UNIVERSITÄT HAMBURG LEBENSMITTELCHEMISCHE PRAKTIKA · Lebensmittelchemisches Praktikum Universität Hamburg 5/103 1.2 Wasserbestimmung in Lebensmitteln nach KARL FISCHER Grundlagen

UNIVERSITÄT HAMBURG

LEBENSMITTELCHEMISCHE

PRAKTIKA

Institut für Lebensmittelchemie

Grindelallee 117

20146 Hamburg

Lebensmittelchemisches Praktikum Universität Hamburg

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Inhaltsverzeichnis

1 WASSER- UND FETTGEHALT IN LEBENSMITTELN 4

1.1 BESTIMMUNG DER TROCKENMASSE IN FLEISCH UND FLEISCHERZEUGNISSEN (INDIREKTE WASSERBESTIMMUNG) 4

1.2 WASSERBESTIMMUNG IN LEBENSMITTELN NACH KARL FISCHER 5

1.3 FETTEXTRAKTION 7

1.3.1 EXTRAKTION NACH SÄURE-AUFSCHLUSS (METHODE NACH WEIBULL-STOLDT) 7

1.3.2 EXTRAKTION NACH AMMONIAKALISCHEM AUFSCHLUSS (METHODE NACH RÖSE-GOTTLIEB) 9

1.3.3 HALBMIKRO-BUTTERSÄUREZAHL (HBSZ) 11

2 PROTEIN- UND KOHLENHYDRATGEHALT IN LEBENSMITTELN 14

2.1 STICKSTOFFBESTIMMUNG NACH KJELDAHL 14

2.2 HYDROXYPROLINGEHALT IN FLEISCH UND FLEISCHERZEUGNISSEN 17

2.3 NACHWEIS VON EI- UND MILCHPROTEINEN IN LEBENSMITTELN MITTELS DISKONTINUIERLICHER NATRIUMDODECYLSULFAT-

POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (DISK-SDS-PAGE) 21

2.4 MONO- UND OLIGOSACCHARIDE 34

2.4.1 BESTIMMUNG DER WIEDERFINDUNGSRATEN FÜR REDUZIERENDE UND NICHT REDUZIERENDE ZUCKER 34

2.4.2 BESTIMMUNG REDUZIERENDER ZUCKER NACH LUFF-SCHOORL 35

2.4.3 BESTIMMUNG DER NICHT REDUZIERENDEN ZUCKER (SACCHAROSE) NACH LUFF-SCHOORL 37

2.5 POLARIMETRISCHE BESTIMMUNG DES STÄRKEGEHALTES IN LEBENSMITTELN 40

3 MINERALSTOFFE, ZUSATZSTOFFE UND WASSERANALYSE 44

3.1 BESTIMMUNG DER GESAMTASCHE 44

3.2 BESTIMMUNG VON ANIONEN 45

3.2.1 BESTIMMUNG VON CHLORID (ARGENTOMETRISCH) 46

3.2.2 BESTIMMUNG VON NITRIT NACH LUNGE (VIS-PHOTOMETRIE) 48

3.2.3 BESTIMMUNG VON NITRAT ALS NITRONATRIUMSALICYLAT-KOMPLEX 49

3.3 CHININ IN TONIC-WÄSSERN (FLUORIMETRISCH) 51

3.4 PYKNOMETRISCHE ALKOHOLBESTIMMUNG 54

3.5 BESTIMMUNG DER KATIONEN MIT ATOMEMISSIONS- UND ATOMABSORPTIONSSPEKTROMETRIE 57

3.5.1 FLAMMENATOMEMISSIONSSPEKTROMETRISCHE BESTIMMUNG VON NATRIUM UND KALIUM 58

3.5.2 ATOMABSORPTIONSSPEKTROSKOPISCHE BESTIMMUNG VON WEITEREN KATIONEN 59

4 EINFÜHRUNG IN DIE CHROMATOGRAPHIE 61

4.1 PAPIER-, DÜNNSCHICHT- UND SÄULENCHROMATOGRAPHIE 61

4.1.1 IDENTIFIZIERUNG VON ZUCKERN 64

4.1.2 IDENTIFIZIERUNG VON ORGANISCHEN SÄUREN 66

4.1.3 IDENTIFIZIERUNG VON KONSERVIERUNGSSTOFFEN 67

4.2 ALTERNATIVE IDENTIFIZIERUNG SOWIE QUANTIFIZIERUNG DER KONSERVIERUNGSSTOFFE MITTELS

HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGCHROMATOGRAPHIE 70

4.2.1 ISOLIERUNG DURCH WASSERDAMPFDESTILLATION 70

4.2.2 ISOLIERUNG DURCH METHANOLISCHE EXTRAKTION 72

4.2.3 FLÜSSIGCHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE DER KONSERVIERUNGSSTOFFE 73

4.3 GASCHROMATOGRAPHIE 76

4.3.1 GASCHROMATOGRAPHIE DER FETTSÄUREMETHYLESTER 76

4.3.2 GASCHROMATOGRAPHIE VON LÖSUNGSMITTELN (ETHANOL UND FUSELALKOHOLE) 84


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5 ALLGEMEINE HINWEISE 87

5.1 SICHERHEIT IM CHEMISCHEN PRAKTIKUM 87

5.2 ENTSORGUNG 88

5.3 HINWEISE ZUM ZITIEREN VON LITERATUR (VORSCHLAG) 89

5.4 HINWEISE ZUR ANFERTIGUNG VON PROTOKOLLEN 91

5.4.1 ALLGEMEINE FORMALIEN 91

5.4.2 WISSENSCHAFTLICHES SCHREIBEN 91

5.4.3 TABELLEN, ABBILDUNGEN UND GLEICHUNGEN 92

5.4.5 DURCHFÜHRUNG 94

5.5 BÜCHERLISTE (LEBENSMITTELCHEMIE – HAUPTSTUDIUM) 101


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1 Wasser- und Fettgehalt in Lebensmitteln

1.1 Bestimmung der Trockenmasse in Fleisch und Fleischerzeugnissen

(Indirekte Wasserbestimmung)

Grundlagen

Die Probe wird nach Vermischen mit Seesand im Trockenschrank bei 103 °C ± 2 °C getrocknet und aus

der Gewichtsabnahme der Wassergehalt berechnet.

Geräte

Abdampfschale (Aluminium- oder Nickelschale)

Glasstab (ein Ende pistillartig flachgedrückt)

Chemikalien

Seesand, gereinigt und geglüht

Durchführung

Probe: Wurst (wird vom Assistenten ausgegeben)

3 – 5 g homogenisierter Probe werden auf 1 mg genau in eine mit 30 – 35 g Seesand gefüllte, mit ei-

nem Glasstab versehene, zusammen mit dem Sand und dem Glasstab vorgetrocknete Abdampf-

schale eingewogen. Dann werden eingewogene Probe und Seesand in der Schale gleichmäßig verrie-

ben und insgesamt vier Stunden im Trockenschrank bei 103 °C ± 2 °C getrocknet. Nach der Hälfte der

Trocknungszeit wird die Probe erneut verrieben. Danach wird im Exsikkator abgekühlt und gewogen.

Der Vorgang wird mit jeweils halbstündiger Trocknungszeit bis zum Erreichen der Massenkonstanz

wiederholt (Massenänderung nicht mehr als 0,1 %). Eine Massenzunahme bleibt unberücksichtigt, da

sie auf Oxidation des Fettes zurückzuführen ist.

Literatur

Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, Nr. L 06.00-3.

K. Rauscher, R. Engst, U. Freimuth, H. Bergner, Untersuchung von Lebensmitteln, 2. Ausgabe, VEB Fach-

buchverlag, Leipzig, 1986.


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1.2 Wasserbestimmung in Lebensmitteln nach KARL FISCHER

Grundlagen

Der Wasserbestimmung nach KARL FISCHER liegt die BUNSEN-Reaktion zugrunde.

Durch einen Überschuss von Schwefeldioxid und die Anwesenheit einer Base wird das Gleichgewicht

der Reaktion auf die rechte Seite verlagert und so für die maßanalytische Wasserbestimmung ver-

wendbar.

2 H2O + SO2 + I2 H2SO4 + 2 HI

Der Endpunkt wird elektrochemisch mittels eines sog. voltametrischen Verfahrens identifiziert. Es

wird ein kleiner konstanter Gleichstrom angelegt (1 – 2 µA). An der Platindoppelelektrode läuft fol-

gende Reaktion ab:

Anode: 2 I- I2 + 2 e-

Kathode: I2 + 2 e- 2 I-

Vor dem Erreichen des Endpunktes wird das zugeführte Iod an der Kathode vollständig zu Iodid redu-

ziert. Es liegt ein irreversibles Redoxpaar vor, die Platinelektroden sind polarisiert (Polarisationsspan-

nung ca. 200 – 500 mV). Am Titrationsendpunkt befindet sich überschüssiges Iod in der Lösung. Die

Anwesenheit des reversiblen Redoxpaares Iod/Iodid führt zu einer Depolarisation der Platinelektro-

den, die sich in einem abrupten Spannungsabfall äußert. Als Endpunkt wird eine geringe Spannung,

z.B. 25 mV gewählt. Da sich das Gleichgewicht der KARL-FISCHER-Reaktion nur langsam einstellt, wird

die Abschaltung am Endpunkt je nach Gerät, Matrix und Arbeitsmedium um fünf bis 20 Sekunden

verzögert.

Geräte

Magnetrührstäbchen

Platindoppelelektrode (vom Assistenten)

Titrierautomat/KARL-FISCHER-Titriergefäß (Einführung vom Assistenten)

Kolbenhubpipette, Nennvolumen 20 µL

Chemikalien

KARL-FISCHER-Lösung, Einkomponentenreagenz, gebrauchsfertig (vom Assistenten)

Methanol, wasserfrei (vom Assistenten)


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Durchführung

Probe: Mehl (vom Assistenten ausgegeben)

Es werden 0,7 – 0,9 g Mehl genau in einen trockenen 50-mL-Messkolben eingewogen, der Messkol-

ben wird mit dem wasserfreien Methanol bis zur Marke aufgefüllt, verschlossen und durch kräftiges

Schütteln gut durchmischt. ( Probelösung)

Vortitration

Zur Beseitigung des Wassers im Titriergefäß, am Magnetrührstäbchen und der Elektrode werden

20 mL Methanol in das Titriergefäß pipettiert und bis zum Endpunkt titriert. Der Verbrauch an KARL-

FISCHER-Lösung für diese erste Titration bleibt unberücksichtigt.

Bestimmung des Blindwertes (Wassergehalt des Lösungsmittels)

20 mL Lösungsmittel (Methanol) werden in das austitrierte Titriergefäß eingefüllt und bis zum End-

punkt titriert.

Bestimmung des Titers

Mit einer 20-µL-Kolbenhubpipette werden 20 µL Wasser in das austitrierte Medium pipettiert. Die

Lösung wird bis zum Endpunkt titriert.

Titration der Probelösung

20 mL der Probelösung werden in das austitrierte Medium pipettiert. Die Lösung wird bis zum End-

punkt titriert.

Anmerkungen

Vor Inbetriebnahme und Messung findet eine Einweisung am Gerät statt.

Eine Bedienungsanleitung für das automatische Titriergerät befindet sich am Gerät.

Alle benutzten Glasgeräte müssen unbedingt trocken sein.

Zur Überprüfung der Kolbenhubpipette sollte mehrmals Wasser mit Raumtemperatur in ein

kleines Becherglas pipettiert und auf der Analysenwaage ausgewogen werden.

Die Abfälle der KARL-FISCHER-Titration sind gesondert zu entsorgen.


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Literatur

E. Scholz, Karl-Fischer-Titration, 1. Auflage, Springer Verlag, Berlin, 1984.

E. Scholz, Hydranal-Praktikum: Wasserreagenzien nach Eugen Scholz für die Karl-Fischer-Reaktion,

Seelze, 2006.

H.D. Isengard, M. Nowotny, Extraktion als Vorbereitung für die Karl-Fischer-Titration, Dtsch. Lebensm.

Rundschau, 88, 246-251 1992.

H. G. Maier, Lebensmittel- und Umweltanalytik, 1. Auflage, Steinkopff Verlag, Darmstadt, 1989.

R. Matissek, G. Steiner, M. Fischer, Lebensmittelanalytik, 5. Auflage, Springer-Verlag, Berlin, 2014.

G. Jander, K.F. Jahr, R. Martens-Menzel, G. Schulze, J. Simon, Maßanalyse, 18. Auflage, Walter de Gru-

yter Verlag, Berlin, 2012.

1.3 Fettextraktion

1.3.1 Extraktion nach Säure-Aufschluss (Methode nach WEIBULL-STOLDT)

Grundlagen

Durch den Säureaufschluss mit anschließender SOXHLET-Extraktion wird auch der Anteil des Fettes im

Lebensmittel erfasst, welcher chemisch oder adsorptiv an Proteine oder Kohlenhydrate gebunden

vorliegt.

Geräte und Hilfsmittel

Extraktionsapparatur nach SOXHLET mit 250-mL-Schliffkolben

Extraktionshülsen, entfettet

Faltenfilter, doppelt, mittlerer Porendurchmesser höchstens 5 µm

Watte, entfettet

Chemikalien

Extraktionsmittel: n-Hexan oder Petrolether (40 – 60 °C)

Salzsäure, reinst, ca. 25 % (w/v)


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Durchführung


Der Kolben der Extraktionsapparatur wird mit einigen Siedesteinchen versehen und 1 h im Trocken-

schrank bei (103 ± 2) °C getrocknet, im Exsikkator auf Raumtemperatur abgekühlt und auf 1 mg genau

gewogen. Je nach dem zu erwartenden Fettgehalt (die Auswaage soll unter 3 g ergeben) werden bis

zu 10 g der gut durchgerührten Probe in ein trockenes 600-mL-Becherglas auf 1 mg genau eingewo-

gen, mit 100 mL dest. Wasser und mit 150 mL Salzsäure (ca. 25 % (w/v)) versetzt. Nach Zugabe einiger

Siedesteinchen und eines Glasstabes wird das Becherglas mit einer Uhrglasschale bedeckt, der Inhalt

zum Sieden gebracht und unter mehrmaligem Umrühren 30 – 60 min auf kleiner Flamme bei schwa-

chem Sieden gehalten; danach werden ca. 100 mL heißes Wasser zugegeben.

Ein Faltenfilter wird im Trichter gründlich mit heißem dest. Wasser durchfeuchtet und anschließend

die noch heiße Aufschlussflüssigkeit schnell filtriert. Becherglas, Uhrglasschale und Glasstab werden

sorgfältig mit heißem dest. Wasser nachgewaschen und bei (103 ± 2) °C im Trockenschrank getrock-

net. Filtrationsrückstand und Filter werden mit heißem dest. Wasser bis zur Säure- bzw. Chloridfrei-

heit ausgewaschen (Prüfung des Waschwassers mit pH-Indikatorpapier bzw. Silbernitratlösung) und

1 – 2 h in dem zum Aufschluss benutzten Becherglas bei (103 ± 2) °C im vorgeheizten Trockenschrank

getrocknet. Auf gründliche Trocknung ist zu achten, da Feuchtigkeit das Ergebnis beeinträchtigen

kann.

Die trockenen Filter mit dem Rückstand werden in eine Extraktionshülse gegeben. Fettspuren im Be-

cherglas werden mit in Extraktionsmittel getränkter Zellstoffwatte aufgenommen und ebenfalls in

die Hülse gefügt und diese in die Extraktionsapparatur eingesetzt. Der Kolben der Extraktionsappa-

ratur wird mit dem Extraktionsmittel gefüllt, die Innenwand des zum Aufschluss verwendeten Be-

cherglases sowie die Uhrglasschale werden mit Extraktionsmittel abgespült und dieses mit in den

Extraktionskolben gegeben. Das Gesamtvolumen des Extraktionsmittels soll etwa das

1,5 – 2-fache des Nennvolumens des Extraktionsaufsatzes betragen. Nach Zusammensetzen der Ap-

paratur wird der Kolbeninhalt 2 – 4 h auf dem Sand- oder Wasserbad am Sieden gehalten (darauf

achten, dass das Extraktionsmittel immer auf einmal vollständig „abhebt“ und in die Vorlage fließt).

Nach der Extraktion wird das Extraktionsmittel destillativ entfernt. Der Kolben wird in waagerechter

Stellung 1 h im Trockenschrank bei (103 ± 2) °C getrocknet und nach Abkühlen im Exsikkator auf

Raumtemperatur auf 1 mg genau gewogen. Der Vorgang wird mit jeweils halbstündiger Trocknungs-

zeit bis zum Erreichen der Massenkonstanz (Massenänderung nicht mehr als 0,1 %) wiederholt. Eine


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Massenzunahme bleibt unberücksichtigt; der Berechnung wird in jedem Falle der niedrigste erhal-

tene Auswaagewert zugrunde gelegt. Extraktion, Trocknung und Wägung müssen unmittelbar auf-

einander folgen.

Das Ergebnis wird unter Berücksichtigung der signifikanten Stellen angegeben.

Anmerkungen

Das Lösungsmittel wird gesammelt und kann zur Extraktion wieder verwendet werden.

Literatur



H. Pardun, Analyse der Nahrungsfette, Verlag Paul Parey, Berlin, 1976.



J. Schormüller (Hrsg.), Handbuch der Lebensmittelchemie, Bd. III/2, Springer-Verlag, Berlin, 1968.

1.3.2 Extraktion nach ammoniakalischem Aufschluss (Methode nach RÖSE-GOTTLIEB)

Grundlagen

Die Eiweißstoffe werden durch Behandeln mit Ammoniak aufgeschlossen. Das Fett wird mit Hilfe

organischer Lösungsmittel extrahiert, von diesen durch Abdampfen oder Destillation befreit und

nach dem Trocknen gewogen.

Geräte

Extraktionsrohr nach MOJONNIER (s. Abb. 1)

Korkstopfen

Abb. 1: Extraktionsrohr nach MOJONNIER.


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Chemikalien

Ammoniaklösung, 25 % (w/v)

Ethanol, min. 94 % (v/v)

Diethylether, Siedepunkt 34 – 35 °C, peroxidfrei

Petrolether, Siedebereich 40 – 60 °C

Phenolphthaleinlösung, 1 % (w/v) in Ethanol

Durchführung

Probe: Kondensmilch (vom Assistenten ausgegeben)

Ein mit einigen Siedesteinchen versehener Rundkolben wird im Trockenschrank 1 h lang getrocknet.

Nach 1 h Abkühlen bei Raumtemperatur auf ± 1 mg gewogen. Von der zu untersuchenden Probe wer-

den etwa 10 g auf ± 1 mg genau in das Extraktionsgefäß eingewogen.

Es werden 2 mL Ammoniaklösung zugegeben, innerhalb von 30 s gemischt, dann 10 mL Ethanol zu-

gegeben und erneut durchgemischt. Zum besseren Erkennen der Phasentrennung können zwei Trop-

fen (ca. 50 μL) Phenolphthaleinlösung zugegeben werden. Zum Durchmischen wird das Extraktions-

rohr mit einem angefeuchteten Korkstopfen verschlossen (Die Korkstopfen werden in Wasser aufge-

kocht und stets unter Wasser aufbewahrt). Es werden 25 mL Diethylether und nach kurzem Schütteln

25 mL Petrolether zugegeben. Das Extraktionsgefäß wird wieder verschlossen und 30 s lang unter ge-

legentlichem Umstürzen geschüttelt. Es wird stehengelassen, bis die Diethylether/Petroletherphase

klar geworden ist und sich vollständig von der wässrigen Phase getrennt hat. Nach Entfernen des

Stopfens wird so viel wie möglich von der organischen Phase in den Rundkolben dekantiert. Es wird

noch zweimal extrahiert, indem der beschriebene Arbeitsgang mit je 15 mL Diethylether und Petro-

lether wiederholt wird.

Das Lösungsmittel wird destillativ abgetrennt und der Rundkolben wird liegend etwa 1 h im Trocken-

schrank bei (102 ± 2,5) °C getrocknet. Zum Abkühlen wird der Kolben 1 h lang bei Raumtemperatur

stehengelassen und anschließend auf ± 1 mg genau gewogen. Das Trocknen wird jeweils 60 min lang

fortgesetzt, bis die Gewichtsabnahme weniger als 1 mg beträgt.

Zur Kontrolle der verwendeten Chemikalien ist nach der gegebenen Arbeitsvorschrift ein Blindver-

such durchzuführen, wobei anstelle des Milchproduktes 10 mL Wasser zugegeben werden. Ein hierbei

ermittelter Blindwert ist festzuhalten und bei der Analysenberechnung zu berücksichtigen. Er sollte

1 mg nicht überschreiten.


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Die Differenz der Ergebnisse der beiden Bestimmungen darf bei Vollmilch, teilentrahmter Milch, Ma-

germilch, Buttermilch, Molke 0,03 g Fett in 100 g der Probe und bei Sahne und Schlagsahne 0,2 g Fett

in 100 g der Probe nicht überschreiten (= Wiederholbarkeit r; r = 0,20 g für Sahne, Schlagsahne). Als

Ergebnis ist das arithmetische Mittel der Bestimmungen auf signifikante Stellen gerundet anzuge-

ben.

Literatur





J. Schormüller (Hrsg.), Handbuch der Lebensmittelchemie, Bd. III/2, Springer-Verlag, Berlin, 1968.

1.3.3 Halbmikro-Buttersäurezahl (HBsZ)

Grundlagen

Die Halbmikro-Buttersäurezahl (HBsZ) gibt an, wie viel Milliliter 0,01 M Alkalilauge zur Neutralisation

der aus 0,5 g Fett erhaltenen, in mit Kaliumsulfat gesättigter schwefelsaurer Lösung löslichen, flüch-

tigen Fettsäuren erforderlich sind. Die Halbmikro-Buttersäurezahl erfasst nicht nur die Buttersäure,

sondern auch einen kleinen Anteil der nächsthöheren Homologen. Buttersäure ist in Lebensmittel-

fetten ausschließlich in Milchfett enthalten, die HBsZ ist somit indirekt ein Maß für den Anteil an

Milchfett in der Probe und damit ein Qualitätskriterium für Milchfetterzeugnisse.

Nach Verseifen des Fettes werden die durch Ansäuern der Seife freigesetzten wasserlöslichen, flüch-

tigen Fettsäuren destillativ entfernt und im Destillat mit Natronlauge titriert. Da die Fettsäuren sich

in ihrer Löslichkeit und Flüchtigkeit gegenseitig beeinflussen, wird zur besseren Erhaltung konstanter

Bedingungen gesättigte Kaliumsulfatlösung (zum Aussalzen der höheren Fettsäuren) und Kokossei-

fenlösung (zur Sättigung des Gemisches mit mittelkettigen Fettsäuren) hinzugefügt.


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Geräte

Destillationsapparatur

Röhrchen nach BECKEL: 11,0 mL und 12,5 mL (s. Abb. 2)

Chemikalien

Kieselgur

Glycerin

Phenolphthaleinlösung, 1 % (w/v) in Ethanol

Alkoholische Kaliumhydroxidlösung: 40 mL Kaliumhydroxidlösung 48 % (w/w) und 40 mL dest. Was-

ser mit 96 %igem Ethanol auf 1000 mL auffüllen. Der Gehalt an Lauge muss unbedingt jedes Mal kon-

trolliert werden (Titration gegen Phenolphthalein; 5 mL Lauge soll 25 – 27 mL 0,1 M Salzsäure verbrau-

chen).

Gesättigte Kaliumsulfatlösung (bei 20 °C etwa 10 g K2SO4 in 100 g wässriger Lösung)

Kokosseifenlösung: 100 g Kokosfett mit 100 mL Glycerin und 40 mL Kaliumhydroxidlösung 75 %

(w/w) in einem 1-L-Kolben bis zur klaren Lösung erhitzen; nach kurzem Stehen mit dest. Wasser auf

1 L auffüllen.

Natriumhydroxid-Maßlösung, c = 0,01 mol/L in dest. Wasser

Durchführung

Probe: Milchprodukt (vom Assistenten ausgegeben)

Verseifung

In einem 50-mL-Rundkolben werden 500 – 520 mg frisch geschmolzenes Fett genau eingewogen,

5,0 mL alkoholische Kaliumhydroxidlösung sowie Siedesteinchen hinzugefügt und unter Rückfluss

15 min lang zum leichten Sieden (Wasserbad) erhitzt. Das Fett muss gelöst und verseift sein. Dann

wird 1,0 mL Glycerin hinzugefügt und weitergekocht, bis der Alkohol größtenteils verdampft ist (stär-

keres Schäumen). Anschließend werden im Trockenschrank bei 100 °C letzte Alkoholreste aus dem

liegenden Kolben verdampft.

Freisetzen der Fettsäuren

Zur heißen Seife werden sofort 15,0 mL Kaliumsulfatlösung unter kräftigem Umschütteln zugefügt.

Der Kolben wird verschlossen und umgeschwenkt bis die Seife gleichmäßig verteilt ist; bei Seifen ho-

her Viskosität evtl. nochmals kurz im Trockenschrank (wenige Minuten, 103 °C ± 2 °C) erwärmen.

Abb. 2: 12,5 mL-Röhrchen nach BECKEL.


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Nachdem der Kolben im Wasserbad bei 20 °C temperiert wurde, werden nacheinander unter Um-

schütteln 0,5 mL Schwefelsäure 25 % (w/v), 1,0 mL Kokosseifenlösung und ca. 0,1 g Kieselgur hinzuge-

geben. Daraufhin wird erneut 5 min in einem 20 °C-Wasserbad temperiert, der Kolbeninhalt

(V1 = 17,5 mL) kräftig geschüttelt und durch ein Faltenfilter ( = 9 cm) in ein BECKEL-Röhrchen filtriert,

bis das Filtrat 12,5 mL (= V2) beträgt [der Filterrückstand darf etwas ausgepresst werden (vorsichtig

mit Reagenzglas o.ä.)].

Destillation

Das Filtrat wird in einem 100-mL-Rundkolben überführt und das BECKEL-Röhrchen wird mit 5,0 mL

frisch ausgekochtem dest. Wasser nachgespült. Nach Zugabe einiger Siedesteine werden 11,0 mL in

die Vorlage destilliert.

Titration

Das Destillat wird quantitativ in einem Erlenmeyerkolben überführt, mit 1 - 2 Tropfen (ca. 20 - 50 μL)

Phenolphthaleinlösung 1 % (w/v, in Ethanol) versetzt und mit 0,01 M Natriumhydroxid-Maßlösung

bis zur bleibenden Rosafärbung titriert.

Ein Blindversuch mit 500 mg Kakaofett wird ebenso wie der Hauptversuch durchgeführt.

Literatur

Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG, Nr. L 18.00-1.

Deutsche Gesellschaft für Fettwissenschaft (Hrsg.), DGF-Einheitsmethoden, 2. Auflage, C - V (51), Wis-

senschaftl. Verlagsges., Stuttgart, 2016.

Matissek, R., Schnepel, F.-M., Steiner, G., Lebensmittelanalytik, 2. Auflage, Springer Verlag, Berlin, 1992.

Pardun, H., Analyse der Nahrungsfette, Verlag Paul Parey, Berlin, 1976.

Rauscher, K.; Engst, R.; Freimuth, U. (REF), Untersuchung von Lebensmitteln, 2. Auflage, VEB Fachbuch-

verlag, Leipzig, 1986.

Schormüller, J. (Hrsg.), Handbuch der Lebensmittelchemie, Bd. IV, Springer-Verlag, Berlin, 1968.


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2 Protein- und Kohlenhydratgehalt in Lebensmitteln

2.1 Stickstoffbestimmung nach KJELDAHL

Grundlagen

Die Probe wird mit konzentrierter Schwefelsäure in Gegenwart von Katalysatoren (hier: Selenreakti-

onsgemisch) oxidativ aufgeschlossen, wobei Proteine und Aminosäuren zu Ammoniumsulfat umge-

setzt werden. In alkalischem Medium wird aus dem Ammoniumsulfat Ammoniak freigesetzt. Dieses

wird mittels Wasserdampfdestillation in eine borsäurehaltige Vorlage überführt und durch acidimet-

rische Titration bestimmt. Aus dem Verbrauch lässt sich unter Berücksichtigung des Stickstoff-Äqui-

valentes und des proteinspezifischen Umrechnungsfaktors der Proteingehalt der Probe berechnen.

Geräte

KJELDAHL-Kolben (für die automatische Wasserdampfdestillation)

Aufschlussblock (Heizblock mit Spirale)

Automatische BÜCHI-Destillationsapparatur oder Destillation nach PARNAS-WAGNER

Wichtig: Für den Aufschlussblock und die automatische BÜCHI-Destillationsapparatur ist eine vorhe-

rige Geräteeinweisung notwendig!

Chemikalien

Selenreaktionsgemisch

Schwefelsäure, 96 % (w/v)

Natronlauge, 33 % (w/v) in dest. Wasser

Borsäure, 4 % (w/v) in dest. Wasser

Salzsäure-Lösung, 0,1 M in dest. Wasser

Tashiro-Indikator: 10 mL Methylrot-Lösung 0,03 % (w/v) in Ethanol 70 % (v/v) und 1,5 mL Methylen-

blau-Lösung 0,1 % (w/v) in Ethanol 70 % (v/v) (nur etwa eine Woche haltbar)


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Durchführung


Vor der Durchführung ist die Absauganlage auf Funktionsfähigkeit zu überprüfen.

ACHTUNG: es wird mit hochkonzentrierter Säure und Lauge gearbeitet!

Aufschluss (im Abzug durchzuführen, Absauganlage ist aufgebaut)

1 g homogenisierte Wurstprobe werden eingewogen und in den KJELDAHL-Kolben überführt. Nach Zu-

gabe von ca. 2 g Selenreaktionsgemisch, 20 mL Schwefelsäure 96 % (w/v) wird der Glasaufsatz auf

dem Kolben befestigt. Der Kolben wird auf dem Heizblock erst langsam, bis das Schäumen nachlässt,

dann stark erhitzt. Dabei ist zu beachten, dass für Nutzung der Apparatur stets alle sechs Kolben an-

geschlossen werden müssen. Sollten weniger Proben bearbeitet werden, müssen die restlichen Kol-

ben mit je 20 mL Schwefelsäure 96 % (w/v) (Achtung: niemals Wasser statt Schwefelsäure verwen-

den!) befüllt werden und „leer“ mit erhitzt werden. Der Aufschluss ist vollständig, wenn die Lösung

klar und farblos oder hellgrün ist (mehrere Stunden). Es wird weitere 30 min erhitzt und der Auf-

schluss zum Abkühlen stehengelassen.

Destillation mittels BÜCHI-Apparatur

Der abgekühlte KJELDAHL-Kolben wird in die automatische Wasserdampfdestillationsapparatur ein-

gespannt. Anschließend wird 6 s (entspricht 75 mL) dest. Wasser zu dosiert, um die Probe zu verdün-

nen und die nachfolgende Reaktion kontrolliert ablaufen zu lassen. Dafür werden im nächsten Schritt

6 s (entspricht 75 mL) Natronlauge zu dosiert. Der Auslauf der Destillationsapparatur muss in die Vor-

lage eintauchen, welche ca. 50 mL Borsäure 4 % (w/v) und zwei Tropfen (ca. 50 μL) Tashiro-Indikator

enthalten soll. Abschließend wird eine Wasserdampfdestillation für 5 min bei 75 % Wasserdampf-

druck ausgeführt.

Destillation nach PARNAS und WAGNER

In die Destillationsapparatur werden 25 ml der verdünnten Aufschlußlösung, 1 – 2 Tropfen (ca. 40 μL)

Tashiro-Indikator sowie 100 mL Wasser gegeben und die Wasserkühlung eingeschaltet. Von oben

werden 50 mL Natronlauge 33 % (w/v) zugegeben. Dabei muss eine Unterschichtung vermieden wer-

den, da es sonst zu heftigen Siedeverzügen kommen kann (evtl. etwas schütteln). Der Auslauf der

Destillationsbrücke muss in die Vorlage eintauchen, welche ca. 50 mL Borsäure 4 % (w/v) und zwei


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Tropfen (ca. 50 μL) Tashiro-Indikator enthalten soll. Es werden 30 – 50 mL überdestilliert; die Destilla-

tionsdauer soll maximal 30 min betragen. Dann wird die Vorlage gesenkt, der Auslauf abgespült und

noch 1 min destilliert.

Abb. 3: Schematische Wasserdampfdestillationsapparatur nach PARNAS und WAGNER.

Abb. 4: Automatische Wasserdampfdestillationsapparatur der Firma BÜCHI.

Titration

Die Vorlagenlösung wird mit 0,1 M Salzsäure bis zum Farbumschlag des Tashiro-Indikators nach grau

titriert.

Abhängig vom Aminosäuremuster ergeben sich für verschiedene Proteinquellen unterschiedliche An-

teile des Stickstoffs am Protein. Da aber der Stickstoffgehalt innerhalb einer Proteinquelle nur in en-

gen Grenzen schwankt, kann der Proteingehalt nach Aufschluss der Probe und Bestimmung des Ge-

samtstickstoffgehaltes unter Zuhilfenahme eines proteinspezifischen Umrechnungsfaktors berech-

net werden.


17/103

Tab. 1: Umrechnungsfaktoren (U) für verschiedene Lebensmittel für die Proteinbestimmung nach KJELDAHL.

Proteinquelle U

Uneinheitliche Proteingemische 6,25

Fleisch, Eier, Fisch, Mais, Leguminosen, Getreide, Gemüse, Obst 6,25

Milch- und Milchprodukte 6,38

Reis 5,95

Ölsaaten, Nüsse 5,40

Gelatine 5,55

Anmerkungen

Der Aufschluss nach KJELDAHL erfasst organisch gebundenen Stickstoff, d. h., er ist nicht spezifisch für

Proteine und Aminosäuren. Es werden auch andere stickstoffhaltige Verbindungen (Nichtproteinver-

bindungen) aufgeschlossen, wobei deren Umsetzung aber nicht immer quantitativ verläuft und/oder

nicht immer zum Ammoniumsalz führt. Der Anteil derartiger Substanzen in Lebensmitteln sollte aber

vernachlässigbar gering sein, sodass diese Bestimmungsmethode ein hinreichend genaues Ergebnis

für den Gesamtproteingehalt liefert.

Literatur



Amtl. Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, Nr. L 06.00-7.


2.2 Hydroxyprolingehalt in Fleisch und Fleischerzeugnissen

Grundlagen

Die Probe wird durch saure Hydrolyse aufgeschlossen. Das dadurch aus dem Bindegewebs-eiweiß

freigesetzte Hydroxyprolin wird nach Abtrennung des Fettes unter Verwendung von Chloramin T oxi-

diert. Das Oxidationsprodukt bildet mit 4-Dimethylaminobenzaldehyd eine rot gefärbte Verbindung.

Die Absorption der diese Verbindung enthaltenden Messlösung wird bei 558 nm photometrisch ver-

messen. Sie ist der Hydroxyprolinkonzentration proportional.


18/103

Geräte

Wasserbad

Glasküvetten, Schichtdicke 1 cm

Spektralphotometer

Schliffstopfenreagenzgläser, graduiert

Thermometer

Chemikalien

Salzsäure-Lösung, 6 M

Petrolether 60/80 (v/v)

Pufferlösung (pH 6,8): 26,0 g Citronensäure-Monohydrat, 14,0 g Natriumhydroxid-Plätzchen und

78,0 g Natriumacetat (wasserfrei) in 750 mL dest. Wasser und 250 mL 1-Propanol (bei 4 °C etwa zwei

Monate haltbar)

L-Hydroxyprolin-Stammlösung I: c = 60 mg/100 mL in dest. Wasser

L-Hydroxyprolin-Stammlösung II: aus Stammlösung I; c = 3 mg/500 mL in dest. Wasser

L-Hydroxyprolin-Standardlösungen: aus Stammlösung II; c = 0; 30; 60; 90; 120 µg/100 mL in dest.

Wasser (bei 4 °C etwa zwei Monate haltbar)

Oxidationsreagenz: 0,7 g Chloramin T Trihydrat in 50 mL Pufferlösung (bei 4 °C und im Dunkeln etwa

eine Woche haltbar)

Farbreagenz: 4,0 g 4-Dimethylaminobenzaldehyd in 14 mL Perchlorsäure 60 % (w/v), langsam 26 mL

2-Propanol hinzugeben (Herstellung erst am Tag der Verwendung und nur so viel, wie benötigt)

Durchführung


Es wird min. eine Doppelbestimmung durchgeführt. Außerdem ist eine Kalibriergerade zu erstellen.

Hydrolyse

4 g der homogenisierten Probe werden in einen 100-mL-Rundkolben eingewogen. Nach Zugabe von

30 mL 6 M Salzsäure und einigen Siedesteinen wird der Ansatz auf dem Sandbad bis zum schwachen

Sieden erhitzt und 8 h unter Rückfluss gekocht.


19/103

Entfettung

Das Hydrolysat wird quantitativ mit Wasser in einen 250-mL-Messkolben überführt und 5 mL Petro-

lether dazu gegeben. Der Kolben wird mit Wasser aufgefüllt, wobei die Petrolether-Schicht oberhalb

der Marke liegen soll. Nach gründlicher Durchmischung und Absetzenlassen wird die Petrolether-

Schicht durch Absaugen mit einer Pasteurpipette entfernt und verworfen. 5,0 mL des verdünnten

Hydrolysates werden in einen 250-mL-Messkolben überführt und mit dest. Wasser aufgefüllt.

Bei fettfreien Proben kann auf die Petrolether-Behandlung verzichtet werden.

Derivatisierung/Farbreaktion

4,0 mL der Verdünnung werden in ein Schliffstopfenreagenzglas pipettiert und 2 mL Oxidations-rea-

genz zugegeben. Nach gründlicher Durchmischung wird der Ansatz 20 min 1 min bei Raumtempe-

ratur stehen gelassen. Dann werden 2 mL Farbreagenz zugegeben und nach Mischung genau 15 min

bei 60 °C 0,5 °C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wird das Schliffstopfenreagenzglas unter

fließendem Leitungswasser mind. 3 min abgekühlt. Nach 30 min Standzeit bei Raumtemperatur er-

folgt die photometrische Messung der Absorption der Lösung bei 558 nm in einer Glasküvette. Die

angegebenen Bedingungen sind genau einzuhalten. Ebenso müssen Derivatisierung, Farbreaktion

und Messung ohne Unterbrechung in einem Arbeitsgang erfolgen.

Kalibriergerade

Durchführung wie oben beschrieben, anstelle des verdünnten Hydrolysates sind jeweils 4 mL der

Hydroxyprolin-Standardlösungen einzusetzen.

Berechnung des Bindegewebsgehaltes

Vorbemerkung

Bindegewebsproteine (Elastin und Kollagen) weisen ein anderes Aminosäuremuster als die anderen

Fleischproteine auf. Kennzeichnend für das Kollagen sind die hohen Gehalte an Glycin, Prolin, Hydro-

xyprolin sowie 5-Hydroxylysin. Hydroxyprolin kommt fast ausschließlich in Bindegewebe vor. In kol-

lagenem Bindegewebe beträgt der mittlere Hydroxyprolinanteil 12,4 %. Der Hydroxyprolingehalt ei-

ner Probe kann daher als Maßstab für den Gehalt an Bindegewebe dienen und damit als Berech-

nungsgrundlage für den BEFFE-Wert (bindegewebseiweißfreies Fleischeiweiß), welcher ein wichtiges

Kriterium für die Qualität von Fleisch und Fleischerzeugnissen nach den entsprechenden Leitsätzen

darstellt.


20/103

Der kollagene Bindegewebsanteil der Probe BGabs errechnet sich nach:

BGabs= 8 ∙ HyP (1)

Bedeutung der verwendeten Größen:

Größe Einheit Bedeutung

BGabs [%] kollagener Bindegewebsanteil bezogen auf die Probe

HyP [%] Hydroxyprolingehalt der Probe

Von größerer Bedeutung in Bezug auf eine Qualitätsbewertung sind der auf das Gesamtprotein be-

zogene Bindegewebsanteil BGrel sowie der BEFFE-Wert. Sie berechnen sich nach:

BGrel = BGabs

P∙100 bzw. BEFFE = P − BGabs (2)



BGrel [%] kollagener Bindegewebsanteil, bezogen auf das Gesamtprotein

BGabs [%] kollagener Bindegewebsanteil, bezogen auf die Probe

BEFFE [%] Gehalt des bindegewebseiweißfreien Fleischeiweiß

P [%] Gesamtproteingehalt der Probe, ermittelt nach 2.1

Anmerkung

Die aufgeführte BEFFE-Berechnung ist nur eine vereinfachte Näherung, da korrekterweise auch noch

weitere stickstoffhaltige Verbindungen wie Fremdproteine (Nichtfleischproteine, z.B. Sojaprotein)

und stickstoffhaltige Nichteiweiß-Verbindungen (z.B. Harnstoff) zu berücksichtigen wären.


21/103

Literatur





Leitsätze für Fleisch- und Fleischerzeugnisse vom 27./28. November 1974 (BAnz. Nr. 134a vom 25. Juli

1975, GMBl 1975 S. 489), zuletzt geändert durch die Bekanntmachung vom 24. September 2014 (BAnz.

AT vom 01.12.2014 B2, GMBl 2014 S. 1533).

2.3 Nachweis von Ei- und Milchproteinen in Lebensmitteln mittels diskonti-

nuierlicher Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (Disk-

SDS-PAGE)

Grundlagen

Diese Methode beschreibt ein Nachweisverfahren von Ei- und Milchproteinen in Lebensmitteln mit-

tels diskontinuierlicher Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (englisch: sodium

dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, disk-SDS-PAGE) nach der Extraktion mit einer phos-

phatgepufferten Salzlösung (englisch: phosphate buffered saline, PBS-Puffer). Die Elektrophorese bie-

tet eine relativ einfache und reproduzierbare Trennung von Proteinen. Anhand dieser Trennung kön-

nen proteinhaltige Zutaten wie Milch- und Eiprodukte in Lebensmitteln zuverlässig identifiziert wer-

den.

Disk-SDS-PAGE

Die SDS-PAGE beruht auf der Wanderung von negativ geladenen Teilchen in einem elektrischen

Gleichstromfeld. Das anionische Tensid Natriumdodecylsulfat unterdrückt die Eigenladung der Pro-

teine, sodass sie ausschließlich nach ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Dies beruht darauf,

dass der unpolare Teil des SDS-Moleküls mit den unpolaren Seitenketten der Proteine in Wechselwir-

kung tritt. Es entstehen negativ geladene SDS-Protein-Komplexe (s. Abb. 5).


22/103

Abb. 5: Strukturformel von Natriumdodecylsulfat.

Die elektrophoretische Trennung wird in einem Polyacrylamidgel durchgeführt. Bei dem hier verwen-

deten Polyacrylamidgel handelt es sich um ein diskontinuierliches Trennsystem (disk) aus einem

weitporigen Sammelgel, welches einen pH-Wert von 6,8 aufweist und einem engporigen Trenngel

(pH 8,8). Dieses diskontinuierliche Trennsystem verhindert das Aggregieren der Proteine und führt zu

einer hohen Bandenschärfe.

Die Proteine werden mittels PBS-Extraktionspuffer aus der Probe extrahiert und die Gesamtprotein-

konzentration nach BRADFORD bestimmt. Dazu wird ein Farbstoff-Protein-Komplex in phosphorsaurer

ethanolischer Coomassie Brilliant Blue G-250 Lösung photometrisch bei 590 nm gemessen.

Für die Kalibrierung wird eine Kalibrierreihe von Rinderserumalbumin (Bovines Serumalbumin, BSA)

photometrisch gemessen. Die Proteinkonzentrationen der Extrakte werden auf 200 – 300 mg/L ein-

gestellt.

Die Extrakte werden mit β-Mercaptoethanol-Reduktionspuffer behandelt, der für die Reduktion der

Disulfidbrücken sorgt. Diese reduzierten Proteine werden mittels disk-SDS-PAGE nach ihrem Moleku-

largewicht aufgetrennt. Die Eigenladung der Proteine wird durch das anionische Detergenz SDS voll-

ständig unterdrückt. Die Trennung der Proteine erfolgt in einem selbst gegossenen Polyacrylamidgel,

welches aus einem 4 %igen Sammelgel und einem 12 %igen Trenngel besteht. Die Proteinbanden

können im Gel unspezifisch entweder durch eine kolloidale Coomassie-Färbung durch die Anlagerung

des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 als blaue Banden, oder mittels Silberfärbung als

dunkle Banden sichtbar gemacht werden.

Für die Auswertung des Elektropherogramms werden die Banden der Proben bzw. der Standards mit

den Banden des Molekulargewichtmarkers verglichen.

Chemikalien

a) Probenvorbereitung

Coomassie Brilliant Blue G-250-Lösung 2 % (w/v): 2 g Coomassie Brilliant Blue G-250 in 100 mL dest.

Wasser lösen

SDS-Lösung 40 % (w/v): 40 g Natriumdodecylsulfat in 100 mL dest. Wasser lösen


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Bromphenolblau-Lösung 5 % (w/v): 5 g Bromphenolblau in 100 mL dest. Wasser lösen

PBS-Extraktionspuffer (pH 7,4): 1,742 g Kaliumdihydrogenphosphat (0,1 M) und 8,766 g Natriumchlo-

rid (0,15 M) in einem 800-mL-Becherglas in 800 mL dest. Wasser lösen, mit Phosphorsäure, Salzsäure

oder Natronlauge pH 7,4 einstellen und Lösung in 1-L-Messkolben überführen und auffüllen

β-Mercaptoethanol-Reduktionspuffer: 1,21 g Tris-HCl (0,1 M), 20 mL Glycerin, 10 mL SDS-Lösung 40 %

(w/v), 4 mL β-Mercaptoethanol und 10 mL Bromphenolblau-Lösung 5 % (w/v) ad 100 mL dest. Wasser

auffüllen

Proteinstandardlösung: 50 mg BSA in 100-mL-Messkolben mit dest. Wasser (500 mg/L)

Tab. 2: Verdünnungsschritte der BSA-Standardreihe.

Standard BSA-Konzentration Verdünnungsschritte

1 500 mg/L -

2 400 mg/L 8 mL Standard 1 auf 10 mL auffüllen




Die reduzierende Thiolverbindung β-Mercaptoethanol im Reduktionspuffer spaltet die Disulfidbrü-

cken der Proteine. Durch die Auffaltung resultiert eine einheitliche Micellenform. Durch die Zugabe

von Glycerin und Bromphenolblau-Lösung in den Reduktionspuffer wird die Handhabung der Pro-

teinlösungen vereinfacht. Glycerin sorgt für eine einfachere Aufbringung der Proben in die Gel-

taschen, indem es sie beschwert und in den Geltaschen hält. Durch die Farbmarkierung von

Bromphenolblau kann die Laufweite der Proteine während der Trennung gut beobachtet werden.

Beim Anlegen einer Spannung wandern die Proteine aufgrund ihrer negativen Ladung in Richtung

der Anode. Die leichteren Proteine bewegen sich schneller durch das Gel als die Proteine mit größe-

rem Molekulargewicht.

a) Lösungen für die Gele

Ammoniumperoxodisulfat (APS)-Lösung: 1 g Ammoniumperoxodisulfat in 10 mL dest. Wasser lösen

Sammelgelpuffer: 15,15 g Tris-Base (0,25 M) und 1 g SDS in einem 400-mL-Becherglas in 400 mL dest.

Wasser lösen. Mit 4 N Salzsäure auf pH 6,3 einstellen. Lösung anschließend in 500-mL-Messkolben

überführen und mit dest. Wasser auffüllen


24/103

Trenngelpuffer: 90,86 g Tris-Base (1,5 M) und 2 g SDS in einem 400-mL-Becherglas in 400 mL dest.

Wasser lösen. Mit 4 M Salzsäure auf pH 8,8 einstellen. Lösung in 500-mL-Messkolben überführen und

mit dest. Wasser auffüllen

Laufpuffer: 3,028 g Tris-Base (0,25 M), 14,413 g Glycin (0,2 M) und 1 g SDS in einem 1-L-Messkolben mit

dest. Wasser auffüllen

Isopropanol

b) Lösungen für kolloidale Coomassie-Färbung

Färbe-Stammlösung: 20 mL Orthophosphorsäure und 100 g Ammoniumsulfat in ca. 700 mL bidest.

Wasser lösen, nach vollständigem Lösen des Ammoniumsulfates 20 mL einer CBB G-250-Lösung hin-

zugeben 5 % (w/v), ad 1 L mit bidest. Wasser auffüllen

Färbelösung: 40 mL der Färbestammlösung mit 10 mL Methanol versetzen. Diese Lösung ist ausrei-

chend zur Färbung von zwei Gelen

c) Lösungen für Silberfärbung (je Gel)

Fixierlösung: 15 mL Ethanol 96 % (v/v) und 5 mL Essigsäure 99 % (v/v) ad 50 mL mit dest. H2O auffüllen

Inkubations-Stammlösung: 68 g Natriumacetat in einem 1-L-Messkolben in ca. 100 mL dest. Wasser

lösen, 300 mL Ethanol 96 % (v/v) zugeben und mit dest. Wasser auffüllen

Inkubationslösung: 100 mg Natriumthiosulfat in einem 50-mL-Messkolben in ca. 10 mL Inkubations-

Stammlösung lösen, 125 μL Glutardialdehyd 50 % (w/v) zugeben und mit dest. Wasser auffüllen

Silber-Stammlösung: 2 g Silbernitrat in 1-L-Messkolben mit dest. Wasser auffüllen

Silber-Färbelösung: 10 μL Formaldehyd in einem 50-mL-Messkolben mit Silber-Stammlösung auffül-

len (muss immer frisch angesetzt werden)

Entwickler-Stammlösung: 25 g Natriumcarbonat in einem 800 mL Becherglas in 800 mL dest. Wasser

lösen und mit Natronlauge auf pH 11,8 einstellen. Lösung anschließend in 1-L-Messkolben überführen

und auffüllen

Entwicklerlösung: 10 μL Formaldehyd in einem 100-mL-Messkolben mit Entwickler-Stammlösung

auffüllen (muss immer frisch angesetzt werden)

Stopplösung: 18,6 g Ethylendiamintetraessigsäure (Triplex 3, 0,5 M) in einem 1-L-Messkolben mit dest.

Wasser auffüllen (je Gel 50 mL einsetzen)


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Geräte

Photometer

Gelgießkammer

Elektrophoresekammer

Spannungsquelle

Mikrotiterplatten

Pipetten (10 – 100 μL, 100 – 1000 μL und 1 – 5 mL)

Eppendorf-Caps 1,5 mL

Durchführung

Probenvorbereitung

Die Gesamtproteinkonzentration des Extraktes soll ca. 10 mg/mL betragen. Hierzu können Literatur-

werte herangezogen werden. Es ist zu beachten, dass die Proteine mit dem PBS-Puffer nicht quanti-

tativ extrahiert werden. Der Extraktionspuffer ist eine phosphatgepufferte Salzlösung, deren pH-

Wert bei 7,4 liegt. Durch diesen Extraktionspuffer wird der pH-Wert konstant gehalten.

Proteinextraktion

Die Probe wird homogenisiert, in ein 1,5-mL-Eppendorf-Cap eingewogen und mit 1 mL PBS-

Extraktionspuffer versetzt. Auf einem Schüttler wird die Probe eine Stunde extrahiert. Anschließend

wird die Lösung bei 15000 rpm für 5 min zentrifugiert und der Überstand wird vorsichtig mit der 1-mL-

Pipette abgenommen. Die Extrakte werden für die Proteinbestimmung nach BRADFORD eingesetzt.

Proteinbestimmung nach BRADFORD

Es werden je 250 μL der BRADFORD-Lösung mit Hilfe der Multipette in die Wells der Mikrotiterplatte

pipettiert (s. Abb. 6). Die Extrakte werden 1:5, 1:10 und 1:20 verdünnt und je 10 μL der Extraktverdün-

nungen, BSA-Standards und des Blindwerts (dest. Wasser) werden als Dreifachbestimmung in die mit

250 μL BRADFORD-Lösung bestückten Wells der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Messung erfolgt mit

dem Microplate Reader bei einer Wellenlänge von 590 nm.

Die BSA-Kalibriergerade sollte mindestens ein R² von 0,95 aufweisen.

Die Proteinkonzentrationen der Proben werden auf 200 bis 300 mg/L eingestellt.


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Abb. 6: Mikrotiterplatte.

Reduktion der Probe

50 μL des nach BRADFORD eingestellten Probenextraktes werden mit 25 μL β-Mercaptoethanol-Reduk-

tionspuffer in einem 1,5 mL Eppendorf-Tube versetzt. Das Tube wird fest verschlossen und für fünf

Minuten in einem Wasserbad auf 95 °C aufgeheizt.

Herstellen der Gele

Wichtiger Hinweis: Die Giftigkeit und die Karzinogenität des unpolymerisierten Acrylamids und des

Formaldehyds machen die Verwendung von Handschuhen beim Umgang mit SDS-Gel und der Durch-

führung der Silberfärbung zwingend erforderlich!!!

a) Vorbereitung des Gießstandes

Die Bauteile des Gießstandes sind in Abb. 8 dargestellt. Aus einer Glasplatte und einer weißen Platte

mit Aussparung wird mit Hilfe von zwei T-förmigen Spacern eine sogenannte Gelkassette geformt.

Dabei müssen die beiden Platten so zusammengesetzt werden, dass die Spacer zwischen den Platten

einen flachen Hohlraum bilden (s. Abb. 7). Diese Gelkassette wird nun in den Rahmen eingesetzt, so-

dass die Glasplatte nach vorne zeigt. Es ist darauf zu achten, dass die Platten und die Spacer an den

Kanten bündig sind und die Aussparung der weißen Platte nach oben zeigt. Die Feststellschrauben

werden vorsichtig angezogen (s. Abb. 9). Der Rahmen wird nun in den Gießstand eingesetzt. Indem

man die beiden Hebel an der Seite des Gießstandes festzieht, wird der Hohlraum der Platten abge-

dichtet. Die Dichtheit wird mit dest. Wasser überprüft.


27/103

b) Herstellung des Trenngels

Die Mengenangaben in Tab. 3 gelten für zwei Gele. Die in Spalte 2 aufgeführten Mengen der Reagen-

zien werden der Reihe nach in ein 50 mL Plastiktube pipettiert. Nachdem die TEMED (N,N,N',N'-Tetra-

methylethylendiamin)-Lösung direkt in die restlichen Lösungen pipettiert wurde, wird sanft umge-

schwenkt. Von dieser Trenngellösung werden 3,5 mL in die Gelkassette pipettiert. Anschließend wird

die Trenngellösung in der Gelkassette mit 1 mL Isopropanol überschichtet. Die Polymerisation bei

Raumtemperatur dauert ca. 45 Minuten. Die in dem Plastiktube verbleibende Flüssigkeit zeigt den

Fortschritt der Polymerisation.

Tab. 3: Pipettierschema für disk-SDS-PAGE Gele.

Chemikalien Trenngel 12 % Sammelgel 4 %

Bidest. Wasser 4,5 mL 2 mL

Trenngelpuffer 4x-Puffer 2,5 mL -

Sammelgelpuffer 2x-Puffer - 2,5 mL

Acrylamid 40 % 3,0 mL 0,5 mL

APS-Lösung 50 μL 50 μL

TEMED-Lösung 10 μL 5 μL

c) Herstellung des Sammelgels

Nach abgeschlossener Polymerisation des Trenngels wird das Isopropanol abgegossen. Restliche Spu-

ren von Flüssigkeit werden mit einem Filterpapier aufgesaugt. Für das Sammelgel werden die Rea-

Abb. 7: Gelkassette

1

2

4

5 6 7

3

3

1

2

Abb. 8: Bauteile für die Herstellung eines

Polyacrylamidgels, 1: Rahmen, 2: Glas-

platte, 3: Platte mit Aussparung, 4: Spa-

cer, 5: Teflonkamm, 6: Feststellschrau-

ben, 7: Gießstand.

Abb. 9: Gelkassette eingebracht in Rah-

men, 1: Aussparung zeigt nach oben, 2:

Feststellschrauben, 3: Glasplatte

(Vorne).


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genzien der Tabelle 2 Spalte 3 nacheinander zusammengegeben. Ein Teflonkamm wird in die Gelkas-

sette eingesetzt. Anschließend wird mit der Sammelgellösung bis zur Oberkante der Gelkassette auf-

gefüllt. Nach 45 Minuten ist das Sammelgel auspolymerisiert. Anschließend werden die Kammern des

Teflonkamms mit einem wasserfesten Stift auf der Glasplatte markiert. Der Kamm verbleibt zunächst

im Gel.

Elektrophorese

Der Rahmen wird aus dem Gießstand entfernt und die Gelkassette mit dem dazwischen liegendem

Gel aus dem Rahmen entnommen. Nun wird die Gelkassette in die Elektrophoresekammer so einge-

setzt, dass die Glasplatte nach vorne zeigt. Mit zwei Klammern wird die Gelkassette fixiert. Dabei ist

darauf zu achten, dass das breite Ende der Klammer nach vorne zeigt. Der Hohlraum hinter der Gel-

kassette wird mit 70 mL Laufpuffer befüllt. Der Pufferbehälter wird mit 110 mL Laufpuffer befüllt. Ist

das Gel vollständig mit Laufpuffer bedeckt wird der Teflonkamm vorsichtig entfernt, ohne die Pro-

bentaschen seitlich zu verschieben (s. Abb. 12).

Je 10 μL der Proben und 7 μL des Molekulargewichtmarkers werden vorsichtig in die Geltaschen pi-

pettiert. Die Elektrophoresekammer wird an die Spannungsquelle angeschlossen (s. Abb. 11). Je Gel

wird eine konstante Stromstärke von 35 mA benötigt.

Die Elektrophorese wird gemäß Bedingungen der Tab. 3 gestartet. Die Elektrophorese wird beendet,

wenn der Farbmarker des Reduktionspuffers die Gelunterkante erreicht hat.

1 2 3

4

Abb. 10: zusammengebaute Apparatur zur Herstellung von

Polyacrylamidgelen, 1: Hebel, 2: Gießstand, 3: Gelkassette in

Rahmen, Kunststoffkamm.


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Tab. 4: Elektrophoresebedingungen.

Stromstärke Dauer Spannung Leistung

Gel Nr. 1 35 mA ca. 40 min 300 V 22 W

Gel Nr. 2 70 mA ca. 40 min 300 V 22 W

Nach dem Ende der Elektrophorese wird der Laufpuffer vorsichtig in ein 800-mL-Becherglas überführt

und entsorgt. Die Klammern der Gelkassette werden gelöst und der restliche Laufpuffer wird eben-

falls entsorgt (Wichtiger Hinweis: Die Entsorgungsanweisungen sind zu beachten). Die Spacer wer-

den aus der Gelkassette entfernt. Die Gelkassette wird vorsichtig mit dem Spacer aufgehebelt. Das

Sammelgel wird mit Hilfe des Spacers abgetrennt und verworfen. Mit Hilfe eines sehr breiten Spatels

wird das Trenngel in eine vorbereitete Kunststoffwanne gelegt.

Kolloidale Coomassie-Färbung

(Wichtiger Hinweis: Die Entsorgungsanweisungen sind zu beachten)

Das Gel wird in eine Kunststoffschale mit frisch angesetzter Färbelösung überführt und über Nacht

geschüttelt. Zum Entfärben der Gele diese in bidest. Wasser schütteln, eventuell mit Hilfe durch Auf-

legen von Zellstoff auf das Gel. Zur Dokumentation wird das Gel eingescannt. Die Färbelösung ist

dabei jeweils kurz vor Gebrauch frisch anzusetzen.

4

2

1

5

1

2

3

3

Abb. 11: zusammengebaute Elektrophoresekammer,

1+2: Kabel führen zur Spannungsquelle, 3: Klammer.

Abb. 12: Einbringen des auspolymerisierten Gels in die Elekt-

rophoresekammer, 1: Elektrode, 2: Hohlraum hinter der Gel-

kasse, 3: Klammer, 4: Gelkassette, 5: Pufferbehälter.

3


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Silberfärbung

(Wichtiger Hinweis: Die Entsorgungsanweisungen sind zu beachten)

a) Fixieren

Die Kunststoffwanne wird mit 50 mL Fixierlösung befüllt und das Gel mit dieser für mindestens

30 min behandelt.

b) Inkubieren

Die Fixierlösung wird verworfen. Nun wird das Gel in der Kunststoffwanne für mindestens 30 min

oder über Nacht mit 50 mL Inkubationslösung behandelt.

An dieser Stelle kann das Verfahren unterbrochen werden.

c) Spülen

Die Inkubationslösung wird verworfen und die Kunststoffwanne dreimal für je 5 min mit 50 mL dest.

Wasser befüllt.

d) Versilbern

Das dest. Wasser wird verworfen. Dem Gel wird in der Kunststoffwanne 50 mL Silber-Färbelösung

zugegeben. Die Versilberung erfolgt für 20 min auf dem Schüttler.

e) Spülen

Die Silber-Färbelösung wird verworfen und das Gel für 1 min mit 50 mL dest. Wasser gewaschen.

f) Entwickeln

Das Gel wird für 30 s mit 50 mL frisch angesetzter Entwicklerlösung behandelt. Die Entwicklerlösung

wird sofort abgegossen.

Das Gel wird erneut mit 50 mL frischer Entwicklerlösung behandelt bis eine ausreichende Färbung zu

erkennen ist. Die Entwicklerlösung wird nun sofort abgegossen und sofort gestoppt.

g) Stoppen

Das Gel wird mit 50 mL Stopplösung für 10 min behandelt

h) Scannen

Zum Schutz des Scanners wird eine durchsichtige Plastikfolie sowohl unter als auch über das Gel ge-

legt.

Die Silberfärbung ähnelt dem Vorgang der Fotoentwicklung. Die Gele werden nach dem Fixieren, In-

kubieren und Waschen in eine Silbernitratlösung gelegt. Die Silberkationen diffundieren in das Gel

und lagern sich an die negativ geladenen Proteine an. Überschüssige Silberionen werden mit Wasser

abgespült. Durch Zugabe von alkalischer Formaldehydlösung werden die Silberionen zu elementarem

Silber reduziert und erscheinen als braun-schwarze Banden.


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Reinigungshinweise

Für die Reinigung der Gießgeräte und der Elektrophoresekammer wird viel dest. Wasser verwendet.

Die Geräte dürfen nicht mit organischen Lösungsmitteln in Berührung kommen. Der Elektrodendraht

an der Elektrophoresekammer muss mit Vorsicht behandelt werden.

Auswertung

Um eine Gesamtproteinkonzentration von 10 mg/mL für die Extrakteinwaage einzustellen wird fol-

gende Formel angewendet:

mEinwaage = 10 mg

P (3)



mEinwaage [mg] Einwaage an Probe für 1 mL Extraktionspuffer, um eine Gesamtpro-

teinkonzentration von 10 mg/mL zu erhalten

P [%] Gesamtproteingehalt der Probe aus der Literatur

Durch die Messung der Kalibrierreihe wird die Proteinkonzentration der Probenextrakte ermittelt.

Nach Umstellen der Geradengleichung wird die Proteinkonzentration wie folgt berechnet:

x = y - b

m (4)



x [mg/L] Proteinkonzentration in der Probe

y [Skt] Extinktion der Probe

b [Skt] y-Achsenabschnitt der Kalibriergeraden

m [L/mg] Steigung der Kalibriergeraden


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Der Proteingehalt P der Extrakte wird mit folgender Gleichung ermittelt:

P =x∙f∙V

mE ∙ 100 % (5)



P [%] Proteingehalt des Extrakts

x [mg/L] Proteinkonzentration in der Probe

f Verdünnungsfaktor des Extrakts

V [mL] Volumen des Extraktes, hier 1 mL

mE [mg] Einwaage an Probe

Die Auswertung der Gele erfolgt über die Zuordnung der Proteinbanden zu den Banden des Moleku-

largewichtsmarkers und der Standards.

Beispielhafte Auswertung anhand von Milch- und Eiprodukten

Charakteristisch für Milch und Eiprodukte sind folgende Proteine:

Tab. 5: Charakteristische Proteine für Milch- und Eiprodukte.

Magermilchpulver Süß- und Sauermolkenpulver Hühnervollei-, Eiklar- und Ei-

gelbpulver

Caseine (11,6 – 25,2 kDa) β-Lactoglobulin (18,3 kDa) Ovalbumin (44,5 kDa)

β-Lactoglobulin (18,3 kDa) α-Lactalbumin (14,2 kDa) Ovotransferrin (76 kDa)

α-Lactalbumin (14,2 kDa) Serumalbumin (66,3 kDa) Ovomucoid (28 kDa)

Serumalbumin (66,3 kDa) Immunoglobuline Lysozym (14,3 kDa)

Immunoglobuline Proteose-Pepton

Proteose-Pepton


33/103

Milchproteine

Bei 67 kDa ist das BSA zu erkennen (s. Abb. 13). Anschließend folgen die Caseine mit -Casein, -Casein

und -Casein. Im niedrigen Molekulargewichtsbereich sind die Molkenproteine ß-Lactoglobulin und

-Lactalbumin zu erkennen. Bei der untersuchten Probe kann durch Betrachten des Proteinmusters

auf das eingesetzte Milchprodukt geschlossen werden. Wurde beispielsweise ausschließlich Molken-

pulver eingesetzt, sind keine Caseine detektierbar.

Eiproteine

In Abb. 13, Spuren 1, 3 und 4, ist das Ovotransferrin bei 76 kDa, das Ovalbumin bei 43 kDa, das Ovomu-

coid bei 30-40 kDa und das Lysozym bei 14 kDa zu erkennen. Meist werden auch bei ausschließlichem

Einsatz von Eigelb- die Eiklarproteine detektiert, da die verfahrenstechnische Trennung nicht von aus-

reichender Sauberkeit ist.

Literatur

M.M. Bradford, A Rapid and Sensitive Methode for the Quantitation of Microgram Quantities of Pro-

tein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, Anal. Biochem. 72, 248-254 1976.

S. J. Compton, Mechanismn of Dye Response and Interference in the Bradford Protein Assay, Anal.

Biochem. 151, 369-374 1985.

200,0 116,3 97,4

66,3

55,4

36,5

31,0

21,5

200,0 116,3 97,4 66,3 55,4

36,5

31,0

21,5

14,4 14,4

M M 1 6 5 4 3 2 Abb. 13: Auftrennung der Ei- und Milchstandardproteine mittels Disc-SDS-PAGE. Die Proteine wurden mittels Coomassie-Färbung visuali-

siert, M: Marker, 1: Hühnervolleipulver, 2: Magermilchpulver, 3: Hühnereiweißpulver, 4: Hühnereigelbpulver, 5: Sauermolkenpulver,6: Süß-

molkenpulver.


34/103

U. K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4,

Nature, 227, 680-685 1970.

N. Kongpien, Diskussion zur Entwicklung einer SDS-PAGE zur Trennung von Milch- u. Ei Proteinen in

selfmade Gelen, SOP-Nr. 2008-17, Praktikumsmethodensammlung Universität Hamburg, Hamburg,

2008.

R. Westermeier, Elektrophorese-Praktikum, VCH Verlag, Weinheim, 1990.

Merck Millipore, Chemikaliendatenbank, zu finden unter http://www.merckmillipore.com/DE/de,

Stand 03.06.2015.


H.-D Belitz, W. Grosch, P. Schieberle, Lehrbuch der Lebensmittelchemie, 5. Auflage, Springer Verlag,

Berlin, 2013.

2.4 Mono- und Oligosaccharide

2.4.1 Bestimmung der Wiederfindungsraten für reduzierende und nicht reduzierende Zu-

cker

Bevor die Hauptversuche (s. 2.4.2 und 2.4.3) mit der Probe durchgeführt werden, muss eine Wieder-

findungsrate (WFR) bestimmt werden. Dafür wird eine Lösung mit bekannter Glucosekonzentration

(c = 12,5 g/L) und eine Lösung mit bekannter Saccharosekonzentration (c = 12,5 g/L) angesetzt und wie

nachfolgend, als reduzierende Zucker (s. 2.4.2 Glucose) bzw. nicht reduzierende Zucker (s. 2.4.3 Sac-

charose), beschrieben analysiert. Anschließend werden die Wiederfindungsraten sowohl für reduzie-

rende Zucker als auch für nicht reduzierende Zucker mit folgender Gleichung berechnet und beim

Assistenten angesagt.

WFR = GehaltIst

GehaltSoll ∙ 100 % (6)



WFR [%] Wiederfindungsrate

GehaltIst [g/L] praktisch ermittelte Konzentration an Glucose

GehaltSoll [g/L] tatsächliche Konzentration an Glucose


35/103

2.4.2 Bestimmung reduzierender Zucker nach LUFF-SCHOORL

Grundlagen

Mit dieser reduktometrischen Methode werden alle reduzierenden Zucker in Summe erfasst. Die in-

tramolekularen Halbacetale werden in alkalischer Lösung gespalten, was zu einer Freisetzung der re-

duzierenden Aldehydgruppen führt. Gleichzeitig finden Epimerisierungen der Zucker (über ihre Endi-

olformen) statt, wobei durch Kettenbruch an der Doppelbindung kurzkettige Hydroxyaldehyde und -

ketone gebildet werden. Die genannten Verbindungen werden in der Siedehitze mit überschüssigen

Kupfer(II)-Ionen oxidiert, die dabei selbst zu Kupfer(I) reduziert werden. Dabei fällt Cu2O aus, während

Cu2+ durch Citrat komplexiert in Lösung gehalten wird. Die Umsetzung erfolgt nicht stöchiometrisch.

Daher müssen die Reaktionsbedingungen genau eingehalten werden. Es handelt sich hierbei um eine

Konventionsmethode.

Die nicht verbrauchten Kupfer(II)-Ionen oxidieren überschüssiges Kaliumiodid zu Iod, das mit Natri-

umthiosulfat titriert wird. Nach Berücksichtigung eines Blindwertes kann aus dem Verbrauch an Thi-

osulfat der Gehalt an reduzierenden Zuckern anhand einer Tabelle ermittelt werden. Proteine und

Aminosäuren müssen vorher durch Klärung entfernt werden, da sie die Fällung von Cu2O beeinflus-

sen.

Geräte

300-mL-Erlenmeyerkolben

Rückflusskühler

Stoppuhr

Chemikalien

Schwefelsäure, 25 % (w/v)

Glucose

Saccharose

Kaliumiodid

Stärke-Lösung, 1 % (w/v), frisch angesetzt

Natriumthiosulfat-Maßlösung, c = 0,1 mol/L

CARREZ-Lösung I: 15 g K4[Fe(CN)6] • 3H20 in 100 mL dest. Wasser lösen

CARREZ-Lösung II: 30 g ZnSO4 • 7H20 in 100 mL dest. Wasser lösen


36/103

LUFF‘sche Lösung: 50 g Citronensäure in 50 mL lauwarmem dest. Wasser lösen, 143,7 g Na2CO3 (was-

serfrei) in 350 mL lauwarmem dest. Wasser. Nach Abkühlen beide Lösungen vorsichtig in 1-L-Messkol-

ben mischen. 25 g CuSO4 • 5 H20 in 100 mL dest. Wasser vorlösen, in den Messkolben geben und mit

dest. Wasser auffüllen. Die Lösung durch einen Faltenfilter in eine Braunglasflasche filtrieren. Die Lö-

sung ist filtriert unbegrenzt haltbar.

Durchführung

Probe: Zucker-Alkohol-Lösung (wird vom Assistenten nach der Bestimmung der WFR ausgegeben)

Probenvorbereitung: Klärung nach CARREZ zur quantitativen Abtrennung der Proteine

10 mL der Probe werden (je nach Zuckergehalt) in einen 100-, 200- oder 250-mL-Messkolben pipettiert

und mit ca. 50 mL dest. Wasser versetzt. Nach Zugabe von 2 mL CARREZ-Lösung I und kräftigem Schüt-

teln werden 2 mL CARREZ-Lösung II zugegeben und erneut gut geschüttelt. Der Messkolben wird mit

dest. Wasser aufgefüllt und nach 10 min Stehenlassen bei Raumtemperatur filtriert.

Oxidation der reduzierenden Zucker mit Kupfer(II)-Ionen

Die zur Bestimmung eingesetzte Probenlösung sollte nicht mehr als 50 mg reduzierende Zucker (als

Glucose) in 25 mL enthalten, ansonsten ist entsprechend zu verdünnen.

25,0 mL LUFF‘sche Lösung und 25,0 mL des evtl. verdünnten Probenfiltrats werden in einen 300-mL-

Erlenmeyerkolben pipettiert, mit Siedesteinchen versetzt und sofort auf einem Drahtnetz über der

Bunsenbrennerflamme unter Rückfluss in 2 min zum Sieden erhitzt. Nach genau 10 min Sieden

(Stoppuhr!) wird sofort mit kaltem Wasser abgekühlt.

Sollte die über dem rotbraunen Niederschlag von Kupfer(I)-Oxid stehende Lösung keine hellblaue Fär-

bung aufweisen, so ist der Überschuss an Kupfer(II)-Ionen verbraucht. Der Ansatz ist dann mit einer

entsprechend verdünnten Lösung zu wiederholen.

Iodometrische Titration des Kupfer(II)-Überschusses

Der erkalteten, oxidierten Probenlösung werden 3 g Kaliumiodid und unter vorsichtigem Umschwen-

ken 25 mL Schwefelsäure 25 % (w/v) zugegeben (schäumt!). Nach Zugabe von 1 mL Stärkelösung wird

mit Natriumthiosulfat-Maßlösung (0,1 mol/L) bis zum Verschwinden der Blaufärbung titriert.


37/103

Blindversuch

Der Blindversuch wird wie oben beschrieben durchgeführt. Statt der Probenlösung werden

25 mL dest. Wasser eingesetzt.

Die diesem Verbrauch entsprechende Menge an reduzierenden Zuckern im Probenansatz wird an-

hand einer Tabelle (siehe ASU nach § 64 LFGB, Nr. L 31.00-11) mittels Interpolation abgelesen. Unter

Berücksichtigung der Verdünnungen und des Probenvolumens kann der Gehalt an direkt reduzieren-

den Zuckern in der Probe cV berechnet werden. Die Angabe des Ergebnisses erfolgt in g/L Probe (bei

festen Proben in %), unter Beachtung der signifikanten Stellen.

Anmerkungen

Bei Verbräuchen unter 5 mL oder über 20 mL an Natriumthiosulfat-Maßlösung muss die Verdünnung

angepasst werden.

Literatur






2.4.3 Bestimmung der nicht reduzierenden Zucker (Saccharose) nach LUFF-SCHOORL

Grundlagen

Bei nichtreduzierenden Zuckern sind alle latenten Carbonylfunktionen blockiert (Vollacetale). Sie sind

in alkalischer Lösung stabil und müssen zunächst mit Salzsäure hydrolysiert werden. Saccharose hyd-

rolysiert (ebenso wie andere Fructofuranoside) schneller als die meisten in der Natur vorkommenden

Di- und Oligosaccharide. Bei exakter Einhaltung der Reaktionsbedingungen ist die Hydrolyse von

Dextrinen daher noch vernachlässigbar. Da bei der Hydrolyse von rechtsdrehender Saccharose Glu-

cose und Fructose entstehen, die die Ebene linear polarisierten Lichtes nach links drehen, nennt man

diesen Vorgang Inversion.


38/103

Die freigesetzten Zucker werden gemeinsam mit den in der Probe zusätzlich vorhandenen reduzie-

renden Zuckern reduktometrisch bestimmt. Aus der Differenz der Bestimmung des Zuckergehaltes

„nach der Inversion” und „vor der Inversion” lässt sich der Gehalt an Saccharose berechnen.

Geräte zusätzlich zu 2.4.2:

Wasserbad mit Thermometer

Chemikalien zusätzlich zu 2.4.2:

Salzsäure, 32 % (w/v)

Essigsäure, mind. 96 % (v/v)

Kaliumhydroxid-Lösung, 30 % (w/v)

Phenolphthalein-Lösung: 0,1 % (w/v) in Ethanol

Durchführung

Probenvorbereitung: Klärung nach CARREZ (s. 2.4.2)

Hydrolyse der Saccharose (Inversion)

25,0 mL der geklärten Probenlösung werden in einen 100-mL- oder 200-mL-Messkolben (je nach Zu-

ckergehalt) pipettiert und mit dest. Wasser auf 75 mL verdünnt. Nach Zugabe von 5 mL HCl 32 % (w/v)

wird der Kolben im Wasserbad in maximal 5 min auf 67 – 70 °C gebracht (Temperaturkontrolle durch

Thermometer im Messkolben). Die Inversionslösung wird genau 5 min bei 67 – 70 °C gehalten. Der

Kolben muss dabei häufig umgeschwenkt werden. Nach der Inversion wird sofort auf 20 °C abge-

kühlt, das Thermometer abgespült und die Inversionslösung mit Kaliumhydroxidlösung 30 % (w/v)

gegen 1 Tropfen (ca. 25 μL) Phenolphthalein-Lösung neutralisiert. Anschließend wird sofort mit weni-

gen Tropfen Eisessig versetzt, bis die Färbung wieder verschwunden ist (Volumen notieren), und mit

dest. Wasser aufgefüllt.

Hauptversuch nach der Inversion

25,0 mL der invertierten und entsprechend verdünnten Lösung werden wie unter 2.4.2 beschrieben

für die reduktometrische Bestimmung der Zucker eingesetzt.


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Blindversuch

Es kann der Verbrauch an Natriumthiosulfat-Maßlösung b aus 2.4.2 herangezogen werden.

Auswertung

Die Auswertung erfolgt wie unter 2.4.2. Die Summe aus direkt reduzierenden und nach Inversion re-

duzierenden Zuckern cN kann so bestimmt werden. Aus der Differenz der gesamtreduzierenden und

der direkt reduzierenden Zucker ergibt sich der Saccharosegehalt der Probe cS nach folgender

Berechnung:

cS = (cN − cV) ∙ 0,95 (7)



cS [g/L] Saccharosegehalt

cN [g/L] Gehalt an reduzierenden Zuckern nach der Inversion

cV [g/L] Gehalt an reduzierenden Zuckern vor der Inversion

0,95 Faktor zur Berücksichtigung des freigesetzten Wasers bei der Konden-

ation von Glucose und Fructose zu Saccharose

Die Angabe des Ergebnisses erfolgt in g/L Probe (bei festen Proben in %), unter Berücksichtigung der

signifikanten Stellen.

Literatur







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2.5 Polarimetrische Bestimmung des Stärkegehaltes in Lebensmitteln

Grundlagen

Da die optisch aktive Stärke eine Ablenkung linear polarisierter Lichtstrahlen bewirkt, stellt die Pola-

rimetrie eine einfache Methode der Stärkebestimmung dar, die für die meisten Lebensmittel hinrei-

chend genau ist. Die häufig als Begleitstoffe auftretenden Hemicellulosen sind dagegen kaum optisch

aktiv, andere optisch aktive Substanzen (z. B. Mono- und Oligosaccharide) können leicht abgetrennt

werden.

Für den Hauptversuch wird die Stärke in Salzsäure gelöst, wobei auf strikte Einhaltung der Reaktions-

bedingungen geachtet werden muss, da die Stärke sonst leicht hydrolysiert. Für den Blindversuch

wird die Stärke aus dem Probenansatz entfernt, um den Drehwert der übrigen optisch aktiven Probe-

ninhaltsstoffe zu bestimmen. Zur Entfernung löslicher (d.i. Stärke, die z. B. durch Sulfatieren oder Car-

boylieren etc. chemisch modifiziert ist) und verkleisterter Stärke (Stärke nach dem Anteigen mit Kle-

berproteinen) ist hierfür eine Fällung mit Tannin/Bleiessig erforderlich.

Geräte

Polarimeter mit 10 cm- bzw. 20 cm-Polarimeterrohr

Wasserbad

Stoppuhr

Thermometer

Chemikalien

Salzsäure, 25 % (w/v)

Salzsäure, c = 0,31 mol/L: 40 mL Salzsäure 25 % (w/v) mit dest. Wasser auf 1000 mL auffüllen

CARREZ-Lösung I: 15 g K4[Fe(CN)6] • 3H20 in 100 mL dest. Wasser lösen

CARREZ-Lösung II: 30 g ZnSO4 • 7H20 in 100 mL dest. Wasser lösen

bei Anwesenheit löslicher Stärke:

Tanninlösung, 10 % (g/v) in dest. Wasser

gesättigte Natriumsulfatlösung (ca. 45 g Na2SO4 • 10H2O/100 mL dest. Wasser)

Bleiessig-Lösung: 30,0 g Pb(CH3COO)2 • 3H2O und 10,0 g PbO mit 10 g dest. Wasser verreiben und so-

lange auf dem Wasserbad erhitzen, bis die Mischung weiß bis rötlich weiß geworden ist. Dann unter

Umrühren 190 mL dest. Wasser hinzufügen und filtrieren.


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Durchführung

Probe: Mehl (vom Assistenten ausgegeben)

Es kann auch eine andere Einwaage als die genannten 2,5 g gewählt werden, es ist nur darauf zu ach-

ten, dass sie für den Blindwert exakt doppelt so hoch ist wie für den Hauptversuch.

Hauptversuch

2,5 g Probe werden genau in einen 100-mL-Messkolben eingewogen, mit 25 mL Salzsäure (0,31 mol/L)

versetzt und gut geschüttelt. Anschließend werden weitere 25 mL Salzsäure (0,31 mol/L) zugegeben.

Der Messkolben wird im siedenden Wasserbad unter häufigem Umschwenken erhitzt, wobei wäh-

rend der ersten 3 min ununterbrochen geschüttelt werden muss, um Klumpenbildung zu vermeiden.

Nach genau 15 min (Stoppuhr) Gesamterhitzungszeit werden sofort 30 mL möglichst kaltes dest.

Wasser zugegeben und unter fließendem Wasser auf Raumtemperatur abgekühlt.

Zur Klärung der Lösung werden nacheinander je 1 mL CARREZ-Lösung I und II unter Umschütteln zuge-

geben, der Messkolben mit dest. Wasser aufgefüllt, die Lösung homogenisiert und durch einen tro-

ckenen Faltenfilter filtriert.

Blindversuch für Proben ohne verkleisterte oder lösliche Stärke (z. B. Mehle)

5 g Probe werden genau in einen 100-mL-Messkolben eingewogen, mit 70 – 75 mL dest. Wasser ver-

setzt und 15 min lang durch Rühren auf dem Magnetrührer ausgelaugt. Nach Entfernen des Rührmag-

neten werden nacheinander je 2 mL CARREZ-Lösung I und II unter Umschütteln zugegeben, der Kolben

aufgefüllt und die Lösung durch einen trockenen Faltenfilter filtriert. Das Filtrat muss auf Stärkefrei-

heit geprüft werden (Iodreaktion: rotbraun, nicht tiefblau). Bei positivem Stärkenachweis muss die

Probe mit Tannin/Bleiessig behandelt werden (s. Blindversuch für Proben mit verkleisterter oder lös-

licher Stärke).

50 mL des Filtrats werden in einen 100-mL-Messkolben pipettiert, mit 2 mL Salzsäure 25 % (w/v) ver-

setzt und im siedenden Wasserbad unter Umschwenken genau 15 min (Stoppuhr) erhitzt, anschlie-

ßend abgekühlt und aufgefüllt.

Blindversuch für Proben mit verkleisterter oder löslicher Stärke (z. B. Backwaren)

5 g Probe werden genau in einen 100-mL-Messkolben eingewogen, mit 70 – 75 mL dest. Wasser ver-

setzt und 1 h durch Rühren auf dem Magnetrührer ausgelaugt. Nach Entfernen des Rührmagneten

werden nacheinander je 5 mL Tannin- und 5 mL Bleiessig-Lösung unter Umschütteln zugesetzt. Der


42/103

Messkolben wird mit gesättigter Natriumsulfatlösung aufgefüllt (um das Pb als PbSO4 zu fällen), um-

geschüttelt und durch einen trockenen Faltenfilter filtriert. Das Filtrat muss auf Stärkefreiheit geprüft

werden (Iodreaktion: rotbraun, nicht tiefblau). Bei positivem Stärkenachweis muss die Stärkefällung

mit einer größeren Menge Tannin/Bleiessig wiederholt werden.

50 mL des stärkefreien Filtrats werden in einen 100-mL-Messkolben pipettiert, mit 2 mL Salzsäure

25 % (w/v) versetzt und im siedenden Wasserbad unter Umschwenken genau 15 min (Stoppuhr) er-

hitzt, nach dem Abkühlen mit je 1 mL CARREZ-Lösung I und II versetzt (unter Schütteln), mit dest. Was-

ser aufgefüllt und filtriert.

Polarimetrische Messung

Die Filtrate aus dem Haupt- und dem Blindversuch werden luftblasenfrei (!) in das Polarimeterrohr

gefüllt und die Drehwinkel am Polarimeter jeweils fünfmal abgelesen, nach jedem Ablesen wird der

Drehwinkel zurückgesetzt (arithmetischer Mittelwert).

Das Ergebnis wird unter Berücksichtigung der signifikanten Stellen angegeben.

Anmerkungen

Nach der § 64 Methode (s.u.) betragen die stärkespezifischen Drehwinkel ()D bei den angegebenen

Reaktionsbedingungen für

Weizenstärke 182,7°

Roggenstärke: 184,0°

Reisstärke: 185,9°

Kartoffelstärke: 185,7°

Gerstenstärke 181,5°

Haferstärke 181,3°

andere: 184,0°

Berechnung:

Es wird empfohlen, die Berechnung aus der § 64 Methode zu übernehmen. Um festzulegen mit wel-

chem spezifischen Drehwinkel die Berechnung erfolgt, muss das Mehl mikroskopisch anhand des

Stärkemusters identifiziert werden.

Anmerkung: Fetthaltige Proben sind vor der Untersuchung zu entfetten.


43/103

Literatur



R. Brieger, O. Dalmer, F. Frgr. v. Falkenhausen, Spezielle Analyse: Erster Teil Anorganische Stoffe Orga-

nische Stoffe I, Springer Verlag, Berlin, 2013.





J. Schormüller (Hrsg.), Handbuch der Lebensmittelchemie, Bd. II/2, S. 443, Springer-Verlag, Berlin, 1967.


44/103

3 Mineralstoffe, Zusatzstoffe und Wasseranalyse

3.1 Bestimmung der Gesamtasche

Grundlagen

Der Begriff Asche bzw. Glührückstand bezeichnet den Rückstand, der bei der vollständigen Verbren-

nung (Veraschung) der organischen Bestandteile eines Lebensmittels unter festgelegten Bedingun-

gen entsteht. Nach Abzug etwaiger Verunreinigungen und Kohlepartikel aus unvollständiger Ver-

brennung korreliert dieser Rückstand mit dem Mineralstoffgehalt des Lebensmittels.

Geräte

Trockenschrank

Muffelofen

Exsikkator

Quarzschalen

Wasserbad

aschefreie Papierfilter

Chemikalien

Wasserstoffperoxid-Lösung 30 % (v/v)

Durchführung

Probe: Wurst, evtl. nach Absprache anderes Lebensmittel (wird vom Assistenten ausgegeben)

Zwei Quarzschalen (min. Doppelbestimmung!) werden zunächst über dem Bunsenbrenner geglüht,

an der Luft vorgekühlt, dann zum endgültigen Abkühlen in einen Exsikkator gestellt und anschlie-

ßend gewogen. Die Einwaage der Probe richtet sich nach der zu erwartenden Aschemenge: Diese

sollte maximal 0,5 g an Auswaage betragen.

Zur Trocknung des Probenmaterials werden die Quarzschalen in einen Trockenschrank (ca. 120 °C)

gestellt und danach mit Hilfe eines Bunsenbrenners vorsichtig weitgehend verkohlt. Viskose, stark

schäumende Proben werden erst völlig entwässert und können dann gefahrlos verkohlt und verascht

werden. Ein Verspritzen bei Proben mit hohem Salzgehalt kann durch Bedecken der möglichst ge-

trockneten Probe mit einem Rundfilter verhindern werden, bevor geglüht wird. Anschließend wird

die Kohle im Muffelofen bei 500 °C (bis 550 °C) verglüht. Bestenfalls wird die Probe schon beim Auf-


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heizen in den Muffelofen gestellt. Nach zwei Stunden wird die abgekühlte Asche vorsichtig tropfen-

weise mit Wasserstoffperoxid 30 % (v/v) durchfeuchtet (Pasteurpipette!, unterm Abzug) und bis zum

kohlefreien Rückstand weiter verascht.

Die Wasserstoffperoxid-Behandlung kann wiederholt werden (gelegentlich wird es notwendig, zur

vollständigen Beseitigung der Kohle einen wässrigen Auszug herzustellen und den Filterrückstand

weiter zu veraschen). Der Ascherückstand kann nunmehr nach Auskühlen im Exsikkator ausgewogen

werden und dient zur Angabe des Aschegehaltes.

Anmerkungen

Viele Aschen, besonders magnesiumreiche, sind sehr hygroskopisch. Sie müssen daher, wenn sie

nicht unmittelbar weiterverarbeitet werden, vor einer analytischen Einwaage erneut geglüht werden.

3.2 Bestimmung von Anionen

Grundlagen

Zweckmäßigerweise erfolgt die Bestimmung von Anionen in komplexen Matrices nach Veraschung.

Da Anionen wie Phosphat oder Chlorid ohne ausreichende Mengen an Gegenionen bei der Trocken-

veraschung nicht quantitativ im Glührückstand verbleiben, muss zu ihrer Bindung Magnesiu-

macetat-Lösung vor der Veraschung hinzugefügt werden. Dieses Veraschungshilfsmittel dient einer-

seits zur Bindung der Anionen an Magnesium und andererseits der Oberflächenvergrößerung durch

Freisetzung von Kohlendioxid.

Chemikalien

Magnesiumacetat-Lösung: 50 g MgO in überschüssiger Essigsäure lösen, mit dest. Wasser ad 1 L auf-

füllen und filtrieren.

Wasserstoffperoxid-Lösung 30 % (v/v)

verd. Salpetersäure: Salpetersäure 65 % (w/v)/dest. Wasser (1:2, v/v)


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Durchführung

Probe: Wurst, evtl. nach Absprache anderes Lebensmittel (wird vom Assistenten ausgegeben)

Zwei Quarzschalen (min. Doppelbestimmung!) werden zunächst über dem Bunsenbrenner geglüht,

an der Luft vorgekühlt, dann zum endgültigen Abkühlen in einen Exsikkator gestellt und anschlie-

ßend gewogen. Die Einwaage der Probe richtet sich nach der zu erwartenden Aschemenge: Diese

sollte maximal 0,5 g an Auswaage betragen.

Nach dem Trocknen des Analysenmaterials bei 120 °C im Trockenschrank wird das Trockengut mit

5 mL Magnesiumacetat-Lösung durchtränkt (bei halbfesten, breiigen Proben werden die 5 mL Mag-

nesiumacetat-Lösung besser vor der Trocknung hinzugesetzt). Zur weiteren Veraschung wird analog

zur Herstellung der Gesamtasche verfahren, wobei allerdings eine Veraschungstemperatur von

500 °C nicht überschritten werden darf.

Die Asche wird hier in 20 mL verdünnter Salpetersäure gelöst und die saure Lösung 1 – 2 h auf dem

Wasserbad zur Abscheidung der Kieselsäure digeriert, dann heiß in einen 50-mL-Messkolben filtriert.

Nach gründlichem Nachwaschen mit heißem dest. Wasser wird der abgekühlte Messkolben aufge-

füllt. Aus dieser Lösung (= Grundlösung) erfolgt die Bestimmung der Anionen (s. Versuch 3.2.1). Der

Filtrierrückstand wird verworfen.

Literatur




3.2.1 Bestimmung von Chlorid (argentometrisch)

Grundlagen

Das in der Probe vorhandene Chlorid wird argentometrisch titriert. Der Titrationsendpunkt wird mit-

tels einer Silber/Silberchlorid-Einstabmesskette potentiometrisch indiziert.

Geräte

Silber/-Silberchlorid-Einstabmesskette

Magnetrührstäbchen


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Chemikalien

Silbernitrat-Maßlösung, 0,01 N

Salpetersäure, 2 N

Natriumchlorid-Eichlösung zur Titerbestimmung der Silbernitratlösung, 0,01 N (Vor der Einwaage

Glühen des Natriumchlorids bei 500 °C bis zur Massenkonstanz)

Durchführung

Die Chloridbestimmung erfolgt sowohl aus der Grundlösung (s. Versuch 3.2) als auch aus einem wäss-

rigen Auszug. Für den wässrigen Auszug werden ca. 10 g Wurst in einem Erlenmeyerkolben genau

eingewogen, mit 100 mL heißem Wasser versetzt und 15 Minuten auf dem siedenden Wasserbad er-

hitzt. Anschließend wird durch ein angefeuchtetes Faltenfilter in einen 200-mL-Messkolben filtriert;

Erlenmeyerkolben und Filter werden mehrfach mit heißem Wasser nachgespült.

Zur Titration wird ein Aliquot der Grundlösung bzw. des wässrigen Auszuges eingesetzt, mit 2 mL

Salpetersäure angesäuert und mit so viel destilliertem Wasser versetzt, dass das Diaphragma der Sil-

ber/Silberchlorid-Einstabmesskette vollständig in die Lösung taucht. Es wird mit Silbernitratlösung

bis zum Endpunkt titriert. Der Titer der Silbernitrat-Maßlösung wird auf gleiche Weise bestimmt.

Anmerkungen

Silberhaltige Abfälle (sauer!) werden in einem separaten Kanister gesammelt.

Es erfolgt eine Einweisung am Gerät.

Literatur

Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren § 64 LFGB: Nr. L 03.00-11 bzw. L 03.42-4.

Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren § 64 LFGB: Nr. L 26.11.03-2.

Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren § 64 LFGB: Nr. L 13.05-4 bzw. L 13.06-4.

Maier H.G., Lebensmittel- und Umweltanalytik, Steinkopff Verlag, Darmstadt, 1990.


48/103

3.2.2 Bestimmung von Nitrit nach LUNGE (VIS-Photometrie)

Grundlagen

Nitrit-Ionen bilden in saurer Lösung Nitrosyl-Kationen, deren Reaktion mit primären aromatischen

Aminen unter Bildung eines Diazoniumsalzes verläuft. Durch Hinzugabe von α-Naphthylamin ent-

steht über eine Azo-Kupplung ein rotvioletter Farbkomplex, der photometrisch bei 540 nm gemessen

werden kann.

Geräte

Spektralphotometer

Glasküvetten (1 cm)

Schliffstopfenreagenzgläser

Chemikalien

LUNGE-I: 2 g Sulfanilsäure in einen 250-mL-Messkolben einwiegen und in 150 mL dest. Wasser lösen.

Nach der Zugabe von 15 mL Eisessig wird der Kolben mit dest. Wasser aufgefüllt.

LUNGE-II: 0,25 g -Naphthylamin in einen 250-mL-Messkolben einwiegen, in 150 mL dest. Wasser lö-

sen. Nach der Zugabe von 10 mL Eisessig 96 % (v/v) wird mit dest. Wasser aufgefüllt. Die Lösung wird

in einer braunen Glasflasche nicht länger als eine Woche im Kühlschrank aufbewahrt.

LUNGES-Reagenz: Mischung aus LUNGE-I und LUNGE-II (1/1, v/v,vor jeder Bestimmung frisch herstellen!)

Kaliumnitrit-Stammlösung: Größenordnung der KNO2-Konzentration ca. 200 mg ad 50 mL mit dest.

Wasser (genaue Konzentration festhalten)

Kaliumnitrit-Standardlösung: 1:100-Verdünnung aus der Stammlösung

Durchführung

Probe: Trinkwasser (Lösen der Salzmischung, die vom Assistenten ausgegeben wird, in 1 L dest. Was-

ser – Achtung nicht überfüllen, es wird keine neue Probe ausgegeben!)

Aus der Kaliumnitrit-Standardlösung werden fünf Kalibrierlösungen in 100-mL-Messkolben herge-

stellt. Dabei ist darauf zu achten, dass die Extinktionen der Kalibrierlösungen im Bereich 0,1 < E < 1,0

liegen. Jeweils 10 mL der Kalibrierlösungen, der verdünnten Probenlösungen (1:100, v/v) sowie der

Blindwerte (dest. Wasser) werden in ein Schliffstopfenreagenzglas gegeben und mit 10 mL LUNGES-


49/103

Reagenz versetzt. Die Ansätze werden für 30 min im Dunkeln stehen gelassen und anschließend bei

einer Wellenlänge von λ = 540 nm gemessen.

Auswertung

Mit den fünf Messwerten aus den Nitrit-Kalibrierlösungen wird die Kalibrierfunktion mit Hilfe der

linearen Regression ermittelt. Der Nitrit-Gehalt der Trinkwasserprobe in mg/L angegeben (Berück-

sichtigung der signifikanten Stellen).

Anmerkungen

Die Reaktion von Sulfanilsäure und -Naphthylamin mit Nitriten ist sehr empfindlich. Die in der Luft

enthaltenen Stickoxide reichen aus, um die Reagenz-Lösung innerhalb weniger Tage rot bis rotviolett

zu färben und damit unbrauchbar zu machen. Aus diesem Grund sollte die Lösung vor Analysenbe-

ginn stets frisch hergestellt werden.

Literatur

Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB Nr. L-37.00-12.


R. Freier, Wasseranalyse - Chemische, physioko-chemische und radiochemische Unterschungs-ver-

fahren wichtiger Inhaltsstoffe, 2. Auflage, Walter de Gruyter Verlag, Berlin, 1974.

3.2.3 Bestimmung von Nitrat als Nitronatriumsalicylat-Komplex

Grundlagen

Nitrat bildet in schwefelsaurer Lösung Salpetersäure, die auf Salicylsäure nitrierend wirkt. Die gebil-

dete Nitrosalicylsäure reagiert im Basischen unter Bildung eines Nitronatriumsalicylats, das bei einer

Wellenlänge von 420 nm photometrisch vermessen werden kann.

Geräte

Spektralphotometer

Glasküvetten (1 cm)


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Chemikalien

Kaliumnitrat-Stammlösung: Größenordnung der KNO3-Konzentration ca. 200 mg KNO3 ad 1 L mit

dest. Wasser (genaue Konzentration festhalten)

Natronlauge 30 % (w/v) in dest. Wasser

Natriumsalicylat-Lösung 0,5 % (w/v) in dest. Wasser, täglich frisch ansetzen!

Schwefelsäure 96 % (w/v)

Durchführung



Aus der Kaliumnitrat-Stammlösung werden fünf Kalibrierlösungen in 100-mL-Messkolben herge-

stellt. Dabei ist darauf zu achten, dass die Extinktionen der Kalibrierlösungen im Bereich 0,1 < E < 1,0

liegen. In einem Becherglas werden jeweils 10 mL der Kalibrierlösung, der Probenlösung (ggf. vorher

verdünnen!) sowie des Blindwertes (dest. Wasser!) vorgelegt und mit Natronlauge auf einen schwach

basischen pH-Wert (Überprüfung mit pH-Papier) eingestellt. Nach der Zugabe von 1 mL Natriumsa-

licylat-Lösung wird die Lösung auf dem Sandbad bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand in

1 mL konz. Schwefelsäure aufgenommen. Anschließend wird die Lösung vorsichtig mit 6 mL dest.

Wasser verdünnt. Nach der Zugabe von 10 mL Natronlauge wird die Lösung quantitativ in einen

100 mL-Messkolben überführt und mit dest. Wasser aufgefüllt. Die Extinktion aller Messlösungen

wird bei 420 nm bestimmt.

Literatur

R. Freier, Wasseranalyse - Chemische, physioko-chemische und radiochemische Unterschungs-ver-

fahren wichtiger Inhaltsstoffe, 2. Auflage, Walter de Gruyter Verlag, Berlin, 1974.

R. Pohling, Chemische Reaktionen in der Wasseranalyse, 1. Auflage, Springer Spektrum, Springer-Verlag

Berlin Heidelberg, 2015.


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3.3 Chinin in Tonic-Wässern (fluorimetrisch)

Grundlagen

Fluorimetrie

Eine Reihe von Molekülen – in der Regel mit einem ausgeprägtem -Elektronensystem – kann durch

Photonen ganz bestimmter Energie zur Emission von Strahlung angeregt werden. Die Anregungs-

strahlung vermag die Elektronen im Molekül vom Grundzustand in den angeregten Zustand zu he-

ben. Beim Zurückkehren in den Grundzustand wird die Energiedifferenz zwischen dem angeregten

und dem Grundzustand in Form von Lichtenergie abgegeben. Die emittierte Strahlung ist dabei im-

mer langwelliger (energieärmer) als die absorbierte Strahlung (STOKE’sche Wellenlängenverschie-

bung), da ein Teil der Energie durch Kollision, Schwingung etc. „verloren geht“. Gemessen wird die

Emissionsintensität, nicht das Verhältnis I/I0 wie bei absorptionsspektrometrischen Verfahren. Die

Fluoreszenz-Intensität ist direkt proportional der Konzentration. Die Fluorimetrie benötigt eine stär-

kere Anregungsenergie als z. B. die UV-Spektrometrie. Es werden z.B. Hg-Dampfentladelampen oder

Xe-Hochdrucklampen verwendet.

Standardaddition

Um Fehler bei der Messung wie z. B. durch Fremdstoffquenching zu verhindern, findet bei der Fluori-

metrie häufig die Methode der Standardaddition Anwendung:

Zur Durchführung wird die Probe in fünf Aliquote geteilt. Vier dieser Probenanteile wird ein definier-

tes Volumen einer Kalibrierlösung unterschiedlicher Konzentration des zu bestimmenden Stoffes

hinzugesetzt. Dem fünften Teil wird das gleiche Volumen an dest. Wasser zugesetzt. Nach dem

Durchmischen haben alle Teile exakt die gleiche Matrixzusammensetzung. Darüber hinaus wird ein

Reagenzienblindwert erstellt und die Fluoreszenzintensität dieses Blindwertes von allen Messwerten

abgezogen. Zur Auswertung wird die gemessene und gegebenenfalls korrigierte Fluoreszenzintensi-

tät gegen die zugesetzte Konzentration des zu bestimmenden Stoffes aufgetragen.

Es ergibt sich eine Kalibriergerade, die nicht durch den Nullpunkt geht, sondern die Y-Achse in einem

Punkt größer Null schneidet (= Fluoreszenzintensität der Lösung ohne Standardaddition). Durch Ext-

rapolation der erhaltenen Kalibriergerade durch die Konzentrationsachse lässt sich der tatsächliche

Gehalt der Probe an dem zu bestimmenden Stoff ablesen.


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Geräte

Spektralfluorimeter (Einführung vom Assistenten)

1-cm-Fluoreszenzquarzküvette

Chemikalien

Chininsulfat Dihydrat

Schwefelsäure 96 % (w/v)

0,5 M Schwefelsäure-Lösung: 27 mL Schwefelsäure 96 % (w/v) werden mit dest. Wasser auf 1 L aufge-

füllt.

Chinin-Stammlösung: ca. 50 mg Dichininmonosulfat Dihydrat auf 0,1 mg genau einwiegen und in

100 mL 0,5 M Schwefelsäure lösen.

Chinin-Aufstocklösung: 3 mL der Chinin-Stammlösung mit 0,5 M Schwefelsäure auf 100 mL verdün-

nen. Die Konzentration der Lösung wird als freie Chininbase [mg/L] berechnet.

Durchführung

Probe: Chinin-Alkohol-Lösung (Tonic-Wasser – wird vom Assistenten ausgegeben)

Bestimmung des Emissions- und Anregungsmaximums

Aus der Aufstocklösung wird eine 1:100-Verdünnung hergestellt und ein Emissions- sowie Anregungs-

spektrum aufgenommen. Damit wird die maximale Anregungs- und Emissions-Wellenlänge ermit-

telt. Hierfür wird zunächst der Emissionsmonochromator am Fluorimeter auf null gestellt und das

Anregungsspektrum aufgenommen. Hieraus wird diejenige Wellenlänge ermittelt, die die stärkste

Anregung bewirkt (Anregungsmaximum). Anschließend wird mit dieser Wellenlänge ein Emissions-

spektrum aufgenommen und so das Emissionsmaximum ermittelt.

Standardaddition

Für die Standardaddition werden in fünf 100 mL Messkolben je 1 mL der ggf. verdünnten Probenlö-

sung vorgelegt. Die Probenlösung in den Messkolben zwei bis fünf wird vor dem Auffüllen mit 0,5 M

Schwefelsäure in aufsteigender Konzentration mit Chinin dotiert. Hierzu werden 1, 2, 3 und 4 mL der

Chinin-Standardlösung (Aufstocklösung) in die Messkolben –zwei bis fünf pipettiert. Die Lösung in

Messkolben eins bleibt undotiert.


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Tab. 6: Beispielhafte Konzentrationsreihe der Standardaddition.

Nr. Messkolben Menge Chinin-Standardlösung [mL] Dotierte freie Chininbase [mg/100 mL]

1 0 0,000

2 1 0,012

3 2 0,025

4 3 0,037

5 4 0,050

Probenvorbereitung

Bei kohlensäurehaltigen Proben ist es zunächst nötig, diese zu entgasen. Hierzu wird ein Teil der

Probe in einen Iodzahlkolben überführt und im Ultraschallbad entgast (anfangs starkes Schäumen!).

Von dieser Lösung wird je 1 mL in fünf 100-mL-Messkolben pipettiert. Zu den Kolben zwei bis fünf

wird je 1, 2, 3 und 4 mL der Aufstocklösung zu pipettiert. Die Messkolben werden mit 0,5 M Schwefel-

säure aufgefüllt und gut geschüttelt.

Messung

Die Messung erfolgt gegen die 0,5 M Schwefelsäurelösung. Hierzu wird eine Quarzküvette mit dieser

Lösung in das Gerät gestellt und die Anzeige auf null tariert. Anschließend werden die Probenlösung

und die aufgestockten Lösungen in aufsteigender Konzentration vermessen.

Auswertung

Die Auswertung erfolgt graphisch und durch lineare Regression:

So ergibt sich die Geradensteigung b, der y-Achsenabschnitt a und den Regressionskoeffizienten r.

Der Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der x-Achse entspricht dem Gehalt an freier Chininbase

in der verdünnten Probe in mg/100 mL. Anschließend erfolgt eine Rückrechnung bzw. der Bezug auf

das eingesetzte Probenvolumen und die Verdünnung. Das Ergebnis wird als Chinin (berechnet als

freie Chininbase) in mg/L angegeben (Berücksichtigung der sign. Stellen).


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Anmerkung

Vor der Inbetriebnahme und Messung erfolgt eine Einweisung am Gerät.

Das Fluoreszenzspektrum einer Substanz ist stark vom Lösungsmittel abhängig. Ein Problem bei der

Fluoreszenz ist das Quenching (Fluoreszenz-Löschung) wie z. B. Konzentrations- oder Fremdstoff-

quenching.

Literatur

A. Müller, Bestimmung von Chinin in Lebensmitteln, SOP Nr. 1998/17, Praktikumsmethoden-samm-

lung, Universität Hamburg, Abteilung für Lebensmittelchemie, 1998.

J. M. Nuijens, H. van der Velden, Rapid fluorimetric determination of quinine in softdrinks, Z. Lebensm.

Unters.-Forsch. 153, 97-98 1973.

AromV: Aromenverordnung (Artikel 22 d. Verordnung zur Neuordnung lebensmittelrechtlicher Kenn-

zeichnungsvorschriften) in der Fassung der Bekanntmachung vom 2. Mai 2006 (BGBl. I S. 1127), die

zuletzt durch Artikel 1 der Verordnung vom 29. September 2011 (BGBl. I S. 1996) geändert worden ist.

G. Schwedt, Fluorimetrische Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1981.

H. G. Maier, Lebensmittel- und Umweltanalytik, Methoden und Anwendungen, Steinkopff Verlag,

Darmstadt, 1990.

3.4 Pyknometrische Alkoholbestimmung

Grundlagen

Der Ethanolgehalt wird aus der Dichte bei 20 °C einer Alkohol-Wasser-Mischung oder eines Destilla-

tes ermittelt. Der Einfluss geringer Mengen eventuell vorhandener Begleitstoffe wie z. B. Methanol,

1-Propanol, 2-Propanol usw. bleibt unberücksichtigt. Sind größere Mengen (> 0,1 %) vorhanden, müs-

sen die Begleitstoffe ermittelt und bei der Berechnung des Ethanolgehaltes berücksichtigt werden.


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Geräte

Wasserbad mit Thermostat (20,0 °C ± 0,1 °C)

Pyknometer, Inhalt 50 cm3 nach REISCHAUER

Einfülltrichter für Pyknometer

Destillationsapparatur

Durchführung

Probe: Zucker-Alkohol-Lösung (vom Assistenten ausgegeben)

Bestimmung des Leerwertes (LW) des Pyknometers

Es ist min. eine Doppelbestimmung durchzuführen. Die Pyknometer werden zunächst gereinigt, äu-

ßerlich abgetrocknet und innerlich durch Ausblasen mit Luft oder Stickstoff getrocknet. Nachdem die

Pyknometer 30 min bei Raumtemperatur gestanden haben, werden sie verschlossen und leer gewo-

gen (= Leerwert).

Bestimmung des Wasserwertes (WW) des Pyknometers

Die Pyknometer werden mittels Einfülltrichter mit frisch ausgekochtem Wasser von ca. 20 °C bis über

die Marke aufgefüllt, verschlossen und 20 – 30 min bei 20 °C im Trockenschrank temperiert. Sie wer-

den dann aus dem Trockenschrank genommen, wobei nur der obere, leere Teil des Halses anzufassen

ist. Dann wird der untere Rand des Meniskus auf die Marke eingestellt und der Hals z.B. mit Filterpa-

pier von innen abgetrocknet. Die Pyknometer werden außen gut getrocknet dann gewogen (Wasser-

wert). Der Wasserwert wird dreimal bestimmt und der Mittelwert der drei Wägungen gebildet.

Aus Leergewicht und Wasserwert lässt sich das Volumen (V) der Pyknometer berechnen:

V = WW - LW

φW -φL (8)



V [m3] Volumen des Pyknometers

WW [kg] Wasserwert (Masse Pyknometer mit Wasser aufgefüllt)


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LW [kg] Leerwert (Leermasse des Pyknometers)

φW [kg/m3] Dichte reines Wasser bei 20 °C (hier 998,20 kg/m3)

φL [kg/m3] Dichte der Luft bei 20 °C (hier 1,2 kg/m3)

Bestimmung des Alkoholgehaltes

Die zu untersuchende Lösung wird mittels Einfülltrichter in die Pyknometer bis über die Marke ein-

gefüllt, verschlossen und 20 – 30 min bei 20 °C im Trockenschrank temperiert. Die Pyknometer wer-

den dann aus dem Trockenschrank genommen, wobei nur der obere, leere Teil des Halses anzufassen

ist. Dann wird der untere Rand des Meniskus auf die Marke eingestellt und man trocknet den Hals

von innen ab. Nun wird der Inhalt quantitativ in die Destillierkolben überführt und dreimal mit

5 – 10 mL dest. Wasser nachgespült. Nach Zusatz von Siedesteinen werden die Destillierkolben an die

Destillierapparatur angeschlossen. Als Vorlage dienen die Pyknometer mit Einfülltrichter.

Es wird langsam unter guter Kühlung destilliert bis die Pyknometer ungefähr bis zum Ansatz der Hals-

verjüngung gefüllt sind. Nun wird mit dest. Wasser bis kurz unter die Marke aufgefüllt und

20 – 30 min im Trockenschrank temperiert. Die Pyknometer werden dann aus dem Trockenschrank

genommen und mit temperiertem dest. Wasser auf die Marke eingestellt. Der Hals ist von innen ab-

zutrocknen. Die Pyknometer werden von außen gut getrocknet und dann gewogen. Die Destillation

und Wägung wird dreimal durchgeführt und der Mittelwert der drei Wägungen (WD) gebildet.

Hieraus lässt sich die Dichte des Destillates (φD) berechnen:

φD = WD - LW

V+ φL (9)



φD [kg/m3] Dichte der Probe

WD [kg] Mittelwert der Masse des Pyknometers mit Probendestillat

LW [kg] Leerwert (Leermasse des Pyknometers)

V [m3] Volumen des Pyknometers

φL [kg/m3] Dichte der Luft bei 20 °C


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Aufgrund der Dichte des Destillates lässt sich der Alkoholgehalt aus der „Amtlichen Alkoholtafel“ ent-

nehmen. Er ist auf eine Dezimale gerundet in Vol.-% anzugeben.

Anmerkungen

Pyknometer sind empfindliche Messinstrumente und erfordern eine pflegliche Behandlung. Sie sind

stets sorgfältig zu reinigen. Die Trocknung muss bei Zimmertemperatur erfolgen. Die Trocknung darf

nicht bei höheren Temperaturen (z. B. im Trockenschrank) erfolgen!

Literatur




3.5 Bestimmung der Kationen mit Atomemissions- und Atomabsorptions-

spektrometrie

Grundlagen

Jede Materie absorbiert nur Licht der Wellenlängen, die sie auch emittieren kann (KIRCHHOFF´sches

Gesetz).

Gerät

Kombiniertes Atomabsorptionsspektrometer bzw. Atomemissionsspektrometrie

(Einführung vom Assistenten)

Probenvorbereitung



Wird ein klares Wasser untersucht, so kann es direkt bzw. verdünnt eingesetzt werden. Trübe Wässer

oder andere Proben müssen vor der Bestimmung der Kationen mineralisiert werden. Die gewonnene

Asche (siehe 3.1) wird dazu mit konz. Salzsäure abgeraucht und mit 10 mL verdünnter Salzsäure auf-


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genommen. Digerieren auf dem siedenden Wasserbad (etwa 20 min) fördert das vollständige Ab-

scheiden der Kieselsäure. Daraufhin wird die noch heiße Lösung durch ein aschefreies Filterpapier

filtriert und der Filter mit heißem dest. Wasser ausgewaschen. Das Filtrat kann anschließend nach

Abkühlung auf Raumtemperatur für die Kationenbestimmung verwendet werden.

3.5.1 Flammenatomemissionsspektrometrische Bestimmung von Natrium und Kalium

Grundlagen

Bei der Flammenatomemissionsspektrometrie (FAES) wird das Emissionsspektrum von angeregten

Atomen gemessen. Werden Atome thermisch oder elektrisch angeregt, so senden diese aufgenom-

mene Energie in Form eines Emissionsspektrums aus, durch die Verwendung eines Monochromators

wird nur das Licht einer bestimmten Wellenlänge gemessen.

Die Probelösung wird z.B. in einer Flamme verdampft und die Salze dissoziieren zu einem geringen

Teil in die Atome. Durch die Flamme werden ein Teil dieser Atome bzw. ihre Valenzelektronen ange-

regt und beim Zurückfallen auf das ursprüngliche Energieniveau wird Licht emittiert. Diese Strah-

lungsenergie wird mittels eines Photomultipliers gemessen und über eine Kalibriergerade der Gehalt

des zu analysierenden Metalls in der Probe bestimmt. Die Ionisation von Proben und Kalibrierstan-

dards wird durch Zugabe von Lithiumsalzen zurückgedrängt, da diese sehr leicht in die Ionen zerfallen

und durch den damit verbundenen Elektronen-„Überschuss“ das Ionisationsgleichgewicht des zu be-

stimmenden Elementes zum „Atom“ hin verschieben.

Chemikalien

Zum Herstellen der Stammlösungen können folgende Salze verwendet werden:

NaCl p.a., getrocknet und wasserfrei

KCl p.a., getrocknet und wasserfrei

Durchführung

Es werden für Natrium und Kalium Kalibrierstandards mit 1, 2, 3 und 4 µg/mL hergestellt.

Tab. 7: Geräteparameter.

Element Spalt [mm] Wellenlänge [nm]

Kalium 0,5 764,9

Natrium 0,5 589,0


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Auswertung

Die Auswertung erfolgt sowohl graphisch als auch rechnerisch durch lineare Regression.

Anmerkung

Vor der Inbetriebnahme und Messung erfolgt eine Einweisung am Gerät.

3.5.2 Atomabsorptionsspektroskopische Bestimmung von weiteren Kationen

Die erhaltene Trinkwasserprobe wird in Hinblick auf die folgenden Kationen analysiert: Fe, Ca, Mg,

Mn, Cu, Zn, Pb, Ni.

Grundlagen

Bei der Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) wird die Resonanz-Absorption von Strahlungsenergie

durch Atome gemessen. Die Probenlösung wird z.B. in einer Flamme verdampft und die Salze disso-

ziieren zu einem geringen Teil in die Atome. Durch eine Hohlkathodenlampe, die das Metall enthält,

das untersucht werden soll, wird Licht einer bestimmten Wellenlänge in die verdampfte Probe ge-

strahlt. Es erfolgt eine Anregung der Atome und damit verbunden eine Absorption/Schwächung des

eingestrahlten Lichtes. Diese Schwächung der Strahlungsenergie wird mittels eines Photomultipliers

gemessen. Aufgrund der Gültigkeit des LAMBERT-BEER’schen Gesetzes lässt sich der Gehalt der Probe

mittels einer Kalibriergerade ermitteln.

Chemikalien

Zum Herstellen der Stammlösungen können beispielsweise folgende Salze verwendet werden:

CaCO3 sicc. p.a., getrocknet und wasserfrei

FeSO4 • 7H2O p.a., getrocknet und wasserfrei

Mg(NO3)

2 • 6H

2O p.a., getrocknet und wasserfrei

MnCl2 • 4H2O p.a., getrocknet und wasserfrei

Die Stammlösungen sollten eine Konzentration von jeweils ca. 100 µg/mL des zu bestimmenden Me-

talls enthalten. Es muss darauf geachtet werden, dass nicht hygroskopische Substanzen verwendet

werden und dass die Angabe des Hydratwassers stimmt; eine gute Möglichkeit ist auch, nur wasser-

freie Substanzen zu verwenden und diese dann bei 100 °C zu trocknen und immer im Exsikkator auf-

zubewahren.


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Beispielhafte Durchführung

Tab. 8: Kalibrierstandards* alle Angaben in [µg/mL].

Element Konzentration Kalibrierstandards [µg/mL]

Calcium 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

Eisen 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0

Magnesium 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0

Mangan 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

*Die Kalibrierstandards sollen verdünnte Salzsäure enthalten.

Tab. 9: Beispielhafte Geräteeinstellungen.

Element Hohlkathodenlampe Max. Lampenstrom Spalt [mm] Wellenlänge [nm]

Calcium Ca 6 mA 0,2 – 0,5 422,7

Eisen Fe 10 mA 0,2 – 0,5 248,3

Magnesium Mg 4 mA 0,2 – 0,5 285,2

Mangan Mn 12 mA 0,2 – 0,5 279,5

Auswertung

Die Auswertung erfolgt rechnerisch durch lineare Regression!

Anmerkung: Vor der Inbetriebnahme und Messung erfolgt eine Einweisung am Gerät.

Literatur

H.G. Maier, Lebensmittel- und Umweltanalytik, Methoden und Anwendungen, Steinkopff Verlag,

Darmstadt, 1990.

E. Merck AG, Die Untersuchung von Wasser, 5. Auflage, Darmstadt, 1969.

K. Höll, Wasser, Untersuchung, Beurteilung, Aufbereitung, 4. Auflage, Walter de Gruyter Verlag, Berlin,

1968.

TrinkwV: Verordnung über die Qualität von Wasser für den menschlichen Gebrauch (Trinkwasserver-

ordnung - TrinkwV 2001) in der Fassung der Bekanntmachung vom 2. August 2013 (BGBl. I S. 2977), die

durch Artikel 4 Absatz 22 des Gesetzes vom 7. August 2013 (BGBl. I S. 3154) geändert worden ist.


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4 Einführung in die Chromatographie

4.1 Papier-, Dünnschicht- und Säulenchromatographie

Die verschiedenen Aufgaben aus dem Bereich der Lebensmittel-Analytik sollen in die Technik der Pa-

pierchromatographie (PC), der Dünnschichtchromatographie (DC) und der Säulenchromatographie

(SC) einführen.

Probenaufarbeitung

Für die Dünnschichtchromatographie eignen sich im Allgemein verschiedene Extraktionsmethoden.

Im Folgenden sind für die jeweiligen Analytgruppen Extraktionsmethoden vorgeschlagen. Je nach

Analyt können auch andere sinnvolle Methoden wie bspw. ein methanolischer Auszug verwendet

werden.

Probenaufgabe

Die zur DC eingesetzten Lösungen sollten 0,01 – 1 % des jeweiligen Analyten in einem möglichst flüch-

tigen Lösungsmittel enthalten. Die Untersuchungslösungen sollten in mehreren kleinen Anteilen

nacheinander aufgetragen werden, wobei vor dem erneuten Auftragen jeweils getrocknet werden

sollte – dabei ist ein Fön hilfreich. Die Lösungen müssen in gleichem Abstand (ca. 15 mm) vom unteren

Rand der DC-Platte aufgetragen werden und dabei möglichst kleine Substanzflecken ( 3 mm) erge-

ben (mehrmals kleine Punkte setzen). Es sollten nicht viel mehr als 12 Proben auf einer 20 cm langen

Platte aufgetragen werden um Ineinanderlaufen zu verhindern; es muss unbedingt verhindert wer-

den, dass sich das Plattenmaterial auflöst und Löcher die die Chromatographie beeinflussen entste-

hen; mehr als ca. 25 µL (abhängig von Lösungsmittel/stat. Phase) sollten nicht aufgetragen werden.

Zum Auftragen können Einmal-Mikropipetten verschiedener Volumina oder „DC-Spritzen“ (10-µL-

Spritzen mit stumpfer Kanüle) eingesetzt werden.

Entwicklung

Es gibt verschiedene Methoden, mit denen man DC-Platten entwickeln kann. Im Praktikum ist eine

Methode gängig, bei der die Platte senkrecht in die DC-Kammer gestellt wird und das Laufmittel „auf-

steigt”. Die DC-Kammer sollte höchstens einen Zentimeter hoch mit Laufmittel gefüllt werden.

Vor der Entwicklung der ersten DC-Platte sollten mindestens 30 min bis zur Äquilibrierung des Gas-

raumes verstreichen. Fließmittel müssen nach spätestens einem Tag bzw. einigen Läufen frisch an-


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gesetzt werden! (Veränderung der Zusammensetzung!). Um bessere Fließgeschwindigkeiten zu er-

reichen, ist es sinnvoll, die Kammer mit Filterpapier auszukleiden, welches mit dem Lösungsmittel

getränkt ist. Es kann auch sinnvoll sein (bspw. Zucker-DC) die Platte einfach eine begrenzte Zeit (sonst

zu starke Diffusionserscheinungen!) „überlaufen“ zu lassen bzw. nach Zwischentrocknen noch mal

im selben oder anderen Fließmittel laufen zu lassen.

Die Laufstrecke sollte, je nach Trennproblem, 5 – 15 cm betragen. Die benötigte Zeit ist unter anderem

vom Sorptionsmittel, der Schichtdicke und der Laufmittel-Zusammensetzung abhängig.

Ist die Entwicklung abgeschlossen, wird die (gesamte) Laufmittelfront markiert, die DC-Platte aus der

Kammer genommen und bis zur Trockne unter einem Abzug oder in einem Trockenschrank (Warn-

hinweis anbringen!) belassen. Bei einer Mehrfach-Entwicklung muss die DC-Platte ebenfalls nach je-

der Entwicklung vollständig getrocknet werden.

Da viele der zur Entwicklung eingesetzten Lösungsmittel flüchtig sind, sollte der Deckel der DC-

Kammer stets geschlossen bleiben. Nachts sind die Lösungsmittelkammern in geschlossene Abzüge

zu stellen!

Es sollten ggf. weitere im Skript nicht angegebene Systeme ausprobiert werden siehe dazu Lit.: Stahl,

Matissek etc..

Detektion

Die Lage der Substanzflecken kann prinzipiell durch folgende Möglichkeiten bestimmt werden: Die

Eigenfärbung der Substanzen, ihre Eigenfluoreszenz, die Fluoreszenzlöschung (bei Platten mit Fluo-

reszenzindikator) und die Detektion mit Sprühreagenzien. Welche Methode angewandt wird, ist von

der jeweiligen Anwendung abhängig. Es bietet sich jedoch an, auch Platten, die mit Detektionsrea-

genzien besprüht werden sollen, vorher unter UV-Licht zu betrachten.

Anmerkung: Es ist bei der Interpretation der Platten darauf zu achten, wie selektiv aufgearbeitet

wurde und wie selektiv das verwendete Detektionsmittel ist (vgl. hierzu Lit.: Jork, Funk, Fischer, Wim-

mer – dort auch genaue Vorschriften zur Herstellung bestimmter Detektionsmittel).

VORSICHT: Viele der genutzten Sprühreagenzien sind Gefahrstoffe! Jeder Studierende muss sich im

Vorfeld über die Gefährdungen der verwendeten Stoffe informieren und ggf. über das Tragen von

Schutzkittel und Schutzbrille hinaus geeignete Schutzmaßnahmen ergreifen.


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Identifizierung (qualitative Analyse)

Die Identifizierung von Verbindungen erfolgt durch Vergleich der Rf-Werte mit denen von Vergleichs-

substanzen, welche auf der gleichen Platte mit aufgetragen werden. Positive Befunde werden durch

Dotierung der Probe mit der entsprechenden Vergleichssubstanz bestätigt. Die Dotierung erfolgt

durch Auftragen der Probe und des Vergleiches auf demselben Punkt der DC. Dabei ist das Auftrage-

volumen der dotierten und undotierten Probe identisch zu wählen. Trennen sich die beiden Substan-

zen nicht, so gilt der Befund als bestätigt.

Dokumentation

Auf einer entwickelten DC-Platte werden Startpunkte, Laufmittelfront und alle detektierten Spots

mit einem weichen Bleistift (Vorsicht bei Cellulose!) markiert. Die DC-Platte wird dann z.B. auf Trans-

parentpapier in Originalgröße dargestellt, eingescannt oder fotografiert (möglichst zeitnah, manche

Detektionen verblassen sehr schnell, auch wenn interessant unter UV-Licht). Chromatographie-Be-

dingungen wie stationäre Phase, mobile Phase, Detektionsmethode sowie Auftragsmengen und Kon-

zentrationen der aufgetragenen Lösungen müssen bei der Dokumentation aufgezeichnet und im An-

hang zu jedem Chromatogramm angegeben werden.

Literatur

R. J. Gritter, J. M. Bobbitt, A. E. Schwarting, Einführung in die Chromatographie, Springer Verlag, Berlin,

1987.

H. Jork, W. Funk, W. R. Fischer, H. Wimmer, Dünnschicht-Chromatographie: Reagenzien und Nachweis-

methoden, Wiley Verlag, Weinheim, 1993.

E. Stahl, Dünnschicht-Chromatographie, 2. Auflage, Springer Verlag, Berlin, 2013.

M. Otto, Analytische Chemie, 4. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2011.

G. Schwedt, Analytische Trennmethoden,1. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2010.

L. Kraus, A. Koch, S. Hoffstetter-Kuhn, Dünnschichtchromatographie, 1. Auflage, Springer-Verlag, Ber-

lin, 2013.


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4.1.1 Identifizierung von Zuckern

Grundlagen

Die Zucker werden mit einem Ethanol/Wasser-Gemisch aus der Probe extrahiert. Nach Zentrifugieren

und Filtration erfolgt die dünnschichtchromatographische Trennung an Kieselgel bzw. die pa-

pierchromatographische Trennung. Zur Detektion werden die Zucker mit Sprühreagenzien zu Verbin-

dungen unterschiedlicher Farben umgesetzt. Es werden Monosaccharide, Disaccharide und Oligosac-

charide erfasst.

Durchführung

Probe: Joghurt (wird vom Assistenten ausgegeben)

Probenvorbereitung

Etwa 5 g Probe werden unter Rühren mit 50 mL 70 %igem Ethanol extrahiert. Das Unlösliche wird ab-

zentrifugiert, anschließend wird filtriert und das Filtrat gegebenenfalls am Vakuumrotationsver-

dampfer eingeengt. Diese Lösung wird zur dünnschichtchromatographischen und zur papierchroma-

tographischen Identifizierung eingesetzt.

a) dünnschichtchromatographische Identifizierung

Tab. 10: Chromatographiebedingungen Dünnschichtchromatographie (Zucker).

Methode Dünnschichtchromatographie

Trennproblem Mono- und Oligosaccharide (z. B. Glucose, Fructose, Galactose, Saccha-

rose, Maltose, Lactose, Xylose, Raffinose, Mannose)

Stationäre Phase Kieselgel G 60

Mobile Phase a) Acetonitril/Wasser (85/15, v/v)

oder b) Ethylacetat/Methanol/Wasser (68/23/9, v/v/v)

oder c) Dichlormethan/Eisessig/Wasser (30/35/5, v/v/v)

Vergleichslösungen 1 % in Ethanol/Wasser (70/30, v/v)

Aufgabevolumen 5 – 10 µL

Detektion Diphenylamin (2 % in Ethanol)/p-Anisidin (2 % in Ethanol)/Phosphor-

säure 85 % (w/v) (10/10/2, v/v/v); nach Besprühen auf 120 °C erwärmen

(2 – 15 min), bis die Spots sichtbar werden


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b) papierchromatographische Identifizierung

Abb. 14: PC-Rundfilter nach POTTERAT.

Abb. 15: Kammer für die Papierchromatographie.

Verwendet werden Rundfilter nach POTTERAT für die Papierchromatographie. Die Proben bzw. Stan-

dards werden jeweils an den engsten Stellen zwischen den hinkelsteinförmigen Ausschnitten aufge-

tragen. Der Rundfilter (1) wird auf einen geeigneten Behälter (2), z.B. eine große Petrischale, gelegt.

Die mobile Phase befindet sich in einem Reservoir (3), z.B. eine kleine Petrischale, auf dem Boden des

Behälters. Der Kontakt zwischen Rundfilter und mobiler Phase wird durch einen Wollfaden oder ei-

nen zusammengerollten Filter (4) hergestellt, welcher in das zentrale Loch des Rundfilters gesteckt

wird und in die mobile Phase eintaucht. Auf den Rundfilter wird ein Deckel (5), z.B. eine umgedrehte

Petrischale, aufgesetzt. Die Entwicklung dauert ca. 14 – 18 h. und sollte daher über Nacht durchge-

führt werden.

Tab. 11: Chromatographiebedingungen Papierchromatographie.

Methode Papierchromatographie, circular

Trennproblem Mono- und Oligosaccharide (z. B. Glucose, Fructose, Galactose, Maltose,

Saccharose, Lactose)

Stationäre Phase Rundfilter nach POTTERAT für die Papierchromatographie

Mobile Phase n-Propanol/Ethylacetat/Wasser (65/10/25, v/v/v)

Vergleichslösungen 1 % in Ethanol/Wasser (70/30, v/v)


Detektion Diphenylamin (2 % in Ethanol)/p-Anisidin (2 % in Ethanol)/ Phosphor-

säure 85 % (w/v) (10/10/2, v/v/v); nach Besprühen 2 – 15 min auf

100 °C erwärmen


66/103

Literatur



E. Merck AG (Hrsg.), Anfärbereagenzien für Dünnschicht- und Papier-Chromatographie, Darmstadt,

1984.

4.1.2 Identifizierung von organischen Säuren

Grundlagen

Die organischen Säuren wie z.B. Äpfel-, Citronen-, Milch-, Wein-, Ascorbin-, Glutamin- und Oxalsäure

werden aus dem wässrigen Extrakt der Probe über einen stark basischen Anionenaustauscher isoliert

und dünnschichtchromatographisch auf Polyamid getrennt. Die Detektion der Säuren erfolgt durch

Besprühen mit einer pH-Indikatorlösung.

Durchführung


Probenvorbereitung

Ca. 10 g des stark basischen Anionenaustauschers wird über Nacht in 100 mL dest. Wasser quellen

gelassen. 5 mL des Anionenaustauschers werden in einem Messzylinder abgemessen und in eine

Chromatographiesäule gegeben. Der Anionentauscher wird mit 100 mL 0,1 M NaOH aktiviert und mit

100 mL 0,1 M Essigsäure gewaschen. Von der Probe wird ein wässriger Extrakt hergestellt, filtriert und

auf die Chromatographiesäule aufgegeben. Der Anionenaustauscher wird mit 200 mL dest. Wasser

gewaschen und die organischen Säuren werden mit 200 mL 3 M Ameisensäure eluiert (Tropfge-

schwindigkeit 1 – 2 Tropfen/s). Das Ameisensäureeluat wird am Vakuumrotationsverdampfer bei

60 °C bis zur Trockne eingeengt und der Rückstand mit wenig Ethanol (ca. 10 mL) aufgenommen. Das

zur Säulenfüllung verwendete Anionenaustauscher-Material wird zur Wiederverwendung regene-

riert (= aktivieren mit Natronlauge, waschen mit Essigsäure).


67/103

Tab. 12: Chromatographiebedingungen Dünnschichtchromatographie (org. Säuren).


Trennproblem Äpfel-,Citronen-,Milch-, Wein-, Ascorbin-, Bernstein-, Glutamin-, Oxal-

säure

Stationäre Phase Polyamid

Mobile Phase Acetonitril/ Essigester/Ameisensäure (82/9/9, v/v/v)

Vergleichslösungen 1 % in Ethanol


Detektion Ameisensäure bei 105 °C im Trockenschrank vollständig abdampfen,

dann mit einer Bromkresolgrün-Lösung besprühen (40 mg Bromkre-

solgrün in 100 mL Ethanol lösen und mit 0,1 M NaOH bis zur Blaufärbung

versetzen)

Literatur

H. Jork, W. Funk, W. R. Fischer, H. Wimmer, Dünnschicht-Chromatographie: Reagenzien und Nachweis-

methoden, Wiley Verlag, Weinheim, 1993.

E. Stahl, Dünnschicht-Chromatographie, 2. Auflage, Springer Verlag, Berlin, 2013.

4.1.3 Identifizierung von Konservierungsstoffen

Grundlagen

Die Konservierungsstoffe werden mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion durch ein Petrolether/Ether-Ge-

misch aus dem Lebensmittel im sauren Milieu (pH < 3) extrahiert. Anschließend werden sie auf Kie-

selgel F254 dünnschichtchromatographisch getrennt. Die Detektion erfolgt durch Fluoreszenzlö-

schung bei Betrachtung unter UV-Licht bei 254 nm.

Durchführung



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Probenvorbereitung

Ca. 1 g Probe wird mit 4 g Kieselgel für die Säulenchromatographie verrieben und in die Säule gefüllt.

Es wird mit 40 mL eines 1:1-Gemisches aus Petrolether und Diethylether eluiert. Das Ethergemisch

wird mittels Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird in 4 mL Ethanol aufgenommen.

Tab. 13: Chromatographiebedingungen Dünnschichtchromatoprahie (Konservierungsstoffe).


Trennproblem Sorbinsäure, Benzoesäure, Chlorbenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure-

ester (Methyl-, Ethyl-, Propyl-und Butyl-) p-Hydroxybenzoesäure, Salicyl-

säure

Stationäre Phase Kieselgel 60 F254

Mobile Phase Petrolether (40/60, v/v)/Dichlormethan/Ameisensäure/Eisessig

(50/60/8/2; v/v/v/v)

Vergleichslösungen je 0,2 % bzw. 0,5 % in Aceton

Aufgabevolumen 5 µL der Standards/10 µL der Probenaufarbeitung

Detektion nach dem Trocknen bei Raumtemperatur unter UV-Licht (254 nm) be-

trachten

Anmerkungen

Statt der hier beschriebenen Lösungsmittelextraktion kann bei wasserdampfflüchtigen Konservie-

rungsstoffen zur Isolierung auch die Wasserdampfdestillation angewandt werden.

Zur photometrischen Quantifizierung kann es erforderlich sein, Ester und Säuren zu trennen. Dies ist

möglich, indem das mit Wasser neutral gewaschene organische Probenextrakt zunächst mit 0,05 M

Natriumhydrogencarbonatlösung I (pH ~ 8,4; Abtrennung der Säuren) und anschließend mit 0,1 M

Natriumhydroxidlösung II (Abtrennung der phenolischen Ester) bearbeitet wird. Nach Ansäuern mit

Schwefelsäure 20 % (w/v) werden die Konservierungsstoffe aus den Lösungen I und II mit dem Ex-

traktionsgemisch extrahiert und weiter wie oben beschrieben (waschen, trocknen, einengen, aufneh-

men in Ethanol) behandelt.

Die ethanolische Lösung des Rückstandes kann auch zur photometrischen Bestimmung der Konser-

vierungsstoffe verwendet werden.


69/103

Literatur

W. Courtial, Die spektralphotometrische Bestimmung der Konservierungsstoffe Sorbinsäure, Benzoe-

säure und PHB-Ester, Dt. Lebensm. Rundschau, 66, 220-223 1970.

W. Diemair, W. Postel, Nachweis und Bestimmung von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln, Wis-

senschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 1967.

W. Frede, Konservierungsstoffe in Lebensmitteln in W. Fresenius, H. Günzler, W. Huber, H. Kelker, I.

Lüderwald, G. Tölg, H. Wisser (Hrsg.), Analytiker-Taschenbuch, Band 7, Springer-Verlag, Berlin, 1988.




70/103

4.2 Alternative Identifizierung sowie Quantifizierung der Konservierungs-

stoffe mittels Hochleistungsflüssigchromatographie

Grundlagen

Zur qualitativen und quantitativen Analyse diverser Lebensmittelinhaltsstoffe hat die Hochleistungs-

flüssigchromatographie (englisch: high performance liquid chromatography, HPLC) die Dünnschicht-

chromatographie in vielen Anwendungsgebieten bereits ersetzt. Gegenüber der klassischen Flüs-

sigchromatographie zeichnet sie sich durch eine starke Miniaturisierung der Komponenten sowie das

Arbeiten unter hohen Drücken (bis etwa 400 bar) aus. Dadurch kann eine Vielzahl von verschiedenen

Substanzen in relativ kurzer Analysenzeit gleichzeitig analysiert werden. Am Beispiel der Konservie-

rungsstoffe sollen zwei unterschiedliche Extraktionsverfahren durchgeführt und verglichen werden.

4.2.1 Isolierung durch Wasserdampfdestillation

Grundlagen

Die Konservierungsstoffe werden aus der Lebensmittelmatrix durch Wasserdampfdestillation abge-

trennt. Stoffe mit einer Säuregruppe sind erst nach Protonierung im sauren Medium wasserdampf-

flüchtig. Wasserdampfflüchtige Konservierungsstoffe sind neben Sorbinsäure und Benzoesäure auch

Ameisensäure, Propionsäure, p-Chlorbenzoesäure, o-Phenylphenol (OPP), Diphenyl (DP), pHB-Ester

(nicht quantitativ, die p-Hydroxybenzoesäure selbst ist nicht wasserdampfflüchtig), Hexamethylen-

tetramin (als Formaldehyd) und Salicylsäure.

Geräte

Destillationskolben (für die automatische Wasserdampfdestillation)

Aufschlussblock (Heizblock mit Spirale)

Automatische BÜCHI-Destillationsapparatur


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Chemikalien

Kochsalz (Handelsware)

Magnesiumsulfat

Tartratpuffer, pH 3,0: 8,0 g Natriumhydroxid und 43,3 g Weinsäure in einem 1-L-Messkolben mit ca.

800 mL dest. Wasser lösen, den pH-Wert überprüfen (ggf. einstellen) und die Lösung mit dest. Wasser

auffüllen

Schwefelsäure, 20 % (w/v) in dest. Wasser

Durchführung


5 – 10 g der Probe werden mit 30 g Magnesiumsulfat und 20 mL Tartratpuffer in einem Destillations-

kolben vermischt und der pH-Wert überprüft (ca. pH 3,0) und ggf. eingestellt. Anschließend wird 6 s

(entspricht 75 mL) dest. Wasser zu dosiert. Der Auslauf der Destillationsapparatur taucht in einen 250-

mL-Messkolben ein. Abschließend wird eine Wasserdampfdestillation für 15 min bei 100 % Wasser-

dampfdruck ausgeführt. Nach dem Ende der Wasserdampfdestillation wird das Destillat mit dest.

Wasser aufgefüllt.

Alternativ kann auch eine traditionelle Wasserdampfdestillation

nach LORENZEN UND SIEH (1962) durchgeführt werden. Dafür werden

Probe, Magnesiumsulfat und Tartratpuffer wie oben beschrieben

vermischt und der pH-Wert überprüft (ca. pH 3,0) und ggf. einge-

stellt. Das Gemisch wird in das Destillationsgefäß (1) überführt und

der 2-L-Kochkolben (2) im Heizpilz (3) mit 1,5 L Wasser und Siedestei-

nen versetzt. Nach JÄCKL (1963) erhöht sich die Intensität der Wasser-

dampfdestillation wesentlich, wenn überhitzter Wasserdampf von

105 °C durch die Probe geleitet wird. Das erreicht man durch Zugabe

von ca. 100 g Kochsalz zu dem Wasser im Kochkolben.

Achtung! Das Kochsalz sollte zu jeder Zeit gelöst vorliegen, da es

sonst zu Siedeverzügen kommen kann.

Der Kolben ist bei geöffnetem Trichterhahn (4) bis zum Sieden des Wassers zu erhitzen und dann der

Dampfablass zu schließen. Danach sind ca. 900 mL in einen 1000-mL-Messkolben zu destillieren.

Abb. 16: Apparatur nach ANTONA-COPOULOS.


72/103

Nach beendeter Destillation wird zunächst der Trichterhahn (4) geöffnet und erst dann der Heizpilz

abgestellt, da sonst der Inhalt des Destillationskolbens in den Kochkolben zurück steigt. Das Destillat

wird mit 5 mL Schwefelsäure 20 % (w/v) angesäuert, mit dest. Wasser aufgefüllt und direkt zur Mes-

sung eingesetzt. Bei dieser Methode ist darauf zu achten, dass die Konzentration der Konservierungs-

stoffe möglicherweise durch das große Volumen des Messkolbens zu gering sein könnte und entspre-

chende Maßnahmen ergriffen werden müssen.

Anmerkungen

Bei kohlenhydratreichen Lebensmitteln kann bei Hitzeeinwirkung in saurem Medium das UV-aktive,

wasserdampfflüchtige 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) entstehen, das eine photometrische Bestim-

mung der Konservierungsstoffe stört. Deshalb sollte zur Vermeidung seiner Bildung ein pH = 3 einge-

stellt werden. Für qualitative Zwecke kann der Puffer jedoch auch z.B. durch 2 g Citronensäure ersetzt

werden.

Bei Störungen durch andere Stoffe (Aromastoffe, ätherische Öle) in Form von Absorption oder Trü-

bung des Destillates wird das saure Destillat mit Diethylether extrahiert, die organische Phase mit

0,1 N Natriumhydroxidlösung reextrahiert und die wässrige Phase vor der Messung mit Schwefel-

säure angesäuert.

4.2.2 Isolierung durch methanolische Extraktion

Grundlagen

Für die meisten Analyten ist eine einfache Extraktion mit einem Lösungsmittel(-gemisch), meist Me-

thanol, ausreichend um diese quantitativ aus einer Matrix zu isolieren. Eine Behandlung mit Ultra-

schall unterstützt diese Extraktion zusätzlich. Der Vorteil dieser Art der Aufarbeitung liegt vor allem

in seiner einfachen Handhabung und der damit verbundenen Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit.

Die Löslichkeit des zu extrahierenden Analyten in dem jeweiligen Extraktionsmittel ist dabei maß-

geblich für die Effizienz verantwortlich und sollte vorher unbedingt überprüft werden.

Geräte

Ultraschallbad

Papierfilter

Chemikalien

Methanol (HPLC-grade)


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Durchführung


Ca. 1 g der Probe werden in einem 20-mL-Messkolben mit ca. 15 mL Methanol versetzt und für 10 min

mit Ultraschall behandelt. Anschließend wird mit Methanol aufgefüllt und homogenisiert. Die Sus-

pension wird durch ein trockenes Papierfilter filtriert. Das Filtrat wird zur Analyse in die HPLC injiziert.

Ggf. muss eine Verdünnung erstellt und gemessen werden.

Bei fettreichen Proben muss das Fett vor der Filtration bei -20 °C ausgefroren werden. Anschließend

wird die eiskalte (!) Suspension filtriert und kann dann für die Analyse genutzt werden.

4.2.3 Flüssigchromatographische Analyse der Konservierungsstoffe

Grundlagen

Die Trennung der Konservierungsstoffe erfolgt an einer Phenyl-Hexyl-Säule nach dem Mechanismus

der Reversed Phase Chromatography. Den Laufmitteln sind jeweils 0,1 % Ameisensäure beigesetzt, da-

mit saure Analyten protoniert und dadurch deren chromatographische Eigenschaften verbessert wer-

den. Die Detektion erfolgt mit Hilfe eines Dioden-Array-Detektors (DAD). Dieser bietet den Vorteil,

dass eine Vielzahl von Analyten mit unterschiedlichen Absorptionsmaxima simultan detektiert wer-

den können.

Geräte

100-µL-HPLC-Spritze

HPLC mit Phenyl-Hexyl-Säule und DAD (Einführung beim Assistenten)

Chemikalien

Methanol (HPLC-grade)

Wasser (bidestilliert)

Ameisensäure (FA) ≥ 98 % (w/v)

Wasser + 0,1 % FA (2,5 L bidest. Wasser mit 2,5 mL Ameisensäure versetzen)

Acetonitril + 0,1 % FA (2,5 L Acetonitril HPLC-grade mit 2,5 mL Ameisensäure versetzen)

Multi-Stammlösung (ca. 4 g/L): In einem 100-mL-Messkolben werden von jedem

Konservierungsstoff jeweils 400 mg eingewogen und anschließend mit Methanol aufgefüllt. Zur voll-

ständigen Lösung ist eventuell eine Behandlung mit Ultraschall notwendig.


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Durchführung

Erstellung der Multi-Standardreihe

Von der Multi-Stammlösung werden jeweils 100, 200, 300, 400 und 500 µL in einen 10-mL-Messkol-

ben überführt und mit Methanol aufgefüllt.

Arbeiten an der HPLC

Vor der Messung erfolgt das Purgen der Kanäle A und B um Luftblasen aus den Schläuchen zu entfer-

nen. Anschließend wird mit den jeweiligen Anfangsbedingungen der LC-Methode äquilibriert. Sobald

der Druck konstant ist, kann die zu untersuchende Lösung injiziert werden.

Tab. 14: HPLC-Parameter.

Methode Hochdruckflüssigchromatographie

Trennproblem Sorbinsäure, Benzoesäure, Chlorbenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure-

ester (Methyl-, Ethyl-, Propyl-und Butyl-), p-Hydroxybenzoesäure, Sa-

licylsäure

Stationäre Phase Phenomenex® Phenyl-Hexyl; 250 x 2,1 mm; 5 µm

Mobile Phase A: bidest. Wasser + 0,1 % FA, B: Acetonitril + 0,1 % FA

Gradient: Zeit [min] %A %B

0 70 30

4 70 30

15 0 100

18 0 100

19 70 30

23 70 30

Flow 1 mL/min

Injektion je 20 µL Standardreihe/Wasserdampfdestillat/meth. Extrakt

Detektion Dioden-Array-Detektor


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Auswertung

Für jeden zu bestimmenden Analyten wird eine Kalibriergerade durch lineare Regression der entspre-

chenden Area-Werte aus den Chromatogrammen der Multi-Standardreihe erstellt. Für jeden Analy-

ten sind dabei die Chromatogramme der Wellenlänge des Absorptionsmaximums auszuwerten.

Anmerkung

Vor Inbetriebnahme und Messung erfolgt eine Einweisung am Gerät. Während des Betriebes der

HPLC ist unbedingt darauf zu achten, dass genügend Laufmittel in den Vorratsbehältern vorhanden

ist und die Schläuche tief genug eintauchen um den Eintrag von Luftblasen in das System zu vermei-

den. Dies würde nicht nur die Analyse stören, sondern führt auch zu Beschädigungen der Säule.

Das Ergebnis der methanolischen Extraktion soll mit der Wasserdampfdestillation verglichen wer-

den. Für jede der beiden Aufarbeitungsmethoden erfolgt jeweils min. eine Doppelbestimmung. Es

werden die Ergebnisse beider Methoden beim Assistenten vorgelegt und die Vor- und Nachteile der

beiden Methoden dargelegt. Anhand dessen soll sich entschieden werden, welchem der Ergebnisse

mehr Vertrauen geschenkt wird.

Literatur

D. A. Skoog, J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Band I, Springer-Verlag, Berlin, 2013.

M.H. Gey, Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag, Berlin, 2015.

N. Antonacopoulos, Verbesserte Apparatur zur quantitativen Destillation wasserdampfflüchtiger

Stoffe, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 113, 113 – 116 1960.

W. Courtial, Die spektralphotometrische Bestimmung der Konservierungsstoffe Sorbinsäure, Benzoe-

säure und PHB-Ester, Dt. Lebensm. Rundschau, 66, 220 – 223 1970.

W. Frede, Konservierungsstoffe in Lebensmitteln in W. Fresenius, H. Günzler, W. Huber, H. Kelker, I.

Lüderwald, G. Tölg, H. Wisser (Hrsg.), Analytiker-Taschenbuch, Band 7, Springer-Verlag, Berlin, 1988.

B. Saad, M. F. Bari, M. I. Saleh, K. Ahmad, M. K. M. Talib, Simultaneous determination of

preservatives (benzoic acid, sorbic acid, methylparaben and propylparaben) in foodstuffs

using high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1073(1),

393-397 2005.

H. S. Lee, R. L. Rouseff, J. F. Fisher, Determination of Food Preservatives in Orange Juice

by Reversed‐Phase Liquid Chromatography, Journal of Food Science, 51(3), 568-570 1986.


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4.3 Gaschromatographie

4.3.1 Gaschromatographie der Fettsäuremethylester

Grundlagen

Zur Identifizierung bzw. Unterscheidung von Fetten und Ölen (insbesondere zum Nachweis von

Fremdfett) wird das Fettsäuremuster herangezogen. In einer Ein-Schritt-Carbonylreaktion werden die

Fettsäuren mittels methanolischer Kalilauge (genauer: mittels des Kalium-Methanolats) aus den Tri-

acylglyceriden zu den jeweiligen Fettsäuremethylestern (FSME) umgesetzt, da diese im Gegensatz zu

den freien Fettsäuren ausreichend flüchtig sind und mittels Gaschromatographie (GC) getrennt wer-

den können.

Geräte

Schraubreagenzgläser mit teflonbeschichteter Dichtung (”Pyrexglas”)

10-µL-GC-Spritze

Kapillar-GC mit Flammenionisations-Detektor (FID) (Einführung beim Assistenten)

Chemikalien

n-Hexan p.a.

methanolische Kaliumhydroxidlösung 11 % (w/v); Diese Lösung wird in einem Schlifferlenmeyerkol-

ben angesetzt und sollte keine Trübung aufweisen. Sie ist im gut verschlossenen Gefäß wochenlang

haltbar.

2 M Salzsäure

Methylorange

Durchführung

Probe: Öl oder Fett (wird vom Assistenten ausgegeben)

Probenvorbereitung: Fettextraktion

Für Proben, die neben Fett auch andere Bestandteile – v.a. Wasser – enthalten:

Je nach Fettgehalt ist eine Probenmenge, die ca. 3 g Gesamtfett entspricht, einzuwiegen und unter

Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat im Mörser zu verreiben. (Bei sehr wasserreichen Proben vor-

her Probe mit Seesand verreiben, 1 h bei 105 °C im Trockenschrank trocknen) Es wird mit Diethylether


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oder Petrolether (Sdp. 40 – 60 C) extrahiert, ggf. in der SOXHLET-Apparatur. Nach Filtration (Faltenfil-

ter) durch wasserfreies Natriumsulfat wird der Diethylether bzw. Petrolether am Vakuumrotations-

verdampfer entfernt. Diese Methode ist besonders schonend und kann auch bei Milcherzeugnissen

angewendet werden.

Bei reinen Ölen oder Fetten erübrigt sich die vorstehende Behandlung. Für komplexe Lebensmittel-

matrices (insbesondere bei Mischungen aus pflanzlichen und tierischen Fetten) sollte das nach Säu-

reaufschluss gewonnene Fett (s. 1.3.1) zur Umesterung eingesetzt werden.

Umesterung mit methanolischer Kaliumhydroxidlösung (PFALZGRAF et al.)

100 – 200 mg Fett werden genau eingewogen und in 10 mL n-Hexan gelöst, davon wird 1 mL zur Um-

esterung in das Pyrexglas pipettiert. Es werden 0,2 mL methanolische Kaliumhydroxidlösung 11 %

(w/v) zugefügt. Das Pyrexglas wird fest verschlossen, die Lösung kräftig geschüttelt und 10 min bei

Raumtemperatur stehengelassen (zwischendurch noch mal schütteln). Dann wird mit 0,25 mL 2 M

Salzsäure neutralisiert (Methylorange dient als Indikator) sowie mit 4 mL n-Hexan verdünnt. Nach

kräftigem Schütteln wird von der oberen Phase 1 µL in den GC injiziert. Für die Auswertung nach der

“Methode mit internem Standard” wird ein definierter Teil der aufgearbeiteten Lösung mit einem

definierten Volumen der Internen-Standard-Lösung (Heptadecansäuremethylester in n-Hexan, meist

200 µL) versetzt (verwendete Volumina notieren).

Freie Fettsäuren werden mit dieser Methode nicht erfasst.

Gaschromatographie

GC-Bedingungen: siehe Gerät (fürs Protokoll notieren)

Je 1 µL injizieren:

a) Standardgemisch, welches alle unten genannten Fettsäuremethylester in bekannter Konzent-

ration enthält. Das Gemisch ist fertig beim GC-Assistenten erhältlich.

b) Proben-Lösung exklusive internem Standard

c) Proben-Lösung inklusive internem Standard.


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Die Fettsäuremethylester eluieren in folgender Reihenfolge:

C8:0 Caprylsäuremethylester

C10:0 Caprinsäuremethylester

C12:0 Laurinsäuremethylester

BHT Butylhydroxytoluol; Antioxidans

C14:0 Myristinsäuremethylester

C16:0 Palmitinsäuremethylester

C16:1 Palmitoleinsäuremethylester

C17:0 Heptadecansäuremethylester (interner Standard)

C18:0 Stearinsäuremethylester

C18:1 Ölsäuremethylester

C18:2 Linolsäuremethylester

C18:3 Linolensäuremethylester

C20:0 Arachinsäuremethylester

C22:0 Behensäuremethylester

C22:1 Erucasäuremethylester

C24:0 Lignocerinsäuremethylester

Auswertung

Auswertung nach der 100 %-Methode:

a) Auswertung des Standards

Nicht berücksichtigt bei den folgenden Berechnungen werden BHT und C17-Methylester!

Für den externen Standard werden in einer Tabelle die Retentionszeiten Rt der Fettsäuremethylester

eingetragen und daneben die Gewichtsprozente (Gew-%, berechnet aus dem Standard), die Flächen-

prozente (A-%, berechnet aus dem Standard-Chromatogramm) und die resultierenden Korrekturfak-

toren KF:

Tab. 15: Auswertung des externen Standards.

FSME Rt M Gew.-% A A.-% KF

C8:0

…

C24:0


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Berechnung der Gewichtsprozente der relevanten Peaks:

Gew-% = m ∙ 100

∑ mi (10)



Gew-% [%] Gewichtsprozent der Fettsäuren des Externen Standards

m [g] Masse der Fettsäure im Externen Standard

mi [g] Gesamtmasse aller Fettsäuren im Externen Standard

Berechnung der Flächenprozente der relevanten Peaks:

A-% = A ∙ 100

∑ Ai (11)



A-% [%] Flächenprozent der Peaks der Fettsäuren des Externen Standards

A [Skt] Area der Fettsäure im Externen Standard

Ai [Skt] Gesamtarea aller Fettsäuren im Externen Standard

Berechnung des Korrekturfaktors KF für jeden Peak:

KF = Gew-%

A-% (12)

b) Auswertung der Probe

Für die Probe werden in einer weiteren Tabelle die Areas des Proben-Chromatogramms (AP), die mit

den entsprechenden KF multiplizierten Areas für die Probe und die daraus berechneten Gewichtspro-

zente (Gew-%P) eingetragen:


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Tab. 16: Auswertung der Probe.

FSME Rt KF AP KF * AP Gew.-%P

C8:0

…

C24:0

Die Gewichtsprozente jeder Komponente in der Probe errechnen sich nach:

Gew-%p = KF ∙ AP ∙ 100 %

∑ (KF ∙ AP)i

(13)



Gew-% [%] Flächenprozent der Peaks der Fettsäuren der Probe

KF - Korrekturfaktor des Standards

Ap [Skt] Area der Fettsäure der Probe

∑(KF ∙ Ap)i [Skt] Gesamtsumme aus der Multiplikation der Area der Probe mit KF

Die Einordnung der Öle/Fette erfolgt durch Vergleich des ermittelten Fettsäuremusters mit Daten der

Literatur, z. B. anhand der Tabellen in den Leitsätzen der Deutschen Lebensmittelbuch-Kommission,

in Hadorn & Zürcher (1967), in Souci, Fachmann, Kraut oder im Skript der TU Berlin. Bei Schwierigkei-

ten mit der Identifizierung empfiehlt es sich, Gewichtsverhältnisse einzelner Fettsäuremethylester

zu ermitteln und mit Literaturwerten vergleichen, z. B. Verhältnis C16:0/C18:0 oder C18:1/C18:2.

Um eine eindeutige Identifizierung vornehmen zu können, müssen Vergleichssubstanzen analog auf-

gearbeitet und analysiert werden. Liegt der Vermutung nahe, dass es sich um ein Fett-Gemisch han-

delt, ist ebenso eine Mischung der jeweiligen Vergleichssubstanzen anzusetzen und ebenfalls zu ana-

lysieren. Nur mit vorliegenden Vergleichschromatogrammen kann eine Ansage erfolgen.

Quantitative Auswertung nach der Methode mit internem Standard

Dies ist eine der gebräuchlichsten Auswertungsmethoden in der Chromatographie. Sie ist besonders

wichtig, wenn es nicht auf das Mengenverhältnis der chromatographierten Substanzen zueinander

ankommt wie im vorliegenden Fall, sondern auf die absoluten Mengen. Durch Zugabe des internen

Standards werden z.B. Aufarbeitungsverluste oder Injektionsfehler rechnerisch eliminiert.


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Benötigt werden die Chromatogramme der Probenlösung (in bekannter Konzentration, die die zu be-

stimmenden Substanzen sowie eine definierte Menge des internen Standards enthält) und der exter-

nen Standardlösung.

Zunächst wird mit Hilfe des Chromatogramms des externen Standards für jede zu bestimmende Sub-

stanz ein Korrekturfaktor KF bestimmt:

KF = mES ∙ AIS

mIS ∙ AES (14)



mES [g] Menge der zu bestimmenden Substanz in Externer Standardlösung

mIS [g] Menge des internen Standards (C17:0) in Externer Standardlösung

AES [Skt] Peakfläche der zu bestimmenden Substanz im Standard-

Chromatogramm

AIS [Skt] Peakfläche des internen Standards im Standard-Chromatogramm

Tab. 17: Auswertung der Fettsäuremethylester der Externen Standardlösung.

FSME A Menge FSME im Ext. Std [ng/µL]* KF

C8:0

…

C24:0

*Die Konzentrationen der einzelnen FSME des externen Standards können mit Hilfe des Aushangs am

GC ermittelt werden.

Zur Bestimmung der Korrekturfaktoren sollte die externe Standardmischung mehrfach injeziert und

ein Mittelwert der Areas der jeweiligen FSME gebildet werden.

Die Menge mP [ng/µL] der zu bestimmenden Substanz(en) in dem µL injizierter Probenlösung errech-

net sich nach:

mP = KF ∙ mIS ∙ AP

AIS (15)


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mP [ng/μL] Menge der Fettsäure in der Probe in 1 μL injizierter Lösung

mIS [ng] Masse der Internen Standardlösung in der Probe

KF - Korrekturfaktor

AIS [SKT] Area der Internen Standardlösung in der Probe

AP [SKT] Area der Fettsäure der Probe

Anschließend wird die mP der einzelnen FSME in [ng/µL] injizierter Probenlösung unter Berücksichti-

gung aller Verdünnungsschritte inklusive der Zugabe des internen Standards (ACHTUNG: der interne

Standard ist ebenfalls in Hexan gelöst, hier erfolgt also unter Umständen ebenfalls eine Verdünnung)

auf die Probeneinwaage bezogen.

Gew-%P,IS

= mP ∙ VF

1 ∙ VF

2 ∙ Vges

mE∙100 % (16)



mP [mg/μL] Masse der Fettsäure in der Probe in 1 μL injizierte Lösung

Gew-%P,IS

[%] proz. Anteil der Fettsäure in Bezug auf 100 mg Probeneinwaage

VF1 - X, X:X Verdünnung der Probe mit n-Hexan

VF2 - X, X:X Verdünnung der Probe mit n-Hexan

mE [mg] Probeneinwaage

Vges [μL] Injektionsvolumen

Die Gehalte der einzelnen Fettsäuren in der Probe werden als Fettsäuremethylester in [mg/100 mg]

oder [g/100 g] Probe dargestellt.

Tab. 18: Zusammensetzung des Fettsäuremusters in der Probe.

FSME AP KF mP[ng/µL] mP [mg/100 mg]

C8:0

…

C24:0


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Anhand von mP [mg/100 mg] bzw. [g/100 g] und den Gew.-% aus der 100 %-Methode kann ein Ver-

gleich der Aussagekraft der beiden Methoden sowie ein Vergleich mit den Literaturwerten erfolgen.

z.B.:

Tab. 19: Zusammensetzung des Fettsäuremusters im Vergleich.

FSME c [mg/100 mg] Gew.-%IS-Methode

Gew.-%100 %-Methode

Literaturwerte

C8:0

…

C24:0

Summe

Zur Diskussion gehört auch ein Kommentar, wenn Σ mP [mg/100 mg] stark von 100 mg abweicht.

Weitere Umesterungsmethoden (nach PARDUN und IUPAC Standard Methods):

Umesterung mit Natriummethylat in methanolischer Lösung; freie Fettsäuren werden hierbei

nicht erfasst.

Umesterung mit Schwefelsäure/Methanol: Die Umesterung erfolgt in gleicher Weise wie bei der

IR-Spektroskopie der trans-Fettsäuren. Freie Fettsäuren werden verestert.

Umesterung mit Bortrifluorid in Methanol; bei dieser Methode werden freie Fettsäuren verestert.

Vollständigkeit der Umesterung

Die Vollständigkeit der Umesterung kann mittels DC kontrolliert werden (Kaluzny et al.):

Stationäre Phase: Kieselgel

Mobile Phase: n-Hexan/Diethylether/Eisessig 90/10/1 oder 70/30/1 (beide v/v/v)

Detektion: 10 %ige Phosphormolybdänsäure


84/103

Literatur

W. Bertsch, W. G. Jennings, R. E. Kaiser (Ed.), Chromatographic Methods, Dr. Alfred Hüthig Verlag, Hei-

delberg, 1987.

H. Hadorn, K. Zürcher, Beitrag zur gaschromatographischen Analyse von Fetten und Ölen, Mitt. Gebiete

Lebensm. Unters. Hyg. 58, 351 – 384 1967.

R. Kaiser, Chromatographie in der Gasphase, Bd.1: Gas-Chromatographie, 2.Auflage und Bd.2: Kapillar-

Chromatographie - Dünnfilm- und Dünnschichtkapillar-GC, 3.Auflage, BI Wissenschafts-verlag,

Mannheim, 1973 und 1975.

M. A. Kaluzny, L.A. Duncan, M.V. Merritt, D.E. Epps, Rapid Separation of Lipid Classes in High Yield and

Purity Using Bonded Phase Columns, J. Lipid Res. 26, 135 – 140 1985.

C. Paquot, A. Hautfenne, IUPAC Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives, 7th ed.,

Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1987.

H. Pardun, Analyse der Nahrungsfette, 1.Auflage, Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, 1976.

A. Pfalzgraf, M. Timm, H. Steinhart, Gehalte von trans-Fettsäuren in Lebensmitteln, Z. Ernährungswiss.

33, 24 – 43 1994.

G. Schomburg, Gaschromatographie - Grundlagen, Praxis, Kapillartechnik, 2.Auflage, Wiley-VCH,

Weinheim, 1987.

S. W. Souci, W. Fachmann, H. Kraut, Die Zusammensetzung der Lebensmittel - Nährwert-Tabellen, 7.

Auflage, Taylor & Francis, London, 2008.

4.3.2 Gaschromatographie von Lösungsmitteln (Ethanol und Fuselalkohole)

Grundlagen

Zur Identifizierung und Quantifizierung von Lösungsmitteln bzw. Alkoholen und Lösungsmittelgemi-

schen eignet sich besonders die Gaschromatographie. Um die Lösungsmittel zunächst aus der Probe

zu isolieren erfolgt eine Destillation. Das Destillat wird anschließend min. in einer Doppelbestim-

mung gaschromatographisch analysiert. Die Auswertung erfolgt anschließend über die Methode der

Einpunktkalibrierung durch den internen Standard. Dabei wird angenommen, dass das Verhältnis

von der Konzentration direkt proportional zum Area ist.


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Geräte

Destillationsbrücke

10-µL-GC-Spritze

Kapillar-GC mit Flammenionisations-Detektor (FID) (Einführung vom Assistenten)

Chemikalien

1-Propanol

Schlifffett

Durchführung

Probe: Chinin-Alkohol-Lösung (wird vom Assistenten ausgegeben)

Probenvorbereitung

Es werden 5 g der Probe in einen 100-mL-Rundkolben eingewogen, mit 500 µL 1-Propanol als internem

Standard und ca. 20 mL dest. Wasser versetzt. Als Destillationsvorlage dient ein 25-mL-Messkolben

der im Eisbad gekühlt wird. Die Destillation gilt als beendet, wenn das Thermometer die Siedetempe-

ratur des „Schleppers“ (hier: dest. Wasser) anzeigt. Anschließend wird noch weitere 5 min destilliert

und der Messkolben abschließend ad 25 mL mit dest. Wasser aufgefüllt. Vom erhaltenen Proben-

destillat wird 1 µL in den Gaschromatographen injiziert. Es wird mindestens eine Doppelbestimmung

durchgeführt.

Gaschromatographie

GC-Bedingungen: siehe Gerät (fürs Protokoll notieren)

Je 1 µL injizieren

a) Standardgemisch, welches alle vier unten genannten Alkohole enthält und zur Identifizierung

der Probenbestandteile dient. Das Gemisch ist selbstständig anzusetzen.

b) Destillierte Proben-Lösungen (inklusive internem Standard).

Die Alkohole eluieren in folgender Reihenfolge: Methanol, Ethanol, 2-Propanol, 1-Propanol.


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Auswertung

Die in der Probe enthaltenen Alkohole werden alle mindestens in einer Doppelbestimmung über die

Methode der Einpunktkalibrierung quantifiziert.

Literatur

W. Bertsch, W. G. Jennings, R. E. Kaiser (Ed.), Chromatographic Methods, Dr. Alfred Hüthig Verlag, Hei-

delberg, 1987.

J. V. Hinshaw, A compendium of GC terms and techniques, LC-GC International 5(10), 22 – 26 1992.

R. Kaiser, Chromatographie in der Gasphase, Bd.1: Gas-Chromatographie, 2.Auflage und Bd.2: Kapillar-

Chromatographie - Dünnfilm- und Dünnschichtkapillar-GC, 3.Auflage, BI Wissenschafts-verlag,

Mannheim, 1973 und 1975.

R. Kenndler, J.F.K. Huber, Methodische Fortschritte der Gaschromatographie, In: Analytiker-Ta-

schenbuch, Bd. 8, S. 3 - 33, Springer-Verlag, Berlin, 1989.

Schomburg, G., Gaschromatographie - Grundlagen, Praxis, Kapillartechnik, 2.Auflage, Wiley VCH,

Weinheim, 1987.


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5 Allgemeine Hinweise

5.1 Sicherheit im chemischen Praktikum

Während des Praktikums wird mit unterschiedlichen Gefahrstoffen gearbeitet, von denen möglich-

erweise ein z.B. toxisches, kanzerogenes, mutagenes oder reproduktionstoxisches (KMR-Stoffe) Ge-

fährdungspotential ausgehen kann. Vor der Durchführung jedes Versuchs muss sich der Studierende

deshalb ausführlich mit möglichen Gefahren und den zu ergreifenden Schutzmaßnahmen auseinan-

dersetzen und diese während der Laborarbeit berücksichtigen. Weitere im Labor befindliche Personen

müssen ggf. in Kenntnis gesetzt werden, dass in ihrem Umfeld mit Gefahrstoffen gearbeitet wird.

Siehe dazu:

- H- und P-Sätze gemäß GHS

- Gefahrstoffverordnung

- Hausbetriebsordnung

- Laborbetriebsordnung

- Leitlinie für Tätigkeiten mit krebserzeugenden, erbgutverändernden und fortpflanzungsge-

fährdenden Stoffen (KMR-Stoffen) der Kategorie I und II im Department Chemie der Universi-

tät Hamburg

- "Sicheres Arbeiten in Laboratorien" (BGI/GUV-I 850-0)

- "Sicherheit im chemischen Hochschulpraktikum – Eine Einführung für Studierende"

(BGI/GUV-I 8553)

- „Tätigkeiten mit Gefahrstoffen an Hochschulen“ (BGI/GUV-I 8666)

- …

Die zu ergreifenden Schutzmaßnahmen umfassen das Tragen von Schutzkittel und Schutzbrille,

stand- und rutschfestem, geschlossenem Schuhwerk (generell Pflicht während der Arbeit im Labor!!!)

sowie darüber hinaus das Arbeiten unter dem Abzug und/oder das Tragen von Schutzhandschuhen.

Bei dem Umgang mit KMR-Stoffen ist vor der Arbeitsaufnahme Rücksprache mit dem betreuenden

Assistenten bzw. der betreuenden Assistentin zu nehmen.


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5.2 Entsorgung

Für die Entsorgung stehen im Praktikumsaal jeweils entsprechend beschriftete Behälter bereit:

- Andere Säuren, nitrit- / nitrathaltig:

nitrit/nitrathaltige Säuren, pH < 7, (z.B. HNO3)

nitrit/nitrathaltige Schwermetallsalzlösungen, pH < 7

- Andere Säuren

Säuren, nitratfrei, pH < 7 (z.B. HCl, H2SO4)

Schwermetallsalzlösungen, pH < 7

- Andere Basen, pH > 7

Alle in diesem Praktikum anfallenden basischen Abfalllösungen

- Halogenorganische Lösemittel (roter Kanister)

Waschflüssigkeiten und Mutterlaugen (Chloroform, Dichormethan etc., auch

Methanol)

- Andere organische Lösemittel (blauer Kanister)

Waschflüssigkeiten und Mutterlaugen

Ethanol, Aceton etc.

- Mit Chemikalien verunreinigte Glasabfälle

keine vollen Vials

- Kontaminierte Betriebsmittel

Handschuhe, Graupapier, Spritzenfilter etc.

- Hausmüll (wirklich nur Hausmüll, keine Glasabfälle, keine Handschuhe)

Die Kanister für flüssige Abfalllösungen maximal bis zur oberen Verdickung füllen und bevor sie zur

Entsorgung gebracht werden fest zudrehen!


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5.3 Hinweise zum Zitieren von Literatur (Vorschlag)

Zitieren im Text:

Literatur wird im Text durch Verweis des Autors und der Jahreszahl zitiert (s. u.). Bei einer direkten

Zitation in Anführungszeichen muss die Quelle direkt danach aufgeführt werden. Sonst empfiehlt

sich die Zitation am Ende des Satzes. Beziehen sich die Quellen auf einen gesamten Abschnitt (bspw.

in der Theorie), können diese auch am Ende zusammengefasst angegeben werden. Zitationen direkt

hinter der Überschrift sind nicht zulässig.

Die Zitation kann sowohl softwarebasiert (z.B. mit Hilfe von Endnote oder anderen gängigen Textver-

arbeitungsprogrammen) als auch manuell erfolgen.

Literaturverzeichnis:

Es müssen alle Literaturstellen in alphabetischer Reihenfolge aufgelistet werden. Dabei müssen alle

Autoren namentlich inkl. Abkürzung der Vornamen erwähnt werden. Zitiert werden Primär- und Se-

kundärliteratur; hierzu gehören Veröffentlichungen in Zeitschriften und Tagungsbänden, Patent-

schriften und Fachbücher. Internetquellen sind nur in Ausnahmefällen zulässig, wie z.B. Rezepturen,

Gefahrenhinweise oder Statistiken.

Folgende Reihenfolge ist einzuhalten:

Name des Autors/der Autoren, Titel des Artikels, Abkürzung der Zeitschrift und wenn vorhanden, die

offizielle Abteilung, Band (unterstrichen oder fett), erste und letzte Seite des Artikels, Erscheinungs-

jahr.

Es muss stets eine einheitliche Darstellung (bspw. Titel kursiv, Jahr fett) gewählt werden. Werden

mehrere Artikel eines Autors zitiert, so wird die Auflistung nach aufsteigender Jahreszahl vorgenom-

men. Werden mehrere Artikel eines Jahres zitiert, so gelten folgende Regeln: Differenzierung der

Textzitate mit einem kleinen lateinischen Buchstaben nach der Jahreszahl. Aufsteigende Reihenfolge

nach Anzahl der Autoren. Ansonsten nach aufsteigendem Datum.


90/103

Beispiel Buch oder Sammelwerk:

M. Meister, Biochemistry of the Amino Acids, Vol. II, Second Edition, Academic

Press, New York, 1965.

W. Kochen, H. Steinhart, J. Malinka, T. Simat, What can we learn from the trypto-

phan disaster? Proposal of a new strategy in drug safety. In: W. Kochen, H. Stein-

hart (ed.), L-Tryptophan – current prospects in medicine and drug safety, Walter

de Gruyter, Berlin, New York, 1994.

(Kochen et al., 1994)

beide Quellen:

(Meister, 1995; Ko-

chen et al., 1994)

Beispiel Zeitschrift:

T. Lippert, Gummibärchen – Herausforderung für die Wissenschaft, Nachr. Chem.

Tech. Lab., 44, 399-401 1996.

(Lippert, 1996)

W. Herbel, A. Montag, Bestimmung niedermolekular gebundener Purin- und Py-

rimidinbasen in Lebensmitteln nach gelchromatographischer Isolierung und

hydrolytischem Druckaufschluss, Z. Lebens. Unters. Forsch., 183, 12-17 1987.

(Herbel und Montag,

1987)

Beispiel Internet:

Bundesinstitut für Risikobewertung, Bewertung von stofflichen Rückständen in

Lebensmitteln, zu finden unter http://www.bfr.bund.de/de/bewertung_von_

stofflichen_rueckstaenden_in_lebensmitteln-431.html, Zugriff 04.03.2017, 14.30

Uhr.

(BfR, 2017)

Beispiel Rechttexte

VO (EG) 178/2002: Verordnung (EG) Nr. 178/2002 des Europäischen Parlamentes

und des Rates vom 28. Januar 2002 zur Festlegung der allgemeinen Grundsätze

und Anforderungen des Lebensmittelrechts, zur Errichtung der Europäischen Be-

hörde für Lebensmittelsicherheit und zu Festlegung von Verfahren zur Lebens-

mittelsicherheit (ABl. Nr. L 31 S. 1), zuletzt geändert durch Anh. Nr. 5 9 ÄndVO (EG)

596/2009 vom 18.6.2009 (ABl. 2009 Nr. L 188 S. 14).

(VO (EG) 178/2002)

LFGB: Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch (Lebens-

mittel- und Futtermittelgesetzbuch - LFGB) in der Fassung der Bekanntmachung

vom 22. August 2011 (BGBl. I S. 1770), zuletzt geändert durch Art. 1 Zweite ÄndVO

vom 3.8.2012 (BGBl. I S. 1708).

(LFGB)


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5.4 Hinweise zur Anfertigung von Protokollen

5.4.1 Allgemeine Formalien

- das Protokoll soll bevorzugt im Word-Format an die Assistenten fristgerecht abgesendet wer-

den, eine PDF-Version ist mit zu versenden

- Dateiname sollte Version und Namen des Studierenden enthalten, unspezifische Dateinamen

wie „protokollfinal.doc“ sind nicht zulässig

- Tabellen verfügen über Überschriften und Abbildungen über Unterschriften

- Deckblatt und Anhang sind Bestandteil des Protokolls

- Verwendung von Kopf- und Fußzeile

- Verwendung von gängigen Schriftarten wie Times New Roman, TheSans UHH oder Arial

- Schriftgröße 11 p oder 12 p

- Zeilenabstand 1,5 p

- empfohlene Seitenränder: oben/links/rechts 2,5 cm, unten 2 cm

- Verwendung von geschützten Leerzeichen zwischen Einheiten und Zahlen

- Vermeidung von Satzfehlern wie „Hurenkindern und Schusterjungen“ (einzelne Zeilen am

Seitenanfang bzw. -ende, bei Unklarheiten: Wikipedia)

- Angabe von Ergebnissen in sinnvoller Größenordnung (signifikante bzw. Nachkommastellen,

Dimension)

5.4.2 Wissenschaftliches Schreiben

klar, präzise und einheitlich

- Berücksichtigung der IUPAC-Regeln

- Berücksichtigung der botanischen Schreibweise

- Namen (-sreaktionen) in Kapitälchen

- Fremdsprachige Wörter kursiv

- Verweise stets zu den jeweiligen Abbildungen/Gleichungen/Tabellen/Kapiteln um Zusam-

menhänge zu verdeutlichen

- Einführung von Abkürzungen, bevor diese benutzt werden

Bspw. Hochleistungsflüssigchromatographie (engl.: High Performance Liquid Chromato-

graphy, HPLC)

- Einheitliche Verwendung von Abkürzungen und Ausdrücken


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bspw. nicht TCM und CHCl3 abwechseln

- statt 50 mL Kolben 50-mL-Kolben

- einheitliche Verwendung von Dezimaltrennzeichen (in deutschen Arbeiten ist kein Komma zu

empfehlen)

- verweise stets zu den jeweiligen Abbildungen/Gleichungen/Tabellen/Kapiteln um Zusam-

menhänge zu verdeutlichen

- Vermeidung der Formulierungen „problemlos“, „einwandfrei“, „keine Schwierigkeiten“ o.ä. in

der Diskussion

- kein Laborjargon

bspw. statt einrotieren/abrotieren, einengen

- mit Formulierungen wie z.B. „könnte“, vielleicht“, „möglicherweise“, „wahrscheinlich“ ver-

knüpfte Ergebnisse bzw. Schlussfolgerungen haben ohne Belege keine Aussagekraft

Tempora:

- Theorie, Warenkunde, rechtliche Einordnung und Beurteilung, Analysenplan Präsens

- Durchführung, Auswertung, Diskussion Perfekt

5.4.3 Tabellen, Abbildungen und Gleichungen

- alle drei Elemente werden mit fortlaufenden Nummern beschriftet

- Tabellen verfügen über Überschriften und Abbildungen über Unterschriften

- wenn eine Tabelle über mehrere Seiten verläuft, muss die Kopfzeile der Tabelle ebenfalls auf

der nächsten Seite übernommen werden

- bei Bildern muss stets die Quelle angegeben werden. Wurde ein Foto oder Bild modifiziert, ist

dies anzugeben (bspw. nach Bauer, 1996; modifiziert)

- bei Gleichungen empfiehlt sich eine Tabelle ohne Rahmen, um ein einheitliches Design zu er-

halten

- die verwendeten Abkürzungen/Symbole/Farben müssen in einer Legende oder in der Be-

schriftung näher erläutert werden

- die Beschriftung (Achsen, Nummerierung der DC, Legenden) in den Abbildungen und Tabellen

sollte stets die gleiche Schriftart haben wie der Fließtext. Dies gilt auch für Gleichungen die

daher nicht in der Schriftart „Cambria Math“ verfasst werden dürfen


93/103

- ob Gleichungen bzw. Variablen kursiv formatiert werden, ist Geschmacksache – auch hier gilt:

Hauptsache einheitlich

- es empfiehlt sich zunächst eine Formatvorlage zu gestalten. Dieses erleichtert ein einheitli-

ches Tabellendesign.

- ebenso ist es für die Übersicht empfehlenswert, die jeweilige Größe in der Tabellen-Kopfzeile

in eckigen Klammern anzugeben, damit Sie nicht in jeder Zeile gesondert aufgeführt werden

muss

- Abbildungen und Tabellen sollten im Fließtext erwähnt und erklärt werden

Beispiel:

TM = mnachher

mvorher ∙ 100 % (Gl. x)

Tab. 20: Bedeutung der in Gl. 2 aufgeführten Größen.

Größe Einheit Beschreibung

TM [%] Trockenmasse

mnachher [g] Auswaage

mvorher [g] Einwaage

100 % Faktor zur Umrechnung in Prozent

5.4.4 Analysenplan (Abschnitt B und C)

Der Analysenplan muss auf das betreffende Produkt ausgerichtet sein. Dies bedeutet, dass nur sinn-

volle Untersuchungen aufgeführt werden sollen. Bei der Ausformulierung sollte jede Bestimmung

begründet werden, d.h. warum dieser Bestimmungswert wichtig für die Analyse der Zusammenset-

zung ist bzw. welche Erkenntnisse über das Produkt daraus abgeleitet werden können. Dabei soll der

Bezug zur Warenkunde und rechtlichen Aspekten erkennbar sein.

Mögliche erwartete Inhaltsstoffe sowie Zusammenhänge zwischen ihnen sollen zur Verdeutlichung

bereits erwähnt werden. Es handelt sich um einen Analysenplan der gesamten Probe, sodass auch

quantitative Fragestellungen im Allgemeinen angesprochen werden müssen.


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Beispiele:

- Ist die Bestimmung des Aschegehalts oder der Trockenmasse sinnvoll?

- Ist die Verwendung von Antioxidantien in Weinbrand realistisch?

- Sind Konservierungsstoffe in wasserfreien Produkten sinnvoll?

- Was für Herausforderungen könnten sich ergeben, wenn sowohl Milch als auch Sahne in mei-

ner Probe vorliegt, wie kann man mit diesen umgehen?

- Wie sind Konservierungsstoffe zu quantifizieren?

5.4.5 Durchführung

Allgemein darf die Formulierung „s. Praktikumsskript“ nur verwendet werden, wenn wirklich alle

Schritte dementsprechend durchgeführt wurden. Abweichungen müssen stets erwähnt werden, bei-

spielsweise Einwaagen oder längere Trocknungszeiten. Das Gleiche gilt für den Ausdruck „nach § 64

Nr. (…)“.

Geräteparameter müssen vollständig erwähnt werden. Dies gilt für alle apparativen Analysen bspw.

AAS, FAES, HPLC-UV, GC-FID. Es empfiehlt sich die Darstellung in Tabellenform.

Beispiel:


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Tab. 21: Chromatographiebedingungen der Cumarin-Analyse mittels HPLC-UV.

Hersteller Agilent Technologies

Gerät G4288C - 1220 LC System VL

Detektor Variable Wavelenght Detector (VWD)

Software EZChromElite

Seriennummer DECAA00210

Säule Agilent Zorbax SB-C18

5 μm Porendurchmesser

2,1 x 150 mm

Seriennummer: USCN005508

Vorsäule C18

Eluenten A: Millipore Wasser + 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA)

B: Methanol + 0,1 % TFA

Flussrate 0,300 mL/min

Injektionsvolumen 20 μL

Detektionswellenlänge 273 nm

Lösungsmittelgradient 0 min – 50 % A, 50 % B

3 min – 20 % A, 80 % B

5 min – 0 % A, 100 % B

7 min – 50 % A, 50 % B

Durchlaufdauer 7 min

5.4.6 Umgang mit DC-Platten

Zur Auswertung der Dünnschichtchromatographie gehören allgemein verschiedene Teile:

1. Theorie (in Abschnitt B und C sehr kurz)

2. Übersicht über die Chromatographieparameter

3. Fließtext für die Zuordnung (mit Rf-Werten und abgeschätzten Gehalten)

4. Scan oder (gut erkennbares) Foto der Platte (mit Nummerierung und Laufmittelfront) im ent-

sprechenden Format (nicht gekippt o. ä.)

5. Tabelle in dem die jeweiligen Spots inkl. Rf-Werte aufgeführt sind


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Sonstige Tipps:

- um die Spots auf den Fotos bestmöglich zu erkennen, empfiehlt sich eine schnellstmögliche

Fotografie (bspw. auch während der Detektion von Zuckern – welche erscheinen zuerst, wel-

che später) und evtl. eine Kontrasterhöhung mit Hilfe eines Bildbearbeitungsprogramms oder

eine Markierung

- um Papier und Tinte zu sparen, müssen die Chromatogramme nicht immer fast seitenfüllend

abgebildet werden

- die Abschätzung des Gehaltes kann bspw. in Bezug zu dem Standard erfolgen, wobei die An-

gabe einer Berechnungsformel zu empfehlen ist

Beispiele:

Tab. 22: Chromatographiebedingungen der dünnschichtchromatographischen Analyse der Konservierungsstoffe.


Trennproblem Sorbinsäure, Benzoesäure, 4-Chlorbenzoesäure, p-Hydroxybenzoe-

säure, Methyl-4-hydroxybenzoat, Ethyl-4-hydroxybenzoat, Propyl-

4-hydroxybenzoat, Butyl-4-hydroxybenzoat, Salicylsäure, 2-Phe-

noxyethanol, 2-Phenoxypropan-2-on, Borsäure, Benzylalkohol

Stationäre Phase Kieselgel G 60 F 254

Mobile Phase Petrolether/Dichlormethan/Ameisensäure/Eisessig (50/60/8/10,

v/v/v/v)

Vergleichslösungen 0,2 % (v/v) in Aceton

Aufgabevolumen 5 µL

Detektion Betrachtung unter UV-Licht bei 254 nm (Fluoreszenzlöschung)


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Abb. 17: Borsäure und Benzylalkohol DC nach Tab. 22 (unter UV-Licht – 254 nm, Bearbeitung: Markierung und Kontrasterhöhung).

Tab. 23: Auswertung der Konservierungsstoff-DC (Borsäure, Benzylalkohol, Abb. 17).

Position Probe Rf-Wert

1 Fremdprobe -

2 Benzylalkohol 0,73

3 Borsäure 0,85

4 Probe 0,57 + 0,12

Auswertung:

„(…) Der als Ascorbinsäre identifizierte Probenspot (vgl. Abb. x) zeigt etwa die doppelte Intensität im

Vergleich zum Standard (cAscorbinsäure = 1,00 g/mol), sodass die verwendete Probenlösung eine ab-

geschätzte Konzentration von 2,00 g/mol aufweist. In der Probe wurde unter Berücksichtigung der

Probeneinwaagen (vgl. Gl. x und Tab. x) so ein abgeschätzter Gehalt von 2,0 % ermittelt werden.“


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5.4.7 Ergebnisse

Die Angabe der Ergebnisse erfolgt inkl. Standardabweichungen und Wiederfindungsraten (ebenfalls

mit Standardabweichungen), wobei auf signifikante Stellen zu achten ist.

Allgemein sollen alle im Analysenplan erwähnten Analysen durchgeführt werden. Wenn dies nicht

der Fall ist, muss eine Begründung erfolgen. Ebenso müssen die Ergebnisse von negativen Analysen

aufgeführt werden (auch wenn keine Antioxidantien analysiert werden konnten, muss dies als Ergeb-

nis festgehalten werden).

Beispiel:

In der zu untersuchenden Probe „Cola-Rum“ wurde nach Weinsäureaufschluss und STAS-OTTO-

Trennungsgang über die Methode der HPLC-UV ein Gehalt von 0,49 g ± 0,040 g in 209,33 g Probe mit

einer Wiederfindungsrate von 102,23 % ± 0,10 % bestimmt.

5.4.8 Diskussion

Allgemein handelt es sich bei der Diskussion um die Darstellung der Ergebnisse und ihrer Zuverläs-

sigkeit, Richtigkeit und Präzision. Dazu gehört stets auch die Berücksichtigung der Wiederfindungs-

raten und Standardabweichungen. Auch bei einer Wiederfindungsrate von 100 % oder einer Stan-

dardabweichung von 0 % ist eine Diskussion notwendig. Die Argumente sollen sich jedoch nicht all-

gemein auf die Methode, sondern sich auf die vorliegende, durchgeführte Analytik beziehen. Ebenso

gehört eine Einordnung der Analysenergebnisse in den Kontext der Probe zur Diskussion. Unter Zu-

hilfenahme einer Beispielrezepturen oder Literaturwerten können bspw. Erwartungen an die Probe

diskutiert werden.

Um die Diskussion nachvollziehbar zu gestalten, sind Verweise (zu Chromatogrammen, Kapiteln, Gra-

phen etc.) notwendig.

Beispiele:

- Warum ist die WDF so hoch/so niedrig?

- Was nimmt Einfluss auf mein Ergebnis?

- Kann das Ergebnis mit statistischer Sicherheit angegeben werden?

- Warum ist mein Ergebnis im Vergleich zur Literatur zu hoch/niedrig?

- Was für Faktoren haben Einfluss auf die Zusammensetzung der Probe?

- Warum sind die Signale des HPLC-UV-Chromatogramms nicht symmetrisch?


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- Warum ist die Standardabweichung so hoch?

- Sind 10 % ± 0,50 % Methanol in einem Likör zu erwarten?

- Ist die vorliegende Trockenmasse für das Lebensmittel realistisch?

- Ist es überhaupt möglich eine exakte Messung durchzuführen?

- Wie wirken sich die anderen Substanzen auf die Analyse aus?

- Woher kommt der DC-Spot auf der Antioxidantien-Platte, wenn es kein Antioxidans ist?

Abweichend zu Abschnitt A wird in Abschnitt B und C eine zusammenhängende Diskussion verfasst,

wobei zusätzlich folgenden Aspekte zu berücksichtigen sind:

Diskussion sowohl der Grundanalytik, qualitativen und quantitativen Analytik; bspw.:

Warum weicht der abgeschätzte Gehalt von der Ansage ab?

Können die Eindrücke der Sensorik bestätigt werden?

Woher kommen der pH-Wert, der Geruch und die Farbe?

Bestätigen/Widersprechen sich verschiedene Werte?

Besonderes Augenmerk auf die Zusammensetzung der Probe legen; bspw.:

Ist die Probe wirklich vegan?

Entspricht ein Gulasch ohne Paprika den Erwartungen?

Ist ein Antioxidans in der vorliegenden Probe sinnvoll?

Sind drei Konservierungsstoffe sinnvoll?

Fehlt eine charakteristische Zutat?

Gibt es evtl. gesundheitliche Risiken? Warum?

Können Zutaten verwechselt werden?

Handelt es sich wirklich um die wertgebenden Inhaltsstoffe, die der Konsument erwartet?

ggf. Methodenauswahl berücksichtigen; bspw.:

Warum wurde keine Farbstoff-DC durchgeführt?

Warum wurde Methanol mittels Photometrie und nicht mittels GC-FID analysiert


100/103

5.4.9 Rechtliche Einordnung und Beurteilung (hauptsächlich Abschnitt B und C)

Allgemein ist darauf hinzuweisen, dass die rechtliche Beurteilung nicht das Gleiche ist wie die recht-

liche Einordnung.

Bei der rechtlichen Einordnung wird festgestellt, welche rechtlichen Beurteilungsgrundlagen (bspw.

Gesetze, Verordnungen, Richtlinien, Leitsätze) bei der zu untersuchenden Probe Anwendung finden.

Es stellt sich somit z. B. zunächst die Frage, ob die vorliegende Probe ein Lebensmittel, ein Kosmeti-

kum oder ein Bedarfsgegenstand (oder ähnliches) ist. Danach wird weiter dahingehend untergliedert,

um welche Art es sich handelt.

- Lebensmittel bspw. feine Backware, Milcherzeugnis, Fleischerzeugnis

- Bedarfsgegenstand bspw. Spielware, Reinigungsmittel, Verpackung

- Kosmetikum bspw. Creme, Shampoo

Aus dieser Einordnung sowie den möglicherweise enthaltenen Inhaltsstoffen (also diejenigen, die in

dem Produkt erwartet werden können) wird ferner abgeleitet, welche weiteren Grundlagen noch gel-

ten.

Die rechtliche Beurteilung erfolgt auf Grundlage der rechtlichen Einordnung. Im Allgemeinen werden

vor allem die korrekte Kennzeichnung sowie die chemische Zusammensetzung beurteilt. Hier wird

systematisch in Hinblick auf die entsprechenden – zuvor in der rechtlichen Einordnung genannten –

rechtlichen Grundlagen/Bestimmungen die Probe bewertet. Hierbei ist wichtig, dass die entspre-

chenden Stellen stets so genau wie möglich angegeben werden.

Formulierungen:

- Sätze werden bspw. mit „gemäß“, „nach“; „im Sinne von“ oder „laut“ eingeleitet, danach folgt

Artikel/Paragraph, Absatz, Nummer, Buchstabe, Satz, Rechtsgrundlage

- im Text können Abkürzungen von Rechtsstellen direkt verwendet werden (ohne Einführung,

bei Verordnungen reicht die Nummer), da der komplette Titel im Literaturverzeichnis aufge-

führt wird

- wird auf Anhänge verwiesen, muss dies immer in Verbindung mit dem Artikel erfolgen

- Rechtstellen können in Anführungsstellen wortwörtlich zitiert werden, bei sehr langen Stel-

len können irrelevante Sachen durch (…) ersetzt werden

- Ausdrücke wie „Verkehrsfähigkeit“, „Beanstanden“ dürfen nicht verwendet werden besser

sind Formulierungen wie „entspricht/entspricht nicht den Anforderungen der Rechtstellen…“


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Beispiele:

Gemäß § 3 Abs. 1 Nr. 3 KäseV darf bei geriebenen Käse in technologisch notwendigem Umfang, höchs-

tens jedoch bis zu 3 % Kartoffelstärke als Trennungsmittel enthalten sein. In der Probe wurde ein Ge-

halt von 5 % ermittelt. Somit entspricht die vorliegende Probe nicht den Anforderungen des § 3 Abs. 1

Nr. 3 KäseV.

Nach Art. 5 i. V. m. Anhang II Teil E Nr.08.2.1 VO (EG) Nr. 1333/2008 ist Cochenillerot A in Chorizo-Wurst

mit einer Höchstmenge von 50mg/kg zugelassen. In der Probe wurde ein Gehalt von 45 mg/kg ermit-

telt. Somit werden die Anforderungen des Art. 5 i. V. m. Anhang II Teil E Nr.08.2.1 VO (EG) Nr. 1333/2008

erfüllt.

5.5 Bücherliste (Lebensmittelchemie – Hauptstudium)

Nur Vorschläge, kein Anspruch auf Vollständigkeit

1. Lebensmittelchemie

für Abschlusskolloquium:

- M. Fischer, M. Glomb, Moderne Lebensmittelchemie, 1. Auflage, Behr’s Verlag, Hamburg, 2015.

- H.-D Belitz, W. Grosch, P. Schieberle, Lehrbuch der Lebensmittelchemie, 5. Auflage, Springer

Verlag, Berlin, 2013.

(wichtig v.a. die Einzelkapitel zu Lebensmittelinhaltsstoffen; Wasser, Fette, Proteine, Kohlen-

hydrate, Mineralstoffe, Zusatzstoffe)

- G. Schwedt, Taschenatlas der Lebensmittelchemie, 2. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2005.

(nur als Repitorium, nur Kurzlehrbuch)

- W. Baltes, Lebensmittelchemie, 5. Auflage, Springer Verlag, Berlin, 2013.

- G. Eisenbrand, P. Schreier, RÖMPP Lexikon Lebensmittelchemie, 2. Auflage, Thieme Verlag,

Stuttgart, 2014.

- R. Ebermann, I. Elmadfa, Lehrbuch Lebensmittelchemie und Ernährung, 2. Auflage, Springer-

Verlag, Wien, 2011.

- W. Frede, Handbuch für Lebensmittelchemiker, 3. Auflage, Springer-Verlag, Berlin, 2010.

Themengebiet Trinkwasser:

- K. Höll, Wasser: Nutzung im Kreislauf: Hygiene, Analyse und Bewertung, 9. Auflage, De Gruy-

ter Verlag, Berlin, 2010.


102/103

Themengebiet Zusatzstoffe:

- M. Weck, H. Grote, K. Matthes, Zusatzstoffe und Enzyme, 1. Auflage, Behr’s Verlag, Hamburg,

2009.

- P. Kuhnert, Lexikon Lebensmittelzusatzstoffe: Zusatzstoffe, Enzyme, technische Hilfsstoffe,

Nahrungsergänzungsstoffe, 4. Auflage, Behr’s Verlag, Hamburg, 2014.

2. Lebensmittelanalytik

Allgemeines:

- R. Matissek, G. Steiner, M. Fischer, Lebensmittelanalytik, 5. Auflage, Springer-Verlag, Berlin,

2014. (v.a. Praktikumsbuch aber Prinzipien der Methoden auch oft wichtige Grundlagen für

die Kolloquien!)

- K. Rauscher, R. Engst, U. Freimuth, H. Bergner, Untersuchung von Lebensmitteln, 2. Ausgabe,

VEB Fachbuchverlag, Leipzig, 1986. (reines Praktikumsbuch, oft wichtig für genaue Durchfüh-

rungen, Variationsmöglichkeiten von Praktikumsskriptvorschriften, Details zu allen mögli-

chen lebensmittelanalytischen Verfahren!)

- G. Schwedt, Analytische Trennmethoden,1. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2010.

- G. Jander, K.F. Jahr, R. Martens-Menzel, G. Schulze, J. Simon, Maßanalyse, 18. Auflage, Walter

de Gruyter Verlag, Berlin, 2012.

- § 64 LFGB – Vorschriften (Achtung viele verschiedene Bände; im ersten Band Liste der ver-

schiedenen Analyten bzw. Lebensmittel) = orange Plastikordner in LC-Bibliothek

Dünnschichtchromatographie:

- E. Stahl, Dünnschicht-Chromatographie, 2. Auflage, Springer Verlag, Berlin, 2013. (reines Prak-

tikumsbuch, genaue Angaben von Fließmittelsystemen, Auswertungen und Bedingungen bei

der DC, farbige Bilder)

- L. Kraus, A. Koch, S. Hoffstetter-Kuhn, Dünnschichtchromatographie, 1. Auflage, Springer-Ver-

lag, Berlin, 2013.

- H. Jork, W. Funk, W. R. Fischer, H. Wimmer, Dünnschicht-Chromatographie: Reagenzien und

Nachweismethoden, Wiley Verlag, Weinheim, 1993. (reines Praktikumsbuch; gut zur Herstel-

lung von Detektionsmitteln, genaue Reaktions- und Selektivitätsangaben)


103/103

Gaschromatographie und HPLC:

- M.H. Gey, Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag, Berlin, 2015.

- C. Mladek, S. Kromidas, HPLC für Neueinsteiger, zu finden unter http://www.kromidas.de/Up-

loads/Dokumente/HPLCfuerNeueinsteiger.pdf, Stand 12.05.2015.

- D. A. Skoog, J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Band I, Springer-Verlag, Berlin, 2013.

- M. Otto, Analytische Chemie, 4. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2011.

- G. Schomburg, Gaschromatographie. Grundlagen – Praxis - Kapillartechnik, Wiley Verlag,

Weinheim, 1986.

Elektrophorese:

- R. Westermeier, Elektrophorese-Praktikum, Wiley-Verlag, Weinheim, 1990.

- Spektroskopische Methoden:

- M. Hesse, H. Maier, B. Zeh, Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, 7. Auflage,

Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 2011.

- K. Cammann, Instrumentelle analytische Chemie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,

2010.

- u.v.a (in der Vorlesung instrumentelle Analytik nachfragen…)

- für Grundlagen, z.B. Chromatographie, Elektrophorese etc. ist das Internet oft auch eine gute

Quelle Achtung: in Protokollen Zitat nur ungern aus dem Internet, für Grundlagenrecher-

che aber oft hilfreich!

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UNIVERSITÄT HAMBURG LEBENSMITTELCHEMISCHE PRAKTIKA · Lebensmittelchemisches Praktikum Universität Hamburg 5/103 1.2 Wasserbestimmung in Lebensmitteln nach KARL FISCHER Grundlagen