Untersuchungen an lipidgebundenen 12-oxo-Phytodiensäure ... · 2.10.2 Untersuchung der verwendeten Lipide durch endogene Lipasen aus 29 Arabidopsis thaliana . Inhaltsverzeichnis

Untersuchungen an

lipidgebundenen 12-oxo-Phytodiensäure-Vorstufen aus

Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH.

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

an der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am

Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie

von

Marcus Dettenberg

Bochum 2003

Gutachter

Prof. Dr. E.W. Weiler

Prof. Dr. W. Hengstenberg

Für meine Eltern

Inhaltsverzeichnis

- 1 -

I Inhaltsverzeichnis

I Inhaltsverzeichnis 1

II Abkürzungsverzeichnis 4

III Abbildungsverzeichnis 6

1 Einleitung 8

2 Material und Methoden 19

2.1 Geräte und Ausstattung 19

2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 20

2.3 Antikörper 22

2.4 Enzyme 22

2.5 Pflanzenmaterial 23

2.6 Biochemische Methoden 23

2.6.1 Proteinbestimmung 23

2.6.2 Chlorophyllbestimmung 23

2.6.3 Präparation intakter Chloroplasten 24

2.6.4 Bestimmung des Intaktheitsgrads von Chloroplasten 24

2.6.5 Präparation von Stroma, Envelope und Thylakoidmembranen 24

2.6.6 Präparation von Proteinkomplexen aus Thylakoidmembranen 25

2.7 Methoden zur Extraktion und Reinigung von Lipiden 26

2.7.1 Extraktion von Lipiden 26

2.7.2 Vorreinigung von Lipiden mittels C18- und NH2-Festphasenextraktion 26

2.7.3 Enzymatische Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure 27

2.8 Untersuchungen zur Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure 27

2.8.1 Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure in intakten Chloroplasten 27

2.8.2 Freisetzung von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure aus „Blau-nativen“- 28

Polyacrylamidgelen

2.9 Versuche zum Transport von freier 12-oxo-Phytodiensäure aus Chloroplasten 28

2.10 Untersuchungen zur Substratspezifität von Lipasen 29

2.10.1 Alkalische Hydrolyse von Lipiden 29

2.10.2 Untersuchung der verwendeten Lipide durch endogene Lipasen aus 29

Arabidopsis thaliana

Inhaltsverzeichnis

- 2 -

2.11 Elektrophoretische Trennmethoden 30

2.11.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 30

2.11.2 „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese 30

2.11.3 Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle 30

2.12 Immunologische Methoden 31

2.12.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose 31

2.12.2 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine 31

2.13 Chromatographische Trennmethoden 32

2.13.1 Hochdruckflüssigkeitschromatographie 32

2.13.1.1 Präparative Reinigung von Lipidklassen mittels HPLC 32

2.13.1.2 12-oxo-Phytodiensäure-Isolierung mittels HPLC 32

2.13.2 Flüssigkeitschromatographie 33

2.13.3 Dünnschichtchromatograpie 33

2.14 Massenspektrometrie 33

2.14.1 Darstellung von 12-oxo-Phytodiensäure - und Fettsäuremethylestern 33

2.14.2 Synthese von Diazomethan 33

2.14.3 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung 33

von 12-oxo-Phytodiensäure- und Fettsäuremethylestern

2.14.4 Peptidsequenzierung mittels ESI-Q-TOF-Massenspektrometrie 34

3. Ergebnisse 35

3.1 Gehalt von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure in verschiedenen 35

Pflanzenspezies

3.2 Lokalisation von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure in Chloroplasten 37

3.2.1 Charakterisierung der Chloroplastenpräparation 37

3.2.2 Charakterisierung von Stroma, Envelope und Thylakoiden 39

3.2.3 Lokalisation von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure an der 43

Thylakoidmembran

3.3 Charakterisierung der Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure 46

3.3.1 Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure aus intakten 46

Chloroplasten

3.3.1.1 Einfluss von Licht auf die Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phyto- 46

diensäure

3.3.1.2 Einfluss des pH-Wertes auf die Freisetzung lipidgebundener 12-oxo- 48

Phytodiensäure

Inhaltsverzeichnis

- 3 -

3.3.1.3 Einfluss von Calcium auf die Freisetzung lipidgebundener 12-oxo- 50

Phytodiensäure

3.4 Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure an der 52

Thylakoidmembran

3.4.1 Komplementationsversuche von Thylakoiden mit Envelope und Stroma 52

3.4.2 Charakterisierung der Freisetzung von lipidgebundener 12-oxo-Phytodien- 53

säure im „blau-nativen“ Polyacrylamidgel

3.5 Charakterisierung des Transports von 12-oxo-Phytodiensäure aus intakten 55

Chloroplasten

3.5.1 Wirkung von Rinderserumalbumin auf den Transport freier 12-oxo-Phyto- 56

diensäure

3.5.2 Wirkung von Acyl-CoenzymA auf den Transport freier 12-oxo-Phytodien- 57

säure

3.5.3 Wirkung von Cytosol auf den Transport freier 12-oxo-Phytodiensäure 59

3.6 Untersuchungen zur Substratspezifität des Freisetzungsenzyms 60

3.6.1 Präparation unterschiedlicher Lipidspezies 61

3.6.2 Alkalische Hydrolyse der unterschiedlichen Lipidspezies 63

3.6.3 Umsetzung der getesteten Lipide durch Lipase(n) 67

3.7 Lokalisation von Allenoxidsynthase in Chloroplasten 73

4 Diskussion 75

5 Zusammenfassung 88

6 Literaturverzeichnis 90

IV Anhang 113

Danksagung 116

Lebenslauf 117

Abkürzungsverzeichnis

- 4 -

II. Abkürzungsverzeichnis

Bezüglich der Standardmaßeinheiten, sowie der Vorsilben für dezimale Vielfache und Teile

von Einheiten gelten die Konventionen der IUPAC. Daneben gelten, soweit im Text

angegeben, die folgenden Abkürzungen.

A Ampere

AOC Allenoxidcyclase

AOS Allenoxidsynthase

A. thaliana Arabidopsis thaliana

BN-PAGE “blau-native” Polyacrylamid-Gelelektrophorese

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius; T (°C ) = T (K) + 273,16 K

CI chemische Ionisierung

Da Dalton, Maßeinheit für die Molmasse eines Proteins

DC Dünnschichtchromatographie

DGDG Digalactosyldiglycerid

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGTA Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-tetraessigsäure

g Gramm

x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g = 9,81 kg x m x s-2

GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie

GC-MS/MS Gaschromatographie-Tandemmassenspektrometrie

h Stunde

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie („High Performance Liquid

Chromatography“)

IUPAC International Union for Pure and Applied Chemistry

LOX Lipoxygenase

M Molar

m Meter

m/z Masse : Ladungsverhältnis eines Ionenfragments; relative Massenangabe bei

der Massenspektrometrie

M+1 Masse des Molekülions + 1 bei der Massenspektrometrie

Abkürzungsverzeichnis

- 5 -

mbar Millibar; 1 mbar = 102 Pa

MGDG Monogalactosyldiglycerid

MDGD-O sn1-O-(9S,13S)-12-oxo-Phytodiensäure-sn2-O-(7Z,10Z,13Z)-hexadeka-

trienoyl)-monogalactosyldiacylglycerid

min. Minute

OD595 optische Dichte bei der Wellenlänge 595 nm

OPDA 12-oxo-Phytodiensäure

p.A. pro Analysis; Bezeichnung einer Substanz mit analytischem Reinheitsgrad

PC Phosphatidylcholin

PE Phosphatidylethanolamin

PG Phosphatidylglycerol

pH Logarithmus der H3O+-Ionenkonzentration in mol x l-1

PS Phophatidylserin

Rf relative Wanderungsgeschwindigkeit einer Fraktion / eines Proteins bei einer

Dünnschichtchromatographie/Gelelektrophorese bezogen auf die Laufmittel-

front/die Laufstrecke

RSA Rinderserumalbumin

RT Raumtemperatur

Rt Retentionszeit einer Fraktion auf einer Chromatographie

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SL Sulfochinovosyldiacylglycerid

s Sekunde

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan

Triton X Octylphenol-Polyethylenglykolether

ü.N. über Nacht

v/v Volumen pro Volumen

vgl. vergleiche

W Watt

w/w Gewicht pro Gewicht

w/v Gewicht pro Volumen

z.B. zum Beispiel

Abbildungsverzeichnis

- 6 -

III. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Übersicht über die Oxylipinbiosynthese 9

Abb. 1.2: Biosynthese von Jasmonsäure (Octadecanoidweg) 11

Abb. 1.3: Strukturformel von sn1-O-(9S,13S)-12-oxo-Phytodiensäure-sn2-O- 13

(7Z,10Z,13Z)-hexadekatriensäure-monogalactosyldiglycerid

Abb. 1.4: Allgemeiner Reaktionsmechanismus von Lipasen 14

Abb. 1.5: Hypothetische Lokalisation und Funktion von MGDG-O 16

Abb. 3.1: Vergleich des Gehalts von lipidgebundener OPDA in unterschiedlichen 36

Pflanzenspecies

Abb. 3.2: Verteilung von freier und lipidgebundener OPDA im Percoll- 38

Stufengradienten

Abb. 3.3: Überprüfung der Auftrennung von Stroma, Envelope und Thylakoiden 40

mittels Gelelektrophorese und Immunodetektion

Abb. 3.4: Verteilung von freier und lipidgebundener OPDA im Saccharose- 42

Stufengradienten

Abb. 3.5: Ergebnis der ESI-QTOF-Messung 43

Abb. 3.6: MGDG-O Verteilung an den über „Blau-native“ Gelelektrophorese 45

aufgetrennten Proteinkomplexe der Thylakoidmembran

Abb. 3.7: Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA in Chloroplasten bei 47

Dunkelheit und unter Starklicht

Abb. 3.8: Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA bei unterschiedlichen 49

pH-Werten

Abb. 3.9: Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA bei verschiedenen 51

Calciumkonzentrationen

Abb. 3.10: Vergleich von freier und lipidgebundener OPDA bei Komplementation 53

von Thylakoiden mit Stroma und Envelope

Abb. 3.11: Hydrolyse von lipidgebundener OPDA an den Proteinkomplexen der 54

Thylakoidmembran nach Gabe von 250 µg MGDG-O als Substrat

Abb. 3.12: Ergebnis der Transportversuche mit fettsäurefreiem RSA 56

Abb. 3.13: Ergebnis der Transportversuche bei verschiedenen CoenzymA- 58

Konzentrationen

Abb. 3.14: Ergebnis der Transportversuche mit gefälltem Cytosol 59

Abbildungsverzeichnis

- 7 -

Abb. 3.15: Überprüfung des über Kieselgel aufgetrennten Rohlipids mittels 61

Dünnschichtchromatographie

Abb. 3.16: Chromatographische Überprüfung von MGDG, MGDG-O und DGDG 62

Abb. 3.17: Übersicht über die Massenspektren der analysierten Fettsäuren 64

Abb. 3.18: Ergebnis der alkalischen Hydrolyse 65

Abb. 3.19: Freisetzung von Fettsäuren aus Lipiden 68

Abb. 3.20: Fettsäure-Freisetzung durch endogene Lipase(n) an den Photosystemen 70

Abb. 3.21: Vergleich der Hintergrundkonzentration von Linolensäure (MGDG) und 72 OPDA (MGDG-O)

Abb. 3.22: Lokalisation von AOS in Stroma, Envelope und Thylakoiden 74

Abb. 4.1: Vergleich der Strukturformeln von MGDG-O und MGDG 76

Abb. 4.2: Hypothetische Rolle von MGDG-O innerhalb der pflanzlichen Abwehr- 81

mechanismen

Abb. IV.1 Massenspektrometrischer Nachweis von 12-oxo-Phytodiensäure 113

Abb. IV.2 Massenspektrometrischer Nachweis von Linolensäure 115

Einleitung

- 8 -

1. Einleitung

Pflanzen sind im Gegensatz zu tierischen Organismen an ihren Standort gebunden und

müssen auf die sie umgebenen abiotischen und biotischen Umwelt- und Standortfaktoren

reagieren. Zu den abiotischen Faktoren gehören physikalische und chemische Reize, wie zum

Beispiel Temperatur, Wasser, Strahlung und chemische Zusammensetzung des Bodens.

Biotischen Faktoren kann u.a. die Konkurrenz zwischen Pflanzen derselben oder ver-

schiedenen Arten um einen Standort oder optimale Wuchsbedingungen sein. Ein weiterer

Faktor ist Stress, der zum Beispiel durch Pathogen- oder Herbivorbefall hervorgerufen

werden kann. Pflanzen müssen auf solche Stresssituationen reagieren bzw. sich dagegen

schützen. Im Zuge der Evolution haben Pflanzen verschiedene Gegenmaßnahmen entwickelt,

welche auf die jeweilig einwirkenden Stressfaktoren abgestimmt sind.

Zu den Maßnahmen gegen Herbivorbefall gehört zum einen die mechanische Abwehr, z.B.

durch Dornen oder Stacheln, und zum anderen die chemische Abwehr.

Zur chemischen Abwehr kann die Fähigkeit gerechnet werden, toxische oder antimikrobielle

Substanzen zu synthetisieren. Dabei muss man unterscheiden, ob diese Substanzen konstant

von der Pflanzen gebildet werden oder, ob die Pflanze die Möglichkeit hat, diese Abwehr-

stoffe bei Bedarf, zum Beispiel bei Verwundung durch einen Herbivoren, gezielt zu

synthetisieren und zu regulieren.

Bei dieser Art der induzierten Pathogen- und Herbivorabwehr muss die Pflanze in der Lage

sein, die Stresssituation zu erkennen und entsprechend zu reagieren. Die Steuerung dieser

Reaktionen wird von einem Teil der sogenannten Phytohormonen übernommen (Übersicht

bei Lamb et al., 1989; Trewavas & Malho, 1997).

Unter Phytohormonen versteht man niedermolekulare Signalstoffe, die in geringen

Konzentrationen wirksam sind und deren Bildungs- und Wirkorte in der Regel voneinander

getrennt sind. Außerdem besitzen sie ein multiples Wirkspektrum, wobei die Konzentration

am Wirkort streng reguliert wird. Neben den bereits länger bekannten fünf Gruppen von

Phytohormonen, den Auxinen, Cytokininen, Gibberellinen, der Abscisinsäure und Ethylen,

wurden in den letzten Jahren weitere Substanzgruppen mit phytohormonartigen Eigenschaften

und Wirkungen entdeckt. Zu diesen endogenen Signalstoffen gehören auch die Oxylipine.

Oxylipine sind azyklische bzw. zyklische Oxidationsprodukt von Fettsäuren, die in Zellen

regulatorische Funktionen übernehmen. Die Biosynthese der Oxylipine geht von Linol- bzw.

Linolensäure aus, welche durch Lipoxygenase (LOX) zu Fettsäurehydroperoxiden umgesetzt

Einleitung

- 9 -

wird. Diese Fettsäurehydroperoxide können durch eine große Anzahl verschiedener

Reaktionen weiter metabolisiert werden, wobei bisher sieben Enzyme bekannt sind, die diese

Reaktionen ausführen (Abb. 1.1; Feussner & Wasternack, 2002 ).

Einleitung

- 10 -

Abb. 1.1: (vorherige Seite) Übersicht über die Oxylipin-Biosynthese Die Übersicht über die Oxylipin-Biosynthese wurde nach Feussner & Wasternack (2002) erstellt.

Die gebildeten Fettsäurehydroperoxide werden durch die Hydroperoxidlyase (HPL), die

Peroxygenase (POX), die Lipoxygenase (LOX), Divinylethersynthase (DES), die Hydro-

peroxidreduktase (HPR) und die Epoxyalkoholsynthase (EAS) weiter metabolisiert. Die

Umsetzung von 13-Hydroperoxiden erfolgt durch die Allenoxidsynthase (AOS), wobei dieser

Reaktionsschritt und die sich anschließenden Reaktionen als „Jasmonsäure-Kaskade“

bezeichnet wird (Creelman & Mullet, 1997).

Die zyklischen Octadecanoide bilden eine Untergruppe der Oxylipine und werden als

Jasmonate bezeichnet. Zu den Jasmonaten gehört das direkte Endprodukt des Biosynthese-

wegs selber, die Jasmonsäure, alle aktive Zwischenprodukte im Biosyntheseweg, sowie alle

biologisch aktiven Derivate, die sich von der Jasmonsäure ableiten. Die Substanzen sind in

Pflanzen weit verbreitet und haben ein multiples Wirkspektrum (Creelman & Mullet, 1997;

Turner et al., 2002).

Jasmonsäure, deren Methylester schon 1962 von Demole et al. beschrieben wurde, inhibiert

das Wurzelwachstum (Staswick et al., 1992) und ist verantwortlich für die Pollenentwicklung

und Blütenorganbildung (Feys et al., 1994; McConn & Browse, 1996; Sanders et al., 2000;

Stinzi & Browse, 2000), sowie die Herbivor- und Pathogenabwehr (McConn et al., 1997;

Thomma et al., 1999).

Die Biosynthese von Jasmonsäure geht von der dreifach ungesättigten Fettsäure α-Linolen-

säure aus und wurde 1984 von Vick und Zimmerman weitgehend aufgeklärt. α-Linolensäure

wird durch eine Phospholipase A1 als Antwort auf ein exogenes Signal, wie z.B.

Verwundung, aus Plastidenmembranen freigesetzt (Mueller et al., 1993; Weiler et al., 1993).

α-Linolensäure wird durch eine 13-Lipoxygenase in Hydroperoxyoktadekatriensäure umge-

wandelt, welche durch die Allenoxidsynthase in das instabile Zwischenprodukt 12,13(S)-

Epoxy-9,11,15(Z)-oktadekatriensäure umgesetzt wird. Dieses instabile Zwischenprodukt wird

entweder durch die Allenoxidcyclase in 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) umgewandelt oder

metabolisiert spontan zu α- oder γ-Ketolen (Wasternack & Hause, 2002). Die Synthese von

α-Linolensäure zu OPDA findet in Plastiden, bei Photosynthese treibenden Pflanzen in den

Chloroplasten statt (Vick & Zimmerman, 1984; Blee & Joyard, 1996; Hamberg et al., 1988).

Einleitung

- 11 -

Abb. 1.2: Biosyntheseweg von Jasmonsäure (Octadecanoidweg)

Einleitung

- 12 -

Danach verlässt die OPDA die Chloroplasten, und aus OPDA wird durch die 12-oxo-Phyto-

diensäure-Reduktase durch Reduktion der Doppelbindung im Cyclopentanring 3-oxo-2-(Pent-

2´-enyl)-cyclo-pentyloktansäure gebildet. Durch drei hintereinander folgende β-Oxidationen

wird diese zu (3R, 7S)-Jasmonsäure umgesetzt. Diese Reaktionen finden wahrscheinlich in

den Peroxisomen statt ( Vick & Zimmerman, 1986; Schaller et al., 2000).

(3R, 7S)-Jasmonsäure kann spontan zu (3R, 7R)-Jasmonsäure isomerisieren, wobei das

Gleichgewicht von (3R, 7S)- zu (3R, 7R)-Jasmonsäure etwa 9 : 1 beträgt ( Sembdner &

Parthier, 1993 ).

12-oxo-Phytodiensäure(OPDA) ist, wie oben schon erwähnt, das erste zyklische Zwischen-

produkt im Biosyntheseweg der Jasmonsäure. Untersuchungen an den Arabidopsis thaliana-

Mutanten dde1 (für DELAYED DEHISCENCE1) und opr3 (für oxo-phytodienoic acid

reductase3), die einen Defekt im Jasmonsäure-Biosyntheseweg bei der Umwandlung von

OPDA zu 12,13(S)-Epoxy-9,11,15(Z)-octadekatriensäure besitzen, zeigen eine Akkumulation

von OPDA nach Verwundung (Sanders et al., 2000; Stinzi & Browse, 2000). Das

Genexpressionsmuster in opr3 Pflanzen, die mit OPDA behandelt wurden, unterschied sich

von der Genexpression bei jasmonsäurebehandelten opr3 Pflanzen (Stinzi & Browse, 2000).

Zusammen mit den Daten von Blechert et al. (1997) ist es wahrscheinlich, dass OPDA selbst

als Signalmolekül wirksam ist und regulatorische Aktivität besitzt, die sich von der Aktivität

der Jasmonsäure unterscheidet (Turner et al., 2002).

Untersuchungen zum endogenen OPDA-Gehalt bei Arabidopsis thaliana führten zu der

Entdeckung von sn1-O-(9S,13S)-12-oxo-Phytodiensäure-sn2-O-(7Z,10Z,13Z)-hexadekatrie-

noyl-monogalactosyldiacylglycerid (MGDG-O; Abb 1.3) (Stelmach et al., 2001).

Erste Untersuchungen zur MGDG-O-Konzentration bei verwundeten Arabidopsis-Pflanzen

haben gezeigt, dass es keine direkt Korrelation zwischen der MGDG-O-Konzentration und

der wundinduziertem Jasmonsäure-Konzentration gibt. Nach Verwundung kommt es

längerfristig zu einen Anstieg des MGDG-O-Gehalts, welcher transient verläuft. Dieser

transiente Anstieg könnte daraufhin deuten, dass MGDG-O nicht das Endprodukt eines

Biosyntheseweges ist, sondern weiter umgesetzt wird (Stelmach et al., 2001).

Einleitung

- 13 -

Abb. 1.3: Struktur von sn1-O-(9S,13S)-12-oxo-Phytodiensäure-sn2-O-(7Z,10Z,13Z)- hexadekatrienoyl-monogalactosyldiacylglycerid (MGDG-O) Dargestellt ist die Strukturformel (A) und ein „ball and stick“-Modell (B) von MGDG-O

Die Funktion von MGDG-O ist bisher unbekannt. Eine mögliche Funktion von MGDG-O

könnte die „Früherkennung“ bei pathogenem Befall durch phytopathogene Pilze sein. Ein

Indiz für diese These könnte die effektive Freisetzung der lipidgebundenen OPDA durch die

sn1-spezifischen Lipasen aus Rhizopus arrhizus und Mucor javanicus, bei denen es sich um

pflanzenpathogenen Saprophyten handelt, sein. Bei Befall von Pflanzenzellen durch phyto-

pathogene Pilze könnte MGDG-O als eine Art „Reporter“ dienen. Dabei könnte OPDA durch

Pilzlipasen freigesetzt werden und entweder direkt, oder nach Umwandlung in Jasmonsäure,

die lokalen pflanzlichen Abwehrmechanismen einleiten (Stelmach et al., 2001). Für eine

solchen Mechanismus könnte ebenfalls die Tatsache sprechen, dass Octadecanoide als lokale

und nicht als systemische Abwehrsignale in Pflanzen agieren ( Kubigsteltig et al., 1999 ) .

Lipasen [E.C.3.1.1.3; Triacylglycerid-Hydrolasen] erfüllen die Aufgabe, Fette aus Triacyl-

glyceriden an Öl-/Wasseroberflächen zu hydrolysieren (Abb 4.1). Dabei sind sie in Tieren

(Borgström & Brockman, 1986), Mikroorganismen (Brune & Goetz, 1992; Jaeger et al.,

1994; Jaeger & Reetz, 1998), Pilzen (Iwai & Tsujisaka, 1984) und Pflanzen (Huang, 1993;

Wooley & Petersen, 1994; Mukherjee & Hills, 1994) weit verbreitet. Man kann bei Lipasen

Einleitung

- 14 -

u.a. zwischen „echten“ Lipasen [E.C. 3.1.1.3], Phosholipasen A1 [E.C. 3.1.1.32],

Phospholipasen A2 [E.C. 3.1.1.4], Phospholipasen C [E.C. 3.1.4.3], Phospholipasen D [E.C.

3.1.4.4] und Galactolipasen [E.C. 3.1.5.1] unterschieden werden.

Abb. 1.4: Allgemeiner Reaktionsmechanismus von Lipasen

Neben der Funktion Speicherfette abzubauen, sind Lipasen auch in pflanzliche Abwehrmaß-

nahmen involviert.

Pflanzen besitzen neben dem Jasmonsäure-Signalweg noch andere hormongesteuerte

Signalwege, mit denen sie auf Stressfaktoren reagieren können. Dabei laufen diese

Signalwege nicht unabhängig voneinander ab, sondern sind untereinander verbunden („cross

talk“). Zu den Hormonen gehören u.a. Ethylen und Salicylsäure. Bei Pathogenbefall kommt

es zur Ausbildung systemischer Resistenzen (SAR), wobei Salicylsäure sowohl für die

Ausbildung der SAR als auch für die Bildung von lokalen Resistenzen verantwortlich ist

(Thomma et al., 1995). Des weiteren ist Salicylsäure in die Reaktionen auf photooxidativen

Stress durch oxidative Sauerstoffspezies involviert (Chamnong et al., 1998; Rao & Davis,

1999).

Für Lipasen bzw. Lipasen-ähnliche Proteine konnten regulatorische Eigenschaften auf

Salicylsäure bzw. auf Salicylsäure-vermittelte Signalwege gezeigt werden. Jirage et al. (1999)

konnte ein Gen identifizieren, das für ein Lipase-ähnliches Protein PAD4 (für phytoalexin

Einleitung

- 15 -

deficient4) kodiert, welches nach Befall durch Bakterien und nach Salicylsäure-Behandlung

akkumulierte.

Falk et al. (1999) zeigte ebenfalls bei Arabidopsis thaliana, dass das Protein EDS1 (für

enhanced disease susceptibility1) eine Homologie zur katalytischen Sequenz von

eukaryotischen Lipasen aufwies und an der Akkumulation von Salicylsäure beteiligt war.

Die Synthese von EDS1 und PAD4 konnte durch Salicylsäure induziert werden (Falk et al.,

1999), wobei beide Proteine positiv auf die Salicylsäure-Synthese wirkten, was für eine

Salicylsäure-abhängige positive Feedback-Schleife sprach, die die Pflanzenabwehr verstärkt

(Shirasu et al. 1997; Falk et al., 1999; Jirage et al., 1999).

Die bisher angeführten Lipasen bzw. Lipase-ähnlichen Proteine sind wahrscheinlich in den

durch Salicylsäure vermittelten Signalweg involviert. Aber auch im Jasmonsäure-Biosyn-

theseweg besitzen Lipasen eine wichtige Funktion. So wurde die Freisetzung von α-

Linolensäure aus Membransystemen durch eine Lipase postuliert, konnte aber erst durch

Ishiguro et al. (2001) in der Arabidopsis thaliana-Mutante dad1 (für DEFECTIVE IN

ANTHER DEHISCENCE1) identifiziert werden. Dabei handelt es sich um eine

chloroplastidäre Phospholipase A1, welche aus Membranlipiden α-Linolensäure sn1-

spezifisch freisetzt. Durch Homologie-Untersuchungen der DAD1-Aminosäuresequenz, die

das für Lipasen typische Aminosäurenmotiv GXSXG enthält, konnten 11 weitere Proteine

bzw. Gene lokalisiert werden. Diese Gene kodieren auf Grund ihrer Sequenzhomologie mit

DAD1 wahrscheinlich für DAD1-ähnliche Proteine. Sechs dieser DAD1-ähnlichen Proteine

besitzen eine chloroplastidäre Transitpepdid-Sequenz. Diese Proteine wurden bisher nicht

weiter charakterisiert (Ishiguro et al., 2001).

Da Monogalactosyldiglycerid (MGDG) ein Strukturlipid der Chloroplastenmembranen

darstellt und MGDG-O wahrscheinlich in Chloroplasten lokalisiert ist (Stelmach et al., 2001),

wäre es möglich, dass die Hydrolyse von OPDA aus MGDG-O durch eine der von Ishiguro et

al. (2001) beschriebenen putativen Lipasen katalysiert wird.

Bei Monogalaktosyldiglycerid (MGDG) handelt es sich um ein Galactolipid. Galactolipide

tragen in der sn3-Position des Glycerins Galactose(n) und bilden mit 80% den Hauptanteil

aller pflanzlichen Lipide (Joyard et al.,1996).

MGDG hat in der Thylakoidmembran neben strukturbildenden Aufgaben auch die Funktion

die Komplexe des photosynthetischen Apparats zu stabilisieren, wie Untersuchungen der

mgd1- und dgd1-Mutanten von Arabidopsis thaliana gezeigt haben (Murphy et al., 1982;

Murphy et al., 1986 ; Härtel et al., 1997; Simidjiev et al., 1998; Jarvis et al., 2000).

Einleitung

- 16 -

Eine analoge Funktion wäre auch für MGDG-O denkbar. In Abb. 1.5 ist die mögliche Loka-

lisation dargestellt. Dabei wird klar, dass über die Funktion und die Lokalisation von MGDG-

O noch keine Daten vorliegen. So könnte MGDG-O sowohl in der Envelope- als auch in der

Thylakoidmembran lokalisiert sein.

Abb. 1.5: Hypothetische Lokalisation und Funktion im Chloroplasten

Dargestellt ist ein Modell für die möglichen Lokalisationsorte, sowie die mögliche Einbindung von MGDG-O in die Jasmonsäure-Biosynthese

Auch die Prozesse, die zur Hydrolyse von MGDG-O führen können, sind noch nicht

aufgeklärt. Ebenso ist unklar, ob es sich hierbei um eine chemische oder eine enzymatisch

katalysierte Reaktion handelt.

Einleitung

- 17 -

Ein weiterer Faktor, der noch nicht geklärt ist, ist der Syntheseweg von MGDG-O. Zum einen

könnte OPDA in freier Form aus α-Linolensäure synthetisiert (siehe Abb. 1.2) und dann mit

Hilfe einer putative Lipase an die sn1-Position des MGDO, im Austausch gegen die dort

vorhandene Fettsäure, gebunden werden. Ein anderer möglicher Syntheseweg könnte darin

bestehen, dass die in sn1-Position sitzende α-Linolensäure direkt am MGDG in OPDA

umgewandet wird. Für die AOS ist die Assoziation an Chloroplastenmembranen nach-

gewiesen (Blee & Joyard, 1996; Song et al., 1998), allerdings war die genaue Lokalisation

des Enzyms in den Chloroplasten zu Beginn dieser Arbeit noch nicht bekannt.

Unabhängig von der MGDG-O-Synthese, ist MGDG-O entweder selbst eine biologisch aktive

Substanz, die in pflanzliche Abwehrmechanismen eingreift, oder diese Lipidklasse dient als

eine Art „Speicher“ für OPDA, aus dem OPDA bei Stresssituation, wie Herbivor- oder

Pathogenbefall freigesetzt werden kann und somit eine schnelle Abwehrreaktion in der

Pflanze einleitet. Bei Arabidopsis thaliana konnte eine membrangebundene enzymatische

Aktivität bereits nachgewiesen, aber noch nicht näher charakterisiert werden (Stelmach et al.,

2001).

Auf Grund der Entdeckung dieser neuen Klasse der Oxylipine in Form lipidgebundener

OPDA an die sn1-Position von Monogalactosyldiglycerid in Arabidopsis thaliana ergaben

sich die Fragestellungen für diese Arbeit.

Da MGDG-O möglicherweise bei Pathogenbefall oder anderen Stresssituationen als

„Speicherlipid“ für OPDA dienen und somit vielleicht eine „Schlüsselfunktion“ innerhalb der

pflanzlichen Abwehr einnehmen könnte, sollte als erstes Ziel dieser Arbeit die Verbreitung

und der Gehalt an lipidgebundener OPDA bei verschiedenen Pflanzenarten bestimmt werden.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der Lokalisation von lipidgebundener OPDA. Da es sich

bei MGDG, an welches die OPDA gebunden vorliegt, um ein typisch chloroplastidäres Lipid

handelt, sollte MGDG-O innerhalb von Chloroplasten lokalisiert werden.

Weiterhin sollte die Hydrolyse lipidgebundener OPDA aus MGDG-O charakterisiert werden.

Dafür war es notwendig, intakte Chloroplasten und deren Kompartimente unter verschiedenen

Bedingungen zu inkubieren und anschließend die Konzentrationänderungen von lipidge-

bundener und freier OPDA zu messen, um so Rückschlüsse auf die Funktion lipidgebundener

Einleitung

- 18 -

OPDA innerhalb der pflanzlichen Abwehrmechanismen ziehen zu können. Außerdem sollte

geklärt werden, ob es sich bei der Hydrolyse um eine chemische oder enzymatische Reaktion

handelte und eine eventuell vorhandene putative Lipase in den Chloroplasten lokalisiert

werden.

Weiterhin wurde der Transport von freigesetzter OPDA aus Chloroplasten charakterisiert und

die Spezifität der eventuell vorhandene putative Lipase untersucht.

Material und Methoden

- 19 -

2. Material und Methoden

2.1 Geräte und Ausstattung

Elektroblotkammer Trans-Blot Cell BioRad, München

Elektro-Eluter Modell 1000 BioRad, München

Gelelektrophorese:

- Polyacrylamidgelkammern Werkstatt, RUB

- Glasplatten Glaserei, Bochum

- Kämme Werkstatt, RUB

GC-MS-Systeme:

- Magnum mit Varian 3400 GC Finnigan, Bremen

- Autosampler A200S ( CTC )

GC-Säule:

- 2B50 Phenomenex, Aschaffenburg

Glaschromatographiesäulen Werkstatt, RUB

HPLC-Anlagen

- Waters 600E System Controller Waters, Milford, USA

- Waters Detektor, 470, Scanning Fluorescence Photometer Waters, Milford, USA

- Spektrometer Lambda Max 481 Waters, Milford, USA

- Waters 510 HPLC-Pumpe Waters, Milford, USA

- Varian Dynamax SD-200 Varian, Darmstadt

- Varian Dynamax UV-1 Varian, Darmstadt

HPLC-Säulen

- Nucleosil 100 ( 250 x 4 mm i.D.; 3 µm ) Knauer, Berlin

- Nucleosil 100 ( 250 x 4 mm i.D.; 15 -25 µm ) Knauer, Berlin

- Luna C 18 (250 x 4 mm i.D.; 5 µm ) Phenomenex, Aschaffenburg

Elektrophoresegeräte:

- PS 2301 Macrodrive Pharmacia Biotech, Freiburg

pH-Meter WTW mit Elektrode pH 538 Wiss. Tech. Werkstätten,

Wertheim

Photometer

- Uvikon 933 Bio-Tek Kontron Instr.

GmbH, Neufahrn


- 20 -

- Novaspec II Pharmacia Biotech,

Wertheim

Rotationsverdampfer Rotavapor Büchi, Schweiz

Sauerstoffelektrode Oxi 538 Oximeter Wiss. Tech. Werkstätten,

Wertheim

Sauerstoffsensor Cell Ox 325 Wiss. Tech. Werkstätten,

Wertheim

Überkopfschüttler

Waagen

- Kern 470 Scaltec, Heiligenstadt

- Feinwaage SBC 32 Scaltec, Heiligenstadt

- Lauda-T Wasserbad Lauda.Dr.R.Worbner, GmbH

& CoKG, Lauda Königshofen

Ultrazentrifugen

- Tischultrazentrifuge TL 100 mit Rotor TL100 Beckman, München

- OTD Kombi mit Rotor T 8.65 Kendro, Hanau

Vakuumkonzentrator Bachhofer, Reutlingen

Vakuumpumpe Vakuumbrand GmbH &

CoKG, Wertheim

Zentrifugen

- Sorvall RC-5B Plus Kendro, Hanau

mit den Rotoren SS34, HB 6 und GSA Kontron, Neufahrn

- Tischzentrifuge 5417 R Eppendorf,

- Kühlzentrifuge 5415 Eppendorf,

Alle weiteren Geräte entsprachen dem üblichen Laborstandard

2.2 Chemikalien und Verbrauchsmittel

(11Z,14Z,17Z)-Eicodekatriensäure (20:3 Fettsäure) Sigma, München

Acrylamid Serva, Heidelberg

Ammoniumpersulfat (APS) Serva, Heidelberg

Aminocapryl-Säulen Chromabond NH2 Machery & Nagel, Düren

Amino-n-carpronsäure Sigma, München


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Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris(hydroxymethyl-)methan Biomol, Hamburg

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) Biomol, Hamburg

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

Borsäure Serva, Heidelberg

Coomassie Brilliant Blue G 250 Serva, Heidelberg

Digalactosyldiglycerid (aus Soja) CPS, Chemie + Service,

Düren

Diazomethan LS Pflanzenphysiologie,

RUB, Bochum

Digitonin Sigma, München

Dithiothreitol (DTT) Biomol, Hamburg

Ethylendiamin- N,N,N’,N’-tetraessigsäure (EDTA) Sigma, München

Glycerin 83-86% Riedel-de-Haen

α-Linolsäure Sigma, München

α-Linolensäure Sigma, München

Margarinsäure (17 : 0 Fettsäure) Sigma, München

Monogalactosyldiglycerid (aus Soja) CPS, Chemie + Service,

Düren

Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg

N-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-ethansulfonsäure (HEPES) Biomol, Hamburg

N,N’-Methylen-bis-acrylamid (BAA) Serva, Heidelberg

N,N,N’,N’-Tetramethylendiamin (TEMED) Serva, Heidelberg

p-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) Duchefa, Haarlem, NL

12-oxo-Phytodiensäure LS Pflanzenphysiologie,

RUB, Bochum

[2H5 ]cis-oxo-Phytodiensäure LS Pflanzenphysiologie,

RUB, Bochum

Ölsäure Sigma, München

Palmitinsäure Sigma, München

Percoll Amershan Biosciences,

Uppsala, Schweden

Phosphatidylglycerol CPS, Chemie + Service,

Düren


- 22 -

Phosphatidylcholin CPS, Chemie + Service,

Düren

Phosphatidylethanolamin CPS, Chemie + Service,

Düren

Phosphatidylserin CPS, Chemie + Service,

Düren

Ponceau S Sigma, München

Proteinpulver Powerplay Wander, Celle

Rinderserumalbumin (RSA) Biomol, Hamburg

Rinderserumalbumin, Fettsäurefrei Sigma, München

Stearinsäure Sigma, München

Sulfochinovosyldiglycerol (Soja) CPS, Chemie + Service,

Düren

Tergitol Sigma, München

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) USB, Cleveland, USA

Triton X-100 Serva, Heidelberg

Alle nicht aufgeführten Chemikalien wurden in Analysequalität, bzw. bei den HPLC-Lauf-

mitteln in HPLC-Qualität, von den Firmen Aldrich, Baker, Biomol, Boehringer, Fluka, Gibco,

Merck, Pharmacia, Riedel-de-Haen, Roth, Serva und Sigma bezogen.

2.3 Antikörper

Im Zuge dieser Arbeit wurden folgende Antikörper verwendet:

Antikörper Antigen Herkunft/Referenz

anti AOS Kaninchenserum denaturiertes Allenoxidsynthase Protein Laudert et al. (1997)

anti 30.3 Kaninchenserum denaturiertes Phosphat-Translokator Flügge & Wessel

Protein (30.3 kDa) aus Spinat-Envelope (1984)

anti-Kaninchen-IgG- Fc-Abschnitte von Kaninchen Serva,

gekoppelt an alkalische Immunoglobulin Heidelberg

Phosphatase


- 23 -

2.4 Enzyme

Lipase aus Mucor javanicus Sigma, München

Alkalische Phosphatase Boehringer, Mannheim

2.5 Pflanzenmaterial

Als Hauptuntersuchungsobjekt dieser Arbeit diente Arabidopsis thaliana (L) HEYNH. C24.

Die Anzucht der Pflanzen erfolgte bei einer Lichtintensität von 150 µE x m-2 x s-1 auf einer

Mischung von Standarderde und Sand im Verhältnis 2:1 unter Gewächshausbedingungen. In

den ersten 4 –5 Wochen wurden die Pflanzen unter Kurztagbedingungen (8h Licht) gehalten

und danach in Langtagbedingungen (16h Licht) umgesetzt. Die Temperatur im Gewächshaus

betrug 22-24°C am Tag und 18-20°C in der Nacht.

Für die Untersuchungen zur Verbreitung des OPDA-haltigen Lipids wurden Brassica

oleracea ssp., Sinapis arvensis, Avena sativa, Tricium aestivum für 2 - 3 Wochen, Vicia faba,

Petroselium crispum, Allium schoenoprasum und Zea mays für 3 – 4 Wochen, Nicotiana

tabacum, Lycopersicon esculentum, Spinacia oleracea, Phaseolus vulgaris und Solanum

tuberosum für 7 – 8 Wochen unter den oben angegebenen Bedingungen im Gewächshaus

angezogen.

Die Anzucht von Bryonia dioica erfolgte in einer Phytokammer unter Kurztagbedingungen

(8h Licht) auf Standarderde, wobei die Temperatur 22-24°C am Tag und 18-20°C in der

Nacht betrug.

Aus dem Freigelände des Botanischen Gartens der RUB stammte das Blattmaterial von

Hyoscyamus albus, Datura spec., Ginkgo biloba, Polystichum setiferum, Pteridium

aquilinum, Polystichum vulgare, Larix decidua, Abies concolor und Taraxacum officinalis.

2.6 Biochemische Methoden

2.6.1 Proteinbestimmung

Für die Quantifizierung von Proteinen wurden die Methoden nach Bradford (1976) und nach

Esen (1978) mit Rinderserumalbumin als Proteinreferenz verwendet.

2.6.2 Chlorophyllbestimmung

Für die Bestimmung des Chlorophyllgehaltes diente die Methode von Arnon (1949 ), wobei

der Gesamtgehalt an Chlorophyll a und b bestimmt wurde.


- 24 -

2.6.3 Präparation intakter Chloroplasten

Für die Lokalisation von MGDG-O und die Charakterisierung der OPDA–Freisetzung aus

dem OPDA-haltigen Lipid war die Präparation intakter Chloroplasten nötig. Hierfür wurde

die Methode von Rensink et al. (1998) verwendet, wobei die Sorbitkonzentration im

Homogenisationspuffer von 300 mM auf 350 mM erhöht wurde.

40 g Blattmaterial von A. thaliana wurden in 80 ml Homogenisationspuffer [350 mM

Sorbitol, 20 mM Tricin/KOH pH 8,4, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM NaHCO3, 0,1%

(w/v) BSA, 330 mg Ascorbat] homogenisiert und durch vier Lagen Mull abfiltriert. Das

Filtrat wurde bei 4.080 x g für 5 min. im Rotor HB 6 zentrifugiert, der Überstand wurde

verworfen und das Pellet mit 2 ml 40% Percoll aufgenommen.

Diese Suspension wurde auf einen Percoll-Stufengradienten aufgeben. Der Gradient bestand

aus 3 ml 70 %, 4 ml 50 % und 4 ml 40 % Percoll (v/v). Es folgte eine 15 minüige

Zentrifugation bei 4.080 x g bei ungebremsten Auslauf. Nach der Zentrifugation wurde die

Bande an der Grenzschicht von 50% zu 70% Percoll, welche den intakten Chloroplasten

entsprach, abgenommen, mit Homogenisationspuffer gewaschen und 10 min. bei 4.080 x g

zentrifugiert.

2.6.4 Bestimmung des Intaktheitsgrades von Chloroplasten

Um den Intaktheitsgrad der für die Versuche eingesetzten Chloroplasten zu bestimmen, wurde

entweder die Sauerstoffentwicklung mittels O2-Elektrode nach Lilley et al. (1975) bestimmt

oder die Aktivität der NADPH-abhängigen Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase nach

der Methode von Bergmeyer (1974) vor und nach der Lyse von Chloroplasten gemessen. Die

Lyse der Chloroplasten erfolgte osmotisch mit TE-Puffer [10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,1mM

EDTA] für 10 min. bei 4°C. Bei beiden Methoden wurden 100 µg Chlorophyll eingesetzt.

2.6.5 Präparation von Stroma, Envelope und Thylakoidmembranen

Hierfür wurden intakte Chloroplasten osmotisch mit TE-Puffer [10 mM Tris/HCl, pH 7,5,

0,1mM EDTA] lysiert und mittels eines Saccharose-Stufengradienten nach der Methode von

Li et al. (1991) in Stroma, Envelope und Thylakoidmembranen aufgetrennt. Der Gradient

bestand aus 5 ml 1,2 mM, 5 ml 1,0 mM und 5 ml 0,46 mM Saccharose. Es folgte eine zwei-

stündige Zentrifugation bei 49.700 x g und 4°C bei ungebremsten Auslauf. Danach wurden

die Fraktionen, welche Stroma, Envelope und Thylakoiden entsprachen abgenommen und,

wie folgt, weiterbehandelt.


- 25 -

Stroma:

Fällung der Stromaprotein mit 80% MeOH für 2h bei -80°C oder bei -20°C. Zentrifugation

des Ansatzes für 15 min. bei 11.000 x g bei 4°C. Das Pellet wurde in 100 µl TE-Puffer

aufgenommen.

Envelope:

Die Fraktion des Envelope wurde mit dem doppelten Volumen TE-Puffer gewaschen, 2h bei

49.080 x g abzentrifugiert und das Pellet in 100µl TE-Puffer aufgenommen.

Thylakoide

Das Thylakoidpellet wurde in TE-Puffer aufgenommen und für 10 min. bei 7.500 rpm

zentrifugiert. Die pelletierten Thylakoide wurden in 0,5 ml TE-Puffer aufgenommen.

Die Überprüfung und Verifizierung der Trennung erfolgte mittels SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese und immunologischem Nachweis charakteristischer Proteine.

2.6.6 Präparation von Proteinkomplexen aus Thylakoidmembranen

Für die Präparation von Proteinkomplexen aus Thylakoidmembranen wurde der

Chlorophyllgehalt intakter Chloroplasten auf 0,75 mg Chlorophyll/ml eingestellt. Danach

folgte eine osmotische Lyse der intakten Chloroplasten (2.6.5) und eine Zentrifugation für 5

min. bei 11.000 x g, um die Thylakoidmembranen zu sedimentieren. Die Thylakoidmem-

branen wurden zweimal 10 min. mit TE-Puffer [10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,1mM EDTA]

gewaschen. Anschließend wurde 300 µg Chlorophyll in 150 µl Lysispuffer [ 50 mM Bis-Tris,

pH 7,0, 1 M 6-Aminocapronsäure, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 1

mM DTT ] und 75 µl 5 % Digitonin aufgenommen und die Ansätze für zwei Stunden im

Überkopfschüttler bei 4°C inkubiert. Nach Inkubationsende wurden die Ansätze eine Stunde

bei 50.000 x g bei 4°C zentrifugiert, der Überstand mit 5 % Coomassie Brilliantblau G 250

versetzt und 10 min. bei 4°C inkubiert. Danach erfolgte eine weitere Zentrifugation bei

50.000 x g bei 4°C. Der Überstand wurde mittels „Blau-nativer“-Polyacrylamid-Gelelektro-

phorese (BN-PAGE, 2.11.2) aufgetrennt.


- 26 -

2.7 Methoden zur Extraktion und Reinigung von Lipiden

2.7.1 Extraktion von Lipiden

Für die Extraktion unterschiedlicher Lipidklassen, darunter auch MGDG-O wurden zwei

verschiedene Methoden verwendet. Für die präparative Gewinnung der verschiedenen

Lipidklassen, sowie für Extraktion von Lipiden aus unterschiedlichen Pflanzenspezies

erfolgte die Präparation nach der Methode von Bligh und Dyer (1959).

Für die Präparation von Rohlipid aus Chloroplasten und aus Gradientenfraktionen wurde eine

Methanolextraktion verwendet.

Für die Lipidextraktion nach Bligh und Dyer (1959) wurde 100 g bzw. 300 g

Pflanzenmaterial in einem dreifachen Volumen kochenden Methanol für 15 min. mit 100 mg

2,6-Di-tert.-butyl-4-methylphenol (BHT) pro 100 g Frischgewicht inkubiert. Nach Ende der

Inkubationszeit wurde das Methanol abfiltriert und das Pflanzenmaterial in 300 ml bzw. 900

ml Methanol/ Chloroform (2:1,v/v) bei RT unter Rühren für eine Stunde inkubiert.

Anschließend wurde das Methanol/Chloroformgemisch abfiltriert und jedes der beide Filtrate

auf ein Verhältnis von Methanol/Chloroform/Wasser (1:1:1, v/v) eingestellt. Die

Chloroformphase wurde ausge-schüttelt, abgenommen und bis zur Trockne am

Vakuumverdampfer einrotiert.

Für die Rohlipidextraktion aus Chloroplasten und Gradientenfraktionen wurde diese direkt in

Methanol-Wasser 70 : 30 (v/v) aufgenommen und für 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurden die Proben 1 min. bei 11.000 x g abzentrifugiert und der Überstand wie

unter Punkt 2.7.3 beschrieben, weiterbehandelt.

2.7.2 Vorreinigung von Lipiden mittels C18- und NH2-Festphasenextraktion

Zur Vorreinigung des Rohlipids wurde das in Methanol-Wasser (70 : 30, v/v) aufgenommene

Rohlipid über C18-Festphasenkartuschen gereinigt. Der Durchlauf wurde verworfen und es

wurde mit je 4 ml iso-Propanol/ n-Hexan (80 : 55; v/v) eluiert. Um freie OPDA aus den

Ansätzen zu entfernen, wurde das Eluat über NH2-Kartuschen gegeben, diese mit 5 ml iso-

Propanol/ n-Hexan (80:55;v/v) eluiert, Durchlauf und Eluat aufgefangen und vereinigt. Das so

vorgereinigte Rohlipid wurde am Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingedampft und der

Rückstand in 2 ml Chloroform/Methanol (1:1;v/v) aufgenommen und ggf. unter Stickstoff bei

-28°C gelagert. Dieser Reinigungsschritt erfolgte nach der Methode von Stelmach et al.

(2001).


- 27 -

2.7.3 Enzymatische Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure

Zur Überprüfung von Proben auf lipidgebundene OPDA wurde ein geeignetes Aliquot in je 1

ml 100 mM TE-Puffer, pH 7,5, und 100 mM Boratpuffer, pH 7,5, gelöst und mit 25 U

Mucor javanicus-Lipase versetzt und über Nacht bei 35°C inkubiert. Um die freigesetzte

OPDA quantifizieren zu können, wurde zur Inkubationsbeginn eine interne Standardisierung

mit 156 ng [2H5] cis-oxo-Phytodiensäure vorgenommen.

Die freigesetzte OPDA und Fettsäuren wurden mit 100 µl konzentrierter HCl angesäuert und

anschließend mitEthylacetat ausgeschüttelt. Die Ethylacetatphase wurde abgenommen und bis

zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Diethylether aufgenommen und

über NH2-Kartuschen gereinigt. Es folgte ein Waschschritt mit 10 ml Chloroform / iso-

Propanol (2:1, v/v) und anschließend die Elution von OPDA und Fettsäuren mit 12 ml

Diethylether / Essigsäure (49:1, v/v) eluiert. Das Eluat wurde unter Stickstoff eingedampft,

der Rückstand methyliert (2.14.1 ), in 30 µl Chloroform aufgenommen und mit Hilfe von

GC/MS analysiert (2.14.4 ).

2.8 Untersuchungen zur Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure

Die Freisetzung lipidgebundener OPDA und der Gehalt an freier OPDA wurde zum einen bei

intakten Chloroplasten und zum anderen an Proteinkomplexen, die mit der „Blau-nativen“-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) aufgetrennt wurden, untersucht.

2.8.1 Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure in intakten Chloroplasten

Intakte Chloroplasten (Präparation, siehe 2.6.3) wurden unter verschiedenen Bedingungen

inkubiert, um die Freisetzung lipidgebundener OPDA in intakten Chloroplasten charakteri-

sieren zu können.

So wurde der Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA (2.7.1, 2.7.2, 2.7.3) während

Dunkelheit, bei Raumlicht und unter Starklicht bestimmt, wobei die Chloroplastenansätze

jeweils für 90 min. inkubiert und im Abstand von 30 min. Aliquots von 0,1 mg Chlorophyll

zur Analyse entnommen wurden. Für die Starklichtversuche wurde eine Lampe vom Typ

Philips Spot PAR 38 (150 W) verwendet, deren Abstand 50 cm zu den auf Eis inkubierten

Chloroplasten betrug.

Für die Untersuchungen zum Einfluss unterschiedlicher pH-Werte wurde der pH- Wert im

Homogenisationspuffer, welcher gleichzeitig auch als Inkubationspuffer [350 mM Sorbitol,

20 mM Tricin/KOH (pH s.u.), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM NaHCO3, 0,1% BSA,

330 mg Ascorbat] diente, auf Werte von 5,5 bis 9,5 in Schritten von einer pH-Einheit variiert.


- 28 -

Bei den Untersuchungen zum Einfluss von Calcium wurde die Calciumkonzentration mit

Hilfe des Programms MaxChelator im Inkubationspuffer [350 mM Sorbitol, 20 mM

Tricin/KOH pH 8,4, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM NaHCO3, 0,1% BSA, 330 mg

Ascorbat] im Bereich von 0,05 bis 100 µM eingestellt. Die Probenentnahme und Weiter-

behandlung erfolgte, wie oben beschrieben.

Bei allen Versuchen wurde die Temperatur in den Versuchsansätzen zwischen 4 und 6°C

gehalten. Bei der Entnahme der Aliquots wurde der Intaktheitsgrad der Chloroplasten

überprüft (2.6.4).

2.8.2 Freisetzung von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure aus „Blau-nativen“-

Polyacrylamidgelen

Nach der Auftrennung von Proteinkomplexen aus Thylakoidmembranen durch „Blau-native“

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2.11.2) wurde das Polyacrylamidgel entsprechend dem

Auftrennungsmuster der Proteinkomplexe geschnitten und die Gelbanden mit Methanol (5 ml

pro Gramm Gel) für 30 min. inkubiert. Nach einer Zentrifugation der Proben bei 11.000 x g

für 1 min. wurde der Überstand für die Vorreinigung von MGDG-O mittels C18- und NH2-

Festphasenextraktion eingesetzt. Danach erfolgte die Überprüfung der lipidgebundenen

OPDA mittels Lipasetest mit Mucor javanicus-Lipase (2.14.4).

2.9 Versuche zum Transport von freier 12-oxo-Phytodiensäure aus Chloroplasten

Neben der Freisetzung von lipidgebundener OPDA in Chloroplasten unter unterschiedlichen

Bedingungen, sollte auch der Transport freigesetzter bzw. freier OPDA aus Chloroplasten

untersucht werden.

Für alle nachfolgenden Versuche wurden intakte Chloroplasten präpariert, wobei der Homo-

genisationspuffer kein BSA enthielt. 0,5 ml Aliquots der Chloroplastensuspension (≅ 0,7 – 1,2

mg Chlorophyll) wurden 1 min bei 11.000 x g zentrifugiert, das Pellet in 0,5 ml Transfer-

Testpuffer [300 mM Sorbitol, 20 mM HEPES/KOH, pH 7,4, 10 mM KCl, 7 mM MgCl2, 10

mM NaHCO3], welcher mit den zu testenden Substanzen (RSA, Acyl-CoenzymA, Cytosol)

versetzt war, aufgenommen und eine Stunde auf Eis unter Belichtung (5000 µE x m-2 x s-1)

inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit wurden die Proben 1 min bei 11.000 x g

zentrifugiert, der Überstand abgenommen und mit 10 µl 10 N KOH für eine Stunde bei

Raumtemperatur alkalisch hydrolysiert.

Danach wurden die freien Fettsäuren sowie die freie OPDA extrahiert, über NH2-Kartuschen

vorgereinigt (2.7.5) und mittels GC/MS-Analyse untersucht. Zur internen Standardisierung


- 29 -

wurden 15,6 ng 17 [2H2], 18 [2H3]-cis-OPDA und 14,9 ng 17 [2H2], 18 [2H3]-α-Linolensäure

eingesetzt.

Um den Einfluss von Protein auf den OPDA-Transport zu testen, wurde in den Transfer-

Testpuffer mit RSA (fettsäure-frei, A-8806, Sigma, München) in Konzentrationen von 0 bis

250 µM eingesetzt, wobei bis 10 µM die Erhöhung der RSA-Konzentration in 2,5-µM-

Schritten erfolgte. Des weiteren wurden 25 µM, 50 µM, 100 µM und 250 µM RSA getestet.

Für die Versuche zum Einfluss von Acyl-CoA wurde in den Transfer-Testpuffer Acyl-CoA in

den Konzentrationen 0 mM, 0,01 mM, 0,02 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,5 mM, 1,0 mM und 2,0

mM eingesetzt. Da als zweiter Co-Faktor ATP benötigt wurde, enthielt der Testpuffer

zusätzlich 4 mM ATP.

Um den Einfluss von Cytosol, welches dem Überstand der ersten Zentrifugation bei der Prä-

paration intakter Chloroplasten entsprach, zu untersuchen, wurde dem Transfer-Testpuffer

cytosolische Proteine zugesetzt. Hierbei wurden zwei Versuchsansätze gewählt, bei denen

jeweils 0 µg, 50 µg, 100 µg, 250 µg, 500 µg, 750 µg, 1000 µg und 5000 µg Protein verwendet

wurden.

Zum einen wurde Gesamtcytosol, welches alle Co-Faktoren und Proteine enthielt, und zum

anderen mit Aceton gefälltes cytosolisches Protein in die Transportversuche eingesetzt.

2.10 Untersuchungen zur Substratspezifität von Lipasen

Neben den Versuchen zu den Freisetzungsbedingungen lipidgebundener OPDA sollte geklärt

werden, wie substratspezifisch diese Freisetzungsreaktion war. Hierzu wurden als erstes die

verwendeten Lipidsubstrate einer alkalischen Hydrolyse unterzogen, um die maximale

Fettsäure-Freisetzung zu bestimmen.

2.10.1 Alkalische Hydrolyse von Lipiden

Für die alkalische Hydrolyse wurden je 100 µg MGDG, MGDG-O, DGDG, Phosphatidyl-

glycerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Sulfochinovo-

syldiacylglycerol mit 1,0 ml 1 N KOH für eine Stunde bei 50°C inkubiert. Die Reinigung der

Proben und Analyse mittels GC/MS erfolgte, wie unter Punkt 2.7.5 und 2.13.4 angegeben.

2.10.2 Umsetzung der verwendeten Lipide durch endogene Lipasen aus Arabidopsis

thaliana

Um die Substratspezifität endogener Lipasen aus A. thaliana zu überprüfen, wurden intakte

Chloroplasten präpariert (2.6.3), lysiert und Proteinkomplexe aus Thylakoidmembranen prä-


- 30 -

pariert (2.6.6). Nach Auftrennung der Proteinkomplexe mittels „Blau-nativer“-Polyacryl-

amid-Gelelektrophorese (2.11.2) wurden die Gelbanden, welche dem Photosystem I bzw. II

entsprachen, isoliert und 1,0 g Gelmaterial mit 100 µg MGDG, MGDG-O, DGDG,

Phosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin oder

Sulfochinovosyldiacylglycerol in 0,25 ml 100 mM Tris/HCl, pH 7,5, und 0,25 ml Borat-

puffer, pH 7,5, für 30 und 60 min. inkubiert. Die Reinigung der Proben und Analyse mittels

GC/MS erfolgte, wie unter Punkt 2.13.4 angegeben.

2.11 Elektrophoretische Trennmethoden

2.11.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Trennung von Proteingemischen unter denaturierenden Bedingungen wurde mittels SDS-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in Apparaturen nach Studier (1973) mit

diskontinuierlichen Gelsystemen nach Laemmli (1970) mit 10 %igen Trenngelen durchge-

führt.

2.11.2 „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von nativen Polypeptiden erfolgte in Anlehnung an Schägger et al. (1991),

modifiziert nach Schleiff et al. (2001), in einem 5 – 13,5 %igen Acrylamidgradientengel mit

500 mM Bis-Tris/HCL, pH 7,0, 2 mM Aminocapronäure und 5 % Digitonin in einem

Puffersystem aus 50 mM Tricin, 15 mM Bis-Tris, pH 7,0 und 0,0075 % Coomassie

Brilliantblau G250 für Kathode und Anode bei einer konstanten Spannung von 120 Volt. Der

Gellauf erfolgte in einem Zeitintervall von 14 – 16 h bei 4°C.

Danach erfolgte ein Wechsel des Laufpuffers zu 50 mM Tricin und 15 mM Bis-Tris, pH 7,0.

Das Gel wurde dann für 5 h bei einer konstanten Spannung von 450 V entfärbt.

Um Polyacrylamidgele zu färben, wurden drei Methoden verwendet. Dazu gehörten die

Färbung mittels Coomassie-Brilliantblau G250 und Silber nach Blum et al. (1987), sowie eine

Gelfärbemethode nach Castellanos-Serra et al. (1999).

2.11.3 Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle

Die Elution geladener Polypeptide aus „blau-nativen“ sowie aus SDS-Polyacrylamidgelen

erfolgte unter Verwendung eines Membranfallensystems ( Electro-Eluter Modell 1000, Bio-

Rad) nach Herstellerangaben. Die quantitative Elektroelution von fixierten Proteinen wurde


- 31 -

durch in einem SDS-haltigen Elektroelutionspuffer [ 25 mM Tris/HCL, pH 8,8, 192 mM

Glycin, 0,1% SDS (w/v)] mit einer konstanten Spannung von 200 V in einem Zeitintervall

von 14 h bei 4°C erreicht. Bei der Elution nicht fixierter Proteine wurde ein nativer

Elutionspuffer [ 25 mM Tris/HCL, pH 8,8, 192 mM Glycin ] verwendet. Die Elutionszeit

betrug 14 h bei einer konstanten Spannung von 200 V. Vor der Entnahme der Proteinlösung

wurde die Apparatur für 10 s bei einer angelegten Spannung von 200 V umgepolt, um die

Polypeptide von der Membranoberfläche zu lösen.

2.12 Immunologische Methoden

2.12.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose

Der Transfer von mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteinen auf Nitrocellulose erfolgte nach

Tobwin et al. (1979). Der elektrophoretische Transfer auf Nitrocellulose (Schleicher &

Schuell, BA 85, Porenweite 0,45 µm) wurde in Blotpuffer [20 mM Tris/HCL, 150 mM

Glycin, 20 % Methanol (v/v), 0,1 % SDS (w/v)] über Nacht bei 55 mA oder alternativ bei 200

mA für zwei Stunden bei 4°C durchgeführt. Der Transfer auf die Nitrocellulose wurde mittels

reversibler Färbung der Proteine mit einer Ponceau-S-Färbung [1 % Ponceau S (w/v), 2 %

Essigsäure (v/v)] kontrolliert.

2.12.2 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine

Um spezifische Proteine nach Immobilisierung auf Nitrocellulose (2.12.1) immunologisch

detektieren zu können, wurden als erstes unspezifische Bindestellen durch eine einstündige

Inkubation in TBSP [50 mM Tris/HCL, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1mM MgCl2, 2 % Powerplay

(w/v)] abgesättigt. Die Bindung der spezifischen Antikörper erfolgte im gleichen Puffer für

zwei Stunden bei Raumtemperatur oder alternativ über Nacht bei 4°C. Die eingesetzten Anti-

körper-Konzentrationen sind nachfolgend aufgeführt:

Antikörper Spendertier Verdünnung

anti AOS, Serum Kaninchen 1:5000

anti Phosphattranslokator-Serum Kaninchen 1:5000

Unspezifisch gebundene Antikörper wurden durch Waschen mit TBST [50 mM Tris/HCL, pH

7,8, 150 mM NaCl, 1mM MgCl2, 0,5 % Triton X-100 (v/v)] von der Nitrocellulose entfernt.

Daraufhin folgte eine einstündige Inkubation mit einem, an alkalische Phosphatase konjugier-


- 32 -

tem, Kaninchen-α-Immunoglobin-Antikörper (1:10.000 verdünnt) in TBSP. Nach Entfernung

von unspezifisch gebundenen Antikörpern (2 x 10 min. mit TBST, 1 x 10 min. mit TBS [50

mM Tris/HCL, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1mM MgCl2] wurde die alkalische Phosphatase mit

330 µg/ml p-Nitroblautetrazoliumchlorid und 165 µg 5 Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in

AP-Puffer [100 mM Tris/HCL, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5mM MgCl2 ] nachgewiesen.

2.13 Chromatographische Trennmethoden

2.13.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) stellt eine hochauflösende Methode

dar, um komplexe Stoffgemische voneinander zu trennen. Diese Methode wurde hier zum

einen zur präparativen Reinigung von unterschiedlichen Lipidklassen (2.13.1.1) und zum

anderen zur Isolierung von freigesetzter OPDA (2.13.1.2) aus enzymatischen Umsetzungen

verwendet.

2.13.1.2 Präparative Reinigung von Lipidklassen mittels HPLC

Nach der Vorreinigung der unterschiedlichen Lipidklassen durch Flüssigkeitschromato-

graphie (2.13.2) mussten die Lipidklassen von Verunreinigungen befreit werden. Hierzu

wurde eine präparative Kieselgel-Säule (Nucleosil 100, 25 mm x 8 mm i.D., 15-25 µm,

Knauer, Berlin) bei einer Flussrate von 5 ml und Detektion bei 205 nm verwendet. Der

benutzte Gradient war wie folgt:

1 min. isokratisch mit Laufmittel A [iso-Propanol / n-Hexan ( 4:3, v/v )], 20 min linear von

Laufmittel A zu Laufmittel B [iso-Propanol / n-Hexan / H2O ( 8:6:1,5, v/v )], 20 min.

isokratisch mit Laufmittel B, 20 min. linear von Laufmittel B zu Laufmittel A, 1 min.

isokratisch mit Laufmittel A.

Es wurden 30 Fraktion zu 2 min. mittels Fraktionskollektor aufgefangen und mittels Dünn-

schichtchromatographie (2.13.3) und Rechromatographie hinsichtlich der Lipidklassen über-

prüft.

2.13.1.2 Isolierung von 12-oxo-Phytodiensäure mittels HPLC

Die über Aminopropyl-Kartuschen vorgereinigten Proben (2.7.5) wurden in 0,2 ml HPLC-

Laufmittel [n-Hexan / 2-Propanol / Essigsäure ( 100/ 1,62 / 0,11; v/v )] aufgenommen und bei

einer Flussrate von 1,5 ml/min. isokratisch auf einer Nucleosil-100 Säule ( 250 mm x 4 mm

i.D.; 3 µm ) aufzutrennen. Die Detektion fand bei 221 nm statt.


- 33 -

2.13.2 Flüssigkeitschromatographie

Diese Methode wurde für die präparative Vorreinigung der unterschiedlichen Lipidklassen

verwendet. Hierzu wurde Lipid präpariert (2.7.1), in 40 ml Chromatographie-Laufmittel

[Aceton / Toluol / H2O ( 91 / 30 / 7; v/v )] aufgenommen und über Kieselgel (Trennstrecke 40

cm) isokratisch bei einer Flussrate von 10 ml pro min. aufgetrennt. Die Trennung der

Lipidklassen wurden dünnschichtchromatographisch überprüft.

2.13.3 Dünnschichtchromatograpie

Die Dünnschichtchromatographie wurde dazu verwendet, die Trennung und die Reinheit der

präparierten Lipide zu überprüfen. Dafür wurden pro Fraktion 500 µl Aliquots entnommen,

bis zur Trockne eingedampft und in 50 µl Chromatographie-Laufmittel [Aceton/Toluol/H2O

(91/30/7; v/v)] aufgenommen. Die Auftrennung erfolgte auf Kieselgelplatten (Laufstrecke: 10

cm) mit Chromatographie-Laufmittel. Die aufgetrennten Lipide wurden mit Jod angefärbt.

2.14 Massenspektrometrie

2.14.1 Darstellung von 12-oxo-Phytodiensäure - und Fettsäuremethylestern

Die quantitative Darstellung GC-MS-Analyse von OPDA und Fettsäuremethylestern

erforderte die Derivatisierung der Säuren in ihre Methylester. Dieser Schritt war notwendig,

da sich die freie Säure gaschromatographisch nicht darstellen lässt. Die Methylierung erfolgte

mittels Diazomethan nach Weiler (1981).

2.14.2 Synthese von Diazomethan

Für die Synthese von Diazomethan wurden pro ml Diethlyether 0,3 ml 40 % KOH (w/v) im

Eisbad unter Rühren gemischt. N-Methyl-N-nitroseharnstoff (ca. 100 mg) wurde portions-

weise zugefügt, bis die Diethyletherphase intensiv gelb erschien. Nach Ende der Reaktion

wurde die organische Phase dekantiert und über KOH getrocknet.

2.14.3 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung von 12-oxo-Phyto-

diensäure und Fettsäuremethylestern

Zur Untersuchung der freigesetzten OPDA und Fettsäuren wurden gaschromatographisch-

massenspektrometrische-Analysen (GC-MS-Analyse) eingesetzt. Die zu untersuchenden

Proben wurden methyliert (2.14.1), unter Stickstoff getrocknet und in 30 µl Chloroform auf-

genommen. Für die Messungen wurde ein Varian GC 3400 Gaschromatograph in Verbindung


- 34 -

mit einem Massendetektor der Firma Finnigan MAT (Bremen, Modell Magnum) verwendet.

Die GC-MS-Analysen erfolgten mit maschineller Aufgabe der Proben bei einem

Injektionsvolumen von 1 µl unter den nachfolgend aufgeführten Chromatographie- und

Detektionsbedingungen:

Splitlos, Injektortemperatur 260°C; Helium als Trägergas ( Vordruck 80 kPa ); Trennsäule

ZB-50 (0,25 mm x 30 m, stat. Phase 0,25 µm); Temperaturprogramm: 1 min. 60°C, 30°C/

min. auf 280°C; Transferline-Temperatur 260°C; Scannbereich 50–400 u, 1 scan/s; chemische

Ionisierung mit Methanol.

Zur Quantifizierung freier OPDA und freier Fettsäuren wurden interne Standards in die zu

messenden Proben eingesetzt. Als interner Standard zur Quantifizierung freier OPDA diente

156 ng [2H5 ]cis-Oxophytodiensäure.

Für die interne Standardisierung zur Quantifizierung von gesättigten und einfach unge-

sättigten Fettsäuren wurde 270 ng Margarinsäure (17:0 Fettsäure), für zweifach und dreifach

ungesättigte Fettsäuren wurde 307 ng 20:3 Fettsäure verwendet.

Die Quantifizierung erfolgte über das Signalverhältnis der unmarkierten zu den markierten

Verbindungen.

2.14.4 Peptidsequenzierung mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie

Coomassie- oder alternativgefärbte Proteinbanden wurden nach SDS-PAGE gemäß Jensen et

al. (1998) mit Trypsin (sequencing grade modified, Promega) im Gel verdaut. Nach

Extraktion der Proteinfragmente aus dem Gelstück wurden die Proben mittels ZipTips C18

(Millipore) entsalzt. Die Durchführung der anschließenden massenspektrometischen Unter-

suchungen unter Verwendung eines „quadrupole/time-of-fligh“ Hybrid-Massenspektrometers

(QTOF2, Micromass) erfolgte durch Herrn Dr. Piotrowski (Lehrstuhl für Pflanzen-

physiologie). Die Peptide wurden mittels Nano-Elektrospray ionisiert. Die Messungen

wurden im Positiv-Modus durchgeführt und die Spektren im m/z-Bereich von 400 – 1600 mit

2,4 s Integrationszeit aufgezeichnet. Doppelt oder dreifach geladene Moleküle wurden für

eine Fragmentierung im MS/MS-Modus ausgewählt. Die Interpretation der MS/MS-Daten

wurde durch den MaxEnt3 Algorithmus und das BioLynx Programm aus den MassLynx 3.4

Software-Paket (Micromass) unterstützt.

Ergebnisse

- 35 -

3 Ergebnisse

12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) ist der erste zyklische Metabolit im Biosyntheseweg der

Jasmonsäure. Bei Jasmonsäure handelt es sich um ein Phytohormon, welches ein multiples

Wirkspektrum besitzt, wozu auch die Herbivor- und Pathogenabwehr gehört (McConn et al.,

1997; Thomma et al., 1999). Durch Untersuchungen an den Arabidopis-Mutanten dde1

(DELAYED DEHISCENCE 1) und opr3 (oxo-phytodienoic acid reductase 3), die im Jasmon-

säure-Biosyntheseweg einen Defekt bei der Umwandlung von OPDA zu 3-oxo-2-(Pent-2´-

enyl)-cyclo-pentyloctansäure aufweisen, haben gezeigt, dass OPDA einen eigenständigen

Signalstoff bildet, der andere regulatorische Eigenschaften besitzt als Jasmonsäure (Blechert

et al., 1997; Stinzi & Browse, 2000).

Neben freier OPDA wurde auch lipidgebundene OPDA in Arabidopsis thaliana entdeckt.

Dabei ist OPDA in der sn1-Position an das plastidäre Membranlipid Monogalactosyl-

diglycerid gebunden, das (sn1-O-(12-oxo-Phytodienoyl)-sn2-O-(hexadekatrienoyl)-mono-

galactosyldiglycerid (MDGD-O). Der Anteil der lipidgebundenen OPDA beträgt im Ver-

hältnis zur freien OPDA über 90 % (Stelmach et al., 2001). MGDG-O könnte somit als

endogener „OPDA-Vorrat“ dienen, aus dem eine schnelle Freisetzung von OPDA möglich ist,

welche entweder selbst physiologisch wirksam oder in den Jasmonsäure-Biosyntheseweg

eingebracht werden kann.

Im folgenden sind die Ergebnisse zur Lokalisation lipidgebundener OPDA innerhalb von

Chloroplasten und zur Charakterisierung der OPDA-freisetzenden Reaktion in Arabidopsis

thaliana dargestellt.

3.1 Gehalt von lipidgebundener OPDA in verschiedenen Pflanzenspezies

Da es sich bei MGDG-O aus Arabidopsis thaliana um einen neu entdecktes Lipid handelte,

sollte als erstes geklärt werden, ob lipidgebundene OPDA nur in Arabidopsis thaliana bzw.

den Brassicaeen vorhanden war, oder ob dieses Lipid bei allen Höheren Pflanzen vorkam.

Von allen getesteten Pflanzen besaß Arabidopsis thaliana mit 2,51 µg/mg Chlorophyll (=

100%) den höchsten MGDG-O Gehalt.

Der Vergleich aller getesteten Pflanzen ist in Abb. 3.1 gezeigt.

Ergebnisse

- 36 -

Abb. 3.1: Vergleich des Gehalts an lipidgebundener OPDA in verschiedenen Pflanzen- species

Pro Pflanzenart wurde 100 g Blattmaterial eingesetzt, eine Lipidpräparation nach Bligh & Dyer (1959) durchgeführt und das Rohlipid auf lipidgebundene OPDA untersucht (2.7.3). Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4.

Lipidgebundene OPDA konnte sowohl in einigen Farnarten, wie z.B. Polypodium vulgare, in

Dikotyledonen und in Monokotyledonen, wie Avena sativum, in unterschiedlichen Konzen-

trationen nachgewiesen werden. Eine Ausnahme bildete die Familie der Solanaceen. Bei

keinem getesteten Vertreter dieser Pflanzenfamilie konnte lipidgebundene OPDA innerhalb

der Nachweisgrenze gemessen werden.

Da die Brassicacee Arabidopsis thaliana, von den getesteten Pflanzen, den höchsten Gehalt

an lipidgebundener OPDA zeigte, wurde sie als Untersuchungsobjekt für die weiteren

Versuche gewählt.

Ergebnisse

- 37 -

3.2 Lokalisation von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure in Chloroplasten

Bei MGDG-O ist OPDA an die sn1-Position eines Monogalactosyldiglycerids (MGDG)

gebunden. Die Lipidklasse der Monogalactosyldiglyceride ist charakteristisch für Chloro-

plasten. Daher lag die Vermutung nahe, dass es sich bei MGDG-O ebenfalls um ein Lipid

innerhalb der chloroplastidären Membransysteme handelte.

Deshalb wurden für die Untersuchungen zur Lokalisation lipidgebundener OPDA als erstes

intakte Chloroplasten nach Rensink et al. (1998) präpariert und auf freie und lipidgebundene

OPDA untersucht.

3.2.1 Charakterisierung der Chloroplastenpräparation

Für die Präparation intakter Chloroplasten wurde ein Percoll-Stufengradient verwendet. Mit

diesem System konnten Zelltrümmer, cytosolische Bestandteile, zerstörte und intakte Chloro-

plasten voneinander getrennt werden.

Die Untersuchung des Gradienten hinsichtlich der Protein- und Chlorophyllverteilung zeigte,

dass es eine Korrelation zwischen Protein- und Chlorophyllgehalt und der Verteilung der

präparierten Chloroplasten gab.

So fanden sich die Maxima im Protein- und Chlorophyllgehalt in den Fraktionen 1 – 3,

welche den cytosolischen Zellbestandteilen und Zelltrümmern entsprach, in Fraktion 7,

welche den zerstörten Chloroplasten entsprach, und in Fraktion 12, welche den intakten

Chloroplasten entsprach.

Die zerstörten und intakten Chloroplasten wurden innerhalb des Gradienten durch Messung

der NADH- und NADPH-abhängigen Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAP-

DH; E.C. 1.2.1.12 und 1.2.1.13) nach Bergmeyer (1974) lokalisiert. Ebenso wurde für

Fraktion 7 und 12 der Intaktheitsgrad der Chloroplasten durch Messung der Sauerstoff-

entwicklung mittels O2-Elektrode nach Lilley et al. (1975) bestimmt.

Die Messungen des Intaktheitsgrades mit der Methode nach Lilley et al. (1975) ergab für

Fraktion 7 einen Wert von 16,78 % +/- 3,22 % und für Fraktion 12 einen Intaktheitsgrad von

74,29 % +/-9,54 % (Anzahl der durchgeführten Versuche, n = 4).

Ergebnisse

- 38 -

Abb. 3.2: Verteilung von freier und lipidgebundener OPDA im Percoll-Stufengradienten Die Präparation von intakten Chloroplasten erfolgte in Anlehnung an die Methode nach Rensink et al. (1998), wobei auf den Gradienten 10 mg Chlorophyll aufgegeben wurden. Der Gradient wurde in 1,0 ml Fraktionen abgenommen und jede Fraktion auf den Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA untersucht, wobei die ermittelte OPDA Konzentration auf die Proteinkonzentration der unter-suchten Fraktion bezogen wurde. A = intakte Chloroplasten, B = zerstörte Chloroplasten, C = cytosolische Bestand-teile und Zelltrümmer. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4.

Ergebnisse

- 39 -

Neben dem Gehalt an lipidgebundener OPDA wurde auch der Gehalt an freie OPDA

bestimmt, da MGDG-O möglicherweise als „Speicher“ für freie OPDA dient (Stelmach et al.,

2001) und OPDA durch die verwendete Präparationsmethode freigesetzt werden kann.

Die Untersuchung der Gradientenfraktionen auf OPDA zeigten, dass die Verteilung von lipid-

gebundener OPDA mit der Verteilung von zerstörten und intakten Chloroplasten korrelierten.

In Fraktion 7, welche den zerstörten Chloroplasten entsprach, betrug die Konzentration von

freier OPDA 348,7 +/-3,9 ng/mg Protein, die der lipidgebundenen OPDA 218,3 +/-8,7 ng/mg

Protein. Somit lag die Konzentration an freier OPDA in zerstörten Chloroplasten über der von

lipidgebundener OPDA.

In Fraktion 12, welche den intakten Chloroplasten entsprach, lag die Konzentration mit 354,7

+/-7,54 ng/mg Protein über der, der freien OPDA, welche 198,9 +/-3,78 ng/mg Protein betrug.

Anhand der Ergebnisse ließ sich die lipidgebundene OPDA sowohl den zerstörten als auch

den intakten Chloroplasten zuordnen. Die freie OPDA, die in den zerstörten und in den

intakten Chloroplasten nachweisbar war, war wahrscheinlich aus der lipidgebundenen OPDA

während der Präparation freigesetzt worden.

3.2.2 Charakterisierung von Stroma, Envelope und Thylakoiden

Die Korrelation zwischen lipidgebundener OPDA und zerstörten und intakten Chloroplasten

im Percoll-Gradient, zeigte, dass lipidgebundene OPDA innerhalb von Chloroplasten loka-

lisiert war.

Chloroplasten bestehen aus verschiedenen Membransystemen. Sie sind von einer doppelten

Hüllmembran, der äußeren und inneren Envelopemembran, umgeben. Das interne Membran-

system, die Thylakoide, ist hierbei nicht mit der inneren Envelopemembran verbunden. Die

Thylakoide liegen dabei entweder einzeln im Stroma (Stromathylakoide) vor, oder sind in be-

grenzten Bereichen übereinander geschichtet (Granathylakoide). Um die lipidgebundene

OPDA in den verschiedenen chloroplastidären Kompartimenten zu lokalisieren, mussten

diese Kompartimente voneinander getrennt werden.

Für die Präparation von Stroma, Envelope und Thylakoiden wurden die Methode nach Li et

al. (1991) verwendet. Hierbei wurden lysierte Chloroplasten auf einem Saccharose-

Stufengradienten aufgetrennt.

Für die weiteren Untersuchungen mußte überprüft werden, ob die durchgeführte Präparation

zu einer sauberen Trennung von Stroma, Envelope und Thylakoiden führte. Dazu wurde eine

Ergebnisse

- 40 -

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit anschließender Immunodetektion auf Envelope-

spezifische Proteine durchgeführt. Für die Immunodetektion wurde ein Antikörper gegen den

Phosphat-Translokator (30.3 kDa) aus chloroplastidärem Spinatenvelope verwendet (Flügge

& Wessel, 1984).

Abb. 3.3: Überprüfung der Auftrennung von Stroma, Envelope und Thylakoiden mittels SDS-Gelelektrophorese und Immunodetektion

A) Nach der Gewinnung von Stroma, Envelope und Thylakoiden (2.6.5) wurde die Proteinzusammensetzung mittels SDS-Gelelektrophorese überprüft, wobei 10 µg Protein aufgetragen wurden.

B) Für die Immunodetektion wurden Antikörper gegen den Phosphat-Translokator (30.3 kDa) verwendet, wobei das Protein aus chloroplastidärem Envelope von Spinat stammte.

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ergab für Stroma, Envelope und Thylakoide ein

unterschiedliches Proteinbandenmuster. Bei der Immunodetektion zeigte sich für den

Phosphat-Translokator, dass die Fraktionen von Stroma und Thylakoide zu 7 % bzw. zu 22 %

mit Envelope verunreinigt waren.

Ergebnisse

- 41 -

Die Trennung von Stroma, Envelope und Thylakoiden konnte mit der Methode nach Li et al.

(1991) erfolgreich durchgeführt werden. Der verwendete Saccharose-Stufengradient wurde

auf freie und lipidgebundene OPDA, sowie auf die Protein- und Chlorophyllverteilung in den

verschiedenen Fraktionen untersucht.

Es zeigte sich, dass Chlorophyll nur in Fraktion 31 und 32 mit einer Konzentration von 0,89

mg Chlorophyll/ml bzw. 0.91 mg Chlorophyll/ml gemessen werden konnte, welche den

Thylakoidmembranen entsprachen.

Protein konnte in allen Fraktionen nachgewiesen werden, wobei der Proteingehalt in den

Fraktionen 31 und 32 (Thylakoide) mit 1,44 mg/ml bzw. 1,56 mg/ml und in Fraktion 12 und

13, welche dem Envelope entsprachen, mit 0,776 mg/ml bzw. 0,7235 mg/ml zwei eindeutige

Maxima bildete.

Die Proteinverteilung korrelierte somit mit der Trennung lysierter Chloroplasten in Stroma,

Envelope und Thylakoiden (Abb. 3.4)

Die Messung von lipidgebundener und freier OPDA ergab, dass lipidgebundene OPDA nur in

den Fraktionen, welche den Thylakoiden entsprachen, nachgewiesen werden konnte. In

Fraktion 31 war 2,49 +/- 0,06 µg/mg Protein und in Fraktion 32 war 2,51 +/- 0,07 µg/mg

Protein enthalten. In diesen Fraktionen war mit 1,5 +/- 0,05 µg/mg Protein bzw. 1,63 +/- 0,06

µg/mg Protein auch freie OPDA vorhanden, deren Anteil aber geringer ausfiel, als der Anteil

der lipidgebundenen OPDA, und wahrscheinlich aus der lipidgebundenen OPDA freigesetzt

worden war.

Des weiteren war freie OPDA auch in den Fraktionen 1 bis 5, welche dem Stroma

entsprachen, enthalten. Die OPDA in diesen Fraktionen war wahrscheinlich während der Lyse

der intakten Chloroplasten aus MGDG-O freigesetzt worden.

In den restlichen Fraktionen war weder freie noch lipidgebundene OPDA nachzuweisen. Freie

OPDA konnte also weder in den Gradienten diffundieren, noch war sie, genauso wenig wie

lipidgebundene OPDA im Envelope enthalten.

Somit ließ sich MGDG-O in den Thylakoiden lokalisieren.

Ergebnisse

- 42 -

Abb. 3.4: (vorherige Seite) Verteilung von freier und lipidgebundener OPDA im Saccharose-Stufengradienten

Die Präparation von intakten Chloroplasten erfolgte in Anlehnung an die Methode nach Li et al. (1991), wobei auf den Gradienten 2 mg Chlorophyll aufgegeben wurden. Der Gradient wurde in 1,0 ml Fraktionen abgenommen und jede Fraktion auf den Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA untersucht, wobei die ermittelte OPDA Konzentration auf die Proteinkonzentration der untersuchten Fraktion bezogen wurde. A = Thylakoide, B = Envelope, C = Stroma Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4.

Ergebnisse

- 43 -

3.2.2 Lokalisation von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure an der Thylakoid-membran

Wie die Untersuchung des Saccharose-Gradienten gezeigt hatte, ist lipidgebundene OPDA

in/an der Thylakoidmembran lokalisiert. Die genaue Lokalisation von MGDG-O sollte mit

Hilfe der Methode von Schleiff & Klösgen (2001) erfolgen. Bei dieser Methode wurden die

Thylakoidmembran mit 5 % Digitonin solubilisiert und so die Proteinkomplexe aus der

Membran „gelöst“.

Untersuchungen haben gezeigt, dass Galactolipide, zu denen MGDG gehört, Struktur-

elemente in den Photosynthesekomplexen bilden (Dörmann & Benning; 2002). Es wäre also

denkbar, dass MGDG-O ebenfalls mit einem oder mehreren Proteinkomplexen assoziiert ist.

Für diese Untersuchungen wurden die solubilisierten Proteinkomplexe mittels BN-PAGE

aufgetrennt und anschließend auf lipidgebundene OPDA untersucht.

Um die aufgetrennten Proteinkomplexe zu identifizieren, wurde eine Proteinsequenz-Analyse

durchgeführt (Ergebnis siehe Abb. 3.5).

Ergebnisse

- 44 -

Abb. 3.5: (vorherige Seite) Ergebnis der ESI-QTOF-Messung

Die BN-PAGE erfolgte ü.N. bei 120 V, wobei das Gel mit 3,0 mg Chlorophyll beladen wurde. Die Proteinbanden und die „Zwischenbanden“ wurden ausgeschnitten und eine Proteinsequenz-Analyse durchgeführt (2.14.4).

Nach der Identifizierung der aufgetrennten Proteinkomplexe der Thylakoidmembran wurde

die Verteilung von lipidgebundener OPDA innerhalb des „blau-nativen“ Polyacrylamidgels

untersucht.

Dazu wurde als erstes der Proteingehalt in den unterschiedlichen Gelbanden nach elektro-

phoretische Elution der geladenen Macromoleküle der Proteingehalt nach Bradford (1976;

Tab.3.1) bestimmt.

eeeeeeeGelbande Proteinkomplex kDa Protein [mg(ml)-1]

1 PS1/PS2 SK 1040 1,97

2 PS1 670 1,85

3 ATP-Synthase 600 1,61

4 RubisCO 520 2,87

5 PS2 440 1,41

6 (Gel) ---- 1,89

7 Cyt b6/f 390 1,44

8 (Gel) ---- 1,24

9 LHC II 232 2,98

10 (Gel) ---- 1,22

Tab. 3.1: Proteinkonzentration in den Banden des „blau-nativen“ Polyacrylamidgels Die Proteinbanden und die „Zwischenbanden“ wurden ausgeschnitten und die Proteine elektroeluiert (2.11.3). Der Proteingehalt wurde nach Bradford (1976) bestimmt. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 3.

Die höchste Proteinkonzentration wiesen mit 2,98 mg/ml die Lichtsammelkomplexe auf. Es

folgte mit 2,87 mg/ml der Proteinkomplex der RubisCO und mit 1,97 mg/ml der PS I / PS II-

Superkomplex. In den restlichen Banden lag die Proteinkonzentration zwischen 1,89 und 1,22

Ergebnisse

- 45 -

mg/ml. Die in den „Zwischenbanden“ gemessenen Proteinkonzentrationen waren wahrschein-

lich auf lösliche Proteine zurückzuführen.

Abb. 3.6: Verteilung von lipidgebundener OPDA an den über BN-PAGE aufgetrennten Proteinkomplexen der Thylakoidmembran

Die Auftrennung der Proteinkomplexe erfolgte durch BN-PAGE (2.11.2), wobei das Gel mit 3,0 mg Chlorophyll beladen wurde. Die Proteinbanden und die „Zwischenbanden“ wurden ausgeschnitten, eine Lipidextraktion mit Methanol durchgeführt und die extrahierten Lipide auf lipidgebundene OPDA untersucht (2.8.2), wobei die ermittelte OPDA-Konzentration auf die Proteinkonzentration der untersuchten Fraktion bezogen wurde. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4.

Die Messungen ergaben, dass lipidgebundene OPDA über die gesamte Auftrennungsstrecke

verteilt war. Eine eindeutige Zuordnung von lipidgebundener OPDA zu einem der getrennten

Proteinkomplexe der Thylakoidmembran ließ sich nicht feststellen.

Ergebnisse

- 46 -

Allerdings zeigten sich am PS I/PS II Superkomplex mit 378,3 +/- 2,7 ng OPDA/ mg Protein,

am Photosystem I mit 363,89 +/- 2,11 ng OPDA/ mg Protein sowie am Photosystem II mit

480,92 +/- 3,38 ng OPDA/ mg Protein die höchsten Werte an lipidgebundener OPDA. Das

könnte darauf hinweisen, dass lipidgebundene OPDA in intakten Chloroplasten möglicher-

weise an den Photosystemen lokalisiert war und während der Präparation abgetrennt wurde.

Allerdings wurde am Photosystem II mit 1,41 mg Protein/ml eine geringe Protein-

konzentration gemessen. Dadurch kann beim Bezug der Konzentration von lipidgebundener

OPDA auf den Proteingehalt ggf. eine höhere OPDA-Konzentration vorgetäuscht werden.

3.3 Charakterisierung der Freisetzung von lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure

MGDG-O konnte in Chloroplasten in/an der Thylakoidmembran, mit einer möglichen

Affinität zu den Photosystemen, lokalisiert werden. Die Bedingung(en), unter denen es zu

einer Hydrolyse der gebundenen OPDA kommt, und die mögliche Funktion(en) von MDGD-

O in/an der Thylakoidmembran sollen in diesem Teil der Arbeit untersucht werden.

3.3.1 Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure aus intakten Chloroplasten

3.3.1.1 Einfluss von Licht auf die Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure

Chloroplasten sind die Organellen der Photosynthese. In der Lichtreaktion der Photosynthese,

welche bei grünen Pflanzen und Cyanobakterien an den Thylakoidmembranen abläuft,

werden nach Absorption von Lichtquanten Elektronen aus dem Photosynthesepigment

Chlorophyll freigesetzt und über Elektronentransportketten auf Ferredoxin übertragen.

Reduziertes Ferredoxin dient zur Reduktion oxidierter Pyridinnucleotide, bei grünen Pflanzen

NADP+. Dabei ist dieser photosynthetische Elektronentransport mit einem vektoriellen

Wasserstoffionentransport über die Thylakoidmembran gekoppelt, welcher zur ATP-Bildung

benutzt wird. Das gebildete ATP und NADPH + H+ wird in der Dunkelreaktion der Photo-

synthese zur Assimilation von Kohlenstoff verwendet.

Zu starke Belichtung kann zu oxidativem Stress führen, gegen den Pflanzen verschiedene

Schutzmechanismen entwickelt haben. So konnte Hundal et al. (1995) an Thylakoid-

membranen von Spinat zeigen, dass die reduzierte Form des Plastochinons oxidative

Substanzen unschädlich machen kann. Das Phytohormon Jasmonäure, das aus OPDA gebildet

Ergebnisse

- 47 -

wird, besitzt ebenfalls die Fähigkeit, vor Photooxidation zu schützen (Overmeyer et al., 2000;

Rao et al., 2000).

Da lipidgebundene OPDA in intakten Chloroplasten, genauer an der Thylakoidmembran und

dort möglicherweise an den Photosystemen lokalisiert ist, wurden intakte Chloroplasten unter

unterschiedlichen Lichtbedingungen inkubiert, um eine eventuell lichtbedingte Freisetzung

von OPDA aus zu untersuchen.

Abb. 3.7: Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA bei Dunkelheit und unter Starklicht

Intakte Chloroplasten wurden 90 min. bei Dunkelheit und unter Starklicht (5000 µE x m-2 x s-1) inkubiert und alle 30 min. der Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA bestimmt (2.8.3). Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4.

Ergebnisse

- 48 -

Bei Dunkelheit nahm die Konzentration der freien OPDA innerhalb der 90 minütigen

Inkubationszeit von 221 +/- 9,69 ng/mg Chlorophyll auf 632,5 +/- 41,74 ng/mg Chlorophyll

zu. Diese Zunahme der freien OPDA war auf eine Abnahme des Gehalts an lipidgebundener

OPDA zurückzuführen, also auf einer Freisetzung der an der sn1-Position gebundenen

OPDA. Die lipidgebundene OPDA nahm in Dunkelheit im selben Zeitraum von 1051 +/-

33,23 ng/mg Chlorophyll auf 409,5 +/- 10,10 ng/mg Chlorophyll ab.

Unter Starklicht kam es zu einer Steigerung dieser Effekte. Die freie OPDA nahm von 275 +/-

6,87 ng/mg Chlorophyll auf 1589,0 +/- 9,41 ng/mg Chlorophyll zu, während die lipidge-

bundene OPDA von 1403 +/- 56,60 ng/mg Chlorophyll auf 164,5 +/- 14,85 ng/mg Chloro-

phyll abnahm.

Um zu kontrollieren, ob die Änderungen im OPDA-Gehalt nicht auf die Lyse intakter

Chloroplasten während der Inkubation zurüchzuführen waren, wurde die Intaktheit zum

jeweiligen Zeitpunkt der Probenentnahme überprüft. Die Messungen an der O2-Elektrode

nach Lilley et al. (1975) zeigten, dass die Intaktheit innerhalb der Inkubationszeit von 75,8 %

auf % 69,4 abnahm.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Zunahme an freien OPDA mit der Abnahme an lipidge-

bundenen OPDA korrelierte, wobei die Freisetzung von OPDA aus lipidgebundener OPDA

durch zunehmende Lichtintensität gesteigert werden konnte.

3.3.1.2 Einfluss des pH-Wertes auf die Freisetzung lipidgebundene 12-oxo-

Phytodiensäure

Da die Freisetzung von OPDA aus lipidgebundener OPDA durch zunehmende Lichtintensität

gesteigert werden konnte, wurden weitere Faktoren untersucht, die mit der Photosynthese in

Verbindung stehen.

Als erstes wurde die Abhängigkeit der OPDA-Hydrolyse vom pH-Wert untersucht. Der

photosynthetische Elektronentransport ist mit der Ausbildung eines Protonengradienten

gekoppelt. Dabei werden Protonen vom Stroma ins Thylakoidlumen transportiert. Der so

entstehende Protonengradient wird für die Bildung von ATP verwendet.

Bei diesen Versuchen wurden intakte Chloroplasten in Homogenisationspuffer mit unter-

schiedlichen pH-Werten inkubiert und die Änderung von freier und lipidgebundener OPDA

untersucht.

Ergebnisse

- 49 -

Abb. 3.8: (vorherige Seite) Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA bei unterschiedlichen pH-Werten

Intakte Chloroplasten wurden 90 min. bei den oben angegebenen pH-Werten inkubiert und alle 30 min. der Gehalt an freier (A) und lipidgebundener OPDA (B) bestimmt (2.8.3). Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4.

Bei einem pH-Wert von 8,5, der dem pH des Homogenisationspuffer entsprach und somit als

Kontrolle diente, nahm die freie OPDA von 132,0 +/- 5,7 ng/mg Chlorophyll auf 548,5 +/-

10,6 ng/mg Chlorophyll zu, wobei gleichzeitig die lipidgebundene OPDA von 1909,0 +/- 19,2

ng/mg Chlorophyll auf 839,0 +/- 4,2 ng/mg Chlorophyll abnahm. Die Zu- bzw. Abnahme

erfolgte kontinuierlich über die Zeit.

Bei einem pH-Wert von 5,5 nahm die freie OPDA von 329,0 +/-5,5 ng/mg Chlorophyll auf

1804,5 +/- 12,0 ng/mg Chlorophyll zu, wobei nach 60 Minuten ein sprunghafter Anstieg der

OPDA-Konzentration zu verzeichnen war.

Die lipidgebundene OPDA nahm im selben Zeitraum kontinuierlich von 2140,0 +/-14,1

ng/mg Chlorophyll auf 214,0 +/- 8,5 ng/mg Chlorophyll ab.

Die sprunghafte Zunahme der freien OPDA konnte nicht auf zerstörten Chloroplasten

zurückgeführt werden.

Ergebnisse

- 50 -

Die Messung mit der Sauerstoff-Elektrode zeigten, dass bei der Kontrolle die Intaktheit der

Chloroplasten bei einem pH-Wert von 8,5 nach 90 Minuten von 81,9% +/- 1,2% auf 72,3%

+/- 2,1% gefallen war. Bei einem pH-Wert von 5,5 noch 71,1% +/-1,4% der Chloroplasten

intakt.

3.3.1.3 Einfluss von Calcium auf die Freisetzung lipidgebundener OPDA

Ein weiterer Faktor, der sich unter Licht ändert, ist die interne Calciumkonzentration (Miller

& Sanders, 1987; Felle, 2001). Deshalb sollte untersucht werden, ob eine Änderung der

Calciumkonzentration im umgebenden Medium Auswirkungen auf die Freisetzung von

OPDA aus lipidgebundener OPDA hat.

Dazu wurden intakte Chloroplasten in verschiedenen Calciumkonzentrationen inkubiert,

welche mit Hilfe des Programms MaxChelator im Homogenisationspuffer eingestellt worden

waren. Es zeigte sich, dass keine der getesteten Calciumkonzentrationen Auswirkung auf die

Änderungen im Gehalt von freier und lipidgebundener OPDA hatte.

Die Zunahme an freier OPDA z.B. bei 10 µM Calcium von 436,7 +/- 27, 2 ng/mg Chloro-

phyll auf 2121,2 +/- 50,9 ng/mg Chlorophyll bzw. die Abnahme an lipidgebundener OPDA

von 2374,0 +/- 124, 8 ng/mg Chlorophyll auf 780,3 +/- 57,2 ng/mg Chlorophyll während der

Inkubation lassen sich wahrscheinlich auf den Einfluss des pH-Werts (3.3.2.2) und der

Inkubation unter Licht (3.3.2.1) zurückführen.

Abb. 3.9: (nächste Seite) Gehalt an freier und lipidgebundener OPDA bei verschiedenen Calciumkonzentrationen

Intakte Chloroplasten wurden 90 min. in den oben angegebenen Calcium-Konzentrationen inkubiert und alle 30 min. der Gehalt an freier (A) und lipidgebundener OPDA (B) bestimmt (2.8.3). Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4

Ergebnisse

- 51 -

Ergebnisse

- 52 -

3.4 Freisetzung lipidgebundener 12-oxo-Phytodiensäure an der Thylakoidmembran

Die Lokalisationsversuche haben ergeben, dass lipidgebundene OPDA in/an der Thylakoid-

membran, und dort wahrscheinlich mit den Photosystemen, lokalisiert ist. Nachdem die Ver-

suche zur OPDA-Freisetzung aus lipidgebundener OPDA bei intakten Chloroplasen ergeben

hatte, dass diese Reaktion durch Licht und Änderungen des pH-Werts stimuliert wird, wurde

in den nächsten Versuchen die Freisetzung lipidgebundener OPDA in/an Thylakoiden

untersucht.

3.4.1 Komplementationsversuche von Thylakoiden mit Envelope und Stroma

Viele Enzyme benötigen für die Reaktion(en), die von ihnen katalysiert werden Co-Faktoren.

Ein Beispiel hierfür ist die Acyl-CoenzymA-Synthetase (ACS), die die Reaktion von Acyl-

CoenzymA aus freien Fettsäuren, ATP und CoenzymA katalysiert (Kornberg & Peter, 1953)

und deren Aktivität an der äußeren Envelopemembran nachgewiesen werden konnte

(Andrews & Kneestra, 1983; Block et al., 1983).

Da lipidgebundene OPDA in/an den Thylakoiden lokalisiert ist, wurde in diesen Versuchen

überprüft, ob das Freisetzungsenzym (putative Lipase) für lipidgebundene OPDA ebenfalls

in/an der Thylakoidmembran oder im Envelope bzw. Stroma lokalisiert ist. Weiterhin sollte

untersucht werden, ob eventuell ein oder mehrere Co-Faktor(en) aus Envelope und/oder

Stroma für die Freisetzungsreaktion notwendig sind.

Die Untersuchung von freier und lipidgebundener OPDA in Thylakoiden wurde über 90 min.

durchgeführt, wobei alle 30 min. der OPDA-Gehalt gemessen wurde (Abb. 3.10). Innerhalb

der 90 min. nahm die lipidgebundene OPDA von 2124,3 +/- 416,0 ng/mg Protein auf 744,5

+/- 619,7 ng/mg Protein ab. Bei der freien OPDA gab es innerhalb von 90 min. eine Zunahme

von 517,3 +/- 196,9 ng/mg Protein auf 1888,8 +/- 427,5 ng/mg Protein.

Nach der Zugabe von Stroma, Envelope bzw. Stroma und Envelope zeigte sich keine

signifikante Änderung in der Zunahme von freier bzw. der Abnahme von lipidgebundener

OPDA. Es kann also davon ausgegangen werden, dass die putative Lipase an bzw. in der

Thylakoidmembran lokalisiert war und für die Freisetzung kein Co-Faktor aus Stroma

und/oder Envelope notwenig war.

Ergebnisse

- 53 -

Abb. 3.10: Vergleich von freier und lipidgebundener OPDA bei Komplementation von Thylakoiden mit Stroma und Envelope

Thylakoide (1,0 mg Protein) wurden mit Stroma (1,0 mg Protein), Envelope (1,0 mg Protein) bzw. mit Stroma und Envelope (je 1,0 mg Protein) für 90 min. inkubiert, wobei alle 30 min. der Gehalt an freier (A) und lipidgebundener (B) OPDA bestimmt wurde. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4

3.4.2 Charakterisierung der Freisetzung von 12-oxo-Phytodiensäure im „blau-

nativen“ Polyacrylamidgel

Da sowohl die lipidgebundene OPDA als auch die Freisetzungsreaktion in Thylakoiden

lokalisiert war, sollte mit Hilfe der BN-PAGE geklärt werden, ob die Hydrolyse von

lipidgebundener OPDA enzymatischen Ursprungs war und innerhalb bzw. an der

Thylakoidmembran lokalisiert werden konnte.

Dazu wurde das „blau-native“ Polyacrylamidgel entsprechend dem Auftrennungsmuster der

Proteinkomplexe geschnitten und die einzelnen Banden mit 250 µg MGDG-O als Substrat

inkubiert und anschließend die freigesetzte OPDA gemessen.

Am PS I/PS II-Superkomplex wurden 91,31 +/- 4,54 µg OPDA/mg Protein aus dem als

Substrat gegebenen MGDG-O freigesetzt. Am Photosystem I wurden 79,56 +/- 0,53 µg

OPDA/mg Protein freigesetzt.

Ergebnisse

- 54 -

Am ATPase-Proteinkomplex nahm die Menge der aus dem Substrat abgegebenen OPDA auf

9,10 µ +/- 0,03 µg OPDA/mg Protein ab. Zu einer weiteren Abnahme der freigesetzten OPDA

kam es am Proteinkomplex der Ribulose-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase, bei der 0,70

µg OPDA/ mg Protein +/- 0,06 µg OPDA/mg Protein freigesetzt wurden.

Abb. 3.11: Hydrolyse von lipidgebundener OPDA an den Proteinkomplexen der Thylakoidmembran nach Gabe von 250 µg MGDG-O als Substrat

Die verschiedenen Gelbanden wurde entweder intakt oder nach Hitze-inaktivierung in je 250 µg MGDG-O als Substrat für min. bei 37°C inkubiert und anschließend die freigesetzte OPDA gemessen. Als Kontrolle dienten Gelstreifen ohne Substrat. Bei diesen Kontrollen konnte nach Inkubationsende zwischen 1,27 µg und 1,40 µg OPDA nachgewiesen werden. Dargestellt sind die um die Kontrollwerte bereinigte Ergebnisse, wobei die ermittelte OPDA-Konzentration auf den Proteingehalt der jeweiligen Gelbande bezogen wurde. Der Proteingehalt wurde nach Elektroelution der Proteine nach Bradford (1976) bestimmt (siehe Tab. 3.1) Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4

Ergebnisse

- 55 -

Am Photosystem II wurden 56,85 +/- 1,12 µg OPDA/mg Protein freigesetzt. Am Cytochrom

b6/f-Komplex wurden 4,15 +/- 0,01 µg OPDA/mg Protein freigesetzt. 1,12 +/- 0,09 µg

OPDA/mg Protein wurden an den Lichtsammel-Komplexen aus dem extern zugesetzten

MGDG-O freigesetzt.

Die größte Freisetzung und damit die höchste Aktivität war am PS I/ PS II-Superkomplex und

an den beiden Photosystemen zu verzeichnen, wenn davon ausgegangen wird, dass alle

Proteine noch aktiv waren.

Um zu klären, ob es sich bei der Freisetzung um einen rein chemische Prozess handelte oder

eine enzymatische Reaktion vorlag, wurden die Proteine im „blau-nativen“ Polyacryamidgel

durch Hitze denaturiert, indem die Gelstreifen von Photosystem I und Photosystem II für 10

Minuten bei 100 °C inkubiert und anschließend in MGDG-O als Substrat aufgenommen

wurden.

An den abgekochten Gelsteifen wurden, im Vergleich zu den unbehandelten Proteinen nur

sehr geringe Mengen an OPDA aus dem Substrat freigesetzt. So betrug die freigesetzte OPDA

am Photosystem I 0,92 +/- 0,03 µg OPDA/mg Protein.

Am Photosystems II wurden nach der Hitzeinaktivierung der Proteine 1,12 +/- 0,05 µg

OPDA/mg Protein aus dem extern hinzugegebenen MGDG-O freigesetzt. Da die Frei-

setzungsreaktion nach der Hitzeinaktivierung der einzelnen Proteinkomplexe im Vergleich zu

den unbehandelten Proben stark abnahm, ist anzunehmen, dass es sich bei der Frei-

setzungsreaktion um eine enzymatische Reaktion handelte.

Als Kontrolle wurde pro Proteinkomplex 1,0 g Gelmaterial sowohl unbehandelt als auch nach

Hitzeinaktivierung auf OPDA untersucht. Diese Kontrollen zeigten OPDA-Konzentrationen

zwischen 1,40 µg +/- 0,06 µg OPDA/mg Protein und 1,27 +/- 0,09 µg OPDA/mg Protein. Die

in diesen Proben gemessene OPDA wurde wahrscheinlich aus der im Gel enthaltenen

lipidgebundenen OPDA freigesetzt.

3.5 Charakterisierung des Transports von 12-oxo-Phytodiensäure aus intakten

Chloroplasten

Die bisherigen Versuche haben gezeigt, dass lipidgebundene OPDA in Chloroplasten

lokalisiert ist und enzymatisch an den Photosystemen freigesetzt wird. Über 90 % der

gesamten OPDA liegt lipidgebunden (Stelmach et al., 2001) vor. Nach der Hydrolyse der

OPDA aus MGDG-O muss die nun frei vorliegende OPDA die Chloroplasten verlassen, um

entweder in den Peroxisomen in Jasmonsäure umgewandelt zu werden (Schaller et al., 2001),

Ergebnisse

- 56 -

oder selbst physiologisch aktiv zu werden (Weiler et al., 1994; Gundlach & Zenk, 1998;

Stinzi et al., 2001). Dieser Transportmechanismus ist noch nicht aufgeklärt und sollte im

Rahmen dieser Arbeit untersucht werden.

3.5.1 Wirkung von Rinderserumalbumin auf den Transport freier 12-oxo-Phytodien-

säure

Für den Transport von OPDA aus intakten Chloroplasten sind mehrere Möglichkeiten

denkbar. Zum einen könnte OPDA die Chloroplasten durch einen reinen Diffusionsprozess

verlassen oder die Diffusion könnte durch einen Proteinfaktor im Cytoplasma, wie z.B. ein

OPDA-bindendes Protein, stimuliert werden. Zum anderen könnte ein aktiver OPDA-

Transport, analog zum Fettsäuretransport (Dormann et al., Joyard & Stumpf, 1990; Judy et

al., 2002; Schnurr et al., 2002), über die Envelopemembran erfolgen. In diesem Versuch

sollte der Einfluss von Protein, welches eine Affinität für Fettsäuren besitzt, auf den

Auswärtstransport bzw. die Diffusion von OPDA untersucht werden. Dazu wurde

fettsäurefreies RSA (Sigma, München) in verschiedenen Konzentrationen verwendet,

welches eine hohe Affinität für freie Fettsäuren und damit auch für freie OPDA besitzt.

Ergebnisse

- 57 -

Abb. 3.12: (vorherige Seite) Ergebnis der Transportversuche mit fettsäurefreien RSA Intakte Chloroplasten (≅ 0,7 – 1,2 mg Chlorophyll) wurden in verschiedenen RSA-Konzentrationen inkubiert, die Chloroplasten durch eine 1 min. Zentrifuga-tion bei 11.000 x g sedimentiert und der Überstand alkalisch hydrolysiert. Anschließend wurde der OPDA-Gehalt im Überstand bestimmt. Als Kontrolle diente der Ansatz ohne RSA. Dargestellt sind die um die Kontrollwerte bereinigte Ergebnisse. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4

Neben dem Gehalt von freier OPDA wurde der Intaktheitsgrad der verwendeten Chloro-

plasten überprüft, um zu kontrollieren, ob die im Außenmedium bestimmte ODPA aus

Chloroplasten diffundiert bzw. transportiert wurde oder durch Lyse intakter Chloroplasten

freigesetzt wurde.

Es zeigte sich, dass es zwischen der Stärke des Auswärtstransports bzw. der Diffusion von

freier OPDA und der RSA-Konzentration eine Abhängigkeit gab. So fand in der Probe ohne

RSA im Außenmedium, welche gleichzeitig als Kontrolle diente, kein Auswärtstransport

bzw. Diffusion von OPDA statt. Im Bereich von 0 µM RSA bis 50 µM RSA kam es zu einem

linearen Anstieg der OPDA-Konzentration von 0 ng/mg Chlorophyll auf 90,4 +/- 29,2 ng/mg

Chlorophyll. Bei höheren RSA-Konzentrationen kam es zu keiner weiteren Zunahme des

OPDA-Gehalts im Außenmedium.

3.5.2 Wirkung von Acyl-CoenzymA auf den Transport freier 12-oxo-Phytodiensäure

Eine andere Möglichkeit für den Transport von OPDA aus intakten Chloroplasten bildet

vielleicht ein Transportsystem, das analog zum Fettsäuretransport verläuft. Der Transport von

in Chloroplasten synthetisierten Fettsäuren verläuft über eine Acyl-ACP-Thioesterase, welche

kurz vor der Passage der Fettsäuren über die Envelopemembranen das Acyl-Trägerprotein

(„acyl carrier protein; ACP) abspaltet (Dormann et al., 1995; Jones et al.,1995), und eine, an

der äußeren Hüllmembran lokalisierte, Acyl-CoA-Synthetase, welche die freien Fettsäuren an

der äußeren Hüllmembran übernimmt und unter ATP-Verbrauch in Acyl-CoA umwandelt

(Kornberg & Pricer, 1953; Andrews & Kneestra, 1983; Block et al., 1983; Joyard & Stumpf,

1990; Judy et al., 2002; Schnurr et al., 2002).

Da für die Reaktion ATP und CoenzymA als Co-Faktoren benötigt werden, wurde für die

Versuche eine konstante ATP–Konzentration von 4 mM verwendet. Variiert wurde hingegen

die Acyl-CoenzymA-Konzentration im Außenmedium und anschließend der Gehalt an freier

OPDA bestimmt.

Ergebnisse

- 58 -

Abb. 3.13: Ergebnis der Transportversuche bei verschiedenen CoenzymA- Konzentrationen

Intakte Chloroplasten (≅ 0,7 – 1,2 mg Chlorophyll) wurden in verschiedenen CoASH-Konzentrationen und 4 mM ATP inkubiert, die Chloroplasten nach Inku-bationsende durch eine 1 min. Zentrifugation bei 11.000 x g sedimentiert und der Überstand alkalisch hydrolysiert. Anschließend wurde der OPDA-Gehalt im Überstand bestimmt. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne CoenzymA und ein Ansatz ohne CoenzymA und ohne ATP. Dargestellt sind die um die Kontrollwerte bereinigte Ergebnisse. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4

Auch bei diesem Versuch zeigte sich eine Abhängigkeit zwischen der eingesetzten Acyl-

CoenzymA-Konzentration und der im Außenmedium gemessenen OPDA. So nahm die

OPDA-Konzentration linear von 0 ng/mg Chlorophyll auf 20,87 +/- 11,46 ng/mg Chloro-

phyll im Bereich von 0 mM bis 0,05 mM CoenzymA zu. Bei höheren CoenzymA-Kon-

Ergebnisse

- 59 -

zentrationen kam es erst zu einem sprunghaften Anstieg von OPDA im Außenmedium auf

102,64 +/- 41,89 ng/mg Chlorophyll und dann zu einer Abnahme auf 64,61 +/- 27,03 ng/mg

Chlorophyll.

3.5.3 Wirkung von Cytosol auf den Transport freier 12-oxo-Phytodiensäure

Nachdem die Versuche mit RSA eine lineare OPDA-Freisetzung aus Chloroplasten ins

Außenmedium gezeigt hatten, sollten Arabidopsis-eigene, cytosolische Proteine auf ihre

Wirkung auf den OPDA-Transport getestet werden. Um u.a. freie OPDA aus der

Proteinfraktion zu entfernen, wurde eine Acetonfällung durchgeführt und die gefällten

Proteine in die Versuche eingesetzt.

Ergebnisse

- 60 -

Abb. 3.14: (vorherige Seite) Ergebnis der Transportversuche mit gefälltem Cytosol Intakte Chloroplasten (≅ 0,7 – 1,2 mg Chlorophyll) wurden in verschiedenen Protein-Konzentrationen inkubiert, die Chloroplasten durch eine 1 min. Zentrifugation bei 11.000 x g sedimentiert und der Überstand alkalisch hydrolysiert. Anschließend wurde der OPDA-Gehalt im Überstand bestimmt. Als Kontrolle diente der Ansatz ohne Protein. Dargestellt sind die um die Kontroll-werte bereinigte Ergebnisse. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4

Bei diesem Versuch zeigte sich, dass ein oder mehrere Proteinfaktor(en) aus dem Cytosol

ebenfalls den Transport von OPDA aus Chloroplasten beeinflussten.

Im gesamten Bereich von 0 µg bis 5000 µg Protein kam es zu einer Zunahme von OPDA im

Außenmedium, wobei diese Zunahme nicht kontinuierlich erfolgte.

Ein möglicher Faktor, der für den Transport bzw. die Diffusion von OPDA verantwortlich

sein bzw. beeinflussen könnte, könnte ein Proteinfaktor, wie z.B das bisher nicht näher

charakterisierte OPDA-Bindeprotein, sein.

Die Transportversuche haben gezeigt, dass sowohl Protein als auch CoenzymA Einfluss auf

die Diffusion bzw. den Transport von OPDA aus Chloroplasten haben. Allerdings scheint

kein Weg allein für den Transport verantwortlich zu sein. Möglich wäre eine Kombination

zwischen aktivem Transport über eine Acyl-CoA-Synthase und einem Proteinfaktor (OPDA-

Bindeprotein), der die Diffusion von freier OPDA über die Envelopemembran beschleunigt.

3.6 Untersuchungen zur Substratspezifität des Freisetzungsenzyms

Im Zuge dieser Arbeit wurden bisher die Freisetzungsbedingungen für lipidgebundene OPDA

untersucht. Ebenso konnte sowohl lipidgebundene OPDA als auch eine putative Lipase, die

für die Freisetzung von OPDA aus der sn1-Position des MGDG-O verantwortlich ist, in

Thylakoiden lokalisiert werden.

Zum Abschluss sollte die Substratspezifität der putativen Lipase untersucht werden. Dafür

wurden die Polyacrylamidbanden von Photosystem I und Photosystem II mit verschiedenen

Substraten inkubiert:

Monogalactosyldiglycerid (MGDG), MGDG-O, Digalactosyldiglycerid (DGDG), Phosphati-

dylglycerol (PG), -cholin (PC), -serin (PS), -ethanolamin (PE) und Sulfochinovosyl-

diacylglycerol (SL)

Anschließend wurden die freigesetzten Fettsäuren und ODDA gemessen.

Ergebnisse

- 61 -

3.6.1 Präparation unterschiedlicher Lipidspezies

Um die Substrate für die Spezifitätsversuche zu erhalten, mussten die verschiedenen

Lipidklassen aus Arabidopsis thaliana präpariert werden. Dazu wurde die Methode nach

Bligh & Dyer (1959) mit anschließender Trennung über eine Kieselgelmatrix verwendet.

Abb. 3.15: Überprüfung des über Kieselgel aufgetrennten Rohlipids mittels Dünn- schichtchromatographie

300 g Pflanzenmaterial wurden nach Bligh & Dyer (1959) aufgearbeitet und das erhaltene Rohlipid über eine Kieselgelmatrix in die verschiedenen Lipidklassen aufgetrennt. Die gesammelten Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromato-graphie auf die vorhandenen Lipide überprüft (A). Des weiteren wurden die Frak-tionen auf lipidgebundenen OPDA überprüft (2.7). In Abb.3.15 (B) sind die verwendeten Standards dargestellt, bei denen es sich um gekaufte Lipide aus Soja (CPS, Düren) handelte. Anzahl der durchgeführten Versuche n = 4

Die erhaltenen Fraktionen wurden auf die vorhandenen Lipidklassen sowie auf ihren Gehalt

an lipidgebundener OPDA (Abb. 3.15) überprüft. Anhand dieser Ergebnisse wurde für die

weitere Präparation von MGDG Fraktion eins, für die Präparation von MGDG-O Fraktion

zwei und für die Präparation von DGDG Fraktion drei verwendet.

Ergebnisse

- 62 -

Die Isolierung von Phospho- und Sulfolipiden aus Arabidopsis thaliana konnte nicht erfolg-

reich durchgeführt werden. Deshalb wurden für die weiteren Versuch käufliche Phospho- und

Sulfolipide aus Soja (CPS, Düren) verwendet.

Die Fraktionen von MGDG, MGDG-O und DGDG wurden mittels Hochdruckflüssigkeits-

chromatographie gereinigt und die Reinigung mittels Dünnschichtchromatographie überprüft

(Abb. 3.16).

Abb. 3.16: Chromatographische Überprüfung von MGDG, MGDG-O und DGDG Nach der Präparation der Lipidklassen über die Kieselgelmatrix wurden die Fraktionen von MGDG (Fr.1), MGDG-O (Fr.2) und DGDG (Fr.3) mittels HPLC weiter aufgereinigt. Dabei wurden pro HPLC-Lauf 30 Fraktion von 2 min. aufge-fangen und mittels Dünnschichtchromatographie auf die Lipidzusammensetzung überprüft. Dargestellt ist das Ergebnis der Dünnschichtchromatographie für die relevanten Fraktion von MDGD (B), MGDG-O (C) und DGDG (D). In Abb. 3.16 (A) sind die Chromatogramme der Rechromatographie der HPLC- Fraktion 8 (MGDG), Fraktion 9 (MGDG-O) und Fraktion 11 (DGDG).

Ergebnisse

- 63 -

Die Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie, der Rechromatoraphie der HPLC-Frak-

tionen 8 (MGDG), 9 (MGDG-O) und 11 (DGDG) haben gezeigt, dass die Isolierung und

Präparation von MGDG, MGDG-O und DGDG erfolgreich durchgeführt werden konnte.

3.6.2 Alkalische Hydrolyse der unterschiedlichen Lipidspezies

Von jeder Lipidspezies wurden 100 µg in die Versuche eingesetzt. Um die Fettsäure-

Zusammensetzung der verschiedenen Lipidspezies zu ermitteln, wurde zunächst eine alka-

lische Hydrolyse durchgeführt.

Während bei den bisherigen Versuchen der Gesamtgehalt an OPDA, also die Summe von cis-

und trans-OPDA angegeben wurden, muss für die Spezifitätsversuche zwischen cis- und

trans-Form unterschieden werden. Über den Octadecanoidweg wird nur cis(+)-OPDA

synthetisiert, welche sekundär infolge von Tautomerisierung in die trans-Form übergehen

kann.

Durch die alkalische Hydrolyse wird cis-OPDA in die trans-Form überführt, so dass sowohl

die endogene OPDA als auch der zugebene interne Standard als trans-OPDA vorliegen.

Die Spektren der gemessenen Fettsäuren und der verwendeten Standards sind in Abb.3.17

dargestellt.

Abb. 3.17: (nächste Seite) Übersicht über die Massenspektren der gemessenen Fettsäuren Dargestellt sind die Spektren der Fettsäuren, wobei 270 ng Margarin-säure (17 : 0 Fettsäure) als Standard für die ungesättigten Fettsäuren Palmitinsäure (16 : 0 Fettsäure), Stearinsäure (18 : 0 Fettsäure) und für die einfach ungesättigte Ölsäure (18 : 1 Fettsäure) diente (A). Als Standard für die mehrfach ungesättigten Fettsäuren Linolsäure (18 : 2 Fett-säure), Linolensäure (18 : 3 Fettsäure) und 16 : 3 Fettsäure dienten 307 ng einer 20 : 3 Fettsäure (B).

Als interner Standard für OPDA diente 156 ng pentadeuterierte OPDA (C).

Ergebnisse

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Ergebnisse

- 65 -

Ergebnisse

- 66 -

Abb. 3.18: (vorherige Seite) Ergebnis der alkalischen Hydrolyse

Pro Versuch wurden je 100 µg Substrat eingesetzt. Dargestellt sind die Ergebnisse für die aus Arabidopsis thaliana isolierten Lipide MGDG, MGDG-O und DGDG (A) und für die aus Soja stammenden Lipide Phosphatidylglycerol, -cholin, -serin, ethanolamin und Sulfochinovosyldiacylglycerol (B). Zur Quantifizierung wurde 270 ng Margarinsäure, 307 ng 20 : 3 Fettsäure und 156 ng pentadeuterierte OPDA verwendet.

Anzahl der Versuche n = 4.

Die bei der alkalischen Hydrolyse ermittelten Fettsäuren-Konzentrationen wurden bei den

nachfolgenden Versuchen gleich 100 % gesetzt, um so die maximale chemische Fettsäure-

Freisetzung mit der enzymatischen Freisetzung vergleichen zu können.

Die alkalische Hydrolyse zeigte außerdem, dass sich die Fettsäure-Zusammensetzung von

Lipiden aus unterschiedlichen Pflanzen voneinander unterscheiden.

Aus MGDG und DGDG, welche neben MGDG-O aus A. thaliana präpariert wurden, ließen

sich hauptsächlich Linol- und Linolensäure, sowie 16: 3 als Fettsäure aus der sn1- und sn2-

Position freisetzen. OPDA konnte aus diesen Lipiden nicht freigesetzt werden. Damit stimmte

die Fettsäurezusammensetzung mit der von Browse et al. (1986; Tab. 3.2.) für A. thaliana

Blätter ermittelte prozentuale Fettsäure-Verteilung überein. Die bei MGDG und DGDG in

geringen Konzentrationen gemessene Palmitinsäure war wahrscheinlich auf eine

Verunreinigung der Lipidpräparation oder der verwendeten GC-MS-Säule zurückzuführen.

Aus der MGDG-O Fraktion wurde trans-OPDA und 16 : 3 Fettsäure etwa im Verhältnis 1 : 1

freigesetzt, wobei diese Fettsäure-Verteilung mit der ermittelteren Struktur von MGDG-O

(Stelmach et al., 2001) übereinstimmte. Die ebenfalls aus der MGDG-O Fraktion freige-

setzten Anteile von Linol- und Linolensäure deuten daraufhin, dass diese Fraktion zu

geringen Teilen noch mit MGDG oder DGDG verunreinigt war.

Die gekauften Phospholipide (Phosphatidylglycerol, -cholin, -serin und –ethanolamin) und

das Sulfolipid Sulfochinovosyldiacylglycerol, die aus Soja stammen, unterschieden sich in

ihrer Fettsäure-Zusammensetzung deutlich von den aus A. thaliana stammenden Lipidklassen.

So waren neben 16 : 3 Fettsäure, Linol- und Linolensäure vor allem Palmitinsäure (bei

Phosphatidylglycerol, -cholin und –ethanolamin), Stearinsäure (bei Phosphatidylglycerol, -

cholin –serin und bei Sulfochinovosyldiglycerid) und Ölsäure (bei Phosphatidylcholin, -serin

und –ethanolamin) freigesetzt. Aus keinem dieser Lipide konnte innerhalb der Inkubationszeit

trans- oder cis-OPDA freigesetzt werden.

Ergebnisse

- 67 -

3.6.3 Umsetzung der getesteten Lipide durch Lipasen

Bevor die endogenen, über BN-PAGE aufgetrennten Lipasen hinsichtlich ihrer

Substratspezifität getestet wurden, wurde mit der sn1-spezifischen Lipase aus Mucor

javanicus übeprüft, welche Fettsäure(n) sich in der sn1-Position der jeweiligen Substrate

befinden. Außerdem sollte mit Hilfe dieser Lipase die maximale enzymatische Fettsäure-

Freisetzung aus 100 µg Substrat bestimmt werden.

Bei der maximalen enzymatischen Freisetzung ergab sich dieselbe Fettsäure-Verteilung, wie

nach alkalischen Hydrolyse, wobei die enzymatische Freisetzung der Fettsäuren zwischen 91

und 71 Prozent der alkalischen Hydrolyse betrug (Abb. 3.19).

Bei der Überprüfung der in der sn1-Position sitzenden Fettsäure zeigte sich, dass bei MGDG

Linolensäure in der sn1-Position saß, wobei nach 15 min. Inkubation mit Mucor javanicus

186 ng/100 µg Lipid (2,22 % im Vergleich zur alkalischen Hydrolyse) freigesetzt wurde.

Das ebenfalls aus Arabidopsis thaliana präparierte DGDG trägt in der sn1-Position Linolen-

säure. Innerhalb der Inkubationszeit wurden 73,3 ng/100 µg Lipid freigesetzt (Abb. 3.19).

Damit stimmte die Verteilung der gemessenen Fettsäuren mit der ermittelten prozentualen

Verteilung für die in sn1- und sn2-Position befindlichen Fettsäuren bei MGDG und DGDG

aus A. thaliana überein (Tab. 3.2. nach Browse et al., 1986).

Position Fettsäuren eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee

16 : 0 16 : 3 18 : 0 18 : 1 18 : 2 18 : 3

MGDG

sn1 2 1 - - 4 93

sn2 - 70 - - 1 28

DGDG

sn1 15 2 - 2 3 76

sn2 9 3 - - 3 83

Tab. 3.2: Fettsäure-Verteilung (mol %) in Arabidopis thaliana Blättern Dargestellt ist die Fettsäure-Verteilung in der sn1- und sn2-Position von Mono-galaktosyldiglycerid (MGDG) und Digalaktosyldiglycerid (DGDG) in A. thaliana Blättern nach Browse et al. (1986)

Ergebnisse

- 68 -

Ergebnisse

- 69 -

Abb. 3.19: (vorherige Seite) Freisetzung von Fettsäuren aus Lipiden Pro Versuch wurden je 100 µg Substrat eingesetzt. Dargestellt sind die Ergebnisse für die aus Arabidopsis thaliana isolierten Lipide MGDG (A), MGDG-O (B) und DGDG (C). Zur Quantifizierung wurde 270 ng Margarinsäure, 307 ng 20 : 3 Fettsäure und 156 ng pentadeuterierte OPDA verwendet. Anzahl der Versuche n = 4.

Bei MGDG-O wurde OPDA aus der sn1-Position freigesetzt. Während bei den bisherigen

Versuchen die Gesamtmenge an cis- und trans-OPDA angegeben wurde, wurde bei den

Untersuchungen zur Substratspezifität zwischen cis- und trans-OPDA unterschieden. Nach 15

min. waren 8,4 ng/100 µg Lipid (0,21 %) cis-OPDA und 33, 22 ng/100 µg Lipid (0,81 %)

trans-OPDA freigesetzt worden. Am nativen MGDG-O trägt die sn1-Position nur cis-OPDA.

Während der Präparation war cis-OPDA wahrscheinlich in die trans-Form isomerisiert, wofür

auch die gemessenen OPDA-Standardwerte sprachen, von dem ebenfalls in Anteil (74 %) in

die trans-Form isomerisiert war.

Für die Bestimmung der Substratspezifität der endogenen, über BN-PAGE aufgetrennten

Lipase(n) wurden die Banden von Photosystem I 10 min. und von Photosystem II für 15 min.

mit 100 µg der verschiedenen Lipide inkubiert. Photoystem I und Photosystem II wurden für

diese Versuche gewählt, da an den Photosystemen sowohl lipidgebundene OPDA als auch die

putative Lipase-Aktivität nachgewiesen werden konnte.

Am Photosystem I wurden, im Vergleich mit den Daten der alkalischen Hydrolyse, nach 10

minütiger Inkubation aus MGDG 7,29 ng/100 µg Lipid (≅ 0,08 %) α-Linolensäure, aus

MGDG-O 39,72 ng/100 µg Lipid cis-OPDA und 25,59 ng/100 µg Lipid trans-OPDA

freigesetzt. Aus DGDG konnte innerhalb dieser Inkubationszeit keine Fettsäure freigesetzt

werden.

Am Photosystem II wurde eine 15 minütige Inkubationszeit verwendet. Aus MGDG wurde

ebenfalls 7,29 ng/100 µg Lipid (≅ 0,08 %) Linolensäure, aus MGDG-O 42,79 ng/100 µg

Lipid cis-OPDA und 25,48 ng/100 µg Lipid trans-OPDA freigesetzt. Aus DGDG konnte

innerhalb der Inkubationszeit wiederum keine Fettsäure freigesetzt werden .

Ergebnisse

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Ergebnisse

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Abb. 3.20: (vorherige Seite) Fettsäure-Hydrolyse durch endogene Lipase(n) an den Photosystemen

Pro Versuch wurden je 100 µg Substrat eingesetzt. Dargestellt sind die Ergebnisse für die aus Arabidopsis thaliana isolierten Lipide MGDG, MGDG-O und DGDG. Die Gelbanden von Photosystem I wurden 10 bzw. 30 min. (A), die Gelbanden von Photosystem II 15 bzw. 30 min. (B) in den Substraten inkubiert und anschließend die freigesetzten Fettsäuren vermessen. Als Kontrolle wurden die Gelbanden unter den gleichen Bedingungen ohne Substrat inkubiert. Dargestellt sind die um die Hintergrundkonzentration bereinigten Werte. Zur Quantifizierung wurde 270 ng Margarinsäure, 307 ng 20 : 3 Fettsäure und 156 ng pentadeuterierte OPDA verwendet. Anzahl der Versuche n = 4.

An den ebenfalls getesteten Phospho- und Sulfolipiden wurden weder am Photosystem I noch

Photosystem II Fettsäuren aus der sn1- oder sn2-Position innerhalb der Inkubationszeiten

(Photosystem I: 10 min; Photosystem II: 15 min.) freigesetzt (Daten nicht gezeigt).

Nach 30 min. Inkubation wurde am Photosystem I aus MGDG 71,93 ng x (100 µg Lipid x g

Gel) -1 (≅ 0,85 %) Linolensäure, aus MGDG-O 107,66 ng x (100 µg Lipid x g Gel) -1 cis-

OPDA und 61,18 ng x (100 µg Lipid x g Gel) -1 trans-OPDA freigesetzt. Aus DGDG konnte

innerhalb der Inkubationszeit 1,52 ng/100 µg Lipid Linolensäure freigesetzt werden.

Am Photosystem II wurde innerhalb der 30 minütigen Inkubationszeit aus MGDG 47,54 ng x

(100 µg Lipid x g Gel) -1 (≅ 0,56 %) Linolensäure, aus MGDG-O 166,73 ng x (100 µg Lipid x

g Gel) -1 cis-OPDA und 103,99 ng x (100 µg Lipid x g Gel) -1 trans-OPDA freigesetzt. Aus

DGDG konnte 4,43 ng x (100 µg Lipid x g Gel) -1 Linolensäure freigesetzt werden.

Aus den ebenfalls getesteten Phopholipiden sowie dem Sulfolipid Sulfonosyldiacylglycerol

konnte wiederum keine Fettsäure freigesetzt werden.

Um die ermittelten Werte genauer einordnen zu können, war ein Vergleich dieser Werte mit

den gemessenen Hintergrundkonzentrationen an Fettsäuren unerlässlich (Abb. 3.21).

Es zeigte sich, dass die Hintergrundkonzentration am Photosystem I von Linolensäure bei

MGDG nach 10 min. 34,21 ng Linolensäure x (100 µg Lipid x g Gel) -1und nach 30 min. 71,6

ng Linolensäure x (100 µg Lipid x g Gel) -1 betrug. Am Photosystem II lag die

Hintergrundkonzentration nach 15 min. bei 25,25 ng Linolensäure x (100 µg Lipid x g Gel) -

1und nach 30 min. bei 64,90 ng Linolensäure x (100 µg Lipid x g Gel) -1. Nach Inkubation mit

MGDG-O betrug am Photosystem I die Hindergrundkonzentra tion von trans-OPDA nach 10

Ergebnisse

- 72 -

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Abb. 3.21: Vergleich der Hintergrundkonzentration von Linolensäure (MGDG) und

OPDA (MGDG-O) Pro Versuch wurden je 100 µg Substrat eingesetzt. Dargestellt ist ein Vergleich der Hintergrundkonzentrationen (rote Balken) von Linolensäure (MGDG) und der cis- und trans-Form von OPDA (MGDG-O). Die Gelbanden von Photosystem I wurden 10 bzw. 30 min. , die Gelbanden von Photosystem II 15 bzw. 30 min. in den Substraten inkubiert und anschließend die freigesetzten Fettsäuren vermessen. Als Kontrolle wurden die Gelbanden unter den gleichen Bedingungen ohne Substrat inkubiert. Zur Quantifizierung wurde 270 ng Margarinsäure, 307 ng 20 : 3 Fettsäure und 156 ng pentadeuterierte OPDA verwendet. Anzahl der Versuche n = 4.

Ergebnisse

- 73 -

min. 9,87 ng/100 µg Lipid und von cis-OPDA 9,11 ng/100 µg Lipid. Nach 30 min. lag die

Hintergrundkonzentration von trans-OPDA bei 14,35 ng/mg Protein und von cis-OPDA bei

5,69 ng/100 µg Lipid. Am Photosystem II betrug die Hintergrundkonzentration nach 15 min.

für trans-OPDA 11,35 ng/100 µg Lipid und für cis-OPDA 6,78 ng x (100 µg Lipid x g Gel) -1

und nach 30 min. für trans-OPDA 12,56 ng x (100 µg Lipid x g Gel) -1 und für cis-OPDA

4,56 ng x (100 µg Lipid x g Gel) -1.

Der Vergleich der Hintergrundkonzentration mit den freigesetzten Fettsäuren zeigte, dass die

Freisetzung von OPDA aus MGDG-O stärker war, als die Freisetzung von Linolensäure aus

MGDG. Dieser Unterschied in der Substratspezifität deutet auf eine MGDG-O spezifische

putative Lipase an den Photosystemen hin.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Ergebnisse daraufhin deuten, dass die an den

Photosystemen lokalisierte(n) Lipase(n) relativ spezifisch für MGDG-O sind. Aus MGDG

und DGDG wurden ebenfalls Fettsäuren aus der sn1-Position freigesetzt, wobei im Hinblick

auf die Hintergrundkonzentration die Fettsäure-Freisetzung geringer ausfiel und die Hydro-

lyse von Linolensäure aus DGDG zu einem späteren Zeitpunkt erfolgte als bei MGDG-O, was

ebenfalls auf eine MGDG-O spezifische Lipase hindeutete.

3.7 Lokalisation von Allenoxidsynthase in Chloroplasten

Die AOS katalysiert die Reaktion von Hydroperoxyoctadecatriensäure in das instabilen

Zwischenprodukt 12,13(S)-Epoxy-9,11,15(Z)-octadetriensäure, welches durch eine Allen-

oxidcyclase zum vermutlich einzigen physiologisch aktiven (9S,13S)-Enantiomer der 12-oxo-

Phytodiensäure (OPDA) umgesetzt wird ( Hamber & Fahlstadius, 1990; Laudert et al., 1997).

Im Arabidopsis thaliana Genom codiert nur ein einziges Gen die AOS (Kubigsteltig et al.,

1999), so dass davon ausgegangen werden kann, dass AOS sowohl in die Jasmonsäure-

abhängige Verwundungsreaktionen als auch in die Samenentwicklungsprozesse involviert ist

(Turner et al., 2002). Untersuchungen zum AOS-Promotor haben gezeigt, dass er durch

verschiedene Signale, zu denen Jasmonsäure, Verwundung, OPDA und Salicylsäure gehören,

aktiviert werden kann. Dieses könnte daraufhin deuten, dass die AOS ein Schlüsselenzym im

Biosyntheseweg von Jasmonsäure ist, dessen Expression strikt reguliert wird, wodurch auch

die Synthese von Jasmonsäure reguliert wird (Laudert et al., 2000).

Ergebnisse

- 74 -

Da es erfolgreich gelungen war, Chloroplasten in Stroma, Envelope und Thylakoidmem-

branen zu zerlegen, sollte mit Hilfe der Immunodetektion geklärt werden, ob die AOS in einer

der Fraktionen lokalisiert werden konnte.

Abb. 3.22: Lokalisation von AOS in Stroma, Envelope und Thylakoiden A) Nach der Gewinnung von Stroma, Envelope und Thylakoiden (2.6.5) wurde

die Proteinzusammensetzung mittels SDS-Gelelektrophorese überprüft, wobei 10 µg Protein aufgetragen wurden.

B) Für die Immunodetektion der AOS wurde ein Antikörper gegen denaturiertes AOS- Protein (Laudert et al., 1997) verwendet.

Es zeigte sich, dass AOS im Stroma, im Envelope und in Thylakoidmembranen nachweisbar

war, wenn auch unterschiedlich stark (Abb.3.22). Das stärkste Immunsignal ließ sich im

Envelope (≅ 100%) nachweisen. Mit absteigender Intensität in der Signalstärke folgten

Stroma (66 %) und Thylakoide (87 %).

Diskussion

- 75 -

4. Diskussion Der gesamte Lebenszyklus von Pflanzen, von der Keimung bis zur Reproduktion, unterliegt

der Regulation durch chemische Botenstoffe, deren komplexes Zusammenspiel die Pflanzen

beeinflussen und steuern. Schon die Pflanzenphysiologen Darwin (1880) und Sachs (1887)

forderten die Existenz solcher chemischen Botenstoffe, denn ihrer Theorie zufolge, wurde für

die koordinierte Entwicklung und Funktion vielzelliger Organismen ein „Kommunikations-

system“ zwischen Zellverbänden aber auch zwischen einzelnen Zellen benötigt. Diese

Theorie konnte durch die Entdeckung des Auxins, als erstes dieser Signalstoffe, durch Went

& Thimann (1937) bestätigt werden. Bis heute konnten weitere Signalsubstanzen identifiziert

und charakterisiert werden (Lethman et al., 1978, Kende & Zeevaart, 1997), die unter dem

Begriff Phytohormonen zusammengefasst werden.

Zu den Phytohormonen gehören die Auxine, Gibbereline, die Abscisinsäure, das Ethylen, die

Brassinosteroide und die Jasmonate (Moore et al., 1987; Yokota et al., 1997). Daneben

weisen auch niedermolekulare Peptidverbindungen, wie z.B. das von Rojo et al. (2002)

charakterisierte Peptid CLAVATA3 (CLV3), phytohormonartige Eigenschaften und

Wirkungen auf (Rojo et al., 2002; Bisseling et al., 1999).

Eine gut charakterisierte Gruppe der Phytohormone bilden die Jasmonate, zu denen die

Jasmonsäure, alle physiologischen Metaboliten im Jasmonsäure-Biosyntheseweg, sowie alle

Substanzen, die sich von der Jasmonsäure ableiten, gezählt werden (Creelman & Mullet,

1997; Turner et al., 2002). Die Funktion der Jasmonsäure als Signalstoff innerhalb der pflanz-

lichen Abwehrmechanismen wurden von Farmer & Ryan (1992) postuliert, wobei sie einen

kausalen Zusammenhang zwischen der Verwundung durch Herbivore, der Bildung von

Jasmonsäure und der Induktion von Proteinase-Inhibitoren nachwiesen. Weitere Unter-

suchungen zur Jasmonsäure haben gezeigt, dass der Jasmonsäure-Signalweg durch ver-

schiedene abiotische Stressfaktoren, wie z.B. osmotischen Stress (Kramell et al., 1995) und

Verwundung, durch Elizitoren, wie Chitin und Oligosaccharide (Dorates et al., 1995), und

durch Hefeextrakt (Parchmann et al., 1997; Leon et al., 2001), aktiviert werden kann.

Ein Zwischenprodukt im Jasmonsäure-Biosyntheseweg ist die 12-oxo-Phytodinsäure

(OPDA), die durch Untersuchungen der Arabidopsi-thaliana-Mutante opr3 als physiologisch

aktiver Metabolit identifiziert werden konnte (Mussig et al.,2000; Stinzi & Browse, 2000).

OPDA liegt in Arabidopsis thaliana nur in geringen Konzentrationen (≥ 10%) als freier

Metabolit vor. Über 90 % der gesamten OPDA-Konzentration liegt lipidgebunden vor. Dabei

ist OPDA mit der sn1-Position eines Monogalactosyldiglycerid verestert, dem sn1-(9S,13S,-

Diskussion

- 76 -

12-oxo-Phytodiensäure)-sn2-O-(7Z,10Z,13Z-hexadekatienoyl)-monogalactosyldiacyl-

glycerid (Stelmach et al., 2001).

Abb. 4.1: Vergleich der Strukturformeln von MGDG und MGDG-O

Dargestellt sind die Strukturformeln von MGDG-O (A) und von MGDG (B)

Monogalactosyldiacylglycerid (MGDG) ist ein Galactolipid, welches der Gruppe der Glyko-

lipide zuzuordnen ist. Galactolipide, zu denen neben MGDG auch Digalactosyldiacylglycerid

(DGDG) gehört, bilden mit 80 % den Hauptanteil des gesamten Lipidpools in Pflanzen

(Joyard et al., 1996) und sind in der sn3-Position des Glycerins mit Galactose(n) verestert.

Die sn1- und sn2-Position des Glycerins sind mit Fettsäuren verestert, deren

Zusammensetzung Rückschlüsse auf den Biosyntheseweg des Lipids zulässt (Heinz &

Rouhgan, 1983). Bei photosynthetisch aktiven Pflanzen kann man zwischen 18:3 und 16:3

Pflanzen unterscheiden. 18:3 Pflanzen sind sowohl in sn1- wie auch in sn2-Position mit α-

Linolensäure verestert, während sich bei 16:3 Pflanzen in sn1- Position α-Linolensäure und in

sn2-Position eine dreifach ungesättigte Fettsäure befindet. Arabidopsis thaliana gehört zu den

16:3 Pflanzen, und besitzt für die Synthese von Diacylglycerin zwei parallele

Biosynthesewege, wobei der eine Syntheseweg in den Plastiden (prokaryotischer Weg) und

der andere Syntheseweg am Endoplasmatischen Retikulum (eukaryotischer Weg) lokalisiert

ist (Heinz & Rouhgan, 1983; Browse et al., 1983). Der prokaryotische Weg ist auf die

Plastide beschränkt, wogegen der eukaryotische Syntheseweg Reaktionen in Plastiden und

Endoplasmatischen Retikulum miteinander verbindet. Thylakoidlipide können auf beiden

Diskussion

- 77 -

Biosynthesewegen synthetisiert werden und anhand der Fettsäurezusammensetzung dem

jeweiligen Biosyntheseweg zugeordnet werden (Heinz & Rouhgan, 1983; Härtel et al., 2000).

MGDG-O ist in sn2-Position mit einer 16 : 3 Fettsäure verestert, was darauf schließen lässt,

dass das MGDG über den prokaryotischen Weg synthetisiert wird. Für die Synthese von

OPDA in der sn1-Position von MGDG-O gibt es mehrere Möglichkeiten. Zum einen könnte

die in der sn1-Position befindliche Fettsäure durch eine putative Lipase gegen OPDA

ausgetauscht und zum anderen α-Linolensäure, die sich in dieser Position befindet, enzyma-

tisch in OPDA umgewandelt werden (Stelmach et al., 2001).

Unabhängig vom Syntheseweg ist MGDG-O entweder selbst eine physiologisch aktive

Substanz, oder dient als „Speicher“ für OPDA, aus dem diese bei Stresssituationen, wie

Herbivor- oder Pathogenbefall, freigesetzt werde kann. Bei Aabidopsis thaliana konnte eine

membrangebundene enzymatische Aktivität, die OPDA freisetzt, nachgewiesen, aber noch

nicht charakterisiert werden (Stelmach et al., 2001).

Im Rahmen dieser Arbeit sollte lipidgebundene OPDA innerhalb der pflanzlichen Zelle

lokalisiert und die Hydrolyse der lipidgebundener OPDA charakterisiert werden.

MGDG-O bildet eine neue Klasse der Oxylipine und konnte bisher nur in Arabidopsis

thaliana nachgewiesen werden (Stelmach et al., 2001). Untersuchungen verschiedener

Pflanzenspezies hinsichtlich des Gehalts an lipidgebundener OPDA zeigten, dass Arabidopsis

thaliana zwar den höchsten Gehalt an lipidgebundener OPDA aufweist, aber lipidgebundene

OPDA im Pflanzenreich weit verbreitet ist. So lässt sich lipidgebundene OPDA in Farnen,

Monokotyledonen und Dikotyledonen nachweisen, was darauf schließen lässt, dass lipidge-

bundene OPDA ein allgemeines, weit verbreitetes Prinzip darstellt (3.1).

Eine Ausnahme bildete die Familie der Solanaceen. In keiner getesteten Solanaceenart konnte

lipidgebundene OPDA nachgewiesen werden. Dafür kann es mehrere Gründe geben. Ent-

weder kommt lipidgebundene OPDA in Solanaceen nicht vor, oder die Konzentration der

lipidgebundenen OPDA liegt unterhalb der möglichen Nachweisgrenze, oder die Konzen-

tration der lipidgebundenen OPDA ist altersabhängig, so dass für die Untersuchungen

möglicherweise das falsche Alter gewählt wurde. Untersuchungen von Stelmach et al. (1998)

verschiedenen Pflanzenspezies auf freie OPDA ergaben für die getesteten Solanaceenarten

Werte im Bereich der Nachweisgrenze.

Nicht nur hinsichtlich lipidgebundener OPDA weisen Arabidopsis thaliana- und Tomaten-

pflanzen Unterschiede im Jasmonsäure-Signalweg auf. So zeigen z.B. Arabidopsis-Mutanten

mit Defekten im Jasmonsäure-Biosyntheseweg auch Defekte in den pflanzlichen Abwehr-

Diskussion

- 78 -

mechanismen und sind männlich steril (Fey et al., 1994; McConn & Browse, 1996; Vijialan

et al., 1998), während vergleichbare Tomaten-Mutanten zwar auch Defekte in den

pflanzlichen Abwehrmechanismen aufweisen, aber männlich fertil sind (Howe et al., 1996; Li

et al., 2001), was für unterschiedliche Funktionen von Jasmonsäure in verschiedenen

Pflanzenarten spricht (Turner et al., 2002). Für die weiteren Versuche wurde auf Grund des

hohen Gehalts an lipid-gebundener OPDA Arabidopsis thaliana verwendet.

MGDG ist ein Strukturlipid und bildet zusammen mit DGDG den Hauptbestandteil der

Chloroplastenmembran (Browse & Somerville, 1983). Daneben ist die Synthese von OPDA

aus α-Linolensäure in den Chloroplasten lokalisiert (Vick & Zimmerman, 1981; Blee &

Joyard, 1996; Hamberg et al., 1988). Auf Grund dieser Tatsachen wurden intakte

Chloroplasten auf lipidgebundene OPDA untersucht.

Durch Analyse des verwendeten Percoll-Gradienten auf freie und lipidgebundene OPDA

(3.2.1) konnte gezeigt werden, das lipidgebundene OPDA in Chloroplasten (zerstört und

intakt) lokalisiert ist. In der Fraktion der zerstörten Chloroplasten liegt der Gehalt an freier

OPDA über dem lipidgebundener OPDA, während in der Fraktion der intakten Chloroplasten

mehr lipidgebundene als freie OPDA enthalten ist. Diese Verteilung von freier und

lipidgebundener OPDA lässt darauf schließen, dass OPDA durch bzw. während der

Präparation, also nach Verwundung freigesetzt wird.

In weiteren Untersuchungen an Stroma, Envelope- und Thylakoidmembranen konnte gezeigt

werden, dass lipidgebundene OPDA in der Thylakoidmembran lokalisiert ist (3.2.2.2). Die

Verteilung des Lipids innerhalb der Membran wurde durch native Auftrennung der

Proteinkomplexe der Thylakoidmembran mittels BN-PAGE untersucht. Lipidgebundene

OPDA liegt über die gesamte Membran verteilt vor, wobei möglicherweise eine Affinität zu

den Photosystemen besteht (3.2.3).

Eine Untersuchung des „blau-nativen“ Gelsystems auf die Hydrolyse von lipidgebundener

OPDA (3.4.2) ergab, dass es sich hierbei um eine enzymatische Reaktion handelt, wobei die

putative(n) Lipase(n) an den Photosystemen lokalisiert ist (sind). Ishiguro et al. (2001) konnte

in der Arabidopsis thaliana-Mutante dad1 (für DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1)

eine chloroplastidäre Phospholipase A1 als „Einstiegsenzym“ in den Jasmonsäure-

Biosyntheseweg identifizieren, welche aus Membranlipiden α-Linolensäure sn1-spezifisch

freisetzt. Homologieuntersuchungen der DAD1-Aminosäuresequenz, die das für Lipasen

typische Aminosäurenmotiv GXSXG enthält, führte in Arabidopsis zu 11 Genen, die auf

Grund ihrer Sequenzhomologie wahrscheinlich für ein DAD1-ähnliches Protein kodieren,

also putative Lipasen darstellen können. Allerdings wurden diese Proteine bisher nicht weiter

Diskussion

- 79 -

charakterisiert. Neben DAD1 besitzen sechs dieser DAD1-ähnlichen Proteine eine chloro-

plastidäre Transitpepdid-Sequenz (Ishiguro et al., 2001). Da die Lipaseaktivität für die

Hydrolyse lipidgebundener OPDA an den Photosystemen lokalisiert ist, könnte eine der von

Ishiguro et al. (2001) identifizierten DAD1-ähnlichen Proteine für diese Aktivität

verantwortlich sein.

Nachdem lipidgebundene OPDA in der Thylakoidmembran und die Hydrolyseaktivität an den

Photosystemen lokalisiert werden konnte, sollte die Bedingungen für die Hydrolyse lipidge-

bundener OPDA untersucht werden.

Die Untersuchungen der Percoll-Gradienten haben gezeigt, dass wahrscheinlich auch Stress,

wie z.B. durch Verwundung, die Freisetzung lipidgebundener OPDA auslösen kann. Zu

Stress können aber auch hohe Lichtintensität, Pathogenbefall, Ozon (O3) und UV-Bestrahlung

führen. Dabei kommt es zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), wie Sauer-

stoffradikalen (•O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Singulett Sauerstoff (1O2), welche

Membranlipide und Protein oxidativ schädigen können, so dass es letztendlich zur Einleitung

des hypersensitiven Zelltodes kommt (Mudd et al., 1997). Untersuchungen von •O2- und H2O2

haben gezeigt, dass diese als Signalstoffe innerhalb pflanzlicher Abwehrmechanismen wirken

(Levine et al., 1994; Solomon et al., 1999). Dabei können sie Gene, die an der pflanzlichen

Abwehr beteiligt sind, sowie Moleküle, die für die Einleitung des hypersensitiven Zelltods

verantwortlich sind, wie z.B. Salicylsäure, systemisch aktivieren (Chamnong et al., 1998; Rao

& Davis, 1999). Durch Untersuchungen der Ozon-toleranten Arabidopsis-Mutante Col-0

konnte Rao et al. (2000) zeigen, dass sowohl der durch Jasmonsäure vermittelte als der durch

Salicylsäure vermittelte Signalweg durch Ozon aktiviert wird, wobei Jasmonsäure als

Antagonist der Salicylsäure wirkt. Die antagonistische Wirkung der Jasmonsäure sowohl auf

die Stärke des „oxidative burst“ als auch auf den Salicylsäure-abhängigen Signalweg, der zum

hypersensitiven Zelltod führt, erlauben Pflanzen wahrscheinlich andere Abwehrmaßnahmen

gegen oxidativen Stress zu aktivieren und den hypersensitiven Zelltod zu umgehen (Rao et

al., 2000).

Untersuchungen des Gehalts an lipidgebundener OPDA bei unterschiedlichen Lichtbe-

dingungen (3.3.1.1) zeigten, dass die Freisetzung von lipidgebundener OPDA mit

zunehmender Lichtintensität steigt. Je stärker die Lichtintensität, desto schneller und stärker

lief die Hydrolyse von lipidgebundener OPDA ab. Dabei zeigte sich, dass die Abnahme im

Gehalt von lipidgebundener OPDA mit der Zunahme an freier OPDA korrelierte. MGDG-O

könnte also als „Speicher“ dienen, aus dem OPDA bei photosynthetischen Stress freigesetzt

und in die Jasmonsäure-Biosynthese eingebracht wird. Die gebildete Jasmonsäure könnte u.a.

Diskussion

- 80 -

dann die oben beschriebene Funktion als Antagonist zur Salicylsäure ausüben (Rao et al.,

2000).

Allerdings kommt es bei Dunkelheit ebenfalls zu einer Abnahme im Gehalt von

lipidgebundener OPDA, die ebenfalls mit einer Zunahme an freier OPDA korreliert. Die

Abnahme an lipidgebundener OPDA lässt sich nicht durch photosynthetischen Stress

erklären, sondern ist wahrscheinlich als Antwort auf die, bei der Präparation und Inkubation

auftretende Verwundung, zu interpretieren. Das könnte bedeuten, dass MGDG-O ebenfalls

bei der Antwort auf Verwundung als „Speicherlipid“ fungiert, wobei die aus OPDA gebildete

Jasmonsäure pflanzliche Abwehrmechanismen gegen Verwundung (Creelman & Mullet,

1997; Seo et al., 1997) z.B. durch Aktivierung bestimmter Abwehrgene (Wasternack &

Parthier, 1997; Reymond & Farmer, 1998; Memelink et al., 2001) einleitet.

Ein weiteres Indiz für die „Speicherfunktion“ von MGDG-O lieferten die durchgeführten pH-

Versuche (3.3.1.2). Durch diese Versuche sollte untersucht werden, ob eine Änderung im pH-

Wert eine Änderung in der Konzentration der lipidgebundenen OPDA bedingt. In intakten

Chloroplasten kommt es während der Photosynthese zur Bildung eines Protonengradienten

über die Thylakoidmembran, wobei sich die Protonenkonzentration im Thylakoidlumen

erhöht. Bei der Inkubation von intakten Chloroplasten in unterschiedlichen pH-Werten zeigte

sich, dass eine Verringerung des pH-Werts zu einer Zunahme der Hydrolyse von lipidge-

bundener OPDA führt. Auch bei diesen Versuchen ist die Zunahme von freier OPDA an die

Hydrolyse der lipidgebundenen OPDA gekoppelt, was die These von MGDG-O als

„Speicher“ für OPDA untermauert. Allerdings ist bei den pH-Versuchen zu beachten, dass die

pH-Wert Änderungen nicht im Thylakoidlumen, sondern im Außenmedium stattfinden, und

somit eher die Verhältnisse nach Verwundung als bei der Photosynthese wiederspiegeln.

Diese Ergebnisse, in Verbindung mit dem Ergebnis des Dunkelversuchs, weisen daraufhin,

dass lipidgebundene OPDA auch in die Abwehrreaktionen nach Verwundung involviert ist.

Als dritter Faktor wurde eine Änderung der Calciumkonzentration im Außenmedium und

deren Einfluss auf den Gehalt von lipidgebundener OPDA untersucht (3.3.1.3). Eine

Änderung in der Calciumkonzentration hat keinen Einfluss auf den Gehalt an lipidgebundener

und freier OPDA. Allerdings trat während der gesamten Versuchsreihe der gleiche Effekt auf,

wie bei Dunkelheit. Auch hier korrelierte die Zunahme an freier OPDA mit der Freisetzung

von OPDA aus MGDG-O, wobei diese Reaktion wahrscheinlich wiederum eine Antwort auf

die Verwundung während der Präparation war.

Anhand der Freisetzung von lipidgebundener OPDA durch Licht und durch eine

Verringerung des pH-Werts, sowie die Lokalisation von lipidgebundener OPDA in der

Diskussion

- 81 -

Thylakoidmembran und die Lokalisation der putative(n) Lipase(n) an den Photosystemen

lässt sich eine Hypothese für die Funktion von MGDG-O innerhalb der pflanzlichen

Abwehrmechanismen aufstellen (Abb. 4.2). MGDG-O dient nach dieser Hypothese als

„Speicherlipid“ für OPDA in der Thylakoidmembran, wobei die putative(n) Lipase(n)

abhängig von der Lichtintensität und/oder des pH-Werts gesteuert werden, was auf einen

phylogenetisch alten Mechanismus hindeuten könnte. Somit könnte die Pflanze bei

Stresssituation, wie zum Beispiel Verwundung und Pathogenbefall oder photooxidativem

Stress schneller und effektiver OPDA, und damit auch Jasmonsäure, bereitstellen, als wenn

diese Substanzen erst aus α-Linolensäure synthetisiert werden.

Diskussion

- 82 -

Abb. 4.2: (vorherige Seite) Hypothetische Rolle von MGDG-O innerhalb der pflanzlichen Abwehrmechanismen

MGDG-O ist in der Thylakoidmembran lokalisiert. Durch putative Lipase(n), die durch Licht und einen niedrigen pH-Wert gesteuert werden, wird OPDA aus MGDG-O freigesetzt. Die freigesetzte OPDA verlässt durch einen bisher nicht charakterisierten Mechanismen die Chloroplasten und wird entweder selbst physiologisch aktiv oder in den Jasmonsäure-Biosyntheseweg eingebracht.

Da der Wirkort von OPDA bzw. Jasmonsäure außerhalb des Chloroplasten lokalisiert ist,

muss die freigesetzte OPDA über eine bisher nicht charakterisierten Mechanismus aus den

Chloroplasten exportiert werden, um entweder selbst physiologisch aktiv (Weiler et al., 1994;

Blechert et al., 1997; Stinzi & Browse, 2000) oder in den Jasmonsäure-Biosyntheseweg (Vick

& Zimmerman, 1984) eingebracht zu werden.

Jasmonsäure wirkt, wie oben beschrieben, u.a. als Antagonist der Salicylsäure bei der

Antwort auf reaktive Sauerstoffspezies (ROS) (Niki et al., 1998; Rao et al,. 2000), die sowohl

bei photooxidativem Stress als auch bei Pathogenbefall gebildet werden (Hundal et al., 1995;

Sharma et al., 1998), und ermöglicht der Pflanzen wahrscheinlich die Aktivierung anderer

Abwehrmaßnahmen gegen photooxidativen Stress. Durch die Freisetzung von 12-oxo-

Phytodiensäure (OPDA) durch eine möglicherweise lichtgesteuerte putative Lipase könnte die

Synthese von antioxidativen Substanzen, wie z. B. Plastochinonen oder Tocopherolen,

eingeleitet werden, um dem hypersensitivem Zelltod entgegenzuwirken. Untersuchungen zur

Tocopherol- und Plastochinonbiosynthese haben gezeigt, dass die Tyrosin-Transaminase,

welche mit der Synthese von p-Hydroxyphenylpyruvat aus L-Tyrosin den ersten Metaboliten

im Biosyntheseweg von Tocopherolen und Plastochinonen synthetisiert, durch Jasmonsäure,

ihren Methylester und durch OPDA induziert werden kann (Lopoukhina et al., 2001; Sandorf

& Holländer-Cyztko, 2002).

Des weiteren wurden im Photosystem II von Cyanobakterien vier Lipide entdeckt, von denen

eins ein MGDG ist (Jordan et al., 2001). Untersuchungen der mgd1- und dgd1-Mutanten von

Arabidopsis thaliana haben gezeigt, dass Galactolipide für die Stabilität und die Funktion der

photosynthetischen Proteinkomplexe notwendig sind (Härtel et al., 1997; Jarvis et al., 2000).

Die räumliche Nähe von lipidgebundener OPDA zu den Photosystemen durch die

Lokalisation in der Thylakoidmembran, könnte wiederum daraufhin deuten, dass MGDG-O

ebenfalls eine Schutzfunktion für die Photosysteme besitzt, indem es bei Bildung von ROS

die Bildung antioxidativer Substanzen injiziert.

Die Funktion von OPDA bzw. Jasmonsäure vor Photooxidation durch die Induktion von anti-

oxidativen Substanzen zu schützen, könnte auf die ersten photosynthetisch aktiven

Diskussion

- 83 -

Organismen zurückgehen und damit einen phylogenetisch alten Mechanismus darstellen. Ein

Indiz hierfür liefert die stammesgeschichtliche Abstammung von Chloroplasten. Da Chloro-

plasten, wie Mitochondrien, in Eucyten auf Grund ihrer doppelten Hüllmembran, ihrer

eigenen zirkulären DNA, sowie ihrer Transkriptions- und Translationseinrichtungen eine

Sonderstellung einnehmen, wurde in der Endosymbionten-Theorie versucht, diese Merkmale

zu erklären. Dabei sollen Chloroplasten und Mitochondrien stammesgeschichtlich auf

Bakterien zurückgehen, welche als intrazelluläre Symbionten in urtümliche Eucyten

inkorporiert wurden(Margulis et al., 1970). Durch phylogenetische Analysen von Einzelgenen

(Gray, 1992; Loisceaux de Goer, 1994; McFadden et al., 1994; Bhattacharya & Medlin, 1995)

und des vollständigen Plastidengenoms (Martin et al., 1998) konnte nachgewiesen werden,

dass Plastiden einen cyanobakteriellen Vorfahren besaßen.

Ein weiterer Hinweis darauf, dass lipidgebundene OPDA möglicherweise einen

phylogenetisch alten Mechanismus darstellen könnte, liefert die in sn2-Position des MGDG-O

befindliche Fettsäure. Lipide, die in dieser Position eine 16 : 3 Fettsäure besitzen, werden

über den prokaryotischen Weg synthetisiert, welcher an der Envelopemembran der

Chloroplasten abläuft (Joyard & Douce, 1987), was bedeutet, dass das MGDG ebenfalls über

den prokaryotischen Weg, und damit über einen phylogenetisch alten Mechanismus,

synthetisiert wird.

Für die Synthese von OPDA in der sn1-Position von MDGD-O gibt es, wie oben schon

erwähnt zwei Möglichkeiten. Zum einen wäre ein Austausch von der in sn1-Position

befindlichen Fettsäure durch eine putative Lipase möglich, zum anderen könnte OPDA direkt

aus der in sn1-Position befindlichen α-Linolensäure synthetisiert werden. Bei A. thaliana

befindet sich α-Linolensäure zu 93 mol % (Tab. 4.1) in der sn1-Position von MGDG

(Browse et al., 1986). Ein direktes Zwischenprodukt im Biosyntheseweg von MGDG zu

MGDG-O konnte mit MGDG-HPOT durch Bogdanova (mündliche Mitteilung) bereits

identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit ist die AOS ebenfalls immunologisch in

Thylakoiden nachgewiesen worden, was daraufhin deuten könnte, dass lipidgebundene

OPDA direkt aus MGDG durch Umwandlung von α-Linolensäure zu OPDA synthetisiert

wird. Allerdings ist AOS auch in Stroma und im Envelope nachweisbar, wobei das stärkste

Immunsignal im Envelope nachweisbar ist. In Arabidopsis thaliana konnte nur ein Gen, das

für AOS kodiert, identifiziert werden (Kubigsteltig et al., 1999), so dass es sich bei der im

Stroma, Envelope und Thylakoiden nachgewiesenen AOS nicht um Isoformen handeln kann.

Transportversuche mit AOS bei intakten Chloroplasten aus Tomaten haben ergeben, dass die

importierte AOS an der inneren Envelopemembran lokalisiert werden konnte (Froehlich et

Diskussion

- 84 -

al., 2001). Der Nachweis von AOS in Stroma und Thylakoiden könnte auf eine

Kontamination dieser Fraktionen mit AOS während der Präparation hindeuten, was

möglicherweise für eine pheriphere Lokalisation von AOS an der inneren Envelopemembran

spricht.

OPDA ist, wie Jasmonsäure, physiologisch wirksam und ebenfalls in die Genregulation

involviert (Weiler et al., 1994; Weber et al., 1997; Blechert et al., 1997; Turner et al., 2002).

Während die Biosynthese von OPDA in den Chloroplasten stattfindet (Vick & Zimmerman,

1981; Blee & Joyard, Hamberg, 1988), läuft die Synthese von OPDA zu Jasmonsäure in den

Peroxisomen ab (Schaller et al., 2001). Der Transport der OPDA von den Chloroplasten in die

Peroxisomen ist noch nicht aufgeklärt. Für diesen Transport kommen mehrere Möglichkeiten

in Betracht. Zum einen könnte OPDA die Chloroplasten durch einen reinen Diffusionsprozess

verlassen oder die Diffusion könnte durch einen Proteinfaktor im Cytoplasma, wie z.B. ein

OPDA-bindendes Protein (Klasen, 2001), stimuliert werden. Zum anderen könnte ein aktiver

OPDA-Transport über die Envelopemembran erfolgen. Eine Möglichkeit für einen aktiven

Transport von OPDA läge in einem zum Fettsäuretransport analoges System. In

Chloroplasten werden die Fettsäure Palmitin- Stearin- und Ölsäure synthetisiert (Browse &

Somerville, 1991), die entweder zur Synthese der Membranlipide der Plastiden verwendet

werden (Ohlrogge & Browse, 1995), oder ins Cytoplasma exportiert werden. Dabei liegen die

Fettsäuren nicht frei vor, sondern sind im Chloroplasten an ein Acyl-Trägerprotein (ACP, für

acyl carrier protein) gebunden. Für den Transport wird das ACP durch eine Acyl-Thioesterase

(Dormann et al., 1995; Jones et al.,1995), welche an der inneren Envelopemembran

lokalisiert ist, abgespalten und durch eine, an der äußeren Envelopemembran lokalisierte,

Acyl-CoenzymA-Synthetase unter ATP-Verbrauch, in Acyl-CoA umgewandelt (Kornberg &

Pricer, 1953; Andrews & Kneestra, 1983; Block et al., 1983; Joyard & Stumpf, 1990; Judy et

al., 2002).

Die Ergebnisse, der zu diesem Thema durchgeführten Versuche, waren nicht eindeutig und

lassen mehrere Interpretationsmöglichkeiten zu (3.5). Die Versuche mit fettsäurefreiem RSA,

mit denen ein Zusammenhang zwischen Diffusion und einem möglicherweise vorhandenen

OPDA-bindenden Protein hergestellt werden sollte, sowie die Versuche zum aktiven OPDA-

Transport (analog zum Fettsäure-Transport) mit verschiedenen CoenzymA-Konzentrationen

und einer konstanten ATP-Konzentration, zeigten einen gesteigerten OPDA-Austritt bzw.

OPDA-Auswärtstransport im Vergleich zur Diffusion, die als Kontrolle diente. Auch die

Versuche mit cytosolischen Proteinen, mit denen der Einfluss von Arabidopsis thaliana-

eigenen Proteinen (mögliches OPDA-bindendes Protein; Klasen, 2001) getestet werden sollte,

Diskussion

- 85 -

zeigten einen gesteigerten OPDA-Austritt im Vergleich zur Diffusion, was möglicherweise

auch auf eine Kombination zwischen Diffusion und einem OPDA-bindenden Protein

schließen lässt. Um die Frage des OPDA-Transports aus Chloroplasten zu klären, sind weitere

Versuche notwendig, so sollte z.B. bei einem aktiven OPDA-Transportsystem, das analog

zum Fettsäuretransport arbeitet, OPDA-CoA nachweisbar sein.

Wenn lipidgebundene OPDA die Funktion eines „Speichers“ für OPDA besitzen soll, aus

dem bei Stresssituationen OPDA schnell freigesetzt wird, ist neben einem effizienten

Transport auch eine spezifisch arbeitende Lipase nötig, die OPDA spezifisch aus der sn1-

Position freisetzen kann. In diesen Versuchen wurde die an den Photosystemen lokalisierte

putative Lipase(n) mit unterschiedlichen Lipiden inkubiert, wobei je 100 µg Lipid eingesetzt

wurden (3.6). Aus Arabidopsis thaliana wurden hierfür die Lipide MGDG, DGDG und

MGDG-O päpariert, während die getesteten Phospho- und Sulfolipide aus Soja (CPS, Düren)

stammten. Es zeigte sich, dass die an den Photosystemen lokalisierte(n) putative(n) Lipase(n)

innerhalb der gewählten Inkubationszeit sn1-spezifisch OPDA (39,72 ng/100 µg Lipid cis-

OPDA; 25,59 ng/100 µg Lipid trans-OPDA am PS I und 42,79 ng/100 µg Lipid cis-OPDA;

25,48 ng/100 µg Lipid trans-OPDA am PS II) freisetzt. MGDG wird ebenfalls als Substrat

erkannt, allerdings fällt hier die Fettsäure-Freisetzung (α-Linolensäure) mit 7,29 ng/100 µg

Lipid am PS I bzw. PS II aus der sn1-Position geringer aus, als bei MGDG-O.

Erst nach einer 30 min. Inkubationzeit wurde auch DGDG als Substrat von den an den Photo-

systemen lokalisierte(n) putative(n) Lipase(n) umgesetzt, wobei hier mit der Hydrolyse von

α-Linolensäure die Fettsäure-Freisetzung sn1-spezifisch verlief. Aus Tab. 4.1 wird deutlich,

dass die putative(n) Lipase(n) wahrscheinlich wirklich sn1-spezifisch arbeiten, denn α-Lino-

lensäure befindet sich sowohl bei MGDG (93 mol %) als auch bei DGDG (76 mol %) in

Blättern von Arabidopsis thaliana in der sn1-Position (Browse et al., 1986; Tab. 4.1).

Position Fettsäuren eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee

16 : 0 16 : 3 18 : 0 18 : 1 18 : 2 18 : 3

MGDG

sn1 2 1 - - 4 93

sn2 - 70 - - 1 28

DGDG

sn1 15 2 - 2 3 76

sn2 9 3 - - 3 83

Diskussion

- 86 -

Tab. 4.1: (vorherige Seite) Fettsäure-Verteilung (mol %) in Arabidopis thaliana Blättern

Dargestellt ist die Fettsäure-Verteilung in der sn1- und sn2-Position von Mono-galactosyldiglycerid (MGDG) und Digalactosyldiglycerid (DGDG) in A. thaliana Blättern nach Browse et al. (1986)

Die getesteten Phospho- und Sulfolipide wurden innerhalb der gewählten Versuchsbe-

dingungen nicht umgesetzt, weil sie wahrscheinlich keine Substrate für die getesteten

putative(n) Lipase(n) darstellen. Lipasen sind nicht nur positionsspezifisch, sondern auch

substratspezifisch (Huang, 1993; Wooley & Petersen, 1994; Mukherjee & Hills, 1994), d.h.

Lipasen die Galactolipide gut hydrolysieren, setzen andere Lipidgruppen, wie z.B.

Phospholipide schlecht um. Umgekehrt gilt dieses natürlich auch. So setzte die von Ishiguro

et al. (2001) charakterisierte PhospolipaseA1 (DAD1) Phosphati-dylcholin im Vergleich zur

Lipase aus R. miehei gut um, während MGDG als Substrat nur schlecht umgesetzt wurde.

Die Ergebnisse der Versuche zur Substratspezifität der putative(n) Lipase(n) deuten darauf-

hin, dass diese Lipase(n), die an den Photosystemen lokalisiert ist (sind), während der

gewählten Inkubationszeiten sn1-spezifich sind und MGDG-O relativ spezifisch umsetzten.

Die verwandten Lipide MGDG und DGDG werden ebenfalls sn1-Position spezifisch

umgesetzt, wobei die Hydrolyse im Vergleich zu MGDG-O geringer ausfällt.

Auch die relativ spezifische Umsetzung von MGDG-O scheint auf eine Einbindung diese

Lipids in die pflanzlichen Abwehrmechanismen hinzudeuten. Dass Lipasen in pflanzliche

Abwehrmechanismen involviert sind, haben die oben angegebenen Untersuchungen von

Ishiguro et al. (2001) gezeigt, der eine PhospholipaseA1 als „Einstiegsenzym“ der Jasmon-

säure-Biosynthese identifizieren konnte. Des weiteren konnte Falk et al. (1999) zeigen, dass

das eds1 Gen (für enhanced disease susceptibility1) aus Arabidopsis thaliana für ein Protein

kodiert, das eine Homologie zur katalytischen Seite von eukaryotischen Lipasen aufwies und

an der Akkumulation von Salicylsäure beteiligt war. Als weiteres Gen, dass für ein Lipase-

ähnliches Protein kodiert, konnte das pad4 Gen (für phytoalexin deficient4) durch Jirage et al.

(1999) identifiziert werden. Jirage et al. (1999) konnte auch zeigen, dass PAD4 nach Befall

durch avirulente Bakterien und nach Salicylsäure-Behandlung akkumulierte. Die Bildung von

EDS1 und PAD4 konnten durch Salicylsäure induziert werden (Falk et al., 1999), wobei beide

positiv auf die Salicylsäure-Synthese wirkten, was für eine Salicylsäure-abhängige positive

Feedback-Schleife sprach, die die Pflanzenabwehr verstärkt (Shirasu et al. 1997; Falk et al.,

1999; Jirage et al., 1999). Jakob et al. (2003) konnte durch „differential screening“ von A.

thaliana-Pflanzen, die mit der resistenz-induzierenden Substanz β-Aminobutynsäure

Diskussion

- 87 -

(Zimmerli et al., 2001) behandelt worden waren, und unbehandelten Pflanzen ein Gen

identifizieren, das für ein Lipase-ähnliche Protein (PRLIP1, für pathogensis-related lipase like

protein) kodiert. Die Induktion von PRLIP1 war durch Salicylsäure und Ethylen, aber nicht

durch Jasmonsäure möglich.

Auf Grund der in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse scheint einen weitere Funktionsana-

lyse von lipidgebundener OPDA und der an der Hydrolyse beteiligten Lipase(n) innerhalb der

pflanzlichen Abwehrmechanismen sinnvoll. So wären Versuche zur Konzentration von

lipidgebundener OPDA unter oxidativen Stress, wie z.B. Inkubation mit Ozon, nötig, um zu

klären, ob und wie sich der MGDG-O Gehalt im Verhältnis zu freier OPDA, Jasmonsäure und

Salicylsäure ändert. Auf Grund der oben beschriebenen Funktionen von Lipasen in der

pflanzlichen Abwehr scheinen ebenfalls weitere Untersuchungen zur Aktivität der putative(n)

Lipase(n) nach Salicyl- bzw. Jasmonsäure-Gabe angebracht.

Weiterhin fehlt eine genaue Aufklärung des MGDG-O Syntheseweges, obwohl mit MGDG-

HPOT schon ein Zwischenprodukt im Biosyntheseweg identifiziert werden konnte

(Bogdanova, mündliche Mitteilung).

Des weiteren fehlt die Identifizierung der putativen Lipase(n) und nähere Charakterisierung

dieser Lipase(n). Hier wäre die Untersuchung der von Ishiguro et al. (2001) über

Homologieanalysen ermittelten, sechs DAD1-ähnliche Proteine, die ein chloroplastidäres

Transitpepdid besitzen, sinnvoll.

Zusammenfassung

- 88 -

5. Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, lipidgebundene OPDA innerhalb der Chloroplasten zu

lokalisieren und die Freisetzung der lipidgebundenen OPDA zu charakterisieren. Grundlage

für diese Arbeit war die Entdeckung von MGDG-O als neuer Metabolit innerhalb der

Oxylipine (Stelmach et al., 200 ).

Da es sich bei MGDG-O um eine neu entdeckte Lipidklasse handelte, wurde in ersten

Versuchen die Verbreitung dieser Lipidklasse untersucht. Es zeigte sich, dass lipidgebundene

OPDA im Pflanzenreich weit verbreitet ist, wobei A. thaliana den höchsten Gehalt an

lipidgebundener OPDA aufweist.

Da es sich bei Monogalactosyldiglyceriden um typische chloroplastidäre Membranlipide

handelt, wurden als erstes intakte Chloroplasten präpariert. Lipidgebundene OPDA ist in

Chloroplasten (zerstört und intakt) lokalisiert, wobei sich der Hauptanteil in intakten

Chloroplasten befindet.

In weiteren Versuchen wurden Stroma, Envelope und Thylakoidmembranen hinsichtlich

lipidgebundener OPDA untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass lipidgebundene OPDA

nur in der Thylakoidmembran nachgewiesen werden kann. Weiterhin kann die Allen-

oxidsynthase, eines der Schlüsselenzyme im Biosyntheseweg der Jasmonsäure, haupsächlich

in der Envelopefraktion, aber auch in Thylakoiden und Stroma, nachgewiesen werden.

Nähere Untersuchungen der Thylakoidmembran, sowie der Proteinkomplexe der Thylakoid-

membran ergaben, dass sich lipidgebundene OPDA nicht direkt einem bestimmten Protein-

komplex zuordnen ließ, sondern über alle Proteinkomplexe bzw. die gesamte Membran

verteilt vorliegt.

Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in der Charakterisierung der Freisetzung von

lipidgebundener OPDA. Dazu wurden verschiedene Versuche mit intakten Chloroplasten

durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Freisetzungsreaktion durch Licht und eine Abnahme im

pH-Wert, also durch Prozesse, die während der Photosynthese ablaufen, gesteigert werden

kann, während verschiedene Calciumkonzentrationen keinen Einfluss auf die Freisetzung

lipidgebundener OPDA haben.

Die Versuche zum Transport der aus dem MGDG-O freigesetzten OPDA führten zu keinem

eindeutigen Ergebnis. Bei dem Transportmechanismus könnte es sich Proteinfaktor im

Cytosol handeln, welcher die Diffusion der freien OPDA über die Membran fördert.

Zusammenfassung

- 89 -

Auf Grund der Ergebnisse ist aber auch ein dem Fettsäure-Transport ähnliches System über

eine Acyl-CoenzymA-Synthetase bzw. eine Kombination der beiden Transportwege möglich.

Die Untersuchungen zur positionsspezifischen Hydrolyse von MGDG-O haben

gezeigt, dass es sich dabei um einen enzymatischen Prozess handelt, welcher an den

Photosystemen der Thylakoidmembran lokalisiert ist. Die hier loklisierten Lipase(n) besitzen

eine relativ hohe Spezifität für MGDG-O. Verwandte Lipide, wie MGDG und DGDG werden

im geringeren Maße bzw. erst nach einem längeren Inkubationszeitraum umgesetzt.

Dagegen war unter den gewählten Versuchsbedingungen bei den untersuchten Phospho- und

Sulfolipiden keine Aktivität nachzuweisen.

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- 90 -

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Anhang

- 113 -

IV Anhang

Berechnung der OPDA- und Fettsäure-Konzentrationen

Für die Beispielrechnung wurden folgende Proben verwendet:

I) OPDA-Konzentration:

Photosystem I; 10 min. Inkubation mit und ohne MGDG-O (Abb. IV.1)

Zur internen Standardisierung wurde eingesetzt:

156 ng pentadeuterierte OPDA, 270 ng Margarinsäure und 307 ng 20 : 3 Fettsäure

Abb. IV.1: Massenspektrometrischer Nachweis von 12-oxo-Phytodiensäure Dargestellt sind die Chromatogramme für unmarkierte (I) und pentadeuterierte (II) OPDA, wobei die ermittelten Peakflächen angegeben sind. Beide Messungen stammen aus der ersten Versuchsreihe. Insgesamt wurden die Versuche viermal durchgeführt und die, um die Kontrollwerte bereinigten, Konzentrationen gemittelt. A: Chromatogramme für unmarkierte (I) und pentadeuterierte (II) OPDA der Gel-Kontrolle (1g Gelmaterial von Photosystem I; Ansatz ohne Substrat; 3.6.3). B: Chromatogramme für unmarkierte (I) und pentadeuterierte (II) OPDA der Probe mit MGDG-O als Substrat (1g Gelmaterial von Photosystem I; 3.6.3)

Anhang

- 114 -

Um die interne OPDA-Konzentration zu ermitteln, wurde vorausgesetzt, dass der verwendete

Standard sich während des Versuchs und der Präparation wie die zu quantifizierende Substanz

verhält. Somit ergaben sich für die oben dargestellte Proben folgende Werte:

Photosystem I; MGDG-O; Gel-Kontrolle; 10 min. Inkubation:

trans-OPDA: x = 371 x 156 ng x (5856)-1 = 9,88 ng

cis-OPDA: x = 172 x 156 ng x (6542) -1 = 4,10 ng

Photosystem I; MGDG-O; 10 min. Inkubation:

trans-OPDA: x = 8951 x 156 ng x (36710)-1 = 38,04 ng

cis-OPDA: x = 7494 x 156 ng x (22944) -1 = 50,95 ng

Neben der Gelkontrolle wurde ebenfalls die Autohydrolyse von OPDA aus MGDG-O kon-

trolliert. In dieser Probe konnte keine OPDA nachgewiesen werden.

Um die aus MGDG-O freigesetzte OPDA zu berechnen, wurde von diesen Werten die Hinter-

grundkonzentration abgezogen.

trans-OPDA: 38,04 ng – 9,88 ng = 28,16 ng

cis-OPDA: 50,95 ng – 4,10 ng = 46,85 ng

Da in die Versuche 100 µg Substrat und ein Gramm Gelmaterial eingesetzt wurden, ergab

sich 46,85 ng cis-OPDA x (100 µg x g Gel) -1 und 28,16 ng trans-OPDA x (100 µg x g Gel) -1.

II) Linolensäure-Konzentration:

Photosystem I; 10 min. Inkubation mit und ohne MGDG (Abb. IV.2)

Zur internen Standardisierung wurde eingesetzt:

156 ng pentadeuterierte OPDA, 270 ng Margarinsäure und 307 ng 20 : 3 Fettsäure

Um die interne Linolensäure-Konzentration zu ermitteln, wurde vorausgesetzt, dass der

verwendete Standard sich während des Versuchs und der Präparation wie die zu

quantifizierende Substanz verhält. Somit ergaben sich für die oben dargestellte Proben

folgende Werte:

Photosystem I; MGDG; Gel-Kontrolle; 10 min. Inkubation:

Linolensäure: x = 29394 x 307 ng x (285806)-1 = 31,57 ng

Anhang

- 115 -

Photosystem I; MGDG; 10 min. Inkubation:

Linolensäure: x = 39514 x 307 ng x (323661)-1 = 37,48 ng

Neben der Gelkontrolle wurde ebenfalls die Autohydrolyse von Linolensäure aus MGDG

kontrolliert. In dieser Probe konnte keine Linolensäure nachgewiesen werden.

Um die aus MGDG freigesetzte Linolensäure zu berechnen, wurde von diesen Werten die

Hintergrundkonzentration abgezogen.

Linolensäure: 37,48 ng – 31,57 ng = 5,91 ng

Da in die Versuche 100 µg Substrat und ein Gramm Gelmaterial eingesetzt wurden, ergab

sich 5,91 ng Linolensäure x (100 µg Lipid x g Gel) -1.

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Abb. IV.2: Massenspektrometrischer Nachweis von Linolensäure Dargestellt sind die Chromatogramme für Linolensäure (I) und die 20 : 3 Fettsäure (II), die als Standard verwendet wurde, wobei die ermittelten Peak-flächen angegeben sind. Beide Messungen stammen aus der ersten Versuchsreihe. Insgesamt wurden die Versuche viermal durchgeführt und die, um die Kontrollwerte bereinigten, Konzentrationen gemittelt. A: Chromatogramme für Linolensäure (I) und 20 : 3 Fettsäure (II) der Gel-Kontrolle (1g Gelmaterial von Photosystem I; Ansatz ohne Substrat; 3.6.3). B: Chromatogramme für Linolensäure (I) und 20 : 3 Fettsäure (II) der Probe mit MGDG als Substrat (1g Gelmaterial von Photosystem I; 3.6.3)

Danksagung

- 116 -

Danksagung

Für sein Vertrauen, das mein Doktorvater Prof. Dr. Weiler mir mit der Überlassung dieses

Themas entgegen gebracht hat, seine Diskussionsbereitschaft und sein Interesse am Fortgang

meiner Arbeit, möchte ich mich ganz herzlich bei Ihm bedanken.

Herrn Prof. Dr. Hengstenberg danke ich für die Übernahme des Korreferates.

Mein wissenschaftlicher Dank gilt Axel Müller, der mir besonders bei analytischen

Problemen eine große Hilfe war, und Markus Piotrowski, der die massenspektrometrischen

Proteinanalysen durchgeführt hat.

Persönlich möchte ich mich bei allen Mitgliedern des Lehrstuhls für Pflanzenphysiologie für

ihre Hilfe und Unterstützung bedanken.

Frau Holländer-Czytko und Axel Müller möchte ich für die kritische Durchsicht dieser Arbeit

danken.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich immer unterstützt und angespornt

haben.

Lebenslauf

- 117 -

Lebenslauf

Ich, Marcus Dettenberg, wurde am 26.02.1974 in Hagen-Hohenlimburg als Sohn von Dipl.

Ing. Heinz-Josef Dettenberg und Gertrude Dettenberg, geb. Kuhne, geboren.

Vom 01.08.1980 bis zum 31.07.194 besuchte ich die Grundschule in Hagen-Boloh.

Anschließend wechselte ich an das Albrecht-Dürer-Gymnasium in Hagen, welches ich vom

01.08.1984 bis zum 30.06.1993 besuchte und mit dem Abitur abschloss.

Vom 01.09.1993 bis zum 30.11.1994 versah ich meinen Zivildienst.

Vom 01.10.1994 bis zum 30.09.2000 war ich als Student an der Ruhr-Universität Bochum im

Fach Biologie eingeschrieben. Den Studiengang Biologie habe ich am 29.03.2000 mit der

Diplomarbeit „Untersuchungen zur Regulation der Tyrosin-Transaminase aus Arabidopsis

thaliana [L.] Heynh.“, angefertigt am Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie unter Herrn Prof. Dr.

E.W. Weiler, erfolgreich abgeschlossen.

Seit dem 02.05.2000 fertige ich meine Promotionsarbeit mit dem Titel „Untersuchungen an

lipidgebundenen OPDA-Vorstufen aus Arabidopsis thaliana [L.] Heynh.“ am Lehrstuhl für

Pflanzenphysiologie bei Herrn Prof. Dr. E.W. Weiler an.

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Untersuchungen an lipidgebundenen 12-oxo-Phytodiensäure ... · 2.10.2 Untersuchung der verwendeten Lipide durch endogene Lipasen aus 29 Arabidopsis thaliana . Inhaltsverzeichnis