am schärfsten ermöglichen, und zu

einem neuen MLST-Schema zusammengestellt. Dies erfolgte einerseits anhand von

Isolaten von Endokarditiden im Rahmen von Klappenprothesen, andererseits anhand von

Stämmen in Zusammenhang mit Septitiden. Zum damaligen Zeitpunkt konnten 31

Sequenztypen (ST) und fünf klonale Komplexe (CC) unterschieden werden. (Thomas et

al., 2007) In dieser Dissertation wird im Wesentlichen auf Studien mit Verwendung dieses

verbesserten MLST-Schemas Bezug genommen.

Eine zentrale Studie untersuchte auf diese Weise 217 nosokomiale Isolate von

S. epidermidis unterschiedlicher geographischer und klinischer Herkunft und ermittelte die

entsprechenden Sequenztypen mit der Intention einer international als repräsentativ zu

vermutenden Sammlung (Miragaia et al., 2007). Es erfolgte eine ergänzende Bestimmung

der Prävalenz des mecA-kodierenden Genortes SCCmec derselben Stämme. Eine Anzahl

von 74 unterschiedlichen Sequenztypen konnten mittels MLST bestimmt werden, welche

durch den eBURST-Algorithmus (Feil et al., 2004) entsprechend den wahrscheinlichsten

Abstammungsverhältnissen 9 epidemischen klonalen Abstammungslinien weltweit

zugeordnet werden konnten (eburst.mlst.net).


15

1.5 Fragestellung

Koagulase-negative Staphylokokken und dessen Hauptvertreter S. epidermidis sind

wichtige und notwendige Bestandteile der physiologischen Hautflora, gleichzeitig nehmen

sie heutzutage als bedeutsame opportunistische Krankheitserreger im nosokomialen

Umfeld eine ambivalente Schlüsselrolle ein (Banerjee et al., 1991; Becker et al., 2014).

Wichtigste Ursache dieser Entwicklung ist die zunehmende Verwendung implantierter

medizinischer Materialien, welche aufgrund der Fähigkeit der Staphylokokken zur

Biofimbildung ein geeignetes Habitat für diese Mikroorganismen bilden (Kozitskaya et al.,

2005). Neben immunsupprimierten Patienten sowie Patienten mit Fremdkörpern wie zum

Beipiel Endoprothesen oder zentralvenösen Zugängen gelten Neugeborene einer

Intensivstation mit ihrem unausgereiften Immunsystem als besonders gefährdet für

nosokomiale KNS-Infektionen (Rogers et al., 2009; Verstraete et al., 2014; Bizzarro et al.,

2015). Als Quelle dieser Infektionen ist der direkte Körperkontakt und die Übertragung

bzw. Einbringung der Mikroorganismen durch medizinisches Personal und medizinische

Fremkörper anzusehen (Milisavljevic et al., 2005). Hierbei ist besonders die Handflora des

medizinischen Personals mit Koagulase-negativen Staphylokokken und speziell

S. epidermidis eine entscheidende Infektionsquelle und bisher bezüglich deren

Kolonisation und temporären Veränderungen der Hautflora im Rahmen der medizinischen

Tätigkeit nur unzureichend erforscht worden.

Im Rahmen dieser Dissertation soll daher die Hautkolonisation von medizinischem

Personal mit Koagulase-negativen Staphylokokken auf einer neonatologischen

Intensivstation vor und während einer medizinischen Beschäftigung durch das in

Handabstrichen gewonnene Material näher analysiert, deren Pathogenitätsfaktoren der

Oxacillinresistenz und Biofilmbildung charakterisiert und stichprobenartig ausgewählte

Isolate anschließend mittels Genotypisierung innerhalb des Untersuchungskollektivs sowie

im internationalen Kontext verglichen werden.

In der Gegenüberstellung zu einer krankenhausfernen Vergleichsgruppe soll geklärt

werden, ob es Unterschiede zwischen der Handflora des medizinischen Personals und

Personen ohne Kontakt zum medizinischen System gibt.

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Material und Methoden

16

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

Tabelle 1: Verwendete Chemikalien

Bezeichnung Hersteller

Acetonitril Sigma-Aldrich®

Ameisensäure Merck

BactoTM

Agar Becton Dickinson

BactoTM

Tryptic Soy Broth (TSB) Becton Dickinson

Borsäure Merck

CaCl2 * 2H2O Sigma-Aldrich®, Merck

Casein, alkalilöslich Merck

Cystein Merck

DifcoTM

Mueller Hinton Agar Becton Dickinson

EDTA Merck

Ethanol absolute chemsolute®, Th. Geyer GmbH

Ethidiumbromid 1% Fluka

Gentian violet solution (Kritallviolett) Medion Diagnostics

Glycerin Carl Roth

HCl 36,5-38% Sigma-Aldrich®

KCl Merck

KH2PO4 Merck

MgCl2 * 6H2O Merck

Na2HPO4 * 2 H2O Merck

NaCl Carl Roth

NucliSENS® easyMAG® Extraction Buffer 1 bioMérieux SA



NucliSENS® easyMAG® Lysis Buffer bioMérieux SA

NucliSENS® easyMAG® Magnetic Silica bioMérieux SA

Oxacillin Natriumsalz Hydrat VETRANAL™

Sigma-Aldrich®

Trifluoressigsäure (TFA)

Merck

Tris Merck


17

Ultra Pure Water Biochrom AG

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich®

2.1.2 Nährmedien

Tabelle 2: Verwendete Nährmedien und ihre Zusammensetzung

Bezeichnung Zusammensetzung (Hersteller)

Casein-Agar BactoTM

Agar 15 g/l

BactoTM

TSB 30 g/l

CaCl2 * 2H2O 0,74 g/l

Cystein 0,12 g/l

Casein 10 g/l

Columbia Agar (COS) gebrauchsfertiger Nährboden mit 5%

Hammelblut (bioMérieux SA)

Oxacillin-Agar DifcoTM

Mueller Hinton Agar 38 g/l

NaCl 40 g/l

MgCl2 * 6H2O 0,21 g/l

CaCl2 * 2H2O 0,18 g/l

Oxacillin 6 mg/l

TS-Agar BactoTM

TSB 30 g/l

BactoTM

Agar 15 g/l

TSB BactoTM

TSB 30 g/l

TSBEtOH BactoTM

TSB 30 g/l

3% EtOH (vol/vol)

2.1.3 Puffer und Lösungen

Tabelle 3: Verwendete Puffer und Lösungen und ihre Zusammensetzung

Bezeichnung Zusammensetzung

PBS-Puffer NaCl 8 g/l

KH2PO4 0,2 g/l

KCl 0,2 g/l

Na2HPO4 * 2 H2O 1,15 g/l

pH 7,2


18

0,85% NaCl-Lösung

70% Ameisensäure

Matrix α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid 10 g/l

50% Acetonitril + 2,5% TFA

60% Glycerin

TBE 5x Tris 54,51 g/l

Borsäure 27,82 g/l

EDTA 2,92 g/l

2.1.4 Einwegartikel und Hilfsmittel

Tabelle 4: Verwendete Einwegartikel und Hilfsmittel


Cellstar® Pipette, 25 ml greiner bio-one

Cryo-Röhrchen mit blauen Perlen Mast Diagnostica Laboratoriumspräparate

GmbH

Deepwell plate 96 /500µl Eppendorf

Drigalski-Spatel, Glas Carl Roth

Druckgaskartusche C 206, Butan-/Propan

80/20

Campingaz®

Einmalösen, 1µl greiner bio-one

Einmalösen, 10µl greiner bio-one

Eppendorf Reaktionsgefäße Eppendorf

Filterspitzen nerbe plus, Biohit

Glasware Schott

Klebefolie Neschen

Kühlblöcke Eppendorf

Multiply® -µStrip Pro 8er Kette Sarstedt

NucliSENS® easyMAG® Disposables bioMérieux SA

NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatte NuncTM

Petrischale, quadratisch 120/120/17 mm greiner bio-one

Pipettenspitzen Sarstedt

Röhren 12 ml mit Schraubverschluss Sarstedt

Sigma Transwab-Liquid Amies medical wire

Trifill Multi Channel Pipetter Reservoir camlab

Zapfenplatten TSP Polysorp nunc-immuno nuncTM


19

2.1.5 Geräte

Tabelle 5: Verwendete Geräte


Brutschrank Hera Cell 240 (mit 5% CO2) Heraeus

Bunsenbrenner Labogaz 206 Campingaz®

Centrifuge 5418 Eppendorf

easyMAG® bioMérieux

Elektrophorese Kammer peqlab Biotechnologie GmbH

Elektrophoresis Power Supply EV 233 peqlab

Feinwaage AT 261 Delta Range® Mettler Toledo

FlexCycler Analytik Jena

Gefrierschrank Premium -20°C Liebherr

GJ Präzisionswaage Kern

Infinite M200 Microplate Reader Tecan

Kühlschrank Liebherr

MicroflexTM

LT MALDI-TOF-MS Bruker Daltonics

Mikrowelle Bosch

pH-Meter MP 200 Mettler Toledo

Pipetten Eppendorf, Biohit

Pipetus®-Akku Hirschmann Laborgeräte

Schüttelinkubator Edmund Bühler GmbH

Sicherheitsbunsenbrenner FIREBOY plus Integra Biosciences

SproutTM

Zentrifuge Heathrow Scientific® LLC

Sterile Werkbank Antares Biohit

Sterile Werkbank Laminar Air Flow Class

100

Gelaire

Ultra-low temperature freezer -80°C Sanyo

Ultraschallgerät Transsonic 460 /H Elma®

UV Transluminator Vilber Lourmat

UV-Kamera-System Intas®

Vortex Genius 3 Ika®


20

2.1.6 Organismen

Tabelle 6: Verwendete Organismen

Bakterienstamm genauere Bestimmung Referenz

DH5α Escherichia coli

Bethesda Research

Laboratories

cMRSA #4 Staphylococcus aureus

Genotyp mecA-positiv

Phänotyp Oxacillin-resistent

definierte laboreigene

Stammsammlung

S. epidermidis 1457 Staphylococcus epidermidis

Genotyp icaA-positiv

Phänotyp Biofilm-positiv

Mack et al. (1992)

2.1.7 PCR und Gelelektrophorese

Tabelle 7: Verwendete Substanzen für die Polymerase-Ketten-Reaktion und

Gelelektrophorese

Substanz Hersteller

10x Dream TaqTM

DNA Polymerase 5u/µl Fermentas

10x Dream TaqTM

Green Buffer Fermentas

dNTP Mix, je 10 mM Fermentas

Aqua ad iniectabilia, pH 5,0-7,0 Laboratori Diaco Biomedicali S.p.A.

Ladder GeneRulerTM

(1kb Plus DNA Ladder) Fermentas

peqGOLD Universal Agarose peqlab

2.1.8 Primer

Tabelle 8: Verwendete Primer

Name Sequenz (5'-3') Hersteller

mecA for GAAATGACTGAACGTCCGAT Eurofins MWG Operon

mecA rev GCGATCAATGTTACCGTAGT

arcC-F TGTGATGAGCACGCTACCGTTAG

arcC-R TCCAAGTAAACCCATCGGTCTG

aroE-F CATTGGATTACCTCTTTGTTCAGC

aroE-R CAAGCGAAATCTGTTGGGG


21

gtr-F CAGCCAATTCTTTTATGACTTTT

gtr-R GTGATTAAAGGTATTGATTTGAAT

mutS-F3 GATATAAGAATAAGGGTTGTGAA

mutS-R3 GTAATCGTCTCAGTTATCATGTT

pyr-F2 GTTACTAATACTTTTGCTGTGTTT

pyr-R4 GTAGAATGTAAAGAGACTAAAATGAA

tpi-F2 ATCCAATTAGACGCTTTAGTAAC

tpi-R2 TTAATGATGCGCCACCTACA

yqiL-F2 CACGCATAGTATTAGCTGAAG

yqiL-R2 CTAATGCCTTCATCTTGAGAAATAA

icaA for TCGATGCGATTTGTTCAAACAT

icaA rev CTGTTTCATGGAAACTCC

2.1.9 Datenbanken und Programme

Tabelle 9: Verwendete Datenbanken und Programme

Produkt Hersteller

flexControl - microflex Bruker Daltonics

BioTyper AutomationControl Bruker Daltonics

optimized database Bruker Daltonics, definierte laboreigene

Stammsammlung

i-Control 1.8 Tecan

Vector NTI AdvanceTM

10 InvitrogenTM

easyMAG 2.0 bioMérieux SA

analytikjena Version 2005-1.2 Analytik Jena AG

R version 2.15.0 The R Foundation for Statistical Computing


22

2.2 Methoden

2.2.1 Struktur der Untersuchungsgruppe und Vergleichsgruppe

Im Rahmen einer Qualitätssicherungsstudie wurden im Zeitraum vom 06.11.2010 bis

15.12.2011 auf zwei neonatologischen Intensivstationen des Universitätsklinikums

Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Handabstriche von insgesamt 20 Mitgliedern des

medizinischen Personals gewonnen. Zur Gewährleistung eines homogenen und

ortsgebundenen Kollektivs wurde die Probennahme auf das Pflegepersonal beschränkt,

welches auf den Stationen ausschließlich aus weiblichen Angestellten bestand.

Die Struktur der Vergleichsgruppe sollte in mehreren definierten Aspekten mit der Struktur

der Untersuchungsgruppe übereinstimmen. Die ProbandInnen sollten das weibliche

Geschlecht besitzen, keine Hauterkrankungen der Hände aufweisen und entsprechend im

berufsfähigen Alter sein. Abgrenzend sollten sie keiner Beschäftigung im

Gesundheitswesen nachgehen, keine regelmäßige Händedesinfektion durchführen, in den

vorangegangenen sechs Monaten keine antibiotischen Substanzen eingenommen haben

und in ebendieser Zeit keinen Aufenthalt in einem Krankenhaus gehabt haben. Insgesamt

wurden damit 10 weitere Probandinnen in der Vergleichsgruppe untersucht.

Weitere Einschlusskriterien aller Probandinnen für die Studie waren die schriftliche

Einverständniserklärung nach mündlicher und schriftlicher Aufklärung. Die molekulare

Typisierung der an der Quelle anonymisierten Stämme wurde durch die Ethikkommission

der Universität zu Lübeck genehmigt (Aktenzeichen 12-134A, Klonale Analyse von

Staphylococcus epidermidis, Zustimmung am 03.08.2012).

2.2.2 Probengewinnung

Es zeigte sich bereits im Vorfeld dieser Studie, dass eine Übertragung von

Mikroorganismen zwischen Objekten über die Kontamination der Hände erfolgen kann.

Feuchtigkeit des primären und besiedelten Objektes, oder der übertragenden Hände,

begünstigt die Weitergabe der Organismen (Marples und Towers, 1979). Diese Tatsache

wurde bei den vorliegenden Methoden genutzt, indem die Abstrichtupfer zur

Probengewinnung befeuchtet wurden, um die Aufnahme der Stämme und damit die

Sensitivität der Methode zu steigern.

Von den Händen der Probandinnen der Untersuchungsgruppe wurden zu drei Zeitpunkten

Abstriche gewonnen. Der erste Abstrich zum Zeitpunkt t1 erfolgte nach einem fünf-tägigen

Freizeitaufenthalt außerhalb des Krankenhauses, vor Dienstbeginn und vor Kontakt mit der

Dienstkleidung. Anschließend leistete die Probandin an vier aufeinander folgenden Tagen


23

ihren Dienst auf einer definierten Station des Krankenhauses ab. Der zweite Abstrich

erfolgte am dritten Tag, der dritte Abstrich am vierten Tag, beide stichprobenartig während

des Dienstes. Die Bearbeitung des Materials erfolgte unter Zusammenfassung des

Probenmaterials der Dienstabstriche zu einem gemeinsamen Zeitpunkt t2+3.

Die Abstriche der Vergleichsgruppe erfolgten nur zu jeweils einem Zeitpunkt.

Der sterile Tupfer wurde mit steriler NaCl-Lösung benetzt und anschließend mit einer

rollenden Bewegung über beide Handinnenflächen der Probandin bewegt. Es folgte der

direkte Verschluss in das entsprechende Abstrichröhrchen mit 1 ml sterilem Amies-

Medium. Dieser Vorgang wurde mit einem zweiten Tupfer wiederholt. Direkt im

Anschluss wurden mit einem dritten Tupfer die Fingerzwischenräume beider Hände

rollend abgestrichen. Auch dies wurde mit einem weiteren Tupfer wiederholt, sodass

letztlich zwei palmare Abstriche und zwei interdigitale Abstriche zur weiteren

Untersuchung vorlagen.

2.2.3 Kultivierung der Mikroorganismen auf Blutagar und TS-Agar

Nach der Durchmischung des Inhaltes der Abstrichröhrchen mittels Vortex wurden diese

unter der sterilen Arbeitsbank geöffnet. Das Untersuchungsmaterial wurde auf sterilen

Blutagarplatten mit Drigalski-Spatel ausgestrichen. Es erfolgte eine Kultivierung für 18-24

Stunden bei einer Temperatur von 37°C und 5% CO2.

Mit 1µl-Einmalösen wurden einzelne Kolonien auf TS-Agar ausgestrichen. Zunächst

wurden 90 Isolate palmar und 90 Isolate interdigital auf diese Weise übertragen. Dabei

wurden die Blutagarplatten quadrantenweise „leergepickt“, bis die erwünschte Anzahl

erreicht war. Es erfolgte erneut eine Kultivierung für 18-24 Stunden bei einer Temperatur

von 37°C und 5% CO2.

Bei Kolonien, welche morphologisch mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit

keine Staphylokokken sein konnten, wurde eine Stichprobe mittels MALDI-TOF

analysiert.

2.2.4 Identifikation der Einzelkolonien mittels MALDI-TOF

Die auf tryptic-soy (TS)-Agar gewachsenen Mikroorganismen wurden mittels 1µl-

Einmalösen auf die Felder des gerätespezifischen Targets übertragen. Der Einschluss des

Standardstammes Escherichia coli DH5α in jeder Durchführung diente der zu Beginn der

Messungen erfolgten Kalibrierung des Gerätes. Die Vorlyse jeder Probe auf dem Target


24

erfolgte durch Applikation von 1µl 70%iger-Ameisensäure. Nach dem Trocknen erfolgte

die Bedeckung der Felder mit je 1µl der Matrix. Nach erneutem Trocknen wurde das

Target in das Massenspektrometer MicroflexTM

LT MALDI-TOF-MS eingeschleust. Die

Kalibrierung wurde als ausreichend anerkannt, wenn fünf der acht möglichen Peaks

erkannt wurden. Die folgende Analyse der Proben erfolgte entsprechend den Anweisungen

in der Produktinformation mittels der dazugehörigen Software BioTyper

AutomationControl unter Abgleich der gemessenen Spektren mit den bekannten

Referenzspektren der optimized database. Die dabei entstehenden Bewertungszahlen

zeigten die Wahrscheinlichkeit für eine sichere Identifikation der Probe an. Werte

zwischen 2.0 und 3.0 zeugten von einer sehr wahrscheinlichen Speziesidentifikation bzw.

sicheren Gattungsidentifikation mit wahrscheinlicher Speziesidentifikation. Werte

zwischen 1.7 und 1.999 beschreiben eine wahrscheinliche Gattungsidentifikation. Bei

geringeren Werten musste die Identifikation als unzuverlässig angesehen werden.

Die Benennung der Staphylokokkenkolonien mit „N.D.“ erfolgte bei nicht eindeutiger

Identifizierung im 1.-Score der Bestimmung durch MALDI-TOF-MS zur Vorbeugung

falsch-hoher Detektionsraten. Die Score-Ergebnisse mit der Bezeichnung

„Staphylococcus sp.“ wurden hierunter subsummiert.

2.2.5 Auswahlverfahren zur Phänotypisierung und Erstellung von Vorkulturen

Im Folgenden wurden maximal 96 Staphylokken-Isolate des Abstriches von t1 einer

Probandin und 96 Staphylokokken-Isolate von t2 und t3 zusammengefasst ausgewertet.

Prinzipiell wurde eine ausgeglichene Zusammensetzung der jeweiligen 96 Stämme aus

palmaren und interdigitalen Isolaten angestrebt.

In dem Falle, dass bereits alle Kolonien eingeschlossen wurden, konnte die Gesamtzahl

von 96 Staphylokokken nicht erfüllt werden und es wurde mit einer geringeren Stammzahl

weiter verfahren.

Zur Erstellung der Vorkulturen für die nachfolgenden Untersuchungen wurden an der

sterilen Werkbank in 96-Deepwell-Platten 400µl TSB pro Well vorgelegt und mit den

einzelnen Kolonien vom TS-Agar beimpft. Die Platten wurden mit Klebefolie

verschlossen. Es erfolgte die Inkubation für 18-24 Stunden bei einer Temperatur von 37°C

und 5% CO2.


25

2.2.6 Screening der Proteaseaktivität und Oxacillinresistenz

An der sterilen Werkbank wurden von den bebrüteten 96-Deepwell-Platten 200µl pro Well

entnommen und in eine NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatte übertragen. Nach dem

Ablassen wurden die Stämme auf Casein- und Oxacillin-Agar übertragen, indem die

Spitzen zuerst auf Casein-, dann auf Oxacillin-Agar aufgesetzt wurden. Die Agar-Platten

wurden für 18-24 Stunden bei einer Temperatur von 37°C und 5% CO2 bebrütet.

Die Auswertung der Proteaseaktivität erfolgte vor und nach dem Auftragen von 1ml HCl

pro TS-Agar-Platte.

Zwei verschiedene phänotypische Arten der Proteaseaktivität wurden als positiv gewertet:

Die denaturierenden Proteasen spalten das Casein des Agars und erzeugen dadurch einen

weißen Ring um die Kolonien, die lysierenden Proteasen zersetzen Casein vollständig und

erzeugen dadurch einen hellen, durchscheinenden Hof um die Kolonien. Die

durchsichtigen Lysehöfe können durch Denaturierung des Caseins durch Auftragen einer

Säure, in diesem Fall Salzsäure, genauer dargestellt werden. Der Effekt der

denaturierenden Proteasen wird dadurch optisch abgeschwächt. (Jonas, 2010)

In dieser Arbeit wurde nicht die physiologische oder pathogene Bedeutung der Proteasen

betrachtet, sondern die unterschiedliche Proteaseaktivität der jeweiligen bakteriellen

Stämme unter standardisierten Bedingungen als schnelle Möglichkeit der phänotypischen

Charakterisierung und Differenzierung verwendet.

Das Wachstum der Kolonien auf Selektivagar zur Detektion der Oxacillinresistenz wurde

vor einem dunklen Hintergrund beurteilt. Dabei handelte es sich um eine

Selektionskonzentration von 6µg/ml.

2.2.7 Screening und Bestätigung der Biofilmbildung

Die Methodik des angewandten Screeningverfahrens basierte auf dem semiquantitativen

Verfahren von Christensen et al. (1985), welches die Adhärenz von S. epidermidis an

Kunststoffoberflächen misst.

Zum Screening der Biofilmanalyse wurden pro NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatte

mit Vorkulturen eine weitere NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatte mit 200µl TSB pro

Well und eine dritte NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatte mit 200µl TSBEtOH pro

Well befüllt. Zur Übertragung der Bakterienstämme wurde eine Zapfenplatte pro

NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatte mit Vorkulturen zuerst auf diese und dann auf

die Platte mit dem vorgelegten TSB aufgesetzt. Dabei wurde 1µl der Bakteriensuspension

übertragen. Dieser Schritt wurde zweimal mit derselben Zapfenplatte wiederholt und dann


26

ebenso dreimal mit der Bakteriensuspension und der NunclonTM

Δ surface 96 Well-

Microplatte mit TSBEtOH durchgeführt. Die auf diese Weise beimpften NunclonTM

Δ

surface 96 Well-Microplatten wurden bei einer Temperatur von 37 °C und 5% CO2 für 15-

21 Stunden bebrütet.

Insgesamt wurden die für MLST bestimmten Stämme zur Bestätigung des

Biofilmbildungsverhaltens in jeweils drei verschiedenen Zyklen mit jeweils vierfach

Bestimmungen für Biofilmbildung in TSB und TSBEtOH analysiert. Dabei wurde eine

Negativkontrolle mit TSB bzw. TSBEtOH mitgeführt. Zur Erstellung der Vorkultur wurden

an der Werkbank zwei bis drei Kolonien einer Reinkultur eines Stammes mittels 10µl-Öse

in 5ml TSB in einem Reagenzröhrchen übertragen. Diese wurden abgedeckt und sechs

Stunden im Schüttelinkubator bei einer Temperatur von 37°C und 150upm bebrütet.

Anschließend wurde eine 1:100 Verdünnung der Vorkulturen in TSB erstellt. Zur Analyse

der Biofilmbildung mit Ethanolzusatz erfolgte die Erstellung einer Parallelreihe mit

TSBEtOH. Von beiden Arten der Suspensionen wurden jeweils vier Mal 200µl auf eine

NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatte übertragen. Die Abdichtung der Platten mit

Klebefolie beugte einer Verflüchtigung des Ethanols vor. Die Bebrütung erfolgte bei einer

Temperatur von 37 °C und 5% CO2 für 17 Stunden.

Die bebrüteten NunclonTM

Δ surface 96 Well-Microplatten wurden ausgeschüttet und

viermalig mit 200µl PBS-Puffer pro Well gespült. Zwischen den Spülvorgängen wurden

die Platten auf Zellstoff ausgeschlagen. Anschließend wurden die Platten für 60-120

Minuten zum Trocknen in den Inkubator gestellt.

Die Färbung erfolgte mit 50µl Gentianaviolett pro Well, welches fünf bis zehn Minuten

einwirkte. Anschließend wurde die Farbe unter dem Wasserhahn mit kühlem Wasser

ausgespült, mit Aqua dest. nachgespült, die Platten wurden ausgeschlagen und das

Trocknen erfolgte erneut für 60-120 Minuten im Inkubator.

Der Farbstoff wurde in einem Volumen von 50µl Isopropanol 70% pro Well eluiert, dieses

wirkte zehn Minuten ein. Darauf folgte die Messung der Extinktion mittels

Photospektrometer und der Software „i-control“ von Tecan.


27

Die Messungen erfolgten unter folgenden Einstellungen:

Mode Absorbance

Wavelength 570nm

Bandwidth 9nm

Reference Wavelength 405nm

Bandwidth 9nm

Number of Flashes 1

Als phänotypisch nicht-biofilmbildend wurde ein Stamm bei der Messung einer optischen

Dichte des gefärbten Biofilms von <0,1 bezeichnet. Hingegen galt ein Stamm mit einer

optischen Dichte des zugehörigen gefärbten Biofilms von ≥0,1 in der nachfolgenden

Auswertung als phänotypisch biofilmbildend.

Die Ergebnisse der auf zweierlei Weise kultivierten Stämme - ohne bzw. mit Ethanolzusatz

im Wachstumsmedium - wurden zusammengefasst interpretiert als positive bzw. negative

Biofilmbildung des Stammes im Generellen.

2.2.8 Einfrieren und Auftauen der 96-Deepwell-Platte

Die Konservierung der Isolate erfolgte mit dem Ziel, zu einem späteren Zeitpunkt

definierte Stämme auftauen und genotypisieren zu können.

Zu den 200µl Bakteriensuspensionen der 96-Deepwell-Platte wurden 250µl 60%igen

Glycerols pro Well hinzugefügt. Die Platten wurden mit Klebefolie veschlossen und eine

gute Durchmischung der Suspensionen mit Glycerol durch Rütteln mit dem Vortex

gewährleistet. Anschließend wurden die Platten bei -80°C eingefroren.

Zur weiteren Untersuchung wurde an der sterilen Werkbank über der gewünschten Well

mittels glühender Metallöse ein Loch in die Klebefolie geschmolzen. Der Ausstrich

erfolgte mit 10µl Einmalöse auf Blutagar. Um Reinkulturen zu erhalten, wurde jeweils

eine Kolonie der aufgetauten und für 18-24 Stunden bei einer Temperatur von 37°C und

5% CO2 bebrüteten Stämme erneut in einem 3-Ösen-Ausstrich auf Blutagar aufgetragen

und kultiviert.

2.2.9 DNA-Isolation

Eine Anzahl von drei bis vier frischen Einzelkolonien der Reinkulturen einer Blutagar-

Platte wurden mittels Einmalöse auf ein Volumen von 250µl PBS-Puffer übertragen. Die

Isolation wurde mittels easyMAG® der Firma bioMérieux SA und der zugehörigen


28

Software entsprechend dem Geräteprotokoll durchgeführt. Verwendet wurden die

zugehörigen Verbrauchsmaterialien, Extraktionspuffer und Lysepuffer und die

Magnetische Silika, welche entsprechend den Substanzanforderungen mit einem

definierten Volumen Ultra Pure Water versetzt wurde. Aus 200µl Bakteriensuspension

entstanden 50µl DNA-Isolat. Dieses wurde in jeweils einem Eppendorf-Reaktionsgefäß bei

einer Temperatur von -20°C eingefroren.

2.2.10 Polymerasekettenreaktion

Zunächst erfolgte die Erstellung eines Mastermixes aus einem Vielfachen der

Zusammensetzung für eine DNA-PCR entsprechend Tabelle 10:

Tabelle 10: Zusammensetzung des Mastermixes für eine DNA-PCR

Substanz Volumen

Primer forward 10 pm 1µl

Primer reverse 10 pm 1µl

dNTP Mix 0,5µl

Puffer (grün) 2,5µl

Taq-Polymerase 0,25µl

Aqua ad iniectabilia 17,75µl

Dieser wurde geschüttelt, zentrifugiert und gekühlt. Nach Vorlegen des Mastermixes in die

Multiply® µStrip Pro 8er Kette wurden jeweils 2µl DNA hinzugegeben und der Ansatz

zentrifugiert. Anschließend wurden die Ansätze in den Cycler eingeschleust.

Nach Amplifizierung wurden die PCR-Produkte bei einer Temperatur von 4-8 °C

aufbewahrt.

Tabelle 11: Phasen der PCR für mecA

Phase Temperatur (°C) Zeit (min)

1 94,0 05:00

2c 94,0 00:30

3c 55,0 00:30

4c 72,0 00:30

5 72,0 04:00

6 4,0 --:--

Es wurden 30 Zyklen von Phase 2c bis 4c durchlaufen.


29

Tabelle 12: Phasen der PCR für icaA


1 94,0 5:00

2c 95,0 0:30

3c 50,0 0:30

4c 72,0 1:30

5 72,0 4:00

6 4,0 --:--


Tabelle 13: Phasen der PCR für MLST


1 94,0 05:00

2c 94,0 00:30

3c 50,0 01:00

4c 72,0 01:00

5 72,0 05:00

6 4,0 --:--


Zur Kontrolle der PCR-Qualität lief bei der nachfolgenden Gelelektrophorese der mecA-

PCR das PCR-Produkt des cMRSA #4 als Positivkontrolle mit, bei der icaA-PCR wurde zu

diesem Zweck das PCR-Produkt des Stammes S. epidermidis 1457 verwendet. In jeder

durchgeführten Elektrophorese wurde eine Negativkontrolle mitgeführt, bei welcher in der

entsprechenden vorherigen PCR 2µl Aqua ad iniectabilia anstelle der DNA verwendet

worden war.

2.2.11 Gelelektrophorese

Die mecA- und icaA-positiven Banden bzw. die Banden der PCR-Amplifikate für MLST

wurden in der Gelelektrophorese mit 1,2%igen (w/v) TBE-Agarose-Gelen dargestellt.

Die Herstellung des Gels erfolgte durch Erhitzung von 150 ml 0,5x TBE-Puffer mit 1,8 g

Agarose. Nach Lösung der Agarose wurden 6µl Ethidiumbromid 1% hinzugegeben und

das Gel gegossen.


30

Als Laufpuffer wurde 0,5x TBE verwendet. Als Standard lief in jeder Reihe ein

Größenstandard mit. Die Elektrophorese der PCR-Produkte erfolgte für eine Zeitspanne

von einer Stunde unter folgenden Geräteeinstellungen:

Elektrische Spannung 120 V

Stromstärke 300 mA

Leistung 300 W

2.2.12 Sanger-Sequenzierung

Die DNA-Proben waren mit den entsprechenden Primern amplifiziert und die PCR-

Produkte mittels Gelelektrophorese auf ihr Gelingen kontrolliert worden. Die Proben und

separat abgefüllte Primer forward und reverse, je 3,2µM, wurden an das Institut für

Klinische Molekularbiologie des UK S-H, Campus Kiel, übermittelt und freundlicherweise

dort sequenziert. Die Sequenzierungsergebnisse wurden in einer elektronischen Datei

zurückübermittelt.

Anschließend erfolgten die Bearbeitung der Sequenzierungsergebnisse in dem Programm

Vector NTI Advance 10 und der Abgleich der zugeschnittenen Sequenzen mit den auf der

Website www.mlst.net erhältlichen Sequenzen, wodurch die Alleltypen und der

Sequenztyp (ST) aus den sieben Genorten ermittelt werden konnten.

Der eBURST-Algorithmus dient der Herausstellung von Verwandschaftsgraden der durch

ein MLST-Schema bestimmten Sequenztypen. In dieser Arbeit wird hierzu das neue

MLST Schema zugrundegelegt (Thomas et al., 2007).

Die Sequenztypen wurden über den eBURST-Algorithmus auf der Website

eBURST.mlst.net des Department of Infectious Disease Epidemiology, Imperial College

London, als einzelstehend oder Bestandteile eines klonalen Komplexes (CC) charakterisiert

und die genetischen Verwandtschaften graphisch dargestellt.

Ein Stamm wurde einer Gruppe zugeordnet, wenn er mit sechs von sieben MLST-Loci

einem anderen Sequenztyp dieser Gruppe glich. Eine Untergruppe wurde durch einen

Sequenztyp gegründet, wenn dieser mindestens drei single locus variants (SLV) besaß.

(Miragaia et al., 2007)

2.2.13 Statistische Auswertung

Im Gegensatz zur Detektion von Mikroorganismen, welche nicht der Gattung der

Staphylokokken zugeordnet sind, wurde in diesem Zusammenhang davon ausgegangen,


31

dass nahezu alle Bakterien der Staphylococcus spp. mit den verwendeten Methoden

gleichermaßen erfassbar seien. Dies erlaubte einen quantitativen Auswertungsansatz.

In dem Programm R version 2.15.0 wurde der Chi-Quadrat-Test als Signifikanztest für die

Größe der Fraktionen definierter Staphylokokkengruppen zu den unterschiedlichen

Zeitpunkten t1 und t2+3 verwendet (Kapitel 3.1, Kapitel 3.3 und Kapitel 3.4). Als

Signifikanzniveau wurde p<0,05 gewählt. Durch den Test wurde geprüft, ob

Abhängigkeiten zwischen Zeitpunkten und Fraktionsgrößen zu vermuten sind, die über

einen Zufall hinausgehen.

Da es sich in dieser Arbeit um einen epidemiologisch-deskriptiven Untersuchungsansatz

handelt, musste von weiteren statistischen Auswertungen abgesehen werden. Hinzu kommt

der Bias, dass eine Probenbegrenzung aus umsetzungstechnischen Gründen vorgenommen

werden musste, sodass weitergehende statistische Aussagen nicht als zuverlässig

anzunehmen gewesen wären.

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen Personals Ergebnisse

32

3 ERGEBNISSE

3.1 Epidemiologie der Staphylococcus spp.

Die Abstriche von 18 Probandinnen zum ersten Zeitpunkt vor Antritt der medizinischen

Tätigkeit (t1) bzw. von 16 Probandinnen während der Arbeit im medizinischen Umfeld an

den folgenden Tagen (t2+3) erbrachten die maximal auszuwertende Anzahl von jeweils 96

Staphylokokken-Isolaten. Die kleinste zur Auswertung zugelassene Koloniezahl von

Staphylokokken zum Zeitpunkt t1 war 95, zum Zeitpunkt t2+3 43. Auf dieser Basis ergab

sich eine Gesamtanzahl der isolierten Staphylokokkenisolate von 1918 zum Zeitpunkt t1

bzw. 1766 zum Zeitpunkt t2+3. In der Vergleichsgruppe wurde die maximal angestrebte

Anzahl von 960 Staphylokokken-Isolaten erzielt.

Im Rahmen der Anzüchtung, Isolation und Identifikation der Isolate wurden auch Spezies

detektiert, die nicht der Gattung Staphylococcus zugeordnet werden konnten (Anhang I,

Tabelle 15, Tabelle 16 und Tabelle 17). Eine quantitative Auswertung ist im Gegensatz zu

den Staphylokokken aufgrund des Stichprobenverfahrens nachfolgend nicht sinnvoll.

Zum Zeitpunkt t1 war S. epidermidis mit 39,1% der Staphylokokken-Isolate (n=750/1918)

am häufigsten zu finden. In abnehmender Größe wurden die nachfolgenden Fraktionen

durch S. capitis mit 19,2% (n=368), S. hominis mit 18,0% (n=346), S. warneri mit 13,2%

(n=253) und S. haemolyticus mit 3,7% (n=70) der insgesamt 1918 Isolate gebildet. Der

Anteil von S. saprophyticus belief sich auf 1,2% (n=22). Die darüber hinaus isolierten und

identifizierten Spezies wie S. aureus, S. lugdunensis, S. equorum, S. auricularis, S. cohnii,

S. xylosus, S. carnosus, S. succinus, S. pettenkoferi, S. condimenti, S. vitulinus und

S. caprae waren jeweils mit einem Anteil von <1% vertreten. (Abbildung 1 und Anhang II,

Tabelle 18)

Zum Zeitpunkt t2+3 wurden die dominanten Fraktionen von denselben fünf Spezies

gebildet. S. epidermidis bildete einen Anteil von 60,1% der Isolate (n=1061/1766), es

folgten in absteigender Reihenfolge S. hominis mit 12,9% (n=227), S. capitis mit 12,3%

(n=218), S. haemolyticus mit 9,6% (n=170) und S. warneri mit 2,9% (n=52). S. aureus

wurde bei 1,1% (n=20) detektiert. Die weiteren Spezies S. saprophyticus, S. cohnii,

S. equorum und S. auricularis bildeten jeweils Anteile von <1%. Nicht detektiert wurden

S. lugdunensis, S. pettenkoferi, S. condimenti, S. xylosus, S. carnosus, S. succinus,

S. vitulinus, S. sciuri, S. pasteuri, S. caprae und S. arlettae. (Abbildung 2 und Anhang II,

Tabelle 19)


33

Abbildung 1: Fraktionen der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t1

Abbildung 2: Fraktionen der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t2+3

S. epidermidis

S. capitis

S. hominis

S. warneri

S. haemolyticus

S. saprophyticus

S. aureus

S. lugdunensis

S. equorum

S. auricularis

S. cohnii

S. xylosus

S. carnosus

S. succinus

S. pettenkoferi

S. condimenti

S. vitulinus

S. caprae

S. sciuri

S. pasteuri

S. arlettae

N.D.

39,1%

19,2%

18,0%

13,2%

3,7%

60,1%

12,3%

12,9%

2,9%

9,6%

S. epidermidis

S. capitis

S. hominis

S. warneri

S. haemolyticus

S. saprophyticus

S. aureus

S. equorum

S. auricularis

S. cohnii

N.D.


34

In den 960 Staphylokokken-Isolaten der Vergleichsgruppe wurden die fünf größten

Fraktionen abermals von S. epidermidis mit 34,5% (n=331), S. warneri mit 19,7%

(n=189), S. hominis mit 15,6% (n=150), S. capitis mit 15,1% (n=145) und S. haemolyticus

mit 4,2% (n=40) gebildet. Es folgten in absteigender Reihenfolge S. equorum mit 2,4%

(n=23), S. xylosus mit 1,7% (n=16) und S. cohnii und S. lugdunensis mit jeweils 1,0%

(n=10). Die Stämme von S. saprophyticus, S. aureus, S. auricularis, S. pettenkoferi,

S. sciuri, S. pasteuri und S. arlettae repräsentierten jeweils einen Anteil von <1%. Nicht

detektiert wurden S. condimenti, S. carnosus, S. succinus, S. vitulinus und S. caprae.

(Abbildung 3 und Anhang II, Tabelle 20)

Abbildung 3: Fraktionen der Staphylokokkenspezies in der Vergleichsgruppe

Im Vergleich der Fraktionsgroßen der fünf dominierenden Spezies im Chi-Quadrat-Test

zeigte sich ein signifikanter Anstieg (p<0,05) der relativen Anteile an der Gesamtzahl der

Isolate des jeweiligen Zeitpunktes von S. epidermidis und S. haemolyticus der Fraktionen

von t1 zum Zeitpunkt t2+3 (S. epidermidis 39,1% bzw. 60,1%, S. haemolyticus 3,7% bzw.

9,6%). Reziprok zeichnete sich eine Abnahme der relativen Anteile von S. warneri (13,2%

bzw. 2,9%), S. hominis (18,0% bzw. 12,9%) und S. capitis (19,2% bzw. 12,3%) im

Dienstabstrich ab.

34,5%

15,1% 15,6%

19,7%

4,2%

S. epidermidis

S. capitis

S. hominis

S. warneri

S. haemolyticus

S. saprophyticus

S. aureus

S. lugdunensis

S. equorum

S. auricularis

S. cohnii

S. xylosus

S. pettenkoferi

S. sciuri

S. pasteuri

S. arlettae

N.D.


35

Im Vergleich der Anteile der Spezies von t1 mit der Vergleichsgruppe bestanden in der

Untersuchungsgruppe signifikant größere Anteile an der Gesamtzahl der Isolate des

jeweiligen Zeitpunktes der Untersuchungs- bzw. Vergleichsgruppe von S. epidermidis

(39,1% vs. 34,5%) und S. capitis (19,2% vs. 15,1%), während in der Vergleichsgruppe die

Fraktion von S. warneri größer war (13,2% vs. n=19,7%) (p<0,05). Keine signifikanten

Unterschiede bestanden zwischen den relativen Anteilen von S. hominis und

S. haemolyticus (18,0% vs. 15,6% bzw. 3,7% vs. 4,2%).

Bei Betrachtung der Fraktionen von t2+3 und der Vergleichsgruppe zeigten sich im

Abstrich der Untersuchungsgruppe signifikant größere Anteile von S. epidermidis (60,1%

vs. 34,5%) und S. haemolyticus (9,6% vs. 4,2%) (p<0,05) mit reziprok geringeren Anteilen

von S. capitis (12,3% vs. 15,1%) und S. warneri (2,9% vs. 19,7%). Kein signifikanter

Unterschied zeigte sich in den Anteilen von S. hominis (12,9% vs. 15,6%).

Letztlich ist S. epidermidis die einzige Spezies der identifizierten Staphylokokken, die zu

jedem Untersuchungszeitpunkt und bei jeder Probandin nachgewiesen werden konnte

(Anhang II, Tabelle 21, Tabelle 22 und Tabelle 23).

3.2 Vielfalt der Staphylococcus spp.

Bei Betrachtung der Vielfalt der Staphylococcus spp. zeigte sich eine durchschnittliche

Spezieszahl von 6,1 Spezies zum Zeitpunkt t1, von 4,5 Spezies zum Zeitpunkt t2+3 und

von 6,8 Spezies in der Vergleichsgruppe. Die Spannweite der unterschiedlichen

Staphylokokkenspezies lag bei 3-11 Spezies vor dem Dienst, 1-7 Spezies im Dienst und 5-

10 Spezies in der Vergleichsgruppe. Der Schwerpunkt in der Speziesvielfalt bzw. dessen

Median war zum Zeitpunkt t1 bei 6 Spezies, zum Zeitpunkt t2+3 bei 5 Spezies und in der

Vergleichsgruppe bei 7 Spezies. (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6).


36

Abbildung 4: Anzahl der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t1

Abbildung 5: Anzahl der Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t2+3

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Anza

hl

der

Pro

ban

din

nen

n (Spezies)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Anza

hl

der

Pro

ban

din

nen

n (Spezies)


37

Abbildung 6: Anzahl der Staphylokokkenspezies der Vergleichsgruppe

3.3 Prävalenz der phänotypischen Oxacillinresistenz der Staphylococcus spp.

In der quantitativen Auswertung der phänotypisch ausgebildeten Oxacillinresistenz im

Vergleich der Isolate der beiden Abstrichzeitpunkte t1 und t2+3 wurde zwischen den

Stämmen von S. epidermidis, S. haemolyticus und sonstigen Staphylococcus spp.

unterschieden (Anhang III, Tabelle 24, Tabelle 25 und Tabelle 26).

Eine Oxacillinresistenz war für S. epidermidis bei jeder Probandin der

Untersuchungsgruppe des medizinischen Personals zu beiden Zeitpunkten t1 und t2+3

nachweisbar (Anhang III, Tabelle 24).

Insgesamt zeigte sich eine deutliche Zunahme der phänotypischen Oxacillinresistenz bei

S. epidermidis mit einem Anteil von 46,0% der Isolate dieser Spezies von Zeitpunkt t1

(n=345/750) auf 72,3% der Isolate dieser Spezies zum Zeitpunkt t2+3 (n=767/1061,

Abbildung 7 und Tabelle 24). Ebenso zeigte sich eine solche Zunahme des relativen

Anteils der Oxacillinresistenz ausbildenden Stämme von S. haemolyticus von 7,1% auf

71,2% (n=5/70 und 121/170, Abbildung 8 und Tabelle 25).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Anza

hl

der

Pro

ban

din

nen

n (Spezies)


38

Abbildung 7: Oxacillinresistenz der Isolate von S. epidermidis zum Zeitpunkt t1 und

t2+3

Abbildung 8: Oxacillinresistenz der Isolate von S. haemolyticus zum Zeitpunkt t1 und

t2+3

Entgegengesetzt zeigte sich eine Abnahme dieser phänotypischen Resistenz bei den

sonstigen Staphylokokkenspezies von insgesamt 8,3% (n=91/1098) zum Zeitpunkt t1 auf

4,1% zum Zeitpunkt t2+3 (n=22/535, Abbildung 9 und Tabelle 26). Diesbezüglich wurden

zu beiden Zeiten die separat ausgewerteten Stämme von S. epidermidis und

S. haemolyticus ausgeschlossen. Im Sinne einer ganzheitlichen Auswertung wurden die

zum Zeitpunkt t1 bzw. t2+3 detektierten 18 bzw. 20 Koagulase-positiven Isolate von

S. aureus in die Analyse eingeschlossen (Tabelle 18 und Tabelle 19). All diese Isolate

waren phänotypisch Oxacillin-sensibel.

0%

10%

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30%

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Oxacillinresistente Stämme

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t1 t2+3




39

Abbildung 9: Oxacillinresistenz der Staphylococcus spp. unter Ausschluss von

S. epidermidis und S. haemolyticus zum Zeitpunkt t1 und t2+3

Die genannten Werte waren in der Prüfung mittels Chi-Quadrat-Test jeweils signifikant

mit p<0,05.

In der Vergleichsgruppe wurden vier Oxacillin-resistente Isolate von S. epidermidis (1,2%)

detektiert. Davon wurden drei Isolate in den Abstrichen einer einzelnen Probandin

identifiziert, der weitere Stamm wurde in den Abstrichen einer weiteren Probandin

nachgewiesen. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass 327 Isolate von 331 detektierten

Stämmen von S. epidermidis in der Vergleichsgruppe sensibel gegenüber Oxacillin waren.

3.4 Prävalenz der Biofilmbildung von S. epidermidis

Basierend auf den absoluten Stammzahlen von S. epidermidis im Bezug auf den Phänotyp

der Biofilmausbildung (Anhang IV, Tabelle 27 und Tabelle 28) zeigte im Gesamten zum

Zeitpunkt t1 eine Anzahl von 321 Isolaten (42,8%) von S. epidermidis keine

Biofilmbildung, zum Zeitpunkt t2+3 konnte bei 353 Isolaten (33,3%) keine Biofilmbildung

im Screening nachgewiesen werden. Positiv auf eine Biofilmproduktion waren 429 Isolate

(57,2%) zum Zeitpunkt t1 und 708 Isolate (66,7%) zum Zeitpunkt t2+3. In der

Vergleichsgruppe waren 193 Isolate (58,3%) nicht biofilmbildend und 138 Isolate (41,7%)

biofilmbildend.

Im Chi-Quadrat-Test zeigte sich ein signifikant größerer Anteil der biofilmbildenden

Stämme von S. epidermidis zum Zeitpunkt t1 im Vergleich zur Vergleichsgruppe (p<0,05).

0%

10%

20%

30%

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100%

t1 t2+3




40

Zum Zeitpunkt t2+3 ist dieser Anteil nachweislich wiederum signifikant höher als zum

Zeitpunkt t1 (p<0,05). (Abbildung 10)

Abbildung 10: Phänotypische Ausprägung der Biofilmbildung der Isolate von

S. epidermidis

3.5 Molekulargenetische Untersuchung mittels MLST

3.5.1 Pärchenanalyse der mecA-positiven Isolate von S. epidermidis

Bestimmte Rahmenkriterien legten die Auswahl der zur Bestimmung des Sequenztypes zu

untersuchenden Isolate fest. Die Selektion erfolgte innerhalb der Fraktionen der Oxacillin-

resistenten Isolate von S. epidermidis bei Probandinnen mit einem detektierten

prozentualen Anteil dieser resistenten Stämme von ≥30% der jeweiligen Gesamtheit der

Isolate von S. epidermidis zum Zeitpunkt t1 an den Händen der jeweiligen Probandin.

(Anhang V, Tabelle 29)

Anhand der Aufschlüsselung der entsprechend dem Screening Oxacillin-resistenten Isolate

von S. epidermidis im Bezug auf die Bildung von Biofilm und Protease (Anhang V,

Tabelle 30), wurden stichprobenartig Stellvertreter einzelner Unterfraktionen ausgewählt.

Die Stichprobenauswahl erfolgte im Sinne einer Pärchenanalyse, es wurden folglich Isolate

von Zeitpunkt t1 und t2+3 gewählt, welche denselben Phänotyp ausbildeten. Bei

Bestätigung des Phänotyps in den Kontrolluntersuchungen und positivem Nachweis des

mecA-Genortes erfolgte die Bestimmung des icaA-Genortes, sowie die Sequenzierung der

definierten sieben housekeeping Gene mittels MLST. Eine Anzahl von 14 Paaren von t1

und t2+3 wurde untersucht sowie zwei einzelstehende Proben von Zeitpunkt t2+3

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10%

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Vergleichsgruppe t1 t2+3

keine Biofilmbildung

Biofilmbildung


41

(Anhang V, Abbildung 12). In der Vergleichsgruppe wurden alle Oxacillin-resistenten

Isolate der weiteren Untersuchung zugeführt.

Es wurden zum Zeitpunkt t1 die Sequenztypen mit folgenden Häufigkeiten bestimmt:

ST5 8x, ST2 2x, ST35 1x, ST66 1x, ST89 1x und STneu 1x. Zum Zeitpunkt t2+3 wurden

folgende Häufigkeiten bestimmt: ST5 8x, ST22 3x, ST2 2x, ST190 2x und ST35 1x.

(Anhang V, Tabelle 31) Damit wurden phänotypische Stammpaare von 14 Probandinnen

untersucht, von welchen sieben Paare bezüglich Sequenztyp und icaA-Locus bestätigt

wurden. Sechs von diesen sieben Paaren wurden durch icaA-negative Stämme mit

Zuordnung zu ST5 repräsentiert. Sequenztyp 5 wurde insgesamt bei allen drei untersuchten

Phänotypkonstellationen bei Betrachtung der Proteaseaktivität und Biofilmbildung

detektiert. Zwei Paare von ST5 mit positivem Nachweis der Proteaseaktivitität und

negativer Biofilmbildung, zwei Paare von ST5 mit positivem Ergebnis der Protease- und

Biofilmbildung sowie zwei Paare von ST5 mit negativer Protease- und Biofilmbildung.

(Anhang V, Tabelle 31)

Ein Paar wurde durch den icaA-positiven ST2 gebildet. Die anderen sieben Paare

unterschieden sich trotz phänotypischer Übereinstimmung hinsichtlich des Sequenztyps

und vereinzelt auch hinsichtlich icaA. (Tabelle 14 und Anhang V, Tabelle 31)

In der Vergleichsgruppe wurden ST227 2x, ST59 1x und ST66 1x detektiert. In diesen

Isolaten war der Nachweis des icaA-Locus negativ.


42

Tabelle 14: Pärchenanalyse der Isolate von S. epidermidis mittels MLST

Eine Zeile repräsentiert ein nach dem Auswahlalgorithmus (Kapitel 3.5.1) untersuchtes

Pärchen. Die Pärchenbestätigung erfolgt unter Berücksichtigung des Sequenztypes und des

Nachweises des Genortes icaA. Die Ziffer „1“ bzw. „0“ bedeutet in der Spalte „Genort

icaA t1“ bzw. „Genort icaA t2+3“ den positiven bzw. negativen Nachweis dieses Genortes.

In der Spalte „Bestätigung eines Paares“ bedeutet „1“ eine Bestätigung und „0“ keine

Bestätigung eines Paares nach den vorliegenden Untersuchungskriterien. Nicht einbezogen

in die Tabelle sind die Ergebnisse der Vergleichsgruppe sowie die beiden einzelstehenden

Proben von Zeitpunkt t2+3.

3.5.2 Untersuchung der Verwandtschaftsgrade der detektierten Sequenztypen

Durch die Verwendung des eBURST-Algorithmus (Abbildung 11) wurden die in dieser

Studie detektierten Sequenztypen den international bekannten Sequenzclustern (Miragaia

et al., 2007; Li et al., 2009; Barbier et al., 2011) zugeordnet, wobei in dieser Dissertation

eine Beschränkung auf mecA-positive Stämme erfolgte.

Es zeigte sich, dass ST2 als Gründer des größten klonalen Komplexes CC2 und im

Speziellen dessen Cluster I auch in dieser Studie insgesamt viermal zum Zeitpunkt t1 und

t2+3 in der Untersuchungsgruppe nachgewiesen wurde. Die Sequenztypen ST22 und ST35

von t2+3 sind als jeweilige SLV von ST2 zu kategorisieren. ST5 ist der zentrale

Abstammungsgründer der Untergruppe II-5 des Clusters II und zeichnete sich in den

untersuchten Stichproben mit 16 Nachweisen zu t1 und t2+3 als der am häufigsten

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43

detektierte Sequenztyp aus. Der Gründer der Untergruppe II-89 ST89 wurde in den

Abstrichen von t1 detektiert.

ST190, welcher bei einer Probandin der Untersuchungsgruppe zum Zeitpunkt t2+3

zweimalig detektiert wurde, zeigt eine genetische Verwandtschaft von ST5 mit

Veränderung eines der sieben MLST-Genloci und ist damit der Untergruppe II-5

zugeordnet. Der in dieser Studie und international erstmalig nachgewiesene Stamm,

welcher in Abbildung 11 mit der Ziffer 3000 vorläufig und inoffiziell betitelt wurde, ist

durch die Veränderung zweier der sieben Genorte von ST5 entfernt.

In der Vergleichsgruppe wurde bei einer Probandin ST59 identifiziert, der dem Cluster II

und der Untergruppe II-5 zugeordnet werden kann. Dieser ist durch die Veränderungen

von zwei Genorten von ST5 entfernt. Bei der Probandin der Vergleichsgruppe, bei welcher

drei mecA-positive Isolate von S. epidermidis ermittelt wurden, zeigten sich der ST227

zweimal und der ST66 einmal. ST227 stellte sich in der eBURST-Abbildung als singleton

heraus, ST66 zeigt einen nahen Verwandtschaftsgrad zu dem in dieser Dissertation nicht

detektierten und nicht dem CC2 zuzuordnenden ST68 unter veränderter Struktur eines der

sieben Genloci. ST66 wurde auch zum Zeitpunkt t1 in der Untersuchungsgruppe einmalig

detektiert.

In Abbildung 11 lassen sich die folgenden Zusammenhänge optisch nachvollziehen: Zum

Zeitpunkt t1 ließen sich die Sequenztypen ST5, ST3000 bzw. STneu und ST89 dem CC2,

Cluster II, zuordnen, während ST2 als Gründer von CC2 dem Cluster I angehörig ist,

sowie sein nahe Verwandter ST35. Außerhalb des CC2 befindet sich ST66. Zum Zeitpunkt

t2+3 zeigten sich die Sequenztypen ST5 und ST190 als dem CC2, Cluster II zugehörig,

sowie ST2, ST22 und ST35 als genetische Schlüsselpunkte innerhalb CC2, Cluster I. Es

stellte sich zu beiden Zeitpunkten eine Tendenz zu eher verwandten Stämmen innerhalb

des CC2 dar, wobei zum Zeitpunkt t2+3 alle mittels MLST untersuchten Stämme dem

CC2 angehören. Die in der Vergleichsgruppe detektierten ST227, ST66 und ST59 zeigten

keine gemeinsame Zuordnung zu einer genetisch verwandten Gruppe.


44

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Diskussion

45

4 DISKUSSION

Im Rahmen dieser Dissertation sollte die Hautkolonisation der Hände von medizinischem

Personal neonatologischer Intensivstationen mit Koagulase-negativen Staphylokokken vor

und während der medizinischen Beschäftigung analysiert werden und diese mit einer

Vergleichsgruppe aus Probandinnen ohne Kontakt zum medizinischen System verglichen

werden.

Hierbei zeigte sich im Auftreten der Staphylokokkenspezies eine vergleichbare Vielfalt mit

drei bis elf Spezies in der Untersuchungsgruppe zum Zeitpunkt t1, eine bis sieben Spezies

zum Zeitpunkt t2+3 und fünf bis zehn Spezies in der Personengruppe ohne medizinischen

Kontakt. Aus diesem Spektrum kann noch keine konkrete Aussage zur Beeinflussung der

Handflora durch die Arbeit im nosokomialen Umfeld mit entsprechenden

Händehygienemaßnahmen abgeleitet werden. In einer Vergleichsstudie wurden mit zwölf

verschiedenen Spezies der KNS auf den Händen einer krankenhausfernen

Untersuchungsgruppe gegenüber elf unterschiedlichen Spezies der KNS auf den Händen

des Pflegepersonals neonatologischer Intensivstationen ebenfalls ähnliche Speziesanzahlen

der KNS detektiert (Aiello et al., 2003). Mikrobiomstudien befassen sich bereits

zunehmend mit der diversen Zusammensetzung der Hautflora (Grice et al., 2008, 2009;

Grice und Segre, 2011) und könnten in dieser konkreten Fragestellung zukünftig weiteren

Aufschluss über die Dynamik der Kolonisation im Bezug auf die Veränderung der Vielfalt

der Spezies durch eine Tätigkeit im nosokomialen Umfeld aufdecken.

Bei Betrachtung der Detektionshäufigkeiten der einzelnen Spezies der Staphylokokken in

Relation zur Gesamtzahl der isolierten und identifizierten Staphylococcus spp., konnten

schließlich fünf Spezies abgegrenzt werden, welche sowohl in den Abstrichen von t1 als

auch t2+3 und in der Vergleichsgruppe den größten Anteil darstellten. Hervorzuheben ist

das Ergebnis von S. epidermidis in der Untersuchungsgruppe mit 39,1% der detektierten

Staphylokokkenspezies zum Zeitpunkt t1, 60,1% zum Zeitpunkt t2+3 und 34,5% in der

Vergleichsgruppe. Die weniger dominierend nachgewiesenen Spezies relevanter

Fraktionsgrößen waren S. capitis sowie S. hominis, S. warneri und S. haemolyticus.

(Anhang II, Tabelle 21, Tabelle 22 und Tabelle 23).

Einerseits ist die Tatsache, dass Isolate der Spezies S. epidermidis im Gegensatz zu den

anderen Staphylokokkenspezies bei jeder einzelnen Probandin zum jeweils untersuchten

Zeitpunkt nachgewiesen wurde, ein in diesem Rahmen hervorstechendes Resultat und

signalisiert die hohe Bedeutsamkeit dieser Spezies als Normalflora in physiologischen und

pathophysiologischen Zusammenhängen. Die Abwehr einer Fehlbesiedlung durch


Diskussion

46

Interaktion mit S. epidermidis konnte bereits exemplarisch in der Suppression von

Propionibacterium acnes nachgewiesen werden (Wang et al., 2014). Stoffwechselprodukte

von S. epidermidis können inflammatorische Vorgänge der Haut hemmen und so in der

Rolle als schützende Mikroflora die Immunantwort der Haut regulieren (Lai et al., 2009)

und sogar die Wundheilung fördern (Lai et al., 2010).

Andererseits stellte sich hier darüber hinaus besonders eindrücklich die Prädominanz von

S. epidermidis in Form des Nachweises als insgesamt häufigste Spezies zum jeweiligen

Zeitpunkt der Untersuchungsgruppe sowie in der Vergleichsgruppe mit Steigerung des

Anteils im nosokomialen Umfeld dar. In einer Studie von Cook et al. (2007) wurde die

Prädominanz von S. epidermidis in der Handflora des Pflegepersonals zweier

verschiedener neonatologischer Intensivstationen nach vorheriger Reinigung mit

antiseptischer Seife bzw. alkoholischem Händedesinfektionsmittel mit Nachweis von

S. epidermidis in 36,3% der Gesamtzahl der mikrobiellen Isolate aller ProbandInnen

ebenfalls als häufigster Organismus der Flora der Untersuchungsgruppe herausgestellt,

wenngleich in einem letztlich geringeren Anteil als den in dieser Dissertation ermittelten

Ergebnissen.

Neben S. epidermidis zeigte auch die Spezies S. haemolyticus einen Anstieg des relativen

Anteils an der Staphylokokkengesamtheit von Zeitpunkt t1 (3,7%) zu t2+3 (9,6%). Parallel

zeichnete sich eine Fraktionsminderung von S. warneri, S. hominis und S. capitis und den

in geringeren Anteilen nachgewiesenen Staphylococcus spp. ab. (Kapitel 3.1).

Ein möglicher Grund dieser Entwicklung der Besiedlung der Haut durch bestimmte

Staphylococcus spp. könnte darin bestehen, dass die Hautreinigungsmaßnahmen gewisse

residente Spezies quantitativ relativ begünstigt, da beispielsweise die in der Tiefe der

Hautspalten lebenden Organismen nur eingeschränkt durch Hautreinigungsmaßnahmen

erreicht werden könnten, wie dies in der Definition der residenten Flora durch die World

Health Organization (2009) formuliert wurde. Dies würde bedeuten, dass nicht alle

Staphylokokkenspezies als gleichermaßen resident oder transient zu beurteilen wären. Die

variabel nachgewiesenen, geringer prävalenten Spezies erschienen dann als eher transiente

Hautflora, da sie eine vermeintlich große Beeinflussbarkeit durch Umweltfaktoren zeigten.

Die Fraktionsgrößen der fünf prädominanten Staphylokokkenspezies S. epidermidis (t1

39,1%, Vergleichsgruppe 34,5%), S. capitis, S. hominis, S. warneri und S. haemolyticus

offenbarten vergleichbare Nachweisraten in der Untersuchungsgruppe zum Zeitpunkt vor

dem Kontakt mit dem nosokomialen Umfeld und der Vergleichsgruppe. Konsekutiv


Diskussion

47

zeigten sich auch vergleichbare Unterschiede zu den im nosokomialen Umfeld ermittelten

Nachweisraten der Staphylococcus spp. des Zeitpunktes t2+3.

Die Ergebnisse signalisieren, dass eine Veränderung der Hautflora in Bezug auf die

Besiedlung mit Staphylokokken bereits in dem zwischen den Abstrichzeitpunkten t1 und

t2+3 liegenden Zeitraum von zwei bis drei Tagen im nosokomialen Umfeld erfolgt ist.

Andererseits zeigt diese Dynamik an, dass das medizinische Personal wiederum innerhalb

von fünf Tagen außerhalb des nosokomialen Umfeldes eine Flora entwickelt hatte, die im

Bezug auf die Nachweisrate der unterschiedlichen Staphylokokkenspezies deutliche

Ähnlichkeiten mit der Besiedlung krankenhausferner Bevölkerung zeigt.

Untersuchungen in den Niederlanden bestätigten, dass das Krankenhauspersonal im

Kontext der neonatologischen Intensivmedizin eine im Vergleich zu einer

krankenhausfernen Vergleichsgruppe veränderte Besiedlung durch KNS aufweist. Diese

wiederum wurde in einem Zeitraum eines krankenhausfernen Aufenthaltes durch in der

Vergleichsgruppe bekannte Stämme von KNS ersetzt. (Hira et al., 2010)

Die Untersuchung der Handflora des medizinischen Personals im Hinblick auf eine

Oxacillinresistenz und Biofilmbildung könnte nun nachfolgend Aufschluss über die

klinische Bedeutung der identifizierten Stämme geben.

Der relative Anteil der Oxacillin-resistenten Isolate von S. epidermidis ist zum Zeitpunkt

t2+3 mit 72,3% im Vergleich zu t1 mit 46% signifikant erhöht. Gegenüberstellend ist eine

Oxacillinresistenz bei Isolaten von S. epidermidis der Vergleichsgruppe ohne Bezug zum

medizinischen System sogar nur bei 1,2% der Isolate zu finden gewesen. Die hohe

Resistenzrate nosokomialer Stämme von S. epidermidis und S. haemolyticus (71,2%) zum

Zeitpunkt t2+3 (Abbildung 7 und Abbildung 8) ist mit der international bekannten

Resistenzrate dieser Stämme im nosokomialen Umfeld vergleichbar. So detektierten

Forscher bezüglich Isolaten aus Blutkulturen Neugeborener eine Oxacillinresistenz bei

S. epidermidis von 73,2% und bei S. haemolyticus von 85,7% (Pereira und Cunha, 2013)

sowie darüber hinaus sogar von 98% bei S. epidermidis und 100% bei S. haemolyticus von

Infektionsereignissen auf neonatologischen Intensivstationen (Brzychczy-Wloch et al.,

2013).

Bereits im Jahr 1986 konnte die Vermutung bestätigt werden, dass KNS auf den Händen

von Ärzten und Krankenpflegepersonal signifikant höhere Resistenzraten gegen

antimikrobielle Substanzen aufwiesen als KNS von den Händen des Personals mit

minimalem Patientenkontakt (Larson et al., 1986). 21 Jahre später wurde konkretisiert,


Diskussion

48

dass ein Anteil von 79% der KNS aus der Handflora medizinischen Personals von

neonatologischen Intensivstationen eine Oxacillinresistenz aufwies (Cook et al., 2007). In

Gegenüberstellung der Handflora des Pflegepersonals neonatologischer Intensivstationen

mit einer krankenhausfernen Vergleichsgruppe wurde darüber hinaus ermittelt, dass der

Anteil der gegen Oxacillin resistenten Isolate von S. epidermidis auf den Händen des

Pflegepersonals mit 90% signifikant größer war als in der Vergleichsgruppe mit 32%

(Aiello et al., 2003).

Neben der hohen Prävalenz der Oxacillinresistenz von S. epidermidis im nosokomialen

Umfeld per se zeigte sich in dieser Dissertation ebenfalls, dass die Prävalenz resistenter

Isolate signifikant unterschiedlich zwischen Pflegekräften (t1 46,0%, t2+3 72,3%) und

Menschen außerhalb des Gesundheitswesens (1,2%) ist. Hierzu gehört auch der Aspekt,

dass eine Oxacillinresistenz von S. epidermidis bei jeder einzelnen Probandin der

Untersuchungsgruppe zu beiden Zeitpunkten t1 und t2+3 nachweisbar ist (Anhang III,

Tabelle 24) und in der Vergleichsgruppe nur bei 2 Probandinnen detektiert wurde. Dies

bestätigt erneut die weite Verbreitung von Oxacillin-resistenten Stämmen von

S. epidermidis im nosokomialen Umfeld und beweist, dass Isolate mit dieser Eigenschaft

auch nach einem mehrtätigen Aufenthalt außerhalb des Krankenhauses noch in der Flora

des medizinischen Personals nachweisbar sind. Es wurde ebenfalls durch Hira et al. (2010)

bestätigt, dass die Nachweisrate von mecA und damit der Antibiotikaresistenz der KNS

nach dem Urlaub der ProbandInnen geringer ist als nach der Diensttätigkeit vor dem

Urlaub, sowie höher als in der krankenhausfernen Vergleichsgruppe.

Diese zu beiden Zeitpunkten gegebene hohe Prävalenz der Oxacillin-resistenten Stämme

von S. epidermidis in der Untersuchungsgruppe deutet an, dass es sich dabei um dieselbe

Population handeln könnte, diesbezüglich wurden weitere Untersuchungen mittels MLST

angeschlossen. Wandeln sich transiente Spezies aufgrund ihrer optimierten Eigenschaften

in eine residente Kolonisationsform um, wäre das Besiedlungsprofil möglicherweise

nachhaltig im Vergleich zu einer krankenhausfernen Vergleichsgruppe verändert. Ein

Selektionsdruck wäre in diesem spezifischen Fall durch den Kontakt mit antibiotischen

Substanzen und Händehygienemaßnahmen im nosokomialen Umfeld denkbar.

Aufgrund molekulargenetischer Untersuchungen konnten Forscher bereits ähnliche

Rückschlüsse im Bezug auf die Umwandlung transienter Besiedlungsformen Oxacillin-

resistenter S. epidermidis-Isolate in residente Flora auf den Händen medizinischen

Personals einer neonatologischen Intensivstation formulieren (Milisavljevic et al., 2005).

Es konnte bislang jedoch kein Zusammenhang zwischen der Nachweisrate der mecA-


Diskussion

49

positiven KNS und der Dauer des krankenhausfernen Aufenthaltes medizinischen

Personals definiert werden (Hira et al., 2010). Zukünftige Studien sollten daher der

interessanten Frage nachgehen, wie der zeitliche Rahmen für eine Verschiebung der

transienten Hautflora im Generellen und im Speziellen der Umwandlung zwischen

transienter Krankenhausflora zu residenter Hautflora ist.

Dies ist auch für die Hypothese von Bedeutung, dass es sich bei einer solchen Verbreitung

resistenter Stämme um ein genetisches Reservoir für die Verbreitung von Resistenzen und

damit Begünstigung komplikationsbehafteter Infektionen durch die überwiegend direkte

Übertragung dieser Mikroorganismen handelt. So wurde bereits die Schlussfolgerung

getroffen, dass vor allem die Organismen der ursprünglich transienten Flora aus dem

nosokomialen Umfeld aufgrund ihrer hohen Resistenzraten und Übertragbarkeit

ursächliche Erreger ernsthafter nosokomialer Infektionen sein können (Eksi et al., 2010).

Im Bezug auf die Prävalenzen der Oxacillin-resistenten Isolate von S. haemolyticus ist zu

erkennen, dass vormalige Trägerinnen dieser Stämme an Zeitpunkt t1 zum Zeitpunkt t2+3

keine nachweisbaren resistenten Isolate von S. haemolyticus mehr besaßen, während bei

Probandinnen, bei welchen zum Zeitpunkt t1 keine Oxacillin-resistenten Isolate von

S. haemolyticus detektiert wurden, zum Zeitpunkt t2+3 einen positiven Nachweis hatten

(Anhang III, Tabelle 25). Dies zeigt an, dass die entsprechenden Oxacillin-resistenten und

-sensiblen Stämme in der Zwischenzeit neu aufgenommen worden sein müssen und

deshalb Angehörige der transienten Flora sind. Tatsache ist, dass zum Zeitpunkt t2+3 ein

signifikant größerer Anteil der Oxacillin-resistenten Stämme von S. haemolyticus im

Vergleich zum Zeitpunkt t1 nachgewiesen wurde, ebenso wie bereits gezeigt werden

konnte, dass der relative Anteil von S. haemolyticus an allen Staphylococcus spp. von t1 zu

t2+3 signifikant zunahm. Es könnten hierbei mehrere Mechanismen von Relevanz gewesen

sein: Einerseits die vermehrte Aneignung der Isolate im Rahmen der transienten

Besiedlung und andererseits die Begünstigung der Etablierung spezieller Stämme durch

den Selektionsdruck des nosokomialen Umfeldes. Letzteres würde begründen, weshalb die

Nachweisrate speziell der Oxacillin-resistenten Isolate von S. haemolyticus zunahm.

Die Oxacillinresistenz der restlichen Staphylococcus spp. unter Ausschluss von

S. epidermidis und S. haemolyticus (Anhang III, Tabelle 26) stellte ebenfalls heraus, dass

die nachgewiesenen Oxacillin-resistenten Isolate einzelner Probandinnen der

Untersuchungsgruppe zum Zeitpunkt t1 im Verlauf durch sensible Stämme zum Zeitpunkt

t2+3 scheinbar ersetzt wurden und umgekehrt. Diese Beeinflussbarkeit durch

Umweltfaktoren im Generellen und die Händehygiene im Speziellen bestätigte erneut das


Diskussion

50

Verhalten dieser restlichen Staphylococcus spp. als eher transiente Flora, wie zu Beginn

anhand der epidemiologischen Vergleiche der verschiedenen Fraktionen der Zeitpunkte t1

und t2+3 überlegt wurde.

Grundsätzlich muss darauf hingewiesen werden, dass die Probengewinnung durch

Abstrichentnahme eine einfache, schnelle und nicht-invasive Technik darstellt, jedoch

nicht die darüber hinaus gehende tiefe Kolonisation der Haut in z.B. Haarfollikeln

wiedergeben kann. Es werden eher die oberflächlich lokalisierten Stämme erfasst, welche

per definitionem in höherer Austauschrate mit dem Umfeld stehen (Grice et al., 2008).

Dies ist in diesem Zusammenhang jedoch auch der Vorteil der Methode, da eine

Mischflora aus transienten und residenten Isolaten gewonnen und auf ihre Beschaffenheit

hin untersucht werden konnte.

Im Rahmen des phänotypisierenden Screenings der Staphylokokken wurde auch die

Ausbildung des Biofilms untersucht. Die Ausprägung des Phänotyps einer Population von

Staphylokokken schwankt bekannterweise in Abhängigkeit von Umweltparametern wie

z.B. der Temperatur, Osmolalität, pH, Licht, Sauerstoffverhältnisse und vorhergehenden

Kontakt zu Betalaktamantibiotika (Matthews und Stewart, 1984). Es wurde in der

vorliegenden Arbeit jedoch davon ausgegangen, dass Klone einer Spezies unter

standardisierten Laborbedingungen konsekutiv einen gleichartigen Phänotyp zeigen.

Da mittlerweile die Fähigkeit zur Biofilmbildung als ein Schlüsselfaktor der Virulenz vor

allem von S. epidermidis und im Rahmen Katheter-assoziierter Infektionen angesehen wird

(Stefani und Varaldo, 2003), beschränkte sich die quantitative Auswertung in der

vorliegenden Arbeit auf diese Spezies. Es zeigten sich signifikant erhöhte Anteile der zum

Zeitpunkt t1 gewonnenen biofilmbildenden Isolate (57,2%) im Vergleich zur

Vergleichsgruppe (41,7%) und wiederum der zum Zeitpunkt t2+3 gewonnenen Stämme

(66,7%) im Vergleich zu t1 (Kapitel 3.4).

Es wäre theoretisch denkbar, dass im Rahmen der Prävalenzzunahme und des zum

jeweiligen Zeitpunkt erhöhten relativen Anteils von S. epidermidis an allen

Staphylococcus spp., Stämme dieser Spezies, welche zudem Biofilme ausbildeten, in ihrer

Anzahl und damit ihrem relativen Anteil zunahmen. Eine mögliche Begründung ist die

gegen Abtragung und äußere Einflüsse schützende Wirkung des Biofilms. Der höhere

Anteil biofilmbildender Isolate in der Untersuchungsgruppe zum Zeitpunkt t1 gegenüber

der Vergleichsgruppe deutet ebenfalls darauf hin, dass sich ein Anteil der biofilmbildenden

Isolate auf den Händen des medizinischen Personals als residente Flora etabliert hat. Dies


Diskussion

51

markiert erneut eine Kolonisationsverschiebung der Hautisolate des medizinischen

Personals zu Staphylokokkenisolaten mit bestimmten Eigenschaften, welche dem

nosokomialen Umfeld zu entstammen scheinen.

Auf der Grundlage der erläuterten klinischen Bedeutung nosokomial verbreiteter

Oxacillin-resistenter bzw. biofilmbildender Stämme von S. epidermidis und des

herausgestellten Verdachtes, dass medizinisches Personal als Überträger solcher Stämme

langfristiger durch derartige Isolate kolonisiert sein könnte, wurde eine genotypisierende

Untersuchung ausgewählter Oxacillin-resistenter Isolate von t1 und t2+3 mittels MLST

durchgeführt.

Die molekulargenetische Pärchenanalyse könnte anhand mecA-positiver Isolate von

S. epidermidis mit vergleichbarem Phänotyp (Anhang V, Tabelle 30 und Abbildung 12)

diesen klonalen Zusammenhang belegen und damit die These einer residenten

Hautbesiedlung mit solchen pathogenen Isolaten bei Personen im medizinischen Bereich

unterstützen. Es stellte sich heraus, dass mit der genannten Methode sieben von 14 Paaren

hinsichtlich ihre Sequenztypes und des Vorhandenseins bzw. Fehlens des icaA-Locus

übereinstimmten (Anhang V, Tabelle 31). In diesen Fällen ist neben der Kontamination der

Hände auf der Arbeit auch eine bereits erfolgte Umwandlung einer transienten

Kolonisationsform zur residenten Flora möglich. Trotz Auswahl unterschiedlich

phänotypischer Pärchen wurde der Sequenztyp 5 bei den drei möglichen verschiedenen

phänotypischen Konstellationen detektiert. Die untersuchten Isolate enthielten

nachweislich nicht den Locus icaA (Kapitel 3.5.1 und Anhang V, Tabelle 31). Innerhalb

der klonalen Linie ST5 gibt es folglich Subklone mit unterschiedlichem Verhalten. Die

beiden Isolate des ST190, einer SLV von ST5, welche zum Zeitpunkt t2+3 detektiert

wurden, zeigten ein ähnliches Verhalten und bildeten innerhalb der Abstriche einer

Probandin zwei unterschiedliche Phänotypen aus. Erster wurde als Biofilmbildner

detektiert, das andere Isolat als Biofilm-negativ. In beiden Stämmen konnte der Genort

icaA ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Aufgrund des fehlenden icA-Locus ist

anzunehmen, dass die Biofilmbildung des ST5 sowie seiner SLV ST190 aufgrund der PIA-

unabhängigen Produktion in der Screening-Untersuchung andersartig ausgeprägt ist. Eine

derartige Protein-vermittelte Biofilmbildung scheint eine signifikant schwächere Adhärenz

zu erzeugen (Rohde et al., 2007), dies könnte die variable Nachweisbarkeit der Fähigkeit

zur Biofilmbildung begründen.


Diskussion

52

Die verbliebenen sieben phänotypischen Paare ließen sich durch Sequenzierung nicht in

Übereinstimmung bringen. Eine Schlussfolgerung auf eine residente oder transiente

Kolonisationsform konnte bei diesen Stämmen nicht getroffen werden, da das

Vorhandensein deckungsgleicher Sequenztypen zu den verschiedenen Abstrichzeitpunkten

nicht über die Stichproben hinaus geprüft wurde. Eine größere Stichprobenerhebung

mittels MLST würde hier weiteren Aufschluss geben.

Folglich lässt der charakterisierte Phänotyp nicht auf den Sequenztyp schließen,

wenngleich singuläre Klone von ST5 und ST2 in der Pärchenanalyse ein identisches und

reproduzierbares Verhalten zeigten.

Eine besondere Konstellation der phänotypischen Fraktionen der Oxacillin-resistenten

Isolate stellte sich bei einer einzelnen Probandin heraus (Anhang V, Abbildung 12). Zum

Zeitpunkt t2+3 war ein hoher Anteil Biofilm- und Protease-bildender Stämme nachweisbar

(n=31/65, Tabelle 30), der zum Zeitpunkt t1 nicht nachgewiesen werden konnte. Dies

erscheint als exemplarische Darstellung der Neuaufnahme eines phänotypisch differenten

Kollektivs und unterschied sich molekulargenetisch als icaA-positiver ST2 auch auf dieser

Ebene von dem in der Biofilm- und Protease-negativen Unterfraktion zu beiden Zeiten

beispielhaft nachgewiesenen icaA-negativen Sequenztyp 5.

Insgesamt ist der Sequenztyp 5 zu den Zeitpunkten t1 und t2+3 unter den Oxacillin-

resistenten mecA-positiven Isolaten von S. epidermidis mit insgesamt 16 Stämmen (53,3%)

am häufigsten detektiert worden, jedoch kein einziges Mal in der Vergleichsgruppe.

Zugleich wurde bei sechs von sieben bestätigten Pärchen der Sequenztyp 5 nachgewiesen.

Dementsprechend kann aufgrund der hohen stichprobenartigen Nachweisrate innerhalb der

Oxacillin-resistenten Isolate eine insgesamt hohe Prävalenz in dieser Fraktion mit

entsprechend variabler Biofilmbildung vermutet werden. Dies signalisiert eine bedeutsame

Dominanz in der Handflora des medizinischen Personals, auch noch nach mehrtägigem

Aufenthalt fern des nosokomialen Umfeldes. Hinzu kommt, dass eine Assoziation dieses

Sequenztypes zu Infektionen bereits bekannt ist (Miragaia et al., 2007).

Miragaia et al. (2007) äußerten die Vermutung, die epidemischen klonalen

Abstammungslinien könnten sich vor allem durch Rekombinationen entwickelt haben.

Diese schließen die Übertragung mobiler genetischer Elemente wie SCCmec ein und

dienen der Anpassung an variierende Lebensbedingungen, einschließlich der verbesserten

Fähigkeiten zur Kolonisation und Resistenzentwicklungen gegenüber dem

Wirtsimmunsystem. Zudem scheinen Stämme innerhalb CC2 eine insgesamt höhere


Diskussion

53

Transfer- bzw. Rekombinationsrate genetischen Materials aufzuweisen. Die genomische

Plastizität und dadurch ermöglichte Anpassung an die Umweltbedingungen bei

Selektionsdruck könnte letztlich auch im Rahmen der Umwandlung transienter in residente

Flora durch Begünstigung der Besiedlung der Haut durch bestimmte Stämme relevant sein.

Weitere Studien sollten ein möglicherweise erhöhtes Vorkommen von ST5 im

medizinischen Umfeld anhand umfangreicherer genotypisierender Untersuchungen klären

und versuchen, weitere Kausalitäten einer solchen Dominanz zu ergründen.

Es zeigte sich, dass der Sequenztyp 2 als Gründer des CC2 und im Speziellen von dessen

Cluster I und als international zeitweise am häufigsten isolierter und damit am weitesten

verbreiteter nosokomial nachgewiesener Sequenztyp (Miragaia et al., 2007) auch in dieser

Studie insgesamt viermal zum Zeitpunkt t1 und t2+3 in der Untersuchungsgruppe

nachgewiesen wurde. Das phänotypische Erscheinen war im Rahmen dieser Dissertation

immer gleich – Biofilm- und Protease-positiv. In der Pärchenanalyse konnte ein Pärchen

mit dem Sequenztyp 2 gefunden werden.

Klonale Analysen mittels MLST von infektionsassoziierten Isolaten von S. epidermidis aus

einem chinesischem Krankenhaus zeigten ebenfalls den Schwerpunkt der mecA-positiven

Isolate bei ST2, wobei zudem der Genotyp bezüglich ica untersucht wurde. Dieser war bei

diesem Sequenztyp, wie auch in der vorliegenden Studie, positiv. (Li et al., 2009) In

weiteren Untersuchungen wurde eine Assoziation von mecA- und icaA-positiven Isolaten

mit ST2 zu schweren Verläufen Katheter-assoziierter Septitiden bestätigt (Cherifi et al.,

2013). Die genetische Grundlage der Fähigkeiten zur Biofilmbildung und

Antibiotikaresistenz kann den Stämmen von S. epidermidis mit ST2 einen

Selektionsvorteil bieten sowie die Verbreitung im Umfeld des Krankenhauses erleichtern

und dadurch indirekt Katheter-assoziierte Infektionen und Bakteriämien fördern. (Li et al.,

2009; Hira et al., 2010; Cherifi et al., 2013)

Eine im Jahr 2011 durchgeführte Untersuchung von Barbier et al. zeigte eine Dominanz

von ST59 und ST5 und eine im Vergleich hierzu geringere Nachweisrate von ST2.

Untersucht wurden MRSE Stämme von Nasenabstrichen ambulanter Patienten in fünf

Ländern, welche weniger als acht Stunden Kontakt mit dem nosokomialen Umfeld hatten

(Ruppé et al., 2009). Es konnten häufige Sequenztypen der SCCmec-positiven Isolate von

S. epidermidis identifiziert werden. Hierzu gehörten die in dieser Dissertation ebenfalls

detektierten ST59, ST5, ST89 und ST2 (Barbier et al., 2011). Eine Fortsetzung der

molekular-epidemiologischen Untersuchungen wiederum klinischer Isolate von


Diskussion

54

S. epidermidis innerhalb der USA bildete eine Studie von 2012 (Mendes et al., 2012). Die

überwiegenden Sequenztypen stellten ST5 und ST2 dar. Ebenfalls wurde ST59 detektiert.

Andernorts wurden im Rahmen der Untersuchung von Infektions-assoziierten Isolaten die

Sequenztypen ST89, ST59 und ST66 detektiert (Li et al., 2009).

Der Sequenztyp 59 sowie 66 wurde in dieser Dissertation jeweils einmalig unter den

mecA-positiven Isolaten von S. epidermidis in der Vergleichsgruppe, fern des

nosokomialen Umfeldes, identifiziert. ST66 wurde zudem einmal an t1 detektiert. Der

Sequenztyp 89 wurde einmalig in der Untersuchungsgruppe zu t1 detektiert, folglich zu

einem Zeitpunkt, an welchem der Kontakt mit dem noskomialen Umfeld auf ein

geringstmögliches Maß reduziert sein sollte. Eine Zuordnung dieser Sequenztypen ST59

und ST89 und ST66 ist bei diesen heterogenen Ergebnissen zu einem krankenhausfernen

bzw. ambulanten oder nosokomialen Umfeld noch nicht möglich. Weitere Untersuchungen

sind zur Zuordnung in einen der Bereiche erforderlich.

Einzelne vorangegangene Studien stellten eine international weitere Verbreitung von ST2

im Vergleich zu ST5 und sämtlichen anderen Sequenztypen im Sinne einer höheren

Detektionsrate heraus (Miragaia et al., 2007, 2008; Li et al., 2009). Dieses konnte in dieser

Studie in einem solchen Verhältnis nicht abgebildet werden, ursächlich scheint eine lokale

Dominanz von ST5 zu sein. Bestimmte Sequenztypen wurden ebenso international

regionenbezogen nachgewiesen (Miragaia et al., 2007). Diesbezüglich wird an dieser

Stelle jedoch auf die quantitativen Einschränkungen der jeweiligen Studien in der Auswahl

der untersuchten Stämme hingewiesen. Die durch Miragaia et al. (2007) gesammelten

Proben aus 17 Ländern schlossen Isolate von Infektionen vielfältiger Krankheitsbilder als

auch Isolate von Besiedlungen ein, wobei unterschiedliche Anzahlen von Isolaten aus den

jeweiligen Regionen gleichermaßen in die Auswertung einbezogen wurden. Letztlich

beschränkten sich die Proben von Li et al. (2009) auf Isolate im Rahmen von Infektionen

eines einzigen Krankenhauses. Im Gesamtkontext konnte diese Dissertation jedoch mittels

MLST beweisen, dass innerhalb der Oxacillin-resistenten S. epidermidis Isolate von

Handabstrichen des medizinischen Personals weltweit erfolgreiche, nosokomiale

Infektionserreger nachweisbar sind.

In einer vorangegangenen medizinischen Dissertation derselben Arbeitsgruppe von Hercuń

(2011) wurde Untersuchungsmaterial mittels Abklatschplatten in Wohnkomplexen bzw.

unmittelbar vor oder auf den Stationen von Krankenhäusern in Deutschland und Polen

gewonnen. Sieben von neun als ST5 identifizierte Isolate wurden in Lübeck gewonnen,

während nur einer von sieben Stämmen von ST2 in Lübeck gefunden wurde (Hercuń,


Diskussion

55

2011). Hier bestätigt sich die Vermutung einer Ortsdominanz des Sequenztyps 5 in

Lübeck, welche zuvor mit den vorliegenden Ergebnissen der Handabstriche des

medizinischen Personals geäußert wurde.

In der Dissertation von Hercuń (2011) zeigte sich ebenfalls, dass die acht Stämme des ST5,

die ausschließlich dem Krankenhausmilieu entstammten, einen positiven Nachweis von

mecA erhielten. Das gleichzeitige Vorhandensein des Genortes icaA in einem Stamm

dieses Sequenztypes konnte nicht nachgewiesen werden. Unter den sieben Isolaten des

ST2 wurden bei fünf Stämmen die gleichzeitige Anwesenheit von icaA und mecA bestätigt.

Diese Isolate wurden zugleich im Krankenhaus isoliert. (Hercuń, 2011) Dies zeigt eine

bemerkenswerte Deckungsgleichheit mit den vorliegenden Sequenzierungsergebnissen der

von den Händen des medizinischen Personals gewonnenen Proben. Keiner der mecA-

positiven Stämme des Sequenztypes 5 erhielt einen positiven Nachweis für icaA, während

bei den mecA-positiven Isolaten des Sequenztypes 2 der icaA-Locus nachgewiesen wurde.

In einer weiteren Dissertation von Knaack (2015) wurde eine Prädominanz des mecA-

positiven und icaA-negativen ST5 in der Kolonisierung der Neugeborenen auf denselben

neonatologischen Intensivstationen identifiziert (Knaack, 2015). Diese Resultate verleiten

in der Zusammenschau dazu, Kontaminations- und Verbreitungswege von leblosen

Oberflächen über die Hände des medizinischen Personals auf die Haut der

neonatologischen Patienten et vice versa zu vermuten. Aktuelle Studien untermauern

genau diese Annahme. In Belgien wurde zuletzt ermittelt, dass ein Drittel der Katheter-

assoziierten Bakteriämien auf Isolate zurückzuführen waren, welche vergleichbar auf den

Händen des Pflegepersonals identiziert wurden, in diesem Kontext ist vorrangig der

Sequenztyp 5 zu nennen (Cherifi et al., 2014). Nebenbefundlich zeigte sich auch hier, dass

die Abwesenheit des ica Operons mit einer schwachen Biofilmbildung einherging.

Weitere genetische Analysen sind nun notwendig, um die klonale Verbreitung von

S. epidermdis genauer zu untersuchen und lokale bzw. geographisch übergreifende Klone

charakterisieren zu können.


Zusammenfassung

56

5 ZUSAMMENFASSUNG

Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) gehören zur normalen Hautflora des

Menschen und werden beim Gesunden als schützend angesehen. Einige KNS, vornehmlich

S. epidermidis und S. haemolyticus, sind in der Lage, sogenannte Biofilme auf Polymer-

Oberflächen implantierter medizinischer Fremdkörper auszubilden und somit zu

Fremdkörper-assoziierten Infektionen zu führen. Darüber hinaus ist die Ausbildung einer

Resistenz gegenüber einer antibiotischen Therapie ein wichtiger Pathogenitätsfaktor. Die

Mikroorganismen werden durch Körperkontakt übertragen, sodass in dieser Dissertation

die Flora der Hände des medizinischen Personals auf eine Besiedlung mit den genannten

Bakterien untersucht wurde. In der Analyse der Abstriche von den Händen medizinischen

Personals vor dem Dienst und während der Schicht, mittels Kultivierung des Materials,

Identifizierung der mikrobiellen Isolate und Ermittlung der Oxacillinresistenz und

Biofilmbildung zeigte sich eine Zunahme der Hautbesiedlung durch S. epidermidis mit

39,1% der Staphylokokkenisolate vor dem Dienst und 60,1% im Dienst. In der

Vergleichsgruppe wurde ähnlich zum Zeitpunkt vor dem Dienst ein Anteil von 34,5% der

Staphylokokkenisolate durch S. epidermidis gebildet. Bei allen medizinisch tätigen

ProbandInnen war bereits vor Beginn der Dienstzeit ein Anteil Oxacillin-resistenter Isolate

von S.epidermidis an den Händen nachweisbar, insgesamt 46,0% der Isolate von

S.epidermidis zu diesem Zeitpunkt. Der relative Anteil Oxacillin-resistenter Isolate dieser

Spezies nahm während der Arbeit im Krankenhaus zusätzlich zu (72,3%). Die Prävalenz

Oxacillin-resistenter Isolate von S. epidermidis stellte sich hierbei als signifikant

unterschiedlich zwischen Pflegekräften und Menschen außerhalb des Gesundheitswesens

(1,2%) dar (p<0,05).

Innerhalb der resistenten Isolate des Pflegepersonals finden sich die weltweit als

erfolgreiche nosokomiale Infektionserreger identifizierten Klone von S. epidermidis der

Sequenztypen 2 und 5 nach dem aktuellen MLST-Schema. In den hier ermittelten

Ergebnissen zeigte sich eine Ortsdominanz des mecA-positiven Sequenztypes 5. Eine

Sequenztypisierung 14 phänotypischer Paare der mecA-positiven Stämme von

S. epidermidis zum Zeitpunkt vor und im Dienst weist in der Hälfte der Paare eine

Übereinstimmung des Sequenztypes nach. Bei diesen Pflegekräften ist neben der

Kontamination auf der Arbeit auch eine bereits stattgehabte Umwandlung der Besiedlung

durch diese Stämme von einer transienten zu einer residenten Kolonisationsform möglich.


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Anhang

67

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Anhang

68

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Anhang

69

Tabelle 17: Epidemiologie der Nicht-Staphylokokken in der Vergleichsgruppe

Aufgeführt sind die Spezies, welche zum einmaligen Zeitpunkt in der Vergleichsgruppe

detektiert wurden. Die Spalten repräsentieren die einzelnen Probandinnen. Die Detektion

wurde mit der Ziffer „1“ bezeichnet, wobei in diesem Zusammenhang keine Aussage über

die Quantität der Spezies getroffen wird.

Spezies n (

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)

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Pro

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)

Acinetobacter spp. 1 1 1 1 4 40

Aerococcus spp. 1 1 1 3 30

Anaerococcus spp. 1 1 2 20

Bacillus spp. 1 1 1 1 1 1 1 1 8 80

Brevibacterium spp. 1 1 10

Corynebacterium spp. 1 1 1 1 1 1 6 60

Kocuria spp. 1 1 1 1 4 40

Lactobacillus spp. 1 1 2 20

Micrococcus spp. 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 100

Moraxella spp. 1 1 2 20

Neisseria spp. 1 1 1 3 30

Paenibacillus spp. 1 1 2 20

Pantoea spp. 1 1 2 20

Pseudomonas spp. 1 1 1 1 4 40

Rothia spp. 1 1 1 1 4 40

Streptococcus spp. 1 1 1 1 1 5 50


Anhang

70

II Staphylokokken-Vielfalt

Tabelle 18: Staphylokokken-Vielfalt zum Zeitpunkt t1

Es sind die absoluten und relativen Anteile der einzelnen Spezies an der Gesamtheit der

isolierten Staphylokokken der Abstriche der Untersuchungsgruppe vor Dienstantritt

aufgeführt.

Spezies n (Isolate) % (Isolate)

S. epidermidis 750 39,10

S. capitis 368 19,19

S. hominis 346 18,04

S. warneri 253 13,19

S. haemolyticus 70 3,65

S. saprophyticus 22 1,15

S. aureus 18 0,94

S. lugdunensis 14 0,73

S. equorum 7 0,36

S. auricularis 5 0,26

S. cohnii 5 0,26

S. xylosus 4 0,21

S. carnosus 3 0,16

S. succinus 3 0,16

S. pettenkoferi 1 0,05

S. condimenti 1 0,05

S. vitulinus 1 0,05

S. caprae 1 0,05

S. sciuri 0 0,00

S. pasteuri 0 0,00

S. arlettae 0 0,00

N.D. 46 2,40

total 1872 100,00


Anhang

71

Tabelle 19: Staphylokokken-Vielfalt zum Zeitpunkt t2+3


isolierten Staphylokokken der Abstriche der Untersuchungsgruppe im Dienst aufgeführt.






S. warneri 52 2,94

S. aureus 20 1,13


S. cohnii 2 0,11

S. equorum 2 0,11


S. lugdunensis 0 0

S. pettenkoferi 0 0

S. condimenti 0 0

S. xylosus 0 0

S. carnosus 0 0

S. succinus 0 0

S. vitulinus 0 0

S. sciuri 0 0

S. pasteuri 0 0

S. caprae 0 0

S. arlettae 0 0

N.D. 8 0,45

total 1758 100,00


Anhang

72

Tabelle 20: Staphylokokken-Vielfalt in der Vergleichsgruppe


isolierten Staphylokokken der Abstriche der Vergleichsgruppe zum einmaligen Zeitpunkt

aufgeführt.



S. warneri 189 19,69




S. equorum 23 2,40

S. xylosus 16 1,67

S. cohnii 10 1,04

S. lugdunensis 10 1,04


S. aureus 4 0,42


S. pettenkoferi 1 0,10

S. sciuri 1 0,10

S. pasteuri 1 0,10

S. arlettae 1 0,10

S. condimenti 0 0

S. carnosus 0 0

S. succinus 0 0

S. vitulinus 0 0

S. caprae 0 0

N.D. 31 3,23

total 960 100


Anhang

73


zum Zeitpunkt t1

Dies ist anhand absoluter Zahlen n und dem prozentualen Anteil der Trägerinnen

ersichtlich.

Spezies n (Probandin) % (Probandin)

S. epidermidis 20 100

S. capitis 20 100

S. hominis 19 95

S. warneri 14 70

S. haemolyticus 13 65

S. saprophyticus 6 30

S. aureus 3 15

S. lugdunensis 5 25

S. equorum 3 15

S. auricularis 2 10

S. cohnii 1 5

S. xylosus 2 10

S. carnosus 1 5

S. succinus 1 5

S. pettenkoferi 1 5

S. condimenti 1 5

S. vitulinus 1 5

S. caprae 1 5

S. sciuri 0 0

S. pasteuri 0 0

S. arlettae 0 0

N.D. 8 40


Anhang

74


zum Zeitpunkt t2+3


ersichtlich.



S. hominis 16 80

S. capitis 17 85


S. warneri 7 35

S. aureus 4 20


S. cohnii 2 10

S. equorum 1 5

S. auricularis 1 5

S. lugdunensis 0 0

S. pettenkoferi 0 0

S. condimenti 0 0

S. xylosus 0 0

S. carnosus 0 0

S. succinus 0 0

S. vitulinus 0 0

S. sciuri 0 0

S. pasteuri 0 0

S. caprae 0 0

S. arlettae 0 0

N.D. 4 20


Anhang

75


der Vergleichsgruppe


ersichtlich.



S. warneri 8 80

S. hominis 10 100

S. capitis 10 100


S. equorum 2 20

S. xylosus 2 20

S. cohnii 3 30

S. lugdunensis 3 30


S. aureus 2 20

S. auricularis 1 10

S. pettenkoferi 1 10

S. sciuri 1 10

S. pasteuri 1 10

S. arlettae 1 10

S. condimenti 0 0

S. carnosus 0 0

S. succinus 0 0

S. vitulinus 0 0

S. caprae 0 0

N.D. 4 40


Anhang

76

III Oxacillinresistenz

Tabelle 24: Phänotypische Oxacillinresistenz der Isolate von S. epidermidis zum

Zeitpunkt t1 und t2+3

Aufgelistet sind die absoluten Stammzahlen. Die Zeilen repräsentieren die Zuordnung zu

einzelnen Probandinnen.

t1 t1 t2+3 t2+3

S. epidermidis

Oxacillin-resistent

S. epidermidis

Oxacillin-sensibel

S. epidermidis

Oxacillin-resistent

S. epidermidis

Oxacillin-sensibel

1 21 14 7

30 17 33 19

28 5 62 3

6 14 63 0

13 51 3 23

6 24 47 9

2 36 10 75

10 21 7 10

22 18 6 52

15 11 76 13

11 10 86 5

32 3 65 18

34 41 11 10

2 7 32 2

28 13 90 1

19 17 47 5

67 16 32 12

4 21 35 8

1 46 2 5

14 13 46 17

total 345 405 767 294


Anhang

77

Tabelle 25: Phänotypische Oxacillinresistenz der Isolate von S. haemolyticus zum

Zeitpunkt t1 und t2+3



t1 t1 t2+3 t2+3

S. haemolyticus

Oxacillin-resistent

S. haemolyticus

Oxacillin-sensibel

S. haemolyticus

Oxacillin-resistent

S. haemolyticus

Oxacillin-sensibel

0 3 1 7

0 4 0 0

0 25 1 0

0 0 33 0

0 3 29 0

4 0 0 4

0 0 0 2

0 2 1 0

0 0 1 27

0 2 1 0

0 0 2 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 1 0 0

1 6 0 1

0 10 15 0

0 0 37 0

0 3 0 0

0 1 0 3

0 5 0 5

total 5 65 121 49


Anhang

78

Tabelle 26: Phänotypische Oxacillinresistenz der Staphylokokken Isolate unter

Ausschluss von S. epidermidis und S. haemolyticus zum Zeitpunkt t1 und t2+3



t1 t1 t2+3 t2+3

sonstige S. species

Oxacillin-resistent

sonstige S. species

Oxacillin-sensibel

sonstige S. species

Oxacillin-resistent

sonstige S. species

Oxacillin-sensibel

0 71 0 67

0 44 1 43

2 36 0 4

15 61 0 0

1 28 0 18

52 10 8 28

0 58 0 9

0 62 0 78

1 55 0 10

0 68 1 5

5 70 0 3

7 54 0 13

0 21 0 75

2 84 0 62

0 48 0 4

0 50 2 27

0 13 7 8

6 62 0 0

0 48 0 34

0 64 3 25

total 91 1007 22 513


Anhang

79

IV Biofilmbildung


S. epidermidis in der Untersuchungsgruppe

Die Zeilen repräsentieren die Zuordnung zu einzelnen Probandinnen.

t1 t1 t2+3 t2+3

keine

Biofilmbildung Biofilmbildung

keine


5 17 11 10

11 36 15 37

8 25 5 60

8 12 34 29

36 28 11 15

10 20 12 44

14 24 12 73

6 25 8 9

26 14 3 55

4 22 27 62

4 17 6 85

35 0 51 32

35 40 11 10

8 1 6 28

16 25 69 22

15 21 11 41

57 26 22 22

7 18 3 40

7 40 5 2

9 18 31 32

total 321 429 353 708

keine


38 13

8 9

25 7

10 37

26 21

20 32

38 1

14 10

6 0

8 8

total 193 138

Tabelle 28: Anzahl der

biofilmbildenden und nicht-

biofilmbildenden Isolate von

S. epidermidis in der

Vergleichsgruppe

Die Zeilen repräsentieren die

Zuordnung zu einzelnen

Probandinnen.


Anhang

80

V Phänotypdifferenzierung

Zei

tpun

kt

% Anteil der Oxacillin-resistenten

Isolate von S. epidermidis an

allen Staphylokokken der

Probandin zum jeweiligen

Zeitpunkt

% Anteil der Oxacillin-resistenten

Isolate von S. epidermidis an allen

Isolaten von S. epidermidis der

Probandin zum jeweiligen Zeitpunkt

t1 1,0 4,5

t2+3 14,6 66,7

t1 31,6 63,8

t2+3 34,4 63,5

t1 29,2 84,9

t2+3 88,6 95,4

t1 6,3 30,0

t2+3 65,6 100,0

t1 13,5 20,3

t2+3 4,1 11,5

t1 6,3 20,0

t2+3 49,0 83,9

t1 2,1 5,3

t2+3 10,4 11,8

t1 10,5 32,3

t2+3 7,3 41,2

t1 22,9 55,0

t2+3 6,3 10,3

t1 15,6 57,7

t2+3 79,2 85,4

t1 11,5 52,4

t2+3 89,6 94,5

t1 33,3 91,4

t2+3 67,7 78,3

t1 35,4 45,3

t2+3 11,5 52,4

t1 2,1 22,2

t2+3 33,3 94,1

t1 29,2 68,3

t2+3 93,8 98,9

t1 19,8 52,8

t2+3 49,0 90,4

t1 69,8 80,7

t2+3 33,3 72,7

t1 4,2 16,0

t2+3 81,4 81,4

t1 1,0 2,1

t2+3 4,5 28,6

t1 14,6 51,9

t2+3 47,9 73,0

Tabelle 29:

Relative Anteile

der Oxacillin-

resistenten Isolate

von S. epidermidis

Aufgelistet sind

die prozentualen

Anteile der

Oxacillin-

resistenten Isolate

von S. epidermidis

an allen

Staphylokokken

und an allen

Isolaten von

S. epidermidis der

jeweiligen

Probandinnen der

Untersuchungs-

gruppe zum

jeweiligen

Zeitpunkt. Die

Untergliederungen

repräsentieren die

Zuordnung zu

einzelnen

Probandinnen.

Nicht einbezogen

in die Tabelle sind

die Ergebnisse der

Vergleichsgruppe.


Anhang

81

Tabelle 30: Phänotpyische Differenzierung der Oxacillin-resistenten Isolate von

S. epidermidis

Phänotypisch aufgegliederte Merkmale sind die Biofilmbildung und Proteasebildung der

im Screening Oxacillin-resistenten Isolate. Dies dient als Grundlage für die

Säulendiagramme in Abbildung 12. Die Untergliederungen repräsentieren die Zuordnung

zu einzelnen Probandinnen. Nicht einbezogen in die Tabelle sind die Ergebnisse der

Vergleichsgruppe.

Zei

tpun

kt

kei

ne

Bio

film

bil

dung

kei

ne

Pro

teas

ebil

dung

kei

ne

Bio

film

bil

dung

Pro

teas

ebil

dung

Bio

film

bil

dung k

eine

Pro

teas

ebil

dung

Bio

film

bil

dung

Pro

teas

ebil

dung

t1 0 4 3 23

t2+3 0 4 0 29

t1 3 4 0 21

t2+3 0 3 0 59

t1 0 1 0 9

t2+3 0 4 0 3

t1 0 8 0 14

t2+3 0 2 0 4

t1 0 2 0 13

t2+3 0 21 0 55

t1 0 1 0 10

t2+3 0 4 0 82

t1 31 1 0 0

t2+3 29 4 1 31

t1 0 13 0 21

t2+3 0 3 0 8

t1 6 2 0 20

t2+3 62 7 0 21

t1 0 1 0 18

t2+3 0 8 0 39

t1 0 45 0 22

t2+3 0 21 0 11

t1 0 6 0 8

t2+3 0 26 0 20


Anhang

82

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

t1 t2+3 t1 t2+3

t1 t2+3 t1 t2+3

t1 t2+3 t1 t2+3

t1 t2+3 t1 t2+3


Anhang

83

Abbildung 12: Darstellung der phänotypischen Charakterisierung Oxacillin-

resistenter Isolate von S. epidermidis.

Differenziert wird nach Biofilmbildung und Proteasebildung. Dies basiert auf den

absoluten Zahlen der Tabelle 29. Die mit einem Pfeil markierten Fraktionen wurden für die

Stichprobenauswahl im Rahmen der Sequenzierung ausgewählt. Ein Balkenpaar

repräsentiert die Zuordnung zu einer Probandin der Untersuchungsgruppe. Nicht

einbezogen in die Darstellung sind die Ergebnisse der Vergleichsgruppe.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

t1 t2+3 t1 t2+3

t1 t2+3 t1 t2+3


Anhang

84

Tabelle 31: Sequenztypen und Identifikation des icaA-Genortes der phänotypischen

Pärchen von S. epidermidis

Diesbezüglich untersucht wurden Stichproben der mecA-positiven Oxacillin-resistenten

Stämme von S. epidermidis (Kapitel 3.5.1). Die Ziffer "1" bedeutet Ausbildung des

Merkmals bzw. positiver Nachweis des Genortes icaA, die Ziffer "0" bedeutet Negativität

in der phänotypischen Screeninguntersuchung bzw. kein Nachweis des Genortes icaA. Die

Untergliederungen repräsentieren die Zuordnung zu einzelnen Probandinnen. Nicht

einbezogen in die Tabelle sind die Ergebnisse der Vergleichsgruppe.

.

Zei

tpun

kt

Oxac

illinre

sist

enz

Pro

teas

ebildun

g

Bio

film

bildun

g

Seq

uen

ztyp

Gen

ort

icaA

t1 1 1 1 5 0

t2+3 1 1 1 22 1

t1 1 1 1 35 1

t2+3 1 1 1 22 1

t1 1 1 0 5 0

t2+3 1 1 0 5 0

t1 1 1 0 5 0

t2+3 1 1 0 5 0

t1 1 1 1 5 0

t2+3 1 1 1 5 0

t1 1 1 1 2 1

t2+3 1 1 1 5 0

t1 1 0 0 5 0

t2+3 1 1 1 2 1

t2+3 1 0 0 5 0

t1 1 1 1 5 0

t2+3 1 1 1 22 1

t1 1 1 1 2 1

t2+3 1 1 1 2 1

t1 1 0 0 5 0

t2+3 1 0 0 5 0

t1 1 1 1 5 0

t2+3 1 1 1 5 0

t1 1 1 1 neu 0

t2+3 1 1 1 35 1

t1 1 1 0 66 0

t2+3 1 1 0 5 0

t1 1 1 0 89 0

t2+3 1 1 1 190 0

t2+3 1 1 0 190 0


Danksagung

85

DANKSAGUNG

In erster Linie danke ich meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Johannes K.-M. Knobloch für

die jahrelange geduldige und fürsorgliche Unterstützung. Durch seine Anleitung und

wissenschaftliche Erfahrung konnte immer eine Lösung für komplizierte Sachverhalte

gefunden werden.

Herrn Prof. Dr. med. Werner Solbach danke ich für die bereitwillige Aufnahme als

medizinische Doktorandin und die Anregungen zur Auseinandersetzung mit Thematiken

der Medizinischen Mikrobiologie über die vorliegende Dissertation hinaus.

Ebenso danke ich der AG Knobloch für die herzliche Aufnahme, Einarbeitung und

hilfsbereite Betreuung in der Zeit meiner Tätigkeit im Labor.

Dies gilt auch für die Mitarbeiter des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und

Hygiene. Ich konnte mich mit methodischen Fragen immer an sie wenden.

Selbstverständlich danke ich all meinen Probandinnen in und außerhalb des

Krankenhauses, ohne diese wäre die Dissertation in der Form nicht möglich gewesen.

Mein besonderer Dank gilt auch den Stationsleitungen, welche mir zur Koordination der

Probengewinnung immer mit Rat zur Seite standen. Diesbezüglich danke ich auch Herrn

Prof. Dr. med. Christoph Härtel, durch ihn entstand der bahnende Kontakt zu meinen

Probandinnen.

Ich danke Dennis Knaack, der mir von Beginn meiner Dissertation an bis heute geduldig

mit Rat und Tat zur Seite steht und mich in allen Lebenslagen unterstützt.

Nicht zuletzt danke ich meiner Familie, im Besonderen meiner Mutter und meinem Bruder,

für die ausdauernde Begleitung und Ermutigung während meines Studiums und der Zeit

meiner Doktorarbeit im Speziellen.

Ich danke dem Institut für Klinische Molekularbiologie der Christian-Albrechts-Universität

zu Kiel für die Durchführung der Sanger-Sequenzierung, unterstützt durch die Deutsche

Forschungsgesellschaft, Exzellenzcluster „Inflammation at Interfaces“ und „Future Ocean“

und in diesem Rahmen gilt mein Dank auch S. Greve and I. Baumgartner für die

technische Untersützung.


Lebenslauf

86

LEBENSLAUF

Clarissa Bahr

Angaben zur Person:

Geburtsort: München

Staatsangehörigkeit: deutsch

Ausbildung und beruflicher Werdegang:

06/2007 Allgemeine Hochschulreife

Note sehr gut (1,4), Gymnasium Bad Essen

10/2007 – 12/2013 Studium der Humanmedizin an der Universtität zu Lübeck

09/2009 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note sehr gut (1,5)

12/2013 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note sehr gut (1,5)

Seit 02/2012 Doktorandin am Institut für Medizinische Mikrobiologie und

Hygiene, Prof. Dr. med. Werner Solbach

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen

Personals,

Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck,

Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. Johannes K.-M. Knobloch

12/2013 Approbation als Ärztin

Seit 01/2014 Assistenzärztin und wissenschaftliche Mitarbeiterin in der

Klinik für Augenheilkunde

Universitätsklinikum Münster der Westfälischen

Wilhelmsuniversität Münster

Seit 2014 Betreuung der Tumorsprechstunde und Susac-Erkrankung

Zusatzqualifikationen und Aktivitäten:

10/2007 Wahl zur Semestersprecherin

11/2008 - 06/2009 Studentische Hilfskraft am Institut für Anatomie im Rahmen

der makroskopischen Anatomie (Präparierkursbetreuung)


Lebenslauf

87

10/2011 Workshop „Problemorientieres Lernen“ (POL)

Sektion Medizin - Bereich Hochschuldidaktik

Leitung eines Tutoriums im Rahmen der

Unterrichtsveranstaltung Klinische Umweltmedizin

11/2014 Vortrag „AMD – Krankheit, Verlauf, Therapie“

AMD-Symposium, Pro Retina Deutschland e.V., Soest

04/2015 Consilium Diagnosticum „Mukoviszidose und

Nachtblindheit“

Münsteraner Fortbildung für Augenärzte, Münster

Veröffentlichungen:

Bahr C, Härtel C, Knobloch J. Transiente und residente Flora an den Händen

medizinischen Personals. Poster. Uni im Dialog – Lübecker Doktorandentag, Universität

zu Lübeck, Lübeck, 2012

Humborg E, Isphording A, Knaack D, Bahr C, Solbach W, Knobloch J. Evaluation of

a rapid PBP2a assay using a highly diverse MRSA population. Journal of Clinical

Microbiology and Infection, 2015 (submitted)

Documents

Transiente und residente Flora an den Händen medizinischen ... · Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med