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Umweltschadstoffe und genetische Variabilität bei aquatischen Wirbellosen – Ergebnisse einer Multigenerationsstudie mit C. riparius

Christian Vogt, Carsten Nowak, Matthias Oetken & Jörg Oehlmann

1 Johann Wolfgang Goethe-Universität, Institut für Ökologie, Evolution und Diversität, Siesmayerstraße 70,

60323 Frankfurt/Main, Tel.: 069 79824871, Fax.: 069 79824748, Vogt@zoology.uni-frankfurt.de

Keywords: Chironomus riparius, Tributylzinn, Genetische Variabilität, Adaptation

Einleitung

Natürliche Selektion ist der primäre Mechanismus, der zur Anpassung von Populationen an spezifi-sche Umweltbedingungen führt. Vorraussetzung für adaptive Evolution ist genetische Variation; sie bildet das Substrat, aus dem vorteilhafte genetische Kombinationen ausgelesen werden können. Anthropogene Einflüsse verändern Umweltbedingungen für natürliche Population in extrem kurzen Zeitmaßstäben, was Populationen vor das Problem rascher adaptiver Evolution stellt. Während Selektion in der Vergangenheit meist als langsamer Prozess verstanden wurde, zeigt eine Vielzahl neuerer Studien, dass viele Arten Adaptationen an schnelle anthropogene Umweltveränderungen innerhalb weniger Generationen entwickeln können (Thompson 1998). Ein Beispiel für rasche anthropogene Umweltveränderungen, die einen hohen Selektionsdruck auf Populationen ausüben können, stellen Schadstoffeinträge in aquatische Ökosysteme, besonderes durch Kläranlagenabläufe oder diffuse Einleitungen (z.B. durch die Landwirtschaft), dar (EU 2000). Da viele Substanzen schlecht wasserlöslich sind, verschwinden diese aus der Wasserphase und werden zum großen Teil an Sedimente gebunden. Belastete Sedimente stellen somit, neben den natürlichen Faktoren, einen weiteren abiotischen Stressor für frei lebende Populationen dar.

In der vorliegen Studie soll das Potenzial einer Anpassung von aquatischen Invertebraten an TBT als chemischen Stressor am Beispiel der gut untersuchten Zuckmücke Chironomus riparius (Dipte-ra) in einer Multigenerationsstudie untersucht werden. C. riparius wurde ausgewählt, da dieser Organismus den größten Teil des Lebenszyklus (4 Larvalstadien) im Sediment verbringt (Armitage et al. 1995). Deshalb ist eine direkte Exposition über das Integument oder über die Nahrung an sedimentgebundene Schadstoffe zu erwarten. Da bekannt ist, dass sich C. riparius an Schwermetal-le adaptieren kann (Miller & Hendricks 1996; Postma et al. 1995a), wurde in dieser Studie der biologisch hoch aktive Umweltschadstoff Tributylzinn ausgewählt, der sich aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit vorwiegend in Sedimenten findet. Diese Organozinnverbindung besitzt eine hohe Toxizität gegenüber Algen, Muscheln und Bakterien und wurde deshalb als Biozid in Antifouling-farben, aufwuchsverhindernden Schiffsanstrichen, eingesetzt. Weiterhin wird TBT im Holz- und Materialschutz verwendet. TBT konnte in natürlichen Sedimenten nachgewiesen werden, wobei Maximalkonzentrationen von 50 mg/kg gemessen wurden (EU 2005). Neben der Abschätzung des Adaptationspotenzials an hoch aktive Biozide soll in der Multigenerationsstudie ein möglicher Verlust an genetischer Variabilität durch die Exposition an TBT erfasst werden. Es wurde eine geringe, subletal wirkende Konzentration des Stressors gewählt, um eventuelle Folgen einer TBT-

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Belastung auf die Populationsstruktur zu erfassen, die mit dem klassischen Life-Cycle-Test (OECD 218) nicht dokumentiert werden können.

Material und Methoden

Multigenerationsstudie

Bei der Multigenerationsstudie wurden Life-Cycle-Experimente in Anlehnung an die OECD-Guideline 218 (OECD 2004) über 11 Generationen durchgeführt. Dabei wurden 2 l Glaskristalli-sierschalen als Testgefäße verwendet, welche mit 1 l rekonstituiertem Wasser und 100 g Quarzsand befüllt wurden. Für das Experiment wurden zu Beginn 31 frische Eigelege aus einer aus elf ver-schiedenen Laborzuchten zusammengekreuzten Population entnommen. Im Anschluss daran wur-den die Larven der einzelnen Eigelege gut durchmischt und jeweils 50 vitale Larven pro Testgefäße eingezählt. Die Tiere wurden mit 0,5 mg/Larve/d gemahlener Tetra-Min Suspension gefüttert. Als Nominalkonzentration der Testsubstanz wurde 80 µg Sn/kg TG ausgewählt. Diese Konzentration wurde in einem Vorexperiment ermittelt, wobei eine leicht erhöhte Mortalität von ca. 10% im Ver-gleich zur Lösemittelkontrolle festgestellt wurde. Da für das apolare TBT ein organischer Lösungs-vermittler verwendet werden musste, wurde zusätzlich eine Lösemittelkontrolle (LMK) mit Ethanol berücksichtigt. Das Sediment wurde zu Beginn des Experimentes mit der Testsubstanz gespikt, wobei das Lösemittel über 48 h abgedampft wurde. Für die Gewährleistung eines populationsrele-vanten Experimentdesigns sowie der statistischen Datensicherheit wurden zehn parallele Testgefäße pro Behandlungsgruppe (gesamt 500 Tiere) angesetzt. Ab dem 12. Versuchstag erfolgte die Auf-nahme der Emergenz, wobei täglich die Anzahl der geschlüpften Tiere erfasst wurde. Die ge-schlüpften Imagines wurden aus den Versuchsgefäßen der jeweiligen Population mit einem Ex-hauster abgesaugt und jeweils in ein mit Edelstahlgaze abgedecktes Glasgefäß (30×20×20 cm) überführt. In diesem konnte die Reproduktion der adulten Tiere statt finden. Für die Eiablage der Weibchen wurde ein mit ca. 300 ml Wasser gefüllter Behälter angeboten. Die produzierten Eigelege wurden einmal täglich abgesammelt und deren Anzahl bestimmt. Für die folgende Generation wurden die aus den Eigelegen geschlüpften Larven analog dem Versuchsbeginn mit jeweils 500 L1-Larven pro Ansatz in die Schalen eingesetzt. Als Versuchsendpunkt diente die Mortalität.

Durchführung der Anpassungsstudien

Um Anpassungseffekte der beiden Population an TBT feststellen zu können, wurden neben dem Multigenerationsexperiment zusätzlich Akuttests mit L1-Larven (Generation 3, 5, 8, 9 und 10) durchgeführt. Dabei wurden jeweils 24 Larven in 96 Mikrowellplatten (2 ml/Well) an die Nominal-konzentrationen von 2; 6,3; 20; 63 und 200 µg Sn/l exponiert. Eine LMK (10 µl Ethanol/l) wurde berücksichtigt. Die Mortalität wurde nach 24 h aufgenommen. Weiterhin erfolgte am Ende der Multigenerationsstudie in einem weiteren Life-Cycle-Experiment in Anlehnung an die OECD-Guideline 218 die Aufnahme einer vollen Konzentrations-Wirkungsbeziehung (50, 80, 120 und 150 µg Sn/kg TG). Auch bei diesem Experiment diente die Mortalität als Endpunkt.

Mikrosatellitenanalyse

Die genetische Variabilität in den einzelnen Generationen wurde an fünf variablen Mikrosatelliten-Loci bestimmt. Hierfür wurden 36 Tiere pro Generation und Behandlung in CTAB Puffer + 4 µl 20 mM Prot. K 1 h bei 63°C verdaut. Nach einem Reinigungsschritt mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) und 1 h Präzipitation in 100% Isopropanol wurde die DNA 2 x mit Ethanol 70% gewaschen und in VE-Wasser resuspendiert. Die 5 Mikrosatelliten-Loci wurden anschließend mittels PCR amplifiziert und auf einem 9% Polyacrylamidgel in einem ALF 1-Sequenzierautomaten (Pharma-

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cia) aufgetragen. Die Fragmentlängen wurden in dem Programm ALFWIN 3.1 Software bestimmt. Verschiedene populationsgenetische Parameter (z. B. beobachtete Heterozygotie), wurden mit Hilfe des Programms Genepop 3.4 (Raymond & Rousset 1995) berechnet.

Ergebnisse und Diskussion

In der Multigenerationsstudie konnten, wie erwartet, keine erhöhten Mortalitäten zwischen den Behandlungsgruppen festgestellt werden. Die LMK weist eine mediane Mortalität von ca. 17% und die TBT-Behandlung von 18% auf. Auffällig sind allerdings die nicht normal verteilten Daten in beiden Behandlungen, wobei diese durch einzelne ausgefallene Replikate erklärt werden können. Als weitere Variationsquelle kommt die biologische Varianz in Betracht. Ähnlich starke Schwan-kungen der Mortalitäten bei C. riparius konnten auch von Janssens de Bisthoven et al. (2001) über den Verlauf von 10 Generationen festgestellt werden. Dabei variierten die Mortalitäten zwischen 10 und 80% in der gleichen Behandlungsgruppe. Zusätzlich können auch jahreszeitliche Einflüsse nicht ausgeschlossen werden, welche auch in Laborstudien von Groenendijk et al. (1999) beschrie-ben wurden.

Weiterhin konnte kein Einfluss der geringen TBT-Belastung auf die genetische Variabilität ermittelt werden. Diese ist in Abbildung 1 durch die beobachtet Heterozygotie dargestellt, die sich in den Generationen stets zwischen 0,4 und 0,6 bewegt. Auffällig ist, dass die beobachtete Heterozygotie in den ersten Generationen deutlich zunimmt. Dieser Anstieg kann durch die noch nicht vollständi-ge Zusammenkreuzung der elf Laborzuchten in der Ausgangspopulation und der anschließenden Durchkreuzung bis zur dritten Generation begründet werden. In den untersuchten Generationen konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den TBT-Behandlungen und der LMK festge-stellt werden. Dieses kann durch die geringen Mortalitäten bei der gewählten Konzentration erklärt werden, durch die keine genetische Verarmung aufgrund von verstärkter genetischer Drift erwartet werden kann. Da Mikrosatelliten weitestgehend neutral sein sollten, kann auch eine reduzierte Diversität durch Selektionseffekte kaum nachgewiesen werden. Betrachtet man jedoch die 3. Gene-ration aufgrund der totalen Durchkreuzung der Ausgangsstämme als Ausgangsgeneration, lässt sich in beiden Ansätzen trotz der relativ großen Individuenanzahl pro Generation ein Absinken geneti-scher Diversität durch Drifteffekte feststellen.

Bei den Empfindlichkeiten gegenüber TBT zeigen die L1-Larven in den Akuttests in den Generati-onen 3, 5 und 8 keine signifikanten Unterschiede für die berechneten LC50 zwischen der LMK und der TBT-Behandlung auf (Abb. 2). Die L1-Larven in den Generationen 9 und 10 sind im Gegensatz dazu unempfindlicher gegenüber dem Stressor, wobei sie signifikant höhere LC50 in den Behand-lungsgruppen aufweisen als in den jeweiligen LMK. Somit kann eine Adaptation von C. riparius an TBT angenommen werden. Auffällig dabei ist die sprunghafte Anpassung zwischen den Generatio-nen 8 und 9. Im Vergleich zu den ermittelten Adaptionspotenzialen von C. riparius gegenüber Schwermetallen zeigt sich bereits nach wenigen Generationen (Miller & Hendricks 1996; Postma et al. 1995b), dass die Population deutlich länger braucht, um sich an das hochaktive Biozid zu adap-tieren. Dies kann durch den relativen niedrigen Evolutionsdruck bei der niedrigen Konzentration erklärt werden, wobei jedoch grundsätzlich eine Anpassung möglich ist.

Deutliche Anpassungseffekte konnten weiterhin im Life-Cycle Experiment am Ende der Multigene-rationsstudie festgestellt werden. Dabei wird für die gegenüber TBT vorexponierte Population eine LC50 von 138 µg Sn/kg TG berechnet. Im Vergleich dazu wiesen die nicht vorexponierten Tiere eine signifikant niedrigere LC50 (p < 0.1) von 108 µg Sn/kg TG auf. TBT vorexponierte Tiere sind somit auch bei einer Sedimentexposition deutlich unempfindlicher gegenüber dem Stressor.

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Zusammenfassung/Schlussfolgerungen

In der durchgeführten Multigenerationsstudie mit einer niedrigen TBT Konzentration (80 µg Sn/kg) konnte ein deutliches Anpassungspotenzial von C. riparius an die Modelsubstanz sowohl in Akut-tests als auch im kompletten Life-Cycle-Experiment gezeigt werden. Die Zuckmücke ist in der Lage, sich an anthropogene Substanzen mit hoher biologischer Aktivität anzupassen. Diese Spezia-lisierung dauert allerdings im Vergleich zur Anpassung an Schwermetalle relativ lange, da erst nach 8 vollen Generationszyklen eine höhere Toleranz gegenüber TBT festgestellt werden konnte. Dieses kann durch die niedrige Konzentration und durch die anthropogen Herkunft der Substanz erklärt werden. Weiterhin wurde kein Einfluss auf die beobachtete Heterozygotie durch den Stressor ermit-telt. Somit ist die Zuckmücke in der Lage, mit TBT schwach bis mäßig verschmutze Habitate wie-der zu besiedeln.

Danksagung

Diese Arbeit wurde im Rahmen des vom Land Baden-Württemberg geförderten BW-Plus Projektes „Genetische Verarmung durch Schadstoffstress bei Wirbellosen – Ein Beitrag zur Biodiversitätsfor-schung“ durchgeführt (Förderkennzeichen BWR 22018). Besonderer Dank gilt den zahlreichen Mitwirkenden und fleißigen Händen der Abteilung Ökologie und Evolution der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main.

Literatur Armitage, P.D., Cranston, P.S., Pinder, L.C.V. (1995): The Chironomidae: Biology and ecology of non-

biting midges. Chapman & Hall, London. EU (2000) Richtlinie 2000/60/EG des Europäischen Parlamentes und des Rates zur Schaffung eines

Ordnungsrahmens für Maßnahmen der Gemeinschaft im Bereich der Wasserpolitik („EU-Wasserrahmenrichtlinie“). Europäische Union, Brüssel, Belgien

EU (2005) Development of an integrated approach for the removal of tributyltin (TBT) from waterways and harbors: Prevention, treatment and reuse of TBT contaminated sediments. Layman’s Report: LIFE02 ENV/B/000341, Europäische Union, Brüssel, Belgien

Groenendijk, D., Van Opzeeland, B., Dionisio-Pires, L.M., Postma, J.F. (1999): Fluctuating life history parameters indicating temporal variability in metal adaption in river rhine chironomids. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 37: 175-181.

Janssens de Bisthoven, L., Postma, J., Vermeulen, A., Goemans, G., Ollivier, F. (2001): Morphological deformities in Chironomus riparius Meigen larvae after exposure to cadmium over several generations. Water, Air and Soil Pollution 129: 167-179.

Miller, M.P., Hendricks, A.C. (1996): Zinc residence in Chironomus riparius: Evidence for physiological and genetic components. Journal of the North American Benthological Society 15: 106-116.

Motulsky, H., Christopoulos, A. (2004): Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression. A practical guide to curve fitting. Oxford University Press, New York, USA.

OECD (2004): Sediment-water chironomid toxicity test using spiked sediment. OECD guidelines for the testing of chemicals. (Original guideline 218, adopted 13th April 2004). Organization for Economic Cooperation and Development. Paris.

Postma, J.F., Davids, C. (1995a): Tolerance induction and life-cycle changes in cadmium-exposed Chironomus riparius (Diptera) during consecutive generations. Ecotoxicology and Environmental Safety 30: 195-202.

Postma, J.F., Mol, S., Larson, H., Admiraal, W. (1995b) Life-cycle changes and zinc shortage in cadmium-tolerant midges, Chironomus riparius (Diptera), reared in the absence of cadmium. Environmental Toxicology and Chemistry 14: 117-122.

Raymond, M., Rousset, F. (1995) GENEPOP (version 1.2): Population-genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal of Heredity 86: 248-249.

Thompson, J. N. (1998): Rapid evolution as an ecological process. Trends in Ecology and Evolution 13: 329-332.

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Abb. 1: Beobachtete Heterozygotie der Lösemittelkontrolle (geschlossene Linie) und der an Tributyl-zinn exponierten Population (gestrichelte Linie) in der Multigenerationsstudie.

Abb. 2: Berechnete LC50 der L1-Larven aus den Akuttest mit TBT-Exposition über das Wasser in den Generationen 3, 5, 8, 9 und 10 der Multigenerationsstudie. Dargestellt sind die LC50 Werte ±±±± Standardabweichung der unbelasteten (weiße Balken) und der TBT vorbelasteten Population (schwarze Balken). Signifikante Unterschiede werden mittels nicht linearer Regression (sig-moidale Konzentrations-Wirkungskurve) und anschließendem Global Fitting nach Motulsky & Christopoulos (2004) bestimmt (*** p < 0,001).