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394 WISSENSCHAFT · SPECIAL: ZELLBIOLOGIE BIOspektrum | 04.12 | 18. Jahrgang JÖRG P. MÜLLER 1 , ASTRID PETERMANN 1 , CHRISTIAN MAWRIN 2 , FRANK-D. BÖHMER 1 1 INSTITUT FÜR MOLEKULARE ZELLBIOLOGIE, UNIVERSITÄTSKLINIKUM JENA 2 INSTITUT FÜR NEUROPATHOLOGIE, UNIVERSITÄTSKLINIKUM MAGDEBURG Protein tyrosine phosphatases (PTP) counteract the enzymatic activity of protein tyrosine kinases. Impaired activity of some members of the PTP family has been found in cancer cells of different malignancies. We have characterized defects in the function of a PTP which negatively regulates the receptor tyrosine kinases FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3), and PDGFR (platelet-derived growth factor receptor) in acute myeloid leukae- mia and meningioma cells. DOI: 10.1007/s12268-012-0200-1 © Springer-Verlag 2012 Protein-Tyrosinphosphatasen als Regulatoren von zellulären Signalprozessen ó Die Tyrosinphosphorylierung von Protei- nen ist ein wesentlicher molekularer Schalter zur Weiterleitung von zellulären Signalen. So wird z. B. die Übertragung mitogener oder motogener Signale sehr häufig durch Reak- tionsketten gewährleistet, in denen Protein- phosphorylierungen durch Protein-Tyrosin- kinasen (PTK) eine entscheidende Rolle spie- len. Das Ausmaß der Tyrosinphosphorylie- rung bestimmter Proteine wird dabei durch das Gleichgewicht zwischen PTK-vermittel- ter Phosphorylierung und Rückreaktion durch Protein-Tyrosinphosphatasen (PTP) bestimmt. Die Mitglieder der PTP-Familie werden durch etwas mehr als 100 Gene codiert. Zu den PTP gehören transmembranale PTP (receptor-like PTP, rPTP) und lösliche (non-receptor PTP, nPTP), „klassische“ PTP, die ausschließlich Phosphotyrosin hydrolysieren (38 Gene), und dual-spezifische Phosphatasen (sogenannte DUSP), die auch Phosphoserin und Phos- phothreonin sowie teilweise andere Substra- te dephosphorylieren können [1]. Die PTP- vermittelte Katalyse hängt bei allen Mitglie- dern der Familie von einem hochreaktiven Cysteinrest im aktiven Zentrum ab. Im Wei- teren fokussieren wir uns auf die Bespre- chung der klassischen PTP. In vielen Fällen führen Dephosphorylie- rungen durch klassische PTP zur Inaktivie- rung von Signaltransduktionsvorgängen. Ein sehr gut untersuchtes Beispiel hierfür ist die negative Regulation des Insulinrezeptors, einer Rezeptortyrosinkinase (RTK), durch die nicht-transmembranale PTP1B. PTP1B-defi- ziente Mäuse zeigen eine erhöhte Insulin- responsivität [2]. Jedoch wurde für einige PTP gezeigt, dass sie eine positive Rolle in Sig- nalwegen spielen. Das am besten verstande- ne PTP-Molekül mit einer solchen Funktion ist die SH2-Domänen-PTP SHP-2 [3, 4]. Die Rolle von PTP in der Onkogenese Wie oben skizziert, kontrolliert die reversi- ble Tyrosinphosphorylierung von Signal- transduktions-Komponenten zelluläre Pro- zesse wie Proliferation, Adhäsion, Migration oder Apoptose. Die Störung dieses Gleichge- wichts durch eine gesteigerte PTK-Aktivität Fehlerhafte Regulation von Protein-Tyrosinphosphatasen Tumorzellen – Vehikel mit defekten Bremsen ¯ Abb. 1: Regulation der Aktivität der Protein- Tyrosinkinase FLT3. Durch die extrazelluläre Bindung des FLT3-Liganden FL wird FLT3 dime- risiert und aktiviert. Dies führt zu einer multi- plen Transautophosphorylierung des dimeren Komplexes, die in einer Aktivierung der Signal- wege RAS/ERK und PI3K/AKT resultiert. Die membranständige Protein-Tyrosinphosphatase DEP-1 wird an den aktivierten Rezeptor rekru- tiert, dephosphoryliert Phosphotyrosinreste und inaktiviert somit FLT3 und dessen Signal- transduktion.

Tumorzellen — Vehikel mit defekten Bremsen

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394 WISSENSCHAFT · SPECIAL: ZELLBIOLOGIE

BIOspektrum | 04.12 | 18. Jahrgang

JÖRG P. MÜLLER1, ASTRID PETERMANN1, CHRISTIAN MAWRIN2,

FRANK-D. BÖHMER1

1INSTITUT FÜR MOLEKULARE ZELLBIOLOGIE, UNIVERSITÄTSKLINIKUM JENA2INSTITUT FÜR NEUROPATHOLOGIE, UNIVERSITÄTSKLINIKUM MAGDEBURG

Protein tyrosine phosphatases (PTP) counteract the enzymatic activity ofprotein tyrosine kinases. Impaired activity of some members of the PTPfamily has been found in cancer cells of different malignancies. We havecharacterized defects in the function of a PTP which negatively regulatesthe receptor tyrosine kinases FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3), andPDGFR (platelet-derived growth factor receptor) in acute myeloid leukae-mia and meningioma cells.

DOI: 10.1007/s12268-012-0200-1© Springer-Verlag 2012

Protein-Tyrosinphosphatasen alsRegulatoren von zellulärenSignalprozessenó Die Tyrosinphosphorylierung von Protei-nen ist ein wesentlicher molekularer Schalterzur Weiterleitung von zellulären Signalen. Sowird z. B. die Übertragung mitogener odermotogener Signale sehr häufig durch Reak-

tionsketten gewährleistet, in denen Protein-phosphorylierungen durch Protein-Tyrosin-kinasen (PTK) eine entscheidende Rolle spie-len. Das Ausmaß der Tyrosinphosphorylie-rung bestimmter Proteine wird dabei durchdas Gleichgewicht zwischen PTK-vermittel-ter Phosphorylierung und Rückreaktion durchProtein-Tyrosinphosphatasen (PTP) bestimmt.

Die Mitglieder der PTP-Familie werden durchetwas mehr als 100 Gene codiert. Zu den PTPgehören transmembranale PTP (receptor-likePTP, rPTP) und lösliche (non-receptor PTP,nPTP), „klassische“ PTP, die ausschließlichPhosphotyrosin hydrolysieren (38 Gene), unddual-spezifische Phosphatasen (sogenannteDUSP), die auch Phosphoserin und Phos-phothreonin sowie teilweise andere Substra-te dephosphorylieren können [1]. Die PTP-vermittelte Katalyse hängt bei allen Mitglie-dern der Familie von einem hochreaktivenCysteinrest im aktiven Zentrum ab. Im Wei-teren fokussieren wir uns auf die Bespre-chung der klassischen PTP.

In vielen Fällen führen Dephosphorylie-rungen durch klassische PTP zur Inaktivie-rung von Signaltransduktionsvorgängen. Einsehr gut untersuchtes Beispiel hierfür ist dienegative Regulation des Insulinrezeptors,einer Rezeptortyrosinkinase (RTK), durch dienicht-transmembranale PTP1B. PTP1B-defi-ziente Mäuse zeigen eine erhöhte Insulin-responsivität [2]. Jedoch wurde für einige PTPgezeigt, dass sie eine positive Rolle in Sig-nalwegen spielen. Das am besten verstande-ne PTP-Molekül mit einer solchen Funktion istdie SH2-Domänen-PTP SHP-2 [3, 4].

Die Rolle von PTP in der OnkogeneseWie oben skizziert, kontrolliert die reversi-ble Tyrosinphosphorylierung von Signal-transduktions-Komponenten zelluläre Pro-zesse wie Proliferation, Adhäsion, Migrationoder Apoptose. Die Störung dieses Gleichge-wichts durch eine gesteigerte PTK-Aktivität

Fehlerhafte Regulation von Protein-Tyrosinphosphatasen

Tumorzellen – Vehikel mit defektenBremsen

¯ Abb. 1: Regulation der Aktivität der Protein-Tyrosinkinase FLT3. Durch die extrazelluläreBindung des FLT3-Liganden FL wird FLT3 dime-risiert und aktiviert. Dies führt zu einer multi-plen Transautophosphorylierung des dimerenKomplexes, die in einer Aktivierung der Signal-wege RAS/ERK und PI3K/AKT resultiert. Diemembranständige Protein-TyrosinphosphataseDEP-1 wird an den aktivierten Rezeptor rekru-tiert, dephosphoryliert Phosphotyrosinresteund inaktiviert somit FLT3 und dessen Signal-transduktion.

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ist ein für viele Tumorerkrankungen rele-vanter Aspekt der Onkogenese. In den letz-ten Jahren ist klar geworden, dass auch dieEinschränkung der Phosphatase-Aktivität ein-zelner PTP zur onkogenen Transformationbeitragen kann [5, 6]. Die dazu beitragendenMechanismen umfassen Deletionen, Allel-verlust (Haploinsuffizienz) und Punktmuta-tionen, die zu einer Inaktivierung der enzy-matischen Aktivität der PTP führen. Aberauch die epigenetische Stilllegung von PTP-Promotoren ist beschrieben worden. PTP, wel-che mitogene Signalprozesse positiv regulie-ren, können dagegen in deregulierter Formals Onkoproteine fungieren. Durch Mutatio-nen konstitutiv aktivierte Formen von SHP-2spielen eine solche Rolle bei der JuvenilenMyelomonozytischen Leukämie (JMML) undwurden auch in anderen Tumorerkrankun-gen beobachtet.

Wir wollen im Folgenden einige neuereBefunde aus unserer Arbeitsgruppe zur Rol-le der rPTP DEP-1 (density-enhanced phos-phatase) im Kontext von zwei Tumorerkran-kungen darstellen.

Regulation von FLT3 durch PTP undAkute Myeloische LeukämieDie RTK FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3) wirdin hämatopoetischen Stammzellen und frü-hen Vorläuferzellen der myeloischen und lym-phoiden Reihe exprimiert. FLT3 spielt einewichtige Rolle für Proliferation, Überlebenund Differenzierung dieser Zellen. Durch dieBindung des FLT3-Liganden (FL) wird FLT3dimerisiert und aktiviert. In der Folge wer-den für RTK typische Signalwege aktiviert,wie die RAS/ERK- und die PI3K/AKT-Kaska-de (Abb. 1). FLT3 ist in den letzten Jahrenintensiv untersucht worden, weil bei unge-fähr einem Drittel von Patienten, die an Aku-ter Myeloischer Leukämie (AML) erkranktsind, somatische Mutationen in FLT3 dia-gnostiziert werden. Diese resultieren in einerkonstitutiven Liganden-unabhängigen Akti-vierung dieser RTK. Vielfältige Untersu-chungen haben gezeigt, dass diese Mutatio-nen zur leukämischen Transformation bei-tragen. Da nicht bekannt war, welche PTP ander Regulation der FLT3-Signaltransduktionbeteiligt sind, haben wir in hämatopoetischen

Zelllinien durch stabile Transduktion vonshRNA (short hairpin-RNA)-Genen die Expres-sion von 20 verschiedenen PTP permanentunterdrückt und die Aktivierung und Signal-transduktion von FLT3 untersucht. Dabei wur-de DEP-1 (PTPRJ, CD148) als FLT3-inhibie-rende PTP identifiziert und charakterisiert.DEP-1 ist eine rPTP, deren extrazelluläreDomäne aus Fibronektin-ähnlichen Repeatsbesteht und die intrazellulär eine einzelnekatalytische Domäne mit hoher intrinsischerAktivität besitzt. Die Depletion von DEP-1resultierte in murinen und menschlichenAML-Zelllinien in einer Erhöhung der Phos-phorylierung von verschiedenen FLT3-Tyro-sinen. Die Hyperphosphorylierung von FLT3war von einer erhöhten FLT3-abhängigenAktivierung von ERK und erhöhter Zellproli-feration begleitet. Durch Ko-Immunpräzipi-tation und Dephosphorylierungsexperimentekonnten wir zeigen, dass FLT3 und DEP-1direkt interagieren (Abb. 1, [7]). Hat dieseWechselwirkung eine Relevanz für die Trans-formation von AML-Zellen? Der Verlust vonDEP-1 in „Wildtyp“-FLT3-exprimierenden Zel-

len war von einer schwachen Zelltransfor-mation in vitro begleitet, reichte jedoch nichtaus, um eine myeloproliferative Erkrankungin einem Mausmodell auszulösen. In Zellen,die eine onkogene Version von FLT3 expri-mierten, fanden wir jedoch eine Dysfunktionvon DEP-1, die durch reversible Oxidation deskatalytisch aktiven Cysteins verursacht war[10]. Die Wiederherstellung der DEP-1-Akti-vität hatte einen abschwächenden Effekt aufdie Zelltransformation in vitro und im Tier-

modell [8]. DieseErgebnisse zeigen,dass der Verlust derFunktion von DEP-1– im Zusammenwir-ken mit weiterenonkogenen Läsionen– einen Beitrag zurleukämischen Trans-formation leistenkann.

DEP-1-Verlust inMeningeomzellenerhöht dieMotilität undInvasivitätDEP-1 wurde in glat-

ten Muskelzellen und Fibroblasten als Regu-lator der Phosphorylierung von Rezeptorendes Wachstumsfaktors aus Blutplättchen (pla-telet-derived growth factor, PDGF) identifiziert.PDGF-Rezeptoren (PDGFR) sind in Meninge-omen häufig aktiviert. Könnte ein Verlust vonDEP-1-Aktivität dafür eine Rolle spielen? Inder Tat wiesen ca. 50 Prozent der von unsuntersuchten Meningeome einen als loss ofheterozygosity nachweisbaren Allelverlust desDEP-1-codierenden PTPRJ-Gens sowie niedri-

ge DEP-1-Proteinspiegel auf. Um die funktio-nellen Konsequenzen des DEP-1-Verlustes zuanalysieren, wurde in DEP-1-exprimierendenMeningeomzellen die PTP durch stabileshRNA-Expression supprimiert. Dies führtezu einer Steigerung der PDGF-stimuliertenZellmigration und der generellen Motilitätder Zellen sowie zu einer erhöhten PDGFR-Signaltransduktion (nicht gezeigt). DEP-1 istalso auch in diesen Zellen ein Negativregu-lator der PDGFR-RTK. Interessanterweise wur-de in Meningeomzellen auch eine Regulationvon Integrin-vermittelten Prozessen festge-stellt: So zeigten DEP-1-depletierte Zellen einereduzierte Anzahl und veränderte Lokalisa-tion von Zell-Matrix-Kontakten (Abb. 2A) undeine reduzierte Phosphorylierung von Paxil-lin, Hand in Hand mit einer herabgesetztenAdhäsion der Zellen an verschiedene Matri-zes. Nach orthotoper Xenotransplantation in Mäuse wiesen die DEP-1-depletierten Zellenim Vergleich zu DEP-1-exprimierenden Zel-len ein invasiveres Wachstum auf (Abb. 2B).Diese Befunde deuten auf eine wichtige Rol-le von DEP-1 für die Unterdrückung einesinvasiven Phänotyps des Meningeoms hin[9]. Wir nehmen an, dass diese Funktion inkombinierter Weise sowohl über eine ne gativeRegulation von PDGFR-Signalaktivität als

˚ Abb. 3: Darstellung von Signaltransduktionsvorgängen, die für dieDEP-1-vermittelte Kontrolle von Zellmotilität, Adhäsion und Invasivitätwichtig sind. DEP-1 dephosphoryliert die Protein-Tyrosinkinase PDGFR,wodurch Zellmigration-stimulierende Signalwege unterdrückt werden.Durch die Regulation der Phosphorylierung von Fokaladhäsionsprotei-nen (FAK, focal adhesion kinase), vermutlich über die Dephosphorylie-rung von C-terminalen inhibitorischen Phosphotyrosinen von Src-Fami-lie-Kinasen (SFK), wird der Integrin-Komplex und die Bindung an FN(Fibronektin) aktiviert. GEFs (guanine nucleotide exchange factors)regulieren die mit der Zelladhäsion und -migration verbundene Aktin-Polymerisation. Erhöhte Motilität und verringerte Zell-Matrix-Adhäsionin DEP-1-defizienten Zellen tragen zu einem invasiven Phänotyp vonMeningeomzellen bei.

˚ Abb. 2: Die Protein-Tyrosinphosphatase DEP-1 fördert die Zell-Matrix-Adhäsion von Meningeomzellen und hemmt invasives Wachs-tum. A, Meningeomzellen der Linie KT21-MG1, in denen die DEP-1-Expression durch stabile Expression von short hairpin-RNA (shRNA)unterdrückt wurde (rechts), bzw. Zellen, welche eine Kontroll-shRNAexprimieren (links), wurden auf Fibronektin-beschichtete Träger immo-bilisiert und fixiert. Zur Visualisierung und Quantifizierung der Zell-Matrix-Kontakte wurden Paxillin und Vinculin immunologisch detek-tiert. Zellen mit unterdrückter DEP-1-Expression zeigen weniger undschwächere Signale, was eine verminderte Bildung von fokalen Adhä-sionen anzeigt. B, invasives Wachstum von DEP-1-depletierten Menin-geomzellen der Linie KT21-MG1. Die Zellen wurden stereotaktisch inden präfrontalen Cortex von NMRI-nu/nu-Mäusen transplantiert. DiePfeile markieren den Bereich, in dem die Invasion der DEP-1-defizientenKT21-MG1-Zellen in das Hirngewebe stattgefunden hat. Kontrollzellenwaren zu einer derartigen Invasion nicht in der Lage [9].

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BIOspektrum | 04.12 | 18. Jahrgang

BIOspektrum | 04.12 | 18. Jahrgang

AUTORENJörg P. MüllerBiologiestudium an den Universitäten Rostock und Dresden. 1984–1987 Arznei-mittelwerk Dresden. 1988–1991 Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimen-telle Therapie in Jena, DDR-Akademie der Wissenschaften, 1989 Promotion(Dr. rer. nat.). 1991–1995 Postdoc in Groningen, Niederlande und Newcastle, UK.1996–2002 Assistenz an der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät an der Univer-sität Jena, 2001 Habilitation im Fach Molekularbiologie. Seit 2003 Institut für Mo-lekulare Zellbiologie, Universitätsklinikum Jena.

Christian Mawrin1992–1998 Medizinstudium an der Universität Magdeburg. 2000 Promotion (Dr.med.). 2005 Facharzt für Neuropathologie und Habilitation. 2006–2008 W2-Pro-fessur und Leitung der Abteilung Neuropathologie am Universitätsklinikum Jena.Seit 2008 Direktor des Instituts für Neuropathologie, Universitätsklinikum Magde-burg.

Astrid PetermannBiochemiestudium an der Universität Jena, 2007–2010 Promotion (Dr. rer. nat.)am Institut für Molekulare Zellbiologie, Universitätsklinikum Jena. 2011 Postdoc inder AG Experimentelle Rheumatologie, Universitätsklinikum Jena, anschließend amInstitut für Molekulare Zellbiologie.

Frank-D. Böhmer1975 Biochemiestudium, Universität Halle, 1980 Promotion (Dr. rer. nat.), Zentral-institut für Molekularbiologie, Berlin-Buch, DDR-Akademie der Wissenschaften.1992–1997 Projektleiter, Max-Planck-Arbeitsgruppe „Signaltransduktion vonWachstumsfaktoren“, Jena. 1995 Habilitation in Biochemie. Seit 2001 Dozent fürMolekulare Zellbiologie, Institut für Molekulare Zellbiologie am Universitätsklini-kum Jena.

auch über eine positive Regulation von fokalen Adhäsionsfunktionen realisiertwird (Abb. 3).

DanksagungWir danken unseren verschiedenen Koope-rationspartnern in den besprochenen Pro-jekten und der Deutschen Krebshilfe undder Deutschen Forschungsgemeinschaftfür finanzielle Unterstützung. ó

Literatur[1] Tonks NK (2006) Protein tyrosine phosphatases: fromgenes, to function, to disease. Nat Rev Mol Cell Biol7:833–846[2] Elchebly M, Payette P, Michaliszyn E et al. (1999)Increased insulin sensitivity and obesity resistance inmice lacking the protein tyrosine phosphatase-1B gene.Science 283:1544–1548[3] Müller JP, Schönherr C, Markova B et al. (2008) Roleof SHP2 for FLT3-dependent proliferation and transforma-tion in 32D cells. Leukemia 22:1945–1948[4] Neel BG, Gu H, Pao L (2003) The ‘Shp’ing news: SH2domain-containing tyrosine phosphatases in cell signa-ling. Trends Biochem Sci 28:284–293[5] Julien SG, Dube N, Hardy S et al. (2011) Inside thehuman cancer tyrosine phosphatome. Nat Rev Cancer11:35–49

[6] Östman A, Hellberg C, Böhmer FD (2006) Protein-tyrosine phosphatases and cancer. Nat Rev Cancer 6:307–320[7] Arora D, Stopp S, Böhmer SA et al. (2011) Protein-tyrosine phosphatase DEP-1 controls receptor tyrosinekinase FLT3 signaling. J Biol Chem 286:10918–10929[8] Godfrey R, Arora D, Bauer R et al. (2012) Cell trans-formation by FLT3 ITD in acute myeloid leukemia invol-ves oxidative inactivation of the tumor suppressor pro-tein-tyrosine phosphatase DEP-1/PTPRJ. Blood 119:4499–4511[9] Petermann A, Haase D, Wetzel A et al. (2011) Loss ofthe protein-tyrosine phosphatase DEP-1/PTPRJ drivesmeningioma cell motility. Brain Pathol 21:405–418[10] Östman A, Frijhoff J, Sandin A et al. (2011)Regulation of protein tyrosine phosphatases by reversibleoxidation. J Biochem 150:345–356

Korrespondenzadresse:PD Dr. Jörg P. MüllerUniversitätsklinikum JenaZentrum für Molekulare BiomedizinInstitut für Molekulare ZellbiologieHans-Knöll-Straße 2D-07745 JenaTel.: 03641-939-5634Fax: 03641-932-5652joerg.mueller2@med.uni-jena.dewww.zellbiologie.uni-jena.de/cms