240 Preudenberg und Eichel,

aufgekocht. Die fast farblose Lasung wurde mit Natiiumsulfat ge- trocknet und unter 0, l mm destilliert. 6 g gaben eine bei 115-116° siedende Fraktion von 3,5 g, die noch 3-mal unter Entfernung des Vor- und Nachlaufs destilliert wurden. Zuletzt wurde 3-mal bei 200 Atm. abgeprelt, nachdem jeweils umgeschmolzen war. S o wurden 0,6 g Nitril vom Schmelzp. 32O erhalten, das allen Anforderungen in optischer Hinsicht geniigte.

C,H,ON (133) Ber. N 10,52 Gef. N 10,73. Es wurde in der Kalte aufbewahrt.

Die Drehung wurde in Hexan-Ather (4 : 1) gemessen (c = 1,5).

nber spezifische Kohlenhydrate der Blutgruppen;

von Karl Freudenberg und Helmut Eichel.')

I. Gruppe A. Einlei tung. Vor einigen Jahren hat K.Yosida2) fest-

gestellt, daO sich im Harn von Menschen der Blutgruppe A gruppenspezifische Merkmale nachweisen lassen. Uiese Beob- achtung wurde von B. B r a h n und F. Schiff bestatigt, die im Speichel und Harn nach Extraktion der Lipoide hoch-

l) DenHerrenProfessorenH.Sachs, A . K l o p s t o c k , E . W i t e b s k i danken wir fur ihre freundliche Hilfe, insbesondere fur die Anleitung zur serologischen Auswertung und fur die Uberlassung der hierfur notwendigen Antisera.

Nach unserer 1. vorlliufigen Mitteilung [Naturw. 20, 657 (1932)l ergab sich, daB auler den von uns untersuchten Kohlenhydraten auch spezifische EiweiBkSrper im Harn vorkommen, deren Bearbeitung Herr Dr. E. Jorpea-Stockholm iibernommen hat. Wir verdanken ihm reich- liche Mengen der Kohleuhydratfraktion.

Bei der serologischen Auswertung und bei den Zuckerbestim- muDgen erfreuten wir uns der Hilfe von Fraulein E. Bi6 und Fraulein K. Hampel .

Ein Teil der hier mitgeteilten Ergebnisse ist der Dissertation von H e l m u t E i c h e l , Heidelberg 1932/33 entnommen.

Z. f. d. ges. exp. Med. 63, 331 (1928).

ober speriifische Koldenhydrate der Blutgruppen. 241

wirksame Konzentrate herstellten I). Uber weitere Versuche berichtet F. Sch i f f in seiner Sehrift ,,Uber die gruppen- spezifischen Substanzen des menschlichen Korpers '' 2). Mittels des Hiimolyse-Hemmungsverfahrens wird die sogenannte A-Substanz auch in nicht eingeengtem, ja sogar in ver- diinntem Harn nachgewiesen. Der Versuch zur Anreicherung der Gruppensubstanzen fiihrt zur Feststellung, daD diese nicht oder sehr schwer dialysieren. Bleiacetat schlagt eine unwirksame Beimengung nieder. I)as von Blei befreite Fil trat hat weder EiweiD- noch Lipoidcharakter. I n einer Anmerkung (S. 102) wird mitgeteilt, da8 nach Hydrolyse mit Salzsaure sich deutliche Mengen einer reduzierenden Substanz nachweisen lieden, die S c h i f f als Kohlenhydrat an- sprach. I n einer kurzen Mitteilung konnten dann K . F r e u d e n - b e r g , H. E i c h e l und W. L)irscher13) nachweisen, daS in Praparaten, die nach einem veranderten Verfahren dargestellt waren, ,,der Gehalt an Kohlenstoff und Wasserstoff in die Gruppe der Polysaccharideweist. 4-5Proc.Stickstoff scheinen der Snbstanz eigentumlich zu sein. F e h l i n gsclie Losung wird nach dem Kochen mit Salzsaure stark reduziert." Die isolierten Praparate betrugen ungefahr 1/5000 der Trocken- substanz des Harns.

Spater verijffentlichten B. B r a h n , F. S c h i f f und F. Weinmann4) Versuche uber tierisches Pepsin, das sie in Angriff genommen hatten, weil in fruheren Versuchen festgestellt war, daB gewisse Priiparate aus Tiermagen noch in sehr grofler Verdiinnung die A-Reaktion ergeben. Tatslchlich konnten die Autoren aus gewissen Pepsinproben des Handels Praparate isolieren, die den aus Harn hergestellten sehr ahnlich waren uud das A-spezifische Schaf hamolysin hemmten. In einer spiiteren Untersuchung6) wurde bei der Oxydation des Prlparates aus Pepsin mit Salpeterslure Schleimsaure festgestellt. K. L a n d s t e i n e r hat in- zwischen gleichfdls ein ahnliches Praparat aus Pferdespeichel in Illnden gehabtE), das nach der Hydrolyse gegen 50 Proc. Zucker ergab (be- rechnet als Glucose) und 7,4 Proc. Stickstoff enthielt.

l) Klin. Wschr. 1929, 1523. Jena 1931, 11, 24, 28, 29, 33ff., 102. Naturw. 20, 657 (1932).

3 Klin. Wschr. 11, 1592 (1932). 6, F. S c h i f f , Dtsch. med. Wschr. 59, 200 (1933). 6, Science 76, 351 (1932).

Annalen der Chemie. 610. Band. 18

242 Freudenherg und Eic i ie l ,

Demnach beruht die serologische Ubereinstimmung der Menschen der Blutgruppe A mit den genannten Tieren auf der Gegenwart gleicher oder sehr ahnlicher Substanzen. Unsere Untersuchung erstreckt sich auf StoEe menschlicher Herkunft, und zwar aus Harn von Persocen der Blutgruppe Astark, Null und B. Neben dem bisher besprochenen kohlen- hydrat-artigen Anteil (Schafantejl der menschlichen Blut- gruppe A , nachweisbar durch A-spezifische Hemmung der Schafbluthamolyse l), auf den sich unsere Untersuchung be- schrankt, fand Herr E. J o r p e s in uuserem Laboratorium eine EiweiOfraktion, die gleichfalls einen A-spezifischen An- teil enthalt (Hemmung der Isoagglutination), iiber den er gesondert berichtet hat 2).

D i e S u b s t a n z . 1000 Liter Harn ergeben 6-12 g des Polysaccharids. Dieser A-Anteil ist ein farbloses amorphes Pulver, das sich lejcht mit bellgelber Farbe in Wasser lost. In Alkohol, Aceton, Pyridin und Eisessig ist es so gut wie unloslich, Ioslich dagegen in Glycol, Glycerin und Ameisen- saure. Die Praparate enthalten 1-4 Proc. Asche, die etwa zur Halfte aus Phosphation besteht und nach deren Abzug etwa 43 Proc. C, 6,O-6,5 Proc. H und 5,O-5,5 Proc. N fest- gestellt werden. Wechselnde Mengen Schwefel (geringste Retarage bis hinauf zu 0,6 Proc.) diirften einer Beimengung angehoren, vielleicht auch geringe Betr lge einer Jodalkgl liefernden Komponente (als OCH, berechnet bis 1 , l Proc.). Die spezifische Dreliung schwankt zwischen - 5 O und + 5 Ein Zusammenhang zwischen Wirksamkeit und Drehungs- vermogen hat sich nicht feststellen lassen, und es gelingt nicht, durch weitere Umfallung die Urehung eines Praparates nennenswert zu andern oder die wirksame Substanz wesent- lich anzureichern. Sie enthalt 9-10 Proc. Acetyl, das so

l) Die beaten Praparate zeigen in 1,25 ccm Gesamtvolumen eine noch gerade sichtbare Hemmung bei Verwendung von 0,Ol bis 0,005 y. Herr E. Jorpes fand, da6 5-10.y unserer Priiparate die A-Iso-agglu- tination sehr deutlich hemmen. Uber die Streuung bei der Auswertung vgl. F. Schi f f und Mitarbeiter, a. a. 0.

2, Zschr. f. Immunitatsf. 81, 154 (1933); Acta pathol. et micro]. Scand. 11, 91, 99 (1934).

ober spezifische k'ohlenhydrate der Blutyruppen. 243

fest haftet, da5 man auf N-Acetyl schliefien kannl). Die Substanz reduziert Feh l ingsche Losung nicht und gibt keine Proteinreaktion. Etwa 10 Proc. des Gesamtstickstoffs (0,3-0,7 Proc.) lassen sich nach v a n S l y k e als Aminostick- stoff kennzeichnen. Bei der Ausfuhrung der Reaktion von S a k a g u c h i (Natriumhypobromid und a-Naphtol) auf Arginin in der Versuchsanordnung zur quantitativen Mikrobestirnmung nach E. J o r p e s 2 ) wird festgestellt, daB, einerlei ob man mit 5 n-Salzsaure 8 Stunden kocht nnd entsprechend auf- arbeitet, oder das Praparat unmittelbar untersucht, hoch- stens 3 Proc. des Gesamtstickstoffs als Arginin-Stickstoff nachzuweisen sind, so da5 zunachst vermutet werden mu5, da8 diese Spur Arginin einer Verunreinigung zuzuschreiben ist. F. S c h i f f hat in seinem Prlparat aus Pepsin gleichfalls einen positiven Ausfall der Sakaguchi-Reakt ion gefunden. Farbreaktionen auf Histidin und Tyrosin nach P a u l y in der Versuchsanordnung von J o r p e s bleiben negativ. Eine schwache Gelbf arbung, die dabei auftritt, laBt keine weiteren Schlusse zu.

Hydro lyse . Bei Zimrnertemperatur bewirkt n-Alkali innerhalb von 48 Stunden keine Xnderung der Wirksamkeit. Bei GO O verschwindet die serologische Hemmnngsreaktion innerhalb einiger Stunden fast vollstandig. Dabei nimmt der nach v a n S l y k e bestimmbare Aminostickstoff von rund 0,6 Proc. auf 2,2--2,G Proc. zu. L)a die Praparate etwa 5 Proc. N enthalten, liegt somit ungefahr die Halfte des Stickstoffs nach der Behandlung m i t Alkali als Aminostick- stoff vor. Es ist anzunehmen, daS dies mit der Abspaltung der Acetylgruppen zusammenhangt, die ungefahr dieser Stickstoffmenge entsprechen. Die Molisch-Reaktion auf Hexosen bleibt bei der Behandlung mit Alkali erhalten.

I) Bei Berucksichtigung etwa vorhandenen Chlorions wurden iiber- einstimrnende Werte gefunden bei der Mikrobestirnmung nach R. Kuhn U. H. R o t h [Verseifung mit methylalkohol. Lauge, sowie Oxydation mit Chromsaure, B. 66, 1274 (1933)], ferner bei der Makrobestimmung nach K.Freudenberg U. M. Harder [Umesterung rnit alkoholischer Toluol- sulfosiiure, A. 435, 230 (1923)l.

s, Biochem. J. 26, 1507 (1932). 16*

2, Biochem. J. 26, 1504 (1932).

244 3 r e u d e n b e s . g und E'ichel ,

Die Hydrolyse rnit Schwefelsaure verschiedener Konzen- tration und bei verschiedenen Temperaturen hat durchweg zu der Feststellung gefuhrt, da13 die serologische Wirksamkeit dann verschwunden ist, wenn die Reduktionskraft etwa die Halfte ihres Endwertes erreicht hat. Die Geschwindigkeits- konstante der sauren Hydrolyse, gemessen an der Zunahme der Reduktion, ist von derselben QroDenordnung wie die Hydrolysenkonstante der Starke, Maltose usw. &fit 38-proc. Salzsaure verschwindet bei 18 die serologische Wrksamkeit in einigen Tagen. Als Glucose berechnet, betragt der redu- zierende Zucker nach Beendigung der Hydrolyse ungef ahr 45-50 Proc. des angewendeten Materials. Gleichzeitig bilden sich 5-10 Proc. Huminsubstanzen. Der reduzierende Zucker besteht, wenn nicht ganz, so doch zum Teil aus Galaktose und wurde als as. Phenylmethyl-hydrazon nachgewiesen.

0,400 g des Praparates wurden in 100 ccm 0,2 nSchwefelsiiure im siedenden Wasserbad 6 Stunden unter RuckfluBkuhlung erhitzt. Nach dem Abkuhlen wurde rnit gesiittigter Bariumhydroxydlosung (gegen Kongopapier) neutralisiert, dann nach Zugabe von 2 ccm vcrdunnter Essigsaure mit Tierkolile (mit verdiinnter Salesiiure und 2-mal mit destilliertem Wasser ausgekocht) versetet und nach einigem Steben ab- zentrifugiert. Die wahige, fast farblose Bydrolysenfliissigkeit wurde i.V. auf etwa 10 ccm eingeengt und von den letzten Spuren von Sul- fationen befreit, sodann i. V. zur Trockne verdampft, in Wasser auf- genommen und nochmals zur Trockne verdampft. Alsdann wurde der sohwach gelbe Riickstand nach Losung in wenig Wasser mit einer verdiinnten Barytlosung genau neutralisiert (Lackmus), auf etwa 1 ccm eingeengt, mit 2 ccm Alkohol versetzt, und sofort abzentrifugiert. Die alkoholische LGsung wurde i. V. eingedampft, der Riickstand in Wasser gelost (0,5 ccm), mit 0,4 g frisch destilliertem as. Methyl-phenyl- hydrazin 1) und absolutem Alkohol bis eur klaren Losung versetzt (1,1 ccrn). Nach 15 Minuten begann die Krystallisation. Nach 12-stun- digem Stehen bei Zimmertemperatur wurde abgesaugt. Aus 30-proc. Alkohol wurden schone weiBe Krystalle erhalten.

Vermutlich entstammt die von Schi f f aus tierischem Material isolierte Schleimsaure ebenfalls ganz oder zum Teil der Galaktose. Die Reduktionskraft der Galaktose wurde im Vergleich zur Glucose bei dem bier angewendeten Mikro- verfahren von H a g e d o r n - J e n s e n festgestellt. Dabei zeigt sich, da13 Galaktose unter diesen Umstgnden ungefahr

l) v a n d e r H a a r , Anleitung eum Nachweis, ziir Trennung und Bestimmung der Monosaccharide und AldehydsLuren, Berlin 1920.

Uber spezifische Kohlenhydrate der Blutgruppen. 245

A-Substanz

186 184O

Miachschmelzpunkte rnit den Methyl-phenyl- Schmelzpunkte der Hydrazone aus I hyd razonen von

Galaktose Mannose I Galaktose Mannose

1890 180° 186O 171O 188O 181 186 O 172 188O 180O

Uber spezifische Kohlenhydrate der Blutgruppen. 245

77 Proc. der Reduktionskraft der Glucose besitzt. Farb- reakt,ionen nach L. A. E l s o n und W. Th. J. Morgan1) (Pyrrolreaktion nach Behandlung mit Acetylaceton) zeigen jedoch, daS nennenswerte Mengen Aminozucker im Hydro- lysengemisch anwesend sind, und zwar lassen sich darin mindestens 10 Proc., wahrscheinlich aber mehr, angeben. Freies Glucosamin hat nur 70 Proc. der Reduktionskraft der Glucose. Wollte man annehmen, daS Galaktose und eine Aminohexose zu gleichen Teilen das Polysaccharid aufbauen, so wiirde damit der Stickstoffgehalt zwar zur Hauptsache erklart werden; unverstandlich bleibt aber die erwahnte Tatsache, daI3 nur ungefahr 50 Proc. reduzierender Zucker (als Glucose berechnet) auftritt. Bei der erwahnten Annahme waren etwa 70 Proc. reduzierender Zucker (als Glucose berechnet) zu erwarten. Mit den 10 Proc. Acetyl ist das Defizit allein nicht zu erklaren, entweder mnI3 redu- zierende Substanz zerstort oder nicht reduzierende anwesend sein. Weitere Hexosen haben sich bisher nicht feststellen lassen. Es wurde versucht, den Gehalt an Hexose nach der T i l lmans - P h i l i p pi- Reaktion 2, colorimetrisch zu be- stimmen. Mit dieser Reaktion (Orcin und Schwefelsaure) wird Aminohexose nicht angezeigt. Der Versuch ergab 31 Proc. (auf Galaktose berechnet).

A n d e r e chemische E i n g r i f f e . Auf die serologische Wirksamkeit haben keinen EinfluS : Pankreas - amylase, Emulsin, Diastase, Taka-diastase, Papain; ebenso J o d (bis xu 40°) in verschiedenen Losungsmitteln; selbst in Bi- carbonatlijsung zersttirt J o d bei 40° wahrend 72 Stunden nur einen Teil der Wirksamkeit. Wasserstoffsuperoxyd

l) Biochem. J. 27, 1824 (1933). J. Ti l lmans u. I<. Phi l ippi , Bio. Z. 216, 36 (1929).

246 Pr e u de n b e rg und Bic h ed,

(30 Proc., 40°, 96 Stunden) hat keine merkliche Wirkung. Die Substanz IaBt sich rnit gleicher Zusammensetzung und Wirksamkeit, jedoch farblos Ioslich, aus dem Perhydrol herausarbeiten. FormaldehydlGsung ist ohne Wirkuug, ebenso konz. Arneisensaure (40 Stunden, lSo).

Mit Essigsaure- anhydrid und Pyridin 1aBt sich die Substanz in ein Gemisch von chloroformliislichen Acetaten uberfuhren.

0,5 g werden in 1 ccm Wasser gelSst und tropfenweise unter Ruhren rnit 7 ccm Pyridin versetzt. Zur besseren Abscheidung werden 7 ccrn &her zugegeben. Die abgeschleuderte Substanz wird noch 2-mal mit 4 ccm Pyridin aufgeruhrt und mit j e 10 ccm Ather niedergeschlagen. Diese pyridinfeuchte Fallung wird in 20 ccm Pyridin aufgeschlammt, mit 12 ccrn Essigsiiure-anhydrid versetzt und bei 40° aufbewahrt nnter zeitweiligern Schutteln. Nach 40 Stunden ist die Hauptmenge geliist. Ein kleiner Ruckstand wird abgeschleudert und wie die ursprungliche Substanz acetyliert. Dabei geht er bis auf einen zu vernachliissigenden Rest in L6sung. Die Acetylierungsgemische werden vereinigt nnd im Vakuumexsiccator uber Schwefelsiiure und KOH eingetrocknet. Der zuruckbleibende riitliche Firnis ist leicht lijslich in Chloroform und in Aceton. E r kst sich nur teilweise in Wasser, ebenso in Alkohol. Beim Verdunsten dieser Losungsmittel werden verschiedene Fraktionen ge- wonnen, die rund 40 Proc. Acetyl enthalten, iihnlich wie andere acety- lierte Polysaccharide. Abgesehen von der gr6Beren oder geringeren Loslichkeit in Wasser oder Alkohol unterscheiden sich diese Fraktionen nicbt; die wa6rigeu Losungen werden von Tannin teilweise gefallt.

Die Acetylprodukte werden bei der iiblichen Entacety- lierung nach F i s c h e r , B e r g m a n n und ZemplBnl) wieder auf den urspriinglichen Acetylgehalt von 10 Proc. und - innerhalb der Fehlergrenxen - auf die volle mirksamkeit zuruckgebracht 3. Auch Elementarzusammensetzung und Drehung der entacetylierten Substanzen sind dieselben wie beim Ausgangsmaterial. Die einzelnen Fraktionen unter- scheiden sich nach der Entacetylierung nicht mehr von- einander. Offenbar liegt das Polysaccharid in verschiedenem Polymerisationsgrad vor.

l) E. F i s c h e r U. M. B e r g m a n n , B. 62, 830, 848, 952 (1919); G. Zemplbn U. A. R u n s , B. 6 6 , 1705 (1923); G. ZemplBn, B. 69, 1258 (1926).

8) Entsprechendes an Tuberkel-polysacchariden: G. A. C. G o u g h , Biochem. J. 26,248(1932); F. S . H o o p e r , A.E. R e n f r e w , T. B. J o h n - son , Am. Rev. Tuberc. 29, 66 (1934).

Uber sperifische Kohlenhydrate der Blutgruppen. 247

11. Ctruppe Sull nnd B. Wenn Harn von Individuen der Blutgruppe Null in

genau der gleichen Weise aufgearbeitet wird, erhalt man in ahnlicher Ausbeute (aus 100 Litern etwa 1 g) ein fast farbloses Praparat, das sich von dem besprochenen ,,A-Poly- saccharid" lediglich durch eine etwas hohere Linksdrehung (- 12 bis - 16 O ) unterscheidet und nur l/sooo der spezifischen Wirkung des ,,A-Polysaccharids " besitzt. Auch hier konnte Galaktose als Spaltstuck durch das as. Methyl-phenyl- hydrazon und Aminozucker durch Farbreaktionen sehr wahr- scheinlich gemacht werden. Geschwindigkeit und Endwert der Hydrolyse, Gehalt an Stickstoff, Aminostickstoff und Acetyl sind die gleichen. Der nach T i l l m a n s - P h i l i p p i bestimmte Gehalt an Galaktose ist wie bei der A-Substanz etwa 33 Proc. Fernerhin gibt das ,,Null"-PrBparat in der- selben Weise wie die A-Substanz eine schmache Reaktion nach S a k a g u c h i - J o r p e s auf Arginin.

Auch aus Harn von B-Individuen wurde eine Substanz isoliert, die nach orientierenden Versuchen den A- und Null- Praparaten entspricht (Galaktose 34 Proc.). Dieses Praparat hemmt die A-spezifische Schaf bluthamolyse ungefahr wie die ,,Null"-Praparate, d a m aber noch schwach die HLmo- lyse mit gewohnlichem Schaf blutimmunserum.

Die Frage, ob das hier bearbeitete Polysaccharid aus den1 Harn von Individuen der Blutgruppe Astark tatsachlich gruppenspezifisch ist, hat uns Herr H. Sachs , dem wir hierfur danken, dahin beantwortet, daB die A-Substanz nicht fiihig ist, bei geeigneten Kaninchen immuni- sierend zu wirken. Dagegen erlagen Meerechweinchen, die mit Menschen- blut-A-Antiserum passiv seusibilisiert waren, bereits einer Injektion von 2,5 mg A-Substanz. Diese A-Substanz ist daher ein Teil der Merk- male der Gruppe A.

Z u s am m en f a s s n n g. Aus dem Harn von Individnen der Blutgruppe A I&&

sich ein stickstoffhaltiges Polysaccharid isolieren, das in Mengen von 0,005 y unmittelbar durch Hamolysehemmung wahrnehmbar ist und Galaktose, Aminohexose und 10 Proc. Acetyl (N- Acetyl) enthalt, sowie gegen Oxydationsmittel auBerordentlich bestandig ist. Abgesehen von der sero-

248 W i n d a u s , I n h o f f e n und U. R e i c h e l ,

logischen Wirksamkeit unterscheidet es sich nur andeutungs- weise von entsprechenden Praparaten aus dem Harn von Individuen der Gruppe Null und, soweit untersucht, der Gruppe B. Das unwirksame Acetylprodukt der A-Substanz 1alt sich zu dem ursprunglichen Acetylgehalt von 10 Proc. entacetylieren und besitzt danach wieder die friihere Wirk- samkeit. Da i m Harn von A- und B-Individuen aulerdem A- und B-spezifische EiweiBkBrper vorhanden sind, handelt es sich bei obigen Kohlenhydraten um Teilfaktoren der Gruppenmerkmale.

In Elcmentarzusammensetzung und Acetylgehalt, Lhneln diese Substanzen den von 0. T. A v e r y und W. F. Goebel ' ) besehriebenen spezifischen Kohlenhydraten aus Pneumokokken Typus I; Unterschiede liegen vor im Gehalt an freiem Aminostickstoff und der optischen Drehung. DaB beide Substanztypen derselben Klasse angehijren , er- scheint nicht eweifelhaft,.

[Mitteilungen ails dem Allgem. Chem. Univ.-Lab. in Gottingen.]

uber die Konstitution des Ergosterins; von A. Windaus, IL 11. Inhoffen und S. U. Reichel.

&lit 5 Figuren irn Text.

(Eingelaufen am 30. MLrz 1934.)

Das Ergosteriiz is t ein dreifach ungesattigter sekundarer AlkohoZ von der Forme1 C,,H4,0. Erst nach Ermittlung der richtigen Formel mit 28 Kohlenstoffatomen 2, ist die Kon- stitutions-Erforschung des Ergosterins auf den richtigen Weg geleitet worden und fiir den gesattigten Stammkohlen- wasserstoff des Ergosterins, das Ergostan C,,H,, , die Formel I bewiesen worden 3).

l) Journ. exp. Med. 6S, 731 (1933). a) Win d a u s U. L U t t r i n g ha u s , Nachr.Ges.Wiss.Gottingen1932,4. s, Chuang, A. 600, 270 (1933).