Untersuchung zur Einsetzbarkeit der Psoralen-PEO-Biotin ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/E-Diss879_Thesis.pdf · Die DNA-Microarray Technologie hat sich seit ihrer Einführung

Untersuchung zur Einsetzbarkeit

der Psoralen-PEO-Biotin Markierung

in der DNA-Microarray Technologie

für die Analyse von Starterkulturbakterien

und ihren Phagenresistenzgenen

Dissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

dem Fachbereich Biologie / Chemie

der

Universität Bremen

vorgelegt von

Michael Patrick Schmidt

Bremen 2004

1. Gutachter: Prof. Dr. Dietmar Blohm

2. Gutachter: PD Dr. Bernd Kazmierczak

Tag des Promotionskolloquiums:

02.06.2004

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG 1

1.1. Biotechnische Produktion von Milchprodukten 2 1.1.1. Genetische Ursachen von Fehlfermentationen................................................ 3 1.1.2. Phagenresistenzmechanismen bei Lactococcus lactis..................................... 4

1.2. Klassische Analyse in der milchverarbeitenden Industrie 7

1.3. DNA-Chip Technologie zur simultanen Genanalyse 7 1.3.1. Fragmentierungsmethoden ............................................................................ 10 1.3.2. Detektionsmethoden...................................................................................... 13 1.3.3. DNA-Markierungsmethoden......................................................................... 15 1.3.4. Strategien zur Signalamplifikation................................................................ 18

1.4. Ziel der Arbeit 20

2. MATERIAL UND METHODEN 22

2.1. Lösungen und Puffer 22

2.2. Medien und Stammhaltung 22 2.2.1. Anzucht von Mikroorganismen..................................................................... 22 2.2.2. Stammhaltung und Lagerung ........................................................................ 23

2.3. Probenmaterial 23 2.3.1. Starterkulturen............................................................................................... 23 2.3.2. Referenzstämme der DSMZ.......................................................................... 23

2.4. Extraktion von genomischer DNA und RNA 24

2.5. Molekularbiologische Software und Datenbanken 24

2.6. Oligonukleotide 25 2.6.1. Primerauswahl ............................................................................................... 25 2.6.2. Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene ...................................... 25 2.6.3. Sondendesign ................................................................................................ 29 2.6.4. Sonden für die Detektion von Bakterien ....................................................... 30 2.6.5. Sonden für die Detektion von Phagenresistenzgenen ................................... 31 2.6.6. Sonden und Primer für das Modellsystem .................................................... 34 2.6.7. Testen der Sondenfunktion............................................................................ 34

2.7. PCR-Amplifikation 35 2.7.1. Probenaufbereitung ....................................................................................... 35 2.7.2. Amplifizierung der Phagenresistenzgene...................................................... 35 2.7.3. Multiplex-PCR .............................................................................................. 36 2.7.4. Agarose-Gelelektrophorese........................................................................... 36 2.7.5. Einzelstrangisolierung................................................................................... 37

2.8. Fragmentierung von genomischer DNA mit Hydroxylradikalen 37 2.8.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung ................................................... 38 2.8.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung .......................................... 39

2.8.3. Optimiertes Protokoll für die Fragmentierung von genomischer DNA........ 39

2.9. Markierung von DNA 40 2.9.1. Markierung von PCR-Produkten mit Psoralen-PEO-Biotin ......................... 40 2.9.2. Kontrolle der Markierungsreaktion mittels Streptavidin-Gelshiftassay........ 41 2.9.3. Direkter Vergleich des PCR-Primer Endlabels und der Psoralen-PEO-

Biotin Markierung......................................................................................... 41 2.9.4. Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration ................................. 42 2.9.5. Markierung von genomischer DNA.............................................................. 42

2.10. DNA-Microarray Hybridisierung 43 2.10.1. Chipherstellung und Sondenpositionierung .................................................. 43 2.10.2. Hybridisierungsprotokoll .............................................................................. 43 2.10.3. Auswertung der Hybridisierung .................................................................... 44 2.10.4. Optimierung der STV-Cy5 Detektionsreaktion ............................................ 45 2.10.5. Hybridisierung gegen einen Sondengradienten............................................. 45 2.10.6. Spezifischer Nachweis von Genen mit dem DNA-Microarray..................... 45 2.10.7. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA.............. 46 2.10.8. Hybridisierungsprotokoll für genomische DNA ........................................... 47 2.10.9. Tyramid Signalamplifikation ........................................................................ 47

3. ERGEBNISSE 48

3.1. Modellsystem für die Markierungsreaktion mit Psoralen-PEO-Biotin 48 3.1.1. Test der entwickelten Primer für das Modellsystem..................................... 49 3.1.2. Hybridisierung von endmarkierten PCR-Produkten auf dem DNA-

Microarray..................................................................................................... 49 3.1.3. Kontrolle der Psoralen-PEO-Biotin Markierung mittels Streptavidin-

Gelshiftassay ................................................................................................. 51 3.1.4. Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten auf

dem DNA-Microarray ................................................................................... 52 3.1.5. Direkter Vergleich der Signalintensitäten von endmarkierter und Psoralen-

PEO-Biotin markierter DNA......................................................................... 53

3.2. Optimierung der Markierungs- und Detektionsmethode 54 3.2.1. Optimierung des Verhältnisses zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-

Base ............................................................................................................... 54 3.2.2. Optimierung der Streptavidin-Cy5 Konzentration........................................ 56 3.2.3. Optimierung der Sondenkonzentration ......................................................... 57 3.2.4. Nachweisgrenze von Psoralen-PEO-Biotin und endmarkierten PCR-

Produkten ...................................................................................................... 58

3.3. Sondendesign und Primerauswahl 60 3.3.1. Datenbankrecherche ...................................................................................... 60 3.3.2. Auswahl der Sondenoligos............................................................................ 60 3.3.3. Testen der Primerfunktion............................................................................. 61 3.3.4. Testen der Sondenfunktion............................................................................ 62

3.4. Fragmentierung von genomischer DNA 64 3.4.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung von genomischer DNA ............. 64 3.4.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung von genomischer DNA .... 65

3.5. Hybridisierung von genomischer DNA 67 3.5.1. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA.............. 67 3.5.2. Hybridisierung von genomischer DNA mit unterschiedlichen

Fragmentlängen............................................................................................. 69 3.5.3. Spezifität des Nachweissystems.................................................................... 71 3.5.4. Nachweisgrenze der rDNA-Gene bei der Hybridisierung von genomischer

DNA .............................................................................................................. 73 3.5.5. Alternativer Nachweis von Bakterien über rRNA ........................................ 74 3.5.6. Direkte Detektion von Phagenresistenzgenen in Starterkulturen.................. 75

3.6. Signalamplifikation 78 3.6.1. Multiplex-PCR für den Nachweis von Phagenresistenzgenen...................... 78 3.6.2. Signalamplifikation durch den Einsatz von TSA.......................................... 81

4. DISKUSSION 83

4.1. Parameteranalyse zur Steigerung der Sensitivität auf dem DNA-Microarray 83

4.2. Sondenauswahlverfahren für den Einsatz auf dem DNA-Microarray 91

4.3. Paralleler Nachweis von Organismen und Phagenresistenzgenen 96 4.3.1. Aspekte bei der Hybridisierung von genomischer DNA .............................. 96 4.3.2. Direkter Nachweis von Bakterien aus Reinkulturen ..................................... 97 4.3.3. Direkter Nachweis von funktionellen Genen aus biologischem

Probematerial .............................................................................................. 102 4.3.4. Methodische Aspekte zur Signal- und Targetamplifizierung ..................... 104

4.4. Ausblick 106

5. ZUSAMMENFASSUNG 108

6. LITERATUR 110

7. ANHANG 129

Abkürzungsverzeichnis

Abi Abortive Infektion

biovar. Biovariation

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin

Cy3 5,5'-Disulfo-1,1'-(γ-carbopentynyl)-3,3,3',3'-tetramethylindolo-

carbocyanin-N-hydroxysuccimidester

DMSO Dimethylsulfoxid

rDNA ribosomale Gene

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

ds doppelsträngig

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

EBI European Bioinformatics Institute

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EMBL European Molecular Biology Laboratory

FISH Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung

gDNA genomische DNA

G+C Mol% Guanin und Cytosin

L. Lactococcus

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD optische Dichte

PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

PEO Polyethylenoxid

PMT Photomultiplier

rRNA RNA der ribosomalen Gene

rpm Runden pro Minute

ss einzelsträngig

SDS Natriumdodecylsulfat

SNP Single nucleotide polymorphism

STV Streptavidin

TSA Tyramid Signalamplifikation

ÜN über Nacht

1. Einleitung 1

1. Einleitung

Die DNA-Microarray Technologie hat sich seit ihrer Einführung in den frühen neunziger

Jahren zu einer der wichtigsten Methoden für die simultane Gen-Analyse entwickelt, die auf

dem Prinzip der reversen Hybridisierung beruht. In diesem Hybridisierungsformat werden

oberflächenimmobilisierte Sonden für das spezifische „Einfangen“ von Zielmolekülen

eingesetzt. Durch die hohe Anzahl von heutzutage weit über hunderttausend Sonden pro cm2

auf einem Chip wird eine hochparallele Datenanalyse ermöglicht. Die DNA-Microarray

Technologie wird mittlerweile in vielen Forschungsbereichen von der Identifikation von

Organismen (Zhou, 2003), SNP-Detektion (Guo et al., 1994), „Sequencing by Hybridization“

(Eickhoff et al., 1996), Populationsgenetik (Chakravarti, 1999), Proteomics (Blagoev and

Pandey, 2001; Templin et al., 2002), Genomics (Schoolnik, 2002) und der

Krankheitsdiagnose (Howbrook et al., 2003) eingesetzt, welches sich in der Anzahl von über

4000 Publikationen widerspiegelt (November 2003, NCBI).

Neuere Ansätze versuchen, neben den erwähnten Bereichen der angewandten Forschung,

auch industriellen Anforderungen gerecht zu werden. Dabei stellt die Überwachung der

Produktqualität von Lebensmitteln eine der möglichen industriellen Anwendungen der DNA-

Microarrays dar (Blohm and Guiseppi-Elie, 2001; Howbrook et al., 2003). Vor allem in den

Bereichen, in denen Bakterien zur biotechnischen Fermentation von Nahrungsmitteln

eingesetzt werden, ist es das Ziel des Produzenten, hochwertige Produkte in einem beliebig

langen Zeitraum unverändert anbieten zu können. Eine Überwachung der Produktqualität ist

durch die vorgeschriebene mehrtägige Lagerungsfrist mit hohen Lager- und Personalkosten

verbunden und könnte durch die wesentlich kostengünstigere Chip-Technologie ergänzt und

langfristig ersetzt werden.

Im Blickpunkt dieser Arbeit steht die Anwendung von DNA-Microarrays für die

Untersuchung von Starterkulturbakterien und ihren Phagenresistenzgenen in der

Milchanalytik, da bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten Fehlfermentationen

auftreten, die unterschiedliche Ursachen haben können. In der Folge sollen zunächst

Grundlagen und Probleme bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten aufgezeigt

werden. Es schließt sich dann eine nähere Betrachtung der DNA-Microarray Technologie an –

von ihren Ursprüngen, über gängige Anwendungen bis hin zu den besonderen Anforderungen,

die sich für die Beantwortung dieser komplexen Fragestellungen ergeben.

1. Einleitung 2

1.1. Biotechnische Produktion von Milchprodukten

In der Bundesrepublik Deutschland wurden im Jahr 2002 29,4 Mio. t Milch an Molkereien

geliefert. Durch Fermentation wurden daraus 41.100 t Sauermilch- und Kefirerzeugnisse,

34.500 t Joghurt, 451.200 t Frischkäse, 43.500 t Sauermilchquark und 1.505.500 t Käse

hergestellt (Jahresbericht der Milchwirtschaft, 2002).

Für die Herstellung dieser Milchprodukte werden vorrangig Milchsäurebakterien der Gattung

Lactobacillus, Lactococcus und Leuconostoc eingesetzt (Daly et al., 1996). Sie bilden

Milchsäure aus Lactose. Durch die Freisetzung des Lactats und die damit verbundene

Ansäuerung der Milch koaguliert das Casein, es kommt am isoelektrischen Punkt des

Milchproteins bei einem pH-Wert von 4,7 zur Dicklegung der Milch. Die Milchsäure und

andere freigesetzte Stoffwechselprodukte wie Wasserstoffperoxid, organische Säuren und

Bacteriocine wirken antagonistisch auf saprophytische oder pathogene Bakterien und

verbessern dadurch die Haltbarkeit des Produkts. Stoffwechselnebenprodukte, wie Diacetyl

und Acetaldehyd, die aus dem Citratstoffwechsel stammen, sind charakteristische

Aromakomponenten der verschiedenen Milchprodukte (Ramos et al., 1994).

Die Fähigkeit von Mikroorganismen, die in der Milch enthaltenen Rohstoffe in

Stoffwechselprodukte mit neuem Geschmack oder anderer Konsistenz umzubauen, erlaubt es

heute einem ganzen Industriezweig, das Ausgangsprodukt Milch mit Hilfe von Starterkulturen

zu veredeln. Starterkulturen sind aufgrund spezifischer Eigenschaften selektierte, definierte

und lebensfähige Mikroorganismen in Reinkultur oder Mischkultur. Sie werden

Lebensmitteln in der Absicht zugesetzt, das Aussehen, den Geruch und Geschmack und die

Haltbarkeit zu verbessern (Weber, 1996). In vielen Bereichen der Lebensmittelindustrie hat

die Anwendung von Starterkulturen inzwischen einen festen Platz. Zu nennen ist z.B. die

Nutzung der alkoholischen Gärung von Reinzuchthefen bei der Herstellung von Bier und

Wein. Weiterhin werden bei der milchsauren Vergärung von Sauerkraut, Obst- und

Gemüsesaft Starterkulturen mit definierter Zusammensetzung verwendet (Weber, 1996).

Je nach Temperaturoptimum der in der Starterkultur enthaltenen Bakterien unterscheidet man

mesophile (Temperaturoptimum bei 22 bis 30°C) und thermophile Kulturen, deren optimale

Wachstumstemperatur bei 38 bis 45°C liegt (Cogan and Accolas, 1996). Die Starterkulturen

können sich aus einem einzigen Stamm (single strain starter cultures), mehreren Stämmen der

gleichen Bakterienspezies (single species, multiple strain starter cultures) oder aus mehreren

verschiedenen Spezies (multiple species starter cultures) zusammensetzen. In der

Milchwirtschaft werden mesophile Säuerungskulturen vor allem für die Rahmsäuerung und

1. Einleitung 3

die Herstellung von Frisch-, Schnitt- und Weichkäse sowie Dickmilch eingesetzt.

Starterkulturen mit thermophilen Milchsäurebakterien, zu denen die Bakterien Streptococcus

salivarius ssp. thermophilus, Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus, Lactobacillus

helveticus und Lactobacillus delbrückii ssp. lactis angehören, werden für die Produktion von

Hartkäse, Butterkäse, Joghurt und Sauermilchquark benötigt. Bei der Herstellung von

Speisequark werden undefinierte, mesophile Kulturen eingesetzt, die aus homofermentativen

Stämmen der Gattung Lactococcus (L. lactis ssp. lactis, L. lactis. ssp. cremoris, L. lactis. ssp.

lactis biovar. diacetylactis) und aus dem heterofermentativen Stamm Leuconostoc

mesenteroides ssp. cremoris zusammengesetzt sind. Während die homofermentativen Stämme

der Gattung Lactococcus hauptsächlich für die Säuerung zuständig sind, bilden L. lactis. ssp.

lactis biovar. diacetylactis und der heterofermentative Leuconostoc-Stamm die wichtigen

Aromakomponenten Diacetyl und Acetoin (Weber, 1996; Siezen et al., 2002).

1.1.1. Genetische Ursachen von Fehlfermentationen

Bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten kann es zu Säuerungsstörungen der

Fermentation kommen, die unterschiedliche Ursachen haben können. 70-80 % aller

Produktionsstörungen während einer Fermentation werden durch Phagen verursacht (Hunger,

1986), die durch unzureichende Desinfektion der Fermenter in die Produktionstanks gelangen

(Riemelt, 1986). Die anschließende selektive Lyse von Starterkulturspezies führt zu

Säuerungsstörungen und kann zu kompletten Produktionsausfällen führen (Klaenhammer and

Fitzgerald, 1994). Aber auch bakterielle Verunreinigungen können die in der Starterkultur

enthaltenen Mikroorganismen verdrängen und so die Organismenzusammensetzung während

einer Fermentation verschieben. Aus diesem Grund wird die Milch nicht mehr zum

gewünschten Produkt umgesetzt. Außerdem können die Phagenresistenzgene, die bei der

Gattung Lactococcus zu 95% Plasmid-codiert sind (Siezen et al., 2002), bei Verlust dieser

extrachromosomalen DNA nicht mehr exprimiert werden. Die Abwehr gegen Phagen ist in

diesem Fall begrenzt und kann zur selektiven Lyse der Milchsäurebakterien führen. Durch die

Minimierung der Anzahl der an der Fermentation beteiligten Milchsäurebakterien, wird die

Säuerungsaktivität reduziert oder kommt vollständig zum Erliegen.

1. Einleitung 4

1.1.2. Phagenresistenzmechanismen bei Lactococcus lactis

Die Starterkulturbakterien können auf die ständige Bedrohung der Bakteriophagen durch

verschiedene Verteidigungsmechanismen reagieren (Forde and Fitzgerald, 1999). Abhängig

davon, in welcher Infektionsphase die Abwehr erfolgt (siehe Abb. 1), werden die

Phagenresistenzgene in vier Gruppen unterteilt (Hill, 1993; Garvey et al., 1995b; Allison and

Klaenhammer, 1998).

Abb. 1. Phagenresistenzmechanismen bei Lactococcus spec. (Glöckner, 2002) I Verhinderung der Phagenadsorption II Blockierung der DNA-Penetration III Restriktion der Phagen-DNA IV Abortive Phageninfektion – Inhibition des Phagenzusammenbaus

Gene der Gruppe I und II beeinflussen das Eindringen der Phagen-DNA in das Bakterium.

Entweder wird die Adsorption des Phagen an die Bakterienhülle verhindert (Forde and

Fitzgerald, 1999) oder die Injektion der Phagen-DNA wird blockiert (Geller et al., 1993). Bis

heute konnte nur jeweils ein Gen für diese Art der Phagenresistenz identifiziert werden (siehe

Tab. 1).

Die auf Restriktion und Modifikation basierenden Abwehrmechanismen (R/M-Systeme) der

Gruppe III werden aufgrund der Struktur ihrer Untereinheiten, der Sequenzerkennung, der

Position der Schnittstelle und des Bedarfs an Cofaktoren in 3 Typen klassifiziert (Siezen et

al., 2002). Die Restriktion wirkt nicht gezielt gegen Phagen-DNA, sondern erkennt Fremd-

DNA aufgrund von Basen-Methylierungen, die nicht dem für die Bakterienzelle typischen

Muster entsprechen. Die zellfremde DNA wird geschnitten und abgebaut. Zu den am

weitesten verbreiteten Abwehrmechanismen des R/M-Systems gehören die Gene des Typ II,

von denen bei der Gattung Lactococcus bisher 8 verschiedene identifiziert werden konnten

(siehe Tab. 1).

Die vierte Gruppe der Phagenresistenzgene wird unter dem Begriff „Abortive

Phageninfektion“ zusammengefasst (abi-Gene, siehe Tab. 1). Es konnten bisher 21

verschiedene abortive Phageninfektionsgene in Lactococcus lactis nachgewiesen werden, die

XXXX XXXX XX

I II III IV

1. Einleitung 5

die Replikation, die Transkription, die Translation und die Verpackung der Phagen-DNA ins

Capsid durch unterschiedliche Mechanismen unterbinden (Siezen et al., 2002). Wie aus der

Tab. 1 hervorgeht, beschränkt sich die durch abi-Gene vermittelte Resistenz nicht nur auf

einzelne Phagen, sondern gilt, soweit getestet, für mehrere Phagen der gleichen Spezies.

Da die bis jetzt gefundenen Resistenzgene unterschiedliche Abwehrmechanismen auslösen

können, sollten Starterkulturen über ein breites Spektrum von Phagenresistenzgenen verfügen,

um sich effektiv vor einer Phagen-Infektion schützen zu können. Durch die Kombination der

Resistenzgene mit unterschiedlicher Phagenspezifität wird zusätzlich ein Schutz vor einer

Vielzahl von Phagen gewährleistet (Siezen et al., 2002). Die Auswahl der Starterkulturen, die

ein breites Spektrum von Phagenresistenzgenen besitzen und so zu einer stabilen

Fermentation beitragen können, kam bisher in der Milch-Industrie nicht zur Anwendung.

Gen kodiert auf

Stamm Resistenz gegen

Mechanismus Literatur

Inhibition der Phagenadsorption:

ads pCI858 L.l.c. H20 936: 712 c6A: c2

Interaktion beim Anheften der Phagen

(Forde and Fitzgerald, 1999)

Blockierung der DNA-Injektion:

pip Chr L.l.l. C2 c6A: c2 verhindert die DNA-Injektion

(Geller et al., 1993)

DNA-Restriktion:

lldI pIL2614 L.l.l. Il1403 Fremd-DNA RM Typ I (Schouler et al., 1998)

lla1403 Chr L.l.l. IL1403 Fremd-DNA RM Typ I (Schouler et al., 1998b)

scrFI Chr L.l.c. UC503 Fremd-DNA 5'-CC↓NGG-3'

RM Typ II (Davis et al., 1993)

llaI pTR2030 L.l.l. ME2 Fremd-DNA 5'-CC↓WGG-3'

RM Typ II (O'Sullivan et al., 1995)

llaII pSRQ700 L.l.c. DCH-4 Fremd-DNA 5'-↓GATC-3'

RM Typ II (Moineau et al., 1995)

llaBI pJW563 L.l.c. W56 Fremd-DNA 5'-C↓TRYAG-3'

RM Typ II (Nyengaard et al., 1996)

llaBII pJW565 L.l.c. W56 Fremd-DNA RM Typ II (Nellermann et al., 1997)

llaCI pAW153 L.l.c. W15 Fremd-DNA 5'-AA↓GCTT-3'

RM Typ II (Madsen and Josephsen, 1998a)

llaDII pHW393 L.l.c. W39 Fremd-DNA 5'-GC↓NGC-3'

RM Typ II (Madsen and Josephsen, 1998b)

llaKR2I pKR223 L.l.l. diacetyl KR2 Fremd-DNA 5'-↓GATC-3'

RM Typ II (Twomey et al., 1998)

llaFI pND801 L.l.c. LL42-1 Fremd-DNA RM Typ III (Su et al., 1999)

1. Einleitung 6

Abortive Phageninfektion:

abiA pCI750, pTR2030, pCI829

L.l.l. ME2 936: sk1, 712 P335: φ31, ul36, φ48, φ50 c6A: c2

stört die Phagen-DNA-Replikation (Dinsmore and Klaenhammer, 1997)

abiB pIL2101 L.l.l. IL416 936: bIL170, nicht bIL41 Degradation des Phagen-transkripts (RNase-Aktivität)

(Cluzel et al., 1991)

abiC pTN20 L.l.l. ME2 936: sk1, jj50, P2 P335: ul36 c6A: c2

geringere Synthese von Phagen- Strukturproteinen

(Durmaz et al., 1992)

abiD pBF61 L.l.l. KR5 936: sk1 c6A: c2

Interaktion mit der Phagen-DNA (McLandsborough et al., 1995)

abiD1 pIL105 L.l.l. IL1403 936: bIL66, bIL170 c6A: c6A, bIL67

Interaktion mit Phagen-Gen-produkt, keine Translation der Phagen-RNA

(Anba et al., 1995)

abiE pNP40 L.l.l. diacetyl DRC3

936: φ712 Interferrenz bei der Phagenentwicklung in der späten lytischen Phase

(Garvey et al., 1995a)

abiF pNP40 L.l.l. diacetyl DRC3

936: φ712 c6A: φc2

verhindert die Phagenreplikation (Garvey et al., 1997)

abiG pCI750 L.l.c. UC653 936: φ712 c6A: φc2

stört die Synthese der Phagen-RNA in der späten lytischen Phase

(O'Connor et al., 1996)

abiH Chr L.l.l. diacetyl S94

936: φ59 c6A: φ53 (pr)

Mechanismus unbekannt (Prevots et al., 1996)

abiI pND852 L.l.l. M138 936: φ712 c6A: φc2

Mechanismus unbekannt (Su et al., 1997)

abiK pSRQ800 L.l.l. W1 936: p2, sk1, jj50 P335: ul36, Q30, Q33

Interaktion bei der Reifung der konkatemeren Phagen-DNA

(Emond et al., 1997)

abiL pND861 L.l.l. diacetyl LD10-1

936: φ712 c6A: φc2

posttranskriptionale Störung des lytischen Zyklus

(Deng et al., 1999)

abiM pND859 L.l.l. diacetyl UK12922

936: 712 Interaktion mit der Phagen-DNA (Deng et al., 1997)

abiN Chr L.l.c. S114 936: φ59 c6A: φ53

Mechanismus unbekannt (Prevots et al., 1998)

abiO pPF144 - 936: φ59 c6A: φ53

Mechanismus unbekannt (Prevots and Ritzenthaler, 1998)

abiP pIL2614 L.l.l. IL1403 nicht bestimmt Mechanismus unbekannt (Portugal et al., 1998)

abiQ pSRQ900

L.l. W37 936: p2 c6A: c21

konkatemere Phagen-DNA kann nicht mehr verpackt werden

(Emond et al., 1998)

abiR pKR223 L.l.l. diacetyl KR2

c2 stört die Phagen-DNA-Replikation (Twomey et al., 2000)

abiS pAW601 L.l.l. W60 nicht bestimmt Mechanismus unbekannt (Matvienko et al., 2001)

abiT pED1 L.l. W51 936: p2, p2k, sk1, jj50 P335: ul36, Q30, φ31, φ50

stört die Phagen-DNA-Replikation und die Phagen-DNA-Verpackung ins Capsid

(Bouchard et al., 2002)

abiU pND001 L.l.l. LL51-1 c2: φc2 936: φ712 P335: φul36

Stört die Synthese der Phagen-RNA

(Dai et al., 2001)

Tab. 1. Phagenresistenzgene bei Lactococcus lactis: Verhinderung der Adsorption des Phagens, Blockade der DNA-Injektion, Restriktion der Phagen-DNA und abortive Phageninfektion.

1. Einleitung 7

1.2. Klassische Analyse in der milchverarbeitenden Industrie

Um die mikrobiologische Qualität in der milchverarbeitenden Industrie zu gewährleisten,

stehen eine Reihe von Standardtechniken für die Untersuchung und Charakterisierung von

Milchprodukten zur Verfügung. In der Produktionsroutine wird dabei zumeist noch auf die

Methoden der klassischen Mikrobiologie zurückgegriffen (Glöckner, 2002). Die

Organismenidentifizierung erfolgt nach zum Teil mehrtägiger Kultivierung auf

Differenzierungsmedien. Neuere Ansätze beruhen auf molekularbiologischen Methoden, die

hinsichtlich ihrer Genauigkeit, Nachweisgrenze und dem benötigten Zeitaufwand stetig

verbessert werden. Es stehen eine Reihe von molekularbiologischen Nachweisverfahren zur

Organismenidentifizierung zur Verfügung, wie z.B. Restriktionsfragmentlängen-

Polymorphismus (Ramos and Harlander, 1990), „Randomly amplified polymorphic DNA

PCR“ (Cocconcelli et al., 1995), „Amplified Ribosomal DNA Retriction Analysis“ (Ward et

al., 1998) oder Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (Amann et al., 1997). Deren Verwendung

ist in den milchverarbeitenden Betrieben noch sehr eingeschränkt, da für komplexe

Fragestellungen eine Vielzahl von Methoden parallel zum Einsatz kommen würden (Keer and

Birch, 2003).

1.3. DNA-Chip Technologie zur simultanen Genanalyse

Eine viel versprechende Methode, die eine simultane Analyse von fermentationsrelevanten

Organismen, Phagen und Phagenresistenzgenen ermöglichen könnte, ist die DNA-Chip oder

DNA-Microarray Technologie, die auf dem molekularbiologischen Prinzip der „reversen“

Hybridisierung beruht. Sie ermöglicht eine sensitive und hochparallele DNA-Analytik von

tausenden von Genen auf einem DNA-Chip (Lander, 1999).

Ursprünglich für die de novo-Sequenzierung genomischer DNA-Fragmente konzipiert (Bains

and Smith, 1988; Drmanac et al., 1989; Khrapko et al., 1989; Saiki et al., 1989), fand das

Hybridisierungsformat in der Folge eine Vielzahl von weiteren Anwendungsgebieten.

Mittlerweile werden die DNA-Microarrays – wie sie in Folge bezeichnet werden - verwendet,

um die komplette Genexpression von Zellen zu analysieren (Chuang et al., 1993). Parallel zur

Analyse der Genexpression hat sich der Microarray im letzten Jahrzehnt zu einer sehr

effektiven Methode entwickelt, um biologisches Probenmaterial untersuchen zu können

(Ehrmann et al., 1994).

Der DNA-Microarray selber besteht aus einer systematischen Anordnung von Sonden auf

einer festen Trägeroberfläche. Er besitzt eine Fläche von wenigen Quadratzentimetern und

1. Einleitung 8

kann aus mehreren Arrays bestehen. Heute existieren zwei grundsätzliche Formen von DNA-

Microarrays, die entweder durch die Verwendung von längeren PCR-Produkten (100 bis etwa

2500 Nukleotide) als Sonden charakterisiert sind oder auf dem Einsatz von kürzeren

synthetischen Oligonukleotiden (<10 Nukleotide bis 70mere) beruhen (Strothmann, 1999).

Poly- oder Oligonukleotidsonden werden je nach Fragestellung eingesetzt. Ein Vorteil der

Oligonukleotid-Arrays besteht darin, dass durch die kurzen Sondensequenzen

Kreuzhydridisierungen mit ähnlichen Sequenzen minimiert werden können. Hierdurch wird

die Spezifität der Hybridisierung erhöht, da einzelne Basen-Fehlpaarungen das Gleichgewicht

der Hybridisierung stärker beeinflussen. Die Detektion von „perfect match“ und „mismatch“

wird so erst möglich (Guo et al., 1994; Hacia et al., 1996; Urakawa et al., 2003).

Die Sonden werden auf ihre Matrix, entweder Nylon, Glas, Silica, Gold oder Silizium

aufgebracht. Nylon und Glas werden als Trägermedium aufgrund ihrer einfachen Herstellung

und den geringen Kosten bevorzugt (Blohm and Niemeyer, 1999; Cheung et al., 1999;

Pirrung, 2002). Insbesondere Glas ermöglicht eine effektive kovalente Bindung der Sonden

(Li et al., 2002). Eine Vielzahl von Studien beschäftigt sich ausschließlich mit der

Optimierung der genutzten Oberflächen (Beier and Hoheisel, 1999; Benters et al., 2001; Diehl

et al., 2001).

DNA-Microarrays unterscheiden sich von klassischen Hybridisierungsansätzen durch eine

erheblich höhere Dichte der immobilisierten Fängersonden. Bis zu 1.000.000 verschiedene

Oligonukleotidsonden können mittlerweile auf DNA-Microarrays aufgebracht werden.

Verfahren für die Generierung von abgegrenzten Feldern (spots) aus verschiedenen

Fängeroligonukleotiden im µm-Bereich waren dafür unabdingbar. Einen Meilenstein stellte

diesbezüglich die Einführung von Techniken für die hochaufgelöste „on-chip“-Synthese von

organischen Oligomeren dar, einem ursprünglich für Peptidsynthese konzipierten Verfahren

(Fodor et al., 1991; Maskos and Southern, 1992; Lipshutz et al., 1999). Fodor et al. adaptierte

hierfür photolithographische Maskierungstechniken aus der Halbleiterproduktion (Fodor et

al., 1991). Alternativ können die Sonden auch enzymatisch und chemisch synthetisiert und

mit automatisierbaren Dispenser- und Plotter-Systemen auf chemisch aktivierten Glasträgern

kovalent immobilisieren werden (Lipshutz et al., 1999). Die Sonden werden durch

„Spotting“-Roboter auf die Oberfläche des Arrays aufgebracht, in einem kontaktfreien

Verfahren durch Piezo- oder Ink-Jet-Systeme oder mit Hilfe von Stahlnadeln, die bei

Oberflächenkontakt kleinste Volumina ablegen. Bedingt durch steuerungstechnische Grenzen,

können nur mittlere Sondendichten erzielt werden.

1. Einleitung 9

Die Sondenauswahl erfolgt anhand der zur Verfügung stehenden Gensequenzen des zu

detektierenden Gens oder Organismus. Durch eine Datenbankrecherche in einer

Nukleotiddatenbank, wie z.B. der des „National Center for Biotechnology Information“

(NCBI), werden unter Betrachtung von eventuellen Redundanzen, Sequenzen für die zu

untersuchenden Gene zusammengestellt. Liegen die Sequenzen nicht vor, müssen die

entsprechenden Gene sequenziert werden. Durch ein multiples Alignment, das durch den

ClustalW-Algorithmus erstellt werden kann, können konservierte bzw. nicht konservierte

Bereiche der Sequenzen gefunden werden (Thompson et al., 1994). Die Sonden werden dann

mit bioinformatischen Programmen aus den Sequenzinformationen generiert. Dabei können

Parameter festgelegt werden, die den Ausschluss von Oligonukleotiden mit Hang zur Bildung

von inter- und intramolekularen Wechselwirkungen oder unerwünschten Schmelz-

temperaturen ermöglichen. Mittlerweile gibt es eine Vielzahl von kommerziellen Software-

Programmen, wie z.B. DNA-Star, Oligo6, Omega, Jellyfish, ARB etc., die diese Auswahl

ermöglichen. Die Spezifität und Funktionstüchtigkeit der Sonden muss aber bei allen

Programmen durch biologische Experimente validiert werden, da noch nicht alle

Hybridisierungsparameter vollständig und korrekt am Computer simuliert werden können

(Matveeva et al., 2003).

Für die simultane Genanalyse wird die zu untersuchende Probe auf dem DNA-Microarray

hybridisiert, hierbei kann es sich um PCR-Produkte, cDNA, rRNA oder genomische DNA

handeln. Die Detektion der Hybridisierung kann schließlich über markierungsfreie oder

markierungsabhängige Methoden erfolgen (siehe 1.3.2). In den meisten Fällen wird die Ziel-

DNA mit einem Farbstoff gekoppelt (siehe 1.3.3) und die Hybridisierungsergebnisse mit

einem Scanner quantifiziert.

Zu den gängigen Anwendungen der DNA-Microarray Technologie zählen die Vergleiche von

Expressionsmustern, der Nachweis von DNA-Sequenzvarianten und die Detektion von

Organismen. Die vergleichende Studie der Expressionsmuster zweier Proben wird über eine

Zweifarbenhybridisierung ermöglicht. Die in cDNA umgeschriebene RNA der Proben wird

hierfür mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert und gegen ausgewählte Sonden

hybridisiert. Auf diese Weise können Unterschiede in der Genexpression identifiziert werden

(Schena et al., 1995; Salin et al., 2002). Die Bestimmung von Ähnlichkeiten ganzer Genome

und Genomabschnitte über die Markierung von genomischer DNA ist ebenfalls möglich

(Behr et al., 1999; Salama et al., 2000; Gill et al., 2002; Schoolnik, 2002; Zhou, 2003).

Weiterhin spielt die Detektion von DNA-Sequenzvarianten in der klinischen Diagnostik eine

immer größer werdende Rolle, wie. z.B. der Nachweis von Punktmutationen (single

1. Einleitung 10

nucleotide polymorphisms, SNP’s), die mittlerweile durch die Microarray Technologie

ermittelt werden können (Guo et al., 1994). Der Nachweis von pathogen Bakterien und

Untersuchungen zur Organismenzusammensetzung in unbekannten Umweltproben ist ein

weiteres Forschungsgebiet (Wu et al., 2001; Ye et al., 2001; Call et al., 2003). Der spezifische

Nachweis von Organismen erfolgt derzeit meist über die Hybridisierung von amplifizierter

rRNA (Guschin et al., 1997; Small et al., 2001; Loy et al., 2002; Wilson et al., 2002) und in

einigen neueren Studien auch ohne deren Amplifizierung (Bavykin et al., 2001; El Fantroussi

et al., 2003; Peplies, 2003). Aber auch genomische DNA kann als Probenmaterial für die

Untersuchung auf dem DNA-Microarray eingesetzt werden (Ye et al., 2001). Der Nachweis

von rDNA (Cho and Tiedje, 2001; Borucki et al., 2003; Call et al., 2003) und weiteren

funktionellen Genen über genomische DNA gelang aber bisher nur mit vorheriger

Amplifikation des Probenmaterials (Ye et al., 2001; Schoolnik, 2002; Zhou and Thompson,

2002; Zhou, 2003). Die Amplifikation ist notwendig, da eine Anreicherung von genetischen

Elementen, wie sie im Falle der rRNA, die bis zu 98 % der Gesamt-RNA eines Organismus

darstellt, im Genom nicht vorkommen (Schoolnik, 2002). Der direkte Nachweis von Genen

wird daher einerseits durch die Komplexität der Zielmolekülfindung bei der Hybridisierung

von Genomen erschwert und anderseits durch die zu geringe Anzahl von Zielmolekülen

beeinträchtigt. Diese Schwierigkeit wird bei der Untersuchung der Expression von Zellen sehr

deutlich, da der Nachweis der mRNA mit dem DNA-Microarray ohne die Amplifikation über

die RT-PCR bisher nicht gelang (Ye et al., 2001). Ein weiterer Grund ist die zu geringe

Stabilität der mRNA-Moleküle für den direkten Nachweis (Schoolnik, 2002), der durch den

Einsatz von genomischer DNA umgangen werden könnte, da genomische DNA sehr stabil ist

und so der experimentelle Aufwand reduziert werden kann (Wu et al., 2001; Cho and Tiedje,

2002). Die Detektion von funktionellen Genen auf DNA-Ebene könnte demnach durch die

Erhöhung der Sensitivität erreicht werden und wird in dieser Arbeit für den direkten

Nachweis von Genen über gDNA untersucht.

1.3.1. Fragmentierungsmethoden

Wie in dem vorherigen Kapitel erwähnt, kann es sich bei der Untersuchung von Proben im

„reversen“ Hybridisierungsformat um PCR-Produkte, cDNA, rRNA oder genomische DNA

handeln (Wetmur, 1991). Für eine Vielzahl von DNA-Microarray Anwendungen werden

PCR- bzw. RT-PCR Produkte für die Hybridisierung verwendet, um spezifische Gene

nachzuweisen oder die Genexpression untersuchen zu können (Ye et al., 2001).

1. Einleitung 11

Für den direkten Nachweis von genomischer DNA muss diese, im Gegensatz zu PCR-

Produkten, aufgrund ihrer Größe in hybridisierbare Fragmente zerkleinert werden, da die

Sondenzugänglichkeit durch die ausgeprägten dreidimensionalen Strukturen der gDNA

stärker eingeschränkt ist (Kelly et al., 2002). In der vorliegenden Arbeit wird eine

sequenzunabhängige Zerkleinerung der gDNA bevorzugt, da die sichere Vorhersage von

Sekundärstrukturfaltungen bei mehreren hundert bp langen Fragmenten noch immer ein

ungelöstes bioinformatisches Problem darstellt. Somit kann die Faltung der Ziel-DNA nur

bedingt beim Sondendesign berücksichtigt werden. Die unspezifische Fragmentierung bietet

den Vorteil von variablen Sekundärstrukturfaltungen und damit variabler

Sondenzugänglichkeit, die sich positiv auf die Hybridisierungseffizienz auswirken kann

(Kelly et al., 2002).

Eine Vielzahl von Methoden stehen zur Fragmentierung von DNA zur Verfügung, die sich in

drei unterschiedliche Kategorien unterteilen lassen: enzymatische, mechanische oder

chemische Fragmentierung von Nukleinsäuren (Sambrook et al., 1989).

Die Verwendung von enzymatischen Verfahren eignet sich nur bedingt zur

sequenzunabhängigen Fragmentierung von gDNA, da Restriktionsenzyme eine vorgegebene

spezifische Erkennungssequenz besitzen (Zhang et al., 2001). Durch einen gleichzeitigen und

partiellen Verdau mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen kann eine zufällige

Zerkleinerung aber ermöglicht werden. Die enzymatische Fragmentierung durch die

Restriktionsendonuklease DNase I, die in Gegenwart von hohen Mn2+ Konzentrationen

Doppelstrangbrüche induziert, ist nur bedingt möglich, da dessen Einsatz, zu nicht

reproduzierbaren Ergebnissen führt (Sambrook et al., 1989; Zhang et al., 2001).

Die mechanische Fragmentierung beruht auf dem Prinzip der Zerkleinerung der DNA durch

Scher-Kräfte. Die Scherung kann durch Ultraschall oder Druck, der durch die Pressung der

DNA in kleine Öffnung erzeugt wird, erfolgen. Das Scheren der DNA mit Hilfe einer Spritze

führt aber nur zu einer schwachen Fragmentierung und zu keiner Bevorzugung eines

Größenbereichs (Hengen, 1997). Beim Scheren mit Ultraschall wird die DNA zum

Schwingen angeregt und zerbricht dabei in Abhängigkeit von der Schallmenge und Zeitdauer

zufällig in kleinere Stücke (Deininger, 1983). Sie besitzt den Nachteil des Materialaufwandes,

da eine sehr kleine und sterile Ultraschallspitze benötigt wird (Oefner et al., 1996).

Eine optimale Lösung für die Fragmentierung von genomischer DNA bezüglich

Reproduzierbarkeit, Kosten und Festlegung der Fragmentgröße, wird durch chemische

Nukleasen ermöglicht, zu denen Methidiumpropyl-EDTA-Eisen (MPE.Fe(II)) oder

Eisenammoniumsulfat (EDTA.Fe(II)) gehören (Tullius et al., 1987; Papavassiliou, 1995;

1. Einleitung 12

Zhang et al., 2001). Grundlage für die Fragmentierung mit EDTA.Fe(II) bildet die Fenton-

Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid durch Eisen(II) reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid

wird durch diese Reaktion in hochreaktive Hydroxylradikale und Hydroxid-Ionen gespalten.

Durch die Zugabe von Natriumascorbat kommt es zu einem zyklischen Prozess. Das oxidierte

Eisen(III) wird wieder zu Eisen(II) reduziert und steht somit erneut für die Bildung von

Hydroxylradikalen zur Verfügung (siehe Abb. 2). Die freien, hochreaktiven

Hydroxylradikale, die auf diese Weise entstehen, reagieren mit der doppelsträngigen DNA

und initiieren eine Reaktion am C-4’-Atom der Desoxyribose (Balasubramanian et al., 1998;

Pogozelski and Tullius, 1998). Diese Interaktion führt letztendlich zur Eliminierung eines

Nucleosids und zu 5’- und 3’-Phosphatresten (siehe Abb. 2). Die Fenton-Reaktion besitzt den

wesentlichen Vorteil, dass die Hybroxylradikale die DNA sequenzunabhängig fragmentieren

und somit die Spaltungen statistisch über die Nukleinsäure verteilt sind (Papavassiliou, 1995).

Weiterhin kann die Größe der fragmentierten DNA aufgrund der Konzentrationen der

Reagenzien festgelegt werden (Kelly et al., 2002).

Abb. 2. Fragmentierung von DNA durch Hydroxylradikale aus der Fenton-Reaktion.

1. Einleitung 13

1.3.2. Detektionsmethoden

Die Detektion der hybridisierten Ziel-DNA auf dem DNA-Microarray kann durch zwei

unterschiedliche Ansätze erfolgen. Die markierungsfreien und markierungsabhängigen

Nachweissysteme der Ziel-DNA.

Im Verlauf der letzten zehn Jahre wurden verschiedene Verfahren zur markierungsfreien

Detektion biomolekularer Interaktionen an Festphasen untersucht. Diese Techniken erlauben

die direkte Beobachtung von Bindungseregnissen an Oberflächen. Die markierungsfreien

Nachweissysteme beruhen auf unterschiedlichen physikalischen Messverfahren, wie z.B.

optische, elektrochemische oder massensensitive Verfahren (Wang, 2000).

Einen vergleichenden Überblick über optische Analyseverfahren findet man bei Brecht und

Gauglitz (Brecht and Gauglitz, 1995), zu der unter anderem die reflektrometrische

Interferenz-Spektroskopie (RIfS) zählt (Brecht and Gauglitz, 1995; Piehler et al., 1997b;

Haake et al., 2002). Das Messprinzip der RIfS beruht auf einer Änderung der optischen

Schichtdicke durch die Bindung eines Analyten, beispielsweise eines Antikörpers oder einer

Nukleinsäure an die beschichtete Oberfläche eines Objektträgers (Piehler et al., 1997a; Sauer

et al., 1999). Zur Detektion wird die Teilreflektion von Licht an den verschiedenen

Phasenübergängen und die dabei entstehenden sich addierenden bzw. subtrahierenden

Phasen-Überlagerungen genutzt. Die Intensität des reflektierten Lichtes wird

wellenlängenunabhängig gemessen und ist proportional zur Schichtdicke. Die

Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie stellt eine weitere optische Detektionsmethode

dar, mit der Änderungen des Brechungsindex oder der Schichtdicke nachgewiesen werden

können (Gotoh et al., 1997).

Die massensensitiven Verfahren beruhen auf einem anderen Prinzip. Bei mechanischen

Beanspruchungen (Spannungen) bestimmter Klassen von Ionenkristallen treten Polarisationen

auf, die durch die Verschiebung der Ladungsschwerpunkte im Kristallverbund verursacht

werden. Massensensitive Sensoren nutzen diese Oberflächenpotentiale an den Grenzflächen

von Festkörpern als sensorisches Prinzip, d.h. die Umwandlung von elektrischen Impulsen in

mechanische Deformationen (Jonata et al., 1994). So konnten u.a. verschiedene DNA-

Interaktionen, wie Protein-DNA-Bindungen (Nikura et al., 1996) und die enzymatischen

Spaltung von DNA (Wang et al., 1999) untersucht werden.

Bei den elektrochemischen Nachweissystemen können durch die Anlagerungen von

Nukleinsäuren an komplementären Sonden Wechselwirkungen an einem Transducer

gemessen werden. Elektronen verändern so z.B. das Redoxpotenzial am Transducer (Umek et

1. Einleitung 14

al., 2001). Durch den Einsatz von „peptide nucleic acid“ (PNA) konnten Punkt-Mutationen

mit diesem elektrochemischen Nachweissystem detektiert werden (Palecek et al., 1998).

Bei den markierungsabhängigen Ansätzen wird hingen die Ziel-DNA mit einem Marker

versehen. Die etablierteste Detektionsmethode zum Nachweis von Hybridisierungs-

ereignissen in der DNA-Microarray Technologie ist die Markierung der DNA mit einem

Fluoreszenzfarbstoff (Epstein et al., 2002a). Bei der Fluoreszenzmarkierung handelt es sich in

der Regel um Fluorescein- oder Carboxymethylindocyanine-Farbstoffe. Sie besitzen den

Nachteil des Quensching-Effekts, der sich bei mehrmaligem Messen in abnehmenden

Signalintensitäten auswirkt (Torimura et al., 2001). Die radioaktive Markierung der DNA ist

ebenfalls zur Detektion geeignet. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmarkierung erreicht sie zwar

eine höhere Sensitivität, aufgrund des experimentell erhöhten Sicherheitsaufwandes steht sie

aber in der analytischen Routine im Hintergrund. Die radioaktive Markierung kommt daher in

der DNA-Microarray Technologie kaum noch zur Anwendung (Salin et al., 2002).

Eine weitere Methode beruht auf der Verwendung von polymeren Microbeads, in die

Nanokristalle aus Zinksulfid-Cadmiumselenid eingebettet sind und als Marker an der Ziel-

DNA gebunden werden. Die Farbe und damit die Wellenlänge, in der sie Licht emittieren,

variiert mit der Größe der eingesetzten Nanokristalle. Auf diese Weise lassen sich aufgrund

der Intensitätsstufen und der 6 verschiedenen Farben theoretisch bis zu 1 Millionen

verschiedene Signale abtrennen (Han et al., 2001). Eine weitere Detektionsmethode beruht

auf der „Sandwich-Hybridisierung“, bei der unmarkierte DNA auf dem DNA-Microarray

hybridisiert wird und im Anschluss mit fluoreszenzmarkierten Reporteroligonukleotiden

nachgewiesen wird (Epstein et al., 2002b). Der Einsatz dieser „Sandwich-Hybridisierung“ ist

für den Nachweis von vielen Genen nur schwer etablierbar, da der experimentelle Aufwand,

zwei funktionsfähige Sonden pro Target zu etablieren, zu hoch ist und die unzureichende

Menge von einer Fluoreszenzmarkierung pro Reportermolekül die Sensitivität erniedrigt. Des

Weiteren erhöht sich die Wahrscheinlichkeit von Kreuzhybridisierungen, die aufgrund der

erhöhten Komplexität der Hybridisierung entstehen (Chandler et al., 2003).

Bedingt durch die mangelnde Sensitivität und dem hohen apparativen Aufwand der

markierungsfreien Nachweisverfahren können diese Methoden noch nicht mit den

markierungsabhängigen Nachweissysteme konkurrieren (Lin et al., 2002; McKendry et al.,

2002; Perraut et al., 2002; Vercoutere and Akeson, 2002).

1. Einleitung 15

1.3.3. DNA-Markierungsmethoden

Für eine markierungsabhängige Detektion der Ziel-DNA auf dem DNA-Microarray muss die

DNA zuvor markiert werden. Die Markierungsmethoden für Nukleinsäuren werden in zwei

Kategorien eingeteilt. In die enzymatischen und chemischen Markierungsmethoden.

Die enzymatischen Markierungsreaktionen werden durch DNA-Polymerasen oder terminale

Transferasen katalysiert. Der Einbau des Markers erfolgt entweder über markierte Nukleotide

die während der PCR eingebaut werden oder über endmakierte Primer (Ye et al., 2001). Eine

weitere Anwendung ist das „Radom-prime Labeling“ (Feinberg and Vogelstein, 1983). Bei

der „Random-prime“ Markierung wird durch die Kombinationen von markierten

Oligonukleotiden (z.B. Hexameren), die dem Klenow-Fragment als Primer dienen und

statistisch alle möglichen Basenkombinationen abdecken, die Nukleinsäure markiert. Die

Random Primer konnten für die Markierung von genomischer DNA zur Standardisierung von

Gen-Expressionsexperimenten in Studien von Talaat verwendet werden (Talaat et al., 2002).

Einen anderen Ansatz bietet die Nick-Translation (Rigby et al., 1977). Die Markierung via

Nick-Translation beruht auf „Strangbrüchen“, die durch die Endonuklease DNase I in die

doppelsträngige DNA eingeführt werden. Die dabei entstehenden freien 3’-Hydroxylgruppen

werden durch die Polymerase I mit markierten Nukleotiden aufgefüllt. Der Strangbruch

bewegt sich auf Grund der 5’-3’ Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase I in Richtung des

3’-Terminus. Auch diese Markierungsmethode konnte zur Markierung von genomischer DNA

verwendet werden. Im Vergleich zum „Random-prime labeling“ konnten zweieinhalb mal

höhere Signalintensitäten auf dem DNA-Microarray gemessen werden (Talaat et al., 2002).

Eine weitere enzymatische Markierungsmethode wird durch den Einsatz der Terminalen-

Desoxynucleotidyltransferase möglich (Langer et al., 1981). Diese addiert an die 3’-OH-

Enden markierte Nukleotide. Eine Untersuchung der Genexpression von Saccharomyces

cerevisiae war so möglich (Wodicka et al., 1997).

Bei den chemischen Markierungsmethoden wird zwischen den chemischen und

photochemischen Markierungen unterschieden. Chemische Markierungsmethoden beruhen

auf dem Einbau von aktivierten Amino- oder Thiol Gruppen in die Nukleinsäuren, die als

Akzeptor für Fluoreszenzfarbstoffe fungieren (Proudnikov and Mirzabekov, 1996). Die

Markierung konnte Ansorge et al. ausnutzen, um Proteine, Nukleinsäuren und Peptide über

Fluoreszenzfarbstoffe sensitiv nachzuweisen (Ansorge et al., 1987). Eine andere chemische

Methode, das „Universal Linkage System“, beruht auf dem kovalenten Anbinden eines Platin-

Farbstoff Komplexes an die Guanin-Reste der Nukleinsäure, wobei es sich bei dem Farbstoff

1. Einleitung 16

um beliebige Fluoreszenzfarbstoffe handeln kann (Alers et al., 1999; van Gijlswijk et al.,

2001).

Bei den photochemischen Markierungsmethoden sind verschiedene photoreaktive Substanzen

bekannt, die innerhalb der Nukleinsäure interkalieren und durch Photoreaktion kovalent an

die flankierenden Basen gebunden werden können (Proudnikov and Mirzabekov, 1996).

Diese Substanzen umfassen Coumarin-Verbindungen (Psoralen, Angelicin) (Lee et al., 1994),

Acridin-Farbstoffe (Acridinorange) (Baruah and Bierbach, 2003), Phenanthroline

(Ethidiumbromid) (Reinhardt and Krugh, 1978), Phenazine (Kleinwachter et al., 1986) und

Phenothiazine (Viola et al., 2003). Neben dem bekannten Ethidiumbromid gehört auch das

Psoralen zu den photoreaktiven Substanzen (Sheldon et al., 1986). Psoralen ist ein

kostengünstiges, bifunktionales, photoreaktives Molekül, welches unter UV Bestrahlung

kovalente Bindungen mit Nukleinsäuren ausbildet (Saffran et al., 1988). In einer zwei Stufen-

Reaktion interkaliert Psoralen in die Nukleinsäure, bevor es in einer Photoreaktion bei 320-

400 nm kovalent an Pyrimidin-Basen bindet. Untersuchungen haben gezeigt, dass am

häufigsten das Adukt mit Thymin, gefolgt von Cytosin gebildet wird (Bethea et al., 1999).

Weiterhin wurde in der Literatur auch die Kopplung des Psoralen an Adenin beschrieben

(Yun et al., 1992). Bei der Psoralen-Markierung handelt es sich um eine Cycloaddition. Die

Basen reagieren in dieser Reaktion mit ihrer 5’,6’-Doppelbindung mit den Psoralen-

Molekülen. In dem Psoralenmolekül hingegen stehen 2 reaktive Seiten, die 4’,5’- (Furan) und

die 3’,4’-(Pyron) Doppelbindungen, zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zur Verfügung

(siehe Abb. 3). Aus diesem Grund ist die Bildung verschiedener Cycloadukte möglich. Es

besteht neben der Möglichkeit zur Ausbildung von zwei Monoadukten (Furanseite oder

Pyronseite) auch die Möglichkeit zur Ausbildung von Diadukten (cross-links), wenn die

geometrische Basenkonformation in der dsDNA dies zulässt (Tessman et al., 1985).

Durch die Synthese von biotinylierten Psoralenderivaten ist es möglich (siehe Abb. 3), die

Nukleinsäurespezifität des Psoralens mit der Detektionssensitivität des Streptavidin-Biotin

Systems zu verbinden (Saffran et al., 1988). Streptavidin besitzt vier hochaffine

Bindungstellen für Biotin; die Bindungskonstante ist mit 10-15 mol-l eine der höchsten

natürlichen Bindungskonstanten. Bei der Markierung von Nukleinsäuren werden Einbauraten

von einem Psoralen-Biotin Molekül pro 40 Basenpaaren erreicht (Oser et al., 1988;

Wassarman, 1993). Die Detektion von Psoralen-Biotin markierter DNA erfolgt über die

Anbindung eines Streptavidin-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugates, wie z.B. das Streptavidin-

Cy5-Konjugat, an die biotinylierte DNA. Die Detektion kann so mit gängigen

Fluoreszenzscannern erfolgen.

1. Einleitung 17

Abb. 3. Struktur des Psoralen-PEO-Biotin Derivates.

Die Verwendung einer Markierungsmethode für genomische DNA in der DNA-

Chiptechnologie muss unter mehreren Aspekten ausgewählt werden. Für den direkten

Nachweis von Phagenresistenzgenen und pathogenen Organismen in Fermentationsproben

sind Nachweisgrenzen im Femto- bis Attomolaren-Bereich und geringe Markierungskosten

für einen hohen Probendurchsatz erforderlich. Die Markierung von genomischer DNA über

endmarkierte Primer in der PCR kann daher ausgeschlossen werden, da für jedes

nachzuweisende Gen, ein eigenes Primerpaar eingesetzt werden müsste. Außerdem

ermöglicht die Endmarkierung keine Mehrfachmarkierung der Probe. Bei den anderen

enzymatischen Reaktionen ist die Reproduzierbarkeit der Experimente stärker eingeschränkt,

da die Markierungsreaktionen von der Enzymaktivität beeinflusst wird, die abhängig vom

Substrat, Co-Faktoren und Ionenkonzentrationen ist (Talaat et al., 2002).

Im Gegensatz zur enzymatischen Markierung ist die Reproduzierbarkeit bei chemischen

Reaktionen höher, da ein Puffer für die optimalen Reaktionsbedingungen ausreicht. Die

Kosten der Reaktion liegen dabei vergleichsweise niedrig. So belaufen sich die Preise für die

enzymatischen Markierungen für 1 µg DNA auf 50.00 US$ für die Einbau von markierten

Nukleotiden, auf 25 US$ bei der Markierung mit der terminalen Transferase und auf 15 US$

beim „random-prime Labeling (Zhang et al., 2001). Bei der chemischen Markierung mit

Psoralen-PEO-Biotin liegen die Kosten bei nur 0.5 US$ pro µg DNA (Zhang et al., 2001).

Zusätzlich wird durch den Einbau mehrerer Psoralen-Biotin Moleküle eine

Mehrfachmarkierung der Probe ermöglicht (Davidson and Malkinson, 1996).

Furanseite

Pyronseite

1. Einleitung 18

1.3.4. Strategien zur Signalamplifikation

Ein weiterer Bereich von zunehmendem Interesse beinhaltet Strategien zur

Signalamplifikation für den Nachweis von geringen Probenmengen (Kricka, 1999).

Grundsätzlich existieren zwei verschiedene Ansätze, die für die DNA-Chiptechnologie

eingesetzt werden können, zu denen die Amplifikation einer zu detektierenden Probe und die

Verstärkung eines vorhandenen Signals gehören (Schweitzer and Kingsmore, 2001; Epstein et

al., 2002b).

Die Amplifikation der Target-DNA kann durch die „polymerase chain reaction“ (PCR) (Saiki

et al., 1988), der „strand displacement amplification“ (SDA) (Little et al., 1999), der „nucleic

acid sequence-based amplification“ (NASBA) (Compton, 1991) oder der „ligase chain

reaction“ (LCR) (Barany, 1991) erreicht werden. Die Anwendung dieser Techniken ist im

Bereich der Microarray-Technologie stark begrenzt. Daher hat sich speziell die Multiplex-

PCR in den letzten Jahren zu einer sinnvollen Ergänzung für die Microarray-Technologie

weiterentwickelt (Call et al., 2001a). Sie kombiniert die parallele Vervielfältigung von

geringen Probenmengen in der Multiplex-PCR mit der hohen Spezifität des DNA-

Microarrays (Call et al., 2001a; Chizhikov et al., 2001). So konnte die Diskriminierung von

pathogenen und nicht pathogenen Escherichia coli Stämmen in Lebensmitteln in der Studie

von Chizhikow et al. gezeigt werden. Die selektive Anreicherung von Nukleinsäuren durch

spezifische Sonden, die an eine abtrennbare Matrix gebunden sind, ist eine weitere

Möglichkeit, Nukleinsäuren aufzukonzentrieren (Tano et al., 1995). Die Sensitivität der HIV-

Detektion konnte in der Arbeit durch die Verwendung von HIV-spezifischen DNA-Sonden,

die an eine Polystyren-Latex Matrix gebunden waren, um den Faktor 100 gesteigert werden.

Die Strategien zur Signalamplifikation ohne Targetamplifikation beruhen auf der

Verwendung von mehreren Reporter-Molekülen, die durch eine Mehrfachmarkierung, wie der

Psoralen-PEO-Biotin Markierung (Zhang et al., 2001), eine Enzym-Substrat Reaktion wie der

„Tyramid Signalamplifikation“ (TSA) (Bobrow et al., 1989), eine Reduktion von Silber unter

Einsatz von Nanopartikeln (Taton et al., 2000) oder eine „rolling circle amplification“ (RCA)

(Lizardi et al., 1998; Nallur et al., 2001) realisiert werden können. Ein weiterer Ansatz ist die

„branched DNA“ (bDNA) Technologie. Sie beruht auf der Kopplung von

Signalamplifikationsmolekülen an die gebundene Nukleinsäuren (Urdea et al., 1987; Yu et al.,

2002). Die Signalamplifikationsmoleküle besitzen bis zu 15 Äste mit je drei Bindungsstellen

für weitere Oligonukleotide, die mit einer alkalischen Phosphatase gekoppelt sind. Ein

Signalamplifikationsmolekül bindet bis zu 45 AP-markierte Oligonukleotide, die für die

Amplifikation genutzt werden können. Diese „Sandwich-Hybridisierung“ setzt jedoch eine

1. Einleitung 19

komplementäre Bindungsstelle voraus, die bei der Detektion von mehreren Genen variiert und

angepasst werden müsste. Das Problem kann durch den Einsatz einer Enzym-Substrat

Reaktion umgangen werden, wie z.B. der „Tyramid Signalamplifikation“ (Bobrow et al.,

1989). Ursprünglich wurde diese Form der Signalamplifikation für Immunoassays entwickelt,

um schwache Signale zu verstärken. Mittlerweile findet sie eine breite Anwendung in der

FISH (Schönhuber et al., 1999; Speel et al., 1999; Pernthaler et al., 2002).

Der Assay beruht auf einer Enzym-Substrat Reaktion, die auf einer sequenzunabhängigen

Anbindung des Reportermoleküls beruht. Hierfür kann z.B. das Streptavidin-Biotin System

mit der Enzym-Substrat Reaktion gekoppelt werden. Dabei binden die Reportermoleküle, in

diesem Fall das Streptavidin Meerrettich-Peroxidase Konjugat (STV-HRP), an die zuvor

biotinylierte DNA (De Jong et al., 1985). Durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid wird das

Enzym aktiviert und setzt im Anschluss ein inaktives Substrat, das Tyramid, in ein aktives

Substrat um. Die dabei entstehenden hoch reaktiven Tyramid-Intermediate können an

Proteine oder an das Enzym selbst binden (Pernthaler et al., 2002). Die Tyramid-Moleküle

werden mit einem Farbstoff gekoppelt, wie z.B. dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 oder FITC, um

die Signalamplifikation detektieren zu können (siehe Abb. 4). Neuere Untersuchungen zeigen,

dass die Abgrenzung der Signalamplifikation auch ohne Kavitäten auf dem DNA-Microarray

möglich ist, da Tyramid-Moleküle lokal gebunden bleiben und kaum diffundieren (Karsten et

al., 2002).

Abb. 4. Tyramid Signalamplifikation auf dem DNA-Microarray.

1. Einleitung 20

1.4. Ziel der Arbeit

Die auf dem Gebiet der Microarray-Technologie und der Etablierung neuer

molekularbiologischer Techniken erzielten Fortschritte, haben in den letzten Jahren neue

Möglichkeiten eröffnet, komplexe biologische Fragestellungen in der Forschung beantworten

zu können. Die Anwendbarkeit der DNA-Microarray Technologie in der Industrie ist bisher

durch eine Reihe von methodischen Defiziten eingeschränkt. Hierzu gehören unzureichende

Nachweisgrenzen, die eine vorherige Amplifizierung des limitierenden Probenmaterials

notwendig machen, und aufwendige Protokolle für die Aufbereitung der zu hybridisierenden

Zielmoleküle.

Ziel dieser Arbeit ist es, ein Protokoll zu etablieren, das die industrielle Anwendbarkeit von

DNA-Microarrays ermöglicht und somit die Basis für eine breite Nutzung dieser Technik

schafft. Die notwendigen Arbeitschritte von der DNA-Extraktion, Fragmentierung,

Markierung und Hybridisierung werden so untereinander ausgearbeitet und optimiert, dass

eine Zusammensetzung dieser Module möglich ist und der Nachweis der DNA direkt über

genomische DNA erfolgen kann (siehe Abb. 5).

Abb. 5. Vorgehensweise beim Einsatz der DNA-Chip Technologie für den direkten Nachweis von genomischer DNA.

Da herkömmliche Markierungsverfahren für einen Routine-Einsatz in der Industrie sehr

kostenintensiv sind, wird die Einsetzbarkeit der Psoralen-PEO-Biotin Markierung für

genomische DNA getestet. Die Markierungsmethode wird anhand eines Modellsystems mit

PCR-Produkten optimiert und deren Signalintensitäten mit denen von endmarkierten PCR-

Produkten verglichen. In diesem definierten Modellsystem wird weiterhin die Auswirkung der

Produktlänge auf die Hybridisierungseffizienz und die Signalintensität untersucht, um die

1. Einleitung 21

Sensitivität des Nachweises zu optimieren. Die Ergebnisse des Modellsystems werden an

genomischer DNA validiert, um zu überprüfen, ob sich die gewonnenen Erkenntnisse des

Modellsystems auf genomische DNA übertragen lassen. Hierfür wird die gDNA mit einer

chemischen Fragmentierungsmethode, der Fenton-Reaktion, in unterschiedliche

Fragmentgrößen sequenzunabhängig zerkleinert und auf dem DNA-Microarray hybridisiert.

Im Anschluss an die Etablierung und Optimierung der Methoden, ist es Ziel dieser Arbeit, die

Anwendbarkeit am Beispiel des direkten Nachweises von Organismen und

Phagenresistenzgenen in der Milch-Analytik zu überprüfen, da bei der biotechnischen

Produktion von Milchprodukten Fehlfermentationen auftreten, die unterschiedliche Ursachen

haben können. Durch die Erstellung eines „Milch-Chips“ kann es der Industrie ermöglicht

werden, Starterkulturen aufgrund ihrer Organismenzusammensetzung und ihres

Phagenresistenzgen-Spektrums so auszuwählen, dass sie zu einer stabileren Fermentation

beitragen können. Um dieses zu ermöglichen, werden etablierte rRNA-Sonden für den

Nachweis von Organismen der Gattung Lactococcus auf ihre Einsatzfähigkeit auf dem DNA-

Microarray überprüft und Sonden für die Detektion der in Lactococcus lactis vorkommenden

Phagenresistenzgene generiert. Nach erfolgreicher Sondentestung wird in der vorliegenden

Arbeit untersucht, ob das etablierte Protokoll für den direkten Nachweis von genomischer

DNA eingesetzt werden kann.

Da die Sensitivität der Microarray-Technologie für den direkten Nachweis von geringen

Mengen an pathogen Organismen und Phagenresistenzgenen in Starterkulturen limitiert ist,

wird abschließend die Psoralen-PEO-Biotin Markierung in Kombination mit der Multiplex-

PCR und der „Tyramid Signalamplifikation“ in der DNA-Microarray Technologie etabliert

und am Beispiel von ausgewählten Phagenresistenzgenen getestet.

2. Material und Methoden 22

2. Material und Methoden

Für alle Lösungen wurde entsalztes und über eine Reinstwasseranlage (SG Reinstwasser)

gereinigtes Wasser mit einem Leitwert < 0,5 mS/cm3 verwendet. Die Chemikalien wurden

soweit nicht anders beschrieben in p.A.-Qualität oder mit molekularbiologischem

Reinheitsgrad von den Firmen Merck, Sigma oder Fluka bezogen. Die Agarose stammte von

Biozym, die Taq-Polymerase von Biomaster.

2.1. Lösungen und Puffer

Lysozymlösung 1 mg/ml (100.000 U/mg) Lysozym aus Hühnereiweiß in TE-Puffer

1x PBS 150 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat pH 7,0

80 g/l NaCl, 2 g/l KCl, 26,8 g/l Na2HPO4 – 7x H2O,

2,4 g/l KH2PO4, ad 1 l mit ddH2O, pH 7,4

1x Hybridisierungspuffer 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01% SDS

Waschpuffer 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01% SDS

Amplifikationspuffer 2 M NaCl, 1 % Blockierungsreagenz (Roche), 1x PBS

5x Probenpuffer 100 mM EDTA, 20 % Ficoll 400, 0,1 % Bromphenolblau,

0,1 % Xylenxyanol, pH 7,3

TETBS 1x TBS, 5 mM EDTA, pH 7,5

TBE-Puffer 89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3

TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7,4

20 x SSC 150 mM NaCl, 15 mM Na3-Citrat, pH 7,0

Stopp-Puffer 500 mM Thioharnstoff, 50 mM EDTA pH 7,0

2.2. Medien und Stammhaltung

2.2.1. Anzucht von Mikroorganismen

M17-Medium zur Anzucht von Lactococcus spec. (Terzaghi and Sandine, 1975)

Die Anzucht von L. lactis erfolgte entsprechend den Versuchsanforderungen entweder auf

Agar-Platten oder in 5 ml Flüssigmedium über Nacht im Brutschrank (Heraeus) oder

Schüttelinkubator (Braun Labtherm/Labshaker) bei 28-30°C und 120 rpm.

M17-Medium 0,5 g Ascorbinsäure, 5,0 g Fleischextrakt, 2,5 g Hefeextrakt, 0,25 g MgSO4,

19,0 g Na-ß-Glycerolphosphat, 2,5 g Pepton aus Casein, 2,5 g Pepton aus

Fleisch, 5,0 g Pepton aus Soja, H2O ad 1000 ml, pH 7,2

GM17-Medium M17-Medium mit 0,5% Lactose


2.2.2. Stammhaltung und Lagerung

Für die Herstellung von Stammkulturen wurden frische ÜN-Kulturen in sauergefallener,

tyndalisierter Milch überführt. Zur Tyndalisierung wurde sterile 11%ige (w/v) Skim-Milch

(Oxoid) dreimal für 30 min bei 90°C im Thermoblock (Eppendorf) inkubiert und jeweils im

Anschluss bei RT abgekühlt. Die Kulturen wurden in 1,5 ml tyndalisierte Milch überimpft.

Zur langfristigen Lagerung wurden die Kulturen bei 30°C über Nacht inkubiert und bei -80°C

eingefroren.

2.3. Probenmaterial

2.3.1. Starterkulturen

Als Ausgangsmaterial für die Analyse der Phagenresistenzgene wurden Wisby (heute

Danisco, Niebüll) bzw. aus verschiedenen Produktionsstandorten der Nordmilch e.G.

Starterkulturen bezogen. Die original verpackten Kulturen wurden unter der Sterilwerkbank

geöffnet und für die einzelnen Untersuchungen aliquotiert. Folgende Starterkulturen standen

zur Verfügung:

Probat 8/0 ’97 Lot.-Nr. L63417121K

Probat 505 Lot.-Nr. L94029932K

Probat M7 Lot. Nr. L93713732K

Probat M4 Lot. Nr. L93117432K

Laut Herstellerangaben setzt sich die Starterkultur Probat 8/0 wie folgt zusammen: 80-98%

Lactococcus lactis ssp. lactis und ssp. cremoris, 1-10% L. lactis ssp. lactis biovar.

diacetylactis, 1-15% Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris. Für die anderen

Starterkulturen waren keine genaueren Angaben vorhanden.

2.3.2. Referenzstämme der DSMZ

Für die Etablierung der Methode zum spezifischen Nachweis von genomischer DNA wurden

zwei Stämme von der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen

(DSMZ, Braunschweig) bezogen und verwendet (siehe Tab. 2).


Organismus Referenz Anzucht

Lactococcus lactis ssp. lactis DSMZ 20481 GM-17 Medium, 28–30°C

Lactococcus lactis ssp. cremoris DSMZ 20069 GM-17 Medium, 28-30°C

Salmonella choleraesius LT2 DSMZ 11320 LB Medium, 28-30°C

Bacillus cereus DSMZ 626 LB Medium, 28-30°C

Pseudomonas fluorescens DSMZ 6290 LB Medium, 28-30°C

Tab. 2. Verwendete Organismen für den spezifischen Nachweis von genomischer DNA.

2.4. Extraktion von genomischer DNA und RNA

Genomische DNA wurde entweder mit dem Qiagen DNeasy-Kit laut den Protokollvorschriften von Qiagen oder mit dem AGOWA Maxi DNA Isolation Kit nach den Angaben des Herstellers extrahiert. Die genomische DNA wurde in Wasser aufgenommen und bei -20°C gelagert. Ein RNase-Verdau erfolgte vor dem Proteinverdau durch die Zugabe von 4 µl RNase (100 mg/ml) für 2 min bei RT. RNA wurde mit dem Qiagen RNeasy Mini Kit aus dem Probenmaterial laut den Angaben des Herstellers für Gram-positive Bakterien extrahiert. Die extrahierte RNA wurde mit 30 µl RNase-freiem Wasser von der Säule eluiert und bei -20°C gelagert.

2.5. Molekularbiologische Software und Datenbanken

Sequenzrecherche: Entrez am NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ Alignment-Tools: ClustalW am EBI http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/ Sequenz- und Sondenvergleich: BLAST am NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ Genedoc 2.6. http://www.psc.edu/biomed/genedoc/ Sequenzanalyse: ORF Finder am NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html Sonden- und Primerdesign: Oligo 6.31 Molecular Biology Insights, Cascade, USA DNA-Star LaserGene Inc. Madison, Wisconsin, USA Gelanalysesoftware: Gel-Pro Analyzer 3.1 Media Cybernetics, Carlsbad, USA


2.6. Oligonukleotide Sämtliche Primer und Sonden wurden, soweit nicht anders gekennzeichnet, von der Firma

ThermoHybaid (Ulm) bezogen. Die Lagerung der in H2O gelösten PCR-Primer und Sonden-

Stammlösungen [100 pmol/µl] erfolgte bei -20°C. Für die Nomenklatur der Primer wurden

die ersten Buchstaben des zu amplifizierenden Gens verwendet. Der Zusatz F steht für den

Sense-Primer, R für den Antisense-Primer. Bei der Verwendung des Primerpaares wurden

diese Kürzel durch ein X ersetzt.

2.6.1. Primerauswahl

Alle verwendeten Primer wurden mit dem Programm PrimerSelect (DNA-Star, Wisconsin)

unter Vermeidung von Sekundärstrukturen und Primer-Dimeren generiert. Ihre Spezifität

wurde mit dem Programmen BLAST überprüft. Um eine spätere Verwendung der Primer für

den simultanen Nachweis von mehreren Genen in einer Multiplex-PCR zu ermöglichen,

wurde darauf geachtet, dass die Schmelztemperatur aller generierter Oligonukleotide um nicht

mehr als 4°C (48-52°C) variierte.

2.6.2. Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene

Die Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene sind in den Tab. 3-7 aufgeführt. Aus

den Tabellen geht das von den Oligonukleotiden erkannte Gen, dessen Sequenz und Länge,

aber auch die Bindungsposition im Gen bzw. die Länge des entsprechenden PCR-Produktes

hervor.

Primer Zielgen/ Acc. Nr.

Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Prod. Länge

EpsC F1 ads-epsC CCTGAGTGTAATAGCGGAATC 21 48,4 24-44

EpsC R1 AF036485 AF100297 AF100298

CTAATCCCCCTAAAATATCAATCC 24 51,6 499-522

499

EpsC F2 ads-epsC CCTATTTTGGTCCACCCTG 19 49,3 9-27

EpsC R2 AF100297 ATCCTTCCTCAAAACTTCCAT 22 50,5 402-423 415

Inj-Pip F1 Inj-Pip CGCATTGCCTAGTATCACGA 20 51,4 1041-1060

Inj-Pip R1 L14679 GTCAAGCTTGTTAAAACTGTTATCA 24 51,1 1491-1514 474

Inj-Pip F2 Inj-Pip ATGCCAGAAATCAAAGAAAAACT 23 51,0 673-695

Inj-Pip R2 L14679 TTGGTCAATAACAGCGAGAACT 22 48,1 1116-1137 465

Tab. 3. Primer zur Detektion der Gene für die Inhibition der Phagenadsorption und der Injektion der Phagen-DNA.




LldI F1

RM Typ I hsdR

TTGCCTCGGAATACCATACC 20 51,6 1007-1027

LldI R1

U90222 AF034786

CTAACACAGCCCCATCATCC 20 51,7 1443-1462 456

LldI F2 U90222 AF034786

ACGGGGTGGCTCAAGTT 17 49,7 257-273

LldI R2 U90222 AF034786

ATGGGCATCGGGTATCC 17 49,8 710-726 470

LldI F3 U90222 AF034786

GATTCTCCAGCGATTCTAACC 21 49,9 2062-2082

LldI R3 U90222 AF034786

GGCAACTGCTCCACCACT 18 50,4 2469-2486 425

Lla1403 F1 RM Typ I hsdR

ACGGGCCTACATGATTGATA 20 49,5 1803-1822

Lla1403 R1 AF013165 GATGACTTTGGGGTTCTGC 19 49,1 2188-2206

404

Lla1403 F2 RM Typ I hsdR

TGCGGGAGAAGATTTTAGTCA 21 51,7 2250-2270

Lla1403 R2 AF013165 ATCTCTTGTTGGCTCATTTCATC 23 51,8 2656-2678 429

Tab. 4. Primer für die Amplifikation der Restriktions & Modifikationssystem I-Gene.



ScrFI M F1 RM Typ II hsdM

AATGATTAAAGAAAAGCGACTACG 24 51,3 42-65

ScrFI M R1 M87289 U89998

AAGGAAATCCACCGACAAGA 20 51,1 426-445 404

ScrFI M F2 RM Typ II hsdM

TCGGTGGATTTCCTTGTCA 19 50,9 431-449

ScrFI M R2 M87289 U89998

TGCCCATCCCAAAGTTTATC 20 51,6 832-851 421

ScrFI R F1

RM Typ II hsdR

CGTTTCTCATGGTCTGGTTCT 21 50,8 343-363

ScrFI R R1

U89998 GGCGCTTGTTTCCTTCATAC

20 51,6 732-751 409

LlaI M F1 RM Typ II hsdM

TTGATGGAATGCGACTTGATA 21 50,7 365-385

LlaI M R1

U17233 CTCCCGCTTAACTCTTCTGC 20 51,0 746-765 401


LlaI R F1 hsdR ATTGAGCTTTTTCCGACAGG 20 51,1 2719-2738

LlaI R R1 U17233 CTTGATTATGCATTTCTTCTACCC 24 51,2 3168-3191 473

LlaII R F1 RM Typ II hsdR

TACGTTCTAAAATCCCCTCCAT 22 51,4 405-426

LlaII R R1 U16027 GGCAACACTTTCCGTAACTAATA 23 50,2 837-859 455

LlaII R F2 RM Typ II hsdR

GAAGCGGTTGCCTGTGG 17 51,9 347-363

LlaII R R2 U16027 CCCGAATACTACGTGAACTGG 21 51,4 811-831

485

LlaBI R F1 RM Typ II hsdR

AAATGGAGCAGAAGCAAAACA 21 51,8 108-128

LlaBI R R1 X97263 GTCGTCGTATTCATAAACTGGA 22 48,8 534-555 448

LlaBI R F2 RM Typ II hsdR

TAATTGGATGGGGACCTATGA 21 51,0 329-349

LlaBI R R2 X97263 GACTTTGGCTTGATCTCCTCTAA 23 51,4 710-732 404

LlaBII R F1 RM Typ II hsdR

AGCCGTAGTGCTACACAGGAA 21 51,7 298-318

LlaBII R R1 Y12736 GGAATTCGGGACGCTTTAT 19 50,9 739-757 460

LlaBII R F2 RM Typ II hsdR

AGATGGCAGAGGAAGGCTATC 21 51,8 1085-1105

LlaBII R R2 Y12736 AAGCGTTCTTTATTTTTCATCTCA 24 51,5 1506-1529 445

LlaCI R F1 RM Typ II hsdR

CTAAGCCGCCTAGTTTTTGTC 21 50,6 546-566

LlaCI R R1 AJ002064 CTAGTGAATAGCGAATTTGAGAAA 24 49,9 955-978 433

LlaCI R F2 RM Typ II hsdR

CAGATTTTTAAGCCTTCCCTCTA 23 51,1 217-239

LlaCI R R2 AJ002064 ACAGGCTCCGAATGTAAAAGA 21 50,9 614-634 418

LlaDII R F1 RM Typ II hsdR

TGCCAGAATAGATGCAACTTGT 22 51,7 39-60

LlaDII R R1 Y12707 TGAGGACGCCTTCCAACA 18 51,9 426-423 385

LlaDII R F2 RM Typ II hsdR

ATCCAGCAAATAAGACTCAAACTA 24 49,2 1129-1152

LlaDII R R2 Y12707 TGCTAACATAATATCAAAATCTGG 24 48,3 1572-1595 467

LlaKRII F1 RM Typ II hsdR

GATTACGATGATAGCGATTTACAA 24 50,3 19-42

LlaKRII R1 AF051563 TTTGAACACTTTTGCCACAAG 21 50,6 399-419 401

LlaKRII F1 RM Typ II hsdR

AACTGGCGACTAATGATGACTG 22 51,1 1049-1070

LlaKRII R1 AF051563 TCCCATTTTCCTTCTAACACTTC 23 51,2 1565-1487 439

Tab. 5. Primer für die Restriktions & Modifikationssystem II-Gene.




LlaFI F1 RM Typ III hsdR

GGATGCTATTATGAACGGTTTAGA 24 51,6 2190-2213

LlaFI R1 AF054600 AGTAATTGGCCATCATTGACTTT 23 51,5 2575-2597 408

LlaFI F1 RM Typ III hsdR

GAAAACATGCTCAATAGTCAGTCT 24 49,2 346-369

LlaFI R1 AF054600 TTCATAAATTCTCCAAGGTCATA 23 48,0 763-785 440

Tab. 6. Primer für die Restriktions & Modifikationssystem III-Gene.



AbiA F1 abiA TTCCTTAAAAACGATAGTTGAAAT 24 48,8 666-689

AbiA R1 U17233 M63080

TGTGACCACGTACTTTTATTGTAA 24 49,1 1086-1109 444

AbiB F1 abiB GATAACATGCCAATTCCAACTG 22 51,4 85-106

AbiB R1 M77708 ATCGGTATTACTTTTATTTCGTCT 24 48,0 567-590 506

AbiC F1 abiC CCTAGTTTTGGATTATGGTATGG 23 49,5 115-137

AbiC R1 M95956 AAATCTTTTGTTTAGGCTCTTCA 23 49,3 647-6669 555

AbiD F1 abiD GGAGAGCTACAAGTCGGTGAGT 22 51,8 385-406

AbiD R1 U10992 TAGGGGCATAAAAAGTTGGTG 21 51,3 788-808 424

AbiDI F1 abiDI ATAGTCCAGCATTTAAGCATCATA 24 49,9 545-568

AbiDI R1 AF116286 ACCCAATCCTCAGAAAAACC 20 49,7 1012-1031 487

AbiEII F1 abiEII GCACAGTCTATTGAACGGGTAAT 23 51,9 229-251

AbiEII R1 U36837 GAGCCAATCTTCAAACAGTTCTT 23 51,3 698-720 492

AbiF F1 abiF TTTATGTGCAGAATACCAAGAGTC 24 50,1 384-407

AbiF R1 U36837 AATAGGATTTTCGCAAGTTAGC 22 49,6 826-847 464

AbiGI F1 abiGi GCAGAGGGAAAAGCACAAA 19 50,3 136-154

AbiGI R1 U60336 ACACTAAAATTCAAAAGACCATTCT 25 49,8 566-590 455

AbiH F1 abiH GGAGCGATTTTGAAGAACAGAC 22 52,0 182-203

AbiH R1 X97651 TGGCGAATGAAATCCTAATACTAC 24 51,6 613-636 455

AbiI F1 abiI CAGACTATTATTGGGAAAAACACC 24 51,0 383-406

AbiI R1 U38973 ACAATCTCTAACCCACAATGACTT 24 50,7 780-803 398

AbiK F1 abiK TTGTTTATCAAAATGGCACATA 22 48,0 1099-1120

AbiK R1 U35629 AACCTCTATCAACAGACCCAGTAT 24 49,9 1548-1571 473

AbiL F1 abiLII AAGGAGGGTATTCAATCACAGTT 23 50,5 424-446

AbiL R1 U94520 CAAGACATTCATTATTCGTTTCAA 24 50,9 818-841 418


AbiM F1 abiM ATGCTAAACCGAAATACACAGAAG 24 51,7 194-217

AbiM R1 U41294 CATTTTTATCCCACCTATTGTCAG 24 51,7 611-634 441

AbiN F1 abiN TTTAATAAGGAGTTACAGATTGATG 25 49,5 61-85

AbiN R1 Y11901 CTCCTAGTTTGTTATTTACACTTTC 25 51,1 502-526 466

AbiP F1 abiP GACCCATACTCCATTTTTACATCA 24 51,8 289-312

AbiP R1 U90222 TCTAATTTTTGCATATCGGTTTTC 24 51,8 690-713 425

AbiQ F1 abiQ CAGCACTTATGTAGGGGTTGTT 22 50,4 126-147

AbiQ R1 AF001314 CTTTTTCATGAGCAGCTTTTCTAT 24 51,3 443-466 341

AbiT F1 abiTII ATGGTTGGATTCCTATGATTATGA 24 51,3 215-238

AbiT R1 AF483000 TGCTGTATTTGCGTTTCTCG 20 51,6 595-614 400

AbiU F1 abiU ATGGTGCCTAGAAACGAAGTAGTA 24 51,3 1090-1113

AbiU R1 AF188839 CTGTTTGTATTGCGATTGGATAA 23 51,6 1485-1507 418

Tab. 7. Primer für den Nachweis der Abortiven Phagen Gene.

2.6.3. Sondendesign

Vor dem Sondendesign wurden die kodierenden Sequenzen der verschiedenen

Phagenresistenzgene in der NCBI Datenbank mit ihren entsprechenden Accession-Nummern

ermittelt und für weitere Arbeitsschritte im FASTA-Format archiviert. Im Fall der

Phagenresistenzgene bei denen mehrere Sequenzeinträge gefunden wurden, wurde die für das

Sondendesign zugrunde gelegte Sequenz durch ein Alignment mit CLUSTALW ermittelt. Die

Konstruktion der Sonden erfolgte mit der herkömmlichen Primer und Sonden-Design-

Software Oligo 6.31 unter Vorgabe bestimmter Parameter. Diese Parameter erlaubten den

Ausschluss von Oligonukleotiden mit Hang zur Bildung von inter- (Dimerbildung) und

intramolekularen Wechselwirkungen (Hairpins). Neben den bereits genannten Kriterien des

einheitlichen Schmelzpunktes (Tm) zwischen 48°C und 52°C sollten die generierten

Oligonukleotide außerdem eine Länge von 21 bp besitzen, um eine gewisse Spezifität zu

gewährleisten. Für die Berechnung der Schmelztemperatur wurde die „nearest neighbor“

(Breslauer et al., 1986) verwendet. Zur Kontrolle der Sondenspezifität wurden die

entwickelten Sonden in einer BLAST-Anfrage gegen bereits vorhandene Datenbankeinträge

abgeglichen (Li et al., 2002). Dieses Vorgehen sollte das Entstehen von falsch-positiven

Detektionssignalen in den nachfolgenden Hybridisierungsexperimenten minimieren.


2.6.4. Sonden für die Detektion von Bakterien

Die Sonden für die Detektion verschiedener Bakterien sind in Tab. 8 aufgeführt. Sie liegen in

Antisense-Orientierung vor und binden somit 16S rDNA sowie 16S rRNA. Die

Sondenbindungsstellen und das 16S rDNA Alignment der verschiedenen Organismen sind im

Anhang aufgeführt (siehe 7.2.). Das Alignment wurde mit ClustelW erstellt, mit denen aus der

Tab. 9 hervorgehenden Sequenzen. Die Bindungsstellen und das Alignment wurden mit

GeneDoc visualisiert.

Sonden

Name

Sequenz (5’-3’) bp Tm Referenz Organismus

EUB338 GCT GCC TCC CGT AGG AGT 18 51,5 (Amann et al., 1990)

Alle Eubakterien

LGCc354 CCG AAG ATT CCC TAC TGC 18 46,8 (Meier et al., 1999)

Low GC Organismen

Llc68 TGC AAG CAC CAA TCT TCA TC 20 50,9 (Beimfohr et al., 1993)

L.l. ssp. cremoris

Lll68 TAC AAG TAC CAA CCT TCA GC 20 44,4 (Beimfohr et al., 1993)

L.l. ssp. Lactis

Lla271 CTA TAA TGC TTA AGT CCA CG 20 42,3 (Beimfohr et al., 1993)

Lactococcus Lactis

Tab. 8. Verwendete Sonden für den spezifischen Nachweis von Mirkoorganismen.

Mikroorganismus Accession Nr.

Lactococcus lactis ssp. cremoris M58836

Lactococcus lactis ssp. lactis X64887

Escherichia coli J01859

Tab. 9. Accession-Nummern der 16S rDNA Sequenzen von den verwendeten Organismen.

EUB338:

Die Sonde ist spezifisch für alle Eubakterien (Position 338-355 bzgl. des E. coli Alignments).

Sie erfasst eine der hochkonservierten Bereiche der 16S rDNA.

LGCc354:

Die Sonde bindet an eine hochkonservierte Targetregion der 16S rDNA (Position 354-355)

und überlappend um 2 Nukleotide mit der Sonde EUB338. Die Sonde erfasst grampositive

Bakterien mit einem niedrigen GC-Gehalt.


Lll68:

Spezifische Sonde für Lactococcus lactis ssp. lactis. Sondenposition 68-89

Llc68:

Spezifische Sonde für Lactococcus lactis ssp. cremoris. Sondenposition 68-89

Lla271:

Die Sonde ist eine Gruppensonde von Lactococcus, die alle Untergruppen erfasst und bindet

an eine konservierte Region der 23S rDNA, die spezifisch für die Gattung der Lactococcen ist

(232-323).

2.6.5. Sonden für die Detektion von Phagenresistenzgenen

Die Sonden für den Nachweis der Phagenresistenzgene sind in den Tab. 10-14 aufgeführt.

Aus patenrechtlichen Gründen können die Sequenzen der Sonden nicht veröffentlich werden.

Sonden

Name

Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Hybridisiert mit PCR-Produkt

EpsC S1 CCT GAT ATA TTA TTT GAT TTT 21 51,9 54-74 EpsC X1

EpcC S2 AAG GAG TAC TAA GTC AGA TAA 21 50,3 82-102 EpcC X2

Inj-Pip S1 CAG GAC TTA GTA CTA GAA TGA 21 51,1 1337-1357 Inj-Pip X1

Inj-Pip S2 ACG AAT TTA TTA CTT ATT TAC 21 49,5 707-727 Inj-Pip X2

Tab. 10. Sonden zur Detektion der Gene für die Inhibition der Phagenadsorption und der Injektion der Phagen-DNA.

Sonden

Name


LldI S1 ATA ATA ATA CGA TTT TAG TGA 21 49,9 1118-1138 LldI X1

LldI S2 CAG ATT CCT CTA GAG TAG ATC 21 51,9 377-397 LldI X2

LldI S3 CTA TAT ATT GAT CGA GAA ATG 21 52,3 2083-2103 LldI X3

LldI S4 AAC GAA TTA AGA AAA TAT TAC 21 51,8 1286-1306 LldI X1

Lla1403 S1 ATA TTA ATA CGA TTT ATA TGG 21 48,4 1931-1951 Lla1403 X1

Lla1403 S2 TTA TAT GAC CAT GAG ATT ATT 21 51,7 2542-2562 Lla1403 X2

Tab. 11. Sonden für den Nachweis von Restriktions & Modifikationsystem I-Gene.


Sonden

Name


ScrFI M S1 ATA GAA AAA CAG CTA AAT ATA 21 49,9 218-238 ScrFI M X1

ScrFI M S2 TAT TAA ATA CTT TGG AAG AAC 21 51,9 611-631 ScrFI M X2

ScrFI R S1 ATT TAC GAT ATA ATA AGT TTG 21 50,0 458-478 ScrFI R X1

ScrFI R S2 GTA TAT TTT GAT AGT GGT ATG 21 49,5 712-734 ScrFI R X1

LlaI M S1 TAT ACA ATT ACC CAA TAT ACT 21 49,5 661-681 LlaI M X1

LlaI R S1 TTA TAA ATA AAA AAC TAA CCA 21 51,0 2858-2878 LlaI R X1

LlaII S1 AAG ATG TAT CTC TAC TAG CAA 21 51,1 648-668 LlaII X1; LlaII X2

LlaII S2 CTG TAG AAA ATC TAG TAA ACC 21 51,0 517-537 LlaII X2; LlaII X1

LlaBI S1 GTA AAA CAT GAA CTA ATA AGA 21 49,5 175-195 LlaBI X1

LlaBI S2 TAA TCA AGT TAA GTT CAA GTC 21 51,6 570-590 LlaBI X2

LlaBII S1 ATA ATT TTA GTT TGG TAT ATG 21 49,8 349-369 LlaBII X1

LlaBII S2 CTA TTC ATT AGA ACA TCC TAC 21 51,0 1437-1457 LlaBII X2

LlaCI S1 ATA TAA CCT GAT GTA ATT AGA 21 48,9 836-856 LlaCI X1

LlaCI S2 TAA GAA ATA AGC TAA ATA ATG 21 50,7 433-453 LlaCI X2

LlaDII S1 CTT AGG ATA TCT ATG GAA TAG 21 51,0 165-185 LlaDII X1

LlaDII S2 ATC GAA GAT AAT AGA CAC TAA 21 51,2 1266-1286 LlaDII X2

LlaKRII S1 AGT ACG GTA ATA ATA TTG AGA 21 51,7 197-217 LlaKRII X1

LlaKRII S2 AAA GTA GGG TTA ATA AAG TAA 21 51,6 1295-1315 LlaKRII X2

Tab. 12. Sonden für den Nachweis von Restriktions & Modifikationsystem II-Gene.

Sonden

Name


LlaFI S1 TCT ATA ACT CGA ACA ATA AAC

21 52,0 2528-2548 LlaFI X1

LlaFI S2 GTA TTT CGT TAG ACA GTC TAT

21 50,6 533-553 LlaFI X2

Tab. 13. Sonden für den Nachweis von Restriktions & Modifikationsystem III-Gene.

Sonden Name


AbiA S1 AGT CAT CTA CAT ATC GAA CTA 21 51,0 704-724 AbiA X1

AbiA S2 TAT ATA ACT TCC GTC AGA TAC 21 51,6 1051-1071 AbiA X1

AbiB S1 CAT TTA ATA CAT CTC TCG TAT 21 51,6 176-196 AbiB X1

AbiB S2 AGG GTA GTA GTT TTT TAA TAA 21 51,6 490-510 AbiB X1

AbiC S1 AGT TAG TAT AGG AGC AAT TAA 21 51,7 214-234 AbiC X1

AbiC S2 GTA TAC TTA ATG TGT TCA TGA 21 49,1 245-265 AbiC X1


AbiD S1 TTT CTG AAT TAC TAT ATA TGC 21 49,9 422-442 AbiD X1

AbiD S2 CTA TAT ATG CTA AAA TCT AAA 21 48,1 411-431 AbiD X1

AbiDI S1 TAA TGA AAG TAT TTA TTT GTC 21 49,9 626-646 AbiDI X1

AbiDI S2 TTC TCT TTT ATA TGA TCA TTC 21 51,4 921-941 AbiDI X1

AbiEII S1 TAC ATA TTT CAG TAA TTA CCC 21 52,0 245-265 AbiEII X1

AbiEII S2 ATA AGC TAA TAC TTC TAT CTG 21 48,6 490-510 AbiEII X1

AbiF S1 ATC ACC ACT ATA TAG ATC TTT 21 50,0 442-462 AbiF X1

AbiF S2 CTG TAT AAC CTA ACT ACG TTC 21 51,6 702-722 AbiF X1

AbiGI S1 TAT ATA TCT CCA CTC ATG TTC 21 51,2 442-462 AbiGI X1

AbiGI S2 TGA TTC TTC TCA TAT ACT CAA 21 51,8 344-364 AbiGI X1

AbiH S1 GAT AAA CAT CTT CCA TAG TAT 21 50,5 542-562 AbiH X1

AbiH S2 CAG TAT CGA ATG TAC TAT CTT 21 51,2 332-352 AbiH X1

AbiI S1 TTC TCT TAG TTA AGT AAT GGT 21 51,0 404-424 AbiI X1

AbiI S2 AAT CTT AAC TTT GTA TAG ACC 21 50,5 597-617 AbiI X1

AbiK S1 TAT TAC CGA ACT ATA TAT GTG 21 50,5 1115-1135 AbiK X1

AbiK S2 ATACACATAGTATACCATGGA 21 51,7 1266-1286 AbiK X1

AbiL S1 CGT AAA ACT ATG ACT ATC TCT 21 51,0 511-531 AbiLII X1

AbiL S2 TTA CCT TCT TTT AAA TTA CTC 21 51,6 666-686 AbiLII X1

AbiM S1 TCT TCT ACT TCT GTG TAT TTC 21 50,9 204-224 AbiM X1

AbiM S2 CTT TAT TAT TTT GTT CTG ATT 21 51,9 236-256 AbiM X1

AbiN S1 CTG TTA GTA ATT TAA CTG TTC 21 49,9 239-259 AbiN X1

AbiN S2 GAA GAC CTA TTT ATA GAT TCA 21 51,0 339-359 AbiN X1

AbiP S1 TAT AAT TTC AAC AAT ATC ATC 21 49,9 343-363 AbiP X1

AbiP S2 ACA TCT GTA TAA AGC TCT AAA 21 51,7 406-426 AbiP X1

AbiQ S1 CTA GTT ACT ATT CGA CTT CTT 21 50,7 231-251 AbiQ X1

AbiQ S2 AGT CTA GTT ACT ATT CGA CTT 21 49,8 234-254 AbiQ X1

AbiT S1 AGT ATC TTT CAT AAT CAT AGG 21 50,9 226-246 AbiTII X1

AbiT S2 TCT CAG TAT CTT TCA TAA TCA 21 51,8 230-250 AbiTII X1

AbiU S1 TTT ATC TCT TAC TAC TTC GTT 21 51,2 1102-1122 AbiU X1

AbiU S2 TAA TAG TCA TAC CAA TGT AAG 21 49,9 1439-1459 AbiU X1

Tab. 14. Sonden für den Nachweis der Abortiven Phagen Gene.


2.6.6. Sonden und Primer für das Modellsystem

Die verwendeten Sonden und Primer der untersuchten Fragmentlängen im Modellsystem sind

in den Tab. 15-16 dargestellt.



Fo Master hsdR GGTTTCATGCAAGCTTATTATCA 23 50,9 472-494

Re 147 U90222 GGCTTCAGCGGTATCTTCACTA 22 53,0 597-618

147


Re 246 U90222 GGGTATCCGCAAAACTGTA 22 47,6 699-717

246


Re 566 U90222 GGCTTCAGCGGTATCTTCACTA 22 52,3 1016-1037

566


Re 821 U90222 ATTCGTTTCATTTCCTCATCACT 23 51,4 1270-1292

821


Re 1077 U90222 GCCTGGCAACTTTCCTTTAT 20 50,4 1529-1548

1077


Re 1308 U90222 ACCATTCAAGAGTGTCCCATTAT 23 51,1 1757-1779

1308

Fo 116 hsdR TTATTTAATTGGCGGACTGAAGAC 24 53,7 640-663

Re 116 U90222 ACGAGAATGGTATATTGGCTAATCA 25 53,2 731-755

116

Tab. 15. Primer für die verschiedenen Fragmentlängen.

Sonden

Name


S1 CCT TTA AAA AAT CCA TCT TC 20 43,1 511-530 147 bp, 246 bp, 566 bp, 821 bp, 1077 bp, 1308 bp

S2 AAA TCA AAC AAA TCG GAA AC 20 46,2 673-692 116 bp, 232 bp

Tab. 16. Sonden zur Detektion der verschiedenen Fragmentlängen.

2.6.7. Testen der Sondenfunktion

Für die Überprüfung der Funktionalität der erzeugten Sonden und zur Kontrolle des

Sondenauswahlverfahrens wurden die in 2.6.2 aufgeführten Primer zur Synthese von PCR-

Produkten an definierten Kulturen verwendet (siehe 2.7.1 und 2.7.2). Zur Aufreinigung der

PCR-Produkte wurde das PCR Purification Kit der Firma Qiagen nach Angaben des

Herstellers verwendet. Die Elution der DNA erfolgte mit TE-Puffer. Der DNA-Gehalt wurde


im Photometer (GeneQuant, Pharmacia) bestimmt. Im Anschluss wurden die PCR-Produkte

mit Psoralen-PEO-Biotin markiert und quantifiziert (siehe 2.9.1 und 2.9.3). In der

Hybridisierung wurden 2 pmol DNA eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden einzeln auf dem

DNA-Microarray mit den entsprechenden Sonden hybridisiert (siehe 2.10.2).

2.7. PCR-Amplifikation

2.7.1. Probenaufbereitung

Um eine schnelle Analyse der Proben zu ermöglichen, wurden die PCR-Reaktionen mit aus

Zelllysaten freigesetzter DNA durchgeführt. Eine frische ÜN-Kultur wurde hierfür wie unter

2.2.1 in GM17-Medium angezogen. Die Kulturen wurden zum Zellaufschluss nach der

Anzucht bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Das

entstandene Pellet wurde zweimal mit 1 ml 10 mM Tris-HCl pH 9,0 gewaschen und

anschließend in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf) überführt. Nach dem letzten

Waschschritt wurden die Zellen in 1 ml 10 mM Tris-HCl bei 95°C für 10 min bei 800 rpm in

einem Thermomixer (Thermomixer 5436, Eppendorf) lysiert. Nach dem Absetzen der

Zelltrümmer als weißes Bodenpellet wurden die lysierten Kulturen bei -20°C gelagert.

2.7.2. Amplifizierung der Phagenresistenzgene

Die Amplifizierung der Phagenresistenzgene wurde entweder im Gradientencycler MJ

Research PTC-200 (Biozym) oder im MJ Research (Biozym) in einem Endvolumen von 50 µl

durchgeführt. Der PCR-Ansatz enthielt 4 µl Zelllysat, 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM

Tris-HCl pH 9,0, je 200 µM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 1 Unit Taq-Polymerase

(Pharmacia), sowie je 0,4 µM Primer. Da alle in 2.6.2 aufgeführten Primer ihren

Schmelzpunkt in einem Temperaturfenster von 4°C haben, konnten alle zur Verfügung

stehenden Primerpaare unter den selben PCR-Bedingungen eingesetzt werden:

Anfangsdenaturierung 2 min bei 95°C, 30 Zyklen Amplifikation mit je 45 sec bei 95°C, 45

sec bei 50°C und 90 sec bei 72°C und abschließender Polymerisierungsphase von 5 min bei

72°C. Der spezifische Nachweis der PCR-Produkte erfolgte über ein Agarosegel (siehe 2.7.4)

oder wie unter 2.10.6 beschrieben mit Hilfe des DNA-Microarrays.


2.7.3. Multiplex-PCR

Für die simultane Detektion von mehreren Phagenresistenzgenen wurde die DNA mit dem

Qiagen DNeasy Tissue Kit, laut dem Protokoll für Gram-positive Bakterien von Qiagen,

extrahiert. Die DNA wurde mit Aqua dest. von der Säule eluiert. Die gleichzeitige

Amplifikation von bis zu 4 Phagenresistenzgenen erfolgte mit 30 PCR-Zyklen (vgl. 2.7.2).

50 µl eines Multiplex-PCR Ansatzes enthielt 800 ng aufgereinigte DNA, 3 mM MgCl2,

50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9,0, je 200 µM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 1 Unit Taq-

Polymerase (Pharmacia), sowie je 0,2 µM Primer. Die für die Multiplex-PCR verwendeten

Primerkombinationen sind in Tab. 17 dargestellt.

Die Multiplex-PCR Produkte wurden anschließend gepoolt, mit dem Qiagen Purification Kit

aufgereinigt und mit TE-Puffer eluiert. Die Markierung wurde wie unter 2.9.1 beschrieben

durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in einem 3%igen Agarosegel für 90 min aufgetrennt

und angefärbt (siehe 2.7.4). Zusätzlich erfolgte der spezifische Nachweis der Multiplex-

Fragmente mit Hilfe des DNA-Microarrays (siehe 2.10.6).

Multiplex- PCR Nr.

Primerpaare

1 LlaDII X1 (385 bp) EpsC X2 (415 bp) LlaBII X2 (445 bp) LlaI X1 (473 bp)

2 LlaI M X1 (401 bp) LlaCI X2 (418 bp) LlaBI X1 (448 bp) Inj-Pip X1 (474 bp)

3 ScrFI R X1 (409 bp) ScrFI M X2 (421 bp) LlaII X1 (455 bp) LldI X2 (470 bp)

4 Lla1403 X1 (404 bp) LldI X3 (425 bp) EpsC X1 (499 bp) Inj-Pip X2 (465 bp)

5 ScrFI M X1 (404 bp) LlaBII X1 (460 bp) LlaII X2 (485 bp) LlaKRII X1 (401 bp)

6 LlaDII X2 (467 bp) LlaBI X2 (404 bp) LlaCI X1 (433 bp) LlaKRII X2 (439 bp)

7 ScrFI R X2 (409 bp) LldI X1 (456 bp) Lla1403 X2 (429 bp) LlaFI X1 (440 bp)

Tab. 17. Kombinationen der Multiplex-PCR Primerpaare für die Phagenresistenzgene I-III.

2.7.4. Agarose-Gelelektrophorese

Die Analyse der Bandengröße erfolgte in einem 1-3%igen TBE-Agarosegel in Gelkammern

mit 75 bzw. 100 ml Volumen (Biometra bzw. Pharmacia). Dazu wurden 10 µl PCR-Ansatz

mit 2 µl 6x Probenpuffer versetzt und mit 10 µl Molekulargewichtsmarker (40 ng/µl 1 kb

Ladder, Gibco BRL) aufgetragen. Die Anfärbung der DNA-Fragmente erfolgte durch eine


20minütige Inkubation des Gels in 1x TBE-Puffer, der 3 µg/ml Ethidiumbromid enthielt.

Anschließend wurde das Gel im UV-Transilluminator (Reprostar; Cannag) bei 302 nm

ausgewertet.

2.7.5. Einzelstrangisolierung

Die in 2.7.2 beschriebene Methode zur Amplifikation der Phagenresistenzgene wurde durch

den Einsatz von biotinylierten Antisenseprimern modifiziert. Nach der PCR lag somit ein

Strang nicht markiert und der andere Strang biotinyliert vor. Durch Streptavidin beschichtete

Magnetpartikel wurde der biotinylierte Strang vom unmarkierten Strang getrennt.

Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem Qiagen Purification Kit. Die

Konzentration der PCR-Produkte wurde photometrisch bestimmt (Pharmacia, GeneQuant).

Für die Einzelstrangisolierung von 20 pmol dsDNA wurden 200 µl der STV-beschichteten

Magnetpartikellösung (10 mg/ml, Boehringer Mannheim) in eine Mikrotiterplatte gegeben.

Die Magnetpartikel wurden dreimal im Magnetständer für 3 min auf einem Schüttler mit

180 µl TETBS gewaschen und der Überstand jeweils verworfen. 20 pmol dsDNA wurden mit

TETBS auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt, auf die Magnetpartikel pipettiert und

resuspendiert. Die Mikrotiterplatte wurde 30 min bei RT geschüttelt, um das Anbinden der

biotinylierten DNA an die STV-Magnetpartikel zu ermöglichen. Der Überstand wurde von

den Magnetpartikeln mit Hilfe des Magnetständers separiert und entfernt. Im Anschluss

erfolgte ein dreimaliges Waschen der Mikrotiterplatte mit TETBS für 3 min auf dem Schüttler

und ein letztes Waschen mit TE-Puffer für 3 min. Vor der Denaturierung wurde der TE-Puffer

entfernt und 50 µl 100 mM NaOH auf die Beads pipettiert. Die Beads wurden 3 min bei RT

auf dem Schüttler gewaschen und der Überstand, der die einzelsträngige DNA enthielt, in ein

Cup überführt. 50 µl 100 mM NaOH wurden erneut auf die restliche Lösung in der

Mikrotiterplatte gegeben und der oben beschriebene Waschschritt wiederholt. Die Überstände

wurden vereinigt und mit 50 µl 200 mM HCl, 5 µl 1 M Tris-HCl (pH 7,0) und 1 µl 0,5 M

EDTA neutralisiert. Die ssDNA wurde im Photometer quantifiziert.

2.8. Fragmentierung von genomischer DNA mit Hydroxylradikalen

Die Fragmentierung von genomischer DNA erfolgte durch eine chemische Reaktion, der

Fenton-Reaktion. Diese wurde anhand von genomischer DNA aus Kälber-Thymus (Sigma)

optimiert. 1 mg der lyophilisierten Kälber DNA wurde in 1 ml Aqua dest. aufgenommen

(1 mg/ml) und anschließend entsalzt, da restliche Salze wie z.B. Tris, die Fenton-Reaktion


hemmen. Die DNA wurde dafür mit einer sterilen Spritze in einen Dialyserahmen (Slide-A-

Lyzer 10K, Pierce) überführt und mit 0,1x PBS pH 7,0 für 24 Stunden umgepuffert. Die DNA

konnte im Anschluss für die Fragmentierung direkt verwendet werden.

Für die Fragmentierung wurde die Fe(II)-EDTA Stammlösung stets frisch hergestellt. Hierfür

wurden 50 µl 10 mM Eisenammoniumsulfat mit 50 µl Aqua dest. gemischt und im Anschluss

mit 100 µl EDTA [10 mM] versetzt [2,5 mM Fe(II)-EDTA Lösung]. 20 µl Fe(II)-EDTA

Lösung [2,5 mM] wurden dann mit 80 µl Wasser auf eine Arbeitskonzentration von 500 µM

verdünnt. Zum Abstoppen der Reaktion wurden pro 100 µl Reaktionsansatz 25 µl Stopp-

Puffer [500 mM Thioharnstoff, 50 mM EDTA] zugegeben.

2.8.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung

Es wurden 2 bis 20 µg Kälber-Thymus DNA in einem Endvolumen von 40 µl mit gleichen

Konzentrationen der Fenton Reagenzien versetzt und in einem Cup kurz gevortext. Die

Endkonzentrationen betrugen 10 mM Fe(II)-EDTA, 1 mM Natriumascorbat, 0,03 % (siehe

Tab. 18). Die Ansätze wurden für 30 min bei RT auf einem Thermomixer inkubiert. Im

Anschluss wurden 20 µl Stopp-Puffer zu den Reaktionen gegeben. 10 µl Probe wurden für die

Analyse mit 2 µl Probenpuffer vermischt. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in einem

1%igen Agarosegel für 45 min bei 100 Volt. Das Gel wurde wie unter 2.7.4 angefärbt. Die

Negativ-Kontrolle enthielt 10 µg Thymus-DNA, die sofort nach der Zugabe der Reagenzien

abgestoppt wurde.

Reagenzien 2 µg gDNA 5 µg gDNA 10 µg gDNA 15 µg gDNA 20 µg gDNA

Thymus DNA [1 µg/µl]

2 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl

1xPBS 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl

Natriumascorbat [10 mM)

4 µl 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl

H2O2 [0,3 %] 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl

FE(II)-EDTA [50 µM]

8 µl 8 µl 8 µl 8 µl 8 µl

H20 18 µl 15 µl 10 µl 5 µl -

Gesamt-Volumen 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl

Tab. 18. Eingesetzte Mengen zur konzentrationsabhängigen Fragmentierung von DNA über die Fenton-Reaktion.


2.8.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung

Die temperaturabhängige Fragmentierung wurde bei 20°C, 30°C, 40°C oder 50°C auf dem

Thermomixer für 0, 1, 2, 3, 4, 5 und 10 min durchgeführt. 10 µl Kälber Thymus DNA

[1 µg/µl] wurden mit 8 µl 1x PBS, 8 µl Natriumascorbat [50 mM], 32 µl Fe(II)-EDTA

Komplex [125 µM], 8 µl 0,3 % H2O2 und 14 µl H2O versetzt. Das Endvolumen betrug 80 µl

[0,1x PBS, 5 mM Natriumascorbat, 50 µM Fe(II)-EDTA Komplex, 0,03% H2O2]. Nach

Ablauf der Zeit wurden 10 µl Probe mit 2 µl Stopp-Puffer und 2 µl Probenpuffer gemischt.

Die Produkte wurden wie unter 2.7.4 beschrieben in einem 1%igen Agarosegel für 45 min

aufgetrennt und angefärbt.

2.8.3. Optimiertes Protokoll für die Fragmentierung von genomischer DNA

Für die Fragmentierung von genomischer DNA aus Bakterien musste die gDNA, nachdem sie

mit dem Qiagen DNeasy Kit extrahiert wurde, für die Fenton-Reaktion umgepuffert werden

(Microcon-30, dreimal mit 500 µl 0,1xPBS, 7 min bei 14.000g). Genomische DNA die mit

dem AGOWA Kit extrahiert wurde, konnte direkt nach der Extraktion fragmentiert werden,

wenn nach dem zweiten Waschvorgang mit dem im Kit enthalten Waschpuffer BLM 2, die

DNA mit 70%igen Aceton gewaschen wurde. Der DNA-Gehalt wurde photometrisch

bestimmt.

Die optimierte Fragmentierung von 10 µg beinhaltet eine Endkonzentration von 0,1x PBS,

5 mM Natriumascorbat, 50 µM Fe(II)-EDTA Komplex und 0,03% H2O2 in einem 80 µl

Reaktionsvolumen. Für die Fragmentierung von mehr als 10 µg wurden die Volumina auf ein

Vielfaches von 80 µl erhöht, die Endkonzentrationen der Reagenzien blieben hingegen

unverändert. Der Reaktionsansatz wurde für 5 min bei 30°C in einem Thermomixer inkubiert

und nach Ablauf der Zeit mit 25 µl Stopp-Puffer pro 100 µl Reaktionsansatz abgestoppt. Die

fragmentierte DNA wurde im Anschluss zweimal mit 500 µl TE-Puffer in einem Microcon-30

(Millipore) umgepuffert. Die Elution der DNA erfolgte für 3 min bei 1000 g. Der DNA-

Gehalt wurde schließlich photometrisch bestimmt.


2.9. Markierung von DNA

2.9.1. Markierung von PCR-Produkten mit Psoralen-PEO-Biotin

Zum Austesten der Sondenfunktionalität und zum Nachweis von PCR-Produkten mit dem

DNA-Microarray wurden die Phagenresistenzgene, wie in 2.7.2 und 2.7.3 beschrienen,

zunächst amplifiziert und die entstandenen PCR-Produkte dann mit Psoralen-PEO-Biotin

(Pierce) markiert. Hierfür wurde der DNA-Gehalt nach der Amplifizierung photometrisch

bestimmt. Die Menge des einzusetzenden Psoralen-PEO-Biotins wurde folgendermaßen

berechnet:

XP

VLn=

** (1)

n: Unmarkierte DNA in pmol

L: Länge des PCR-Produktes

V: Markierungsverhältnis pmol Psoralen zu pmol DNA-Base

P: Konzentration von Psoralen-PEO-Biotin in µM

X: Einzusetzende Menge an Psoralen-PEO-Biotin in µl der Stocklösung [20 mM]

Die PCR-Produkte wurden mit dem Qiagen Purification Kit aufgereinigt und mit TE-Puffer

eluiert. Der DNA-Gehalt wurde photometrisch bestimmt. Im Anschluss wurde die zu

markierende DNA in ein 100 µl Cup überführt und mit TE-Puffer, abzüglich der

einzusetzende Menge an Psoralen, auf ein Volumen von 50 µl aufgefüllt. Die PCR-Produkte

wurden in einem PCR-Cycler (Landgraf) für 10 min bei 95°C denaturiert. Nach der

Denaturierung wurden die Reaktionsgefäße schnell in einen –80°C Kühlschrank überführt

und für 15 min schockgefroren, um eine Renaturierung zu unterbinden. Dieser Schritt konnte

durch flüssigen Stickstoff ersetzt werden, wobei dieser über die Reaktionsgefäße gegossen

wurde. Die gefrorene DNA-Lösung wurde bei 4°C in der Hand aufgetaut, im Dunkeln mit der

entsprechenden Menge an Psoralen-PEO-Biotin [20 mM] versetzt, gevortext und auf Eis

gestellt. Eine 96 Well Mikrotiterplatte (Falcon) wurde vorher in einem Eis-Bad positioniert

und die gekühlten Proben in die Wells pipettiert.

Das UV-Crosslinken erfolgte anschließend bei 366 nm für 25 min bei 4°C mit einer UV-

Lichtquelle (Ulta-Lum, Ambion). Nach der UV-Bestrahlung wurden die Proben aus den

Wells in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Die Entfernung nicht gebundener Psoralen-PEO-


Biotin Moleküle erfolgte durch die Fällung der DNA. Dafür wurde die DNA mit 1/10

Volumenanteil 3 M Natriumacetat pH 4,8 und 2,5 Volumenanteilen eiskaltem 100% Ethanol

versetzt und bei –20°C für 30 min präzipitiert. Nach einem Zentrifugationsschritt von 30 min

bei 13.000 rpm, wurde der Überstand vorsichtig dekantiert. Im Anschluss wurden 500 µl

eiskaltes 70 %iges Ethanol ins Reaktionsgefäß pipettiert und erneut 20 min bei 13.000 rpm

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet unter einem Abzug für 15 min

getrocknet, um restliches Ethanol zu entfernen. Die markierte DNA wurde in 20 µl Aqua dest.

aufgenommen und direkt für die Hybridisierung eingesetzt oder bei -20°C gelagert (siehe

2.10.2).

2.9.2. Kontrolle der Markierungsreaktion mittels Streptavidin-Gelshiftassay

Zur Überprüfung der Markierung der DNA, wurde ein Gelshiftassay durchgeführt. Dazu

wurden ca. 1 pmol markierte DNA mit 4 µl Streptavidin (16 pmol/µl) für 30 min bei RT auf

einem Thermomixer inkubiert. Zu diesem Ansatz wurden 2 µl Probenpuffer gegeben und die

markierten Produkte in einem 2%igen Agarosegel für 90 min aufgetrennt. Die Auswertung

des Gels erfolgte nach durchgeführter Ethidiumbromidfärbung auf einem Transilluminator,

mit anschließender Graustufenanalyse des digitalisierten Bildes mit der Software Gel-Pro.

2.9.3. Direkter Vergleich des PCR-Primer Endlabels und der Psoralen-PEO-

Biotin Markierung

Für den direkten Vergleich des PCR-Primer Endlabels und der Psoralen-PEO-Biotin

Markierung wurden die Signalintensitäten der Hybridisierung miteinander verglichen. Hierzu

wurden die in Tab. 15 aufgeführten Primer verwendet, um PCR-Produkte von 116 bp bis

1308 bp zu synthetisieren. Die PCR-Reaktionen wurden entweder mit 5’ endmarkierten Cy5-

Primern oder mit nicht markierten Primern durchgeführt. Letztere wurden im Anschluss, wie

unter 2.9.1 beschrieben markiert, aufgereinigt und in Wasser aufgenommen. Da eine

Konzentrationsbestimmung der Produkte über das Photometer nicht möglich ist, wurde der

DNA-Gehalt mit der Software Gel-Pro bestimmt. Dafür wurde 1 µl der Produkte mit 1 µl 6x

Probenpuffer und 4 µl Wasser versetzt, und mit 10 µl des Molgewichtsmarkers (100 ng/µl)

auf ein 1%iges Agarose-Gel aufgetragen. Die Konzentration der endmarkierten PCR-

Produkte konnte photometrisch bestimmt werden. Je 1 pmol PCR-Produkt wurde für die

Hybridisierung eingesetzt und für 2 Stunden auf dem Slide hybridisiert (siehe 2.10.2).


2.9.4. Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration

Das optimale Verhältnis zwischen DNA-Base und Psoralen-PEO-Biotin wurde durch die

Variation der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration untersucht. Dazu wurden gleiche Mengen

der PCR-Produkte 246 bp, 566 bp und 821 bp (siehe Tab. 15) mit einer ansteigenden Menge

an Psoralen-PEO-Biotin versehen. Das Verhältnis zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-

Base variierte in den Verhältnissen 30:1, 15:1, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 und 1:10. Die

einzusetzende Psoralenmenge wurde wie unter 2.9.1 berechnet. Die Stammlösung des

Psoralen-PEO-Biotins [20 mM] wurde mit TE-Puffer auf 2 mM verdünnt, da sonst zu kleine

Volumina pipettiert werden mussten. Die Volumina wurden mit TE-Puffer auf 40 µl

Markierungsvolumen aufgefüllt und wie unter 2.9.1 markiert. Die Produkte wurden nach der

Markierung in 20 µl Wasser aufgenommen. Die Konzentration der Psoralen-PEO-Biotin

markierten DNA wurde nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der DNA über ein

Agarosegel und der anschließenden Auswertung der Banden mit Gel-Pro ermittelt (vgl. 2.9.3).

Im Anschluss wurde 1 pmol des markierten PCR-Produktes wie unter 2.10.2 hybridisiert.

2.9.5. Markierung von genomischer DNA

Für die Markierung von genomischer DNA wurde ein Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen

Verhältnis von 8:1 gewählt. Die einzusetzende Menge an Psoralen-PEO-Biotin wurde wie

folgt berechnet:

XP

VG=

1515** (2)

G: Unmarkierte gDNA in µg

V: Markierungsverhältnis pmol Psoralen zu pmol DNA-Base

P: Konzentration von Psoralen-PEO-Biotin in µM

X: Einzusetzende Menge an Psoralen-PEO-Biotin in µl der Stammlösung [20 mM]

1515: Konvertierungsfaktor von µg in pmol

Die Nukleinsäure, wurde wie unter den in 2.9.1 aufgeführten Protokollvorschriften, markiert

und bis zur Hybridisierung bei -20°C gelagert.


2.10. DNA-Microarray Hybridisierung

2.10.1. Chipherstellung und Sondenpositionierung

Für die Hybridisierung der PCR-Produkte und der genomischen DNA auf DNA-Microarrays

wurden Pico-Slides der Firma PicoRapid (Bremen) verwendet. Die Slides besitzen eine

Phenyldiisothiocyanat (PDITC) Oberfläche, an die aminomodifierte Oligonukleotide kovalent

gebunden werden können. Die Sonden (siehe Tab. 9 und Tab. 11-15) wurden mit einer 5’C6-

Aminolink Modifikation bestellt und in Wasser aufgenommen (100 µM Stammlösung). Die

Sondenoligonukleotide wurden mit Wasser auf 10 µM verdünnt. Mit einem Top-Spotter

wurden die Sonden, in einer Arraygröße von 6 x 4 Spots, auf einen Slide aufgebracht und

immobilisiert. Die Anzahl der Arrays auf den einzelnen Slides war variabel. Nach dem

Aufbringen der Sonden erfolgte die kovalente Sondenanbindung für 24 Stunden in einer

feuchten Kammer, bevor die freien reaktiven Gruppen auf dem Slide nach den Angaben des

Herstellers in einem Blockierungschritt deaktiviert wurden. Unter Argon Schutzgas wurden

die PicoSlides luftdicht in Slideboxen eingeschweißt. Die Lagerung der Chips erfolgte bei

-20°C; mit einer maximalen Haltbarkeit von 3 Monaten.

2.10.2. Hybridisierungsprotokoll

Die blockierten PicoSlides wurden bei RT aufgetaut und in 25 ml Prähybridisierungspuffer (2

mg/ml BSA, 500 µg/ml Heringssperma, 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4 und 0,01 %

SDS) für eine Stunde bei 48°C prähybridisiert. Die Slides wurden nach dem Prähybridisieren

kurz mit Wasser abgespült und mit Luftdruck getrocknet. Die markierte DNA wurde in 2x

Hybridisierungspuffer aufgenommen und mit Wasser auf 100 µl aufgefüllt. Die

Endkonzentration des Hybridisierungspuffers betrug 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl

(pH 7,4) und 0,01 % SDS. Die Probenlösung wurde 10 min bei 95°C denaturiert, für 10 min

auf Eis gestellt und kurz zentrifugiert. Im Anschluss wurde die Probe mittig auf den Slide

pipettiert. Der Slide wurde mit einem Deckglas versehen, so dass sich die Flüssigkeit

gleichmäßig verteilen konnte. Es folgte eine Hybridisierung für 1–2 Stunden bei 46°C in einer

feuchten Hybridisierungskammer (Vermicon) in einem Wärmeschrank. Nach der

Hybridisierung wurde das Deckglas durch leichtes Schwenken des Slides in einer mit Wasser

gefüllten Küvette abgelöst. Die Slides wurden in eine Glasküvette überführt und mit 100 ml

Waschpuffer bei 46°C auf einem Schüttler für 10 min gewaschen. Im Anschluss wurden sie

kurz mit Wasser abgespült und erneut mit Luft getrocknet. Die Slides konnten nach der


Hybridisierung von endmarkierten PCR-Produkten sofort mit einem Fluoreszenzscanner

(Axon), bei einer PMT von 500 im Cy3-Kanal und 750 für den Cy5-Kanal, gescannt werden.

Für PCR-Produkte, die Psoralen-PEO-Biotin markiert wurden, erfolgte eine Inkubation mit

Streptavidin-Cy5 (Zytomed). Dazu wurde der getrocknete Slide mit 100 µl STV-Cy5

Detektionslösung inkubiert, die 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % SDS und 80

pmol Streptavidin-Cy5 enthielt. Der Slide wurde mit einem Deckglas abgedeckt. Die

Anbindung des Streptavidin an die biotinylierte DNA fand für 20 min bei RT im Dunkeln

statt. Das Deckglas wurde nach der Inkubation mit einer wassergefüllten Küvette durch

vorsichtiges schwenken entfernt und der Pico-Slide für 10 min mit 100 ml Waschpuffer

gewaschen. Der Slide wurde mit Luftdruck getrocknet und mit den oben beschriebenen

Einstellungen am Axonscannen gescannt.

2.10.3. Auswertung der Hybridisierung

Die Rohdaten der Hybridisierungsergebnisse wurden mit der Software GenePix 4.1 (Axon)

ermittelt. Für die Berechnung der absoluten Signalintensität der Sonden, wurde der lokale

Hintergrund vom eigentlichen Sondensignal (Median) subtrahiert. Die Daten wurden in das

Computerprogramm Excel importiert und der Mittelwert der absoluten Signalintensitäten der

jeweiligen Sonden, die mehrfach auf dem Array vorhanden waren, gebildet. Die

Standardabweichung wurde aus dem Mittelwert dieser absoluten Signalintensitäten errechnet.

Jede Sonde befand sich bis zu zehnmal auf dem Array. Die erhaltenen Daten wurden mit

Excel in Diagrammen visualisiert.

Zur Absicherung der Ergebnisse wurde bei jeder Hybridisierung das Oligonukleotid M13B-

Cy3 (5’ GTAATC-ATGGTCATAGCTGTT-3’) als positive Kontrolle in der

Hybridisierungslösung mitgeführt. Anhand dieser Positiv-Kontrolle konnten die

Schwankungen zwischen den einzelnen Slides und den Hybridisierungen aufgrund der

Signalintensitäten der Sonde M13cB-Amino (5’-AACAGCTATGACCATGATTAC-3’)

normiert werden. Als Negativ-Kontrolle wurde die Sonde To-C (5’-

ATGTAATCTAATTTTCAGAGC-3’) eingesetzt, eine Sequenz aus der Tomate, die keine

Homologien zu den untersuchten Genen aufzeigt. Alle Hybridisierungen waren zweifach

Bestimmungen, um die Ergebnisse statistisch abzusichern.


2.10.4. Optimierung der STV-Cy5 Detektionsreaktion

Die optimale einzusetzende Streptavidin-Cy5 Menge wurde durch Variationen der

Streptavidin-Cy5 Konzentration bestimmt. Hierfür wurden die PCR-Produkte 246 bp, 566 bp

und 821 bp synthetisiert (siehe 2.7.2) und wie unter 2.9.1 mit einem Markierungsverhältnis

von 15:1 markiert. 1 pmol des PCR-Produktes wurde, wie unter 2.10.2 beschrieben, einzeln

auf einem Slide hybridisiert. Die DNA Konzentration der markierten PCR-Produkte wurde

zuvor über ein Agarosegel und Gel-Pro bestimmt (vgl. 2.9.3). Die Hybridisierung wurde nach

zwei Stunden abgebrochen. Die Detektion der Hybridisierung erfolgte mit unterschiedlichen

Streptavidin-Cy5 Konzentrationen (200, 400, 800, 1600, 3200 und 6400 nM). Es wurden

1,25 µl, 2,5 µl, 5 µl, 10 µl, 20 µl bzw. 40 µl Streptavidin-Cy5 (16 pmol/µl) mit 50 µl 2x

Hybridisierungspuffer gemischt und mit Wasser auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt.

2.10.5. Hybridisierung gegen einen Sondengradienten

Zur Überprüfung von eventuellen sterischen Effekten, die das Anbinden des STV-Cy5

Konjugats an die Psoralen-PEO-Biotin markierte DNA behindern könnte, wurden die Sonden

S1 und S2 in verschiedenen Verdünnungen (10 µM, 5 µM, 1 µM, 0,5 µM und 0,1 µM) auf

den DNA-Chips immobilisiert. In einer anschließenden Hybridisierung mit dem Psoralen-

PEO-Biotin markierten PCR-Produkten (246 bp, 566 bp und 821 bp) sollte der Einfluss der

Sondenverdünnungen auf das Hybridisierungssignal getestet werden. Für die Hybridisierung

wurde jeweils 1 pmol Psoralen-PEO-Biotin markiertes PCR-Produkt eingesetzt. Die

Hybridisierung erfolgte wie in 2.10.2 beschrieben.

2.10.6. Spezifischer Nachweis von Genen mit dem DNA-Microarray

Der Nachweis von funktionellen Genen nach ihrer Amplifikation über die PCR erfolgte mit

spezifischen Sonden (vgl. 2.6.7) mit dem DNA-Microarray. Dafür wurden die

nachzuweisenden Gene mit den in 2.6.2 aufgeführten Primern, wie unter 2.7.2 bzw. 2.7.3

beschrieben, amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit dem Qiagen Purification-Kit

aufgereinigt, Psoralen-PEO-Biotin markiert und auf dem DNA-Microarray mit den

entsprechenden Sonden hybridisiert (siehe 2.9.1 und 2.10.2).


2.10.7. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA

Das unspezifische Anbinden der genomischen DNA an die Slide-Oberfläche wurde durch

verschiedene Blockierungsschritte optimiert. Der Prähybridisierungs-, Hybridisierungs-,

Wasch- und Detektionspuffer wurde hierfür variiert. Die erfolgreiche Optimierung wurde

über das Signal zu Hintergrundverhältnis zweier Sonden ermittelt. Hierfür wurden die

Signalintensitäten und der lokale Hintergrund der Sonden EUB338 und LldI S1 ausgewertet.

Die Hybridisierung erfolgte wie in 2.10.2 beschrieben, zusätzlich aber mit den unten

aufgeführten Modifikationen. Es wurde je 1 pmol des Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-

Produktes LldI X1, 1 pmol des Cy5-endmarkierten PCR-Produktes 16S und 5 µg

fragmentierte Psoralen-PEO-Biotin markierte Thymus-DNA in der Hybridisierungslösung

eingesetzt. Psoralen-PEO-Biotin markierte Thymus DNA wurde als genomische DNA

verwendet, da keine Kreuzreaktionen, mit den Sonden EUB338 und LldI S1 festgestellt

werden konnten. Die Hybridisierung wurde mit 80 pmol STV-Cy5 nachgewiesen.

Das PCR-Produkt 16S (223 bp) wurde über konservierte Primer, 16S-3Fo (5’-

CACACTGGAACTGAGACACGG-3’) und 16S-3Re (5’-TATTACCGGGGC-TGCTGG-3’)

aus der 16S rDNA amplifiziert. Als Template für die Amplifizierung der beiden PCR-

Produkte wurde die Starterkultur Probat 505 verwendet. Die Bedingungen der PCR sind in

2.7.2 beschrieben. Das PCR-Produkt 16S wurde von der Sonde EUB338 und das PCR-

Produkt LldI X1 von der Sonde LldI S1 gebunden. Für die Optimierung des

Hybridisierungsprotokolls wurden verschiedene Konzentrationen von Reagenzien in den

einzelnen Puffern ausgetestet, um den Hintergrund zu reduzieren (siehe Tab. 19).

A B C D E

BSA in der Prähybridisierungslösung

0 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml

Milchpulver im Waschpuffer

0 % 2 % 4 % 6 % 8 %

BSA in der STV-Cy5 Detektionslösung

0 mg/ml 0,2 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml

BSA in der Hybridisierungslösung

0 µg/µl 0,2 µg/µl 0,5 µg/µl 1 µg/µl 2 µg/µl

Psoralen in der Prähybridisierungslösung

0 µg/ml 0,4 µg/ml 4 µg/ml 20 µg/ml 40 µg/ml

Tab. 19. Eingesetzte Konzentrationen zur Verbesserung des Signal zu Hintergrund Verhältnisses.


2.10.8. Hybridisierungsprotokoll für genomische DNA

Für die Hybridisierung von genomischer DNA wurde das Hybridisierungsprotokoll variiert.

Die extrahierte, fragmentierte und markierte DNA wurde mit einem GeneFrame (AP-Gene)

auf einen prähybridisierten Slide für 20 Stunden hybridisiert [900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl

pH 7,4, 0,01 % SDS und 0,5 µg/µl BSA]. Das Volumen wurde durch den Geneframe auf 70

µl reduziert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit dem Waschpuffer II [900 mM NaCl,

20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,01 % SDS und 4 % Milchpulver] bei 46°C auf einem Schüttler

für 10 min. Der Hybridisierungsnachweis erfolgte mit 35 µl STV-Cy5 Detektionslösung, die

900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % SDS und 29 pmol Streptavidin-Cy5, enthielt.

Die Detektionslösung wurde auf den Array pipettiert, mit einem Deckglas (24 mm x 24 mm)

abgedeckt und 20 min bei RT inkubiert. Das Deckglas wurde mit einer wassergefüllten

Küvette vorsichtig durch schwenken entfernt und der Slide für 10 min mit 100 ml

Waschpuffer gewaschen. Der Slide wurde wie unter 2.10.2 beschrieben getrocknet.

2.10.9. Tyramid Signalamplifikation

Für die Signalverstärkung mit TSA auf dem DNA-Microarray wurde genomische DNA wie

unter 2.10.8 beschrieben vorbereitet. Auf die Prähybridisierung und das BSA in der

Hybridisierungslösung wurde verzichtet. Die Hybridisierungslösung enthielt dafür 1 %

Blockierungsreagenz (Roche). Die Hybridisierung erfolgte im Geneframe für 18 Stunden bei

46°C auf dem Slide. Anschließend erfolgte ein 10 minütiger Waschschritt bei 46°C im

Waschpuffer. Der Nachweis der Hybridisierung erfolgte mit 35 µl STV-HRP

Detektionslösung pro Subarray, die 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % SDS und

1,4 µg Streptavidin-HRP (Zymed) enthielt. Die Detektionslösung wurde auf den Array

pipettiert, mit einem Deckglas (24 mm x 24 mm) abgedeckt und 20 min bei RT inkubiert. Der

Slide sollte ab diesem Zeitpunkt nicht mehr trocken fallen. Das Deckglas wurde entfernt und

der Slide für 10 min im Waschpuffer bei RT gewaschen. Im Anschluss erfolgte ein

Pufferaustausch für die Signalamplifikation für 5 min auf einem Schüttler in 1x PBS.

Anschließend wurde auf den nassen Slide 25 µl des frisch angesetzten TSA-

Amplifikationspuffers pipettiert, der durch die Zugabe von 1 µl Tyramid-Cy5 (Perkin-Elmer)

und 10 µl der H2O2 Lösung (5 µl 30% H2O2 in 1000 µl PBS) zu 1000 µl Amplifikationspuffer

hergestellt wurde. Der Slide wurde mit einem Deckglas für 15 min bei 37°C in einer

Hybridisierungskammer (Vermicon AG) inkubiert. Das Deckglas wurde entfernt und es folgte

ein fünfminütiger Waschritt bei RT in 1x PBS auf einem Schüttler. Der Slide wurde wie unter

2.10.2 beschrieben getrocknet und gescannt.

3. Ergebnisse

48

3. Ergebnisse

3.1. Modellsystem für die Markierungsreaktion mit Psoralen-PEO-Biotin

Die Anwendbarkeit und die Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode

wurde anhand eines Modellsystems mit verschiedenen PCR-Produkten aus dem

Phagenresistenzgen lldI auf dem DNA-Microarray getestet. Die Primer und die Sonden für

dieses System wurden über die Software Oligo6 und DNA-Star generiert (vgl. 2.6.1 und

2.6.3).

Mit diesem Modellsystem konnte der Einfluss der Fragmentlänge und die

Sondenbindungstelle auf die Hybridisierungseffizienz untersucht werden. Wie in Abb. 6

dargestellt, variierten die mit DNA-Star generierten Fragmente im Modellsystem in ihrer

Länge vom kleinsten Fragment mit 116 Basenpaaren bis zum größten Fragment mit 1308

Basenpaaren. Der Nachweis der Fragmente auf dem DNA-Microarray erfolgte mit zwei

Sonden, die mit der Software Oligo6 generiert wurden. Es wurde eine endständige Sonde S1

und eine mittelständige Sonde S2 verwendet, bezogen auf die Fragmentlängen die größer oder

gleich 566 bp waren. Für kleinere Fragmente unter 566 bp, waren beide Sonden endständig.

Die DNA-Fragmente wurden aus dem Phagenresistenzgen lldI über die PCR synthetisiert

(siehe 2.6.6). Als Template wurde genomische DNA aus der Starterkultur Probat 8/0

verwendet, die per PCR positiv auf das Vorhandensein dieses Plasmid-codierenden Gens

getestet wurde (siehe 2.6.2 und 2.7.2).

Abb. 6. Fragmentlängen und Positionen der Sonden S1 und S2 im Modellsystem für die Testung und Optimierung der Markierungsreaktion.

3. Ergebnisse

49

3.1.1. Test der entwickelten Primer für das Modellsystem

Die Funktionalität der generierten Primer für das Modellsystem (siehe 3.1) wurde durch die

Synthese der unterschiedlichen Fragmentlängen überprüft (siehe 2.6.6 und 2.7.2). In dem

Geldbild in Abb. 7 sind die Ergebnisse des Primertests deutlich zu erkennen. Wie theoretisch

ermittelt, konnte durch den Einsatz der Primerpaare DNA-Fragmente mit einer Länge von 116

bp, 147 bp, 246 bp, 566 bp, 821 bp, 1077 bp und ein 1308 bp aus dem Gen lldI der

Starterkultur Probat 8/0 amplifiziert werden (siehe 2.7.1). Nach der Betrachtung des

Agarosegels bleibt festzuhalten, dass alle für das Modellsystem benötigten Fragmentlängen

synthetisiert werden konnten.

Abb. 7. Geldbild zum Funktionstest der generierten Primerpaare.

3.1.2. Hybridisierung von endmarkierten PCR-Produkten auf dem DNA-

Microarray

Die Funktionalität der generierten Sonden S1 und S2 wurde durch die Hybridisierung von

endmarkierten, doppel- und einzelsträngigen PCR-Produkten getestet. Hierzu wurden die

PCR-Fragmente mit Cy5-markierten Senseprimern über die PCR endmarkiert (siehe 2.7.2).

Die Synthese der Produkte wurde durch den modifizierten Primer nicht beeinflusst (Daten

nicht dargstellt). Um den Einfluss von ssDNA und dsDNA auf die Hybridisierungseffizienz

untersuchen zu können, wurde neben den Cy5-markierten Senseprimern und den

unmarkierten Antisenseprimern in einem zweiten Ansatz Cy5-markierte Senseprimer und

biotinylierte Antisenseprimer verwendet, um die ssDNA isolieren zu können. Die

Einzelstrangisolierung erfolgte wie in 2.7.5 beschrieben. 1 pmol der doppelsträngigen bzw.

einzelsträngigen PCR-Fragmente wurden für zwei Stunden einzeln auf dem DNA-Microarray

Längen-standard

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

1500 bp

147 bp 116 bp 246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp MM

3. Ergebnisse

50

hybridisiert und ausgewertet (siehe 2.10.2). Die Hybridisierung wurde zweimal wiederholt,

um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleisten zu können. Für die Darstellung der

Hybridisierungssignale wurden die absoluten Werte anhand der Positivkontrolle M13cB

normiert (siehe 2.10.3).

Abb. 8. Hybridisierungsergebnis von 1 pmol Cy5-endmarkierter einzelsträngiger DNA.

Wie aus der Abb. 8 zu erkennen ist, können für die Sonden S1 und S2 bei allen

Fragmentlängen Hybridisierungsereignisse gemessen werden. Die Signale variierten von 2000

bis zu 14000 absoluten Signalintensitäten. Bei Fragmente die kleiner als 566 bp waren,

konnten für beide Sonden ähnliche Signalintensitäten gemessen werden. Dagegen wurden bei

längeren Fragmenten schwächere Signale für die Sonde S2 ermittelt. Insgesamt nahm für

beide Sonden die Signalintensität mit der Länge des hybridisierten Fragmentes deutlich ab.

Abb. 9. Hybridisierungsergebnis von 1 pmol Cy5-endmarkierter doppelsträngiger DNA.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

147 bp 116 bp 246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp

Fragmentlänge

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ität

S1S2

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

147 bp 116 bp 246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp

Fragmentlänge

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ität

S1S2

3. Ergebnisse

51

Im Vergleich zur Hybridisierung von einzelsträngiger DNA zeigte die Hybridisierung von

doppelsträngiger DNA schwächere Hybridisierungssignale. Die Signalintensitäten schwanken

zwischen 250 und 6500 absoluten Einheiten und nahm auch bei der Hybridisierung von

längeren Fragmenten ebenfalls stark ab (siehe Abb. 9). Im Durchschnitt zeigt die

mittelständige Sonde S2 schwächere Signale als die endständige Sonde S1. Bei dem längsten

Fragment mit 1308 bp konnte für die Sonde S2 kein Hybridisierungssignal mehr

nachgewiesen werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden erstellten Sonden und PCR-Produkte als Testsystem

für die Etablierung und Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierung verwendbar sind.

Die Hybridisierung von einzelsträngiger DNA resultiert in höhere Signalintensitäten, die aber

den Aufwand der Einzelstrangisolierung nicht rechtfertigen, da auch mit doppelsträngiger

DNA detektierbare Hybridisierungssignale nachgewiesen werden konnten. Aus diesem Grund

wurde für die weiteren Versuche auf die Einzelstrangisolierung von DNA verzichtet.

3.1.3. Kontrolle der Psoralen-PEO-Biotin Markierung mittels Streptavidin-

Gelshiftassay

Nach erfolgreicher Sondentestung mit endmarkierten PCR-Produkten im Modellsystem, sollte

die Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode an unmarkierten PCR-Produkten getestet

werden. Zu diesem Zweck wurde das Anbinden der Psoralen-PEO-Biotin Moleküle an die

DNA über einen STV-Gelshiftassay kontrolliert. In diesem Assay wurde das unmarkierte

PCR-Produkt (246 bp Fragment) mit Psoralen-PEO-Biotin markiert und im Anschluss mit

Streptavidin inkubiert (siehe 2.9.2). In Abb. 10 ist das Ergebnis des Gelshiftassays nach seiner

elektrophoretischen Auftrennung, mit Hilfe eines Graustufenanalyseprogramms Gel-Pro

dargestellt. Die Graustufenanalyse weist bei der Kontrolle, dem unmarkierten PCR-Produkt,

einen Peak bei ca. 250 Basenpaaren auf (siehe Abb. 10, grüne Linie). Deutlich sichtbar ist

hingegen der Gelshift bei dem Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkt 246 bp. Neben

dem Peak des freien PCR-Produktes bei 246 bp ist die Existenz von zwei weiteren Peaks bei

ca. 350 bp und 430 bp erkennbar (siehe Abb. 10, blaue Linie). Diese Peaks stellen

höhermolekulare Adukte der Streptavidin-Biotin Kopplung dar. Je nach Markierungsgrad des

eingesetzten PCR-Produktes kommt es zur Bindung verschiedener Mengen von Streptavidin

an die DNA. Durch die Masse von ca. 60 kD werden die Laufeigenschaften der entstandenen

Adukte verändert. Die Lage der gekoppelten Streptavidin-Moleküle ist aufgrund der

sequenzunabhängigen Markierung nicht definierbar. Die verschiedenen Produkte innerhalb

3. Ergebnisse

52

einer Bande sind dementsprechend divers und nehmen mit steigender Menge an gebundenem

STV zu.

Als Ergebnis dieses Experimentes konnte das Funktionsprinzip der Psoralen-PEO-Biotin

Markierung unter den gewählten Parametern nachgewiesen werden, ohne die eine Bindung

der STV-Moleküle und damit der beschriebene Gelshift nicht möglich wäre.

Abb. 10. Streptavidin Gelshiftassay des 246 bp Fragmentes (grün: unmarkiert; blau: markiert)

3.1.4. Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten

auf dem DNA-Microarray

Nach erfolgreicher Testung der Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode im Gelshiftassay

erfolgte die Adaptierung dieser Methode an die DNA-Chip Technologie.

Dazu wurden die unmarkierten PCR-Produkte 116 bp bis 1308 bp mit Psoralen-PEO-Biotin,

mit einem 2:1 Verhältnis von Psoralen zu DNA-Base, markiert (siehe 2.9.1). Eine

Quantifizierung der markierten PCR-Produkte war über das Photometer nicht mehr möglich,

da Psoralen ebenso wie DNA ein Emmissionsmaxima bei 260 nm aufweist. Daher wurden die

markierten PCR-Produkte über ein Agarosegel mit einer definierten Menge eines

Molekulargewichtsmarkers quantifiziert (siehe 2.9.3). Im Anschluss wurde 1 pmol der

Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkte für 2 Stunden einzeln auf dem Chip

hybridisiert und ausgewertet (siehe 2.10.2 und 2.10.3).

MM MM

3. Ergebnisse

53

Abb. 11. Hybridisierung von 1 pmol Psoralen-PEO-Biotin markierter doppelsträngiger DNA.

Die Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten zeigt deutliche

Signale für alle eingesetzten PCR-Produkte. Wie aus der Abb. 11 zu erkennen ist, variieten

die Hybridisierungssignale von 1000 bis 39000 absoluten Signalintensitäten. Die

Signalintensität der beiden Sonden erhöhte sich mit der Länge des hybridisierten Fragmentes.

Für die endständige Sonde S1 konnte erst mit dem 566 bp Fragment deutliche Signale

gemessen werden, wohingegen für die mittelständige Sonde S2 schon beim kleinsten

Fragment mit einer Länge von 246 bp deutliche Signale detektiert wurden. Ab einer Länge

von 1077 Basenpaaren nahm die Signalintensität nicht mehr zu und erreichte in diesem

System ein Plateau.

3.1.5. Direkter Vergleich der Signalintensitäten von endmarkierter und

Psoralen-PEO-Biotin markierter DNA

Die beiden Markierungsmethoden wurden anhand der Signalintensitäten miteinander

verglichen, um die Vorteile einer mehrfachen Markierung zu verdeutlichen. Der direkte

Vergleich von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten mit denen von endmarkierten

PCR-Produkten ist in Abb. 12 dargestellt. Die Signalintensität nahm mit der Länge der PCR-

Produkte bei der Endmarkierung deutlich ab (siehe Abb. 12 A), während die Signalintensität

bei der Psoralen-PEO-Biotin Markierung bis zu einer Länge von 1077 Basenpaaren zunahm

(siehe Abb. 12 B). Es konnte eine Steigerung der Signalintensitäten bei dem längsten

Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkt im Vergleich zu dem endmarkierten PCR-

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp

Fragmentlänge

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ität

S1

S2

3. Ergebnisse

54

Produkt um den Faktor 30 gemessen werden. Die Hybridisierungssignale konnten bei den

Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten aufgrund der Mehrfach-Markierung

demnach deutlich gesteigert werden.

Abb. 12. Direkter Vergleich der Hybridisierungssignale bei der Endmarkierung (A) und der Psoralen-PEO-Biotin Markierung (B) von PCR-Produkten.

3.2. Optimierung der Markierungs- und Detektionsmethode

3.2.1. Optimierung des Verhältnisses zwischen Psoralen-PEO-Biotin und

DNA-Base

Das optimale Verhältnis zwischen DNA-Base und Psoralen-PEO-Biotin wurde durch die

Variation der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration untersucht. Dazu wurden gleiche Mengen

der PCR-Produkte 246 bp, 566 bp und 821 bp mit einer ansteigenden Menge an Psoralen-

PEO-Biotin versehen (siehe 2.9.4). Das Verhältnis zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-

Base variierte von 30:1 bis 1:10. Die Experimente erfolgten in Doppelbestimmungen. Die

Daten wurden im Anschluss normiert (siehe 2.10.3).

Bei der Optimierung des Verhältnisses von Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Base ist ein

sigmoider Kurvenverlauf zu erkennen (siehe Abb. 13 und Abb. 14). Der Kurvenverlauf beider

Sonden erreicht bei einem Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basenverhältnis von 15:1 ein

Sättigungsbereich. Die Signalintensitäten konnten durch die Erhöhung des Verhältnisses von

Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Base im Vergleich mit dem aus 3.1.4 erhaltenen Ergebnissen

um bis zu einem Faktor 3 gesteigert werden. Für das kleinste Fragment konnte bei einem

Verhältnis von 15:1 eine Signalintensität für die Sonde S1 von ca. 9000, für das mittlere

Fragment eine Signalintensität von etwa 18000 und für das längste Fragment eine

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bpA

bsol

ute

Sign

alin

tens

ität

S1

S2

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

147bp

116bp

246bp

566bp

821bp

1077bp

1308bp

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

S1

S2

A B

3. Ergebnisse

55

Signalintensität von ca. 55000 gemessen werden (siehe Abb. 13). Für die Sonde S2 konnten

ähnlich hohe Hybridisierungssignale gemessen werden. Für das kleinste Fragment mit 246 bp

konnte eine Signalintensität von ca.12000, für das mittlere Fragment etwa 28000 und für das

Längste eine Signalintensität von ca. 45000 gemessen werden (siehe Abb. 14).

Abb. 13. Abhängigkeit der Signalintensität vom Verhältnis der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration zu DNA-Base für die Sonde S1.

Abb. 14. Abhängigkeit der Signalintensität vom Verhältnis der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration zu DNA-Base für die Sonde S2.

Sonde S1

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 5 10 15 20 25 30 35

Verhältnis pmol Psoralen zu 1 pmol DNA Base

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ität

246 bp566 bp821 bp

Sonde S2

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 5 10 15 20 25 30 35

Verhältnis pmol Psoralen zu 1 pmol DNA Base

Abs

olut

e S

igna

linte

nsitä

t

246 bp566 bp821 bp

3. Ergebnisse

56

3.2.2. Optimierung der Streptavidin-Cy5 Konzentration

Der Nachweis der Hybridisierung findet über das Reportermolekül Streptavidin-Cy5 statt. Die

Optimierung der einzusetzenden Streptavidin-Cy5 Menge wurde durch die Variation der

Streptavidin-Cy5 Konzentration bestimmt. Hierfür wurden die PCR-Produkte bei einem

optimierten Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen Verhältnis von 15:1 markiert (vgl. 3.2.1)

und einzeln auf dem Chip hybridisiert. Die Hybridisierung wurde mit unterschiedlichen STV-

Cy5 Konzentrationen nachgewiesen (siehe 2.10.4).

Abb. 15. Einfluss der Streptavidin-Cy5 Konzentration auf das Hybridisierungssignal für die Sonde 1.

Wie anhand der Abb. 15 zu erkennen ist, nahm die Signalintensität für alle PCR-Produkte bis

zu einer Konzentration von 800 nM für die Sonde S1 zu. Eine weitere Steigerung der

Streptavidin-Cy5 Konzentration auf 1600 nM führte hingegen zu einer Abnahme der

absoluten Signalintensitäten der Fragmente. Für die Sonde S2 waren die Ergebnisse

kongruent (Daten nicht gezeigt). Die Abnahme ist durch die unspezifische Bindung des

Streptavidin-Cy5 an die Chip-Oberfläche zu erklären, was am Bespiel des 821 bp Fragment in

Abb. 16 gezeigt wird. Ab einer Streptavidin-Cy5 Konzentration von 800 nM wurde eine

Sättigung der Streptavidin Moleküle an die biotinylierte DNA erreicht. Höhere

Konzentrationen führten zu einem erhöhten Hintergrund, der sich negativ auf die absolute

Signalintensität auswirkte. Ab einer Konzentration von 6400 nM Streptavidin-Cy5 wurde das

eigentliche Signal vom Hintergrund überlagert. Aus diesem Grund wurde für die folgenden

Experimente eine Streptavidin-Cy5 Konzentration von 800 nM verwendet.

200400

8001600

32006400

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Abso

lute

Sig

nalin

tens

itäte

n

Streptavidin-Cy5 Konzentration in nM

246 bp

566 bp

821 bp

3. Ergebnisse

57

Abb. 16. Darstellung der Signalintensitäten mit steigender Konzentration an STV-Cy5.

3.2.3. Optimierung der Sondenkonzentration

Zur Überprüfung von eventuellen sterischen Effekten, hervorgerufen durch die Anzahl der gebundenen DNA-Moleküle an einer Sonde, die das Anbinden des 60 kDa großen Streptavidin-Moleküls an die DNA beeinflussen könnte, wurden die Sonden S1 und S2 in verschiedenen Sondenkonzentrationen auf den Chip immobilisiert (siehe 2.10.5). Ein pmol Psoralen-PEO-Biotin markiertes PCR-Produkt wurde einzeln auf dem Chip hybridisiert. Wie aus Abb. 17 zu entnehmen ist, nahm die Signalintensität mit steigender Sondenkonzentration zu und näherte sich der Sättigung. Die erhöhte Sondenkonzentration wirkte sich somit positiv auf die Signalintensität aus. Sterische Effekte, die das Anbinden der Streptavidin-Moleküle an die DNA beeinflussen könnten, konnten nicht beobachtet werden.

Abb. 17. Variation der Sondenkonzentration auf dem DNA-Microarray.

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

200 400 800 1600 3200 6400

Konzentration von Streptavidin-Cy5 in nM

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

SignalHintergrundabs. Intensität

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Sondenkozentration in µM

Abs

olut

e S

igna

linte

nsitä

t

246 bp S1566 bp S1821 bp S1246 bp S2566 bp S2821 bp S2

3. Ergebnisse

58

3.2.4. Nachweisgrenze von Psoralen-PEO-Biotin und endmarkierten PCR-

Produkten

Die Nachweisgrenze des DNA-Microarrays von endmarkierten und Psoralen-PEO-Biotin

markierten PCR-Produkten wurde ebenfalls anhand des Modellsystems getestet. Die

markierten PCR-Produkte mit einer Länge von 246 bp, 566 bp und 821 bp wurden einzeln auf

dem DNA-Microarray in den Konzentrationen 10 nM, 1 nM, 100 pM und 10 pM hybridisiert.

Die Hybridisierung der Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkte wurden mit 800 nM

Streptavidin-Cy5 auf dem DNA-Microarray nachgewiesen. Wie aus Abb. 18 zu erkennen ist,

konnten die endmarkierten PCR-Produkte bis zu einer Konzentration von 1 nM (100 fmol/100

µl) nachgewiesen werden. Konzentrationen unter 1 nM waren mit der Cy5-Endmarkierung

nicht mehr detektierbar (Daten nicht dargestellt).

Abb. 18. Nachweisgrenze für endmarkierte PCR-Produkte im Modellsystem.

Im Gegensatz dazu, konnten noch geringere Mengen von Psoralen-PEO-Biotin markierten

PCR-Produkten detektiert werden. Wie aus Abb. 19 der zu entnehmen ist, wurden Fragmente

noch bis zu einer Konzentration von 10 pM nachgewiesen, was bei einem

Hybridisierungsvolumen von 100 µl einer DNA-Menge von 1 fmol entspricht. Die

Nachweisgrenze der Methode ist auf Grundlage dieser experimentellen Daten im

Modellsystem demnach erreicht.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

246 bp S1 246 bp S2 566 bp S1 566 bp S2 821 bp S1 821 bp S2

Sonde und Produktlänge

Abs

olut

e S

igna

linte

nsitä

t

1000 fmol100 fmol

3. Ergebnisse

59

Abb. 19. Nachweisgrenze für Psoralen-PEO-Biotin markierte PCR-Produkte.

Für den direkten Vergleich der Nachweisgrenzen beider Markierungen wurde die

Hybridisierungsergebnisse des PCR-Produktes 821 bp für die Sonde S1 von 1000 fmol bis 1

fmol end- und Psoralen-PEO-Biotin-markierter DNA logarithmisch dargestellt (siehe Abb.

19). Während die Nachweisgrenze bei der Endmarkierung bei 100 fmol lag, konnten bis zu

1 fmol Psoralen-PEO-Biotin markierter DNA nachgewiesen werden. Die Sensitivität konnte

somit durch die Psoralen-PEO-Biotin Markierung im Vergleich zur Endmarkierung um den

Faktor 100 gesteigert werden.

Abb. 20. Vergleich der Nachweisgrenze für endmarkierte (A) und Psoralen-PEO-Biotin markierte DNA (B) am Beispiel der Hybridisierung des 821 bp langen PCR-Produktes für die Sonde S1.

1

10

100

1000

10000

100000

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ität

1000 fmol100 fmol10 fmol1 fmol

A B

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

246 bp S1 246 bp S2 566 bp S1 566 bp S2 821 bp S1 821 bp S2

Sonde und Produktlänge

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

1000 fmol100 fmol10 fmol1 fmol

3. Ergebnisse

60

3.3. Sondendesign und Primerauswahl

3.3.1. Datenbankrecherche

Nach erfolgreicher Etablierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierung wurden Sonden für den

Nachweis von Phagenresistenzgenen generiert. Zur Ermittlung der relevanten Sequenzen

wurde eine Datenbankrecherche in der NCBI-Datenbank durchgeführt. Die Accession-

Nummern sowie die entsprechenden Sequenzen wurden für die Auswahl der Sonden und

Primer festgehalten (siehe 2.6.2). Die codierenden Sequenzbereiche wurden herausgefiltert

und im FASTA-Format gespeichert. Redundante Sequenzeinträge wurden berücksichtigt,

indem durch das Alignment mit ClustalW konservierte Bereiche, für die Primer und Sonden,

selektiert wurden. Die codierenden Bereiche dieser Sequenzen (cds) bildeten die Grundlage

für die Sonden- und Primerauswahl. Es wurden insgesamt 34 Sequenzeinträge für

Phagenresistenzgene, die in Lactococcus beschrieben sind, gefunden (siehe Tab. 3 - Tab. 7).

Die Phagenresistenzgene wurden in vier Gruppen eingegliedert, zu denen die Inhibition der

Phagenadsorption, die Inhibition der Injektion der Phagen-DNA, die Restriktion der Phagen-

DNA und die abortiven Phageninfektion gehören (siehe 1.1.2).

3.3.2. Auswahl der Sondenoligos

Die Sonden für die Detektion der Phagenresistenzgene auf dem DNA-Microarray wurden

durch die Software Oligo6 generiert. Die Sonden wurden unter Berücksichtigung des Tm-

Wertes, sowie der inter- und intramolekularen Wechselwirkungen von der Software erstellt

(siehe 2.6.3). Für jedes Gen wurden 2 Sonden aus der generierten Liste ausgewählt. Die

Sondenfunktionalität wurde durch die Hybridisierung von spezifischen PCR-Produkten auf

dem DNA-Microarray überprüft (siehe 2.6.7). Die Lage der Sonden im PCR-Produkt war für

die Auswahl sekundär, da nach erfolgreicher Sondentestung, primär genomische DNA mit

den Sonden detektiert werden sollte. Bei der Sondenauswahl wurde aber berücksichtigt, dass

ein PCR-Produkt von beiden Sonden gebunden werden konnte, um die Anzahl der PCR bzw.

die Multiplex-PCR Ansätze für die Sondentestung zu minimieren. Wie aus den Tab. 10 - Tab.

14 zu entnehmen ist, wurden insgesamt 2 Sonden für die Detektion der Gene für die

Inhibition der Phagenadsorption, 2 Sonden für die Injektion der Phagen-DNA, 6 Sonden für

den Nachweis von Restriktions & Modifikationssystem Typ I, 18 Sonden für den R/M Typ II

und 2 Sonden für den R/M Typ III ausgewählt. Des Weiteren wurden 36 Sonden für den

Nachweis von abortiven Phagen Genen selektiert.

3. Ergebnisse

61

3.3.3. Testen der Primerfunktion

Zur Überprüfung der Primerfunktion wurden alle Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene an definierten Kulturen getestet. Die Primer wurden unter Vermeidung von Sekundärstrukturen und Primer-Dimeren generiert. Um eine spätere Verwendung der Primer für den simultanen Nachweis von mehreren Genen in einer Multiplex-PCR zu ermöglichen, wurde darauf geachtet, dass die Schmelztemperatur aller generierter Oligonukleotide untereinander um nicht mehr als 4°C variierte. Die Produktlänge sollte nur zwischen 400 und 500 bp betragen, um ein Gleichgewicht zwischen der Hybridisierungs-effizienz und der Amplifizierung gewährleisten zu können (siehe Tab. 3 - Tab. 7). Vier molekulargenetisch charakterisierte Starterkulturen und eine Quarkprobe (Glöckner, 2002) wurden zur Überprüfung der Primerfunktion für die Phagenresistenzgene der Gruppe I-IV per PCR getestet (siehe 2.7.2). In den Gelbildern in Abb. 21 und Abb. 22 sind die Ergebnisse anhand der resultierenden Banden deutlich zu erkennen.

Abb. 21. Überprüfung der Primerfunktion für die Phagenresistenzgene der Gruppen I-III.

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp MM

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

MM LlaI R

X1 LlaBI X1

LlaII X2

LlaDII X2

LlaDIIX1

LlaCI X2

LlaCIX1

LlaBII X2

LlaBIIX1

LlaBI X2

LlaII X1

473 bp

448 bp

485 bp

467 bp

385bp

418bp

433bp

445bp

460bp

404bp

455 bp

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

MM

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

MM EpsC X1

Inj-Pip X1

LlaI M X1

ScrFI R X1

ScrFI M X2

ScrFI M X1

Lla1403 X2

Lla1403 X1

LldI X3

LldI X2

LldIX1

Inj-Pip X2

EpsC X2

499 bp

474 bp

401 bp

409 bp

421bp

404bp

429bp

404bp

425bp

470bp

456bp

465 bp

415 bp

3. Ergebnisse

62

Abb. 22. Überprüfung der Primerfunktion für die Phagenresistenzgene der Gruppe IV. Nach der Betrachtung der Bandengröße bleibt festzuhalten, dass mit den generierten

Primerpaaren die erwartete Produktlänge erzielt werden konnte (siehe 2.6.2). Die PCR-

Produkte wurden nicht sequenziert, da die Primerpaare an definierten Kulturen getestet

wurden und eine Hybridisierung auf dem DNA-Microarray zur Sequenzüberprüfung erfolgte

(siehe 3.3.4). Mit den für die Gene llaKR2I, llaFI, abiA, abiF, abiI, abiK, abiT und abiU

ausgewählten Primern konnten weder aus den Starterkulturen noch aus den Quarkprobe PCR-

Produkte amplifiziert werden. Die Untersuchung des kompletten Phagenresistenzgen-

Spektrums der einzelnen Starterkulturen und der Quarkprobe ist im Anhang dargestellt (siehe

Tab. A1).

3.3.4. Testen der Sondenfunktion

Zur Kontrolle der Sondenfunktion und des Vorgehens bei der Sondenauswahl wurden die

PCR-Produkte aus 3.3.3 verwendet. Die PCR-Produkte des jeweiligen Gens wurden mit

Psoralen-PEO-Biotin markiert und zur Überprüfung der Sondenfunktion und Kreuzreaktivität,

einzeln auf dem DNA-Microarray hybridisiert (siehe 2.6.7). Die Reproduzierbarkeit wurde

durch Doppelbestimmungen statistisch abgesichert (siehe 2.10.3). Jede Sonde befand sich bis

zu zehnmal auf dem Array.

Wie aus der Abb. 23 zu entnehmen ist, variierten die Hybridisierungssignale von 1000 bis

18000 absoluten Signalintensitäten für die einzelnen PCR-Produkte der

Phagenresistenzgruppe I-III. Für die Sonden Lla1403 S2, ScrFI R S1 und LlaDII S1 konnten

nur schwache bzw. im Falle der Sonde Inj-Pip S2 keine Hybridisierungssignale mit dem

korrespondierenden PCR-Produkt detektiert werden.

Abi B

AbiC

Abi D

Abi DI

AbiE

AbiG

AbiH

AbiL

AbiM

AbiN

Abi P

Abi Q

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp MM

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp MM

505 bp

555bp

424 bp

487 bp

492bp

455bp

455bp

418bp

441bp

466bp

425 bp

341 bp

3. Ergebnisse

63

Abb. 23. Hybridisierungssignale der Sonden der Phagenresistenzgruppe I-III.

In Abb. 24 sind die Hybridisierungsergebnisse der PCR für die Phagenresistenzgene der

abortiven Phageninfektion dargestellt. Für alle Sonden konnten spezifische Hybridisierungs-

signale mit den markierten PCR-Produkten gemessen werden. Wie aus beiden Abbildungen

deutlich wird, sind die Hybridisierungssignale der einzelnen Sonden untereinander sehr

heterogen. Sie schwankten von 671 bis 25326 absoluten Signalintensitäten.

Abb. 24. Hybridisierungssignale der Sonden der Phagenresistenzgruppe IV.

Auffällig war, dass für die meisten Sondenpaare eines Gens, unterschiedlich starke

Signalintensitäten gemessen werden konnten, obwohl das gleiche Ziel-Molekül in der

Hybridisierung eingesetzt wurde. So konnte zum Beispiel für die Sonde AbiDI S1 ein Signal

von 19250 und für die Sonde AbiDI S2 von 2500 gemessen werden. Für einige Sondenpaare

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

EpsC S1

EpsC S2

Inj-P

ip S1

Inj-P

ip S2

LldI S

1

LldI S

2

LldI S

3

LldI S

4

Lla140

3 S1

Lla140

3 S2

ScrFI M

S1

ScrFI M

S2

ScrFI R

S1

ScrFi R

S2

LlaI M

S1

Lla R

1 S1

LlaII S

1

LlaII S

2

LlaBI R

S1

LlaBI R

S2

LlaBII R

S1

LlaBII R

S2

LlaCI R

S1

LlaCI R

S2

LlaDII R

S1

LlaDII R

S2

Sonde

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

AbiB S1

AbiB S2

AbiC S

1

AbiC S

2

AbiD S

1

AbiD S

2

AbiDI S

1

AbiDI S

2

AbiE S1

AbiE S2

AbiG S1

AbiG S2

AbiH S

1

AbiH S

2

AbiL S1

AbiL S2

AbiM S1

AbiM S2

AbiN S

1

AbiN S

2

AbiP S1

AbiP S2

AbiQ S1

AbiQ S2

Sonde

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

3. Ergebnisse

64

konnten aber ähnliche Hybridisierungssignale ermittelt werden, z.B. für AbiN, AbiP oder

AbiQ. Insgesamt gesehen konnten alle PCR-Produkte der Phagenresistenzgene spezifisch

über die generierten Sondensatz nachgewiesen werden, da keine falsch-positiven

Hybridisierungssignale mit den synthetisierten PCR-Produkten auf dem DNA-Microarray

detektiert werden konnten.

3.4. Fragmentierung von genomischer DNA

Für die Fragmentierung von genomischer DNA in hybridisierbare Fragmente wurde die

Fenton-Reaktion gewählt, die eine sequenzunabhängige Zerkleinerung der DNA durch

Hydroxylradikale ermöglicht. Im Modellsystem konnte das höchste Hybridisierungssignal mit

einer Fragmentlänge von 1000 bp gemessen werden (siehe 3.1.4). Daher wurde die Spaltung

der genomischen DNA durch die Fenton-Reaktion für diese Größenordnung optimiert. Zu

diesem Zweck, wurde durch die Variation der Zeit, sowie der Temperatur und der

Konzentration der Reagenzien die Bedingungen für die Fenton-Reaktion ermittelt, mit denen

die gDNA in Fragmente mit einer Länge von unter 1000 bp gespalten werden kann.

3.4.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung von genomischer DNA

Zunächst wurde bei gleich bleibender Konzentrationen der Fenton-Reagenzien die

Fragmentierung von DNA-Mengen zwischen 2 und 20 µg genomischer DNA untersucht.

Hierzu wurden die unterschiedlichen DNA-Mengen für 30 Minuten mit den Fenton-

Reagenzien inkubiert (siehe 2.8.1). Als Negativkontrolle dient ein Ansatz, bei dem die

Fenton-Reaktion sofort nach der Zugabe der Reagenzien mit einem Stopp-Puffer

unterbrochen wurde.

Wie aus Abb. 25 zu entnehmen ist, wurde die genomische DNA unterschiedlich stark

fragmentiert. Die gDNA der Negativ-Kontrolle, wurde wie erwartet nicht fragmentiert, da die

Fenton-Reaktion sofort nach dem Start abgebrochen wurde. Die genomische DNA der

Negativ-Kontrolle konnte auf Grund ihrer Größe nicht im 1 % Agarosegel komplett

aufgetrennt werden. Höher molekulare DNA war somit noch in der Geltasche sichtbar. Durch

die Extraktion der DNA wurde aber ein Teil der gDNA durch Scherkräfte degradiert. Aus

diesem Grund sind noch eine Bande bei ca. 50 kb und ein diffuser Bandenschmier zu

erkennen. Die anderen Spuren zeigen unterschiedliche DNA-Mengen nach der

Fragmentierung. Die Spur für 2 µg DNA zeigt deutlich die erfolgreiche Fragmentierung in

3. Ergebnisse

65

DNA-Größen unter 750 bp. Mengen von 5 µg bis 20 µg konnten ebenfalls fragmentiert

werden, wobei die Abhängigkeit der Fragmentgröße von der DNA-Konzentration zu erkennen

ist. Eine Menge von 5 µg DNA weist Fragmentgrößen unterhalb von 1000 bp, 10 µg hingegen

unter 1500 bp. Bei einer DNA-Menge von 15 µg bzw. 20 µg DNA wird die gDNA in

Fragmente kleiner als 4 kb bzw. 8 kb gespalten. Da in allen Spuren bis auf die

Negativkontrolle keine Banden mehr zu erkennen sind, kann davon ausgegangen werden, dass

in allen Ansätzen höher molekulare DNA komplett gespalten wurde. Die Fragmentierung ist

demnach von der DNA-Menge abhängig und wurde für die weiteren Experimente optimiert.

Abb. 25. Abhängigkeit der Fragmentgröße von der DNA-Konzentration.

3.4.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung von genomischer

DNA

Nachdem in 3.4.1 gezeigt werden konnte, dass gDNA durch die Fenton-Reaktion

konzentrationsabhängig fragmentiert werden konnte, wurde im folgenden Experiment der

Einfluss der Temperatur und der Zeit auf die Fenton-Reaktion für deren weitere Optimierung

untersucht. 10 µg genomische DNA wurden bei 20°C, 30°C, 40°C und 50°C für 0-10

Minuten fragmentiert, um die Effizienz der Fragmentierung zu verbessern. Gleichzeitig wurde

die Konzentration der Reagenzien erhöht (siehe 2.8.2).

Die Ergebnisse der zeit- und temperaturabhängigen Fragmentierung von 10 µg genomischer

DNA sind in Abb. 26 dargestellt. Anhand der Abbildung ist zu erkennen, dass zum

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

10 kb

Längen-standard

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

10 kb

Längen-standard

10 µg 2 µg 5 µg 15 µg 20 µg NK MM MM

3. Ergebnisse

66

Startzeitpunkt in allen vier Temperaturansätzen eine diskrete Bande bei 50 kb und höher

molekulare DNA in der Geltasche sichtbar waren. Die Fragmentgrößen nehmen bei allen

Ansätzen mit der Reaktionszeit ab, wobei die gDNA schon nach einer Minute in kleinere

Fragmente zerkleinert wurde. Eine diskrete Bande bei ca. 50 kb ist nicht mehr sichtbar (Spur

2-7). Deutlich zu erkennen ist die erhöhte Geschwindigkeit der Fragmentierung bei höheren

Temperaturen ab 40°C. Bei 50°C ist die genomische DNA schon nach einer Minute unter 750

bp fragmentiert, was im Vergleich zu 20°C zehn Minuten benötigt. Die optimalen

Fragmentgrößen für die Hybridisierung um die 1000 bp sind daher bei Temperaturen über

40°C und den eingesetzten Konzentrationen nicht mehr zu realisieren. Da eine zu starke

Degradierung der DNA bei zu hohen Temperaturen vermieden werden musste, wurde die

Fragmentierung von 10 µg genomische DNA in den folgenden Experimenten bei 30°C für 5

min durchgeführt. Für die Fragmentierung größerer DNA-Mengen wurde nur das Volumen an

die entsprechende DNA-Menge angepasst, die Konzentrationen blieben unverändert (siehe

2.8.3).

Abb. 26. Fragmentierung von 10 µg genomischer DNA bei 20°C (A), 30°C (B), 40°C (C) und 50°C (D) zu verschiedenen Zeitpunkten.

Die Reproduzierbarkeit der Spaltung der DNA wurde nach der erfolgreichen Optimierung

überprüft. Hierzu wurden die Schwankungsbreiten von fünf identischen Fragmentierungs-

Zeit in min

Zeit in min

A B

C D

Längen-standard

Längen-standard

250 bp

500 bp 750 bp

1 kb

10 kb

250 bp

500 bp 750 bp

1 kb

10 kb

500 bp 750 bp

1 kb

10 kb

250 bp

500 bp 750 bp

1 kb

10 kb

1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’

1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’

250 bp

MM MM

MM MM

3. Ergebnisse

67

experimenten miteinander verglichen. 10 µg genomische DNA wurde bei 30°C für 5 Minuten

fragmentiert. Dabei zeigte sich, das die Reproduzierbarkeit gewährleistet war, da keine

Schwankungsbreiten auftraten (Daten nicht gezeigt). Daher konnte ein reproduzierbares und

schnelles Protokoll für die Fragmentierung von gDNA entwickelt werden. Durch die

Variation von Zeit, Konzentration und Temperatur konnte die Fragmentierung von

genomischer DNA für Fragmentgrößen unterhalb von 1000 Basenpaaren optimiert werden.

3.5. Hybridisierung von genomischer DNA

Für die Etablierung einer PCR-unabhängigen Methode zur Detektion von Organismen und

Phagenresistenzgenen mit dem DNA-Microarray, wurde zunächst das Hybridisierungs-

protokoll für genomische DNA optimiert. Die Validierung der Methode zum direkten

Nachweis von genomische DNA wurde im Anschluss durch verschieden Beispiele überprüft.

3.5.1. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA

Das Hybridisierungsprotokoll, für die Hybridisierung von genomischer DNA, wurde an dem

in 2.10.7 beschriebenen System und verwendeten Reagenzien optimiert, da im Vergleich zu

PCR-Produkten, bei der Hybridisierung von genomischer DNA ein stark erhöhter Hintergrund

gemessen werden konnte. Durch die Blockierung der Slide-Oberfläche sollte einerseits die

unspezifische Bindung des Streptavidin-Cy5-Moleküls, andererseits die unspezifische

Bindung der genomischen DNA, verringert werden. Die Optimierung erfolgte über die

Ermittlung des Verhältnisses von Signal zu Hintergrund (S/N). Bei diesen Experimenten

handelte es sich jeweils um Doppelbestimmungen, um die Ergebnisse statistisch abzusichern.

Die Hybridisierung wurde wie in 2.10.2 beschrieben, zusätzlich aber mit denen in Tab. 20

aufgeführten Modifikationen, durchgeführt.

Als erstes wurde die Prähybridisierung verbessert. Vor der Optimierung des

Hybridisierungsprotokolls, waren die Signale kaum vom Hintergrund zu diskriminieren (siehe

Tab. 20). Durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen an BSA in die

Prähybridisierungslösung konnte das S/N-Verhältnis verbessert werden, wobei ab einer BSA-

Konzentration von 5 mg/ml keine Steigerung mehr festgestellt werden konnte. Das S/N-

Verhältnis stieg für die Sonde LldI S1 von 1,2 ohne Optimierung, auf ein Verhältnis von 9,3,

bei einer Zugabe von 5 mg/ml BSA in der Prähybridisierungslösung (siehe Tab. 20). Das für

die Sonde EUB338 von 1,8 auf 9,3. Insgesamt konnte daher eine etwa siebenfache Steigerung

3. Ergebnisse

68

des Signal/Rausch-Verhältnisses durch die Blockierung der Slide-Oberfläche mit BSA

ermittelt werden.

Durch die Einführung eines Milchpulver-Blockierungsschrittes in der Waschlösung, sollte

eine weitere Blockierung der Slide-Oberfläche, vor der Zugabe von Streptavidin-Cy5, erreicht

werden. Wie aus der Tab. 20 zu entnehmen ist, konnte durch die Zugabe von Milchpulver zur

Waschlösung das Hintergrundsignal reduziert werden und somit das S/N-Verhältnis deutlich

verbessert werden. Ab einer Konzentration von 4 % Milchpulver konnte keine Verbesserung

mehr festgestellt werden. Das unspezifische Anbinden des Streptavidin-Cy5 Moleküls konnte

durch diese Maßnahmen um den zwei Faktor verringert werden.

BSA in der Prähybridisierungs-lösung in mg/ml

0 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml

Sonde

S/N-Verhältnis

EUB 338

1,8

LldI S1

1,2

EUB 338

2,5

LldI S1

3,1

EUB 338

4,1

LldI S1

3,9

EUB 338

9,4

LldI S1

8,6

EUB 338

9,3

LldI S1

8,6

Milchpulver in der Waschlösung 0 % 2 % 4 % 6 % 8 %

Sonde

S/N-Verhältnis

EUB 338

9,3

LldI S1

8,6

EUB 338

15,1

LldI S1

13,5

EUB 338

19,5

LldI S1

20,4

EUB 338

19,6

LldI S1

20,3

EUB 338

19,7

LldI S1

20,4

BSA in der STV-Cy5 Detektionslösung 0 mg/ml 0,2 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml

Sonde

S/N-Verhältnis

EUB 338

19,7

LldI S1

20,4

EUB 338

19,5

LldI S1

20,4

EUB 338

19,8

LldI S1

20,2

EUB 338

19,5

LldI S1

21,1

EUB 338

19,6

LldI S1

20,5

BSA in der Hybridisierungs-lösung

0 mg/ml 0,2 mg/ml 0,5 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml

Sonde

S/N-Verhältnis

EUB 338

19,1

LldI S1

20,6

EUB 338

20,8

LldI S1

23,1

EUB 338

23,5

LldI S1

24,0

EUB 338

23,4

LldI S1

24,1

EUB 338

23,5

LldI S1

24,0

Psoralen in der Prähybridisierungs-lösung

0 µg/ml 0,4 µg/ml 4 µg/ml 20 µg/ml 40 µg/ml

Sonde

S/N-Verhältnis

EUB 338

23,5

LldI S1

24,0

EUB 338

29,5

LldI S1

28,6

EUB 338

30,5

LldI S1

29.1

EUB 338

30,2

LldI S1

29,3

EUB 338

30,4

LldI S1

28,9

Tab. 20. Optimierung des Signal zu Hintergrund Verhältnisses bei der Hybridisierung von genomischer DNA.

3. Ergebnisse

69

Die Zugabe von BSA zur der Detektionslösung führte bei einer Konzentration zwischen 0,2

mg/ml bis 4 mg/ml zu keiner Verbesserung der Resultate (siehe Tab. 20). Der Zusatz von

BSA während der Hybridisierung führte hingegen zu einer leichten Verbesserung des

Signal/Hintergrund-Verhältnisses. Die Zugabe von 0,5 mg/ml BSA zur Hybridisierunglösung

führte zu einer Verbesserung für die Sonde EUB338 von 19,1 auf 23,5 und für die LldI S1

von 20,6 auf 24,0. Höhere BSA-Konzentrationen konnten das S/N-Verhältnis nicht weiter

verbessern (siehe Tab. 20). Daher konnte eine Steigerung von 23 % bei der Verwendung von

0,5 mg/ml BSA in der Hybridisierungslösung erreicht werden.

Die eingefügten Blockierungsschritte führten zu keiner vollständigen Blockierung des

Hintergrundes, die bei der Hybridisierung von PCR-Produkten erreicht wurde (Daten nicht

gezeigt). Das S/N-Verhältnis erhöhte sich für die Sonde LldI S1 von 1,2 ohne Optimierung,

auf 24,0 mit Optimierung und für die Sonde EUB338 von 1,8 auf 23,5. Aus diesem Grund

wurde ein weiterer Blockierungsschritt eingefügt. Durch die Absättigung der Slide-

Oberfläche mit Psoralen, sollte ein unspezifisches Anbinden des noch freien Psoralen-PEO-

Biotins in der DNA-Lösung, welches durch die Fällung nicht ganz entfernt worden war,

verhindert werden. Wie aus der Tab. 20 zu entnehmen ist, konnte durch die Zugabe von 4

µg/ml Psoralen zur optimierten Prähybridisierungslösung eine weitere Steigerung von 29 %

des S/N-Hintergrund Verhältnisses erreicht werden.

Insgesamt gesehen konnte durch die Optimierung des Prä-, Hybridisierungs- und

Waschpuffers der erhöhte Hintergrund reduziert werden, der bei der Hybridisierung von

genomischer DNA auftrat. Durch die Zugabe von Psoralen, BSA und Milchpulver in den

einzelnen Arbeitsschritten konnte das Signal zu Hintergrund-Verhältnis für die Sonde LldI S1

von 1,2 auf 28,9 und für die Sonde EUB338 von 1,8 auf 30,4 erhöht werden. Das Signal zu

Rausch-Verhältnis konnte im Durchschnitt um 2000 % gesteigert werden Das

Hybridisierungsprotokoll für genomische DNA wurde demnach erfolgreich optimiert.

3.5.2. Hybridisierung von genomischer DNA mit unterschiedlichen

Fragmentlängen

Nach erfolgreicher Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA (siehe

3.5.1), wurden die in 3.1.4 anhand von PCR-Produkten dargestellte Abhängigkeit der

Signalintensität von der Fragmentlänge mit der Hybridisierung von genomischer DNA

verifiziert. Wie aus der Abb. 11 zu entnehmen ist, sind mit längeren PCR-Produkten höhere

Signalintensitäten als mit kürzeren zu erreichen. Für die Fragmente von ca. 1000 bp konnten

3. Ergebnisse

70

die stärksten Hybridisierungssignale gemessen werden. Analog dazu wurde genomische DNA

aus der Starterkultur Probat 8/0 extrahiert, für 5, 7.5, 10, 12.5 und 15 min, wie unter 2.8.3

beschrieben, bei 20°C fragmentiert, um Fragmentgrößen für die Hybridisierung von <100,

<500, <750, <1000 und <1500 bp zu erhalten. Die gDNA wurde mit Psoralen-PEO-Biotin wie

unter 2.9.5 markiert und im Anschluss 20 Stunden auf dem DNA-Microarray hybridisiert

(siehe 2.10.8). Die genomische DNA wurde mit validierten rDNA-Sonden aus der FISH,

nachgewiesen (siehe 2.6.4).

Abb. 27. Einfluss der Fragmentlänge auf die Hybridisierung von 10 µg genomischer DNA.

Die Abb. 27 zeigt das Hybridisierungsergebnis für 10 µg Starterkultur Probat 8/0 nach

20stündiger Hybridisierung. Die Signalintensitäten der jeweiligen Sonden beschreiben eine

Gauß-Kurve. Wurde DNA mit einer durchschnittlichen Länge von unter 100 bp hybridisiert,

waren die Signale sehr schwach, da nur sehr wenig Markierungen aufgrund der Länge der

Fragmente eingebaut werden konnten. Für genomische DNA, mit einer Länge unter 1000 bp,

konnten für alle Sonden die stärksten Hybridisierungssignale gemessen werden. Eine weitere

Erhöhung der Fragmentlänge um 500 bp führte hingen zu keiner weiteren Erhöhung der

Signalintensität. Die gemessen Signal der einzelnen Sonden nahmen für größere Fragmente

als 1000 bp sogar wieder ab. Die Signale der etwa 1000 Basenpaaren langen Fragmente,

konnten im Vergleich zu den kleinsten Fragmenten mit unter 100 bp im Durchschnitt um den

Faktor 10 gesteigert werden.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68

Sonde

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

<100 bp<500 bp<750 bp<1000 bp<1500 bp

3. Ergebnisse

71

Auffällig war, dass für alle vier Sonden, EUB338, LGGc354, Llc68 und Lll68, die das gleiche

Zielmolekül binden, unterschiedliche Signalintensitäten gemessen werden konnten. Die

Sonde EUB338, die alle Eubakterien nachweist, zeigte das schwächste Signal, die Sonde

Llc68, die für Lactococcus lactis ssp. cremoris spezifisch ist, das Stärkste. Die Sonde

LGCc354, die alle grampositiven Bakterien mit niedrigen GC-Gehalt detektiert, die Sonde

Lla271, die die Gattung Lactococcus nachweist, und die Sonde Lll68, die Lactococcus lactis

ssp. lactis bindet, zeigten mittlere Signalintensitäten. Die Signalintensität der Negativ-

Kontrolle lag auf der Höhe des Hintergrundes.

Die Abhängigkeit der Signalintensität von den Fragmentlängen konnte für genomische DNA

bestätigt werden. Für die weiteren Versuche wurde daher die genomische DNA in Fragmente

mit einer Länge von unter 1000 Basenpaaren fragmentiert, um ein Equilibrium zwischen der

Signalintensität und der Hybridisierungseffizienz gewährleisten zu können.

3.5.3. Spezifität des Nachweissystems

Die in 3.5.2 erhaltenen Daten für die Hybridisierung von genomischer DNA wurden auf ihre

Spezifität untersucht, da mit den bisherigen Experimenten nicht bewiesen werden konnte, ob

die gesamte Methode spezifisch für den Nachweis von Organismen ist oder ob es sich um

unspezifische Hybridisierungssignale handelte.

Die Spezifität der Methode wurde durch die Hybridisierung von genomischer DNA aus

Reinkulturen der Subspezies Lactococus lactis ssp. lactis und Lactococcus lactis ssp.

cremoris überprüft. Die Hybridisierungssignale von gattungsfremden Bakterien wie Bacillus

cereus, Salmonella choleraesuis LT2 und Pseudomonas fluorescens wurden zur

Untersuchung der Spezifität ebenfalls untersucht. Es wurden die Sonden Llc68, Lll68,

EUB338, LGCc354 und Lla271 für die Analyse verwendet. 10 µg gDNA des jeweiligen

Bakteriums wurden fragmentiert, Psoralen-PEO-Biotin markiert und für je 20 Stunden auf

dem DNA-Microarray hybridisiert (siehe 2.9.5 und 2.10.8).

Da die verwendeten Sonden sowohl rDNA als auch rRNA detektieren können, wurde

weiterhin überprüft, ob es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure um genomische DNA

oder rRNA handelt. Zu diesem Zweck wurden gleiche Mengen an RNase-behandelter und

nicht RNase-behandelter genomischer DNA hybridisiert.

3. Ergebnisse

72

Abb. 28. Überprüfung der Spezifität für die Hybridisierung von genomischer DNA.

Die Hybridisierung von genomischer DNA aus L.l. ssp lactis auf dem DNA Microarray führte

zu Hybridisierungssignalen für die Sonde EUB338, LGCc354, Lla271 und Lll68. Die Sonde

Llc68, für den Nachweis von L.l. ssp. cremoris, zeigte keine Signalintensitäten (siehe Abb.

28). Im Gegensatz dazu führt die Hybridisierung von genomischer DNA aus L.l. ssp cremoris

zu Signalintensitäten der Sonde EUB338, LGCc354, Lla271 und Llc68. Es konnten keine

Signalintensität für die Sonde Lll68 nachgewiesen werden, die L.l. ssp. lactis detektiert (Abb.

28). Die Hybridisierung von genomischer DNA anderer Gattungen führte zu keinen

Hybridisierungssignalen der Sonden Lla271, Llc68 und Ll68 (Daten nicht dargestellt). Für die

Sonde EUB338 konnten hingen bei allen Hybridisierungen Signale gemessen werden. Bei der

Hybridisierung von Bacillus cereus, bei dem es sich um ein grampositives Bakterium mit

niedrigem GC-Gehalt handelt, konnte zusätzlich ein Hybridisierungssignal für die Sonde

LGCc354 ermittelt werden. Die Spezifität der Methode konnte demnach durch die

Hybridisierung von genomischer DNA aus unterschiedlichen Bakterien gezeigt werden.

Die Hybridisierungsergebnisse von RNase-behandelter und nicht RNase-behandelter

genomischer DNA, zeigten keine nennenswerten Unterschiede (Daten nicht gezeigt). Aus den

experimentellen Daten kann daher entnommen werden, dass es sich bei diesem Nachweis um

genomische DNA handelt und nicht um rRNA Verunreinigungen, die bei der DNA-

Extraktion entstehen können.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68 Kontrolle

Sonde

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsiti

tät

Lactococcus lactisssp. lactis

Lactococcus lactisssp. cremoris

3. Ergebnisse

73

3.5.4. Nachweisgrenze der rDNA-Gene bei der Hybridisierung von

genomischer DNA

Die Nachweisgrenze der rDNA-Gene, bei der direkten Hybridisierung von genomischer

DNA, wurde durch die Hybridisierung von unterschiedlichen Mengen von genomischer DNA

aus Lactococcus lactis ssp. cremoris bestimmt. Der DNA-Gehalt wurde nach dem

Fragmentieren gemessen und 5, 10 bzw. 15 µg genomische DNA mit Psoralen-PEO-Biotin

markiert. Da eine Konzentrationsbestimmung nach dem Markieren mit dem Photometer nicht

mehr möglich war, wurde der komplett markierte Ansatz auf dem DNA-Microarray

hybridisiert.

Abb. 29. Nachweisgrenze für den direkten Nachweis von genomischer DNA aus L.l. ssp. cremoris auf dem DNA-Microarray.

Wie aus der Abb. 29 zu erkennen ist, zeigten die eingesetzten Mengen von 10 und 15 µg

gDNA bei allen Sonden Hybridisierungssignale. Bei der Hybridisierung von 5 µg

genomischer DNA, konnte für die Sonde EUB338 kein Hybridisierungssignal mehr detektiert

werden. Die restlichen Sonden wiesen bei dieser Menge noch schwache Signale auf. Die

Nachweisgrenze für die Detektion der rDNA-Gene liegt bei ca. 5 µg genomische DNA. Für

die Detektion von Bakterien sollte demnach mindestens 5 µg genomische DNA eingesetzt

werden, um noch Hybridisierungssignale messen zu können.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68 Kontrolle

Sonde

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ititä

t

5 µg 10 µg15 µg

3. Ergebnisse

74

3.5.5. Alternativer Nachweis von Bakterien über rRNA

Zur Überprüfung, ob sich die Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode auch für den

Nachweis von rRNA eignet, wurde RNA aus der Starterkultur Probat 8/0 extrahiert (siehe

2.4). 5 µg RNA wurde mit Psoralen-PEO-Biotin markiert (siehe 2.9.5) und auf dem DNA-

Microarray für 2 Stunden hybridisiert. Im Gegensatz zur Hybridisierung von genomischer

DNA, konnte bei der Hybridisierung von RNA auf die Fragmentierung verzichtet werden, da

native RNA-Moleküle hybridisiert wurden (~ 100-2300 Basenpaaren).

Abb. 30. Hybridisierungsergebnisse von 5 µg Psoralen-PEO-Biotin markierter RNA.

Wie aus der Abb. 30 zu entnehmen ist, führte die Hybridisierung von RNA, zu positiven

Hybridisierungssignalen der 16S und 23S rRNA-Sonden. Für die 23S Sonde Lla271 konnten

die deutlichsten Hybridisierungssignale und für die Sonden EUB338 und Lll68 die

schwächsten Signale gemessen werden. Mittlere Signalintensitäten konnten für die Sonden

Llc68 und LGCc354 detektiert werden. Der Nachweis der wesentlich instabileren mRNA der

Phagenresistenzgene, über die generierten Sonden, gelang aber nicht (Daten nicht gezeigt).

Die Psoralen-PEO-Biotin Markierungsreaktion kann somit ebenfalls für die Markierung von

rRNA verwendet werden und wäre für den Nachweis von Bakterien eine Alternative.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000


Sonde

Abs

olut

e S

igna

linte

nsitä

t

3. Ergebnisse

75

3.5.6. Direkte Detektion von Phagenresistenzgenen in Starterkulturen

Der Nachweis der Phagenresistenzgene in Starterkulturen, mit vorheriger Amplifikation über

die PCR, konnte in 3.3.4 mit dem DNA-Microarray gezeigt werden. Nach der Etablierung der

Hybridisierung von genomischer DNA auf dem DNA-Microarray (siehe 3.2, 3.4 und 3.5.1)

sollten die Phagenresistenzgene der Gruppe I-III, die zu 98 % Plasmid-codiert vorliegen, ohne

PCR nachgewiesen werden. Hierfür wurden 20 µg der charakterisierten Starterkultur Probat

8/0 (Glöckner, 2002) und 10 bzw. 20 µg der nicht charakterisierten Starterkultur Probat 505

einzeln auf dem DNA-Microarray hybridisiert. Die Hybridisierungen wurden zweimal

wiederholt. Die Starterkulturen wurden wie in 3.3.3 dargestellt auf das Vorhandensein von

Phagenresistenzgenen durch die PCR überprüft, um die Ergebnisse der Microarray-

Hybridisierung validieren zu können. Die PCR-Untersuchung des Phagenresistenzgen-

Spektrums der beiden Starterkulturen ist im Anhang dargestellt (siehe Tab. A1).

Abb. 31. Hybridisierungsergebnis von 20 µg Starterkultur Probat 8/0 auf dem DNA-Microarray mit eingezeichnetem Schwellenwert.

Wie aus Abb. 31 zu erkennen ist, konnten für die Sonden der rDNA-Gene die höchsten

Signalintensitäten gemessen werden. Die Signale schwankten von 500 für die Sonde EUB338

bis 7000 absoluten Signalintensitäten für die Sonde Llc68. Die Sonden der positiv getesteten

Phagenresistenzgene der Gruppe I-III zeigten eher schwache Signale. Lediglich für die

Sonden EpsC S2, LldI S2 und LlaII S2 konnten stärke Signalintensitäten gemessen werden.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

EUB338

LGCc 3

54

Lla271

Llc 68

Lll68

EpsC S1

EpsC S2

LldI S

1

LldI S

2

Lla140

3 S1

Lla140

3 S2

LlaII S

1

LlaII S

2

LlaBII R

S1

LlaBII R

S2

LLaC

I S1

LlaCI S

2

Kontro

lle

Sonde

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ität

3. Ergebnisse

76

Die ermittelten Signale für die Sonden der negativ getesteten Phagenresistenzgene lagen in

Höhe der Negativ-Kontrolle (Daten nicht dargestellt). Somit konnten keine falsch-positiven

Hybridisierungssignale gemessen werden.

Zur Absicherung der Hybridisierungsergebnisse für gDNA, wurde ein Schwellenwert

festgelegt. Dieser Schwellenwert betrug das Zweieinhalbfache der höchsten Negativkontrolle

(Sabatti et al., 2002). Nach Abzug dieses Schwellenwertes von den absoluten

Signalintensitäten, in diesem Fall lag der Cut-off bei 325 absoluten Signaintensitätem, zeigten

nur noch die 16S und 23S Sonden, die Sonden EpsC S2 und Lla1403 S2, LldI S1 und S2, die

Sonden LlaBII S1 und S2, und die Sonden LlaII S1 und S2, ein signifikantes Signal. Diese

Ergebnisse stimmen mit den Ergebnisse des Nachweises der Phagenresistenzgene über die

PCR überein (siehe Tab. A1). Die Signale der restlichen Phagenresistenzgen-Sonden lagen

nach der Einführung des Signifikant-Wertes unter dem Schwellenwert. Somit konnten die

Phagenresistenzgene scrFI und llaCI nicht direkt in der Starterkultur Probat 8/0 nachgewiesen

werden.

Abb. 32. Hybridisierungsergebnisse von 10 µg und 20 µg Starterkultur Probat 505 auf dem DNA-Microarray.

Die Ergebnisse der Hybridisierung von 10 und 20 µg genomischer DNA aus der Starterkultur

Probat 505 ist in Abb. 32 dargestellt. Die Sonden für die Detektion der rDNA zeigten

Hybridisierungssignale von minimal 300 bis maximal 7800 absoluten Signalintensitäten. Die

Verhältnisse der Signalintensitäten der rDNA-Sonden untereinander waren für beide

Starterkultur fast identisch (vgl. Abb. 31). Für die Sonde Llc68 konnten die eindeutigsten

Hybridisierungssignale gemessen werden.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

EUB338

LGCc 3

54

Lla271

Llc 68

Lll68

EpcC S1

EpcC S2

LldI S

1

LldI S

2

Lla140

3 S1

Lla140

3 S2

LlaBI R

S1

LlaBI R

S2

LlaBII R

S1

LlaBII R

S2

LlaII S

1

LlaII S

2

Kontro

lle

Sonde

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

10 µg20 µg

3. Ergebnisse

77

Hohe Signalintensitäten konnten ebenfalls für die Sonde des Phagenresistenzgens epsC S2 bei

10 µg detektiert werden. Die restlichen Phagenresistenzgene wiesen nur schwache Signale bei

10 µg auf. Die Verdopplung der hybridisierten Menge von 10 µg auf 20 µg an genomischer

DNA zeigte eine Steigerung der Signalintensitäten bei den meisten Sonden von ca. 100 %.

Für die Sonden der Phagenresistenzgene scrFI, llaI, llaCI und llaDII konnten keine

Hybridisierungsereignisse gemessen werden (Daten nicht dargestellt).

Die Schwellenwerte lagen nach deren Berechnung, die das Zweieinhalbfache der höchsten

Negativkontrolle entsprachen, für 10 µg genomische DNA bei 125 und für 20 µg bei 625

absoluten Signalintensitäten. Wie in Abb. 33 zu erkennen ist, konnten nach dem Abzug der

Schwellenwerte für 10 und 20 µg die rDNA-Gene eindeutig nachgewiesen werden. Das

Signal für die Sonde EUB338 war bei 20 µg nicht mehr signifikant. Die Sonden der

Phagenresistenzgene EpsC S1 und EpsC S2, LldI S1 und S2, Lla1403 S2, LlaBI S1 und S2,

LlaBII S1 und S2 lagen über dem Schwellwert für 10 µg. Bei 20 µg genomischer DNA

zeigten nur noch die Sonden EpsC S1 und S2 und die Sonde LldI S2 Signale. Dieses lag an

dem höheren Schwellenwert, da die unspezifischen Bindungen mit der Menge der

hybridisierten DNA zunehmen. Der Hintergrund und die Negativ-Kontrollen erhöhen sich

dementsprechend. Wie an den erhöhten Standartabweichungen zu erkennen ist, stieg damit

auch die Schwankungsbreite der absoluten Signalintensitäten der identischen Sondenspots auf

dem Chip. Somit konnten nur 5 der 11 in der Starterkultur Probat 505 vorhandenen

Phagenresistenzgene mit dem DNA-Microarray direkt nachgewiesen werden (vgl. Tab. A1).

Abb. 33. Hybridisierungsergebnisse für 10 und 20 µg Starterkultur Probat 505 nach Abzug des Schwellenwertes.

0

500

1000

1500

2000

2500

EUB338

LGCc 3

54

Lla271

Llc 68

Lll68

EpcC S1

EpcC S2

LldI S

1

LldI S

2

Lla140

3 S1

Lla140

3 S2

LlaBI R

S1

LlaBI R

S2

LlaBII R

S1

LlaBII R

S2

LlaII S

1

LlaII S

2

Kontro

lle

Sonde

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

10 µg20 µg

3. Ergebnisse

78

3.6. Signalamplifikation

Ein limitierender Faktor für den direkten Nachweis von funktionellen Genen mit dem DNA-

Microarray, ist die zu geringe Anzahl von Gen-Kopien pro Bakterium. Aus diesem Grund

wurden zwei unterschiedliche Strategien zur Signalamplifikation für die DNA-

Chiptechnologie getestet, um funktionelle Gene eindeutiger detektieren zu können: Die

Amplifikation der Ziel-DNA und die Verstärkung eines vorhandenen Signals. Die

Amplifikation des Ziel-DNA sollte durch den Einsatz einer Multiplex-PCR erreicht werden,

die Signalamplifikation durch eine Enzym-Substrat Reaktion auf dem Microarray.

3.6.1. Multiplex-PCR für den Nachweis von Phagenresistenzgenen

Eine Vervielfältigung der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III in 28 Uniplex-PCR-

Reaktionen ist für den Einsatz in der Routineanalytik nicht geeignet und wurde daher durch

die Verwendung von vier Primerpaaren in einer Multiplex-PCR vereinfacht (siehe 2.7.3). Für

die Amplifizierung der Phagenresistenzgene in der Multiplex-PCR wurden die in Tab. 17

aufgeführten Primerkombinationen gewählt. Es wurden die Starterkulturen Probat 505 und

Probat 8/0 untersucht. Da bis zu vier Primerpaare in einem Reaktionsansatz verwendet

wurden, war eine Identifizierung der Produkte im 3%igen Agarosegel nicht mehr eindeutig

(siehe Abb. 34), da sich die PCR-Produkte nur um wenige Basenpaare unterschieden. Es

waren keine weiteren unspezifischen Banden zu erkennen. Alle vorhandenen Banden lagen

im Bereich zwischen 385 und 550 Basenpaaren (siehe 2.6.2). Die korrekte Amplifikation, und

somit der Nachweis der Gene in den Starterkulturen, wurde mit dem DNA-Microarray

überprüft. Die Multiplex-PCR Ansätze der Starterkulturen wurden vor der Aufreinigung

vereinigt, mit Psoralen-PEO-Biotin markiert und komplett auf den DNA-Microarray

hybridisiert (siehe 2.7.3).

Abb. 34. Agarose-Gel der Multiplex-PCR Ansätze 1-7 der Starterkultur Probat 505. 1 2 3 4 5 6 7

400 bp

500 bp

Längen-

standard

300 bp

600 bp

MM MM

3. Ergebnisse

79

Das Hybridisierungsergebnis der Multiplex-PCR Ansätze der Starterkultur Probat 505 ist in

Abb. 35 dargestellt. Für die spezifischen Sonden der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III

konnten Hybridisierungssignale zwischen 1000 und 53000 absoluten Signalintensitäten

gemessen werden. Die Sonden EpsC S1, EpsC S2, Inj Pip S1, Inj Pip S2, LlaI R S1, Lla1403

S2, LlaCI S1 und LlaDII S1 zeigten schwächere Hybridisierungssignale (siehe Abb. 35). Für

die Sonden LlaKRII S1, LlaKRII S2 und LlaFI S1 konnten keine Hybridisierungssignale

detektiert werden. Diese Gene konnten in der PCR ebenfalls nicht detektiert werden (siehe

Tab. A1). Somit konnten keine falsch-positiven oder falsch-negativen Hybridisierungs-

ereignisse gemessen werden. Im Vergleich zur direkten Hybridisierung von genomischer

DNA der Starterkultur Probat 505, bei der nur 5 Phagenresistenzgene nachgewiesen wurden

(vgl. 3.5.6), konnten durch den Einsatz der Muliplex-PCR mit anschließender Hybridisierung

auf dem DNA-Microarray alle in der Starterkultur vorhandenen Phagenresistenzgene der

Gruppe I-III nachgewiesen werden.

Abb. 35. Hybridisierungsergebnis der Multiplex-PCR Ansätze von Starterkultur Probat 505.

Die Hybridisierung der Multiplex-PCR Ansätze der Starterkultur Probat 8/0 führte ebenfalls

zu positiven Ergebnissen. Wie aus der Abb. 36 zu erkennen ist, konnten Hybridisierungs-

signale zwischen 850 und 47000 absoluten Signalintensitäten gemessen werden. Für die

Sonde LlaDII S1 und LlaDII S2, LlaKRII S1 und LlaKRII S2, Inj-Pip S1 und Inj-Pip S2,

LlaFI S1, LlaBI S1 und LlaBI S2 konnten keine Hybridisierungssignale detektiert werden.

Die Ergebnisse der Multiplex-PCR mit anschließender Hybridisierung stimmten mit den

Ergebnissen der Uniplex-PCR für die Starterkultur Probat 8/0 überein (siehe Tab. A1). Somit

konnten keine falsch-positiven oder falsch-negativen Hybridisierungsereignisse nachgewiesen

1

10

100

1000

10000

100000

LldI S

1

Lla140

3 S2

ScrFI R

S2

LlaFI S

1

Inj-P

ip S1

LlaI M

S1

LlaBI R

S1

LlaCI R

S2

LldI S

2

ScrFI M

S2

ScrFI R

S1

LlaII S

1

EpsC S2

LlaI R

S1

LlaBII R

S2

LlaDII R

S1

ScrFI M

S1

LlaII S

2

LlaBII R

S1

LlaKRII S

1

LlaBI R

S2

LlaCI R

S1

LlaDII R

S2

LlaKRII S

2

EpsC S1

Inj-P

ip S2

LldI S

3

Lla140

3 S1

Sonde

Ab

solu

te S

ign

ali

nte

nsi

tät

3. Ergebnisse

80

werden. Es konnten alle 7 vorhandenen Phagenresistenzgene detektiert werden, während bei

der direkten Hybridisierung von genomischer DNA nur 5 Gene ermittelt werden konnten.

Abb. 36. Hybridisierungsergebnis der Multiplex-PCR Ansätze von Starterkultur Probat 8/0.

Der Nachweis der Phagenresistenzgene konnte mit der Multiplex-PCR mit anschließender

Hybridisierung auf dem DNA-Microarray demnach im Vergleich zur Uniplex-PCR für beide

Starterkulturen korrekt gezeigt werden (vgl. Tab A1). Die parallele Amplifizierung mit den

eingesetzten Primer-Paaren war spezifisch. Für beide Hybridisierungsergebnisse war

auffällig, dass eine starke Verschiebung der Mengenverhältnisse durch die Multiplex-PCR

detektiert werden konnte. So konnten für die PCR-Produkte eines Multiplex-PCR Ansatzes

auf der einen Seite hohe Signalintensitäten für eine Sonde, auf der anderen Seite aber auch

sehr niedrige Signalintensitäten für eine andere Sonde gemessen werden. Dieses ist

beispielhaft in Abb. 36 anhand des Multiplex-PCR Ansatzes Nr. 7 (LldI, ScrFI M, ScrFI R

und LlaII ) zu erkennen.

Der Vergleich der Hybridisierungsergebnisse zwischen der Uniplex-PCR und der Multiplex-

PCR mit anschließender Hybridisierung zeigten Unterschiede in den Höhen der

Signalintensitäten (siehe 3.3.4). Dieses ist dadurch zu erklären, dass bei der Hybridisierung

des Multiplex-Ansatzes die kompletten Multiplex-PCR Ansätze vereinigt und hybridisiert

wurden (siehe 2.7.3), während bei der Uniplex-PCR nur 2 pmol eingesetzt wurden.

Dementsprechend hoch sind die Signalintensitäten bei der Multiplex Hybridisierung für viele

Sonden. Generelle Aussagen über die Signalverstärkungsrate sind wegen den genannten

Problemen der Multiplex-PCR aber nicht zu treffen.

1

10

100

1000

10000

100000

EpsC

S2

LlaI R

S1

LlaBI

I R S

2

LlaDII

R S1

LlaKR

II S1

ScrFI M

S1

LlaII

S2

LlaBI

I R S

1

LlaKR

II S2

LlaBI

R S2

LlaCI

R S1

LlaDII

R S2

EpsC

S1

Inj-P

ip S2

LldI S

3

Lla14

03 S1

LldI S

1

LlaFI

S1

Lla14

03 S2

ScrF

I R S

2

Inj-P

ip S1

LlaI M

S1

LlaBI

R S1

LlaCI

R S

2

LldI S

2

ScrF

I M S2

ScrF

I R S

1

LlaII

S1

Sonde

Ab

solu

te S

ign

ali

nte

nsi

tät

3. Ergebnisse

81

Da alle Gene erfolgreich in den 7 Multiplex-PCR Ansätzen amplifiziert und mit dem DNA-

Microarray nachgewiesen werden konnten, erweist sich der Einsatz der Multiplex-PCR als

eine sensitive Alternative zur direkten Hybridisierung von genomischer DNA, setzt aber eine

Amplifikation über die PCR voraus und verhindert selbst semi-quantitative Aussagen.

3.6.2. Signalamplifikation durch den Einsatz von TSA

Um funktionelle Gene auch bei geringen Konzentrationen ohne PCR-Amplifikation

nachweisen zu können, wurde die Einsatzfähigkeit der Tyramid Signalamplifikation zur

Steigerung der Sensitivität des DNA-Microarrays getestet. Es wurden je 10 µg genomische

DNA der Starterkultur Probat 505 auf dem DNA-Microarray hybridisiert. Um die

Signalamplifikation messen zu können, wurde eine Hybridisierung ohne Signalamplifikation

mit Streptavidin-Cy5 nachgewiesen und parallel dazu eine zweite Hybridisierung mit

Signalamplifikation unter Verwendung von Streptavidin-HRP und Tyramid-Cy5 durchgeführt

(siehe 2.10.9). Die Ergebnisse der Hybridisierung sind in Abb. 37 und Abb. 38 dargestellt.

Wie aus der Abb. 37 zu erkennen ist, konnten die Signalintensitäten mit Signalamplifikation

um einen Faktor zehn, im Vergleich zu den Signalintensitäten ohne Signalamplifikation,

gesteigert werden.

Abb. 37. Hybridisierungsergebnisse mit und ohne Signalamplifikation.

Für die Sonden EUB338 und Lll68 konnten ohne Signalamplifikation schwache

Signalintensitäten von 425 bzw. 621, mit Signalamplifikation stärkere Signale von 2000 bis

4300 detektiert werden. Die Signalintensität der Sonde LGCc354 erhöhte sich von 1400 auf

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000


Sonde

Abso

lute

Sig

nalin

tens

ität

STV-Cy5TSA

3. Ergebnisse

82

12000 absolute Signalintensitäten. Für die Sonde Lla271 und Llc68 konnten die höchsten

Signalamplifikationen festgestellt werden. Die Signale erhöhten sich von 6600 auf 37000 für

die Sonde Lla271 bzw. von 12500 auf 60100 für die Sonde Llc68.

Der Nachweis der Phagenresistenzgene war hingegen nicht eindeutig. Es konnten zwar mit

TSA Signale für die Sonden der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III detektiert werden, die

Intensitäten lagen aber im Bereich der Negativkontrolle, so dass ein eindeutiger Nachweis

dieser Gene misslang (vgl. Abb. 38).

Abb. 38. Hybridisierungsergebnisse mit und ohne Signalamplifikation.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

EUB338

LGCc 3

54

Lla271

Llc68

Lll68

EpsC S1

EpsC S2

LldI S

1

LldI S

2

LldI S

3

LldI S

4

Lla140

3 S1

Lla140

3 S2

LlaII S

1

LlaII S

2

LlaBI R

S1

LlaBI R

S2

LlaBII R

S1

LlaBII R

S2

Kontro

lle 1

Kontro

lle 2

Sonde

Abs

olut

e Si

gnal

inte

nsitä

t

STV-Cy5TSA

4. Diskussion

83

4. Diskussion

Der Einsatz DNA-analytischer Verfahren, wie der PCR und anderen

Amplifizierungstechniken oder auch diversen Hybridisierungstechniken wie Southern-,

Northern- oder anderen Blot-Techniken, haben in den letzten Jahren neue Möglichkeiten

eröffnet, komplexe biologische Fragestellungen beantworten zu können (Keer and Birch,

2003). Aufgrund der zum Teil sehr aufwendigen und kostenintensiven Techniken, hat sich ein

neues Format, die DNA-Microarray Technologie, zu einer der molekularbiologischen

Techniken des letzten Jahrzehnts entwickelt. Sie beruht auf dem Prinzip der reversen

Hybridisierung und stellt ein geeignetes Format für den hochparallelen Nachweis von Genen

dar, deren Anwendbarkeit bisher durch verschiedene methodische Defizite eingeschränkt

wurde (Peplies, 2003). So belegen zwar zahlreiche Beispiele die universelle Einsatzfähigkeit

dieser Nachweistechnik, sind aber aufgrund mangelnder Sensitivität der Methode und

limitierendes Probenmaterial auf eine vorherige Amplifikation mit anschließender

Hybridisierung beschränkt (Freeman et al., 2000). Für einen hohen und kostengünstigen

Probendurchsatz ist dieses methodische Defizit nicht zu vernachlässigen. Daher wurde in der

vorliegenden Arbeit untersucht, ob durch die Steigerung der Sensitivität ein direkter

Nachweis von genomischer DNA, ohne vorherige Amplifikation, mit der DNA-Microarray

Technologie möglich ist. Dieses wurde am Beispiel des direkten Nachweises von Organismen

und Phagenresistenzgenen in der Milch-Analytik überprüft, da bei der biotechnischen

Produktion von Milchprodukten Fehlfermentationen auftreten, die unterschiedliche Ursachen

haben können. Bei der Beantwortung dieser komplexen Fragestellung bietet sich die DNA-

Microarray Technologie an, da sie eine hochparallele und kostengünstige Analyse ermöglicht.

4.1. Parameteranalyse zur Steigerung der Sensitivität auf dem DNA-

Microarray

Eine Steigerung der Sensitivität des DNA-Microarrays, die für einen direkten Nachweis von

genomischer DNA unumgänglich ist, kann durch verschiedene Parameter ermöglicht werden.

Zu diesen Parametern gehören die Art des Nachweissystems (Freeman et al., 2000), die

Konzentrationen der immobilisierten Fängeroligonukleotide (Peterson et al., 2001), die Länge

der eingesetzten Sonden (Relogio et al., 2002) und die Chip-Oberfläche (Pirrung, 2002), die

einen erheblichen Einfluss auf die Sensitivität ausüben. Für den Nachweis der

Hybridisierungsereignisse von genomischer DNA mit spezifischen Sonden auf dem DNA-

4. Diskussion

84

Microarray wurde daher ein markierungsabhängiges Nachweissystem ausgewählt, um die

Sensitivität des Detektionssystems zu maximieren. Es wurde auf eine photochemische

Markierungsreaktion zurückgegriffen, die Psoralen-PEO-Biotin Markierung, da die Kosten

für andere markierungsabhängige Nachweissysteme bei einem hohen Probendurchsatz nicht

zu vernachlässigen sind (Zhang et al., 2001) und eine Steigerung des Fluoreszenzsignals

durch den Einbau mehrerer Reportermoleküle ermöglicht wird (Andras et al., 2001). Die

Anwendbarkeit und die Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode wurde

anhand eines Modellsystems mit verschiedenen PCR-Produkten auf dem DNA-Microarray

getestet (vgl. Abb. 6). Die PCR-Produkte variierten vom kleinsten Fragment mit 116 bp bis

zum größten Fragment mit 1308 bp, um die Auswirkungen der Länge auf die

Hybridisierungseffizienz und Signalintensität in diesem definierten System austesten zu

können. Die Funktionalität der generierten Sonden wurde im Vorfeld durch die

Hybridisierung von endmarkierten doppelsträngigen und einzelsträngigen PCR-Produkten

überprüft. Alle aufgebrachten Sonden trugen einen 5’-Aminolinker, der mit den aktivierten

Isothiocyanatgruppen an der Microarray-Oberfläche reagiert und so eine überwiegend

definierte Orientierung der immobilisierten Fängeroligonukleotide ermöglicht (Benters et al.,

2002).

Die Hybridisierung von einzelsträngiger DNA resultierte, im Vergleich zur Hybridisierung

von doppelsträngiger DNA, in höheren Signalintensitäten, die aber den Aufwand der

Einzelstrangisolierung nicht rechtfertigten, da auch mit doppelsträngiger DNA detektierbare

Hybridisierungssignale nachgewiesen werden konnten (vgl. Abb. 8 und Abb. 9). Für die

Detektion von genomischer DNA wäre eine Einzelstrangisolierung ohnehin nicht praktikabel,

da ein DNA-Strang zuvor per PCR oder mit enzymatischen Methoden biotinyliert werden

müsste.

Eine empirische Untersuchung, die die Hybridisierungseffizienz unterschiedlich langer

doppel- und einzelsträngiger DNA-Moleküle auf dem DNA-Microarray umfassend

untersucht, ist in der Literatur bisher nicht beschrieben. Guo et al. konnten zwar zeigen, dass

mit einzelsträngigen DNA-Molekülen höhere Signalintensitäten als mit doppelsträngigen

DNA-Molekülen erreicht werden konnte, die Untersuchung war aber auf ein PCR-Produkt

mit 157 bp beschränkt (Guo et al., 1994). Ähnliche Resultate konnte auch Call et al. erlangen.

Die Hybridisierung nach 1-minütiger Denaturierung eines 104 Basenpaaren langen PCR-

Produktes führte im Vergleich zur Hybridisierung eines nativen PCR-Produktes, zu einer

Verdopplung der Signalintensitäten (Call et al., 2001b). Längere Denaturierungsszeiten

ergaben keine weiteren Verbesserungen. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse

4. Diskussion

85

unterstützen daher die aufgeführten Resultate, da mit allen einzelsträngigen Fragmenten, die

unterschiedlich lang waren, mindestens doppelt so hohe Signalintensitäten erreicht werden

konnten. Eine mögliche Erklärung ist darin zu finden, dass zwar beide Ansätze vor der

Hybridisierung denaturiert wurden, der einzelsträngige PCR-Ansatz aber nicht wieder mit

dem Gegenstrang renaturieren konnte, da dieser durch die Einzelstrangisolierung entfernt

wurde. Im Gegensatz dazu kann es bei dem denaturierten doppelsträngigen PCR-Ansatz

wieder zur Renaturierung kommen (Wetmur, 1991). So unterliegt der Ansatz der

Konkurrenzsituation zwischen Renaturierung und Hybridisierung mit den vorhandenen

Sonden, welche sich in niedrigeren Signalintensitäten widerspiegelt. Dieses konnte für alle

Fragmentlängen gezeigt werden (vgl. Abb. 8 und Abb. 9). Durch die Zugabe von „Blocking“-

Oligonukleotiden, die an den komplementären Strang des Ziel-Moleküls binden, kann dieses

Problem gelöst werden. Sie werden in hohen Konzentrationen zur denaturierten

Hybridisierungslösung gegeben. Eine Renaturierung der komplementären Stränge wird so

erschwert, wie Studien von Tao et al. auf dem DNA-Microarray zeigen konnte (Tao et al.,

2003). Je nach Lage der „Blocking“-Oligonukleotide, werden mit dsDNA ähnlich hohe

Hybridisierungssignale ermittelt, wie mit ssDNA. Die Strategie wurde in vorliegendem Arbeit

nicht verfolgt, da für jedes zu untersuchende Ziel-Molekül ein eigenes Paar von „Blocking“-

Oligonukleotiden in jeder Hybridisierung eingesetzt werden müsste.

Betrachtet man die beiden Hybridisierungsansätze, so ist deutlich zu erkennen, dass die

Hybridisierungssignale mit der Länge der Fragmente stark abnehmen (vgl. Abb. 8 und Abb.

9). Die Abnahme ist auf Grund der ausgeprägten Sekundärstrukturen der DNA zu erklären,

die mit der Länge der Fragmente zunehmen und so die Zugänglichkeit der Sonden

einschränken. Die Sekundärstruktur der nachzuweisenden Zielmoleküle wirkt sich daher

massiv limitierend auf die Effizienz der Hybridisierung aus, wie bereits in verschiedenen

Studien gezeigt werden konnte (Mir and Southern, 1999; Southern et al., 1999; Nguyen and

Southern, 2000). Auch selbstkomplementäre Sequenzbereiche der Fängeroligonukleotide

können zu entsprechenden Effekten beitragen (Riccelli et al., 2001). Es wurden aber bisher

keine systematischen Studien, die die Hybridisierungseffizienz unterschiedlicher

Fragmentlängen auf dem DNA-Microarray untersuchen, durchgeführt. Aus den erhaltenen

Daten des Modellsystems wird daher deutlich, dass die Fragmentlänge und die damit

verbundenen Sekundärstrukturen einen erheblichen Einfluss auf die Hybridisierungseffizienz

ausüben können, da für Fragmentlängen über 566 bp schwächere Hybridisierungssignale

detektiert wurden als für kleinere Fragmente. Für die Hybridisierung von endmarkierten PCR-

Produkten, sollte daher die Länge der zu hybridisierenden Fragmente eine Größe von 250 bp

4. Diskussion

86

nicht überschreiten, um starke Hybridisierungssignale detektieren zu können. Die

Größenlimitierung der Fragmente kann durch den Einsatz von „Helfer“-Oligonukleotiden

verringert werden, die gegen die flankierenden Sequenzbereiche einer Sondenbindungstelle

gerichtet sind, um deren Zugänglichkeit zu erhöhen (Fuchs et al., 1998; O'Meara et al., 1998;

Peplies et al., 2003). Deren Einsatz ist jedoch nicht unproblematisch, da zwar eine Steigerung

der Signalintensitäten gemessen werde konnte, gleichzeitig ließen sich aber unter den

Kontrollen der entsprechenden Sonden zusätzliche Signale detektieren (Peplies et al., 2003).

Des Weiteren zeigten sich deutliche Verschiebungen in den Intensitäten und Verhältnissen

aller gemessenen Signale, so dass von einer Reorganisation des Gesamtmoleküls ausgegangen

werden kann, die andere Sondenbindungsstellen einschränkt.

Die Computerunterstützte Vorhersage von Sekundärstrukturen könnte eine andere

Lösungsstrategie sein, die aber nur für die Hybridisierung von PCR-Produkten praktikabel ist,

da die korrekte Berechung der Sekundärstrukturfaltungen von genomischer DNA, bei

mehreren hundert Basenpaar langen Fragmenten, noch immer ein ungelöstes

bioinformatisches Problem darstellt (Dong et al., 2001). Somit kann die Faltung der Ziel-

DNA nur bedingt bei der Hybridisierung von genomischer DNA berücksichtigt werden.

Ein weiterer wichtiger Parameter, der die Sensitivität beeinflusst, ist die Markierung der Ziel-

DNA (Baggerly et al., 2004). Für die direkte Detektion von genomischer DNA, wurde zur

Steigerung der Sensitivität des Nachweissystems, die Psoralen-PEO-Biotin Markierung

etabliert und mit der Endmarkierung verglichen.

Die erfolgreiche Psoralen-PEO-Biotin Markierung der PCR-Produkte für das Modellsystem

ließ sich in einem Streptavidin-Gelshiftassay durch Bildung verschiedener Peaks nachweisen

(vgl. Abb. 10). Welche Aduktstufen die verschiedenen Peaks repräsentieren, konnte bei der

Auswertung des Gelshifts nicht beantwortet werden. Aufgrund der vier Bindungstellen des

Streptavidins, wären hochmolekulare Aggregaten, die aus bis zu vier DNA-Fragmenten und

einem Streptavidin-Molekül bestehen, möglich (Niemeyer et al., 1994). Die Markierung

deutete jedoch, unter den verwendeten Bedingungen, auf eine partielle Markierung der DNA

hin, die noch optimiert wurde.

Die Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten führte im

Modellsystem mit allen Fragmentlängen zu messbaren Hybridisierungssignalen (vgl. Abb.

11). Die Hybridisierungssignale der beiden Sonden nahmen im Gegensatz zur Hybridisierung

von endmarkierten PCR-Produkten mit der Länge des hybridisierten Fragmentes zu, wobei ab

einer Länge von 1077 Basenpaaren in diesem System die Signalintensitäten nicht mehr

gesteigert werden konnten und ein Plateau erreicht wurde. Studien von Wu et al. bestätigen

4. Diskussion

87

diese Ergebnisse, die aber aufgrund von unterschiedlich langen Sonden, gegen die ein PCR-

Produkt hybridisiert wurde, getroffen wurden (Wu et al., 2001). Die Hybridisierungssignale

erreichten ebenfalls bei einer Sondenlänge von ca. 1,2 kb ein Plateau. Die Ursache liegt

wahrscheinlich in der Ausbildung von starken Sekundär- und Tertiärstrukturen der DNA, die

längere DNA-Moleküle in ihrer Hybridisierung einschränken. Die nahezu identischen

Signalintensitäten für die Fragmente 1077 bp und 1308 bp sind durch die Anzahl der

Markierungen und der Hybridisierungseffizienz zu erklären. So trägt das 1308 bp Fragment

zwar mehr Markierungen als das 1077 bp Fragment, die Signalintensität des längeren

Produktes wird aber wiederum durch die eingeschränkte Hybridisierungseffizienz reduziert,

so dass die Signalintensitäten ähnlich hoch sind. Mit steigender Länge der Fragmente müsste

es demnach auch wieder zu einem Abfall der Signalintensitäten kommen. Diese These konnte

in einem späteren Abschnitt dieser Arbeit mit genomischer DNA bestätigt werden (vgl.

Abb. 27).

Die deutlich erhöhten Signalintensitäten bei der Psoralen-PEO-Biotin Markierung im

Vergleich zur Endmarkierung sind aufgrund der höheren Anzahl der Markierungen zu

erklären. Auffällig war, dass für die mittelständige Sonde S2 mit Psoralen-PEO-Biotin

markierten PCR-Produkten höhere Signalintensitäten ermittelt werden konnten, als mit der

endständigen Sonde S1. Für endmarkierte PCR-Produkte konnten hingegen für die Sonde S1

die stärkeren Hybridisierungssignale gemessen werden (vgl. Abb. 12). Dieses Ergebnis kann

darauf hinweisen, dass unterschiedliche Sekundärstrukturen für die Psoralen-PEO-Biotin

markierten und endmarkierten PCR-Produkte vorlagen, die alternative Sondenzugäng-

lichkeiten ermöglichen. Die Markierung der DNA mit Psoralen-PEO-Biotin würde so die

Hybridisierungseffizienz beeinflussen. Hybridisierungsuntersuchungen von Psoralen

markierten DNA-Molekülen, die in flüssiger Phase durchgeführt wurden, können diese These

aber nicht bestätigen (Johnston et al., 1981; Ussery et al., 1992; Bethea et al., 1999; Eichman

et al., 2001). Die Tatsache, dass der Nachweis der Hybridisierung indirekt erfolgte, könnte ein

Grund für die unterschiedlichen Verhaltensweisen der Sonden sein. Durch die zu geringe

Sondenanzahl von zwei Sonden ist diese Annahme aber eher spekulativ, könnte aber durch

die Ausweitung des Sondensatzes im Modellsystem überprüft werden. So könnten z.B. die

PCR-Produkte komplett mit Sonden abgedeckt werden, um generelle Aussagen über den

Einfluss der Markierung bzw. des Nachweissystems auf die Hybridisierungseffizienz zu

treffen.

Durch die Ermittlung des optimalen Verhältnisses zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-

Base, wurde die Markierungsreaktion optimiert. Der sigmoide Kurvenverlauf beider Sonden

4. Diskussion

88

erreichte bei einem Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen Verhältnis von 15:1 eine Sättigung

für die drei untersuchten Fragmentlängen (vgl. Abb. 13 und Abb. 14). Die

Hybridisierungssignale der beiden Sonden konnten durch die Optimierung bis zu einem

Faktor 3 gesteigert werden und so eine Absättigung der DNA-Moleküle mit Psoralen-PEO-

Biotin erreicht werden. Die Messung der Markierungseffizienz erfolgte indirekt, über die

Signalintensität der hybridisierten PCR-Produkte. Eine direkte Messung war aufgrund der

überlappenden Emmissionsspektren von Psoralen-PEO-Biotin und DNA bei 260 nm nicht

möglich. Die Markierungseffizienz von einer Markierung pro 40 DNA-Basen bei einem

Verhältnis von 15:1 konnte aber später durch die Quantifizierung des Biotins und der DNA in

Eichreihen mit unterschiedlichen Farbstoffen, wie SYBR Green und HABA, bestätigt werden

(persönliche Mitteilung Stefan Weiß, AG Blohm). Einbauraten an jeder 20. Base, die von

Zhang et al. in der Biotinylierungsreaktion eines 236-mers ermittelt wurden (Zhang et al.,

2001), konnten mit dem verwendeten Protokoll nicht erreicht werden. Im Unterschied zu den

in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten und den Empfehlungen von Levenson et al.

(Levenson et al., 1990) orientiert sich Zhang jedoch bei der eingesetzten Psoralen-PEO-Biotin

Menge nicht an der Anzahl der eingesetzten Basen, sondern verwendet stets eine

Endkonzentration von 200 µM Psoralen-PEO-Biotin. Levenson hingegen empfiehlt ein

Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen Verhältnis von 2:1 und erzielte damit eine mit einer

Markierungsrate von 1 Label pro 40 Basen. Die erreichte Markierungsrate ist daher mit den

Literaturdaten durchaus vergleichbar, könnte aber durch den Einsatz einer stärkeren UV-

Lichtquelle verbessert werden. Ein weiterer Vorteil wäre die Reduzierung des Zeitaufwandes

von 25 Minuten mit der verwendeten Handlampe auf wenige Minuten.

Um eine weitere Steigerung der Signalintensitäten zu ermöglichen, wurde die einzusetzende

Streptavidin-Cy5 Menge variiert. Es wurde eine optimale Konzentration von 800 nM STV-

Cy5 ermittelt (vgl. Abb. 15). Die Abnahme der Signalstärke ab einer Konzentration von 1600

nM STV-Cy5 ist durch die unspezifische Bindung des Streptavidin-Cy5 an die Chip-

Oberfläche zu erklären. Das so erhöhte Hintergrundrauschen wirkte sich negativ auf die

absolute Signalintensität aus und überlagerte ab einer STV-Cy5-Konzentration von 6400 nM

das eigentliche Signal (vgl. Abb. 16). In der Literatur beschriebene Konzentrationen des

Streptavidin-Cy5 zur Detektion von biotinylierten DNA-Molekülen auf dem DNA-

Microarray sind sehr unterschiedlich und variieren je nach eingesetzter Chipoberfläche

zwischen einer 1:5 (Zhang et al., 2001) und einer 1:500 (Ramakrishnan et al., 2002)

Verdünnung. In dieser Arbeit wurde eine 1:20 Verdünnung (800 nM STV-Cy5) für optimale

Signalintensitäten ermittelt. Eine empirische Untersuchung wurde in den aufgeführten

4. Diskussion

89

Arbeiten aber nicht durchgeführt, da sich die eingesetzten Verdünnungen an die vom

Hersteller empfohlenen Werte orientieren, die auf Immunoassays optimiert wurden.

Ein weiterer Parameter, der die Effizienz einer DNA-Microarray Hybridisierung beeinflusst,

ist die Konzentration der immobilisierten Fängeroligonukleotide (Peterson et al., 2001). So ist

anzunehmen, dass mit steigender Sondenkonzentration die Menge an Bindungsstellen für die

Ziel-Moleküle zunimmt und so eine Steigerung der Signalintensität erreicht wird. Die Studien

von Relógio et al. zeigen, dass optimale Signalintensitäten mit Sondenkonzentrationem

zwischen 10 µM und 100 µM zu erreichen sind (Relogio et al., 2002). Die Bindungskapazität

der Sonden auf dem DNA-Microarrays wird durch die Oberflächenchemie beeinflusst, so dass

die Werte untereinander schwanken können (Benters et al., 2001; Taylor et al., 2003). In

dieser Arbeit wurden ausschließlich aktivierte Phenylendiisothiocynat-Objekträger (PDITC)

verwendet (Benters et al., 2001). Wie aus Abb. 17 zu entnehmen ist, nahm die Signalintensität

mit steigender Sondenkonzentration zu und näherte sich der Sättigung bei einer Konzentration

von 10 µM. Die ermittelten Daten korrelieren daher mit den Ergebnissen von Relògio et al.

Höhere Sondenkonzentrationen führten aber, im Gegensatz zu den Untersuchungen von

Benters et al., zu einer schnelleren Sättigung der Signale. Dieses ist aufgrund der

unterschiedlich eingesetzten Nachweissysteme zu erklären, da in der vorliegenden Arbeit der

Nachweis der hybridisierten PCR-Produkte indirekt über die Anbindung eines Streptavidin-

Cy5 Moleküls erfolgte. In der Studie von Benters et al. erfolgte der Nachweis direkt, über ein

gekoppeltes Fluoreszenzmolekül an den Oligonukleotiden. Aufgrund der hohen Dichte der

Sonden, ist anscheinend das Anbinden der 60 kDa großen Streptavidin-Moleküle an die

biotinylierte DNA eingeschränkt, so dass sich Sondenkonzentrationen mit 100 µM mit diesem

Nachweissystem nicht rentieren.

Durch die Optimierung der Fragmentlänge, Psoralen-PEO-Biotin-, der Streptavidin-Cy5- und

der Sonden-Konzentration konnte die Sensitivität des Nachweises von Psoralen-PEO-Biotin

markierten PCR-Produkten, im Vergleich zu endmarkierten PCR-Produkten, um den Faktor

100 gesteigert werden (vgl. Abb. 20). Endmarkierte PCR-Produkte konnten bis zu einer

Konzentration von 1 nM detektiert werden, während Psoralen-PEO-Biotin markierte PCR-

Produkte bis zu einer Konzentration von 10 pM nachgewiesen werden konnten (vgl. Abb. 18

und Abb. 19). Die Sensitivität der Psoralen-PEO-Biotin Markierung ist im Vergleich zu

anderen Markierungsmethoden um den Faktor 10 sensitiver, wie die Studie von Call et al.

zeigte, der eine Detektionsgrenze von nur 114 pM auf dem DNA-Microarray erreichen konnte

(Call et al., 2001a). Le Berre et al. konnte die Nachweisgrenze von 10 pM ebenfalls erreichen,

jedoch nur bei einer Oligo gegen Oligo Hybridisierung (Le Berre et al., 2003).

4. Diskussion

90

Um einen Ausblick für kommende Optimierungsstrategien zu geben, soll an dieser Stelle

noch auf weitere Parameter eingegangen werden, die in dieser Arbeit nicht berücksichtigt

wurden, mit der sich die Nachweisgrenze aber vermutlich auf Attomol-Mengen weiter

reduzieren ließe. So beeinflusst, neben den oben aufgeführten Parametern, auch der Abstand

zwischen der eigentlichen Sondensequenz und der Chipoberfläche, die

Hybridisierungseffizienz. Diese oberflächenvermittelte sterische Hinderung kann durch

Spacer-Moleküle, die zwischen der aktivierten Microarray-Oberfläche und dem

Fängeroligonukleotid eingeführt werden, vermindert werden kann (Southern et al., 1999).

Hierbei handelt es sich idealer Weise um ungeladene, auf Kohlenwasserstoffketten basierende

Verbindungen (Shchepinov et al., 1997). Dabei können auch Oligomere aus identischen

Nukleotiden verwendet werden, mit denen eine lineare Abhängigkeit der Signalintensität von

der Spacer-Länge nachgewiesen wurden (Guo et al., 1994). Eine Sättigung des Signals wurde

aber für verschiedene Sonden mit unterschiedlichen Spacer-Längen erreicht (Peplies et al.,

2003), so dass generell jede Sonde einzeln optimiert werden müsste. Durch den Einsatz von

modifizierten Chip-Oberflächen, konnten sterische Effekte ebenfalls reduziert werden

(Benters et al., 2001). Dendrimer-Slides erhöhen durch ihre vernetzte, baumartige

Oberflächenstruktur den Abstand von der Sonde zur Oberfläche und ermöglichen gleichzeitig

die Immobilisierung höherer Sondenkonzentrationen (Benters et al., 2002; Le Berre et al.,

2003). Die Herstellung derartiger Oberflächen ist aber sehr aufwendig und kostenintensiv,

könnte sich aber für sehr sensitive Anwendungen lohnen.

Auch die Orientierung der Sonde auf dem DNA-Microarray beeinflusst die

Hybridisierungseffizienz durch sterische Hinderungen. So untersuchten Mir und Southern die

Fähigkeit von 5’- und 3’-immobiliserten Sonden, rRNA effektiv zu binden (Mir and Southern,

1999). Die gezielte Invertierung von Fängersonden zu Signalsteigerung führte zwar zu

effektiveren Signalen, eine andere Untersuchung konnte dieses aber nur ansatzweise

bestätigten (Peplies et al., 2003), so dass sich keine generellen Rückschlüsse ableiten ließen.

Ein weiterer Ansatz für die Optimierung von Microarray-Experimenten beruht auf dem

Einsatz von Nukleinsäure-Analoga, wie PNAs (Peptide Nucleic Acids) (Nielsen et al., 1991)

oder LNAs (Locked Nucleid Acids) (Koshkin et al., 1998). Aufgrund ihrer Struktur und ihren

physikalischen Eigenschaften ermöglichen sie eine erhöhte Bindungskapazität mit

Nukleinsäuren und können die Spezifität des Nachweises deutlich steigern (Weiler et al.,

1997; Simeonov and Nikiforov, 2002). Der Einsatz von PNAs ist aber aufgrund der

schlechten Löslichkeit eingeschränkt (Simeonov and Nikiforov, 2002; Brandt et al., 2003).

LNAs dagegen haben mittlerweile ein breites Anwendungsgebiet gefunden (Braasch and

4. Diskussion

91

Corey, 2001; Jacobsen et al., 2002; Tolstrup et al., 2003). Durch die hohen Kosten für die

Synthese dieser Nukleinsäure-Analoga ist deren Einsatz, im Vergleich zu herkömmlichen

Oligonukleotiden, noch nicht konkurrenzfähig. In naher Zukunft wird aber sicherlich die

LNA-Technologie ihren Platz in der DNA-Microarray Technologie einnehmen.

Insgesamt gesehen, weisen diese Optimierungsparameter auf eine komplexe Interaktion zur

Steigerung der Signalintensitäten hin, die es noch weiter zu untersuchen gilt. Durch die

vorliegenden Daten konnte aber schon gezeigt werden, dass ein Equilibrium zwischen der

Hybridisierungseffizienz und der Signalintensität in diesem Modellsystem zwischen 800 –

1000 Basenpaaren erreicht wurde. Dieses Gleichgewicht führte zu einer enormen Steigerung

der Signalintensitäten.

4.2. Sondenauswahlverfahren für den Einsatz auf dem DNA-Microarray

Die größte Schwierigkeit in der Beantwortung biologischer Fragestellungen mit einem DNA-

Microarray besteht in der Notwendigkeit spezifische und einheitliche Sonden für die zu

untersuchende Probe auszuwählen. Hervorgerufen wird dieses Problem durch die parallele

Anwendung von Sonden mit unterschiedlichen Charakteristika, die unter identischen

Bedingungen, bezüglich Temperatur oder Ionenkonzentration, eine korrekte Analyse des

biologischen Probenmaterials ermöglichen müssen. Die Sondenauswahl ist daher ein

entscheidender Prozess in der DNA-Microarray Technologie, der über die Spezifität und

Sensitivität der Analyse entscheidet.

Mittlerweile gibt es eine Vielzahl von kommerziellen Software-Programmen, wie z.B. DNA-

Star, Oligo6, Omega, Jellyfish, ARB etc., die diese Auswahl ermöglichen. Die Spezifität und

Funktionstüchtigkeit der Sonden muss aber bei allen Programmen durch biologische

Experimente validiert werden, da noch nicht alle Hybridisierungsparameter vollständig und

korrekt am Computer simuliert werden können (Matveeva et al., 2003).

Je nach Fragestellung, werden unterschiedlich lange Sonden eingesetzt (Zhou, 2003). Für den

Nachweis von Organismen und Phagenresistenzgenen wurden in dieser Arbeit kurze

Oligonukleotide verwendet, da mit langen DNA-Sonden über 100 bp eine Diskriminierung

von sehr ähnlichen Sequenzen nicht gewährleistet werden kann (Gerhold et al., 1999;

Lipshutz et al., 1999; Call et al., 2001a; Li and Stormo, 2001). Die Spezifität der

Hybridisierung wird aufgrund der kurzen Sequenz erhöht, da einzelne Basen-Fehlpaarungen

das Hybridisierungs-Gleichgewicht stärker beeinflussen als lange Sonden (Guo et al., 1994;

Hacia et al., 1996; Urakawa et al., 2003). Zur Detektion von Bakterien wurden validierte

4. Diskussion

92

rRNA-Sonden aus der FISH, mit denen sich Low-GC, Eubaktieren, Lactococcus und deren

Subspezies abtrennen ließen, eingesetzt (Amann et al., 1990; Beimfohr et al., 1993; Meier et

al., 1999). Die Diskriminierung der beiden Subspezies L.l. ssp. lactis und L.l. ssp. cremoris

war mit den kurzen Sonden auf dem DNA-Microarray möglich (vgl. Abb. 28).

Für die Detektion von Phagenresistenzgenen wurden hingegen eigene Sonden entworfen.

Durch die Sequenzrecherchen in der GenBank am NCBI, konnten spezifische Sonden der

Phagenresistenzgene auf Grundlage der Sequenzinformationen konstruiert werden. Da sich

die größten frei zugänglichen Datenbanken GenBank, DDBJ und EMBL, die die

internationale „Nucleotide Sequence Database Collaboration“ bilden, täglich abgleichen

(Baxevanis, 2003), wurde auf eine Recherche in weiteren Datenbanken verzichtet. Der

einheitliche Schmelzpunkt, der für eine hochparallele Analyse auf dem DNA-Microarray

notwendig ist, wurde durch das Sondenauswahlprogramm Oligo 6 ermittelt und für die

Sondenauswahl der Phagenresistenzgene dementsprechend berücksichtigt. Oligonukleotide

mit Hang zur Bildung von inter- und intramolekularen Wechselwirkungen wurden

ausgeschlossen, um die Hybridisierungseffizienz der Sonden zu erhöhen. Andererseits wurde

bei der Selektion der Oligonukleotide die Sekundärstruktur der Ziel-Moleküle nicht beachtet,

da primär genomische DNA eingesetzt wurde, bei der die korrekte Vorhersage der Struktur

aus den schon genannten Gründen nicht sinnvoll war. In der Regel wird aber bei der

Hybridisierung von PCR-Produkten die Sekundärstrukturstabilität der Ziel-Moleküle bei der

Auswahl der Sonden berücksichtigt (Rouillard et al., 2003; Tolstrup et al., 2003). Fraglich ist,

inwieweit diese Vorhersage mit den nativen Strukturen übereinstimmen. Untersuchungen von

Glavac zeigen, dass die Vorhersage mit dem MFOLD-Faltungsalgorithmus (Zuker, 1989) nur

dann mit experimentellen SSCP-Analysen („single-strand conformation polymorphism“)

korrelieren, wenn relativ kurze DNA Fragmente zwischen 50 und 100 bp zur Berechnung

eingesetzt werden (Smith et al., 2000; Glavac et al., 2002). Dieses Ergebnis unterstützt daher

die in dieser Arbeit gewählte Vorgehensweise.

Die Spezifität der ausgewählten Sonden wird in vielen DNA-Microarray Publikationen durch

eine Datenbankanfrage, unter der Verwendung des BLAST-Algorithmus, abgeglichen (Li and

Stormo, 2001; Li et al., 2002; Rouillard et al., 2003; Tolstrup et al., 2003). Bei BLAST

handelt es sich um einen heuristischen Suchalgorithmus für einen Datenbankvergleich, der

zwar schnell, aber weniger sensitiv arbeitet (Altschul et al., 1990). Da bisher nur eine sehr

geringe Anzahl von Organismen sequenziert und in Datenbanken hinterlegt ist, stellt sich die

Frage, nach der „wirklichen“ Spezifität dieser Datenbankanfrage. Eine Datenbank-Anfrage ist

nur so spezifisch, wie die derzeitigen Datenbestände es ermöglichen. Für die Organismen und

4. Diskussion

93

Phagenresistenzgene, die in der Milchwirtschaft relevant sind, liegen diese Sequenzen

weitestgehend vor (Siezen et al., 2002), so dass die Abfrage der Datenbank durchaus Sinn

machte und für Kontrolle der Spezifität aller ausgewählten Sonden auch durchgeführt wurde.

Für den Nachweis der Phagenresistenzgene mit dem DNA-Microarray wurden insgesamt 2

Sonden für die Inhibition der Phagenadsorption, 2 Sonden für die Injektion der Phagen-DNA,

6 Sonden für den Nachweis des Restriktions- und Modifikationssystems (R&M) Typ I, 18

Sonden für den R&M Typ II und 2 Sonden für den R&M Typ III ausgewählt. Des Weiteren

wurden 36 Sonden für den Nachweis von Genen für die abortive Phageninfektion selektiert.

Die Spezifität und Funktionalität der Sonden wurde experimentell über die Hybridisierung mit

korrespondierenden PCR-Produkten getestet (vgl. Abb. 23 und Abb. 24). Die Ergebnisse der

BLAST-Anfrage für die Sonden konnte bestätigt werden, da Kreuzhybridisierungen der PCR-

Produkte mit den 68 Sonden im Experiment ausblieben. Es gab keine falsch positiven

Hybridisierungssignale.

Für die Hybridisierungssignale der Sonden war aber auffällig, dass trotz äquimolaren Mengen

an PCR-Produkt, die Signalintensitäten untereinander sehr heterogen waren. Die Ursache liegt

in den sehr unterschiedlichen Hybridisierungseffizienzen der PCR-Produkte mit ihren

korrespondierenden Sonden. Dieses Ergebnis ist zwar für die Beantwortung von qualitativen

Fragestellungen zu vernachlässigen, ist aber für quantitative Untersuchungen problematisch,

da in einem idealen Microarray-System die Hybridisierungseffizienz einer Sonde primär von

der Sequenz und der Konzentration des entsprechenden Zielmoleküls abhängig sein sollte

(Peplies, 2003). Wie können diese unterschiedlichen Hybridisierungseffizienzen und die

damit verbundenen Schwankungen in den Signalintensitäten erklärt werden?

Der Parameter Fragmentlänge, der die Hybridisierungseffizienz beeinflusst, kann nicht in

Betracht gezogen werden, da alle PCR-Produkte ungefähr die gleiche Länge besaßen. Ein

möglicher Parameter könnte die Sondenzugänglichkeit im PCR-Produkt sein. So kann

vermutet werden, dass die Sonden, die endständig zum PCR-Produkt binden, einen

effektiveren Zugang zum PCR-Produkt finden, als Sondenbindungsstellen, die mittelständig

sind. Diese These wurde mit den vorliegenden Daten untersucht, indem die

Hybridisierungssignale aller Sonden ausgewertet wurden. Dazu wurde die Sondenposition mit

der Signalintensität verglichen. Die Signalintensitäten und die Sondenpositionen zu den

jeweiligen PCR-Produkten sind in der Tab. 21 zusammengefasst. Die Sondenbindungsstelle

wurde in drei Gruppen eingeteilt:

4. Diskussion

94

Eine Sonde, die in den ersten 50 Basen des PCR-Produktes bindet, wurde als 3’endständig,

die ab der 51. Base bindet, wurde als mittelständig und die in den letzten 50 Basen bindet,

wurde als 5’endständig bezeichnet.

Die Signalintensität der Sonden wurde willkürlich in vier Signalgruppen unterteilt:

Hybridisierungssignale bis 1000 Signaleinheiten wurden als schwache Signale (3), bis 10000

als hohe Signale (2) und bis 650000 als sehr hohe Signale (1), definiert. Sonden, für die kein

Hybridisierungssignal detektiert werden konnte, wurden zur Gruppe (4) zugeordnet.

Sonde Bindungsstelle

im PCR-Produkt Signalgruppe Sonde Bindungsstelle

im PCR-Produkt Signalgruppe

EpsC S1 3’endständig 2 EpsC S2 3’endständig 2

Inj-Pip S1 mittelständig 2 Inj-Pip S2 3’endständig 4

LldI S1 3’endständig 2 LldI S2 mittelständig 1

LldI S3 3’endständig 2 LldI S4 mittelständig 1

Lla1403 S1 mittelständig 2 Lla1403 S2 mittelständig 3

ScrFI M S1 mittelständig 2 ScrFI M S2 mittelständig 2

ScrFI R S1 mittelständig 3 ScrFI R S2 5’endständig 2

LlaI M S1 mittelständig 2 LlaI R S1 mittelständig 3

LlaII S1 mittelständig 2 LlaII S2 mittelständig 2

LlaBI S1 mittelständig 2 LlaBI S2 mittelständig 2

LlaBII S1 3’endständig 3 LlaBII S2 5’endständig 1

LlaCI S1 mittelständig 2 LlaCI S2 mittelständig 2

LlaDII S1 mittelständig 3 LlaDII S2 mittelständig 2

AbiB S1 mittelständig 2 AbiB S2 mittelständig 3

AbiC S1 mittelständig 2 AbiC S2 mittelständig 2

AbiD S1 3’endständig 2 AbiD S2 3’endständig 2

AbiDI S1 mittelständig 1 AbiDI S2 mittelständig 2

AbiE S1 3’endständig 1 AbiE S2 mittelständig 1

AbiG S1 mittelständig 2 AbiG S2 mittelständig 2

AbiH S1 mittelständig 2 AbiH S2 mittelständig 2

AbiL S1 mittelständig 1 AbiL S2 mittelständig 2

AbiM S1 3’endständig 2 AbiM S2 3’endständig 1

AbiN S1 Mittelständig 2 AbiN S2 mittelständig 2

AbiP S1 3’endständig 2 AbiP S2 mittelständig 2

AbiQ S1 Mittelständig 2 AbiQ S2 mittelständig 2

Tab. 21. Zusammenfassung der Hybridisierungssignale.

4. Diskussion

95

Nach diesen Kriterien ergab sich, dass für

• 16 % der Sonden sehr hohe (3’end. 2 Sonden; mittel. 5 Sonden; 5’end. 1 Sonde)

• 70 % der Sonden hohe (3’end. 8 Sonden; mittel. 26 Sonden ; 5’end. 1 Sonde)

• 12 % der Sonden schwache (3’end. 1 Sonde; mittel. 5 Sonden; 5’end. 0)

• 2 % der Sonden keine (3’end 1 Sonde ; mittel. 0 ; 5’end. 0)

Hybridisierungssignale detektiert werden konnten.

Es konnten für 43 Sonden (86 %) hohe bis sehr hohe Signalintensitäten gemessen werden.

62,5 % der Sonden, für die sehr hohe Hybridisierungssignale gemessen wurden, waren

mittelständige Sonden. Die Sonde, für die kein Hybridisierungssignal detektiert werden

konnte, war eine 3’endständige.

Die von Chizhikov et al. aufgestellte These (Chizhikov et al., 2001), dass mittelständige

Sonden eine schlechtere Sondenzugänglichkeit besitzen, kann mit diesen Daten nicht bestätigt

werden. Zur weiteren Überprüfung der These müsste die Auswahl der Sonden aufgrund ihrer

Bindungsstelle getroffen werden, was in dieser Arbeit aber nicht in Betracht gezogen wurde,

da mit den Sonden genomische DNA detektiert werden sollte. So wurden 14 endständige

Sonden mit 36 mittelständigen Sonden verglichen. Fünf der 36 mittelständigen Sonden

zeigten nur schwache Hybridisierungssignale, während es bei den endständigen zwei der 14

Sonden waren.

Der Einfluss der Sondenbindungsstelle auf die Hybridisierungseffizienz konnte mit dem

Sondensatz und den PCR-Produkten demnach nicht schlüssig gezeigt werden. Insgesamt

weisen die vorliegenden Daten auf eine komplexe Interaktion unterschiedlicher Parameter

hin, die es weiter zu untersuchen gilt. Ein einfaches Modell für die Erklärung der

Hybridisierungseffizienz wird sicherlich in naher Zukunft nicht zur Verfügung stehen, da sehr

viele Parameter die Effizienz beeinflussen können. Liegen diese aber vor, könnten die

bioinformatischen Programme zur Sondenauswahl so optimiert werden, das zukünftig auch

quantitative Analysen mit dem DNA-Microarray möglich sein werden.

Mit dem in dieser Arbeit verwendeten Sondenauswahlverfahren konnte gezeigt werden, dass

die methodische Vorgehensweise beim Sondendesign erfolgreich war und qualitative

Analysen möglich sind. Da nur für eine Sonde kein Hybridisierungssignal gemessen werden

konnte, ist die angewandte Strategie zur Sondenauswahl für zukünftige Projekte

dementsprechend verfolgenswert.

4. Diskussion

96

4.3. Paralleler Nachweis von Organismen und Phagenresistenzgenen

4.3.1. Aspekte bei der Hybridisierung von genomischer DNA

Die Untersuchung von komplexem Probenmaterial auf dem DNA-Microarray kann durch die

Hybridisierung von PCR-Produkten, cDNA, rRNA oder genomischer DNA realisiert werden.

Bisher gelang der rDNA-Nachweis von Organismen über gDNA, aufgrund mangelnder

Sensitivität, nur mit vorheriger Amplifikation des Probenmaterials (Call et al., 2001a; Ye et

al., 2001). Dabei wurden Untersuchungen mit Escherichia coli (Gill et al., 2002),

Helicobacter pylori (Salama et al., 2000), Pseudomonas ssp. (Cho and Tiedje, 2001), Listeria

monocytogenes (Borucki et al., 2003) und Mycobacterium tuberculosis (Talaat et al., 2002)

durchgeführt. Für die Analysen wurde die genomische DNA per Nick Translation oder

Random Priming markiert und gleichzeitig amplifiziert. Der direkte Nachweis wird einerseits

durch die Komplexität der Zielmolekülfindung bei der Hybridisierung von Genomen

erschwert und anderseits durch die zu geringe Anzahl von Zielmolekülen beeinträchtigt.

Bevor die Ergebnisse der Hybridisierung von genomischer DNA aus Rein- und

Starterkulturen erörtert und diskutiert werden, soll an dieser Stelle einleitend auf die

theoretische Betrachtung der Hybridisierung von genomischer DNA ohne vorherige

Amplifikation eingegangen werden.

Die Genome der bislang identifizierten und sequenzierten Bakterien variieren vom kleinsten

Genom des Mycoplasma genitalium Bakteriums mit 580 kb (Peterson et al., 1993) bis zum

größten Genom des Bradyrhizobium japonicum Bakteriums mit 9,1 Mb (Kaneko et al., 2002).

Die für die Milchindustrie relevanten Bakterien, wie z.B. Milchsäurebakterien der Spezies

Lactococcus lactis, besitzen ein mittleres Genom von 2.4 Mb (Bolotin et al., 2001). Es stellte

sich die Frage, welche Menge an genomischer DNA in der Hybridisierung eingesetzt werden

müsste, um alle Gene dieser Milchsäurebakterien detektieren zu können?

Durch die Fragmentierung des 2,4 Mb großen Genoms in 1000 bp große Fragmente, entstehen

ca. 2400 Fragmente. Die Nachweisgrenze des DNA-Microarrays lag bei der Markierung von

DNA mit Psoralen-PEO-Biotin bei 1 fmol (siehe 3.2.4). Bei dieser Nachweisgrenze muss

folglich von jedem 1000 bp Fragment mindestens 1 fmol bzw. 660 pg vorhanden sein, um

dieses detektieren zu können. Für die Detektion von allen 2400 Fragmenten wird demnach

mindestens eine Menge von 1,6 µg genomischer DNA benötigt. Der direkte Nachweis aller

chromosomal codierenden Gene des Milchsäurebakteriums auf dem DNA-Microarray sollte

mit dieser DNA-Menge folglich möglich sein. Wie später in diesem Kapitel zu erkennen sein

4. Diskussion

97

wird, stimmt dieser theoretisch errechnete Wert mit dem praktisch gemessen Wert der

Nachweisgrenze größenordnungsmäßig überein.

Der Vorteil bei dem rDNA-Nachweis von Bakterien ist, im Gegensatz zur Detektion von

Plasmid-codierten Genen, das rDNA-Gene mehrfach im Genom vieler Bakterien vorkommen.

So besitzt das Bakterium Lactococcus lactis bis zu 10 Genoperons der rDNA (Bolotin et al.,

2001). Für die Detektion von Plasmid-codierenden Genen ist ein absoluter Wert nicht zu

berechnen, da es sich bei diesen Genen nicht um „housekeeping Genes“ handelt. Das

Vorhandensein und die Anzahl der Plasmide ist in Bakterien variabel und von biologischen

Faktoren abhängig. Die meisten Phagenresistenzgene, die in Lactococcus lactis gefunden

wurden, sind in den untersuchten Starterkulturen nicht vorhanden bzw. sind auf eine

Bakterienpopulation bezogen, nur in wenigen Bakterien zu finden. So wurde das Vorkommen

der 17 in der Starterkultur 8/0 enthaltenen Phagenresistenzgene anhand von Einzelisolaten

quantitativ per PCR-Nachweis untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Gene für die

Adsorptionsresistenz ads, die beiden Gene für die Restriktionsenzyme des Typs I und das Gen

abiB in mehr als 40 % der untersuchten Isolate nachgewiesen werden konnten (Glöckner,

2002). Die Gene llaII, llaBI, llaDII und abiM spielen mit Prozentsätzen von 15 %, 16 %,

10 % und 7 % eine untergeordnete Rolle. Die restlichen Gene konnten nur in 2-3 % der

Starterkulturisolate nachgewiesen werden. Für den Nachweis der Phagenresistenzgene auf

dem DNA-Microarray stellt dies ein nicht zu unterschätzendes Problem dar. Die hier

aufgestellten theoretischen Überlegungen wurden durch Experimente evaluiert.

4.3.2. Direkter Nachweis von Bakterien aus Reinkulturen

Ein Protokoll, das den direkten Nachweis von genomischer DNA erlaubt, konnte durch die

Zusammensetzung der einzelnen Module erreicht werden. Zu diesen Modulen gehörten die

DNA-Extraktion, die Fragmentierung von gDNA in hybridisierbare Fragmente, die

Markierung mit Psoralen-PEO-Biotin, die Hybridisierung und der Nachweis. Ein ähnliches

Modul-System, das aber auf den Nachweis von rRNA beschränkt war, konnte Bavykin et al.

zur Diskriminierung der Bakterien Escherichia coli, Bacillus subtilis und Bacillus

thuringiensis erfolgreich einsetzen (Bavykin et al., 2001). Zur Fragmentierung der

Nukleinsäure wurde ebenfalls eine chemische Nuklease eingesetzt, die Fragmente zwischen

20 und 100 bp produzierte. Dagegen konnte in dieser Arbeit die Effizienz der Fragmentierung

von genomischer DNA so reproduzierbar optimiert werden, dass durch die Variation der Zeit

4. Diskussion

98

und der Temperatur, die Fragmentgröße der gDNA frei wählbar waren (vgl. Abb. 25 und

Abb. 26).

Das Modellsystem der Fragmentlängen konnte so mit gDNA an fünf verschiedenen Sonden

validiert werden. Das Modellsystem wurde nicht nur bestätigt, sondern konnte auch erweitert

werden, da mit Fragmenten um 1500 bp schwächere Signalintensitäten gemessen wurden

(vgl. Abb. 27). Die Abnahme der Intensität kann durch die fortschreitende Ausbildung von

sekundär bzw. tertiär Struktur der DNA erklärt werden, wodurch die Sondenzugänglichkeit,

wie angenommen, weiter erschwert wurde (siehe 4.1).

Wie zuvor erwähnt, gelang der Nachweis der genomischen DNA bisher nur mit vorheriger

Amplifikation des Probenmaterials. Dabei ermöglichte die Amplifizierung von 1 µg gDNA

mit anschließender Hybridisierung auf dem DNA-Microarray einen Organismennachweis von

24 unterschiedlichen Listeria monocytogenes Stämmen (Borucki et al., 2003) und 12

verschiedener Pseudomonaden (Cho and Tiedje, 2001). Durch die in dieser Arbeit

beschriebenen Optimierungsstrategien (siehe 4.1), konnte die Sensitivität der Analyse

demnach so gesteigert werden, dass die direkte Hybridisierung von genomischer DNA aus der

Starterkultur Probat 8/0 zu positiven Signalen für die rDNA-Sonden führte (vgl. Abb. 27) .

Da mit den ermittelten Daten aber nicht bewiesen werden konnte, ob es sich um eine

spezifische oder unspezifische Hybridisierung handelte, wurde die Spezifität der Methode

durch die Hybridisierung von genomischer DNA aus Reinkulturen der Subspezies Lactococus

lactis ssp. lactis und Lactococcus lactis ssp. cremoris überprüft. Aus den erhaltenen Daten

konnte entnommen werden, dass die Diskriminierung der zwei Subspezies durch die

Hybridisierung von genomischer DNA aus Reinkulturen möglich und eindeutig ist (vgl. Abb.

28). Die Hybridisierung von genomischer DNA aus Reinkulturen anderer Gattungen, wie

Bacillen, Salmonellen und Listerien, führte zu keinen Hybridisierungssignalen der Sonden

Lla271, Llc68 und Lll68 (Daten nicht gezeigt). Die Hybridisierungssignale der genomischen

DNA für die getesteten Reinkulturen waren somit spezifisch und ließen auf ein

funktionsfähiges Protokoll schließen.

Auffällig waren die unterschiedlich starken Hybridisierungssignale für die Sonden EUB338,

LGCc354 und Llc68 bzw. Lll68, obwohl diese das gleiche Ziel-Molekül, die 16S rDNA,

detektierten. So konnte bei der Hybridisierung von genomischer DNA aus Lactococcus lactis

ssp. cremoris für die Sonde Llc68 die höchsten und für die Sonde EUB338 die schwächsten

Hybridisierungssignale detektiert werden. Aus den Daten ist zu erkennen, dass eine

Quantifizierung des Probenmaterials aufgrund der unterschiedlich starken Signalintensitäten

nur schwer möglich ist. Jede Sonde müsste aufgrund ihrer Hybridisierungseffizienz normiert

4. Diskussion

99

werden, wie es schon Ansatzweise in der Arbeit von Cho et al. über eine mitgeführte

Kontroll-Sonde versucht wurde, die parallel zur eigentlichen Sonde mit auf einem Spot

immobilisiert wurde (Cho and Tiedje, 2002). Aufgrund des Quotienten der Referenz-DNA

und der zu untersuchenden Ziel-DNA konnten quantitative Aussagen getroffen werden (Cho

and Tiedje, 2002). Die Quantifizierung war aber nur mit PCR-Produkten möglich. Mit

biologischem Probenmaterial konnten keine Ergebnisse erzielt werden. Die Studie von Cho

verdeutlicht, wie schwierig es ist, komplexes Probenmaterial zu normieren. So lange

sämtliche Parameter, die die Hybridisierungseffizienz beeinflussen, nicht erkannt und

beschrieben sind, können quantitative Aussagen mit biologischem Probenmaterial nicht

getroffen werden. Bestenfalls sind momentan semiquantitative Aussagen möglich (Peplies,

2003).

Die Nachweisgrenze, die für die Milchindustrie ein wichtiges Kriterium für den Einsatz als

zukünftige Methode zur Organismenidentifizierung darstellt, wurde durch die Hybridisierung

von unterschiedlichen Mengen von genomischer DNA aus Lactococcus lactis ssp. cremoris

bestimmt. Die Nachweisgrenze lag in diesem System bei ca. 5 µg genomischer DNA (vgl.

Abb. 29). Da die Konzentrationsbestimmung der DNA nach dem Markieren mit Psoralen-

PEO-Biotin nicht mehr möglich war und somit der gesamte Ansatz auf dem DNA-Microarray

hybridisiert wurde, ist davon auszugehen, dass durch die anschließende Fällung und dem

damit verbundenen Verlust von DNA, eine geringere Menge zum Einsatz kam.

Der theoretisch errechnete Wert von 1,6 µg genomischer DNA stimmt demnach

größenordnungsmäßig ungefähr mit dem experimentell erhaltenen Wert überein. Für ein

Genom von Lactococcus lactis mit 2,4 Mb, welches 5,2*10-15 g wiegt (2,4 Mb dsDNA

entsprechen 1,58 * 109 Dalton), ergibt sich aus 1,6 µg genomische DNA eine Zellzahl von

etwa 108 Bakterien. Da zehn rDNA Genoperons in Lactococcus lactis vorkommen (Bolotin et

al., 2001), ist die Zellzahl um den Faktor zehn geringer. Infolgedessen ergibt sich eine

Zellzahl von ungefähr 107 Bakterienzellen, die in die Hybridisierung eingesetzt werden

müssen, um Hybridisierungssignale detektieren zu können. Diese Zellzahl wäre für die

Detektion potentieller Kontaminanten in Starterkulturen und Milchprodukten unrealistisch,

könnte aber durch eine kurze unspezifische Voranreicherung der Kultur erreicht werden. Die

Methode wäre ohne diese Schritte nicht sensitiv genug, da für PCR-Analysen schon 10

Bakterien ausreichend sind (Call et al., 2003). Da die PCR in der konventionellen

Produktüberwachung aber noch nicht integriert ist, kann sich die DNA-Microarray

Technologie, wenn sich die Sensitivität der Methode weiter steigern ließe, etablieren (siehe

4.3.4). Die DNA-Microarray Technologie stellt daher eine ideale Plattform für die

4. Diskussion

100

Milchindustrie dar, die den hochparallelen und kostengünstigen Nachweis von Bakterien

ermöglicht.

Es sei darauf hingewiesen, dass für die Detektion von pathogenen Bakterien in Starterkulturen

und Milchprodukten der Sondensatz erweitert und praktisch validiert werden muss. Die

vorliegende Arbeit zeigt jedoch jetzt schon das hohe Potential dieser Methode, Bakterien

spezifisch mit dem DNA-Microarray zu detektieren. Der Nachweis erfolgte über Nacht, ohne

vorherige Amplifikation des Probenmaterials und ermöglichte so eine schnelle Analyse. Die

benötigte Zeit für das komplette Protokoll könnte aber auf unter sechs Stunden optimiert

werden, wenn die Hybridisierungszeit auf zwei Stunden verkürzt würde. Die zweistündige

Hybridisierung führte ebenfalls zu spezifischen, aber schwächeren Signalen (Daten nicht

gezeigt). Die Unterscheidung zwischen einer unspezifischen und spezifischen Hybridisierung

kann aber durch kürzere Hybridisierungszeiten erschwert werden, wie die Studie von Dai et

al. belegt (Dai et al., 2002). Die Unterscheidungsschwierigkeit konnte mit den hier ermittelten

Daten nicht bestätigt werden, da eine eindeutige Diskriminierung möglich war. Um generelle

Aussagen über Hybridisierungskinetiken von gDNA treffen zu können, sollte zukünftig der

Sondensatz und das biologische Probenmaterial erweitert werden. Zur weiteren Verkürzung

des Protokolls könnten die Zeit für die Nukleinsäurefällung und das Markieren, durch den

Einsatz von kommerziellen Aufreinigungssäulen und einer starken UV-Lichtquelle, optimiert

werden. Eine hohe Datenanalyse im Laufe von nur wenigen Stunden wäre so zu erreichen.

Eine Unterscheidung, ob sich die detektierten Organismen in einem toten oder lebendigen

Stadium befanden, war mit diesem Sondensatz nicht möglich. Die Frage nach der

Teilungsfähigkeit ist für die milchverarbeitende Industrie von besonderem Interesse, da

ausschließlich teilungsfähige Organismen, sei es in positiver oder bei pathogen Organismen in

negativer Hinsicht, zu einer Veränderung des zu fermentierenden Produktes und damit zu

einem Qualitätsverlust/gewinn führen. Es ist daher für die milchverarbeitende Industrie von

entscheidender Bedeutung, eine zeitsparende Nachweismethode einzusetzen, die es

ermöglicht, lebende und teilungsfähige Organismen von den abgestorbenen, nicht mehr

teilungsfähigen Organismen zu unterscheiden und zu identifizieren.

Zur Identifikation aktiver, teilungsfähiger Organismen könnten sich die intergenetischen

Bereiche (internal transcribed spacer, ITS) des rRNA-Operons eignen, die artspezifisch sind

(Söller et al., 2000; Hassan et al., 2003). Während der Prozessierung der prä-rRNA wird die

ITS zu Nukleotiden abgebaut. Dieser Abbau findet ebenso nach dem Absterben der

Mikroorganismen statt. Da es in den toten Zellen zu keiner Transkription mehr kommt, sind

vier Stunden nach dem Zelltod die „internal transcribed spacer“ auf rRNA-Ebene nicht mehr

4. Diskussion

101

nachzuweisen. Im Gegensatz dazu lassen sich diese Bereiche der rDNA-Gene noch Tage nach

dem Zelltod nachweisen (Schmid et al., 2001). Somit stellt die ITS eine optimale Möglichkeit

zum Spezies-spezifischen Nachweis von lebenden, d.h. teilungsfähigen Organismen dar. Eine

eindeutige Identifizierung der Mikroorganismen anhand der ITS wird ebenfalls ermöglicht

(Gurtler and Stanisich, 1996).

Es wurde daher experimentell überprüft, ob sich die Psoralen-PEO-Biotin

Markierungsmethode, auch für die Markierung und den Nachweis von RNA eignet, die im

Gegensatz zur DNA zwar schneller degradiert, aber auf Grund ihrer Größe, von max. 2,3 kb,

direkt und ohne Fragmentierung in der Hybridisierung eingesetzt werden könnte. Guschin et

al. und andere Arbeitsgruppen konnten bereits zeigen, dass der Nachweis von nitrifizierenden

Bakterien mit dem DNA-Microarray möglich ist (Guschin et al., 1997). Die 16S rRNA wurde

zuvor über PCR amplifiziert und markiert. Andere Studien beschäftigten sich mit dem

Nachweis von Cyano- (Rudi et al., 2000) und sulfatreduzierenden Bakterien (Koizumi et al.,

2002; Loy et al., 2002) in ihrer natürlichen mikrobiellen Gemeinschaft. Darüber hinaus

konnte Wilson et al. aufgrund einer Vielzahl von Sonden verschiedene Organismen mit dem

DNA-Microarray diskriminieren (Wilson et al., 2002). Die aufgeführten Anwendungen waren

aber, wie oben erwähnt, auf PCR-Amplicons beschränkt.

In dieser Arbeit konnte die rRNA aus der Starterkultur Probat 8/0 mit dem DNA-Microarray

ohne Amplifikation nachgewiesen werden (vgl. Abb. 30). Der direkte Nachweis war somit

möglich und wäre eine Alternative zur Hybridisierung von gDNA. Die Identifizierung von

Bakterien, ohne Amplifizierung der rRNA, konnte bereits in Studien gezeigt werde. Dabei

wurden aber sehr unterschiedliche Markierungs- bzw. Nachweisstrategien verfolgt. Der

direkte Nachweis von rRNA konnte durch eine Sandwichhybridisierung mit biotinylierten

Proben (Small et al., 2001) bzw. durch den Einsatz von chemischen Markierungen (Bavykin

et al., 2001; El Fantroussi et al., 2003; Peplies, 2003) ermöglicht werden. Der Nachweis der

ITS könnte mit der kostengünstigen Psoralen-PEO-Biotin Markierung demnach erfolgreich

sein, muss durch ITS spezifische Sonden jedoch erst validiert werden, was nicht Ziel dieser

Arbeit war.

Im Gegensatz zum erfolgreichen Nachweis der rRNA gelang der Nachweis der wesentlich

instabileren mRNA der Phagenresistenzgene, über die ausgewählten Sonden, nicht. Die

Untersuchung des Expressionsmusters der Phagenresistenzgene stellte sich unter den

experimentellen Bedingungen als wesentlich schwieriger heraus, die ohne eine Amplifikation

nicht zu bewerkstelligen war. Um nicht nur das Vorhandensein, sondern auch die Expression

4. Diskussion

102

der Gene zu untersuchen, wird der direkte Nachweis der mRNA zukünftig ein weiteres

wichtiges Ziel sein, um Fermentationen präziser analysieren zu können (Siezen et al., 2002).

4.3.3. Direkter Nachweis von funktionellen Genen aus biologischem

Probematerial

Für den Nachweis von funktionellen Genen liegt im Falle einer direkten Detektion eine

reduzierte Verfügbarkeit der Zielmoleküle vor. Bisher wurde nur der PCR-basierte Nachweis

von Umweltgenen (Wu et al., 2001; Cho and Tiedje, 2002; Taroncher-Oldenburg et al., 2003)

bzw. der cDNA-basierte Nachweis von mRNA (Dennis et al., 2003) beschrieben. Die stark

eingeschränkte Verfügbarkeit der Zielmoleküle wird bei dem Nachweis der

Phagenresistenzgene in Starterkulturen noch erschwert, da die meisten Phagenresistenzgene,

die in Lactococcus lactis gefunden wurden, in den untersuchten Starterkulturen nicht

vorhanden bzw. bezogen auf eine Bakterienpopulation, nur in wenigen Bakterien zu finden

sind (Glöckner, 2002). Dieses konnte durch die experimentellen Daten dieser Arbeit bestätigt

werden.

Die direkte Hybridisierung der genomischen DNA aus der Starterkultur Probat 8/0 führt zu

positiven Hybridisierungssignalen für die rDNA-Sonden. Es konnten die Organismen

Lactococcus lactis ssp. lactis bzw. cremoris nachgewiesen werden. Dass Lactococcus lactis

ssp. cremoris der dominierende Organismus in der Starterkultur Probat 8/0 ist (vgl. Abb. 31),

konnte durch quantitative Untersuchungen mit der FISH bestätigt werden (Glöckner, 2002).

Eine semiquantitative Untersuchung der Organismenzusammensetzung in der Starterkultur

war folglich mit dem DNA-Microarray möglich. Wie Glöckner et al. zeigen konnte, ist die

Verschiebung der Populationszusammensetzung in einer Starterkultur ein möglicher Hinweis

auf eine Fehlfermentation und könnte daher für eine zukünftige Analyse verwendet werden

(Glöckner, 2002). Diese Daten müssen aber erst durch den Einsatz des DNA-Microarrays im

Laboralltag praktisch validiert werden.

Etwas anders verhielt es sich bei dem Nachweis der Phagenresistenzgene. Die in der

Starterkultur Probat 8/0 enthaltenen Gene der Gruppe I-III (siehe Tab. A1) konnten nach der

Festlegung des Schwellenwertes, um unspezifische Hybridisierungen auszuschließen, nicht

vollständig detektiert werden (vgl. Abb. 31). Es konnten 5 der 7 in der Starterkultur Probat

8/0 vorkommenden Phagenresistenzgene nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der

Hybridisierung korrelieren demnach nur teilweise mit denen, die über die PCR erzielt wurden

(siehe Tab. A1).

4. Diskussion

103

Die quantitativen Analysen von Glöckner et al. bestätigen die erwähnten Probleme, der zu

geringen Kopienzahl der Plasmide in der Starterkultur Probat 8/0, die mit dem DNA-

Microarray nicht mehr eindeutig nachzuweisen sind. Die Phagenresistenzgene ads-epsC, lldI

und lla1403, die mit dem DNA-Microarray detektiert werden konnten, kamen in mehr als

40 % Prozent der Einzelisolate der Starterkultur Probat 8/0 vor (Glöckner, 2002).

Die Hybridisierung der nicht quantitativ untersuchten Starterkultur Probat 505, führte zu

ähnlichen Ergebnissen. Auch hier konnte die rDNA eindeutig nachgewiesen werden. Für die

in dieser Starterkultur vorkommenden funktionellen Gene konnten vor der Festlegung des

Schwellenwertes Hybridisierungssignale gemessen werden (vgl. Abb. 32). Die Verdopplung

der hybridisierten Menge von 10 µg auf 20 µg genomischer DNA führte zu einer Steigerung

der Signalintensitäten bei den meisten Sonden um ca. 100 %. Nach Abzug des

Schwellenwertes konnten bei 20 µg genomischer DNA aber nur noch das Phagenresistenzgen

ads-epsC detektiert werden (vgl. Abb. 33). Für 10 µg gDNA konnten noch zusätzlich die

Gene lldI, lla1403, llaBI und llaBII schwach nachgewiesen werden. Die Verdopplung der

eingesetzten Menge an genomischer DNA führte demnach zu keiner Verbesserung der

Hybridisierungssignale, da in diesem Fall die unspezifische Hybridisierung mit den

Kontrollen zunahmen und die Signale damit unter dem Schwellenwert lagen. Es konnten nur

5 der 11 in der Starterkultur Probat 505 vorhandenen Phagenresistenzgene mit dem DNA-

Microarray direkt nachgewiesen werden (vgl. Tab. A1).

Die Sensitivität des DNA-Microarrays ist für den direkten Nachweis von

Phagenresistenzgenen folglich beschränkt und erreicht bei einer unbekannten Kopienzahl der

Plasmide seine Grenzen. Die Nachweisgrenze für Gene, die auf Plasmiden codiert sind, sollte

demzufolge durch die Hybridisierung von gDNA aus Bakterien, die eine genau definierte

Kopienzahl von Plasmiden beinhalten, experimentell bestimmt werden (Nordstrom et al.,

1984). Dieses ist für die Festlegung der Nachweisgrenze von Plasmid-codierten Genen

unumgänglich und müsste ergänzt werden.

Ein möglicher Lösungsansatz für die genannten Probleme, könnte die Isolierung der reinen

Plasmide aus den Bakterien sein, die zu eindeutigeren Signalen führen könnten, da eine

Vorauswahl bzw. Anreicherung der zu untersuchenden Zielmoleküle getroffen werden kann

(Wu et al., 2001). Der Nachteil dieser Vorgehensweise würde aber darin bestehen, dass nur

Gene die auf Plasmiden codiert sind, in diesem Schritt detektiert werden könnten. Somit

würden sich zwei Protokolle, eins für den Nachweis von chromosomal-codierten Genen und

eines für den Nachweis von Plasmid-codierten Genen ergeben. Wie dieser Schritt umgangen

werden kann, wird im folgenden Kapitel erörtert.

4. Diskussion

104

4.3.4. Methodische Aspekte zur Signal- und Targetamplifizierung

Es stehen eine Vielzahl von Methoden der Signal- und Targetamplifizierung für die

Untersuchung von biologischem Probenmaterial zur Verfügung, deren Anwendungen im

Bereich der Microarray-Technologie aber aufgrund methodischer Aspekte eingeschränkt sind

(Schweitzer and Kingsmore, 2001). Daher wurden in dieser Arbeit zwei unterschiedliche

Methoden für die DNA-Chiptechnologie getestet, um funktionelle Gene eindeutiger und

hochparallel detektieren zu können.

Die Multiplex-PCR hatte sich in den letzten Jahren zu einer idealen Ergänzung für die

Microarray-Technologie weiterentwickelt (Call et al., 2001a; Chizhikov et al., 2001). Sie

kombinierte die parallele Vervielfältigung von geringen Proben-Mengen in der Multiplex-

PCR mit der hohen Spezifität des DNA-Microarrays. Der Nachweis von 5 funktionellen

Genen, mit nur 10 fg gDNA-Template und fünf Primerpaaren, war so möglich (Call et al.,

2001a). Wie in Tab. 17 dargestellt, wurde der Nachweis der 28 Phagenresistenzgene der

Gruppe I-III durch die Verwendung von vier Primerpaaren in sieben Multiplex-PCRs

vereinfacht. Mehr als vier Primerpaare in einem Ansatz wurden nicht verwendet, da die

intramolekularen Wechselwirkungen mit der Anzahl der Primer deutlich zunahmen und

unspezifische Produkte entstanden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse konnten auch in

anderen Multiplex-Experimenten erzielt werden (Elnifro et al., 2000; Labrie and Moineau,

2000; Chizhikov et al., 2001). Eine Identifizierung der Produkte im 3%igen Agarosegel war

aber nicht mehr eindeutig, da sich die PCR-Produkte nur um wenige Basenpaare

unterschieden (siehe Abb. 34). Die Amplifikation und somit der Nachweis der Gene in den

Starterkulturen, wurde mit dem DNA-Microarray überprüft. Die Hybridisierungsergebnisse

der Multiplex-PCR Ansätze der Starterkulturen Probat 505 und Probat 8/0 waren eindeutig

und spezifisch (vgl. Abb. 35 und Abb. 36). Es gab keine falsch-positiven oder falsch-

negativen Hybridisierungsereignisse.

Die in der Sondentestung mit PCR-Produkten nur schwach bzw. gar nicht funktionierenden

Sonden, Lla1403 S2, ScrFI R S1, LlaDII S2 bzw. Inj-Pip S2, zeigten in der Multiplex-

Hybridisierung stärke Signalintensitäten. Eine plausible Erklärung ist darin zu finden, dass bei

der Hybridisierung des Multiplex-Ansatzes die kompletten Multiplex-PCR Ansätze vereinigt

und hybridisiert wurden, während bei der Uniplex-PCR nur max. 2 pmol eingesetzt wurden.

Die Multiplex-Ansätze wurden komplett vereinigt, da ein möglichst einfaches Protokoll für

den Nachweis von Phagenresistenzgenen entwickelt werden sollte. Der Einsatz der

kompletten PCR-Ansätze wirkte sich positiv auf die Signalstärke der Sonden aus, da mehrere

4. Diskussion

105

Zielmoleküle für die Hybridisierung zur Verfügung standen. Die Etablierung der Multiplex-

PCR der Phagenresistenzgene der Gruppe IV, die nur sehr selten in Starterkulturen

vorkommen (siehe Tab. A1), konnte aus zeitlichen Gründen nicht mehr erfolgen und sollte

daher zukünftig noch ergänzt werden.

Da alle Gene erfolgreich in den 7 Multiplex-PCR Ansätzen amplifiziert und mit dem DNA-

Microarray nachgewiesen werden konnten, erwies sich der Einsatz der Multiplex-PCR als

eine sensitive Alternative zur direkten Hybridisierung von genomischer DNA, setzt aber eine

Amplifikation über die PCR voraus, die eigentlich umgangen werden sollte.

Um dennoch den direkten Nachweis von funktionellen Genen auf dem DNA-Microarray,

ohne eine Amplifikation der genomischen DNA, zu ermöglichen, wurde eine

Signalamplifikation auf dem DNA-Microarray etabliert. Diese Signalamplifikation beruhte

auf einer Enzym-Substrat Reaktion, die schon in der FISH eingesetzt wurde, um schwache

Signale zu verstärken (Schönhuber et al., 1999; Speel et al., 1999; Pernthaler et al., 2002). Da

nur das Streptavidin-Cy5 Molekül gegen die Streptavidin-HRP und die Tyramid-Cy5

Moleküle ausgetauscht werden musste, konnte das bestehende Protokoll der Module ohne

größere Schwierigkeiten erweitert werden. Durch den Einsatz der Signalamplifikation

konnten die Signalintensitäten im Vergleich zum Ansatz ohne Signalamplifikation für den

Nachweis der rDNA der Starterkultur Probat 505 um den Faktor 10 gesteigert werden (vgl.

Abb. 37). Der Nachweis der Phagenresistenzgene war hingegen nicht eindeutig. Es konnten

zwar mit TSA Signale für die Sonden der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III detektiert

werden, die Intensitäten lagen aber im Bereich der Negativkontrolle, so dass ein eindeutiger

Nachweis der Phagenresistenzgene misslang (vgl. Abb. 38).

Die unspezifische Signalamplifizierung kann sicherlich durch die Optimierung der Methode

ausgeschlossen werden. So steigert z.B. die Erhöhung der Temperatur während der

Waschschritte die spezifische Signalamplifikation, wie es Volante et al. in FISH-

Experimenten zeigen konnte (Volante et al., 2000). Eventuell wird die Optimierung der TSA-

Reaktion auf dem DNA-Microarray aber auch andere Strategien erfordern, die jetzt noch nicht

abzusehen sind. So könnte durch die gleichzeitige Immobilisierung von Proteinen und Sonden

auf einem Spot, die Bindung der Tyramid-Cy5 Moleküle an den DNA-Microarray gesteigert

werden, da Tyramid Moleküle an Proteinreste, wie Tyrosin, binden können (Pernthaler et al.,

2002).

Die in dieser Arbeit vorgestellten Amplifikationstechniken bieten sich daher beide an

funktionelle Gene detektieren zu können. Die TSA-Reaktion auf dem DNA-Microarray wird

aber sicherlich zukünftig der Weg sein, um funktionelle Gene, die nur in sehr geringen

4. Diskussion

106

Mengen vorkommen, direkt nachzuweisen, da eine Target-Amplifizierung umgangen werden

kann.

4.4. Ausblick

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass DNA-Microarrays, die auf der

Anwendung von gerichteten Oligonukleotidsonden basieren, für den spezifischen Nachweis

von Organismen und Phagenresistenzgenen in Starterkulturen eingesetzt werden können. Das

entwickelte kostengünstige Protokoll erlaubte erstmalig eine Organismenanalyse von

Starterkulturen aufgrund der direkten Hybridisierung von genomischer DNA.

Auch andere Anwendungen können von der entwickelten kostengünstigen Methode

profitieren, da sie sich nicht nur auf den Nachweis von Milchsäurebakterien beschränkt,

sondern eine generelle Methode zur Detektion von genomischer DNA darstellt. Betrachtet

man die erzielten Fortschritte bei der Anpassung der Microarray-Technologie an den

komplexen Nachweis von genomischer DNA aus Starterkulturen, zeigt sich, dass dieses

Hybridisierungsformat in den nächsten Jahren für entsprechende Untersuchungen in der

Milchindustrie verfügbar sein wird. Durch eine Steigerung der Sensitivität der Methode, wie

z.B. die in dieser Arbeit noch nicht optimierte Signalamplifikation mit TSA, könnten die

Anforderungen der Milchindustrie, pathogene Organismen in geringen Mengen

nachzuweisen, erfüllt werden. Die Unterscheidung zwischen toten und lebendigen

Mikroorganismen könnte dabei durch den Einsatz von ITS-Sonden gelingen. Durch diese

Verbesserungen kann bei einem ausreichenden Umfang des Sondensatzes eine erhebliche

Verkürzung der zum Teil mehrtägigen Analyse, die mit hohen Lagerkosten verbunden ist,

erreicht werden.

Da der Nachweis von Phagenresistenzgenen nur bei den Genen gelang, die in mehr als 40 %

der untersuchten Starterkulturisolate vorkommen, wird die Optimierung der TSA-Reaktion

auf dem DNA-Microarray ebenfalls dazu beitragen, das komplette Phagenresistenzgen-

Spektrum in Starterkulturen detektieren zu können.

Aber auch ohne diese Veränderungen ist eine Analyse möglich, da die Funktionstüchtigkeit

des DNA-Microarrays in Verbindung mit der Multiplex-PCR in der vorliegenden Arbeit

bereits gezeigt werden konnte. Das Potential des „Milch-Chips“, Fehlfermentationen aufgrund

des vorhandenen Phagenresistenzgen-Spektrums in Starterkulturen zu unterbinden, muss noch

überprüft werden. In der Literatur sind bereits Studien beschrieben, in denen der

Zusammenhang zwischen der Art bzw. der Anzahl der vorhandenen Resistenzgene und dem

4. Diskussion

107

Verlauf der Fermentation untersucht wurden. Der synergistische Effekt bei der Abwehr der

Phagen sk1 und c2 konnte z.B. beim gleichzeitigen Vorkommen der Resistenzplasmide

pNP40 mit den Resistenzgenen abiE und abiF und pBF61, das das Gen für AbiD trägt,

gezeigt werden (McLandsborough et al., 1998). Auch die Kombination mehrerer

Phagenresistenzmechanismen in einer L. lactis-Zelle erhöhte deren Chance sich gegen Phagen

zu verteidigen (O' Sullivan et al., 2001). Während diese Resistenzgene zu verschiedenen

Zeitpunkten der Phageninfektion ansetzen, vermittelt die Kombination der "Abortive

Infection of Phages"-Gene abiG auf dem Plasmid pMU1311 bzw. abiE und abiF auf pNP40

ebenfalls ein breiteres Resistenzspektrum gegen Phagen der c2- und der 936-Spezies, als die

beiden Plasmide alleine (Pillidge et al., 2000). Liegt in der Starterkultur ein breites Spektrum

von Phagenresistenzgenen vor, könnten als Reaktion auf das Auftreten bestimmter

Phagenspezies die jeweils effektivsten Gene zur Abwehr aktiviert werden.

Die Auswahl der Starterkulturen, die ein breites Spektrum von Phagenresistenzgenen

besitzen, kann demnach von großem Vorteil für eine stabile Fermentation sein. Da die Anzahl

der Phagenresistenzgene in den untersuchten Starterkulturen begrenzt ist, könnte ein

konjugativer Gentransfer die Anzahl der Phagenresistenzgene erhöhen. Die meisten

Phagenresistenzgene befinden sich auf Plasmiden, deren konjugativer Transfer zwischen den

verschiedenen Lactococcus-Stämmen ausführlich beschrieben wurde (Neve et al., 1984; Neve

et al., 1987). Der konjugative Gentransfer findet dabei nicht nur zwischen

Starterkulturorganismen der gleichen Spezies sondern auch zwischen nahe verwandten

Spezies wie Lactococcus und Streptococcus (Gasson, 1983; Kleinschmidt et al., 1993) bzw.

zwischen Starterkulturorganismen und für die Starterkultur untypischen Organismen wie B.

subtilis statt (Gasson, 1983; Lorenz and Wackernagel, 1994; Heller et al., 1995; Zenz et al.,

1998). Nach wie vor gilt der konjugative Transfer von natürlich vorkommenden Plasmiden als

die vom Konsumenten am ehesten akzeptierte Art Starterkulturstämme mit multiplen

Phagenresistenzen zu erzeugen (Allison and Klaenhammer, 1998). Die in den letzten Jahren

von der Bevölkerung ablehnende Haltung gegenüber gentechnischen veränderten

Lebensmitteln wird so nicht beeinträchtigt, da durch den konjugativen Gentransfer nur

natürlich vorkommende Starterkulturen in der Fermentation eingesetzt werden (Pridmore et

al., 2000). Die Selektion der Starterkulturen, die über ein breites Phagenresistenzgen-

Spektrum verfügen, kann im Vorfeld über den in dieser Arbeit erstellen „Milch-Chip“

erfolgen. Das hohe Potential der DNA-Microarray Technologie wird daher sicherlich die

Analyse in der Milchindustrie in den nächsten Jahren grundlegend bestimmen und verändern.

5. Zusammenfassung

108

5. Zusammenfassung

Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung zur Einsetzbarkeit der Psoralen-PEO-Biotin

Markierung in der DNA-Microarray Technologie für die Analyse von Starterkulturbakterien

und ihren Phagenresistenzgenen, da bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten

Fehlfermentationen auftreten, die hauptsächlich durch Phagen verursacht werden.

Für die Untersuchung wurden verschiedene molekularbiologische Methoden ausgearbeitet

und optimiert, da die Einsetzbarkeit der DNA-Microarray Technologie in der Industrie durch

verschiedene methodische Defizite bisher eingeschränkt war. Durch die Zusammensetzung

der Methoden, wie der DNA-Extraktion, Fragmentierung, Markierung und Hybridisierung,

konnte ein Protokoll für den direkten Nachweis von genomischer DNA etabliert werden.

Die kostengünstige Psoralen-PEO-Biotin Methode wurde für die Markierung von

genomischer DNA optimiert, da herkömmliche Markierungsverfahren für den Routine-

Einsatz in der Industrie zu kostenintensiv waren. Die Markierungsmethode wurde anhand

eines Modellsystems mit unterschiedlich langen PCR-Produkten optimiert und deren

Signalintensitäten mit denen von endmarkierten PCR-Produkten verglichen. Dabei konnte

gezeigt werden, dass die Fragmentlänge bei PCR-Produkten einen großen Einfluss auf die

Hybridisierungseffizienz hat und die Hybridisierungssignale bei der Endmarkierung

dementsprechend mit der Länge abnehmen. Hingegen kommt es bei der Psoralen-PEO-Biotin

Markierung zu einer Konkurrenzsituation zwischen der sterischen Hinderung und der

Mehrfachmarkierung, so dass die Signalintensitäten bis zu einer Länge von ca. 1 kb

zunahmen und ein Plateau erreicht wurde. Die Sensitivität konnte im Vergleich zur

Endmarkierung durch Optimierung der Parameter um den Faktor 100 gesteigert werden.

Die Ergebnisse des Modellsystems wurden an genomischer DNA validiert, indem genomische

DNA mit einer optimierten chemischen Fragmentierungsmethode, der Fenton-Reaktion, in

unterschiedliche Fragmentgrößen sequenzunabhängig fragmentiert wurde. Die Ergebnisse des

Modellsystems konnte mit genomischer DNA bestätigt werden. Für genomische DNA stellt

sich bei der Psoralen-PEO-Biotin Markierung ein Equilibrium zwischen der Signalintensität

und der Hybridisierungseffizienz ebenfalls bei einer Fragmentlänge von ca. 1 kb ein.

Für den spezifischen Nachweis der 34 Phagenresistenzgene, die in Lactococcus lactis

beschrieben sind, wurden für jedes Gen zwei Sonden mit bioinformatischen Softwarepaketen

ausgewählt, so dass ein Sondensatz von 68 Sonden vorlag. Die Funktionalität der generierten

Sonden wurde experimentell über Psoralen-PEO-Biotin markierte PCR-Produkte auf dem

DNA-Microarray bestimmt. Dabei konnte gezeigt werden, dass alle generierten Sonden

5. Zusammenfassung

109

spezifisch für die PCR-Produkte waren und Kreuzhybridisierungen ausblieben. Der Nachweis

der Phagenresistenzgene durch Hybridisierung von PCR-Produkten auf DNA-Microarrays

war somit erfolgreich. Eine Korrelation zwischen der Lage der Sonde auf dem PCR-Produkt

und der Signalintensität konnte nicht hergestellt werden. So konnten sowohl für

mittelständige als auch für endständige Sonden starke Hybridisierungssignale gemessen

werden. Insgesamt weisen die vorliegenden Daten auf eine komplexe Interaktion

unterschiedlicher Parameter hin, die es weiter zu untersuchen gilt.

Nach erfolgreicher Sondentestung und Optimierung der Teilschritte des Protokolls, konnte in

der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass DNA-Microarrays, die auf der Anwendung von

gerichteten Oligonukleotidsonden basieren, für den spezifischen Nachweis von Organismen

und Phagenresistenzgenen in Starterkulturen eingesetzt werden können. Das entwickelte

kostengünstige Protokoll erlaubte erstmalig eine Organismenanalyse von Starterkulturen

aufgrund der direkten Hybridisierung von genomischer DNA. Der Nachweis von

Phagenresistenzgenen ohne deren Amplifikation, gelang nur bei den Genen, die in mehr als

40 % der untersuchten Starterkulturisolate vorkamen.

Aus diesem Grund wurde das Protokoll um zwei verschiedene Signalamplifikations-

Strategien erweitert, um funktionelle Gene, die nur in geringen Mengen in der Probe

vorkommen, eindeutig zu detektieren. 1.) Durch den Einsatz der Multiplex-PCR konnten alle

Phagenresistenzgene der Gruppe I-III der Starterkulturen Probat 8/0 und Probat 505 spezifisch

mit dem erstellten Sondensatz auf dem DNA-Microarray nachgewiesen werden. 2.) Der

Einsatz der Signalamplifikation mit TSA auf dem DNA-Microarray führte zu einer 10fachen

Verstärkung der Signale für die rDNA-Sonden. Der eindeutige Nachweis der

Phagenresistenzgene gelang aber nicht, da unspezifische Signalamplifikationen nicht

vermieden werden konnten. Durch die Optimierung der TSA-Methode kann der spezifische

Nachweis sicherlich verbessert werden, so dass es zukünftig möglich sein wird, alle

Phagenresistenzgene ohne Amplifikation über die Hybridisierung von genomischer DNA

nachzuweisen.

Betrachtet man die erzielten Fortschritte bei der Anpassung der Microarray-Technologie an

den komplexen Nachweis von genomischer DNA aus Starterkulturen, zeigt sich, dass dieses

Hybridisierungsformat in den nächsten Jahren für entsprechende Untersuchungen in der

Industrie verfügbar sein wird. Durch den in der vorliegenden Arbeit ausgearbeiteten „Milch-

Chips“ wird es zukünftig der Milchindustrie möglich sein, Starterkulturen aufgrund ihrer

Organismenzusammensetzung und ihres Phagenresistenzgen-Spektrums so auszuwählen, dass

sie zu einer stabileren Fermentation beitragen können.

6. Literatur

110

6. Literatur

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7. Anhang

129

7. Anhang

7.1. Ergebnisse der Analyse der Phagenresistenzgene Gen Starterkulturen Quark

Probat 8/0

97

Probat

505

Probat

M4

Probat

M7

Q1 D-NW 206

EWG

Adsorptionsresistenz

ads-EpsC + + + - +

Inhibition der Injektion

inj-pip - + - - +

Restriktion der Phagen-DNA

lldI + + + + +

lla1403 + + + + +

scrFI + + + + -

llaI - + - - +

llaII + + + + +

llaBI - + + + +

llaBII + + + + +

llaCI + + - - +

llaDII - + + + -

llaFI - - - - -

llaKRII - - - - -

Abortive Infektion der Phagen-DNA

abiA - - - - -

abiB + + + + +

abiC + - - - -

abiD - - - + -

abiDI - - - + -

abiE - + - - +

abiF - - - - -

abiG + - - - -

abiH - - - - +

abiI - - - - -

abiK - - - - -

abiL - - - + +

abiM + + + + -

abiN + - - - +

abiP - + + + -

abiQ - - + - -

abiT - - - - -

abiU - - - - -

Tab. A1 Phagenresistenzgene in den untersuchten Starterkulturen und Quarkprobe

7. Anhang

130

7.2. Alignment

Abb. A1 Alignment der 16S rDNA mit eingezeichneter Sondenbindungsstelle Lll68 hellgrün; Llc68 rot; EUB338 orange; LGCc354 dunkelgrün

Danksagung

Abschließend möchte ich einer Reihe von Personen danken, ohne deren Hilfe und Mitwirken diese

Arbeit in der vorliegenden Form nicht hätte entstehen können.

Beginnen möchte ich mit Herrn Prof. Dr. Dietmar Blohm, der mir die Möglichkeit eröffnet hat,

dieses spannende Thema in seiner Arbeitsgruppe zu bearbeiten. Er stand mir in kritischen Situationen

stets diskussionsbereit und helfend zur Seite. Hierfür, und für das große Maß an Freiheit, das er mir

gelassen hat, möchte ich mich herzlich bedanken.

Herrn PD Dr. Bernd Kazmierczak danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.

Frau Dr. Christiane Glöckner hat als meine direkte Betreuerin maßgeblich zum Gelingen dieser

Arbeit beigetragen. Sie hat mir die Möglichkeit gegeben, mich zu entfalten, stand mir aber immer mit

Rat und Tat zur Seite. Ihre Sicht der Dinge hat mir sehr geholfen, niemals das Wesentliche aus den

Augen zu verlieren. Hierfür danke ich Ihr außerordentlich.

Als von unschätzbaren Wert haben sich Stefan Weiß und Chris Würdemann erwiesen. Ihre

wissenschaftlichen Ideen und geistigen Inspirationen haben maßgeblich dazu beigetragen, diese

Arbeit zu vollenden. Ihre freundschaftliche Art und außerordentliche Kollegialität werden mir stets in

Erinnerung bleiben. Vielen Dank „Jungs“.

Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Britta Becker für die wissenschaftliche sowie seelisch-moralische

Unterstützung, insbesondere in der doch recht langwierigen „Endphase“. Herzlichen Dank dafür.

Der gesamten Arbeitsgruppe Biotechnologie und Molekulare Genetik möchte ich für das sehr

angenehme und familiäre Arbeitsklima danken, an das ich mich noch sehr lange erinnern werde.

Unverzichtbar für diese Arbeit war die konstruktive Kritik von Frau Katja Nickolaus beim

Zusammenschreiben. Sie half auch dabei, den Fehlerteufel zu besiegen. Sie machte u.a. aus den

genierten Sonden, die generierten Sonden ☺. Vielen Dank hierfür.

Besonders bedanken möchte ich mich bei meiner Familie und meinen Freunden, insbesondere bei

Thomas Fuchs und Stefanie Meyerdierks, die viel Geduld während der letzten drei Jahre mit mir

hatten. Hierfür danke ich Euch allen außerordentlich.

Documents

Untersuchung zur Einsetzbarkeit der Psoralen-PEO-Biotin ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/E-Diss879_Thesis.pdf · Die DNA-Microarray Technologie hat sich seit ihrer Einführung