Uber den Aufbau der Wandungen yon Cladophora glomerata im Lichte der verfeinerten Methoden

der Lichtmikroskopie Von

Hermann und Hugo Ziegenspeek~ Augsburg

Mit 3 Textabbildungen

(Eingelangt am 10. April 1951)

Cladophora glomerata gedeiht in rasch fliel~enden Biichen, wo sie flat- ternde Bewegungen ausfiihrt. Wenn auch mit Hilfe des Polarisafionsmikro- skopes und der Dichroskopie (Z ieg e n s p e c k 1939) Querxnicellierung der primhren, diinnen Lamelle und Liingsmicelliecung der derben oder sehr derben, sekund~iren Lamelle festgestellt wurden, so kann das noch nicht diese sehr starke mechanische Beanspruchung erkl~iren. Andere Methoden ( F r e y - W y s s l i n g 1938) haben besonders lange Makromolekiile tiber 2,5# bei den Siphonocladiale:s, zu denen diese polyenergide Alge gehtirt, fest- gestellt. Es lag daher in Ausdehnung der Ergebnisse bei Fasern und Holz- fasern ( Z i e g e n s p e c k 1951) nahe, die Methoden der verfeinerten Licht- mikroskopie zu verwenden.

Angelehnt an die Methodik der Elektronenmikroskopie wurden folgende Wege gewhhlt, weil uns die Metallbeschattung nicht zug~inglich war:

1. Einbettung an im Brechungsexponenten ans~eigende Medien: Gemische yon Phenol mit Glycerin, Milehs~iure, Paraffin61, Chdax, Immersions61 u. dgl. Es wird angestrebt, einen Brechungsexponenten zu erreichen, der den der g a n z e n Wandung fast erreicht oder wenig tiberschreitet, well so eine Differenzierung innerhalb der Wandung erm6glicht wird uJ~d zugleich die Reflexion an der Grenze der Wand I ausgeschaltet ist.

2. Auseinanderziehen der Einzelelemente der Wandung dutch beginnende oder schwache Quellung in Natronlauge, Chlorzinkl6sungen und selbst kurzes Verweilen in Kupferoxydammon. Es ist denkbar, daf~ ein Tell der Wand: die ,,Fiillung ~ bereits verquollen w~ire, wenn die dichter gepackten Elemente noch wenig angegriffen sein wiirden.

3. Die Quellung zumal in Kupfoxydalnmon, Chlorzinksalzshure, Schwefels~ure usw. wird etwas weiter getrieben. Durch Auswaschen in Ammoniak oder verdtinnten S~iuren je nach dera Angewandten kann dieser Vorgang unterbrochen werden.

Zum Beobachten wird man Methode 2 mit 1 kombinieren. Aufhellen mit Eau de Javelle und HerausliSsen yon Inhaltsstoffen und Olen mit Alkohol,

16 14. und H. Ziegei~sped<

H~irtosol, Aceton und ;~ther sorgen fiir das Entfernen stSrender Inhalts- stoffe. Stiirke kann dureh kurzes Koehen in verdiinnter HC1 entfernt werden.

Die Beobaehtungsmethoden sind folgende: A. Die Priiparate werden zwisehen gekreuzten Nikols mit sehr inten-

siver, aber gekiihlter Beleuehtung dutch Niedervoltlampen oder Bogen- lampen betraehtet. Die kristallisierten Elemente ergeben Additionsfarben hellgrau bis weil]lieh (oder aueh Subtraktionsfarben dunkelgrau bis sehwarz), je naeh der Stellung zur Sehwingungsebene des Polarisators. Sie heben sieh dann }seller leuehtend (oder s&leehter dunkler) yon dem sehwaeh grau antin- gierten Untergrunde ab. Man kann aueh eine ganz sehwaehe Glimmerplatte

VergrSfierung 1 : 1000 Dunkelfeld 1/7 hnm. Leitz Periplan 10 Leica l m m = l ~ .

Abb. 1. Die Polarisationsebene (Pfeil) liegt quer zum Faden, daher nut Fila der Primhrwand siehtbar. Phenol mit 10N Glyzerin.

etwa 2/8 bis 2~/10 einsehalten, manehmal hilft ganz sehwaehes Abweiehen der Nikolstellung yon der Vertikalen. Als Objektive wiihlte ieh mit grbf]tem Vorteile 1/: F1 yon Leitz, ~-eil dieses verh~iltnism~ifiig hohe numerisehe Appertur mit gro!3er Tiefensehiirfe vereinigt. Die Ausschaltung yon allzu intensiver Einstrahlung seitlieher Objekte usw. nimmt man mit einer Apper- turblende vor. D as Objektiv Immersion F/100 mit Apperfurblende yon Reiehert leistet ebenfalls sehr gute Dienste.

B. Dunkelfeld ohne oder besser mit Azimutblende wirkt mit 1--5 ver- einigt ganz eigenartig. Nach Aussehalten der Reflexe an der Wandober- f]gehe durch die Einbetfung kommen die Breehungsuntersehiede i n n e r h a l b der Wandung zur Gelfung. Das Dunkelfeldlieht ist zudem infolge der

Aufbau der wandungen yon Cladophora glomerata 17

Spiegelungen polarisiertl Die kristallinen Elemente der Membran wirken nun als zweiter Nikol; wir k5nnen durch Drehen der Pr~iparate entweder die liings- oder quergeriehteten Einzelteile siehtbar maehen. Mit-unter erhbht man die Deutliehkeit der Bilder dutch Aufsetzen eines Analysators oder dnreh die Apperturblende des Objektivs, wodureh ~;berstrahtung Yer- mieden wird.

C. Das Phasenkontrastverfahren im Verein mit 1--3 l[ifit im~erhalb der Wandung mehr oder weniger deutlieh die Einzelelemente erkennen. Oft jedoeh sind die Bilder noeh kontrastarm. Da die Inter ferenz (Z i e g e n s p e e k 195t) yon de r Kristallnatnr abhiingig ist, so bekommt man dutch Aufsetzen eines Analysators oder Unterlegen eines Polarisators sehr dent- liehe Bilder. Parallel zur Sehwingungsebene ist die Interferenz am stiirkstem Ieh mSehte das gerhalten als ,,Diinterferenz" bezeiehnen. Es ist atso eine iihnliehe Er-. scheinung wie die Absorp- tion einzelner Wellenl~ingen, die zum Diehroismus fiihrt, Die Kombination mit Di- ehroismtis naeh sanfter An- fiirbung dutch Coriphosphin oder aueh Akridinorange er-

�9 hbht die Kontraste no& mehr. Das Einsehalten Yon geeigneten Kontrastfiltern (Blaugriin oder Gelbgriin) Abb. 2. Da die Polebene lfings zum Faden streicht, ergibt zuletzt die besten sind die Fila der sekund~ren Wand sichtbar, wie Bilder. oben.

Es gelang uns mit der Kombination der Methoden 1--5 mit A--C feine und feinste Strukturelemente innerhalb der Wandung deutlieh naehzu- weisen. Wir betonen, dal~ bereits Methode 1 allein znm Erkennen fiihrte, was wegen der nur geringfiigigen Eingriffe yon besonderer Wiehtigkeit ist.

Die Bilder naeh 2 ergeben sehr deutlieh mit A--C vereint die Einzel- elemente Yon etwas unter 1 # Dicke. Die Primiirlamelle hat quergeriehtete? etwas kiirzere Teilehen, die wir Fila (sing. Filum -- Faden) nennen, da diese Bezeiehnung noeh nieht abgegriffen nnd handlieh ist.

Ira Dunkelfelde B, Abb. 1 und 2, weniger gut naeh Verfahren A, erkennt man, daft die Fila an den Enden feillst zugespitzt und fiidig ausgezogen sin& Diese Anteile sind 0,1 }~ und darnnter dick. Wit verweisen auf die Photo- gramme A und B, die mit Leiea aufgenommen sind und naeh Feinkornent- wieklung auf 1 : 1000 vergrSl~ert wurden. Diese Yerfilzung der feinsten F~iden

Protoplasma, Bd. XLI/1. 2

18 H. mid I{. Zie~el~speck

bemerkt man am deutliehstel~, "wellll yllall die F~iden zerreil~f. Sie ragen zum Teil frei auf dem Abrisse heraus und liegen haarseharf an der Grenze der Wahrnehmung: Zumal die Azimutbtende und Yerdrehen des Tisehes l~iI~,t sie aufleuehten und als in den Dimensionen des feinen Goldkolloides (also "delleieht Bis etwa 100--60 A) liegend absehiitzen.

Naeh 5 kann man Aufl~isung der Wandung in ein Gewirr derber, meist etwas verbreiterter Fila betraehten (Photogramm 3 linke Seite). Die Breite entsprieht etwa i ]~ gleieh 10.000 A. Deutlieh bemerkt man im Priiparate, besser als im Photo festzuhalten ist, die Aufl6sung der Fila zu noeh feineren Gebilden, die etwa die Dieke der ausgezogenen Enden der Fila, 0,1 # und darunter, haben. Sie breehen noeh deutlieh doppelt. Die Verfeinerung fiihrt z~l Gebi|den yon etwa 0,05}~, was 300A entspriiehe.

Im Sinne der Elektro- nenmikrosko.pie (Fr ey- W y s s l i n g mid M~ihle- t h a 1 e r 1950) haben wir in denFila das vorAugen, was man dort als Mikro- fibrillenbiindel bezeieh- /let.

Die feineren Elemente mid Mikrofibrillen selber oder gehen an sie heran. Die L~inge der Fita ist 10, 13, 20tz und dariiber, Mi- krofibrillen etwa 5, 8, 10 #. Wit betonen, dal~ das Liehtmikro,skop aueh in diesem Falle ~-iel yon den mit dem Elektronen-

Abb. 3. Quelhmg in Kupferoxydammon. Na& Unter- mikroskop siehtbaren breehen in Phenolglyzerin. Links die hellen gequol- Dingen infolge seiner ho- lenen Fila im Verbande, re&is Zerteilung der frei- hell numerisehen Apper-

liegenden Fila zu Mikrofibrillen. ttlr erreiehen lgt~t, well

bei Eigenleuchten die Abbildungsmbgliehkeit naeh dem Dunkelfeldprinzip erweitert i st. u ist abet das Auseinanderzerren der Struktur.

Die Betraehiung bei sehwiieheren VergrSi~ermagen ( Z i e g e n s p e e k t951 a) lehrt nun weiter, dalt die Fila nieht genau lhngs ~erlaufen, sondern in steilen Spiralen stehen, die fiber die erst nachtriiglieh Nngezogenen Zellgrenzen hinweggelaen. Die Fiiden der Algen erhalten damit eine Feder- festigung, wobei Spannen und Entspannen der Feder das wiegende Fluten her-~orruft. Eine derariige Bauart ist nun sowohl den Fasem der hSheren PfIanzen und Moose eigen wie dem Phpcompces unter den Pilzen (F rey - W y s s li n g 1950). Wit nennen sie spirofilat.

Es mua nun die weitere Frage gestellt werden: Ist diese Textur aus Fiiden der vSllig enthiillte Bau der Wandung? Beraits der Versueh, die

Aufbau der Wandungen ~-on Cladophora glomerata 19

Priiparate raseh, z. B. in Paraffintil, einzubetten, lehrt, daft noeh ein Zusatz gemaeht werden muB.; denn es tritt eii1 nieht mehr ausgleichbares Sehrump- ~en und Zusammensinkei1 ein. Aus dem II1halte gehen die Ftillfliissigkeifen viel zu schwer heraus, als es ein soleher Filzbau erwarten liil~t. Es mu[~ noeh eine Fiillsubstanz innerhalb des Filterfilzes vorhanden seth. Set es, daft noeh feinere Fibrillen vorhanden sind, set es, daft nieht kristallisierte Zellulosen im Sinne *con H e r m an vorliegen.

Zur gervollkommnung unserer Untersuehung lag es I1ahe, den IEP mit den Methoden yon H ~ f l e r und P e e k s i e d e r (1947) dutch Einbetten und Fiirben in gepufferter Akridii1orangeltisui1g naehzuweisen.

Absiehtlieh haben wit Membranpr~iparate naeh Aufhellen mit Eau de Javelle und Ausziehen mit Alkohol, Aeeton und Nther gewahlt, um sieher nur Wandungen zu untersuehen. Ein Wasehen in Essigwasser und in destil- liertem Wasser diente zu vblliger Beseitigung adsorbierter Kationen.

Die Wandungen ergaben die kennzeiehi1ende Kupferrotfarbung zwisehen p~ 4,8 und 8 bet Beobaehtung im I/eieherisehen Fluoreszenzmikmsko p. Das Blaulieht ergibt strahlendere Bilder, die zur Untersuchui1g auf Fila ver- wei1det wurden. Mit dieser Fiirbung konnten jedoeh solehe nieht aufge- funden werden, aueh wenn man yon der Apperturblende Gebraueh machte. Offenbar beteiligt sieh die ganze Wandung an dem Zustandekommen der Fiirbui1g des IEP. Unterhalb pK 5,5 sieht mail eine mehr weifilieh-griinliehe Fluoreszenz, bet pK 5,5 ist die F~irbung mehr gelblleh bis gelbliehorange. Bet p~ 11 ist ebenfalls I1ur eine schwaehe orange Fluoreszenz vorhanden.

Das Ergebnis ist insofern wert-r als de r Bereieh der Speieherung der kupferroten Fluoroehromphase nieht naeh Art der htiheren Pflanzen ist, sondern sieh an den der Chitinw~inde der Pilze ansehlief~t. Wenn aueh I1aeh den vorliegenden Angaben Cladophora wie alle Siphonocladiales und Siphonales kein Chitin, also kein N in der Zellwand fiihren sollen, so ver- halten sieh offei1bar die Wandstoffe iihnlieh dem Chitin der Hymenomyeeten. Da naeh den Ergebnissen der Serologie ( Z i e g e n s p e e k und Mez 1929) die Entwieklungslinie yon den SiphonocIadiaIes tiber die Siphonales zu den Phyeomyeeten, Protoascomyeetineae zu den Hymenolnyeeten verl~iuft, so ki3nnte man die Lage des IEP als eine Bestiitigung auf anderem Wege an- sehauen, sofern dahingeriehtete, ausgedehntere Untersuehungen im gleiehen Sinne verlaufen wiirden.

gusammenfassung Mit verfeinerten Methoden l~ifit die Lichtmikroskopie bet Cladophora

glomerata einen eufiliaten Aufbau der Membran nach Art der Fasern der hiiheren Pflanzen erkennen, wie er auch mit dem Elektronenmikroskop und Metallbeschaitung abbildbar ist. Der IEP liegt im Bereiche desienigen der Membran der Pilze, nicht desjenigei1 der Zellwand der hi3heren Pflanzen.

In den angegebenen Schriften finden sich weitere Literaturangaben:

F r e y - W y s s l i n g , i958: Submikroskopisehe Morphologie. Protoplasma-Mono- graphie 15.

2~

20 H. und H. Ziegenspeek: A u f b a u der W a n d u n g e n yon Cladophora glomere~ta

F r e y - W y - s s l i n g , 1949: Desgl. in For t schr i t te der Botanik XII. - - 1950: Der submikroskopische Fe inbau yon Chi t inzel lw/ inden. Yier te l jahrber .

Natforsch. Ges. Ziirich 95, 45--52. H 6 f 1 e r - P e c k s i e d e r, /94,7: F luo re szenzmik roskop i s&e Beobach tungen an h6heren

Pilzen. Ost. bot. Zig. 94. M e z - Z i e g e n s p e c k, 1929: Der serodiagnostisd~e KiJnigsberger S t a m m b a u m . M t i h l e t h a l e r , 1950: Die S t ruk tu r der Zellwand. Or ion 5, 26--30. Z i e g e n s p e e k, 1939: Die DifferenzieruHg der l~inzelzelle. P r o t o p l a s m a 32.

- - 1951: Der submikroskopische Bau des Holzes. Handbuch der Mikroskopie 11. - - 1951 a: Cladophora. Forsehungsber id l t e des Natw. Vereins yon Schwaben n a d

Neuburg.