Untersuchungen über die Pathogenese der Aleutenkrankheit der Nerze : II. Elektrophoretische und biochemische Untersuchungen des Harnes

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  • Aus dem Institut fiir Pathologie der Tierarztlichen Hochschde Hannover Direktor: Prof. Dr. L.-Cl. Schulz

    Abteilung fi ir Immunpathologie Leiter: Prof. Dr. G. Trautwein

    und der Medizinischen Universitats-Poliklinik Heidelberg Direktor: Prof. Dr. H . Pliigge

    Untersuchungen iiber die Pathogenese der Aleutenkrankheit der Nerzel)

    11. Elektrophoretische und biochemische Untersuchungen des Harnes

    Von

    G. TRAUTWEIN und H. WEICKER

    Mit 6 Abbildungen und 3 Tabellen

    (Eingegangen am 23. Dezember 1968)

    Bei Versuchsnerzen entwickelt sich 3-4 Wochen nach experimenteller In- fektion mit dem Agens der Aleutenkrankheit eine Dysproteinamie mit Erho- hung der 1)-Globulinfraktion auf 21-29 rel.O/o und entsprechender Abnahme der Albuminfraktion (TRAUTWEIN, 1969). In den folgenden Monaten erreicht die y-Globulinfraktion Werte von 40-47 rel.O/o, urn dann auf dieser Hohe mehrere Monate zu bleiben. Ungefahr ab der 4. Woche lassen sich in den Nie- ren infizierter Nerze erste morphologische Veranderungen in Form von inter- stitiellen Infiltraten und glomerularen Veranderungen nachweisen. Bislang ist unbekannt, zu welchem Zeitpunkt nach experimenteller Infektion Funktions- storungen der Nieren mit Proteinurie eintreten. Ziel der vorliegenden Unter- suchungen war es daher, durch qualitative Eiweigproben, papier- und immun- elektrophoretische Untersuchungen des Harnes infizierter Nerze in verschiede- nen Phasen post infect. den Beginn einer Proteinurie und die Art der ausge- schiedenen Proteine zu erfassen. Durch biochemische Untersuchungen des Harnes erkrankter Nerze wurden die bei Aleutenkrankheit ausgeschiedenen Uroproteine naher charakterisiert.

    Material und Methode Gewinnung von Harnproben. Zur Harngewinnung wurden Versuchs-

    nerze 24 Std. in modifizierten Stoffwechselkafigen gehalten und der Harn durch eine Kombination von Drahtrosten kotfrei gewonnen.

    Qualitative Eiweipnachweise. Orientierende Untersuchungen auf Eiwei8 im Harn erfolgten mit Albustix-Teststabchen (Merck) bzw. rnit 20 O/oiger Sul fosaliz ylsaure.

    :$) Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir fur die finanzielle Unterstiitzung.

    49')

  • 754 TRAUTWEIN und WEICKER

    Papierelektrophorese. Bei positivem Eiweii3nachweis wurde der Harn durch ein Papierfilter filtriert, mit Cialit (1 : 50 000) versetzt, durch Dialyse gegen Polyvinylpyrrolidon auf 1/10 des Ausgangsvolumens ein eengt und an-

    papierelektrophoretische Auftrennung erfolgte in TRIS-Puff er, p H 8, 6, ge- mai3 der in der ersten Mitteilung angegebenen Methodik (TRAUTWEIN, 1969).

    Immunelektrophorese. Die immunelektrophoretische Untersuchung des eingeengten Harnes erfolgte rnit der Mikromodifikation der Immunelektro- phorese nach SCHEIDEGGER (1955) entsprechend der in der I. Mitteilung an- gegebenen Methodik (TRAUTWEIN, 1969). Hierbei wurde auf einem Objekt- trager das Immunelektropherogramm der Harnprobe eines aleutenkranken Nerzes rnit dem Immunelektropherogramm des Blutserums eines gesunden Nerzes verglichen. Als Antiseren wurden ein selbst hergestelltes polyvalentes Antinerzserum vom Kaninchen und ein Antiserum gegen Bence- Jones-Protein des Menschen (Highland Laboratories, USA) verwandt.

    Immundijjusion. Die zweidimensionale Immunodiff usion nach OUCHTER- LONY (1962) wurde mit einer LKB-Immunodiff usionsapparatur (LKB-Produk- ter AB, Stockholm) auf Objekttragern durchgefuhrt. In die peripheren Locher wurden die zu vergleichenden Serum- und Harnproben bzw. y-Globulin vom Nerz eingefullt. Die Entwicklung der Immunodiffusion erfolgte rnit einem in das zentrale Loch eingefullten Kaninchenserum gegen Nerzvollserum.

    Biochemische Untersuchungen. Fur die biochemischen Untersuchungen standen je 80 ml Sammelurin gesunder bzw. aleutenkranker Nerze 7 Monate p. i. zur Verfugung. Entsprechend der Urin-Aufarbeitung bei menschlichen Paraproteinosen wurde folgende Isolierung der Uroproteine vorgenommen: Der dialysierte Sammelurin von Normaltieren bzw. erkrankten Tieren wurde 5 Min. bei p H 7,4 auf 70' erhitzt und bei 6000 U/min zentrifugiert. Der klare Oberstand wurde gefriergetrocknet und das Sediment verworfen (PRU 11). Die gefriergetrocknete Substanz wurde zur Extraktion der Lipide 12 Std. mit wasserfreiem Methanol und anschliei3end 12 Std. mit Chloroform- Methanol 2 : 1 v/v im Ruckflui3 extrahiert.

    Der lufttrockene Extraktionsruckstand wurde rnit Wasser eluiert und das Eluat filtriert und anschliei3end gefriergetrocknet. Die gefriertrockne Substanz (A) wurde in einer 1 O/oigen Losung auf 100' C erhitzt und anschliei3end bei 6000 U/min zentrifugiert. Der Oberstand wurde dialysiert und der Inhalt des Dialyseschlauches gefriergetrocknet. Das Sediment wurde verworfen. Die ge- friertrockne Substanz (A 100') wurde 1 O / o in 0,6 m eiskalter HCIOp gelost, bei 17 OOO U/min zentrifugiert und der Oberstand sofort gegen fliei3endes Wasser dialysiert. Das Sediment wurde verworfen. Nach anschliefiender Dia- lyse gegen Aqua dest. wurde der Inhalt des Schlauches gefriergetrocknet. Nach Trocknung uber Phosphorpentoxyd wurden an der perchlorsaureloslichen Fraktion folgende Analysen durchgefuhrt: N-Bestimmung nach KJELDAHL (YEMM u. WILLIS, 1954), Ermittlung der Gesamthexosen mit der Orcin- und Anthronmethode, bezogen auf den Galaktose-Standard (WINZLER, 1955), Fucose-Bestimmung nach DISCHE und SHETTLES (1948), Neuraminsaure-Be- stimmung rnit der Resorcin-Methode von SVENNERHOLM (1957), Bestimmung der enzymatisch freigesetzten Neuraminsaure nach der Methode von WARREN (1959), Neuramidase-Abbau mit 1 mg (500 i. U.) kristalliner Neuramidase (1 Ampulle), Behring-Werke, Marburg. Eingesetzt wurden 2 mg Glykoproteid (KUHN, GRASSLIN u. WEICKER, 1967), Glucuronsaure-Bestimmung nach DISCHE und SHETTLES, modifiziert von GREGORY (1960), Xylose-Bestimmung mit der kolorimetrischen Methode von ROE und RICE (1948) nach Hydrolyse des Glykoproteids mit 2 N Schwefelsaure, anschliei3ender Neutralisation der

    schliei3end auf vorbereitete Papierelektrophoresestreifen au B getragen. Die

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    Schwefelsaure mit Bariumhydroxyd bei 50' C und Entfernung des restlichen Bariums an Dowex 50 X 8 (200-400 msh), Hf-Form, Hexosamin-Bestim- mung nach Hydrolyse des Glykoproteids mit 8 N HC1 (3 Std. 100" C) mit der Methode von CESSY und PILIEGO (1960). Der Neutralzucker-Verlust durch Hydrolyse wurde durch die Quote des Hydrolyse-Verlustes der Reinsubstanz korrigiert.

    Ergebnisse Laufend nach experimenteller Infektion mit dem Agens der Aleuten-

    krankheit durchgefuhrte Harnuntersuchungen lassen erkennen, dai3 in der 7.-8. Woche post infectionem von rund 70 O/o der Nerze EiweiB mit dem Harn ausgeschieden wird. 3-4 Monate p. i. finden sich Uroproteine im Harn nahezu aller infizierter Nerze. Die Eiweii3ausscheidung 1ai3t sich auch 12 Mo- nate p. i. bei Versuchsende noch nachweisen.

    Ein Vergleich der Elektropherogramme des Blutserums und des Harnes zeigt, dai3 Veranderungen des Blutserums mit Anstieg der y-Globulinfraktion 3-4 Wochen p. i. beginnen (TRAUTWE~N, 1969), wahrend Uroproteine erst in der 7.-8. Woche papierelektrophoretisch nachweisbar werden. Demnach geht die Dysproteinamie den Nierenfunktionsstorungen mit Ausscheidung von Uro- proteinen voraus.

    Papierelektrophoretisch weisen die Uroproteinfraktionen bei einzelnen Nerzen starke individuelle Schwankungen auf (Tab. 1). Jedoch sind in allen Phasen der Krankheit Albumine, a-, p- und y-Globuline im Harn nach-

    weisbar (Abb. 1, 2, 3). Insgesamt ent- i + - steht der Eindruck, dai3 sich die y-Glo-

    A

    B

    C

    D

    h

    -

    bulinausscheidung in den spaten Phasen der Aleutenkrankheit 9-12 Monate p. i. verstarkt; die hohen y-Globulin- werte der entsprechenden Blutseren werden jedoch nur bei einzelnen Tieren erreicht.

    Abb. 1. Papiereletrophoretische Untersuchung von Blutserum und Harn des Nerzes 383 vor und nach experimenteller Infektion. A, .B, D = Serum vor, 8 bzw. 12 Wochen post in- fectionem. C, E = Harn 8 bzw. 12 Wochen p. i. A = Serum, Alb. = 69 O/o, a, = 6 O / o , a? = 8 O/O, B = 8 O/O, y = 9 O / o , B = Serum, Alb. = 46 O/o, a, = 8 O / o , a2 = 8 O / o , B = 9 "10, y1 = 10 o / o , yp = 19 O / o , C = Harn, Alb. = 41 Ole, a + /? = 33 O / o , y = 26 O / o . D = Serum, Alb. = 39 O / o , a, = 8 " / o , a, = 8 " / o , ,8 = 9 " /o , y1 = 6 O / o , y2 = 30 O / o . E = Harn, Alb. =

    36 " / o , a = 18 O / o , B = 17 O/o, y = 29 O/o

  • 756 TRAUTWEIN und WEICKER

    Tabelle 1 Papierelektrophoretische Untersuchung des Harnes in verschiedenen Phasen der experimen-

    tellen Aleutenkrankheit

    12

    ( 2 3 - 391 ( 1 5 - 4 1 ) [ 18 - 26 1 ( 1 6 - 21 ) 23.5 16,O 27,O 33.5

    ( 1 3 - 3 L l ( 10 - 22 I ( 2 5 - 291 ( 1 5 - 521

    In Obereinstimmung mit der Papierelektrophorese finden sich auch in der Immunelektrophorese Proteine im Albuminbereich sowie in unterschiedlicher Konzentration im Bereich der a-, /3- und y-Globuline (Abb. 4). In keinem

    Fall wird das ganze Spektrum der Serumproteine im Harn erkrankter Nerze nachweisbar.

    Die zweidimensionale Immuno- diffusion nach OUCHTERLONY (1 962) wurde zur Klarung der Frage durch- gefuhrt, ob in Harn und Serum aleutenkranker Nerze Proteine mit gemeinsamen Antigendeterminanten vorkommen. Das Ergebnis der bei 12 Nerzen durchgefuhrten Immuno-

    + - t

    Abb. 2. Vergleich der Elektrophoresedia- gramme und Elektropherograrnrne des Blut- serums und Harnes von Nerz 378, 3 Monate p. i. Blutserurn (A): Alb. = 31 Ole, a, und a = 14 '10, /3 = 12 '10, y1 = 7 '10, yr = 36 O/O. Harn (B): Alb. = 37O/0, al und a, = 2 O o / o ,

    B = 15 Ole, y = 28 O/o

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    t

    A

    t

    Abb. 3. Pap

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