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260 Brockmann, Grubhofer, Kass, Kalbe: [Jahrg. 84 9-Phenyl-3-benzyl-5.6-benz-isoalloxazin 9 - Phen y I - 5.6 -be nz - i SO all o xaz i n 1) wurde in Waaser aufgeschwemmt und durch Zutropfen von verd. Natronlauge in Liisung gebracht. Die iiberschiiss. Natronlauge wurde dans durch Zugsbe von verd. Salpetersiiureneutralisiert, bis eine geringe Triibung auftrat. Nd dem Filtrieren wurde mit Silbenitrat-Lijsung im UberschuB versetzt, der entatan- dene Niedcrschlag zentrifugiert, zweimal mit Alkohol + Ather ausgewaschen uhd scharf getrocknet. 0.3g dieses Silbersalzes wurden in iiberschuss. Benzylchlorid 6 Stdn. gekocht, dann daa Benzylcblorid i. Vak. abdestilliert und der Riiokstand mit Chloroform ausgezogen. Der nach dem Verdampfen des Chloroforms verbliebene Riickstand wurde wiederholt aus Benzol umkristallisiert. hhgefarbene Nadeln vom Schmp. 318-319O; Ausb. 0.14 g. C,H,O&V”, (430.4) Ber. N 13.01 Gef. ”12.80 - ~______ -- ___ __ ~__ 38. Hans Brockmann, Nikolsus Grubhofer, Wilhelm K8Ss und Hans K a1 b e: Uber das Acti.nomycin C (Antibiotic8 8us Actinomyceten, V. Mitteil.+)) [Aus dem Organisch-Chemischen Inetitut der Universitat Gottingen] (Eingegangen am 6. November 1950) Am einer bisher unbekannten Streptomyees-Art, die a18 Str. eliryso- niallus bezeichnet ist, wurde Actinomycin C, ein rotea Antibioticum, isoliert, daa Unterschiede gegeniiber Actinomycin A und B aufweist. Durch energische Siiui-ehydrolyae leseen aich aus Actinomycin C sechs Aminosiiuren abspalten, die ala Z-Threonin, d-Valin, Sarkosin, d- Allo-isoleucin, l-F’rolin und N-Methyl-l-valin identifiziert wurden. Bei der Hydrolyse rnit Bsriumhydroxyd entsteht eine rote, kriatalli- sierte Verbindung, die dem chromophoren Teil dea Actinomycins C entstammt. Die Actinomycinesind eine neuartige Grnppe von Natur- stoffen, in denen eine chromophore Komponente wehmheinlich peptidartig mit vemchiedenen AminosBuren verbunden ist. I.) Einleitung Bei unseren Untersuchungen uber Antibiotics aus Actinomyceten stieI3en wir auf einen Streptomyces-Stamm’), dessen gelbe Kulturloeung gegen Staphylo- coccus azweus bakteriostatisch stark wirksam war. Durch Extraktion der Niihr- losung mit Butylacetat und chromatographische Adsorption von dessen Ver. dampfungsriickstand konnte eine gut kristnllisierte, alizarinrote Verbindung mit dem Schmp. 2520 und [a]:: -309O (*3O) isoliert werden, die his zur Ver- dunnung 1 : IOOOOO00 das Wacbtum von Staphylococcus aureus und bis *) 1.-IV. Mitteil.: Naturwies. 86, 376 [1949], 37, 138, 492, 494 [1960]. Anm. d. Redaktion: Die in dieser Arbeit benutzten Bezeichnungen d m d 1 bedeubn im Sinne von Wohl u. Freudenberg (B. 66,309 [1923]) dieKonfigurationbezogen auf d-( t)-Glycerinaldehyd. 1) Nach W. Lindenbein, der dariiber an anderer Stelle bcrichten wird, ist dieser Stamm rnit keiner der im Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (6. Aufl. 1048) beschriebenen Spezies identisch. Insbesondere unterscheidet er sich erheblich von Strepto- inyces antibioticus, dem Actinomycinbildner S. A. Waksmens. Er wurde daher als neue Spezies mit dem Namen Str. chrysomaUus belegt.

Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

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260 Brockmann, G r u b h o f e r , Kass, K a l b e : [Jahrg. 84

9-Phenyl-3-benzyl-5.6-benz-isoalloxazin 9 - P h e n y I - 5.6 -be nz - i SO all o xaz i n 1 ) wurde in Waaser aufgeschwemmt und durch

Zutropfen von verd. Natronlauge in Liisung gebracht. Die iiberschiiss. Natronlauge wurde dans durch Zugsbe von verd. Salpetersiiure neutralisiert, bis eine geringe Triibung auftrat. N d dem Filtrieren wurde mit Silbenitrat-Lijsung im UberschuB versetzt, der entatan- dene Niedcrschlag zentrifugiert, zweimal mit Alkohol + Ather ausgewaschen uhd scharf getrocknet.

0.3g dieses Silbersalzes wurden in iiberschuss. Benzylchlor id 6 Stdn. gekocht, dann daa Benzylcblorid i. Vak. abdestilliert und der Riiokstand mit Chloroform ausgezogen. Der nach dem Verdampfen des Chloroforms verbliebene Riickstand wurde wiederholt aus Benzol umkristallisiert. hhgefarbene Nadeln vom Schmp. 318-319O; Ausb. 0.14 g.

C,H,O&V”, (430.4) Ber. N 13.01 Gef. ”12.80

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38. Hans Brockmann, Nikolsus Grubhofer, Wilhelm K8Ss und Hans K a1 b e: Uber das Acti.nomycin C (Antibiotic8 8us Actinomyceten,

V. Mitteil.+)) [Aus dem Organisch-Chemischen Inetitut der Universitat Gottingen]

(Eingegangen am 6. November 1950)

Am einer bisher unbekannten Streptomyees-Art, die a18 Str. eliryso- niallus bezeichnet ist, wurde Actinomycin C, ein rotea Antibioticum, isoliert, daa Unterschiede gegeniiber Actinomycin A und B aufweist. Durch energische Siiui-ehydrolyae leseen aich aus Actinomycin C sechs Aminosiiuren abspalten, die ala Z-Threonin, d-Valin, Sarkosin, d- Allo-isoleucin, l-F’rolin und N-Methyl-l-valin identifiziert wurden. Bei der Hydrolyse rnit Bsriumhydroxyd entsteht eine rote, kriatalli- sierte Verbindung, die dem chromophoren Teil dea Actinomycins C entstammt. Die Actinomycine sind eine neuartige Grnppe von Natur- stoffen, in denen eine chromophore Komponente wehmheinlich peptidartig mit vemchiedenen AminosBuren verbunden ist.

I.) E in le i tung Bei unseren Untersuchungen uber Antibiotics aus Actinomyceten stieI3en

wir auf einen Streptomyces-Stamm’), dessen gelbe Kulturloeung gegen Staphylo- coccus azweus bakteriostatisch stark wirksam war. Durch Extraktion der Niihr- losung mit Butylacetat und chromatographische Adsorption von dessen Ver. dampfungsriickstand konnte eine gut kristnllisierte, alizarinrote Verbindung mit dem Schmp. 2520 und [a]:: -309O (*3O) isoliert werden, die his zur Ver- dunnung 1 : IOOOOO00 das Wacbtum von Staphylococcus aureus und bis

*) 1.-IV. Mitteil.: Naturwies. 86, 376 [1949], 37, 138, 492, 494 [1960]. Anm. d. Redaktion: Die in dieser Arbeit benutzten Bezeichnungen d m d 1 bedeubn

im Sinne von Wohl u. F r e u d e n b e r g (B. 66,309 [1923]) dieKonfigurationbezogen auf d-( t)-Glycerinaldehyd.

1) Nach W. Lindenbein, der dariiber an anderer Stelle bcrichten wird, ist dieser Stamm rnit keiner der im Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (6. Aufl. 1048) beschriebenen Spezies identisch. Insbesondere unterscheidet er sich erheblich von Strepto- inyces antibioticus, dem Actinomycinbildner S. A. Waksmens. Er wurde daher als neue Spezies mit dem Namen Str. chrysomaUus belegt.

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Uber das Actinomycin C 261 Nr. 3/19511

1 : 10000 das von Escherichia coli hemmte. Bei der Maus waren bei oraler Ver- abreichung einer waBrigen Lijsung 50 mg/kg Korpergewicht, bei intraperi- tonealer 5 mg/kg innerhalb 24 Stdn. tkidlicb.

Dieses rote Antibioticum, fur das wir die vorlaufige Bru ttoformel C&,O,& ermittelten2), ist in seinen physikalischen und chemischen Eigemchaften sowie in seinem biologischen Verhalten dem von S. A. Waksmans) aus Streptomyces antibioticus isolierten Actinomycin A der Formel C,,H,,011N8 auflerordentlich iihnlich. Unterschiede zwischen beiden Verbindungen sind lediglich folgende : 1.) Der N-Gehalt des Actinomycins A liegt 1 % hoher als der u118erea Prs- perates. 2.) Aus Actinomycin A erhielt Waksman ein Diacetyl-Derivat mit dem gleichen Schmelzpunkt wie das hsgangsprodukt, wiihrend unser Anti- bioticum bei dlen Acetylierungsversuchen unveriindert zuruckgewonnenwurde. 3.) Actinomycin A sol1 in Aceton mal3ig loslich sein, wiihrend unsere Verbin- dung sich spielend leicht darin lost. Diese Unterschiede erlaubten %war nicht, die Identitat beider Verbindungen mit Sicherheit auszuschlieBen, schienen uns aber doch mehr dafur zu sprechen, da13 wir ein zwei tes Act inomycin in HInden hatten, das sich in seiner Konstitution nur unwesentlich von Actino- mycin A unterscheidet.

Rote, als identisch mit Actinomycin A angeaehene Antibiotica sind in neu- ester Zeit von verschiedenen Autoren beschrieben worden'). Ob die X a n tho - mycine6) dem Actinomycin nahestehende Antibiotica sind, lii13t sich noch nicht entscheiden.

na uber die Konstitution des Actinomycins A, abgesehen von der Ver- mutung, da13 es eine chinoide Gruppierung enthalt, nichts bekannt war, haben wir unser Antibioticurn, ungeachtet seiner moglichen Identitiit mit Actino- mycin A, eingehender untersucht. Dabei ergab sich, daB der hydrolytische Abbau ein geeigneter Weg ist, einen Einblick in die Konstitution zu gewinnen.

Bei liingerem Erhitzen unseres Actinomycins mi t Salzsiiure oder Schwefel- saure wurden Kohlendioxyd und Ammoniak im Verhaltnie 1 : 2 abgeapalten und ein braunschwarzer Niederschlag fie1 aus, der gelbe, offenbar dem chromo- phoren Teil dea Molekuls entstammende Anteile enthielt. Seine Menge betrug etwa 25 yo des Ausgangsmaterials. Das Filtrat dieses Niederschlagss hinter- lie13 beim Verdampfen einen Ruckstand mit positiver Ninhydrin-Reaktion, der im ein- und zweidimensionalen Papierchomatogramm funf Aminosiiure- Flecke zeigte. Drei von ihnen hatten RF-Werte wie Prolin, Threonin und ISO- leucin bzw. Allo-isoleucin. I n ubereinstimmung damit konnten tatsiichlich

2) H. Brockmenn u. N. Grubhofer, Naturwiss. 36, 376 [1949]; zuerst beschrieben in der Diplomarbeit von N. Grubhofer, Gttingen, Man 1947.

3) S. A. Waksman u. H. B. Woodruff, Journ. Bacteriol. 40, 583 [1940]; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 45, 609 [19.u)]; S. A. Weksmen u. M. Tishler, Journ. biol. Chem. 143, 519 [1942].

4) M. Welsch, Bull. SOC. chim. Biol. 28,557 [1946]; H. Umezare u. Mitarb., Journ. Penicillin (Japan) I, 129 119471; P. C. Trussell u. E. M. Richardson, (hadim Journ. Res. I, 27 /1948]; W. Kochelety u. Mitarb., Arch. Biochem. 17, 191 [1948]; H. Serlet, Enzymologia 14, 49 [1950].

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6) C. B. Thorne u. W. H. Peterson, Journ. biol. Chem. 178, 413 [1948].

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262 Brockmann, Grubhofer , K U S S , Kalbe: [Jahrg. 84

1-Threonin , 1-Prol in und d-A4110-isoleucin in Substanz aus dem Hy- drolysat abgetrennt werden. Die vierte Aminosiiure wurde nach ihrer Isolie- rung als N-Methyl -1-va l in erkannt, wahrend die Natur der funften - offenbar cbenfalls einer N-Methyl-aminosaure - mit einem R, -W-ert wie Valin z u nachs t ungeklart blieb.

Als diese Ergebnisse und einige andere uber den milden Saureabbau unseres Antibicticums vorlagen, erschien eine vorlaufige Mitteilung von C. A. D a l - gl iesh und A. R. Todde) uber die Isolierung einea kristallisierten, roten Anti- bioticums vom Schmp. 252O, das dem Actinomycin A und unserem Praparat sehr ahnlich ist, sich aber von beiden, wenn auch nicht erheblich, in den Ana- lysenzahlen unterscheidet. Diese Verbindung, von den englischen Au toren provisorisch als Ac t inomy cin B7) bezeichnet, lieferte bei der energischen Saurehydrolyse I- P rol i n , d - Val i n , 1 - T h r eo n i n , N - Me t h y 1 - V a l i n und Sarkos in . Milde Saureeinwirkung setzte eine mit der Sakeguchi-Reaktion nachgewiesene Guanidino-Gruppe frei.

Ein Vergleich des Praparates von Todd und Dalgl iesh mit unserem8) hat ergeben, daB die beiden einander sehr ahnlichen Verbindungen sich, abgeaehen von geringen Differemen im Schmelzpunkt und in der spezifischen Drehung, dadurch unterscheiden, daB im Papierchromatogramm des Actinomycins B der Fleck der Isoleucingruppe fehlt. Gewisse Unterschiede fand Todd auch im Infrarot-Spektrum zwischen 1500 und 700 cm-l. Wir haben daher unser Anti- bioticum vorlaufig als Act inomycin C bezeichnet. Die Tafel 1 brinet einen Vergleich der drei Actinomycine.

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Tafel 1. Vergleich d e r Act inomycine ~ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ~ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ~ _____-___

Actinomycin B 1 Actinomycin C I __ .~ -~ ~ _ _ ~-~ Actinomycin A

Schmp. 2500 (Zers.) [a]%: -320:. (k5O) [a]:: -365O [aJ3: -309:. (h3O)

(c=0.25% in Athanol) (c=0.25% in Athanol) 1 (c=0.25% in Athenol) C59.1 H 6.81 N 13.35 1 C58.8 H 7.1 N 13.4 1 (359.65 H 6.87 N B.75

I Schmp. 255O (Zers.) korr. 1 Schmp. 262O (Zem.) korr.

In Amton miiBig loslich 1 I

Diecetyl-Derivat mit dem / gleichen Schmp. wie Actino-

mycin A i I

1 In Aceton eehr leicht loslich i Kein Acetyl-Derivet

Leukoecetyl-Derivet ~ ' Leukoacetyl-Derivet Schmp. 241O j Schmp. 253O korr.

C 58.52 R 6.45 N 12.04 1 1 C 59.50 H 6.95 N 11.14

6) Abstracts of Communications of the Intern. Congress of Biochemhtry, Cambridge, August 1949, S. 246; Nature (London) 164,830 [1949]. Die Isoliemg erfolgte eus einem nicht naher gekennzeichneten Adinomyces-Stdmm. Anm. bei der Komktur (3.2.51) : Inzwiechen ist eine ausfiibrliche Veroffentlichung iiber dimes Act inomycin erschienen, die uhs Herr Prof. Todd freundlicherweise als Msnuakript zug&nglich gemacht hat (C. E. Dalg l iesh , A. W. Johnson, A. R. T o d d u. L.C.Vining, Journ. ohem. Soc. London 1960,2946).

7) Als Actinomycin B wurde urspriinglich von W a k s m a n eine farbloee, nicht niiher cherakterisierte Begleitsubstanz des Actinomycins A bezeichnct.

Herr Prof. T o d d war 80 freundlich, uns eine Probe seines Praparates zu iiberlassm nnd unser Praparat mit seinem Actinomycin B zu vergleichen.

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Die angefiihrten Befunde kennzeichnen die Actinomycine als Naturstoffe, in denen ein bisher unbekanntes Bauprinzip verkorpert ist, namlich die Ver- kniipfung einer farbigen Komponente mit verschiedenen Aminosauren. Damit sind der Konstitutionsermittlung folgende Aufgaben gestellt :

1 .) Aufklarung der farbigen Komponente, worunter der aminosaurefreie Teil des Molekiils verstanden werden so11,

2.) Identifizierung und quantitative Bestimmung der Aminosiiuren, 3.) Ermittlung, in welcher Weise die Aminosauren untereinander und mit

dem chromophoren Teil verbunden sind.

11.) Eigenschaf ten des Act inomycins C Actinomycin C kristallisiert aus Eesigester in alizarinroten, hexagonalen

Bipyramiden (Abbild. 1). Seine auffallend hohe spezifische Drehung ist stark konzentrationsabbangig. Die I$slichkeit in Aceton, Chloroform und Benzol ist grob, die in Alkohol und Essigester maI3ig. Verdiinnte Losungen in Eisessig oder Methanol fluoreacierenunter der Analysenlampe intensiv gelb- gun, solche in Aceton, Benzol oder Pyridin da- gegen nur schwach rotlich bzw. gar nicht. Von Wasser wird daa Antibioticurn nur sparlich auf- genommen; es laBt sich mit Ammoniumsulfat wider ausfiillen. Die wabrige Liisung ist kolloidal und schiiumt stark. Beim Erwgrmen trubt vie sich und verliert ihre Oberflachenaktivitat, beim Er- kahm wird sie wider kl&r und schaumt beim *bbild. 1. Actinomyein c

aus Essigester (50 x vergr.) Schu tteln. Actinomycin C ist leicht zu einer hellgelben Leukoverbindung reduzierbar,

die an der Luft wider die gelbe Farbe des Ausgangsproduktes annimmt, eine Rertktion, die schon Waksman an seinem Actinomycin A beobachtet und auf das Vorliegen einer chinoiden Gruppierung zuriickgefiihrt hat.

Wie wir fanden, kann unter gewissen Bedingungen die Reduktion und Riickoxydation eine griine, offenbar semichinoide Zwischenstufe durchla~fen~).

Die= tritt beaonders auffallig in Erscheinung, wenn man die rote %sung dea Actino- mycins C in konz. SalzGure mit Titantrichlorid versetzt. Weniger ausgeprkgt ist die Griinfarbung bei der Reduktion mit wenig Zinn(I1)-chlorid in Eseigester oder Chloroform. Die griine Zwischenstufe tritt hier auch suf, wenn man die hellgelbe Leukoverbindung mit Luftaauerstoff oder Chloranil dehydriert. Die griine Chloroformlosung hat acharfe Absorptionsbanden bei 695 und 630 mp.

Die Entstehung eines griinen Semichinons gibt Anregung, die Frage zu priifen, ob im Actinomycin C bines der bisher beka;nnten, zur Bildung griiner Semichinone befahigten chromophoren Syateme vorliegt. Mgm ist versucht, dabei an eine P h e n a z i n - Gruppierung zu denken.

Die oben angegebene vorlaufige Formel CQoHWO&N, fur Actinomycin C baA sierte auf Mo1.-Gew.-Beatimmungen, die wir kryoskopisch und durch isotherme Destillation nach B a r g e r - R a s t durchgefuhrt haben. Die hierbei erhaltenen

9) Die Angaben unserer I. Mitteil. (Naturwiaa. 86, 376 [1949]), daf3 bei der Reduktion des Actinomycins im Gegensatz zu den Abbauprodukten der milden SLurehydrolyse die griine Zwischenstufe nicht auftritt, ist demnach zu korrigieren.

Chenilsche Derichte Jahrg. 84. 19

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B r o c k m a n n , G r u b h o f e r , K a s s , Kalbe : [ Jahrg. 84 264

Zahlen weichen stark. voneinander ab, so daB ihr Wert zweifelhaft ist. Wir haben daher versucht, sie auf chemischem Wege mit Hilfe der katalytischen Hydrierung zu kontrollieren. Die Wasserstoffaufnahme des Actinomycins C1 unter "ormaldruck mit Platin-Katalysator in Eisessig erfolgt bis zum SchluB schnell und stetig (Abbild. 2), ein Zeichen, daB nur leicht und daher vollstandig hydrierbare Gruppen vorliegen. Nimmt man an, daB im Actinomycin C nur e ine solche Gruppe vorhanden ist, so errechnet sich aus dem Wasserstoff- Verbrauch das Mo1.-Gew. 1200 (&25) statt 800, wie bei den oben genannten

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Abbild. 2. Wasseerstoff-Aufnahme 17. 330.9 mg Actinomycin unter

Normalbedingungen

Methoden gefunden. Diese Discrepaw konnte dadurch bedingt sein. daB bei der, Hydrierung z.T1. eine reduktive Verknupfung von 2 Mol. Actinomycin eintritt. D a m wiirde der Wasserstoff- verbrauch geringer und das daraus be- rechnete M d .- Gewicht yrot3er werden.. Diese Moglichkeit wird aber dadurch ausgeschlossen, daB sich nach Reoxy- dation an der Luft aus der Reaktions- losung Actinomycin C in einer Ausbeu te von 92% zuruckgewinnen liiBt und die chromatographische Untersuchung kei- nerlei Rnhaltspunkte fur die Bildung- bimolekularer Keduk tionsprodu kte er- geben hat. Da wir beim Actinomycin die Ergebnisse der Hydrierung fur be- wciskraftiger halten als die differieren- den Werte der kryoskopischen und der B a rge r -Ras t -Methode, betrachten wir

vorliiufig den Wert 1200 als das Mindest-MoL-Gewicht unseres Antibioticums. Es ware zu verdoppeln oder zu verdreifachen, wenn zwei bzw. drei hycirierbare Gruppen im Molekul vorhanden sind. Zur Annehme eines so groBen Mo1.- Gewichts besteht aber bei einer Verbindung, die zu etwa 60% aus Sminosauren aufgebaut ist, sich dennoch leicht in Benzol lost und dazu bei 2520 schmilzt, vorlaufig kein zu-inpender Grund.

Mit Zinn(I1)-chlorid l&Bt sich Actinomycin C in salzsaurer Usung scharf auf die hellgelbe Leukastufe titrieren. Die hierhei gefundenen Werte liefern ebenfalls ein Mo1.-Gew. 1200.

d u s den Analysenqahlen unserer alten Bruttoformel C,H,,O,,N, und dem durch Hydrierung ermittelten Mo1.-Gew. 1200 errechnet sich die Formel C,,H,,O,,N,,. Dn, unser Antibioticum, wie im nachsten Abschnitt gezeigt wird, offenbar ein Gemisch verschiedener Actinomycine ist, konnen die AtomzRhlen dieser Formel nur als Nlherungswerte angesehen werden.

Actinomycin C IiiBt sich aus Ather unter Farbvertiefung nach Rot mit min- destens 4-proz. Snlzsiiure ausschiitteln. Es ist also eine Base, aber eine so schwache, daB in alkoholischer Losiing eine konduktometrische Titration nicht nioglicli war.

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Nr. 3/1951] Uber das Actinornycin C 265

Versetzt man die gelbe %sung in Acetanhydrid mit wenig konz. Schwefel- slure, so wird sie rot und zeigt eine Absorptionsbande bei 577 mp, die nach einiger Zeit unter Gelbfiirbung der Liisung verschwindet.

Bei Versuchen, Salze des Actinomycins C darzustellen, erhielten wir ein kristallisiertes Perchlorat, das wegen seiner Unbestandigkeit nicht umkristal- lisiert werden konnte. Es enthiilt auf das Mo1.-Gew. 1200 bezogen 3 Moll. Per- chlorsaure.

Versuche, die Funktion der 0- und N-Atome aufzuklaren, haben bisher folgendes ergeben: Actinomycin C enthalt keine Methoxy-, Acetyl- und Car- boxygruppen. OH-Gruppen konnten durch Acetylierung nicht nachgewieaen werden. Bei der reduzierenden Acetylierung erhielten wir analog wie Waks- m a n beim Actinomycin A aus umerem Priiparat eine kristallisierte, blaagelbe Verbindung, deren Analysenzahlen bei einem Mo1.-Gew. 1200 annahernd auf ein Leakodiacetat passen. Man kann diesen Refund als weiteren Hinweis fur das Vorliegen eines chinoiden Systems ansehen. Da das Reduktionsprodukt antibiotisch unwirksam ist, besteht die Moglichkeit, da13 bei der acetylieren- den Reduktion nebenher noch andere Reaktionen ablaufen. In dieaem Fall wiirde nach Verseifung und Reoxydation aus dem Leukoprodukt kein Actino- mycin C mehr zuriickgebildet. Die experimentelle Priifung dieser Frage schei- tert daran, dal3 eine Vemeifung der Acetylgruppen ohne gleickeitige Veriinde- rung des siiure- und alkaliempfindlichen Sctinomycins nicht moglich ist.

Aus den Ergebnissen der Methylimid- und Zerewit inoff -Bestimmung be- rechnen sich fur die obiqe ?J;iherungsformel 5 N-CH,-Gruppen und 8 aktive H-Atome.

Das Verhalten des Actinomycins C gegen Sdpetrige Siiure gibt keine An- zeichen fur das Vorliegen primiirer oder sekundiirer Amhopuppen. Die Nin- hydrin-Reaktion ist ebenso wie die anderen ublichen Reaktionen auf Amino- sauren und Peptide negativ. Mit Nesslers-Reagens gibt Actinomycin C einen graubraunen Niedemchlag, der sich auch zum Markieren des Actinomycins im Papierchromatogramm eignet. Am Licht bleicht es bei Luftzutritt inner- halb weniger Tage aus, wobei Abnahme der Wirksamkeit und der Extinktion parallel gehen.

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111.) Z u r F r a g e d e r E inhe i t l i chke i t des Act inomycins C’ Die Existellz, verschiedener Actinomycine steht in Analogie zum Vorkom-

men verschiedener Penic i l l ine , Po lymyxine , Sub t i l i ne , E n n i a t i n e usw. und ist ein weiteres Beispiel fur das bei Mikroorganismen ebenso wie h6heren Pflamen haufig anzutreffende Prinzip, daI3 ein Verbindungstyp in mehreren, einander sehr Bhnlichen Varianten hervorgebracht wird. Ebenso wie bei den Polypeptid-Antibioticis bietet im Actinomycin-Molekul der vielleicht ebenfalls polypeptidartig gebaute Aminosiiureteil manche Moglichkeit fur chemische Abwandlungen.

Bei den Mikroorganismen gibt es fur die Durchfuhrung des genannten Varia- tionsprinzips folgende Wege: 1.) Jede der Arten, die zur Syn’these des frag- lichen Verbindungst.yps befahigt sind, erzeugt nur e ine chemische Variante.

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2.) Eine Spezies bsut mehrere Varianten nebeneinander auf. 3.) Durch Muta- tionen erwirbt ein Stamrn die Fiihiglreit, neue chemische Abwandlungen deR Verbindungstyps durchzufuhren. Fur den speziellen Fall der Actinompine ergibt sich demzufolge die Frage, ob die als A, I3 und C bezeichneten Vertreter einheitliche, von verschiedenen Streptomyces-Arten gebildete Verbindungen sind, oder aber Gemische von Actinomycinen, und zweitens die andere, ob ein Stamm uber langere Zeit hin das gleiche bzw. die pleichen Actinomycine pro- duziert. Die folgenden Befunde zeigen einen Weg, um diese Fragen zu klaken.

l m Laufe der Untersuchung fie1 uns auf, daB unsere in letzter Zeit isolierten Actinomycin-Priiparate sich von den zuerst erhaltenen durch eine groBere Loslichkeit in Essigester und Alkohol unterscheiden und einen urn 2O niedri- geren Schmelzpunkt zeigen. Als wir daraufhin sorgfaltig gereinigte Praparate erneut analysierten, fanden wir Andysenzahlen, die von den fruheren deutlich abwichen. Dagegen war die spezifische Drehung und das durch katalytische Hydrierung ermit telte Molekulargewicht innerhalb der Fehlergrenzen gleich- geblieben. Besonders bemerkenswert ist, daB das Hydrolysctt unserer ersten Actinomycin-Praparate im Papierchromatogramm nicht den Fleck des N-Me- thyl-valins zeigte, der von den Flecken der anderen aus Actinomycin C abge- spaltenen Aminosiiuren gut abgetrennt und daher nicht zu iibersehen ist. Diese Befunde lassen sich so deuten, daB bei unserem anfangs einheitlichen und mog- licherweise nur e in Actinomycin produzierendcn Stamm im Laufe vieler Uber- impfungen Mutadionen aufgetreten sind und jetzt eine Population mehrerer Mut.anten vorliegt, die verschiedene Actinomycine bilden. Unsere jetzigen Praparat.e miiBten dann Gemische verschiedener Actinomycinc sein. DaB sie sich trotzdem bei der fraktionierten Kristallisation aus verschiedenen 1,osungs- mitteln und hei der Adsorptionschromatographie uie einheitliche Verbindungen rerhalten, ist nicht uberraschend, denn bei dem groBen ?rlolekulargewicht wer- den sich geringfugige Unterschiede in der Konstitution nur wenie auf die physikalischen Eigenschafteii auswirken. Da am ehesten noch ein EinfluB auf die Verteilungskoeffizienten zu erwarten war, kam zur Priifung auf Einheit- lichkeit als einzige Methode die frektionierte Gegenstromverteilung in Frage, fur die es zunachst ein geeignetes Losungsmittel-Paar zu finden qalt. I n Benzol- Essigsaure, Butanol-Essigsaure und Ameisensaure-Methylenchlorid gab unser Actinomycin in der von K. Gru bhoferlo) . beschriebenen Verteilungs-Appa- r a t k d i e fiir eine reine Substanz cha.rakteristische Verteilungskurve. Snders dagegen verhielt es sich, wie Abbild. 3 zeigt, in ..&her - G-proz. Salzsiiure. Die hier erhaltene Verteilungskurve ist die eines Gemisches. Proben aus den Spitzenfraktionen in Itohr 14, 17 und 21 wurden h-ydrolysiert und papier- chromatographisch auf Aminosiiuren gepruft, wohei im H ydrolysat der letzten Fra.ktioii ke in Threonin-Fleck zu beobachten war. Die Fraktionen 19-25 wurden zur Kontrolle nochmals uber 40 Stufen verteilt. Die dabei gefundene Kurve 2 zeigt, daB die Gegenstromverteilung iiber viele Stufen fortgesetzt werden muBte, um zu vollig einheitlichen Fraktionen zu kommen.

Da Actinomycin siiureempfindlich ist, konnte der Verlauf der Vertedungs- kuwe im System Ather-Salzsiiure durch die Entstehung von Saurespa,ltungs-

1 0 ) Chem.-1ng.-Technik 22, 209 [1950].

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produkten dcs Antibioticums zustande kommen. Dagegen sprechen jedoch fol- gende Beobachtungen 1 Actinomycin C veriindert in 6-proz. Salzsiiure bei Aus- schlnl3 von hellem Idcht innerhalb der fur die Verteilungsoperation erforder- lichen Zeit von etwa 2 Stdn. weder seine biologische Wirkeamkeit noch seine Estinktion. Ferner sind die Verteilungskurven mit einem bereits einmal der Verteilung unterworfenen Praparat gut reproduzierbar. Auch die Auffindung

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Abbild. 3. Verteilung von Actinomycin C irn Sptem Ather-5.6-proz. Salzsiiure. Kurve 1: PTap&rat aus sfindig iiberimpftem Stamm. Kurve 2: Frakt. 19-25 dmon neuerlich verteilt. Kurve 3: %perat

aus nicht iib.erimpftem Stamrn. Extinktion bei 450 mp gemesseh

einer threonin-freien Fraktion k a m nicht auf hydrolytische Wirkung der Siiure zuriickgefiihrt werden, denn zur Abspaltung von Aminosiiuren aus Actino- mycin C sind nach unseren Erfahrungen weit energischere Bedingungen erfor- derlich, als sie bei der fraktionierten Verteilung vorliegen. Wenn man diese Befunde als Beweis dafur gelten liiot, da13 bei der Verteilung keine Verande- rung des Actinomycins C durch die Saure eintritt, dann bleiht zur Deutung der Verteilungskurven nur die Annahme ubrig, daB unser Actinomycin-Prii- pamt ein Gemisch verschiedener Actinomycine ist. Eine endgiiltige Bestati- gung kann nur auf praparativem Wege erbracht werden, eine Aufgebe, die wir in Angriff genommen haben. Wir behalten vorlaufig die Bezeichnung Actino- mycin C bei, um zum Ausdruck zu bringen, daB sich unser Praparat von den beiden anderen bieher bekannten Actinomycinen unterscheidet, die moglicher- weise ebenfalls Gemische eind.

DaB im Gcgensatz zu den anderen bisher untersuchten Losungsmittel- Paaren nur in Ather-Salzsaure eine Auftrennung erfolgt, konnte daran liegen,

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268 Brockmann, G r u b h o f e r , Kass, K a l b e : [Jahrg. 84

daI3 hier die Rasii$tiit des Actinomycins mit ins Spiel kommt und die gegen- seitige Mischbarkeit der beiden Phasen geringer ist als bei den anderen I& sungsmi t tel- Paaren.

Von groI3em Interesse ware es gewesen, das zu Beginn unserer Arbeiten gewonnene Actinomycin C anhand seiner Verteilungskurve mit unseren jetzi- gen haparaten zu vergleichen, um festzustellen, ob unser Stamm. urspriing- lich nur e in Actinomycin gebildet hat. Leider stand uns dafiir keine Probe mehr zur Verfiigung. Wir haben aber aus einer aeit einem Jahr nicht mehr iiberimpften Kultur umeres Stammes ein Actinomycin isoliert, das im Gegen- strom-Verfahren zwischen Ather und 6-proz. Salzsaure verteilt eine ganz an- dere Kurve lieferte als daa aus dem laufend iiberimpften Stamm pewonnene Actinomycin (Abbild. 3, Kurve 3).

Aus dem Vergleich der beiden Kurven laI3t sich unter der Voraussetzung, daI3 keine Saureschadigung des Actinomycina eintritt, der SchluD eiehen, dal3 ein haufig iiberimpfter Stamm ein komplizierteres Actinomycin-Gemisch bildet als ein nur selten uberimpfter, waa in Einklang mit der oben geiiunerten An- nahme steht, daI3 im Laufe der Urberimpfungen eine Population von Rlutanten gebildet wird. Wir sind damit beschaftigt, zu priifen, ob eiri vollig einheit- licher, aus einer Einspor-Kultur gewonnener Stamm zunachst nur e in *4ctino- mycin erzeugt.

Die in diesem Abschnitt geschilderten Befunde machen es wahrscheinlich, da13 mindestens ein Teil der bisher verwendeten Praparate Gemische verschie- dener SActinomycine gewesen sind. Zur Frage, wieweit solche Gemische zur Konstitutionsermittlung verwendet werden kounen, laat sich folgendes sagen : Wenn sich die verschiedenen Actinomycine im Aminosiiureteil ihres Molekiils unterscheiden, konnen fur dessen Aufklarune; selbstverstandlich nur einheit- liche Praparate verwendet werd'en. Diese Arbeit bleibt aber einem spateren Stadium der Konstitutionsermittlung vorbehalten. Zunachst kam e8 darauf an, zwei Aufgaben zu dosen, niimlich erstens, einen Weg zu finden, um den chromophoren Teil in Form kriatrtllisierter Abba.uprodukte aus dem Actino- mycin-Molekiil herauszulosen, und zweitens die methodischen Grundlagen fur die Identifizierung und quantita.tive Bestimmung der heim Abbau entstehen- den Aminosiiuren zu schaffen. Beides kann auch mit Actinomycin-Gemischen durchpefiihrt werden. Unter diesem Gesichtspunkt sind die im folgenden ge- schilderten Ergebnisse zu bewerten.

Unsere bisherigen Versuche zur Abspaltung des chromophoren Teils sollen hier nur kurz erwahnt werden. Wie schon oben berichtet, fallt bei der Saure- hydrolyse des Actinompins C ein braunschwarzer Kiederschlag aus, der zweifel- 10s dem aminosaurefreien Teil des Molekrils entstarnmt. Er enthalt neben gelbroten Fraktionen schwarze, melaniniihnliche Anteile. Kristallisierte Abhau- produkte konnten wir aua dieaem Xiedemchlag bishkr nicht gewinnen. Da, die melanins hnlichen Produkte wahrscheinlich bei eher tiefer greifenden Umset- zung aus der chinoiden Uruppe entstehen, wurde die Siiurehydrolpse bei Gegen- wart von R,eduktionsmitteln wie Schwefliger Siiilre oder Zinn(I1)-chlorid vor- genommen. Tatsiichlich unterblieb dabei die Bildung der Melanine vijllig und ea entstanden rein gelbe Abbauprodukte, mit deren Untersuchung wir beschaf-

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06er das Actinomycin C 269 Nr. 311 9511

tiyt sind. Erfolgreicher waren Versnche, den chromophoren Teil mit Barium- hydrovyd abzuspalten, denn dabei konnte ein aminosaurefreies, kristallisiertes Abbauprodukt gefaBt werdeull), iiber das in einer spateren Mitteilurig ausfiihr- lich berichtet wird. Dies- Verfahren errnoglicht, einen Einblick in die Konsti- tution des chromophoren Teils zu gewinnen und die Frage zu kliiren, ob die verschiedenen Actinomycine im Bau des chromophoren Teils ubereinstimmen.

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IV.) T r e n n u n g und Iden t i f i z i e rung d e r Aminosauren

Bei der Saurehydrolyse des Actinomycins C erhalt man etwa 60% dea Ausgangsmaterials als kristallisiertes Aminosaure- Gemisch, iiber dessen Zu- sammensetzung die Papierchromatographie die ersten Anhaltspunkte lieferte. Zur endgultigen Identifizierung der Sminosauren, beaonders auch hinsichtlich ihrer Konfiguration, war es unerlaBlich, sie in Substanz zu isolieren. Die Me- thode der Wahl war dafur ohne Zweifel die Verteilungschromatogmphie mit StSirke oder Cellulose als Trager der stationaren Phase. Da aber zur Zeit un- serer Hydrolyseversuche dieses Verfahren in priiparativer Hinsicht fur die Verarbeitung von 0.5-1 g Aminosauregemisch noch nicht erprobt war und anderemeits das Hydrolysat unserer ersten Actinomycin-Prsparate im Papier- chromatogramm nur vier Aminasauren, darunter Prolin, erkennen lieB, haben wir zunachst untersucht, wieweit sich mit Hilfe der klassischen Methoden eine Trennung dea Gemischea erreichen liiI3t. PDabei konnte 1 -Pro l in ohne Schwie- rigkeit iiber das Re inecka t abgetrennt und durch Analyse und spezif. Dre- hung identifiziert werden. Bei der fraktionierten Kristalliaation aus Alkohol erhielten wir in kleiner Menge 1-Threonin und in guter Ausbeute eine schon kriatallisierte Aminosaure, bei der die Entacheidung zwischen d- Iso leuc in und d-Allo-isoleucin zuniichst nicht sicher zu treffen war, und schlieBlich ale die vierte Komponente dea Gemisches eine Verbindung vom Schmp. 160°, die keine primare Amino-Gruppe enthielt, mit Hypochlorit Methylamin ent- wickelte und daher als N-Methyl-aminosaure angesprochen wurde2). Ihr Hp- Wert war dem des Valins sehr ahnlich. Nach den unten angefiihrten Befun- den liegt die Annahme nahe, da13 .ein Gemisch aus Sarkosin und Valin vor- gelegen hat 12).

Die Versuche zeigen, daB mit den klassischen Methoden bis zu einem ge- wissen Grade eine Trennung des Gemisches zu erreichen ist. Da sie aber mit Verlusten verbunden ist und fur ein Gemisch von sechs Aminosauren, wie es bei der Hydrolyse spater erhaltener Actinomycin-Praparate auftrat, sicher nicht in Betracht kam, haben wir uns der Frage zugewandt, in welcher Form

11) H. Brockmann u. N. Grubhofer, Naturwiaa. 87, 494 [1950]. 12) Damit atehen allerdings folgende Befunde nicht in Einklang : Da bei der van Slyke-

Beatimmung kein Amino-Sticbtoff gefunden wurde, kann nur aehr wenig Valin vorhanden geweaen aein. Es iet unwahrscbeinlich, cia0 eine so geringe Valinmenge den Schmelzpunkt dee Sarkosina von 205O auf 160° herunterdriickt. Ferner lieB sich die Fraktion vom Schmp. 1600 in ein gut kriatalliaiertes 3.5-Dinitro-benzoat vom Schmp. 186O iiberfiihren, wiih- rend der dea Sarkoein-dinitrobenzoates bei 153.5O lie& Es scheint uns demnach nicht ganz e ~ a c h l o s s e n , da0 umer demaligea Actinomycin ein Abbauprodukt geliefert hat, daa bei den spEter erhaltenen haparaten nicht mehr aufgetreten iet.

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270 Brockmann, G r u b h o f e r , K a s s , K a l b e : [dahrg. 84

die Verteilungschromatographie am zweckmafiigsten in priiparativem MaB- stab aiuuwenden ist. Wahrend im l’apierchromfitogramm bis dahin nur Men- gen unterhdb 1 mg verarbeitet worden waren, lagen Versuche von W. H. S te in und St . Moore13) vor, bei denen an Starkesaulen etws 25 mg Amino- saure-Gemisch pro Saule eingesetz t wurden. Da aber besondere Starkesorten fur diese Methode erforderlich sind, und fiir ihre Anwendung auf grol3ere Men- gen zeitraubende Vorarbeiten notig erschienen, hielten wir es fur einfacher, die Papierchromatographie zur praparativen Trennung unseres Gemisches heranzuziehen. Das ist, wie wir fanden, in verhaltnismiii8ig einfacher Weise moglich, wenn man wie bei der zweidimensionalen PaFierchrcimatographie g a u e Bogen verwendet und auf diese das Hydrolysat als Streifen parallel zu einer Kante auftragt. J e 10 solcher Bogen, von denen jeder etwa 10 mg Aminosiure-Gemisch tragt, werden in die fur zweidimensionale PaFierchro- matogaphie gebrluchlichen Glaskasten gehangt. Die in Abbild. 4 gezeigte Anordnung gestattet, 10 Bogen aus einem Trog zu triinken, ohne daB sich diese gegenseitig beriihren. Beim Entwickeln der Chromatogramme bilden

I 1 Abbild. 4. Anordnung zur praparativen Trennung von Aminosiiuren an Papierbogen

sich bandformige Zonen, die nach MaBgabe einea mit Ninhydrin behandelten Test-Streifens ausgeachnitten und eluiert werden. Da fhnf Kasten gleichneitig beschickt wurden, konnten etwa 500 mg Aminosaure-Gemisch in einem An- satz verarbeitet werden. Bei Vermendung von o-Kresol als mobile Phase traten auf den Bogen funf und bisweilen sechs Zonenbander auf, die im folgenden nach steigenden RF-Werten, also von oben nach unten numeriert sind. Zone I, V und VI waren stets gut abgesetzt, wahrend 11, I11 und IV hiiufig iiber- lappten. Ihre rollstiindige Trennung gelang, wenn sie gemeinsam eluiert und einer erneu ten Bogenchromatographies mit Bu tanol-20-proz. Essigsaure als mobiler Phase unterworfen wurden. Die Reihenfolge der Fraktionen blieb da- bei die gleiche.

Journ. biol. Chem. 178, 52 [1948].

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Nr. 3l2954.1 Uber das Actinornvcin C 27 1

Wahrend unserer Untersuchung erschien eine Mitteilunq von H. K. Mi t - chel und F. A. Haslrins14) uber eine interessante Ausfiihrringsform der Ver- teilungschromatographie, bei der als Triiger der stationkren Phase Cellulose in Form eines ZusammengepreBten Stapels aus Rundfiltern, eines sog. ,,Chro- matopile" verwendet wird. Eine Anwendung auf unser Aminosilure-Gemisch ergab, dal3 die Trennleistung des Chromatopiles unmreichend war.

Sehr wertvoll erwies sich bei unseren Arbeiten der mikrobiologische Amino- sSure-Test, der nicht nur eine Kontrolle unserer analytischen Befunde, son- dern auch quantitative Angaben iiber den Aminosauregehalt des Hydrolysates ermoglichte 16).

Aus Zone I der Chromatogramme konnte nur wenig I -Threonin erhalten werden, das durch Analyse, Biuret-Reaktion und Oxydation zu Acetaldehyd identifiziert wurde. Die spezif. Drehung war wesentlich geringer, als in der Literatur angegeben. Da uns nur wenige Milligramm zur Verfiigung standen, messen wir dieser Abweichung keine grol3e Bedeu tung bei. Mikrobiologisch wurden im Hydrolysat 4.3% Threonin gefunden. Um festzustellen, in welchem Umfang es unter unseren Hydrolyse-Bedinglingen zerstijrt wird, haben wir Actinomycin C unter Zusatz einer bekannten Menge d,Z-Threonin hydroly- siert. $uB dem mikrobiologisch ermittelten Threoningehalt des Hydrolysates ergah sich ein Verlust von etwa llo/o der Ausgangsmenge.

Die ldcntifizierung des Abbauproduktes aus Zone I1 ais Sa rkos in gelmg erst, als wir durch die Befunde von ToddI6) auf diese Aminosiiiire aufmerk- sam wurden. Die anfallende Menge war gering; die Charakterisierung erfolgte durch Elementtwanalyse und die RF-Werte in verschiedenen Liisungsmitteln.

Die bei den ersten Versuchen in sehr geringer Menge aus Zone I11 gewon- nene Aminosaure gab eine rein blaue Ninhydrin-Reaktion und stimmte in ihren RF-Werten gut mit Valin iiberein. Da im Actinomycin-Hydrolysat mikro- biologisch kein 1-Valin nachzuweisen war, wurde das Gemisch der Zonen 11, I11 und IV mit Bariumhydroxyd racemisiert und erneu t mikrobiologisch ge- priift. I)er jetzt gemessene I-Valingehalt betrug 2%) woraus folgt, daB das Gemisch der drei Fraktionen vor der Racemisierung 4% d-Val in enthalten hat. Bei einem groBeren Ansatz konnte d-Valin in einer zur Analyse aus- reichenden Menge gewonnen werden, so dal3 auch die Charakterisierung durch Schmelzpunkt, ~pezif. Drehung und Analyse moglich war.

Wesentlich baser 4 s beim Sarkosin und Valin war die Ausbeute an der Aminosaure aus Zone IV. Dem RF-Wert und den Analysenergebnissen nach gehort sie in die Gruppe der Leucine. Da ihre spezif. Drehung in Waaser und Salzsaure die gleiche Richtung hat, kann weder Leucin noch Norleucin vor- liegen, denn bei beiden andert sich beim Ubergang von Wasser zu Salzsiiure die Drehungsrichtung. Da unsere Aminosaure linksdrehend ist, war zwischen

14) Science 110, 278 [1949]. 16) Seine Durchfiihrung im Werk Elberfeld der Fsrbenfebriken Beyer ver-

denken wir Hm. Dr. E. Auhagen u. Hrn. Dr. J. SchQid. Lit.: E. E. Snell, Adwnbes in Protein Chemistry 11, 85 [1945].

16) Herr Prof. Todd war so freundlicb, uns brieflich von der Auffinduog des Sarko- sine 8h Spaltprodukt des Actinomycine B Mitteilung zu mechen.

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B r o c k m a n n , G r u b h o f e r , K a s s , Ka lbe : [ Jabrg. 84 ~-

272

d-Isoleucin und d-Allo-isoleucin zu entscheiden. Ein Vergleich der spezif. Drehung und der Schmelzpunkte von drei Derivaten (Tafel 2 ) 1aBt diese Ent- scheidung zugunsten des d - All o - isol e u c ins ausfallen.

Tafel 2. Vergleich der Abbau-aminosiiure mit d-Isoleucin und d-Allo- is0 le u c in

d-Isoleucin

[.I5 W=r) -10.7O [.I5 (Salzssiure) , 41.6O

Schmp. d. Phenylisocyanat-Verb. 121-127' Schmp. d. h'aphtylisocyanat-Verb. 179O Schmp. d. Formyl-Derivetea 156O [a]; des Methyl-athyl-aeetaldehyd-

dinitrophenyl-hydrazons (Chloro- form) i -21.20

I ' Abbau- ~ d-410-isoleucin ,

I -14.2O -15.6O

I 1510 157O 167-168'

1250

-38.0' -31.8'

169O 1260

+180 , $140

Eine endgiiltige Bestatigung dafiir brachte der oxydative Abbau zum Me- thy l - a thy l - ace t a ldehyd , der bei unserer Aminosiiure und bci syntheti- schem d-&lo-isoleucin ein rechtsdrehendes 2.4-Dinitro-phenylhydrazan lieferte, wahrend das 2.4-Dinitro-phenylhydrazon des aus d-Isoleucin erhaltenen Me- thyl-& thyl-acet-aldehyds linksdrehend war. Die unnatiirliche d-Konfiguration unseres Abbauproduktes gibt sich iibrigens auch durch seinen siiBen Ge- schmack und den Abbau mit d-Aminosaure-oxydase zu erkennen.

Allo-isoleucin ist unseres Wissens bisher nicht in der Natur aufgefunden. Das Vorkommen der d-Konfiguration ist nicht iiberraschend, denn auch in anderen *4ntibioticis hat man Aminosiiuren mit d-Konfiguration gefunden, so z.B. d-Leucin im Gramicidin und Subtilin.

Das Vorliegen von P ro l in in Zone V gab sich schon durch die gelbe Kin- hydrin-lteaktion zu erkennen. Sach Sublimation im Hochvakuum fanden wir den Schmp. 219wund [ a ] g : -76.00 (Wasser). Fiir die besten Praparate ist Schmp. 222O, : -85.0° angegeben.

1Mikrobiologisch wurden im Aminosauregemisch der Actinomycin C-Hydro- lyse 20% 1-Pro l in gefunden.

N-Methyl -1-va l in , daa sich in der untersten Zone der Papierchromato- gramme findet, ist erst kurzlich von A. H. Cook1') sowie von 1'1. A. P l a t t n e r und U. Nagerl*) als Baustein polypeptidiihnlich gebauter Antibiotica aus Fusarien entdeckt worden. Unser Priiparat wurde durch Schmelzpunkt, Ana- lyse und Farbreaktion mit Kitrobenzoylchloridd charakterisiert. Seine spezif. Drehung in Wasser und SaLsiiure stimmt gut mit den von P l a t t n e r und Neger angepebenen Werten iiberein.

Zusammenfassend lal3t sich sagen, dal3 bei der Saurehydrolyse des Actino- mycins C die gleichen Aminosiiuren entstehen wie aus Actinomycin R, aul3er- dem aber noch d-Allo-isoleucin. Von grol3er Bedeutung fur die Kern- zeichnung der verschiedenen Actinomycine und ihre Konstitutionsermittlung

17) A. H. Cook, S. F. Cox, T. H. Farmer u. M. S. Lacey, Nature 160, 31 [1947]. la) Helv. chim. Acta, 31, 665 [1948].

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Cber das Actinoinycin C' 273 Nr. 3/195i]

ist die quantitative Aminosaure-Bestimmung. Sie setzt voraus, daB bei der Hydrolyse alle Aminosauren unveriindert und vollstandig aus ihren Bindun- gen herausgelost werden. Bei den im Actinomycirf C nachgewiesenen Amino- sauren ist eine im groBeren Umfange eintretende Zerstorung durch die Saure nicht zu befiirchten. Zu beriicksichtipen ist aber, daB die Actinomycine eine anscheinend chinoide Gruppe enthalten, die oxydierend wirken kann. Sie durchliiuft dabei, wie die oben crwahnten Reduktionsversuche zeigen, eine tiefgriine Zwischenstufe. Die bei Hydrolyse unter LuftabschluB zu beobach- tende Grunfarbung der Reaktionslosung ist daher ein Zeichen, daB sich der chromophore Teil des Actinomycins osydierend betatigt. Die Befiirchtung, daI3 dadurch ein erheblicher Teil des Threonins z.erstort wird, scheint, wie die oben erwiihnte iind unter Zusatz i-on Threonin durchgefuhrte Hydrolyse zeigt, nicht berechtigt zu sein19).

Nimmt man an, daI3 der mikrobiologisch gefundene Gehalt des Aminosaure- gemisches an P ro l in , Val in und Threon in annahernd richtig ist, so lassen sich auf Grund folgender Uberlegungen auch iiber die Mengen der drei anderen Aminosiiuren gewisse Angaben machen. Dus bei der Hydrolyse anfallende kristdlisierte Aminosiiure-Gemisch enthielt 9.6% Gesamt-N, 3.1 % Amino-N und4.7yo Methylimid-N; daraus ergeben sich 1.8% Imino-N. Inguteruberein- stimmung damit berechnen sich aus dem mikrobiologisch ermittelten Prolin- gehalt von 20% 1.9% Imino-N fur das Gemisch.

Da im Aminosaure-Gemisch 4.3% Z-Threonin vorhanden sind, ist dieaes mit 0.4% an den 3.1 % Amino-N des Gemisches'beteiligt.

Demnach stammen die restlichen 2.7% Amino-N dea Gemisches aus d-Allo- isoleucin und d-Valin. Cm aus dieser Zahl auszurechnen, wieviel F'rozent d-Allo-isoleucin und d-Valin im Gemisch vorhanden sind, mu13 man ihr Men- genverhliltnis zueinander kennen.

Dieaea Verhaltnis ergibt sich aus der Analyse der vereinigten Fraktionen 11, I11 und IV dea Papierchromatogrammes. Wie oben gezeigt, enthiel't diesea Gemisch 4% d-Valin. Fur Sarkosin errechnet sich aus dem Methyl-N-Wert des Gemisches ein Gehalt von 5.5%. Danach enthalt das Gemisch der drei Praktionen 90.5 yo d-Allo-isoleucin. D~LB Mengenverhaltnh Valin : Allo-isoleu- cin bt also 1 : 22. Daraus und aus den 2.7% Amino-N berechnet sich fur das bei der Hydrolyse erhaltene Aminosaure-Gemisch ein Gehalt von 24% d-Allo- isoleucin und rund 1% d-Valin.

Da im Gemisch der Fraktionen 11, 111 und IV 5.5% Sarkosin enthalten sind, muB dieses Gemisch rund 27% dea Gesamthydrolysates betragen. Da- mit steht in guter ubereinstimmung, da13 bei der chromatographischen Tren- nung 23 % des Ausgangsmaterials als Gemisch von d-Allo-isoleucin, Sarkosin und d-Valin isoliert werden konnten. Hieraus folgt weiter, daD das Sarkosin zu 1.6% im Gesamtgemisch der Aminosauren vorhanden sein muI3.

1.) Jedoch kann man gegen dieeen Versuch einwenden, d a B Aminoaiiuren im Verband bekanntlich empfindlicher gegen Siiure win konnen m d ferner, daB ein Verlust von 10% Threonin bei grobm OberschuB an dieeer Aminoeiium nicht unbedingt b w g t , daB bei der ohne Zuaatz durchgefuhrten Hydrolyse auch nur 10% der vorhandenen Menge ver- lomngehen. Der gefundene Threoningehalt ist daher mit Vorbehalt zu bewerten.

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Brockmann, Grubhofer , Kass, Kalbe: [ Jahrg. 84 . ~- -~ ~ ______. ~~

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Ein Sarkosingehalt von 1 .6y0 im Gesamtgemisch der Aminosiiuren wiirde fur dieses 0.25% Methylimid-N ergehen. Zieht man diese Menge von den gefundenen 4.7% ab, so bleiben 4.45% fur N-Methyl-2-valin. Seine Menge im Hydrolysat wiire demnach 42%. Man liommt so zu der in Tafel 3 angege- benen Zusammensetzung des Aminosaure-Gemisches.

I n die Zahlen der Tafel3 gehen die Feh-

Gemisches samt-S-Bestimmungen, die des mikrobio- logischen Testes und schliel3lich die bei der Hydrolyse entstehenden Verluste ein. Die Pehlerbreite ist daher nicht unerheblich. Trotzdem zeigt die Zusammenstellung mit aller Deutlichkeit, da13 zwei Amino&uren, namlich d-Balin und Sarkosin, in wesent- lich kleinerer Menge vorhanden sind als N-Me thyl- 1-valin, d-Allo-isoleu cin uqd 1- Prolin, die annahernd imverhaltnis 2 : '1 : 1

vorliegen. Nimmt man an, daI3 nur e in d-Valin- und e in Sarkosin-Rest im Actinomycin-Molekiil vorhanden ist, dann miiI3te das Mo1.- Gewicht ein Viel- fctches von 1200 sein. Um den gleichen Fa,ktor miiI3te auch die Zahl der chro- mophoren Gruppen gro13er werden. Wie schon oben gesagt, scheint u m ein so grol3es Mol.:Gewicht unwahrscheinlich. Angesichts der im Abschnitt I11 geschilderten Befunde mochten wir den geringen d-Valin- und Sarkosingehalt vielmehr als weiteren Hinweis dafiir ansehen, daB unser Actinomycip nicht einheitlich, sondern ein Gemisch ist. d-Valin und Sarkosin wurden dann Komponenten des Gemisches entstammen, die nur in untergeordneter Menge vorhanden sind. Der Beweis dafiir ware erbracht, wenn es gelange, durch Gegenstromverteilung des Actinomycins C Fraktionen t u erhalten, deren Hydrolysat im Fapierchromatogramm kein Sarkcsin oder Valin zeigt.

Tafel 3. Zusammensetzung des ler der Amino-S-, Jfethyl-x-20) und Ge- kristal l is ierten Aminosiiure-

Aminosiiure 1 Prozentgehalt - ~~~~~

-~ _ _ ~ ~

I-Threonin . . . . . . i 4.3 Sarkosin . . . . . . . . '

1 d-Valin ,........ ~

d-Allo-isoleucin . . 24 I-Prolin ,. . . . . . . . 1 2o N-Methyl-l-velin . ~ 42

92.9

V.) Milde Saurehydrolyse des Act inomycins C Wie schon Waksman bei seinem Actinomycin -4 beobachtete, verliert

auch Actinomycin C bei kurz,em Erwarmen mit Saure seine antibiotische und toxische Wirkung. Unsere Versu che, durch kurzdauernde Einwirkung von Saure zu definierten Abbauprodukten zu kommen, sind bisher unbefriedigend verlaufen, so daB nur kurz dariiber berichtet werden soll. Lant man 6 n HCI 20 Min. bei 100° auf Actinomycin einwirken, so hinterbleibt beim Verdampfen der Reaktionslosung ein gelbroter Riickstand, der im Gegensatz zum Actino- mycin in Wasser gut loslich ist. Er besteht aus den Hydrochloriden gelbroter, basischer Abbauprodukte. Die Basen selbst lassen sich durch mehrmaliges Abdampfen mit Wasser aus den Hydrochloriden gewinnen und sind wasser- unloslich. Bei der milden Salzsaure-Spaltung des Actinomycins wird auf das Mo1.-Gew. 1200 berechnet 0.9 Mol. NH, frei. Eine Abspaltung von Amino- sauren tritt dagegen nicht ein.

20) b n c h e Aminosiiuren geben bei der Methyl imid-Best img Blindwerte, so daB die von uns gefundenen Zahlen flir N - C H , zu hoch sein komen.

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Uber das Actinomycin C 275

Durch Adsorption an Aluminiumoxyd lassen sich die Abbaubasen in zwei Hauptfraktionen zerlegen, eine, die als orangefarbene Zone fest adsorbiert, iind eine. die lkicht eluiert wird. Wir haben sie diesem chromatographischen Ver- halten entsprechend a l szonenbase und E l u a tbase bezeichnet. Beide lassen sich in arnorphe Pikrate und Pikrolonate iiberfuhren. Bei der Hydrolyse deu -4ctinomgcins entsteht zuerst die Eluatbase, die durch weitere Siiureeinwir- kung in die Zonenbase iibergeht. Mit Salpetriger Skure entwickeln beide Frak- tionen nur sehr wenig Stickstoff, bilden aber rote Nitrosoverbindungen. Die Zonenbase zeigt amphoteres Verhalten; sie IaBt sich mit Methanol und Sdz- saure verestern.

Bemerkenswert ist das Verhalten der Abbaubasen gegen Reduktionsmittel. Durch Zinn(I1)-chlorid werden sie iiber eine tiefgriine Zwischenstufe zu einer blafigelben Leukoverbindung reduziert, die an der Luft unter Durchlaufen der grunen Stufe wieder ihre anfangliche gelbrote Parbe annimmt. Mit Schwefel- wasserstoff bleibt die Reduktion auf der griinen Zwischenstufe stehen. Her- vorzuheben ist, da13 die Griinfiirbung vie1 deutlicher und leichter eintritt als beim Actinomycin C, bei dem wir sie daher erst spatcr aufgefunden haben. In Eisessig hat das griine Semichinon Banden bei 684, 622 und 568 mp.

Eine eingehendere Untersuchung der beiden Rasen hat ergeben, da8 sie Gem;sche sehr ahnlicher Verbindungen sind. I n t'bereinstimmung mit der oben erwahnten Heobachtung, daB hei der Salzsaureeinwirkung unter den von u rn gewahlten Bedingungen keine Aminosiiuren abgespalten werden, erhal t man bei der energischen Hydrolyse der Abbaubasen die gleichen Aminosauren wie aus Sctinomycin C . DaB nach 20 Min. langer Einwirkung von 6nHCl hei 100° noeh keine Aminosauren abgespalten werden, ist bemerkenswert, denn Polypeptide werden nach unseren Errahrungen unter diesen Bedingungen schon merklich hydrolysiert. Bei einem Hydrolyse-Versuch, bei dem Actino- mycin C in einer Rlischung aus gleichen Teilen Eisessig und 10-proz. Salzsiiure bei 37O aufbewahrt wurde, lieBen sich erst nach 2 Wochen N-Methy l -va l in und d-Allo-isoleu cin im Papierchromatogranim nachweisen.

Der Notgemeinschaft der Deuhchen Wissenschaft und dem Werk Elberfeld der Farben- fabriken Rayer, insbesondere Hrn. Dr. Auhagen, Hm. Dr. Bohne, Hrn. Dr. Fr iedr ich und Hm.Dr. Schm id danken wir fur weitestgehende Vnterstiitzung, die allein die Durch- fiihrung unserer Arbeiten moglich gemacht hat.

Hm. Prof. Todd, Cambridge, sind wir fur kollegialen Erfahrungsaustauscb sehr ver- bunden.

____.__ Nr. 3/1951] -. -~

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Beschreibung der Versuche

1.) Darstellung und Eigenschaften des Actinomycins C Nach Untersuchungen von W. Lindenbein*l) unterscheidet sich unser Streptomyces-

Stamm morphologisch und physiologisch eindeutig von Streptom yces antibioticus, aus den1 Waksman daa Actinomycin A isoliert hat. Auch mit Str. ilaveolus und St?. fultissimus ist er nicht identisch, so dal3 offenbar eine bisher unbekannte S p i e s vorliegt.

Me Kultur unserea Stammes wurde bei 28O in P-Kolben, bei GroBamiitzen im Sub- xnemverfahren durchgefiihrP). Die Xihrlosung enthielt in 1 1 dest. Wasser: 20 g GIy-

11) Wird demnachst an anderer Stelle veroffentlicht. =) Fiir die Durchfuhrung dieser Ansiitze sind wir dem Werk Elberfeld der Farben-

f a b r i k e n Bayer zu grobm Dank verpflichtet.

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Brockmann, Grubhofer , K a s s , K a l b e : [ J ahrg. 84 276

~ e r i n , 10 g KNO,, 5 g K,HP04, 5 g XaC1,5 g JlgSO,.7 H,O, 0.01 g FeS04.7 H,O. In der braungelben, mit dichtem Mycel bewachsencn Niihrlosung der P-Kolben war nach 26 Ta- gen der Actinomycingehalt auf etwa 100 mg/Z angestiegen.

Daa Mycel wurde auf grobem Isinen abfiltriert, bei 100' getrocknet und feinvermahlen mit Benzol extrahiert. Die Kulturlosung wurde erschopfcnd mit Butylacetat ausgcriihrt urid diesea anschliehnd i. Vak. verdampft. Den siruposen Butylacetet-Riickstand ver- einigte man mit dem Benzolextrakt des hlycels und filtrierte die so erhaltene Benzollosung durch eine Adsorptionssiiule aus Aluminiumoxyd 11. Bcim Entwickeln dea Chromato- gramms mit reichlich Benzol erschien ein gelber Vorlauf, d w e n Verdampfungsriickstand neben vie1 Fett ein rotes, wesserloaliches 01 enthielt. Es war bakteriostatisch unwirksam und durch einen starken ,,Erdgemch" ausgezeichnet.

Die unterste orangerote Zone dea Chromatogramms, etwa die Hiilfte von deesen Liinge ausmachend, enthielt das Act inomycin C. Aus den dariiberliegenden braunen Zonen lieBen sich schwach wirksame, wasserlosliche, braune ole eluiereh, die nicht niiher unter- sucht wurden.

Die aus der Saule abgetrennte Actinomycin-Zone wurdc auf einer Glwinternutsche mit Essigester eluiert und daa nochmals filtrierte Eluat fast zur Sirupkonsistenz eingeengt. Den Riickstand versetzte man mgleich mit dcm doppelten Vol. frisch dest. Schwefelkohlen- stoffes, aus dem das Actinomyoin C nach kuner %it auskristallkierte. Nach Waschen mit Eesigester-Schwefelkohlenstoff (1 : 2) und anachlieOend mit Schwefelkohlenstoff wurde itus Essigester umkristallimert. An Stelle des EBsigeaters kann auch Ather, Methanol oder Methylal verwendet werden.

Die bei unseren ersten Versuchcn erhaltenen Priiparate sind. sofern sie Unterschiede zu den spater erhaltenen zeigten, durch den Zuecrtz (alt) bzw. (neu) gekennzeichneb.

Act inomycin C (neu) schmilzt bei 252O unter Aufschiiumen und Dunkelfarbung. Da sohon unterhalb dea Schmelzpunktes lengsam Zereetzung eintritt, wurde stets bei 240' in den Berl-Block eingesetzt und die Temperatur 4O/Min. gesteigert.

Von konz. Schwefelsiiure wird daa Antibioticum mit roter Farbe eufgenommen, in walk. Alkalilauge ist seine Liislichkeit nicht grohr ala in U'asaer. Alkohol. Alkalilauge lost rnit brauner Farbe. In Claisen-huge ist die Farbe anfangs purpurrot und wird dann schnell braun. Das ~pezif. Gewicht von Actinomycin C ' (alt) ist 1.0155.

L ii s 1 i c h ke i t v o n A c t i n om y c i ii C - P r ii p ar a t e n (Die Zahlen bedeuten g/100 g Liisungsmittel)

____ .-

Act inomycin C' (alt) Act inomycin C (neu) Absol. Alkohol . . . . . . . Absol. Alkohol . . . . . . . . . . . . 13

> 100 . . . . . . . . . . .

........... ..............

0.07

i Benzol Chloroform Aceton

Wesser .................... 0.14 Eeeigeater . . . . . . . . . . . . . . . . 0.78 Waaser 98O . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.05 Schwefelkohlenetoff . . . .

A b h i i n g i g k e i t d e r . a p e z . D r e h u n g y o n d e r K o n t s n t r a t i o n (in Xthanol)

ActinomycinC(a1t) : [a13 : --319' (+3) -312O -290" --250° --240°

Actinomycin C (alt) : C:,,HDDO,,Nl1 (1260.4)

Konzentrat. in mg/ccm .... 5.00 2.50 1.00 0.50 0.25

ActinomycinC(neu) : [a]:: -309' (+3)

Ber. C 59.00 H 7.12 N 12.22 5 N-CH, 5.95, 8 akt. H 0.64 Cef. C 59.03, 59.06 H 7.04, 7.10 Pi 12.27*), 12.21") N - C B , 5.4 0 ) Mittelwert aus 2 Bertlmmungen yon niehriach umkristallisiertein Praparat, getr. h i

0.) Mehdach umkrlstalllslertes, aus Aceton init Petrolather amorph ausgefillltes und in glei-

Mo1.-Gew. nach R e s t in Campher: Gef. 705, n8Ch B e c k m a n n in Phenol: gef. 915,

akt. H0.63

121)0/0.0t Torr uber P,OI.

cher Welse getrocknetes PrOparat.

n8Ch B a r g e r - R a s t in Tetrahydrofaran: gef. 876-944. Actinomycin C (beu) : C,&IH,,O,,Nll (1214)

Ber. ('59.75 H 6.91 N 12.70 Gef. C'.59.65 H 6.87 N 12.75

Page 18: Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

Nr. 3/1951] fiber das Actinomycin C 277

K a t a l y t i s c h e H y d r i e r u n g : I n einer Halbmikro-Apparatur verbrauchten 100 mg Actinomycin C (alt) in 7 ccm Eisessig b.Ggw. von 100 mg F’t-Katalptor (Adame-Shr i - ner) 1.8 ccm Wesserstoff. I n einem zweiten Vemuch wurden von 208.9 mg Actinomycin C. (elt) in 8ccm Eisessig mit 100mg Pt-Katalyeetor 4.3ccm Waeserstoff aufgenonunen. In einer Differential-Apperatur nahmen 330.9 mg Actinomycin C (neu) in 5 ccm Eieessig rnit 200 mg Katalysator 6.1 ccm Wasseretoff auf (Abbild. 2). Die aus dem Wasserstoff- verbrauch ber. Werte fur daa Mo1.-Gew. sind 1280. 1110, 1218 ( ~ t 2 5 ) .

A u f a r b e i t u n g d e s H y d r i e r u n g s p r o d u k t e s : Die easigsaure Kiipe von 278 mg Actinomycin C (neu) m r d e durch eine Nutsche vom K a t a l p t o r abgesaugt. Hydrier- geGB und Nutache spulte man mit Benzol gut nach. I n der Saugflasche befanden aich bereits 200 ccm Benzol, die nach der Filtration mit 200 ccm Wasser unterschichtet wur- den. Die hellgelbe Lijsung hack schon wenige Sek. nach der Filtration wieder einen rot- gelben Farbton angenommen; weder wiihrend der Hydrierung, noch wiihrend der Rack- oxydation konnten tiefergefiirbte Zwischenatufen beobachtet werden. Nach Stehen uber Nacht wurde das Benzol vom schwach hellgelben Waaaer abgetrennt, noch zweimal mit Rasser und schlieBlich mit Natriumhydrcgen~rbonat-lijsung gewaschen, d a m mit Natri- umsulfat getrocknet und durch eine Siiule von Aluminiumoxydfiltriert. Abgeaehen von einer auBerst schmalen braunen Zone am oberen Ende zeigte daa adsorbierte Actinomycin kein Zeichen von Uneinheitlichkeit. Nach Elution mit Methanol und deseen Verjagen i. Vak. nahm man in wenig Esaigester auf, engte fast zur Sipkonsistenz ein und fiigte das zehn- fache Volumen Schwefelkoblenstoff hinzu. Die abgeachiedenen Kriatalle wogen nach dem Trocknen 256 mg (= 92”/;, dea Ausgangsmaterials), zeigten einen Schmp. von 250.5 (korr.) und keine Schmp.-Erniedrigung mit Actinomycin C (neu). Zur Kontrolle wurden 221 mg Actinomycin C in Eisessig gelost und ohne Hydrierung in derselben Weise sufgearbeitet, wobei 210 mg (95% des Ausgangsmaterials) wiedererhalten werden konnten.

~

2.) D e r i v a t e d e s Act inomycins C P e r c h l o r a t : Eine unter Erwiirmen hergestellte Lijsung von 175 mg A c t i n o m y c i n

(alt) in 0.5 ccm Butanol wurde nech dem Abkiihlen mit 0.16 ccm 50-proz. Perchlor+re vemetzt. Das in feinen, roten Nadeln auskristallisierte Salz (180 mg) wurde mit Ather ausgewaschen und lie13 sich nicht umkrktallieieren; Schmp. 192O (korr.).

C,,H,,O,,N,,. 3.HCl0, (1561.7) Ber. C 47.72 H 6.12 N 9.88 c16.81 Gef. C 46.35 H 5.97 N 9.80 c1 6.73

Ein iniihnlicher Weiee gewonneneaPerchlorat von Actinomycin C(neu) enthielt 6.18% C1. -%quiv.-Gew. durch konduktometr. Titration: Ber. 517, gef. 542.

Acety l ie rungsversuche: J e 50 mg Act inomycin C (alt) wurden in 2 ccm Acet- anhydrid gelost und eine Probe mit 1 ccm %&in, die andere mit 200 mg e n t w h r t e m Natriumacetat versetzt. Darauf wurde 2 Stdn. unter RiickfluB gekocht und im Vekuum- exsiccator iiber Kaliumhydroxyd eingedunstet. I n beiden Fallen konnb unveriindertea Actinomycin in fast quantihtiver Ausbeute wieder erhalten werden. Die Acetylbeetim- mung lieferte keinen uber den Blindwert hinausgehenden Betrag. Erwiirmen in Acetan- hydrid unter Zusatz von einer Spur konz. Schwefelsaure ergab nach Zeraetzen mit W a w r und Ausiithern nur schmierige, braune Zereetzungsprodukte.

L e h k o e c e t a t : Eine Lijsung von 200 mg Act inomycin C (alt) in 2 ccm Awtan- hydrid wurde rnit 500 mg Zinkstaub und einem Tropfen Pyridin verseht. Nachdem, be- fordert durch kriiftigea Schiitteln, die Ltisung hellgelb geworden war, filtrierte man vom Zinkstaub ab und lie13 die hellgelbe Lijsung im Vakuumexsiccator uber vie1 Kaliumhydro- xyd eindunsten. Der Riickstand wurde in Chloroform aufgenommen, die Lasung mit Wesser geweschen, mit Natriumeulfat getrocknet, auf 10 ccm eingeangt und mit 20 ccm Schwefelkohlensbff vemetzt. Die ausgeechiedenen Kristalle (140 mg), hellgelbe, recht- eckige Tiifelchen, wurden mit Petroliither gewaschen; Schmp. 253O korr.

C,,H,,Ol,Nll (COCH,), (1346.5) Ber. C 58.87 H 7.11 N 11.50 2CH8C0 6.39 Gef. C 59.59 H 6.97 N 11.15 CH,CO 4.78*)

*) Verwifung tnit 30-proz. Schwelels%ure, Apparatur nach K b g l - P o s t o w s k l (A. 440, 34 [ 1 9 2 4 ] ) .

Page 19: Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

Brockmann, Grubhofer , K a s s , Ka lbe : [ Jahrg. 84 . .

278

3.) Gegens t rom-Ver te i lung von Act inomycin C In den Lijsungsmittelpaaren Benzol-Essigdure, Butanol-Essigsiiure und Ameisensiiure-

Methylenchlorid gab Act inomycin C (neu) bei der Gegenstrom-Verteilung in einer 40- stufigen Glasapparatur nach G r u b hoferI0) die einer reinen Substanz zukommende Ver- teilungskurve. Das fiir eine Trennung geeignete Paar Ather-Sa1ze;iure (5.5636) hat den Nachteil, da0 sich daa Antibioticum nur zu 0.1 7; in jeder Phase lost. Immerhin konnten durch Verwendung einer Glasapparatur, die 800 ccm IAosungsmittel je Stufe fa&,, 80 mg Substanz einer 4Ostufigen Verteilung untenvorfen werden, so daB die erhaltenen Spitzen- fraktionen zu Hydrolyeeversuchen ausreichtcn. Die Fraktionen 19-25 wurden vereinigt und in einer 100 ccm-Apparatur erneut iiber 40 Stufen verteilt, wobei sich die in Kurve 1 (Abbild. 3) durch eine Unsymmetrie bei Stufe 22-24 angedeutete Komponente bereita als distinktives Maximum zu erkennen gibt. Um den Actinomycingehalt der einxelnen Verteilungestofen zu beetimmen, wurde das Lijsungsmittel- Gemisch neutralisiert, wodurch sich das Antibioticum quantitativ in die Atherschicht iiberfiihren lie0, in der es stufen- photometrisch bestimmt wurde. Die bei 2 cm Schichtdicke und 450 mu gemessene Ex- tinktion der einzelnen Stufen ist in der Zeichnung der Verteilungskurve als Man fur die Actinomycin-Konzentration gewihlt.

4.) Energische S i u r e h y d r o l y s e d e s Act inomycins c' Mit Sa lzsaure : 487 mg Act inomycin C (alt) wurden mit 3 ccm konz. Salzsiiure

in einem zu einer groben Capillare ausgezogenen und zugeschmolzenen Glasrohr. 9 Stdn. auf 125O erhitzt. D a m wurde uber die Capillare ein Gummischlauch gezogen, der mit einem mi t Barytwasser gefullten Peligot-Rohr verbunden war, und die Capillare im Schlauch abgebrochen. Durch Anlegen von Vakuum wurde der Gasinhalt des Rohrea durch das Peligot-Rohr gesaugt. Sachdem kohlendioxyd-freie Luft eingelassen war, m e in der gleichen Weise wiederum evakuiert. Durch eine noehmalige Wiederholung dieaer iMaBnahme wurde das im ReaktionsgefaU befmdliche Kohlendioxyd vollstiindig in die Barytlosung iiberfiihrt; ea fallte hier 51.8 mg Bariumcarbonat aus (0.75 Mol. COJ1 Mol. Farbstoff). Der aus der Reaktionslosung ausgefallene schwanbraune Niederschlag wurde abfiltriert. Er wog trocken 103 mg (240,; des Ausgangsmaterials). Das mit wenig Tier- kohle entfarbte Filtrat des Niederschlages hinterlie0 beim Eindampfen einen farblosen, kristallinen Riickstand, desaen Gewicht nach Trocknen iiber Phosphorpentoxyd 334 mg betrug (69 X des Ausgangsmaterials). Dieser Riickstand enthielt 3.3 % Amino-Stickstoff und zeigte die spezifische Drehung [.Is: -47.8O.

Um den Ammoniumchloridgehalt des Riickstandes zu bestimmen, wurden 67.5 mg (entspr. 97.2 mg Ausgangsmaterial) mit 1 ccm 50-proz. Platinchlorwasserstffsiiure ubor- g o w n und zur Trockne verdampft. Der Ruckstand wurde mit absol. Alkohol in einen gewogenen Porzellanfiltertiegel iibergespiilt und mehrmals nachgewaachen. Das zuriick- gebliebene gelbe Kristallisat wog getrocknet 25.82 mg. Nach VerglEhen des Salzes hinter- blieben 18.0 mg Platin (enepr. 2.06 mg Ammoniak-Stickstoff). Daa Chloroplatinat ent- hielt also nur Ammoniak und keine anderen Basen. Seine Menge entspricht 1.78 Mol. NH, pro Mol. Farbstoff.

Mi t Schwefelsaure: 6.18 g Act inomycin C (alt) wurden in 40 ccm 30-proz. Schwe- fels;iure unter Ruckflu0 36 Stdn. auf l l O o erhitzt. Das obere Ende des Kiihlers war mit einem geraumigen, mit Barytw-r gefullten Peligot-Rohr verbunden. Die Reaktiom- losung wurde nach kurzem Erhitzen dunkelgriin. Wie beim vorhergehenden Versuch wurde daa entwickelte Kohlendioxyd quantitativ in daa Barytwakser iiberfuhrt. Der Menge Bariumcarbonat (607 mg) entaprechend waren aus 1 Mol. Farbstoff 0.72 Mol. Kohlendioxyd entstanden.

Dm Trockengewicht des aus der Reaktionslosung abfiltrierten schwarzen Niederschla- ges war 1.4 g (233; des Ausgangsmaterials). Die vakuumtrockene Subetanz zeigte fol- gende Analysenzahlen: C 54.53, H 5.11, N 6.22 und N-Methyl 1.00. Das mit Barium- hydroxyd von Schwefelsiiure befreite Filtrat d i e m Niederschlagea hinterlie0 beim Ver- dampfen einen weinen, kristallinen Ruckstand (3.9 g nach Trocknen i. Hochvak., entspr. 63 % des Ausgangsmaterials). Dieses Produkt, im folgenden als ArninoGure- Gemisch be- zeichnet, diente als Ausgangsmaterial fiir die folgenden Trennungsversuche.

Page 20: Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

i‘ber das Actinomycin C 279

F r a k t i o n i e r u n g d e s Aminosaure-Gemisches : 1.93 g des Gemisches wurden mit 4 ccm 99-proz. Alkohol zu einem Brei verriihrt und in einem ,ExtrcLktionsapparet mit 20 ccm Alkohol 10 Min. ausgezogen. Der kristalline Ruckstand in der Extraktionshiilse wog 0.83 g (R I). Der Verdampfungsriickstd des Extraktes (1.10 g) wurde zweimal mit je 10 ccm 99-proz. Alkohol digeriert, wobei 90 mg Ruckstand vom Schmp. 235O hinterblie- hen (R 11). Kach zweimaligem Umkristallisieren dieser Substanz wurden 15 mg einer gut kristallisierten Frahion vom Schmp. 245-255O erhalten, die positive Biuret- und Ninhydrin- Reaktion gab und im Papierchromatogramm den gleichcn RF-Wertzeigte wie T h r e o n i n .

Das Filtrat von R 11 wurde mit 30 ccm gesiitt. alkohol. Cadmiumchlorid-Liisug ver- setzt. Der ausgefallene weine Niederschlag wurde in 40 ccm Waaser gelost, das Cadmium durch Einleiten von Schwefelwasserstoff in der Siedehitze entfernt und daa Hltrat vom Chdmiumsulfid-Niederschlag auf ein kleines Volumen eingeengt. Diem Ibsung schiittelte man aolange anteilweise mit einer Lijsung von Reinecke-Skure in Ather, bis der Ather nicht mehr entfarbt wurde. Der ausgefallene voluminose Niederschlag vom Schmp. 189O wurde aus Aceton-Wmser umkristallisiert. Man erhiclt so 257 mg R e i n e c k a t vom Schmp. 198O, das nach dem Zerlegen mit 211 HC1 und Audthern .der Reinecke-Saure I - P r o l i n lieferte, das sich im Papierchromatogramm als einheitlich envies. Nach Um- kristallisieren aus Isoprcipylalkohol Schmp. 21Z0, [a]:: -78O (Waaser); Ausb. 60 mg, Schmp. des P i k r a t e s 146O.

Des rote Filtrat des qolin-Reineckatea wurde angesiiuert, erschopfend mit Ather ausgezogen, um die Reinecke-Saure zu entfcrnen, und dann bis zur Sirupkonsistenz ein- gedampft. Der Riickstand, der im Papierchromatogramm nehen wenig Prolin eine Sub- stanz mit dem RF des Valins zeigte, wurde nach einiger Zeit kristalliri. Beim Umkristalli- sieren aus Alkohol erhielt man in kleiner Menge farblose Nadeln vorn Schmp. 160°, die eine rote Ninhydrin-Reaktion gaben, keinen Amino-Stickstoff enthielten nnd beim Er- warmen mit Natriumhypochlorit intensiven Geruch nach Methylamin entwickelten.

Der Ruckstand R I d e im Extraktionwpparat aus 96-proz. Alkohol umkristalli- siert und bei 170°/0.01 .Ton sublimiert. Dabei hinterblieb kein nennenswerter Riickstand. 1)as Sublimat (533 mg) zeigte im Papierchromatogramm (0-Kresol) zwei Flecke mit den RF-Werten des I so leuc ins und Valins. Es wurde in 10 ccm 2n. NaOH gelost und unter Riskuhlung anteilweise mit einer ather. Liisung von 3.5-Dinitro-benzoylchlorid umge- setzt2s). Als die Reaktionslosung auf pH 4 gebracht wurde, schieden sich Kristalle Bus. Das Filtrat stellte man nun auf pH 3 ein, woraufhin wiedemm eine kristalline Fallung auftrat. Die bei pH 4 erhaltene Fraktion hatte nach zweimaligem Umkristanisieren aua 20-proz. Essigsiiure den Schmp. 186O.

Das bei pH 3 - 4 ausgefallene D i n i t r o b e n z o a t bildete nach zweimaligem Umkristalli- sieren aus 30-proz. Eesig6ure unregelmiiDige Tiifelchen (80 mg) vom Schmp. 178O (Schmp. von Iso leu c i n - 3.5 - d i n i t r o - b enz oa t 170.4O). Nach 2stdg. Hydrolyse mit 20-proz. Salz- saure und Entfernung der Dinitrobenzoe6ure wurden 15 mg einer farblosenVerbindung mit dem Schmp. 247O und [ a ] g : -14.4O (Wasser) erhalten, die sich im Papierchromato- gramm wie I s o 1 e u c i n verhielt.

In einem anderen Versuch wurden 300 mg Aminosiiure-Gemisch kurz mit Alkohol extrahiert und darauf im Extraktionsapparat 6ma1 aus 99-proz. Alkohol umkristallisiert. Das so erhaltene Kristallisat (70 mg) gab eine intensive Ninhydrin-Reaktion; Schmp. 276O, [a]”: -15.2O (Wasser).

Ber. C 54.94 H 9.99 N 10.68 Amino-N 10.62 Gef. C 54.31 H 9.69 N 11.00 Amino,-N 10.19, Mo1.-Gew. 117

(ebullioskcp. in Eisessig)

.. . ~ ~~ ~ ~~

Nr. 3119511

C,H,O,N (131.2)

P r a p a r a t i v e T r e n n u n g d e r Aminosauren d u r c h P a p i e r c h r o m a t o g r a p h i e Daa verwendete Aminosiiure-Gemisch enthielt 9.6% Gesamt-Stickstoff, 3.1 % Amino-

Stickstoff und 5.1 :(, N-MethyL Von einer 4-proz. wMr. Losung dieses Gemisches wurden 0.25 ccm, enthaltend. 10 mg Aminosauren, rnit einer feinen Pipette auf einen Filtrier- papier-Bogen ( W h a t m a n Nr. 1) entlang einer Linie aufgetragen, die in 7 cm Abstand dem breiteren Rand des Bogens parallel lief. Aniang und Ende des Striches waren 3 cm

2a) G. B. Town, Biochem. Journ. 36, 578 [194l].

Chemiache Berichte Jahrg. 81. 20

Page 21: Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

280 Brockmann, Grubhofer, K a s s , Ka lbe : r Jahrg. 84

von den Schmalaeiten entfernt. Nach dem Trocknen wurden je 10 solcher Bogen mit der dem Aminosiiure-Streifen benachbarten Kante in den mit frisch iiber Zinkstaub destil- liertem wassergesiittigten o-Kresol gefiillten T r o p ) dea Chromatogramm-Kastem ge- hiingt. Durch Einschieben von 5 mm starken Glasstiiben zwischen die Bogen (Abbild. 4, S. 270) lien sich eine gegenseitige Beriihrung verhindern.

Nachdem das Kresol den unteren Rand der Bogen erreicht hatte, wurden die= zu- Gchst bei Raumtemperatur vorgetrocknet und d a m bei 105O vom reatlichen Kreaol be- freit. Zur Enielung guter Chromatogramme war es wichtig, wiihrend der hu f i e i t des Liisungsmittels die Temperatur im Kasten auf 2O konetant zu halten.

Nach dem Entwickeln mit Ninhydrin (0.4-proz. Lijsung in Butanol) zeigten solche Bogen fiinf parallel zur Lijsungsmittelfront verlaufende, gewellte und gezackte Biinder von 3 cm Breite. Zur Gewinnung der Aminosliuren wurden auf jedem Bogen nur zwei 5 mm breite Leitstreifen in der Laufrichtung des Lijsungsmittels mit Ninhydrin-Lsung bespriiht und entwickelt, nach denen die Aminosiiure-Biinder ausgeschnitten wurden. Je 30-40 gleichartige wurden mit einer Klammer zu einem Biindel zusammengenommen und durch Einhangen einer Schmahite in einen mit Wasser gefullten Trog emchopfend eluiert, waa etwa 5 Stdn. dauerte. Die eingedampften Eluate wurden aus wenig Waaser unter Zusatz von Tierkohle umkriatahiert.

Die einzelnen BLnder und die daraus eluierten Fraktionen sind im folgenden nach atei- gendem RF-Wert von I-VI numeriert. Band I enthalt das Threonin. Die Bander I1 111 und IV mit Sarkosin, Vslin und Isoleucin iiberlappten sich hlufig. Sie wurden daher zusammen als ein Streifen ausgeschnitten und eluiert. Daa Eluat chromatographierte man erneut in der eben beschriebenen Weise, wobei aber Butanol-20-proz. Essigsiiure als Phasenpaar gewahlt wurde. Dabei entwickelten sich gut getrennte Zonenbander. Band V enthielt Prolin, Band VI das N-Methyl-valin.

2 - T h re onin : Aus 600 mg AminosLure- Gemisch erhielt man auf 30 Bogen nur 10 mg Fraktion I. Sublimation bei 1000/0.01 Torr lieferte ein kristallisiertes Sublimat vom Schmp. 24@-242O; [XIS: + 7 O (Wawer).

C,H,O,N (119.1) Oxydation mit PerjodsLurenach Nicolet35) ergab Acetaldehyd, der ale 2.4-Dini-

t ro-phenylhydrazon vom Schmp. 146O identifiziert wurde. Mit synthet. Acetaldehyd- dinitrophenylhydrazon keine Schmp.-Erniedrigung.

Der mikrobiologiche Test des Aminosiiure-Gemiches ergab einen Gehalt von 43?, l-Threonin. Bei einer Probehydrolyse, bei der 400 mg Actinomycin C von vornherein mit 100 mg d,l-Threonin vemtzt worden waren, so d a B im Hydrolysat 17.6% I-Threo- nin zu emarten waren, wurden 15.6% gefunden.

Sarkosip: Wie erwahnt, konnten die Biinder 11, 111 und I V durch Chromatographie mit 0-Kresol nicht vollig aufgetrennt werden. Daa Gemisch dieser drei Fraktionen m d e &her nochmals chromatographiert, wobei ale mobile Phase Butanol diente, welches durch Schiitteln mit 20-proz. Eseigeiiure gesiittigt worden war. Die Reihenfolge der Zonen blieb dabei die gleiche.

Durch Elution von 100 Bandern der Fraktion I1 konnten 12 mg eines Bristalliaata ge- women werden, das mit Natriumhypochlorit-Lsung deutlichen Geruch nach Methyl - amin gab. Die Fraktion wurde papierchromatopphch durch Vergleich mit reinem Sarkosin als solchee identifiziert.

RF-Werte in verschiedenen Loeungsmitteln

Ber. C40.33 H 7.62 N 11.76 Get C40.52 H7.91 9 11.58

Frakt. II Serkoein Rakt . 11 Sarkoein Kmol .......... 0.35 0.34 Phenol .......... 0.74 0.73 Butanol-Easigkure 0.23 0.17-0.21 sek. Butanol ..... 0.84 0.84 Benzylakohol ... 0.09 0.08 Collidin .......... 0.08 0.08

CIH,O,N (89.2) Ber C 40.44 H 7.92 N 15.72 Qef. C 40.43 H 7.89 N 15.64

24) Wir verwendeten 50 cm lange, 3-5 cm breite und 5 om hohe Tr6ge rnit t r a p -

1 6 ) L. A. Shinn u. B. H. Nicolet, Journ. Biol. Chem. 188, 91 [1941]. formigem Querschnitt aus glaaiertem Steingut, die in einer Topferei engefertigt weren.

Page 22: Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

1)as Gemisch der Fraktionen IT, 111 und IV enthielt 0.90; "Methyl. Daraus berechnet sich ein Sarkosingehalt von 5.5'7;.

d - Valin: Fraktion 111, die durch Hochvakuum-Sublimation gereinigt wurde, fie1 ebenfalls nur in sehr geringer Menge an. Rp-Wert in o-Kresol 0.52, in Butanol-20-pmz. Esaigsiiure 0.41, in obereinstimmung mit dem zum Vergleich untersuchten d,l-Valin Schmp. 2960; [.I'D": +5.80 (Wasser), -24.9O (20-proz. Salzsiiure).

C,H,,O& ( l l i .14) Ber. C 51.26 H 9.47 N 11.96 Get C! 51.13 H 9.61 N 12.02 Beim mikrobiologischen Test d a Gemisches der Fraktionen 11, I11 und IV war kein

2-Valin festzustellen (Erfaeaungsgrenze 0.2%). wohl aber in einer Menge von 2%. nach- dem durch Erhitzen mit heiugesiittigter Bariumhydroxyd-bang (12 Stdn. bei 105O) ram- misiert worden war. I m nunmehr optisch inaktiven Gemisch der drei Fraktionen miiseen also urspriinglich 4% d-Val in vorhanden gewesen sein.

d - A110 - isoleuc in: Aus 8OOmgAmino&ure-Gemisch wurden auf80 Bogen Fdtrierpapier mit o-Kresol ale mobiler Phase 184mg kristallisiertea Gemisch der Fraktionen 11, ILI und IV erhalten. Bei der Chromatographie des Gemisches auf 12 Bogen rnit Butanol- 20-proz. Essigsiiure erhielt man aus Fraktion IV nach zweimaligem Umkriillisieren am Wesser und Hochvakuum-Sublimation 32 mg gut kristallisierter Aminoeiiure rnit siilkm Geschmack. Schmp. 284O; [a]g :-15.60 (Waaser), -31.8O (20-proz. Salzsiiure, c=2.7).

Phenylisocyanat-Verbindung: 6 mg derAminosiiure wurden in 0.5 ccm 0.2n NaOH unter Eiskiihlung mit 10 mg P h e n y l i s o c y a n a t geschiittelt, bis dessen Geruch verachwunden war. Nach Zuacltz von etwas Tierkohle filtrierte man vom ausgefallenen Niederschlag ab und gab zum Filtrat 0.55 ccm 0.2 n HC?. Die nach einiger Zeit ausgeachie- denen Kristalle wurden aus verd. Alkohol umkriitallisiert; Schmp. 157O. E. A b d e r - h a l d e n und W. Zeisset geben den Schmp. 151O anPe).

N a p h t y l iso c y a n a t - Verb i n d u n g : Sie wurde analog der vorstehenden Verbindung darrgestellt; Schmp. 167-168O. Abderha lden und Zeisset fanden den Schmp. lao a@).

Formyl-Verbindung: 20 mg der Aminoeiiure wurden in 1 ccm w a s e r h i e r Ameisensiiure unter FeuchtigkeitsabschluB drei Stdn. auf 100° erhitzt. Nachdem die Siiure i.Vak. abgedampft war, wurde der Riickstand in wenig Ameisensirure aufgenom- men und diese wiederum verdampft. D i e Behandlung wurde noch ein zweites Ma1 wie- derholt. Den i. Vak. uber Kaliumhydroxyd getrockneten Riickstand extrahierte man mit einigen ccm Essigester, filtrierte vom Ungelijeten ab und engte auf 0.5ccm ein. Naoh Zusatz des doppelten Volumens Petroliither schioden sich Kristalle Bun, die nach noch- maligem Umkristalliaieren aus Eeeigeater-Petroliither unscharf gegen 125O schmolzen. A b d e r h a l d e n und Zeisset fanden den Schmp. 126O *6).

A b b a u m i t Ninhydr in : 10 mg Aminosiiure wurden nach K. Lohrs7) abgebmt und lieferten ein optisch aktives 2.4-Dinitro-phenylhydrazon vom Schmp. 130O.

2-Prolin: Fraktion V zeigte den RF-Wert des Prolins und die fur diw Iminosiiure charakteriatische Gelbfiirbung mit Ninhydrin. Der Verdampfungsriicknd des Eluates aus 50 Bogen Filtrierpapier wurde in wenig heiBem abed. Alkohol gelost und mit Ather wieder ausgefiillt. Das so erhaltene, stark hygroskopische F'rodukt wurde i. Hochvak. sublimiert und dann aus Waeaer umkristelliaiert; Ausb. 60 mg. Schmp. 218O, [a]B: -75.4O (Wasser). Daa bei 199O schmelzende R e i n e c k a t gab mit P r o l i n - R e i n e c k a t keine Schmp.-Erniedrigung.

Aus dem Aminosiiure-Uemisch, daa nach dem mikrobiologischen Teat 207; Prolin enthiilt, ist diesea auch ohne. Anwendung der Chromatographie leicht zu iaolieren, indem man das Gemisch rnit Alkohol k u n extrahiert, die alkohol. Liisung eindampft, in wenig Waaser eufnimmt und mit Reinecke-Salz in schwach salzsamr Lasung fillt. Das Rein- eckat wird in der iiblichen Weise zerlegt.

C,H,,O,N (131.2) Ber. C 54.94 H 9.99 N 10.68 Gef. C 55.07 H 9.99 N 10.65 <

CsHBO& (115.1) Ber. C 52.16 H 7.88 N 12.17 Gef. C 50.5 H 7.85 N 12.40 N-Methyl-Z-val in: Fraktion VI, das untamte Band des Chromatogrammea farbte

sich auf dem Papier beim Beapriihen mit 0.1-prdz. benzolischer Liisung von p - N i t r o -

e7) Biochem. Ztschr. 820, 115 [19M)]. Ztschr. phpiol. Chem. 186, 121 [1931].

Page 23: Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

benzoylchlor id und anschlieDendem Betupfen mit Pyridin voriibergehend kirschrot (Reaktion von E. Waser2*)). RF-N'erte: Kresol 0.85, Benzylalkohol 0.40, Collidin 0.40. Mit einem synthet. N-Methyl-d,Z-valin wurden die gleichen Werte erhalten. Schmp. 290°, [a]E: +16.5O (Wasser), +28.6O (10n HCl). PI. A. P l a t t n e r und U. Nager2#) fanden [a]g.s: f17.5 (Wasser), f30.9 (5n HCI).

C,H,,O$l (131.2) Ber. C 51.94 €I 9.99 N 10.68 N-CH, 11.93 Gef. <! 54.61 H 9.69 N 10.39 N-CH, 12.05

5.) Energische S i iurehydrolyse d e s Act inomycins C u n t e r r e d u - z ie renden Bedingungen

a) H y d r o l y s e m i t Salzsi iure u n d Zinn(I1)-chlor id: 230 mg A c t i n o m y c i n L! in 4ccm konz. Salzsiiure wurden nach Zugabe von 160mg Zinn(I1)-chlorid 16 Stdn. im Bombenrohr unter Stickstoff auf 90° erwiirmt. Die anfangs gelbe Issung wurde bald rot und ein roter Xederachlag fie1 aus. Nach beendeter Reaktion wurde das Hydro- l p a t erschopfend rnit Butanol extrahiert, daa alle gefarbten Anteile aufnahm. Die Bu- tanollosung schiittelte man zweimal mit 0.1 n HC1 durch. Die wiiDr.-salzsaure Phase dieaer Verteilung wurde rnit der durch Schwefelwasserstoff vom Zinn befreiten Hydrolysen- fliisaigkeit vereinigt und i. Vak. iiber Kaliumhydroxyd eingedunstet. Der Ruckstand zeigte im Papierchromatogramm die sechs'im Actinomycin C enthaltenen Aminosiiuren.

Die gelbrote Butanollosung schiittelte man zur Oxydation u. U. vorhandener Leuko- verbindungen rnit 1 ccm 0.5-proz. Wasserstoffperoxyd, wobei sich die Farbe der Lijsung erheblich vertiefte. Die mit W d e r gewaachene Butanollosung wurde i.Vak. zur Trockne verdampft und die Chloroformlosung des Riickstandes durch eine Saulc von Kieaelgel filtriert. Durch fraktionierte Elution mit Benzol-Athanol (1 : 1) wurde eine Fraktion er- halten, die beim Eindampfen ein rotes Pulver hinterlieB. Dieses Produkt lieferte nach 24stdg. Hydrolyse nut konz. Salzsaure ein Hydrolysat, das im Papierchromatogramm ke i n e Aminosaureflecken zeigte.

b) H y d r o l y s e m i t Jodwasserstoff-Eisessig: Eine Losung von 170 mg A c t i n o - m y c i n C (neu) in einer Miscliung aus 5 ccm Eisessig und 3 ccm Jodwasserstoffeiiure wurde nach Zusatz von 0.8 g Phosphoniumjodid 12 Stdn. im geschlossenen Rohr auf 100° erhitzt. Die Liisung wurde durch das Phosphoniumjtdid sogleich hellgelb und behielt diese Farbe wiihrend. der ganzen Reaktionsdauer.

Der beim Eindampfen i. Vak. hinterbliebene olige Riickstand wurde zwischen 10 ccrn Wasserund 10 ccm Benzol verteilt, wobei die farbigen Anteile in die Benzolphaae gingen. h i m Filtrieren der mit Natriumsulfat getrockneten Benzollosung durch eine SIule von Kieselgel bildete sich eine schmale braune Zone, wahrend die Hauptmenge d$ Siiule ah' intensiv blau fluorescierendes Filtrat verliel3. Beim Verdampfen hinterlieD es farb- lose Nadeln, die nach Umkristallisieren aus Petrolather bei 114--115° schmolzen. Nach 24stdg. Kachen mit konz. Salzsiiure waren im Hydrolysat dieser Fraktion papierchromato- graphisch keine Aminosiiuren nachzuweisen. Die vom Benzol abgetrcnnte wiiBt. Phase versetzte man mit iiberschiiea., heiB gesiitt. Silberacetat-Lasung, filtrierte den ausgefal- lenen Niederschlag ab und verdampfte, nachdem zuvor das Silber mit Schwefelwaaser- stoff entfernt war, das Filtrat zur Trackne. Im Papierchromatogramm des farblosen kristallisierten Riickstandes fehlte der Threonin-Fleck, wahrend die iibrigen im Salzsiiure- und Schwefelsiiure-Hydrolysat nachgewiesenen Aminosiiuren vorhanden waren.

6.) Milde S a q r e h y d r o l y s e d e s Act inomycins C Ammoniakbes t immung: Eine Liisung von 598 mg Act inomycin C (neu) in

12 ccm 6% HCl wurde 25 Min. auf 100° erhitzt, dann auf 60 ccm verdiinnt und 8 Stdn. im Perforator mit Ather extrahiert. Dcr Ather hinterlien beim Verdampfen keinen wag- baren Riickstand. Das Hydrolysat wurde i.Vak. verdampft und der Riiclratand in Borat- Puffer vom pH 10 aufgenommen. Diese l&ung wurde im Kjeldahl-Apparat im Wasaer- dampf-Strom destilliert und das entweichende Ammoniak in einer Vorlage in 0.1.n HC:l aufgefangen; gef. 5.9 mg NH, (0.89 3101.). _____

Helv. chim. Acta 2, 757 [1924]. *O) Helv. chim. Acta 31, 3194 [1948].

Page 24: Über das Actinomycin C (Antibiotica aus Actinomyceten, V. Mitteil

Uher das Actinoniycin C 283 ~ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ~

Nr. 3/1951]

Hydrolyse m i t Eisessig-Salzsi iure: Eine Losung von 200 mg Actinornycin c' (neu) in 20 ccm eines Gemisches aus glcichen Volumina Eisessig und 10-proz. Salzaiiure wurde bei 374 aufbewahrt. In groderen Zeitabstiinden wurde 1 ccm abpipettiert und im Vakuumexsiccator iiber Kaliumhydroxyd zur Trockne verdampft. Ei Teil des roten, lackartigen Ruclrstandes wurde im zweidimensionalen Papierchromatogramm mit P h e n o l und Coll idin als mobile Phasen untersucht. Nach zwei Wochen traten schwache Flecken von N-Methyl -va l in und Allo- isoleucin ad, die im L a d e der folgenden Woche immer deutlicher wurden. Sach einer Hydrolyeendauer von etwa 8 Wochen emchienen im Papierchromatogramm auch die Flecken der anderen Aminosiiuren und wurden im weiteren Verlauf der Spaltung stiirker. Die roten Bestandteile des Hydrolyaates hatten immer den RF-Wert 1. Nach 16 Wochen wurde die Hydrolyae abgebrochen, der Rest der tiefroten Reaktionslosung im Exsiccator verdampft und der Ruckstand zunilchst er- schopfend mit Chloroform, dann mit Aceton und schliedlich rnit Butanol auegezogen. Geringe Mengen eines schwamn, pulvrigen Riickstandes hinterblieben ale unliislich in Butanol.

Alle drei Fraktionen waren rotbraune, amorphe Produkte, die rnit Zinn(I1)-chlorid einc intensive Griinfiirbung zeigten. Im Papierchromatogramm enviesen sie sich ale frei von beigemengten Aminosiiuren. Wurden sie 24 Stdn. mit 20-proz. Salzsiiure gekocht, SO entstand wie beim Actinomycin C ein schwaner, melaninBhnlicher Niedemchlag und im Chromatogramm konnten noch alle Aminosiiuren des Actinnmycins C nachgewieaen werden.

Die fa rb igen A b b a u p r o d u k t e d e r mi lden Salzsi iure-Hydrolyse: 1 g Actino- m y c i n C (olt) wurde mit 10 ccm 20-proz. Salzsiiure 20 Min. auf 105O erwarmt. Nachdem i. Vak. zur Trockne verdampft war, wurde die Lijsung des Riickstandes in 10 ccm Weaser durch eine Saule von Aluminiumoxyd (Liinge 10 cm, Durchmeeeer 2 cm) filtriert und ausgiebig mit 0.1 n HCl nachgewaachen. Es bildete sich eine gelbrote, f& haftende Zone und ein gelbes Filtrat. Daa i. Vak. auf 20 ccm eingeengte Filtrat fallte man mit iiberschiise, Sublimatlosung und zerlegte den abzentrifugierten Niederschlag rnit Schwefelweeserstoff. Das Filtrat des Quecksilbersulfid-Niedemchlages hter l ieB beim Verdampfen daa H y d r o - chlor id der Elua tbase . Durch mehrmaligea Abdampfen mit Waseer entetand aus dem Hvdrochlorid die Base, ein gelbbraunea Pulver, das sich in Pyridin, Ekssig, weniger gut in Butanol loste, in Wasser dagegen unloslich war. Aus der wii0r. Liisung des Hydro- chlorides fie1 auf Zusatz von Goldohlorwassemtoffkiiure ein orangeroter Niederschlag, der aus heidem Alkohol umgelost wurde.

Gef. C44.85 H 5.59 N8.59 Au 17.5 Durch Umsetzen der wiih. Liisung des Hydrochlorides rnit Pikrolonsiiure lieB sich ein

gelbbraunes, amorphes P i k r ol on a t gewinnen. Gef. C 53.77 H 5.98 N 13.95, Amino-N 0.45

Versetzt man die Eluatbase oder ihr Hydrochlorid in Eiceaaig mit dem gleichen Vo- lumen ge&tt. Natriumnitrit-Lijsung und verdiinnt nach einigen Minuten mit dem 20fachen VoL Waseer, so fallt ein hraunroter Niederschlag aus, der in der von Feiglao) angegebenen Auafiihrung als Tiipfelreaktion eine positive LiebermFnnsche Nitroso-Reaktion zeigt.

Die gelbrote Zone des Hydrolysates wurde mit Pyridin-Waseer (1 : 1) eluiert, daa Eluat zur Trockne verdampft und die konz. wal3r. Llisung dea Riickstandes mib Pikrolodure- Lawng vereetzt. Daa auagefallene P i k r o l o n a t zerlegte man mit 2 n HC1, schiittelte die Pikrolonsiiure rnit Benzol aus und verdampfte die wiiDr. Phase. Der Riickstand wurde ernent in das Pikrolonat tibergefiihrt.

Gef. C 53.55 H 6.15 N 13.78 Amino-N 0.43 Verbesscr te D a r s t e l l u n g d e r Abbauhascn: Urn die E l u a t b a s e , die bei bn-'

gerer Einwirkung der SBure in die Zonenbase iibergeht, in beseerer Auabeute zu erhalten, wurde die mit 6n HCl bei 100° angeeetzte Hydrofyse des Actinomycins nach 5 Min. unter- brochen, die Salzsiiure i. Vak. verjagt und der Riickstand zweimal mit Weeser ausgezogm, das die Spaltbesen aufnahm. Unverandertes Actinomycin, das ungelost zuriickbleb,

30) F. Feigl, V. Anger u. 0. F r e h d e n , Mikrochem. 15, 181 [1934].

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Brockmann, Henkel: Pikromycin, ein bitter [Jahrg. 84 __ ~~~~~ .

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wurde erneut in gleicher Weise hydrolysiert und die Behandlung wiederholt, bis alles Aus- gangsmaterial umgesetzt war. Daa wabr. Hydrolysat wurde durch eine Aluminiumoxyd- Siiulefiltriert und die Siiule so lange rnit Weseer gewaachen, bis das Filtrat nur noch schwach gelblich gefiirbt war. Zur r6stlosen Entfernung der Zonenbase wurde daa Filtrat nochmals durch eine Aluminiumoxydsiiule gegeben. Das Filtrat dieser Adsorption machte man mit Natronlauge schwach alkallisch und schiittelte rnit Essigester aus. AnschlieBend wurde mit verd. Salzsiiure angeeiuert und die Eluatbase rnit Chloroform ausgeschuttelt. Die getrocknete Chloroformlosung hinterlieb beim Verdampfen das H y d r o c h lor id d e r E l u a t b a s e . Aus seiner konz. Liisung in Methanol fie1 bei Zusatz von gesiitt. P i k r i n - aiiure-lijsung daa o r a n g e r o t e P i k r e t , daa zur Reinigung in Chloroform gelost und durch Zugabe von Ather ale flockiger, orangerotar Niederschlag wieder ausgefiillt wurde:

Die Zonenbase wurde aus Actinomycin C (neu) 80 dargestellt, daO die Hydrolyse mit azeotroper Salzeiure im Waaserbad nach 30 Min. durch Abdestillieren der Salzsiiure i.Vak. beendet wurde. Der Rucketand wurde in Butanol eufgenommen und die Lijsung a n Aluminiumoxyd chromatographiert. Die Eluatbase konnte durch liingeres Nach- waachen mit Butanol vollig entfernt werden. Sodann wurde das Butanol in der Saule durch Athanol verdriingt, dieses durch Wasser und endlich durch n/lo NaOH. D m alkal. Eluat wurde schwach angesiiuert und mit Butanol-Chloroform (1 : 9) ausgeschiittelt. Nach Verjagen des Usungsmittelgemisches i. Vak. wurde das zuriickgebliebene Zonenbw- Hydrochlorid in gleicher Weise wie daa der Eluatbaae in des Pikrat iibergefiihrt. Daa Pikrat wurde in wenig Methbnol gelost, mit ? Z / ~ ~ H C ~ versetzt und die Pikrinsiiare im Perkolator ausge&thert. AmchlieBend wurde die Zonenbase in Butenol-C%loroform (1 : 9) geschiittelt und hinterblieb beim Verdampfen des Lijsungsmittels als amorpher, gelh- brauner Ruckstand.

39. Hans Brockmann und Willfried Henkel: Pikromycin, ein bitter sehmeckendes Antibioticum aus Aetinomyceten (Antibiotica 8us Actino--

myceten, V1. Mitteil.*)) [Aus dem Organisch-Chemischen Institut der Universitiit Gottingen]

(Eingegangen am 16. November 1950)

Es nird die Isolierung eines bitter echmeckenden Antibioticums aus einem Slwptonzyces-Stamrn beechrieben, fiir daa die Bruttoformel C,,H,O,N ermittelt wurde. Durch Alkali lieB sich damus ein stick- stoff-freies Abbauprodukt CZoH,,O, gewinnen.

Wie' bereits kurz mitgeteilt, konnteri wir aus der Kulturflussigkeit eines noch nicht naher charakterisierten, in unwrem Institut von W. Lindenbein und I. Olfermann isolierten Streptomyces-Stammes (Stamm 326) ein kristalli- sieites Antibioticum abtrennen, das wir seines bitteren Geschmackes wegen P ik romyc in genannt haben'). Im folgenden berichten wir ausfuhrljcher ubcr Darstellung und Eigenschaften der neuen Verbindung.

Zur Isolierung des Antibioticums wurde der Stamm 326 im Submers-Ver- fahren mit Glycerin und Glykokoll als Kohlenstoff- bzw. Stickstoff- Quelle kultiviert, wobei die gegen Staphylococcus aureus getestete antibiotische Wirk- samkeit der Nahrlosung nach 6-8 Tagen ihr Optimum erreichte. Ather oder beaser Athyl- bzw. Amylacetat nahm beim Verruhren mit der vom Mycel be-

*) V. Mitteil.: B. R. vorstehende Arbeit, R. 84, 260 [1951]. l) H. B r o c k m a n n u. W. H e n k e l , Naturwiss. 35, 138 [1950].