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Universität Leipzig Biophysikalisches Praktikum Herstellung von Liposomen und die Untersuchung der kationeninduzier- ten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer Institut für Medizinische Physik und Biophysik Direktor: Prof. Dr. D. Huster Härtelstraße 16-18 D-04107 Leipzig Verantwortlicher: Dr. Christian Berger Wintersemester 2010/2011 Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Härtelstraße 16-18, 04107 Leipzig Tel: (0341) 97 15 740, Fax: (0341) 97 15 709 E-Mail: [email protected]

Universität Leipzig Biophysikalisches Praktikum · Chloroform im Rotationsverdampfer. Lösen Sie den so hergestellten Lipidfilm mit Pufferlö- Lösen Sie den so hergestellten Lipidfilm

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    Biophysikalisches Praktikum

    Herstellung von Liposomen und die Untersuchung der kationeninduzier-ten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer Institut fr Medizinische Physik und Biophysik

    Direktor: Prof. Dr. D. Huster

    Hrtelstrae 16-18

    D-04107 Leipzig

    Verantwortlicher: Dr. Christian Berger Wintersemester 2010/2011 Institut fr Medizinische Physik und Biophysik, Hrtelstrae 16-18, 04107 Leipzig Tel: (0341) 97 15 740, Fax: (0341) 97 15 709 E-Mail: [email protected]

  • Herstellung von Liposomen und die Untersuchung der kationeninduzier-ten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer

    1 Einleitung Zellmembranen bestehen aus einer fluiden Doppelschicht aus Phospholipiden und Choleste-rol, in die Proteine und eine Vielzahl andere Molekle eingebettet sind (Abb. 1). Zur Untersu-chung verschiedenster Prozesse an Zellmembranen werden aufgrund der hohen Komplexitt der biologischen Systeme hufig Phospholipidvesikel als Modellsysteme verwendet.

    Abb. 1: Das Modell von Singer und Nicholson beschreibt die Zellmembran als fluide Doppelschicht aus Phospholipiden und Cholesterol, in die intrinsische Membranproteine eingebettet sind. Zustzlich binden periphere Proteine an die Membranoberflche.

    Ein Phospholipidmolekl ist aus der polaren Kopfgruppe, dem Glycerol-Rckgrat sowie den beiden unpolaren, hydrophoben Alkylketten aufgebaut (Abb. 2). In diesem Versuch verwen-den Sie das negativ geladene Phosphatidylglycerol (PG), das aus natrlichen Zellmembranen (Hhnerei) isoliert wurde und daher in einer Mischung aus verschiedenen Alkylketten vor-liegt.

    Abb. 2: Chemische Struktur eines Phosphatidylglycerols (oben) und eines Phosphatidylcholins (unten). Die Lnge der Alkylketten und die Anzahl der Doppelbindungen knnen variieren.

  • Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer 2

    Aufgrund ihres amphiphilen Charakters (polare Kopfgruppe und unpolare Alkylketten) orga-nisieren sich Phospholipide in wssriger Lsung spontan in verschiedenen berstrukturen, um die freie Enthalpie beim Lsen der hydrophoben Alkylketten in Wasser zu minimieren (hyd-rophober Effekt). Die Ausbildung der berstrukturen ist von den Wechselwirkungen zwi-schen den Lipiden (elektrostatische, van-der-Waals- und hydrophobe Wechselwirkungen so-wie Wasserstoffbrckenbindungen), ihrer ueren Form (Gre der Kopfgruppe im Vergleich zu den Lipidketten) sowie dem Wassergehalt der Membran und der Temperatur abhngig. Werden die hier verwendeten Phospholipide in Wasser berfhrt, entstehen spontan multila-mellaren Vesikel (MLV), die mittels verschiedener Methoden in einschichtige Vesikel (Lipo-somen) verschiedener Gre berfhrt werden knnen (Abb. 3). In den sich in wssriger Um-gebung gebildeten multilamellaren (mehrschichtigen) Vesikeln sind mehrere Lipiddoppel-schichten zwiebelschalenartig angeordnet. MLVs knnen daher sehr groe Durchmesser von bis zu ~10 m erreichen.

    Vakuumrotationsverdampfer

    Abb. 3: Protokoll zur Herstellung und Klassifizierung von Lipidvesikeln

  • Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer 3

    Werden die MLVs mit Ultraschall behandelt, brechen die Vesikel auf, und es bilden sich klei-ne einschichtige Vesikel (small unilamellar vesicles, SUV) mit einem Durchmesser von 20 bis ca. 100 nm. Eine andere Methode zur Herstellung von Liposomen ist das sogenannte Ge-frier-Tau-Verfahren. Bei wiederholten Einfrieren der Vesikelsuspension in flssigen Stick-stoff und anschlieenden Auftauen entsteht eine Suspension einschichtiger Liposomen mit verschiedenen Gren. Wird diese mehrfach mit hohem Druck durch eine Polykarbonat-membran mit Poren definierter Gre gepresst (Extrudertechnik), lsst sich eine Suspension von Liposomen einheitlicher Gre (typisch sind 100 nm) herstellen. Liposomen stellen einfache Modelle fr Zellmembranen dar. Sie knnen je nach Prparation z.B. Proteine und hnliche Molekle enthalten und werden als Transportvehikel fr pharma-kologische Wirkstoffe verwendet. 2 Grundlagen 2.1 Membranfusion Membranfusionen sind Bestandteil wichtiger zellbiologischer Prozesse wie Exozytose, Endo-zytose, dem intrazellulren Vesikeltransport, der Befruchtung sowie der Virus- und Bakteri-eninfektion von Zellen. Ihr molekularer Mechanismus ist jedoch bis heute noch nicht voll-stndig verstanden. Im mehrstufigen Modellschema zur Fusion von Phospholipidversikeln (Abb. 4) spielen verschiedene physikalische Wechselwirkungen zwischen den Vesikeln und Triggermoleklen eine Rolle. In diesem Versuch wird die Vermischung der Vesikelmembra-nen bei Fusion unter dem Einfluss von Ca2+-Ionen mit Fluoreszenzspektroskopie untersucht.

    Mischung der Liposomen Mischung der Lipide der ueren Doppelschicht evtl. ohne echte Fusion (Semifusion) Vermischung der Liposomeninhalte(vollstndige echte Fusion)

    D

    u.a. hydrophobe Wechselwirkungen

    lokale Strung der LipiddoppelschichtC

    reduzierte hydrostatische Abstoung

    direkter molekularer Kontakt der OberflchenB

    unspezifische Wechselwirkungen (van-der-Waals-Anziehung, reduzierte elektrostatische Abstoung)

    AggregationA

    Mischung der Liposomen Mischung der Lipide der ueren Doppelschicht evtl. ohne echte Fusion (Semifusion) Vermischung der Liposomeninhalte(vollstndige echte Fusion)

    D

    u.a. hydrophobe Wechselwirkungen

    lokale Strung der LipiddoppelschichtC

    reduzierte hydrostatische Abstoung

    direkter molekularer Kontakt der OberflchenB

    unspezifische Wechselwirkungen (van-der-Waals-Anziehung, reduzierte elektrostatische Abstoung)

    AggregationA

    Abb. 4: Schema der Membranfusion. Als Trigger fr die Fusion kommen Kationen (Ca2+, Mg2+, La3+, ), kalziumbindende Proteine, Virusproteine, Peptide oder Polymere in Frage.

  • Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer 4

    2.2 Fluoreszenzspektroskopie Grundlage der Fluoreszenzspektroskopie ist die Wechselwirkung elektromagnetischer Strah-lung mit Materie. Absorbiert ein Molekl elektromagnetische Strahlung mit einer Frequenz im ultravioletten oder sichtbaren Bereich, fhrt das zur Anregung von bergngen zwischen den Elektronenenergieniveaus des Molekls. Die einfallende Strahlung hebt ein Elektron aus einem energetisch niedrigeren in ein energetisch hheres Orbital, was zu einem angeregten, energiereicheren Zustand des Molekls fhrt. Im Anschluss an die Absorption finden verschiedene Deaktivierungsprozesse statt, durch wel-che die Abgabe der aufgenommenen Energie erfolgt. Diese Energieabgabe kann entweder strahlungslos oder unter Aussendung von Strahlung verlaufen. Ein Molekl besitzt daher ein Absorptions- und ein Emissionsspektrum. Das Emissionsspektrum ist aufgrund der kleineren Quantenenergien gegenber dem Absorptionsspektrum zu greren Wellenlngen verscho-ben. Fluoreszenz wird meist bei aromatischen oder heterozyklischen Moleklen beobachtet. Insbe-sondere Molekle mit zwei oder mehreren kondensierten Ringen haben fr diese Vorgnge eine groe Bedeutung. Solche Molekle werden auch als Fluorophore bezeichnet. In diesem Versuch wird die Membranfusion mit Hilfe von Fluoreszenzsonden untersucht, die bei der Prparation der Liposomen in die Modellmembranen eingebaut werden. Hierbei wird die Vermischung der Membranlipide, wie sie im Zuge einer Membranfusion oder bei einer starken Aggregation von Liposomen auftritt, mit Hilfe des NBD-Rhodamin-Mischungsassays nachgewiesen. Dazu sind die Fluorophore an die Kopfgruppe von Phospholipiden gebunden (Abb. 5).

    Abb. 5: Chemische Struktur von Rhodamin-PE und NBD-PE Das Donatormolekl NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) stellt einen Fluorophor dar, dessen Absorptionsmaximum bei einer Wellenlnge von 460 nm liegt. Das Emissionsmaximum von NBD liegt mit 520 nm im Absorptionsmaximum von Rhodamin (Rho). Die Anregungsenergie

  • Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer 5

    des Donatormolekls kann also bei einem hinreichend kleinen Abstand zwischen den Mole-klen (Frsterradius) strahlungslos auf das Akzeptormolekl Rhodamin bertragen werden. Das dadurch seinerseits angeregte Rhodamin emittiert dann die Strahlung mit dem Emissi-onsmaximum bei 588 nm (Abb. 6).

    Abb. 6: Absorptions- und Emissionspektrum eines Donator-Akzeptor-Paares, A bezeichnet das Absorptions-spektrum, E das Emissionsspektrum. Die Indizes bezeichnen Donator (D) und Akzeptor (A).

    Tritt eine Vermischung von Membranlipiden im Zuge einer Fusion von Liposomen mit und ohne Fluorophor auf, so werden die Fluorophore durch laterale Diffusion ber die nun gre-re Oberflche verdnnt. Der Abstand zwischen Donatoren und Akzeptoren wird vergrert, und die Transfereffizienz sinkt. Die Akzeptorfluoreszenz nimmt ab, und die Donatoreigenflu-oreszenz nimmt zu (Abb. 7).

    Acceptorfluorescence

    +

    excitation

    Resonanceenergytransfer

    excitation

    Reduced acceptor fl.Inc reased donor fl.

    Trigger

    Abb. 7: Zum Prinzip des Rhodamin-NBD-Mischungsassays Die Berechnung der Mischungsausbeute M erfolgt nach folgender Gleichung:

    %100

    0588

    0520

    588

    520

    0588

    0520

    588

    520

    =

    II

    II

    II

    II

    M

    Triton

    Triton

    Ca

    Ca

    .

    In die Berechnung gehen sowohl Donator- (I520) als auch Akzeptorfluoreszenzintensitt (I588) ein. Dabei sind die Intensitten in Abwesenheit von Kalziumionen mit 0 indiziert, die mit Triton indizierten Werte sind die Fluoreszenzintensitten nach der Lysierung mit 1 vol% Triton X-100. Der vom System hierdurch eingenommene Zustand ist durch eine sehr starke

  • Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer 6

    Verdnnung der Sonden gekennzeichnet und wird als 100%-Wert der Lipidmischung ange-nommen. 3 Ablauf 3.1 Liposomenprparation Material: Egg PG Mw = 771 g/mol Rho-PE Mw = 1276 g/mol NBD-PE Mw = 898 g/mol Stellen Sie 0,5 L der Pufferlsung 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 her. Berechnen

    Sie die Zugaben vor Praktikumsbeginn. (MHEPES = 238,3 g/mol, MNaCl = 58,44 g/mol) Stellen Sie zunchst jeweils eine Probe multilamellarer Vesikel (MLV) aus PG mit und

    ohne Fluoreszenzmarker her. Die Phospholipide liegen als Pulver vor. Wiegen Sie die bentigten Mengen der Lipide ein,

    um ca. 3 ml Vesikelsuspension einer Konzentration von 1 mg/ml zu erhalten. Fr die MLV ohne Fluoreszenzmarker nehmen Sie diese direkt im Puffer auf.

    Fr die Vesikel mit Fluoreszenzmarker stellen Sie zunchst eine Chloroformlsung (Arbei-ten Sie unter dem Abzug!) der Lipide in der gleiche Menge und Konzentration wie oben her, der Sie je 1 mol% Rhodamin-PE und NBD-PE (Abb. 5) zusetzen. Evaporieren Sie das Chloroform im Rotationsverdampfer. Lsen Sie den so hergestellten Lipidfilm mit Pufferl-sung von der Glaswand ab. Berechnen Sie die bentigten Mengen vor Praktikumsbeginn. (KonzRho-PE = 1 mg/ml, KonzNBD-PE = 1 mg/ml)

    Die Lipidsuspensionen werden fr ca. 30 min bei 37C im Schttelbad inkubiert. Teilen Sie die MLV-Suspensionen auf (2 ml fr LUV, 1 ml fr SUV) und stellen Sie daraus

    mittels Ultraschalltechnik small unilamellar vesicles (SUV) bzw. mittels Extrudertechnik large unilamellar vesicles (LUV) her.

    Prparation von SUV: Ultraschallbehandlung (GEHRSCHUTZ verwenden! Eiswasser zur Khlung der Probe, Spitze subern, Spitze in die Mitte des Rhrchen keine Berhrung mit dem Rand!), 15 min - cycle 0,5 - Leistung bis zu 100% (langsam von Minimum stei-gern, um ein Herausspritzen zu vermeiden)

    Prparation von LUV (100 nm Durchmesser): 10 Gefrier-Tau-Zyklen mit flssigem Stickstoff, Lipex Biomembranes Extruder: Extruder subern, 2 Polycarbonatmembranen einlegen, Stickstoffdruck 20-25 bar, vorher 2x mit Puffer splen, 5 Extrusionszyklen

    3.2 Messung der Membranfusion mittels FRET Messen Sie die Vermischung der Lipidmembranen fr die verschiedenen hergestellten Sys-

    teme unter Einfluss von Ca2+-Ionen, d.h. fr LUV/LUV*, LUV/SUV*, SUV/LUV*, SUV/SUV* (*=markierte Vesikel)!

    Mischen Sie hierzu markierte und unmarkierte Vesikel im Verhltnis 1:1 (je 20 l) mit 2 ml Puffer in der Kvette (Wie hoch ist die molare Lipidkonzentration in der Kvette?).

    Die Messung der Spektren erfolgt am Fluoromax 2 Spektrometer (Anregung bei 460 nm, Aufzeichnung der Spektren von 500-630 nm, Inkrement 1nm, Integrationszeit 0,2 s, Tempe-rierung 37C).

  • Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer 7

    Messen Sie Fluoreszenzspektren fr eine Ca2+-Konzentration von 0/0,2/0,5/1/2/5/8/10/20 und 50 mM in der Kvette. (Die jeweiligen Zugabemengen an Ca2+-Lsung werden mit Hil-fe eines speziellen Programms berechnet. (Stammlsungen: 10/100/1000 mM Ca2+))

    Messen Sie ein Fluoreszenzspektrum nach Zugabe von 1 vol% Triton X-100 Lsung (20%ige Stammlsung) fr die Werte bei vollstndiger Lipidmischung.

    Werten Sie die Intensitten bei 520 und 588 nm fr Ausgangsspektrum (I0), Tritonspektrum (ITriton) und jedes Spektrum der verschiedenen Ionenkonzentrationen (ICa) aus. Berechnen Sie die Mischungsausbeute M entsprechend der obigen Gleichung und stellen Sie diese gra-phisch in Abhngigkeit der Ca2+-Konzentration dar (halblogarithmisch).

    Protokoll

    1. Zielstellung 2. Methode 3. System 4. Prparation 5. Messung

    Wertetabelle Beobachtungen Spektren-Ausdruck Ergebnis-Grafik

    6. Diskussion

    Herstellung von Liposomen und die Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer Herstellung von Liposomen und die Untersuchung der kationeninduzierten Membranfusion durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer 1 Einleitung 2 Grundlagen 2.1 Membranfusion 2.2 Fluoreszenzspektroskopie 3 Ablauf 3.1 Liposomenprparation 3.2 Messung der Membranfusion mittels FRET Protokoll 1. Zielstellung 2. Methode 3. System 4. Prparation 5. Messung 6. Diskussion

    /ColorImageDict > /JPEG2000ColorACSImageDict > /JPEG2000ColorImageDict > /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 300 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages true /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict > /GrayImageDict > /JPEG2000GrayACSImageDict > /JPEG2000GrayImageDict > /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict > /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile () /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /Description > /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ > /FormElements false /GenerateStructure true /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles true /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /NA /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /LeaveUntagged /UseDocumentBleed false >> ]>> setdistillerparams> setpagedevice