Untersuchungen zu extrazellulären ... - uft.uni-bremen.de Votteler_Projektbericht.pdf · Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis

Universität Bremen

Fachbereich 2: Biologie

Projektbericht

angefertigt in der Abteilung Marine Mikrobiologie

Leitung: Prof. Dr. Ulrich Fischer

Untersuchungen zu extrazellulären Enzymen bei marinen

heterotrophen Bakterien unter besonderer Berücksichtigung der

Amylasen

vorgelegt von

Tatjana Votteler

Bremen, Mai 2007

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUBGSVERZEICHNIS ........................................................................................ IV

1. EINLEITUNG ........................................................................................................... ......... 1

1.1. Herkunft und Funktion von Enzymen ...........................................................................................1

1.2. Enzyme in der Industrie .................................................................................................................1

1.2.1. Eignung der Enzymquellen für biotechnischen Einsatz ..........................................................2

1.3. Amylasen .......................................................................................................................................3

1.4. Peptidasen ..................................................................................................................................... 3

1.5. Lipasen ...........................................................................................................................................4

1.6. DNasen ...........................................................................................................................................5

1.7. Ziel und Vorgehensweise der vorliegenden Arbeit .......................................................................5

2. MATERIAL UND METHODEN....................................................................................... 6

2.1. Material .........................................................................................................................................6

2.1.1. Herkunft der marinen heterotrophen Bakterien ......................................................................6

2.1.2. Bacillus subtilis ………...........................................................................................................6

2.2. Medien, Lösungen und Puffer ......................................................................................................7

2.2.1. M1 (Medium 1)-Medium (modifiziert nach Widdel & Bak, 1992) .......................................7

2.2.2. ASN (Artificial Seawater Nutrients)-Medium (Rippka et al., 1979,

modifiziert nach Rethmeier, 1995) ........................................................................................9

2.2.3. LB (Luria-Bertani)-Medium (Sambrook et al., 1989) ...........................................................10

2.2.4. Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Enzyme ......................................................10

2.2.4.1. Stärke-Agar für den Amylase-Nachweis (modifiziert nach Gerhard

et al., 1994) .......................................................................................................................11

2.2.4.2. DNA-Toluidinblau-Agar für den DNase-Nachweis (modifiziert nach

Schreier, 1969) ..................................................................................................................11

2.2.4.3. Magermilch-Agar für den Peptidase-Nachweis (modifiziert nach

Gerhard et al., 1994) ........................................................................................................11

2.2.4.4. Olivenöl-Rhodamin-B-Agar für den Lipase-Nachweis (modifiziert

nach Kouker & Jaeger, 1987) ..........................................................................................11

2.2.5. DNA-Stammlösung für den DNase-Nachweis ......................................................................11

2.2.6. Magermilchpulver-Lösung für den Peptidase-Nachweis ......................................................11

Inhaltsverzeichnis II

2.2.7. Lugolsche Lösung ..................................................................................................................12

2.2.8. Bradford-Reagenz (Bradford, 1976) ......................................................................................12

2.2.9. 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5) ...............................................................................12

2.2.10. 0,15 M Zitronensäurephosphat-Puffer (pH 7,5) ..................................................................12

2.2.11. Stärke-Puffer für die Amylase-Aktivitätsfärbung ................................................................12

2.2.12. 2x SDS-Probenpuffer (modifiziert nach Laemmli, 1970) ...................................................12

2.2.13. Lösungen für die Silbernitratfärbung ...................................................................................13

2.2.13.1. Fixierer A .......................................................................................................................13

2.2.13.2. Fixierer B .......................................................................................................................13

2.2.13.3. Fixierer C .......................................................................................................................13

2.2.13.4. Entwickler ......................................................................................................................13

2.3. Methoden .....................................................................................................................................13

2.3.1. Hälterung der Organismen .....................................................................................................13

2.3.2. Assays für die Detektion von extrazellulären Enzymen ........................................................14

2.3.2.1. Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar (modifiziert nach Gerhard

et al.,1994) .......................................................................................................................14

2.3.2.2. DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar (modifiziert nach

Schreier, 1969) .................................................................................................................14

2.3.2.3. Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar (modifiziert nach

Gerhard et al., 1994) .......................................................................................................14

2.3.2.4. Lipase-Nachweis auf Olivenöl-Rhodamin B-Agar (modifiziert

nach Kouker & Jaeger, 1987) ..........................................................................................15

2.3.3. Methoden zur Anreichreung und Bestimmung von Proteinen ..............................................15

2.3.3.1. Anzucht der Kulturen im Flüssigmedium .......................................................................15

2.3.3.2. Anzucht der Bacillus subtilis- Kultur ..............................................................................15

2.3.3.3. Herstellung zellfreier Kulturüberstände ...........................................................................15

2.3.3.4. Ammoniumsulfatfällung ..................................................................................................16

2.3.3.5. Proteinbestimmung (Bradford, 1976) ..............................................................................16

2.3.4. Methoden zur Auftrennung und Detektion von Proteinen .....................................................17

2.3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert

nach Laemmli, 1970) ......................................................................................................17

2.3.4.2. Amylase-Aktiviätsfärbung im Gel nach SDS-PAGE (modifiziert

nach Kim et al., 1995, Lacks & Springhorn, 1980) .........................................................17

2.3.4.3. Silbernitratfärbung der Proteine .......................................................................................18

2.4. Chemikalien .................................................................................................................................19

Inhaltsverzeichnis III

3. ERGEBNISSE ....................................................................................................................20

3.1. Produktion extrazellulärer Enzyme auf festen Medien ................................................................20

3.1.1. Bestimmung der Amylaseaktivität auf Stärke-Agar ..............................................................21

3.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene ......................................................22

3.2.1. Anreicherung der Amylase ....................................................................................................22

3.2.2. Ammoniumsulfatfällung ........................................................................................................23

3.2.3. Amylase-Aktivitätsbestimmung im SDS-Gel ........................................................................23

3.2.4. Silbernitratfärbung der Proteine .............................................................................................25

4. DISKUSSION .....................................................................................................................26

4.1. Extrazelluläre Enzyme aus marinen heterotrophen Bakterien .....................................................26

4.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene ......................................................26

5. LITERATURVERZEICHNIS ..........................................................................................29

Abkürzungsverzeichnis IV

Abkürzungsverzeichnis

A

Aqua dest.

ASN

d

Da

et al.

G

k

M1

m

Ampere

destilliertes Wasser

Artificial Seawater Nutrients

Tage (days)

Dalton

und andere (et alii)

Gramm

Kilo

Medium

Milli

µ

n.u.

p.a.

PAGE

RT

rpm

SDS

s

V

Mikro

noch unbekannt

zur Analyse (pro analysi)

Polyacryamid-Gelelektrophorese

Raumtemperatur

Rotationen pro Minute (rounds per minute)

Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)

Sekunde

Volt

v/v Volumen pro Volumen (volume per volume)

W Watt

w/v Gewicht pro Volumen (weight per volume)

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1. Herkunft und Funktion von Enzymen

Jeder Organismus produziert eine große Vielfalt von Enzymen (Madigan et al., 2003), welche

für die Katalyse der zahlreichen biochemischen Reaktionen verantwortlich sind (Voet et al.,

2002). Die meisten Enzyme werden von den Organismen in kleinen Mengen synthetisiert und

sind an zellulären Prozessen beteiligt. Jedoch sind einige Mikroorganismen befähigt, gewisse

Enzyme in viel größeren Mengen zu produzieren und diese nach außen zu sekretieren

(Madigan et al., 2003). Extrazelluläre Enzyme spalten Makromoleküle, welche nicht in die

Zelle aufgenommen werden können, zu transportablen Mono-, Di- oder Oligomeren (Fritsche,

2002). Diese können nach der Aufnahme in die Zelle als Nährstoffe für das Wachstum

verwendet oder in Form von Makromolekülen gespeichert werden (Madigan et al., 2003).

1.2. Enzyme in der Industrie

Mikroorganismen und Enzyme werden schon seit langer Zeit zur Verarbeitung von

pflanzlichen und tierischen Rohstoffen verwendet. Früher standen die Verfahren mit lebenden

Mikroorganismen im Vordergrund. Dazu gehört die Herstellung von alkoholischen

Getränken, Hefe-Fermentation von Teig bei der Brotherstellung, Konservierung von Gemüse

durch Fermentation mit Lactobazillen (z.B. Sauerkraut) oder die Herstellung von Käse (Uhlig,

1991). Gegen Ende des 19. Jahrhunderts wurde erkannt, dass Enzyme unabhängig von

lebenden Zellen wirken (Buchholz & Kasche, 1997). Heutzutage werden sowohl lebende

Zellen als auch isolierte Enzyme in der Industrie verwendet (Schmid et al., 2001).

Enzyme unterscheiden sich von den üblichen chemischen Katalysatoren in einigen wichtigen

Punkten: Sie weisen höhere Reaktionsgeschwindigkeiten auf, funktionieren unter milderen

Reaktionsbedingungen, sie haben größere Reaktionsspezifität und sind regulationsfähig (Voet

et al., 2002). Aufgrund ihrer Reaktionsspezifität entstehen bei enzymatischen Reaktionen

relativ reine Produkte, was die Abfallmenge reduziert (Marrs et al., 1999). Die milden

Reaktionsbedingungen, bei denen Enzyme arbeiten, senken den Energieverbrauch, was die

Produktionskosten und die Treibhausgasemissionen vermindert (Rozzel, 1999).

Enzyme werden in zahlreichen Industriezweigen in biokatalytischen Prozessen angewandt

(siehe Tab. 1.1.). Sie werden in der Lebensmitteltechnologie, bei der Papier-, Textil- und

Lederbehandlung, sowie für analytische und diagnostische Zwecke eingesetzt. Auch in der

pharmazeutischen und chemischen Industrie werden Enzyme verwendet Dabei ist die Stereo-,

Regio- und Substratspezifität der enzymatischen Katalyse in diesen Industriezweigen von

Einleitung 2

besonderer Bedeutung, weil dadurch Verbindungen synthetisiert werden, die mit

konventionellen chemischen Methoden schwer herzustellen sind (Schmid, 2006; Marrs et al.,

1999; Rozzel, 1999; Koeller & Wong, 2001)

Tab. 1.1.: Anwendungsgebiete und einige Beispiele für Herkunftsorganismen von biotechnisch genutzten Enzymen (Schmid, 2006; Uhlig, 1991)

Enzymtyp Anwendung Organismen

Proteasen Waschmittelzusatz Bacillus licheniformis

Mehl- und Backwaren Aspergillus oryzae

Käsereifung und Aroma Lederbehandlung Amylasen Stärke-Abbau Bacillus amyloliquefaciens

Papierherstellung Bacillus subtilis

Textilbehandlung Aspergillus oryzae Teig- und Backwaren- verarbeitung Lipasen Waschmittelzusatz Aspergillus nidulans Käsereifung und Aroma Cellulasen Waschmittelzusatz Trichoderma reesei

Früchteverwertung und Wein Aspergillus niger Futtermittelherstellung

1.2.1. Eignung der Enzymquellen für biotechnischen Einsatz

Ob ein Enzym zum technischen Einsatz kommt, wird durch das Verhältnis des

anwendungstechnischen Nutzens und dem Preis des Enzyms bestimmt (Schmid, 2006). Die

Kosten der Enzymproduktion und Aufarbeitung sinken mit steigendem Enzymgehalt in den

Enzymquellen. Bei der Suche nach neuen Enzymquellen können Mikroorganismen mithilfe

von Enzym-Assays auf die Produktion von gesuchten Enzymen getestet werden. Inwieweit

sich diese Mikroorganismen auch als Enzymproduzenten für enzymtechnische Verfahren

eignen, kann durch Untersuchungen der Enzymproduktion und der Enzymeigenschaften

herausgefunden werden (Buchholz & Kasche, 1997).

Viele Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit, diejenigen Enzyme verstärkt zu

synthetisieren, deren Substrate im Medium vorhanden sind. Bestimmte Bakterien produzieren

nur dann Amylasen, wenn Stärke als Kohlenstoffquelle in der Umgebung vorliegt. Andere

Kohlenstoffquellen, wie Glucose, können hingegen die Synthese der Amylasen reprimieren.

Solche Enzyme werden als induzierbare Enzyme bezeichnet. Enzyme, deren Synthese

Einleitung 3

unabhängig von den äußeren Faktoren ist und kontinuierlich stattfindet, werden als

konstitutive Enzyme bezeichnet (Ruttloff et al., 1978).

Um hohe Ausbeuten bei der Enzymsynthese zu erreichen, muss die Induktion und Repression

der Synthese berücksichtigt werden (Buchholz & Kasche, 1997). Eine maximale Synthese

induzierbarer Enzyme wird erst durch den Einsatz bestimmter Nährsubstrate, welche als

Induktoren wirken, erreicht. Als typische Induktoren sind Stärke (Amylase), Casein, Albumin

(Protease), Pektin (Pektinase), u.a. bekannt (Ruttloff et al., 1978).

1.3. Amylasen

Amylasen spalten Stärke und Glykogen durch Hydrolyse der α-1,4-glycosidischen Bindung

zu Dextrinen und Zuckern (Uhlig, 1991). Stärke ist ein wichtiges Reservepolysaccharid der

höheren Pflanzen (Ruttloff et al., 1978) und ist Hauptbestandteil der meisten Nahrungsmittel

und der wichtigste Energielieferant unserer Ernährung (Uhlig, 1991). Stärke setzt sich aus den

Bestandteilen Amylose und Amylopektin zusammen, die aus Glucoseuntereinheiten bestehen.

Amylose ist ein lineares Polymer, das aus 6.000 oder mehr α-1,4-glycosidisch verbundenen

Glucoseresten besteht. Amylopektin ist hingegen ein verzweigtes Molekül. Es setzt sich aus

etwa 2 Mio. α-1,4- und α-1,6-glycosidisch verbundenen Glucoseresten zusammen, wobei die

α-1,6-glycosidischen Bindungen etwa 5 % der Gesamtbindungen ausmachen (van den Maarel

et al., 2002).

Viele Bakterien können Stärke als Kohlenstoff- und Energiequelle für ihr Wachstum nutzen.

Dafür werden die Stärkemoleküle extrazellulär von den Bakterien zu transportablen

Molekülen gespalten, bevor sie in die Zelle aufgenommen und weiterverwertet werden. Eine

ganze Reihe Stärke-abbauender Enzyme, die eine große Vielfalt von Produkten liefern,

werden von diesen Mikroorganismen gebildet. Viele dieser Enzyme finden bei den

stärkeverarbeitenden, industriellen Prozessen Anwendung (van der Veen et al., 2000).

Man unterscheidet α-, β- und Glycoamylasen. α-Amylasen (1,4-α-D-glucan

glucanohydrolase; EC 3.2.1.1) hydrolysieren α-1,4-glycosidische Bindungen innerhalb des

Makromoleküls, wobei Glucose, Maltose und Grenzdextrine freigesetzt werden. β-Amylasen

(1,4-α-D-glucan maltohydrolase; EC 3.2.1.2) spalten Maltose vom nicht reduzierenden Ende

des Polysaccharids ab und Glycoamylasen (1,4-α-D-glucan glucohydrolase; 3.2.1.3) spalten

Glucose ebenfalls vom nicht reduzierenden Ende ab (Ruttloff et al., 1978;

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/).

Einleitung 4

1.4. Peptidasen

Proteolytische Enzyme (EC 3.4) katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen in

Proteinen und Peptiden. Sie werden in zwei Hauptgruppen, die Exo- und Endopeptidasen

unterteilt. Exopeptidasen spalten Peptidbindungen, die nahe dem C- oder N-Terminus liegen

und werden aufgrund ihres Reaktionsortes entweder als Amino- oder als Carboxypeptidasen

bezeichnet. Endopeptidasen spalten ketteninterne Peptidbindungen. Sie werden nach ihrem

katalytischen Mechanismus in Serin-, Aspartat-, Cystein- und Metalloproteasen unterteilt

(Rao et al., 1998).

Peptidasen kommen sowohl in Tieren als auch in Pflanzen und Mikroorganismen vor. Jedoch

haben die mikrobiologisch erzeugten Peptidasen technisch die größte Bedeutung (Uhlig,

1991). Die große Vielfalt der Peptidasen erregte weltweite Beachtung und es wurde versucht

diese Vielfalt physiologisch und biotechnologisch auszunutzen (Rao et al., 1998).

Serinproteasen (Subtilisine) werden als Waschmittelzusatz zur Entfernung von eiweißhaltigen

Verschmutzungen eingesetzt (Schmid, 2006). In der Lederindustrie werden Peptidasen zur

Entfernung von Haaren von den Tierhäuten verwendet und ersetzen somit den Einsatz von

giftigen Chemikalien (Rao et al., 1998). Auch in der Lebensmittelindustrie werden Peptidasen

eingesetzt. Bei der Verarbeitung von Teig bewirken Peptidasen den partiellen Abbau des

Getreide-Klebereiweißes (Gluten). Die Dehnbarkeit des Teiges wird erhöht, wodurch

verbessertes Gasrückhaltevermögen für das CO2 (Gärung) erreicht wird. Außerdem werden

Peptidasen zum Zartmachen von Fleisch (partieller Verdau des Muskelgewebes) (Schmid,

2006), zur Herstellung von Soja-Produkten und zur Synthese von Aspartam (kalorienfreier

Süßstoff) eingesetzt (Rao et al., 1998). Auch in der Grundlagenforschung spielen Peptidasen

eine wichtige Rolle. Ihre Fähigkeit, selektiv bestimmte Peptidbindungen zu spalten, wird bei

der Peptidsynthese und bei der Sequenzierung von Proteinen ausgenutzt (Rao et al., 1998).

1.5. Lipasen

Lipasen (Triacylglycerol acylhydrolase; EC 3.1.1.3) katalysieren sowohl die Hydrolyse als

auch die Synthese von Estern aus Glycerin und langkettigen Fettsäuren. Lipasen durchführen

diese Reaktionen mit hoher Regio- und Enantioselektivität, was sie zu wichtigen

Biokytalysatoren in der organischen Chemie macht. Viele Lipasen werden großtechnisch

produziert, wobei der Großteil von ihnen aus Pilzen und Bakterien stammt. Das kommerziell

wichtigste Anwendungsgebiet von Lipasen ist ihr Zusatz zu Detergenzien (Jaeger & Reetz,

1998).

Einleitung 5

Ein weiteres Anwendungsgebiet von Lipasen ist die Papierindustrie. Dabei werden Lipasen

zur Entfernung von Triglyceriden und Wachs aus Zellstoff bei der Papierherstellung

eingesetzt (Jaeger & Reetz, 1998). Außerdem kann beim Recycling-Prozess von Altpapier die

Drückerschwärze nach Vorbehandlung mit Lipasen, Cellulasen und Xylanasen leichter

entfernt werden (Schmid, 2006). Lipasen werden auch für die Synthese von Biopolymeren,

wie Polyester sowie Feinchemikalien, wie Medikamenten oder Duftstoffen, eingesetzt (Jaeger

& Eggert, 2002).

1.6. DNasen

DNasen gehören zu den Nukleasen. Sie katalysieren die Spaltung von

Desoxyribonukleinsäure (DNA) entweder durch die Hydrolyse von Phosphodiester-

Bindungen oder durch das Entfernen von Phosphat (Zenkova, 2004). Extrazelluläre

Nukleasen sind bei Bakterien selten. Ihre Produktion begrenzt sich auf eine kleine Anzahl von

Bakterien-Arten, die weit über das Reich der Eubakterien verteilt sind (Benedik & Strych,

1998).

DNasen werden in der Analytik eingesetzt. Bei der Isolierung von RNA werden DNasen

zugesetzt, um mögliche DNA-Kontaminationen zu entfernen (Lottspeich & Zobras, 1998).

Restriktionsendonukleasen, die bestimmte Sequenzen erkennen und schneiden, werden z.B.

bei der Erstellung von genetischen Fingerabdrücken (Fingerprinting) oder beim Klonieren

bestimmter DNA-Fragmente in Vektoren verwendet (Voet et al., 2002).

Bestimmte DNasen werden bei der Behandlung von Symptomen der Cystischen Fibrose

eingesetzt. Bei dieser Erbkrankheit kommt es durch Schleimbildung in den Atemwegen zur

dramatischen Behinderung der Atmung. Dabei wird die Viskoelastizität des Schleims durch

extrazelluläre DNA aus den Leukocyten drastisch erhöht. Durch Inhalationssprays, welche

DNasen enthalten, werden die Symptome gelindert (Schmid, 2006).

1.7. Ziel und Vorgehensweise der vorliegenden Arbeit

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden zwölf heterotrophe Bakterienstämme aus der

Ostsee, welche von Cyanobakterien aus der Stammsammlung der Arbeitsgruppe Marine

Mikrobiologie isoliert wurden, zunächst hinsichtlich der Produktion verschiedener

extrazellulärer Enzyme getestet. Im zweiten Teil wurde dann bei dem Stamm, der die höchste

Amylaseaktivität aufwies, die Expression der Amylase codierender Gene untersucht.

Außerdem sollte anhand der erhaltenen Ergebnisse beurteilt werden, ob dieser Stamm als

Enzymquelle für einen möglichen biotechnischen Einsatz geeignet ist.

Material und Methoden 6

2. Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Herkunft der marinen heterotrophen Bakterien

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden freundlicherweise von

Dipl.-Biologin Annina Hube (Universität Bremen, Abteilung Marine Mikrobiologie) zur

Verfügung gestellt. Die Organismen (siehe Tab. 2.1.) stammen aus der Ostsee bei Boiensdorf

und wurden von den Cyanobakterien Nodularia harveyana (Stammbezeichnung der

Heterotrophen Bo 53) und Oscillatoria brevis (Stammbezeichnung der Heterotrophen Bo 10)

isoliert. Die Stämme wurden von Annina Hube mithilfe der Sequenzierung und

Charakterisierung von Merkmalen einer Gruppe oder einige von ihnen sogar einer Art

zugeordnet (siehe Tab. 2.1).

Tab. 2.1.: Verwendete Bakterienstämme und deren Art bzw. Gruppenzugehörigkeit

Stamm Art Gruppe

Bo 10-09 Muricauda aquimarina Bacteroidetes

Bo 10-10 n.u. Bacteroidetes



Bo 10-19 Rhodobaca sp. Alpha-Proteobacteria

Bo 10-20 Roseobacter sp. Alpha-Proteobacteria

Bo 53-20 n.u. Gamma-Proteobacteria

Bo 53-33 Porphyrobacter sp. Alpha-Proteobacteria





2.1.2. Bacillus subtilis

Ein Bacillus subtilis-Stamm wurde von Dipl.-Biologe Helge Mühl (Universität Bremen,

Abteilung Marine Mikrobiologie) zur Verfügung gestellt. Aufgrund seiner Fähigkeit zur

Produktion großer Mengen extrazellulärer Amylasen (Helge Mühl, persönliche Mitteilung),

n.u.= noch unbekannt


wurde dieser Stamm als Positivkontrolle im Amylaseaktivitätstest nach der SDS-PAGE

eingesetzt.

2.2. Medien, Lösungen und Puffer

2.2.1. M1 (Medium 1)-Medium (modifiziert nach Widdel & Bak, 1992)

Die Komponenten des M1-Mediums sind in den Tabellen 2.2.-2.7. aufgeführt. Die KH2PO4-,

Spurenelement-, Se-W- und NH4Cl-Lösungen wurden als Stammlösungen angesetzt und

getrennt autoklaviert. Die 7-Vitamin-, Vitamin B12-, Riboflavin- und Thiamin-Lösungen

wurden ebenfalls als Stammlösungen angesetzt und sterilfiltriert (Minisart-Filter,

Porengröße 0,2 µm, Sartourius). Diese Lösungen wurden dem Medium nach dem

Autoklavieren steril zugesetzt. Als Kohlenstoffquellen dienten Stärke oder Maltose. Stärke

wurde vor dem Autoklavieren dem Medium zugesetzt. Maltose wurde in Aqua dest. gelöst,

sterilfiltriert (Minisart-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius) und dem Medium nach dem

Autoklavieren hinzugefügt.

Tab. 2.2.: Zusammensetzung des M1-Mediums

Komponenten g/l oder ml/l

NaCl 13,19 MgCl2 x 6 H2O 2,84 g KCl 0,36 g MgSO4 x 7 H2O 3,4 g CaCl2 x 2 H2O 0,74 g NaHCO3

0,095 g Aqua dest. ad 1000 ml KH2PO4-Lösung (50 g/l) 10 ml NH4Cl-Lösung (50 g/l) 10 ml Spurenelementlösung 2 ml Se-W-Lösung 1 ml 7-Vitamin-Lösung 1 ml Vitamin B12-Lösung (50 mg/l) l 1 ml Vitamin B2-Lösung 1 ml Vitamin B1-Lösung 1 ml


Tab. 2.3.: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das M1-Medium

Komponenten mg/l oder ml/l

FeSO4 x 7 H2O 2100 mg Na2-EDTA 5200 mg H3BO3 30 mg MnCl2 x 4 H2O 100 mg CoCl2 x 6 H2O 190 mg NiCl2 x 6 H2O 24 mg CuCl2 x 2 H2O 10 mg ZnSO4 x 7 H2O 144 mg Na2MoO4 x 2 H2O 36 mg

Die Spurenelemente wurden in 800 ml demineralisiertem Wasser gelöst, und der pH-Wert

wurde mit 5 M NaOH-Lösung vor dem Autoklavieren auf 6,0 eingestellt.

Tab. 2.4.: Zusammensetzung der Se-W-Lösung für das M1-Medium


NaOH 200 mg Na2SeO3 x 5 H2O 18 mg Na2WO4 x 2 H2O 18 mg Aqua dest. ad 1000 ml

Tab. 2.5.: Zusammensetzung der 7-Vitamin-Lösung für das M1-Medium


NaH2PO4 x H2O (3 mM) 414 mg Na2HPO4 x 2 H2O (7 mM) 1246 mg Vitamin H1 40 mg D-(+)-Biotin 20 mg Niacin 100 mg Ca-D-(+)-Pantothenat 50 mg Vitamin B6 150 mg Folsäure 40 mg Liponsäure 20 mg Aqua dest. ad 1000 ml

Tab. 2.6.: Zusammensetzung der Vitamin B2-Lösung für das M1-Medium


NaH2PO4 x H2O (25 mM) 3450 mg Vitamin B2 50 mg Aqua dest. ad 1000 ml


Tab. 2.7.: Zusammensetzung der Vitamin B1-Lösung für das M1-Medium


NaH2PO4 x H2O (25 mM) 3450 mg Vitamin B1 50 mg Aqua dest. ad 1000 ml

2.2.2. ASN (Artificial Seawater Nutrients)-Medium (Rippka et al., 1979, modifiziert nach

Rethmeier, 1995)

Die Komponenten des ASN-Mediums sind in den Tabellen 2.8 und 2.9 aufgeführt. Na2CO3

wurde in demineralisiertem Wasser gelöst und getrennt autoklaviert. Nach dem Abkühlen

wurde es dem Medium zugegeben.

Die K2HPO4-, Spurenelement- und Eisen-Ammonium-Citrat-Lösungen wurden als

Stammlösungen angesetzt und getrennt autoklaviert. Die Vitamin B12-Lösung wurde hingegen

sterilfiltriert (Minisart-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius). Diese Lösungen wurden dem

Medium nach dem Autoklavieren steril zugesetzt.

Tab. 2.8.: Zusammensetzung des ASNIII/2-Mediums


NaCl 12,5 g MgCl2 x 6 H2O 1 g KCl 0,25 g MgSO4 x 7 H2O 1,75 g CaCl2 x 2 H2O 0,25 g NaNO3

0,75 g Agar (nur für feste Medien) 15 g Aqua dest. ad 900 ml Na2CO3 (in 100 ml demineralisiertem Wasser lösen) 0,12 g K2HPO4 x 3 H2O-Lösung (4 g/l) 2,5 ml Spurenelementlösung 0,5 ml Fe-NH4-Citrat-Lösung (6 g/l) 0,25 ml Vitamin B12-Lösung (10 mg/l) 0,5 ml


Tab. 2.9.: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das ASNIII/2-Medium

Komponenten g/l pder ml/l

Na3-Citrat x 2 H2O 3 g Na3-EDTA x 2 H2O 5,5 g H3BO3 2,86 g MnCl2 x 4 H2O 1,81 g ZnSO4 0,222 g Na2MoO4 x 2 H2O 0,318 g CuSO4 x 5 H2O 0,079 g Co(NO3)2 x 6 H2O 0,0494 g Aqua dest. 1000 ml

2.2.3. LB (Luria-Bertani)-Medium (Sambrook et al., 1989)

Die Zusammensetzung des LB-Mediums ist in Tab. 2.10 aufgeführt. Nach dem Auflösen der

einzelnen Komponenten in Aqua dest. wurde das Medium autoklaviert.

Tab. 2.10.: Zusammensetzung des LB-Mediums


Trypton 10 g Hefeextrakt 5 g NaCl 10 g Aqua dest. ad 1000 ml

2.2.4. Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Enzyme

Für den Nachweis der extrazellulären Enzyme wurde das ASNIII/2-Medium (siehe Kap. 2.2.2.)

verwendet. Dafür wurden den Medien 15 g/l Agar vor dem Autoklavieren zugegeben. Nach

dem Autoklavieren wurden die Medien auf ca. 50 °C abgekühlt und die Na2CO3-, K2HPO4-,

Spurenelement-, Eisen-Ammonium-Citrat- und Vitamin B12-Lösungen hinzugefügt. Der pH-

Wert der fertigen Medien wurde mit 1 M NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Anschließend

wurden die Medien in Aliquots von 20-30 ml in Petrischalen gegossen. Die Platten wurden

bis zur Verwendung bei 4 °C im Dunkeln und gegen Austrocknung geschützt gelagert.

Die weiteren Zusätze zu den Medien bzw. die Abweichungen in der Herstellung sind jeweils

unten aufgeführt. Pepton, Fleisch- oder Hefeextrakt dienten als Energie- und

Kohlenstoffquellen, um gutes Wachstum der verschiedenen Bakterienstämme zu

gewährleisten und erfüllten in dem eigentlichen Enzymtest keine Funktion.


2.2.4.1. Stärke-Agar für den Amylase-Nachweis (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994)

Dem ASNIII/2-Medium wurden vor dem Autoklavieren 2 g/l lösliche Stärke und 10 g/l Pepton

zugegeben. Das Medium wurde bei 115 °C für 10 min autoklaviert.

2.2.4.2. DNA-Toluidinblau-Agar für den DNase-Nachweis (modifiziert nach Schreier,

1969)

Dem ASNIII/2-Medium wurden vor dem Autoklavieren 100 mg/l Toluidinblau (AppliChem)

und 10 g/l Fleischextrakt zugegeben. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden 0,5 g/l DNA

aus der DNA-Stammlösung (siehe Kap. 2.2.5.) hinzugegeben.

2.2.4.3. Magermilch-Agar für den Peptidase-Nachweis (modifiziert nach Gerhardt et al.,

1994)

Dem ASNIII/2-Medium wurden 10 g/l Hefeextrakt zugegeben und anschließend bei 115°C

autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden dem Medium 20 g/l

Magermilchpulver aus der Magermilchpulver-Lösung (siehe Kap. 2.2.6.) hinzugegeben.

2.2.4.4. Olivenöl-Rhodamin-B-Agar für den Lipase-Nachweis (modifiziert nach Kouker

& Jaeger, 1987)

Dem ASNIII/2-Medium wurde vor dem Autoklavieren 10 g/l Fleischextrakt hinzugefügt. Nach

dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurden dem Medium 25 g/l (2,5 % (w/v)) steriles Olivenöl

(Lidl) und 0,01 g/l Rhodamin B aus einer sterilen wässrigen Lösung mit 1 mg/ml Rhodamin B

zugegeben. Das Medium wurde auf einer Rührplatte gut gemischt und in Petrischalen

gegossen.

2.2.5. DNA-Stammlösung für den DNase-Nachweis

Es wurden 0,5 g DNA aus Fischsperma in 10 ml sterilem 10 mM Tris-HCl, pH 8 über Nacht

bei 4°C und mäßigem Rühren gelöst. Für die Sterilisation wurde vor dem Lösen der DNA ein

Tropfen Chloroform hinzugegeben.

2.2.6. Magermilchpulver-Lösung für den Peptidase-Nachweis

Es wurden 20 g (handelsübliches) Magermilchpulver in 200 ml Aqua dest. gelöst und bei 110

°C für 10 min autoklaviert.


2.2.7. Lugolsche Lösung

Bei der Lugolschen Lösung handelt es sich um eine 1 %ige Iod-Kaliumjodid-Lösung. Dazu

wurden Iod und Kaliumjodid im Verhältnis 1:2 in Aqua dest. gelöst.

2.2.8. Bradford-Reagenz (Bradford, 1976)

Für die Herstellung des Bradford-Reagenz wurden 40 mg des Farbstoffes Serva Blau G-250

in 50 ml Ethanol (absolut) und 100 ml 85 % iger Orthophosphorsäure gelöst und anschließend

mit Aqua dest. auf 1 l aufgefüllt. Das Bradford-Reagenz wurde dreimal durch Papierfilter

(Schleicher & Schuell 595 1/2 Faltenfilter) filtriert und in einer dunklen Flasche bei 4 °C

gelagert.

2.2.9. 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5)

Lösung A : Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat [0,2 mol/l]: 27,6 g/l

Lösung B: di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat [0,2 mol/l]: 35,6 g/l

Für die Herstellung von 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) wurden 8 ml Lösung A, 42 ml

Lösung B und 50 ml Aqua dest. miteinander vermischt.

2.2.10. 0,15 M Zitronensäurephosphat-Puffer (pH 7,5)

Lösung A: di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat [0,2 mol/l]: 35,6 g/l

Lösung B: Zitronensäure-Monohydrat [0,1 mol/l]: 21 g/l

Für den gewünschten pH-Wert von 7,5 wurden 88,7 ml Lösung A und 11,3 ml Lösung B

miteinander vermischt.

2.2.11. Stärkepuffer für die Amylase-Aktivitätsfärbung

Für die Herstellung des Stärkepuffers wurde der Zitronensäurephosphat-Puffer (siehe Kap.

2.2.10.) mit 10 g/l löslicher Stärke versetzt und anschließend aufgekocht, um die Stärke zu

lösen.

2.2.12. 2 x SDS-Probenpuffer (modifiziert nach Laemmli, 1970)

Die Zusammensetzung des 2x SDS-Probenpuffers, sowie die Endkonzentrationen der

verschiedenen Substanzen im Puffer sind in Tab. 2.11. dargestellt.


Tab. 2.11.: Zusammensetzung des 2 x SDS-Probenpuffers

Substanz Zugabe [µµµµl] Endkonzentration im Puffer

10 % (w/v) SDS 400 4 % 1 % (w/v) Bromphenolblau 200 0,2 % 87 % (w/v) Glycerin 230 20 % 1 M Tris-HCl (pH 6,8) 170 170 mM

2.2.13. Lösungen für die Silbernitratfärbung

2.2.13.1. Fixierer A

Zur Herstellung dieser Lösung wurden 50 ml Methanol mit 10 ml Eisessig vermischt und auf

100 ml mit Aqua dest. aufgefüllt.

2.2.13.2. Fixierer B

Für die Herstellung von Fixierer B wurden 5 ml Methanol mit 7 ml Eisessig vermischt und

auf 100 ml mit Aqua dest. aufgefüllt.

2.2.13.3. Fixierer C

Fixierer C ist eine 10 %ige wässrige Glutaraldehyd-Lösung.

2.2.13.4. Entwickler

Entwickler ist eine wässrige Lösung, die zu 3 % aus Na2CO3 und zu 0,0185 % aus

Formaldehyd besteht.

2.3. Methoden

2.3.1. Hälterung der Organismen

Die Reinkulturen der verschiedenen Stämme wurden in Petrischalen auf festem ASN-Medium

(siehe Kap. 2.2.2.) von Dipl.-Biologin Annina Hube für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

Zur Erhaltung von Stammkulturen wurde zunächst von den einzelnen Reinkulturen etwas

Zellmaterial mit einer Impföse von den Platten entnommen und in jeweils 30 ml flüssiges

ASNIII/2-Medium mit 10 g/l Fleischextrakt in 50 ml Erlenmeyerkolben überführt. Nach zwei

Tagen Inkubation auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300

Incubator Shaker) bei 120 rpm und 21 °C wurden die Stämme durch Begutachten des

mikroskopischen Bildes (Zeiss Jürgens Mikroskop) auf Reinheit überprüft. Anschließend


wurde von den Reinkulturen jeweils 200 µl in Eppendorfcups überführt und mit sterilem

87 %igen (w/v) Glycerin auf 1 ml aufgefüllt. Die auf diese Weise präparierten Stammkulturen

wurden bei -80 °C gelagert.

Zur Reaktivierung wurde aus den Eppendorfcups das aufgetaute Zellmaterial mit einer

Impföse entnommen und auf feste Nährböden (ASNIII/2 mit 10 g/l Fleischextrakt)

ausgestrichen. Die Platten wurden mit Parafilm gegen Austrocknen geschützt und bis zum

Anwachsen der Kulturen bei 21 °C inkubiert. Danach wurden diese Platten bei 4 °C gelagert

und dienten als Stammplatten zum Animpfen von flüssigen und festen Medien.

2.3.2. Assays für die Detektion von extrazellulären Enzymen

Im ersten Teil dieser Arbeit sollten zunächst die in Tab. 2.1 aufgeführten Stämme hinsichtlich

der Produktion von extrazellulären Enzymen untersucht werden.

2.3.2.1. Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al., 1994)

Bei diesem Test wurden die Stärke-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.1.) mit den zu

untersuchenden Stämmen von den Stammplatten (siehe Kap. 2.3.1.) punktförmig beimpft und

2-9 Tage bei 21 °C inkubiert. Danach wurden die Bakterien vorsichtig von den Agarplatten

entfernt und die Platten für 2 min mit Lugolscher Lösung (siehe Kap. 2.2.7.) überschichtet.

Das in dieser Lösung enthaltene Iod-Kaliumjodid färbt hochmolekulare Stärke dunkelblau an.

Amylase-positive Stämme spalten die Stärkepolymere in ihrer Umgebung. Dies führte dazu,

dass nach dem Abgießen der Lugolschen Lösung an den Stellen, wo sich diese Stämme

befanden, farblose Zonen auftraten.

2.3.2.2. DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar (modifiziert nach Schreier, 1969)

DNase-Toluidinblau-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.2.) wurden punktförmig beimpft und bei

21 °C inkubiert. DNase-positive Kolonien konnten durch die Bildung eines rosafarbenen Hofs

auf dem ansonsten blau gefärbten Agar identifiziert werden. Die Platten wurden alle 2-4 Tage

nach Farbveränderungen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert.

2.3.2.3. Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar (modifiziert nach Gerhardt et al.,

1994)

Magermilchpulverhaltige Agaplatten (siehe Kap. 2.2.4.3.) wurden punktförmig mit den zu

untersuchenden Stämmen beimpft und bei 21 °C inkubiert. Peptidase produzierende Kolonien

ließen sich durch die Entstehung eines klaren Hofes in dem trüben Agar identifizieren. Die


Entstehung der klaren Höfe ist auf die Hydrolyse des im Magermilchpulver enthaltenen

Caseins zurückzuführen. Die Platten wurden alle 2-4 Tage auf das Vorhandensein von klaren

Höfen untersucht und bis zu drei Wochen inkubiert.

2.3.2.4. Lipase-Nachweis auf Olivenöl-Rhodamin-B-Agar (modifiziert nach Kouker &

Jaeger, 1987)

Bei diesem Test wurden die olivenölhaltigen Agarplatten (siehe Kap. 2.2.4.4.) punkförmig

beimpft. Lipase-Aktivität konnte mittels Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 360 nm

anhand der Fluoreszenz des feiwerdenden und sich im Wasser lösenden Rhodamin B

nachgewiesen werden. Die Platten wurden bis zu vier Wochen lang inkubiert und alle 5-7

Tage mittels UV-Bestrahlung auf das Vorhandensein der Lipase-Aktivität untersucht.

2.3.3. Methoden zur Anreicherung und Bestimmung von Proteinen

2.3.3.1 Anzucht der Kulturen im Flüssigmedium

Für die Produktion der extrazellulären Amylasen wurden sechs 100 ml Erlenmeyerkolben mit

jeweils 50 ml M1-Medium mit 10 g/l Maltose und sechs weitere 100 ml Erlenmeyerkolben

mit jeweils 50 ml M1-Medium mit 5 g/l löslicher Stärke befüllt. Diese Medien wurden mit

Stamm Bo 10-09 (siehe Tab. 2.1.) von einer Stammplatte (siehe Kap. 2.3.1) beimpft und bei

21°C auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker)

bei 120 rpm 3 Wochen lang inkubiert. Die Aufteilung der 300 ml der jeweiligen Medien in 50

ml Fraktionen wurde vorgenommen, weil aus Vorversuchen bekannt war, dass Stamm

Bo 10-09 in dem M1-Medium mit Stärke in großem Mediumvolumen nicht anwächst.

2.3.3.2. Anzucht der Bacillus subtilis-Kultur

Ein 50 ml Erlenmeyerkolben wurde mit 20 ml LB-Medium (siehe Kap. 2.2.3.) gefüllt.

Anschließend wurden dem Medium 2 g/l unsterile lösliche Stärke hinzugegeben und das

Medium beimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (New

Brunswick Scientific innova 4000 Incubator Shaker) bei 100 rpm herangezogen.

2.2.3.3. Herstellung zellfreier Kulturüberstände

Die Flüssigkulturen (siehe Kap. 2.3.3.1) wurden in Zentrifugenbecher überführt und für 30

min bei 4 °C und 10.000 x g in einer Zentrifuge (Beckman AvantiTM J-25) zentrifugiert. Die

Überstände wurden in neue Zentrifugenbecher überführt und erneut unter gleichen


Bedingungen für 30 min zentrifugiert. Zur Entfernung der restlichen Mikroorganismen aus

den Überständen wurden diese mit Hilfe einer Pumpe (Jürgens) über einen Cellulose-Acetat-

Filter (Sartorius) mit einer Porengröße von 0,2 µm filtriert. Die sterilen Überstände wurden

bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Zur Herstellung eines zellfreien Überstandes der Bacillus subtilis-Übernachtkultur wurden

von dieser jeweils 1 ml in zwei 1,5 ml Eppendorfcups überführt und in einer Zentrifuge

(Heraeus Instruments) bei 12.000 rpm abzentrifugiert. Anschließend wurden die Aliquots

vereinigt und sterilfiltriert (Minisart-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartourius).

2.3.3.4. Ammoniumsulfatfällung

Das Aussalzen der Proteine durch die Zugabe von Ammoniumsulfat ist die älteste und die am

häufigsten angewendete Methode zur Proteinfällung. Ammoniumsulfat vergrößert

hydrophobe Effekte in der Lösung und fördert Proteinaggregationen über hydrophobe

Wechselwirkungen (Lottspeich & Zobras, 1998). Zur Fällung der Proteine wurde den

Kulturüberständen (siehe Kap. 2.2.3.3.) unter Rühren in einem Eisbad Ammoniumsulfat bis

zu einer Sättigung von 80 % zugegeben. Als Kontrollen wurden 250 ml unbeimpftes M1-

Medium mit 0,5 % Stärke und 250 ml unbeimpftes M1-Medium mit 1 % Maltose eingesetzt

und der gleichen Behandlung unterzogen. Mit diesen Kontrollen wurden zuvor auch die in

den Kap. 2.3.3.1 und 2.3.3.2 beschriebenen Arbeitsschritte durchgeführt.

Nach der vollständigen Zugabe des Ammoniumsulfates zu den Ansätzen wurden diese für

weitere 30 min in einem Eisbad gerührt und anschließend bei 10.000 x g für 40 min und bei

4 °C zentrifugiert (Beckman AvantiTM J-25). Die Überstände wurden entfernt und die Pellets

in jeweils 3 ml 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) resuspendiert. Zur Entsalzung wurden

die Proben in Dialyseschläuche mit einer Porengröße von 12-14 kDa überführt und über

Nacht unter Rühren bei 4 °C gegen 0,1 M Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,5) dialysiert.

2.3.3.5. Proteinbestimmung (Bradford, 1976)

Bei der Proteinbestimmung nach Bradford (1976) wird der Farbstoff Serva Blau G-250

(Coomassie Brillantblau G-250) eingesetzt. Dieser Farbstoff bindet recht unspezifisch an

kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten der Proteine. Die Komplexbildung

zwischen Farbstoff und Protein bewirkt die Stabilisierung des Farbstoffes in seiner

unprotonierten, anionischen Sulfonat-Form, wodurch sich das Absorptionsmaximum von

Coomassie Brillantblau G-250 von 465 zu 595 nm verschiebt (Lottspeich & Zobras, 1998).

Somit kann der Farbstoff-Proteinkomplex photometrisch bei 595 nm bestimmt werden.


Für die Proteinbestimmung wurden 50 µl Probe, 50 µl 2 M NaOH und 1 ml Bradford-

Reagenz (siehe Kap. 2.2.8.) in ein Eppendorfcup gegeben und sofort auf einem Whirl-Mixer

gemischt. Nach 90 s wurde die Absorption bei 595 nm in einem Photometer (Novaspec II

Farmacia) in Kunststoff-Einmalküvetten gegen den Leerwert (entsprechendes Medium oder

0,1 M Natrium-Phosphatpuffer) gemessen. Eine Eichkurve wurde mit Rinderserumalbumin

(Stammlösung 0,1 mg/ml in 1 M NaOH) im Bereich von 0 bis 10 µg erstellt.

2.3.4. Methoden zur Auftrennung und Detektion von Proteinen

2.3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert nach Laemmli,

1970)

Zur Analyse der extrazellulären Amylase wurden die mit Ammoniumsulfat-gefällten Proteine

mittels der SDS-PAGE aufgetrennt. Bei dieser Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese

wird das anionische Detergenz SDS (sodium dodecyl sulfate) benutzt. SDS überdeckt die

Eigenladungen der Proteine, so dass Micellen mit konstanter negativer Ladung pro

Masseneinheit entstehen. Dadurch werden bei dieser Methode die Proteine im Wesentlichen

nach ihrer Größe aufgetrennt (Lottspeich & Zobras, 1998).

Die Ammoniumsulfat-gefällten Proben (siehe Kap. 2.3.3.4.) wurden im Verhältnis 1:2 mit

dem Probenpuffer (siehe Kap. 2.2.12.) versetzt. Auf die Zugabe von Disulfidbrücken-

reduzierenden Substanzen und auf die Hitzedenaturierung der Proben wurde verzichtet, da

dies zum Verlust der Enzymaktivität führen würde.

Die Auftrennung erfolgte in einer vertikalen XCell SureLockTM Novex Mini-Cell

Elektrophoresekammer (Invitrogen). Als Laufpuffer diente der 1:20 verdünnte NuPAGE

MOPS-SDS-Laufpuffer (Invitrogen). Als Proteinmarker wurde ein vorgefärbter PageRuler

Marker (Fermentas) mit Molekulargewichten von 10 bis 170 kDa eingesetzt. Die Geltaschen

des fertigen NuPAGE 12 % Bis-Tris Gels (Invitrogen) wurden mit 12 µl Probe bzw. 5µl

Proteinmarker beladen. Die Auftrennung wurde bei 4 °C mit 150 V, 70 mA und 10 W für ca.

90 min durchgeführt.

2.3.4.2. Amylase-Aktivitätsfärbung im Gel nach SDS-PAGE (modifiziert nach Kim

et al., 1995; Lacks & Springhorn, 1980)

Mit der Amylase-Aktivitätsfärbung kann die Amylaseaktivität der Proteinbanden im Gel nach

der SDS-PAGE nachgewiesen werden.


Nach der Auftrennung der Proteine durch die Elektrophorese wurde das Gel mit Aqua dest.

gespült und anschließend 3 x 15 min bei 21 °C und 70 rpm auf einem Rotationsschüttler (New

Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) mit Zitronensäure-Phosphatpuffer (siehe

Kap. 2.2.10.) gewaschen. Danach wurde dieser durch den Stärkepuffer (siehe Kap. 2.2.11.)

ersetzt und das Gel bei gleichen Bedingungen für 1 h inkubiert. Anschließend wurde der

Puffer abgegossen und das Gel gut mit Aqua dest. gespült, bis die anhaftende Stärke von der

Oberfläche des Gels entfernt war. Die Färbung erfolgte in Lugolscher Lösung (siehe Kap.

2.2.7.) für 2 min.

Die Amylaseaktivitäts-Zonen sollten als helle Bereiche im dunkelblau angefärbten Gel

erscheinen.

2.3.4.3. Silbernitratfärbung der Proteine

Die durch die SDS-PAGE aufgetrennten Proteine sollten nach der Amylase-Aktivitätsfärbung

mit 0,1 %igem Silbernitrat nach Wiechmann (1993) angefärbt und detektiert werden. Alle

Einzelschritte der Färbung erfolgten unter Schwenken des Gels auf einem Rotationsschüttler

(New Brunswick Scientific innova 2300 Incubator Shaker) bei 80 rpm und RT.

Zur Fixierung der Proteine wurde das Gel nacheinander für 30 min in Fixierer A (siehe Kap.

2.2.13.1.), für 20 min in Fixierer B (siehe Kap. 2.2.13.2.) sowie für 20 min in Fixierer C

(siehe Kap. 2.2.13.3.) inkubiert. Zum Waschen wurde das Gel mit 100 ml Aqua dest. mittels

eines Folienschweißgerätes (Petra Electrinic vacufix electron FS500A) in eine Folie

eingeschweißt und für mindestens 30 min inkubiert. Anschließend wurde eine Ecke der Folie

aufgeschnitten, und es wurden 0,5 mg Dithiothreitol (DTT) in 1 ml Aqua dest.

(Endkonzentration 5µg DTT/ml) zugegeben. Die Folie wurde verschweißt und das Gel für 20

min mit DTT zur Reduktion der Proteine inkubiert. Erneut wurde eine Ecke der Folie

aufgeschnitten und die DTT-Lösung durch 100 ml 0,1 %ige Silbernitat-Lösung ausgetauscht.

Zur Anbindung der Silber-Ionen an die Proteine wurde das Gel für 20 min in der Silbernitrat-

Lösung inkubiert. Danach wurde das Gel aus der Folie entnommen, mit Aqua dest. gespült

und zweimal mit Entwickler (siehe Kap. 2.2.13.4.) überschichtet. Sobald eine gute Anfärbung

der Proteinbanden zu erkennen war, wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,3 M

Zitronensäure-Lösung gestoppt. Anschließend wurde das Gel mit Aqua dest. gewaschen und

in einer 0,03 %igen Na2CO3-Lösung für 10 min konserviert.


2.4. Chemikalien

Wenn nicht anders vermerkt, wurden alle Chemikalien in p.a.-Qualität von den Firmen

Merck, Sigma-Adrich, Serva, Fluka, Riedel de Häen sowie Acros Organics bezogen.

Ergebnisse 20

3. Ergebnisse

3.1. Produktion extrazellulärer Enzyme auf festen Medien

Es wurden 12 Stämme mariner heterotropher Bakterien hinsichtlich der Produktion

extrazellulärer Amylasen, DNasen, Peptidasen und Lipasen untersucht (siehe Kap. 2.3.2.). In

Tab. 3.1. sind die Ergebnisse der Plattentests dargestellt.

Tab. 3.1.: Produktion von Amylase, DNase, Peptidase und Lipase durch verschiedene marine heterotrophe Stämme

Stamm Amylase DNase Peptidase Lipase

Bo 10-09 + + - - Bo 10-10 + - - - Bo 10-13 + - - - Bo 10-15 - - - - Bo 10-19 - - - - Bo 10-20 + - - - Bo 53-20 - - - + Bo 53-33 + - - - Bo 53-34 + - - - Bo 53-37 - + + + Bo 53-39 - - - - Bo 53-45 + + - -

+ = positives Testergebnis - = negatives Testergebnis

Wie aus Tab. 3.1. ersichtlich, ist Amylase von den vier getesteten Enzymen das am häufigsten

vorkommende extrazelluläre Enzym bei den untersuchten Bakterienstämmen. Dabei konnte

bei sieben von insgesamt 12 Stämmen die Fähigkeit zur Produktion extrazellulärer Amylase

festgestellt werden. Bei diesen Stämmen handelt es sich um Vertreter der α-Proteobakterien

und der Bacteroidetes-Gruppe (siehe Tab. 2.1. und 3.1.). Als DNase-positiv erwiesen sich drei

Stämme, die alle der Bacteroidetes-Gruppe angehören (siehe Tab. 2.1. und 3.1.). Peptidase

könnte nur bei Stamm Bo 53-37 nachgewiesen werden. Bei zwei Stämmen konnte die

Fähigkeit zur Produktion extrazellulärer Lipase festgestellt werden. Dabei ist einer dieser

Stämme ein Vertreter der γ-Proteobakterien und der andere Stamm gehört der Bacteroidetes-

Gruppe an.

In Abb. 3.1. sind Beispielplatten für den Nachweis extrazellulärer DNasen, Amylasen und

Proteasen dargestellt.

Ergebnisse 21

Abb. 3.1.: Beispielplatten für den Nachweis der Produktion von extrazellulären Enzymen. A: DNase-Nachweis auf DNA-Toluidinblau-Agar; positive Kolonien konnten anhand der Bildung eines rosafarbenen Hofes um die Kolonien identifiziert werden. B: Amylase-Nachweis auf Stärke-Agar; positive Kolonien waren nach dem Überschichten mit Lugolscher Lösung anhand farbloser Zonen zu erkennen. C: Peptidase-Nachweis auf Magermilch-Agar; positive Kolonien konnten anhand klarer Hydrolyse-Höfe identifiziert werden. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (hp photosmart 715) und bei A und B zusätzlich mit Hilfe einer Durchlicht-Einrichtung (Schütt Labortechnik Kolonien-Zähler). Stämme mit Enzymaktivitäten wurden mit einem Pfeil markiert. Stämme mit der höchsten Amylaseaktivität sind bei B mit einem grünen Pfeil markiert.

Mit den Plattentests konnte gezeigt werden, dass Amylase von den getesteten Enzymen das

am häufigst vorkommende extrazelluläre Enzym bei den untersuchten Stämmen ist. Daher

wurden die Stämme mit Amylaseaktivität für weitere Arbeit ausgewählt und näher untersucht.

3.1.1. Bestimmung der Amylaseaktivität auf Stärke-Agar

Es sollte untersucht werden, welcher von den sieben ausgewählten Amylase-produzierenden

Stämmen die höchste Amylaseaktivität aufweist. Dieser Test wurde, wie im Kap. 2.3.2.1.

beschrieben, durchgeführt. Die Amylaseaktivität wurde anhand der Größe der Klarzone auf

Stärke-Agar im Vergleich mit dem Kolonie-Durchmesser nach 2, 3, 5 und 9 Tagen Inkubation

bestimmt.

Tab. 3.2.: Amylaseaktivität bei Amylase-positiven Stämmen auf festen Medien nach 2, 3, 5 und 9 Tagen Inkubation

Zeit [d] 2 3 5 9 Stamm

Bo 10-09 +++ +++ +++ +++ Bo 10-10 + ++ ++ +++ Bo 10-13 + + ++ +++ Bo 10-20 - + + + Bo 53-33 ++ ++ ++ +++ Bo 53-34 + ++ ++ +++ Bo 53-45 +++ +++ +++ +++

- = keine Amylaseaktivität: keine Klarzone; + = geringe Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie < Kolonie-Durchmesser; ++ = mittlere Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie entspricht dem Kolonie-Durchmesser; +++ = starke Amylaseaktivität: Klarzone um die Kolonie > Kolonie-Durchmesser

B CA

Ergebnisse 22

Die Ergebnisse in Tab. 3.2. zeigen, dass die Stämme Bo 10-09 und Bo 53-45 nach 2, 3 und 5

Tagen Inkubation die höchste Amylaseaktivität aufweisen (siehe Abb. 3.1. B). Vermutlich

handelt es sich bei den beiden Isolaten um ein Duplikat und somit um die gleiche Art (Annina

Hube, persönliche Mitteilung). Daher wurde der Stamm Bo 10-09 für die weiteren

Untersuchungen ausgewählt.

3.2. Untersuchungen zur Expression der Amylase codierender Gene

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde bei Stamm Bo 10-09, welcher die höchste

Amylaseaktivität aufwies (siehe Kap. 3.1.1.), die Expression der Amylase codierenden Gene

untersucht. Dabei sollte festgestellt werden, ob es sich bei der Amylase um ein konstitutives

oder induzierbares Enzym handelt. Dazu wurden Medien, welche Stärke oder Maltose als

einzige Energie- und Kohlenstoffquelle enthalten, mit diesem Stamm beimpft. Nach

ausreichender Inkubation sollten zellfreie Überstände von den Kulturen gewonnen und die

darin enthaltenen Proteine gefällt werden. Anschließend sollten die Proteine der

verschiedenen Ansätze mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf das Vorhandensein von

Amylaseaktivität getestet werden.

3.2.1. Anreicherung der Amylase

In Abb. 3.2. sind die Kulturen des Stammes Bo 10-09 sowie Negativkontrollen (unbeimpfte

Medien) nach dreiwöchiger Inkubation dargestellt.

Abb.3.2.: Kulturen des Stammes Bo 10-09 nach dreiwöchiger Inkubation in M1-Medium mit 0,5 % Stärke oder 1 % Maltose und die entsprechenden Negativkontrollen. Aufgenommen mittels einer Digitalkamera (hp photosmart 715). S = Kulturen, die in M1-Medium mit Stärke herangezogen wurden SNEG = unbeimpftes M1- Medium mit Stärke MNEG = unbeimpftes M1-Medium mit Maltose M = Kulturen, die in M1-Medium mit Maltose herangezogen wurden

Die Kulturen, welche auf Stärke gewachsen sind, weisen eine rötliche Färbung auf. Die

Färbung der Kulturen, die auf Maltose gewachsen sind, ist gelblich. Das unbeimpfte Medium

S SNEG MNEG M

Ergebnisse 23

mit Stärke ist aufgrund der ungelösten Stärkepolymere sehr trüb, wohingegen das Medium

mit Maltose klar ist.

Die Anreicherung der Amylase aus den Kulturüberstanden des Stammes Bo 10-09 (siehe

Kap. 2.3.3.3.) erfolgte mittels der Ammoniumsulfatfällung. Die Proteinkonzentrationen in den

zellfreien Kulturüberstanden waren unter der Detektionsgrenze der Methode nach Bradford

(siehe Kap. 2.3.3.5.).

3.2.2. Ammoniumsulfatfällung

Die Proteine in den Kulturüberständen, welche 1 % Maltose oder 0,5 % Stärke enthielten,

wurden bei einer 80 % igen Sättigung mit Ammoniusulfat gefällt. Die Fällung der Proteine in

dem Ansatz, welches Stärke beinhaltete, erwies sich als problematisch. Es hat sich

herausgestellt, dass Stärke bei Zugabe von Ammoniumsulfat ausfällt. Dadurch wurde nach

der Zentrifugation ein großes Stärke-Protein-Pellet erhalten.

Nach der Dialyse betrug die Proteinkonzentation in dem Ansatz mit Stärke 1,74 µg/ml und in

dem Ansatz mit Maltose 0,6 µg/ml.

3.2.3. Amylase-Aktivitätsbestimmung im SDS-Gel

Mit Hilfe der Amylase-Aktivitätsfärbung sollten die Proben auf Anwesenheit von Amylase

getestet werden. Auf diese Weise sollte überprüft werden, ob der Stamm Bo-10-09 die

Fähigkeit besitzt, sowohl bei Anwesenheit von Stärke als auch bei Anwesenheit von Maltose,

extrazelluläre Amylasen zu produzieren.

In Tab. 3.3. ist das Auftragsschema der Proben im Gel für die SDS-PAGE dargestellt.

Ergebnisse 24

Tab. 3.3.: Auftragsschema der Proben im Gel zum Nachweis von Amylase

Tasche Probe 1 PageRuler Proteinstandard 2 - 3 - 4 Kulturüberstand von Bo 10-09 mit 1 % Maltose nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) 5 - 6 - 7 unbeimpftes Medium mit 1 % Maltose nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) 8 - 9 - 10 Kulturüberstand von Bo 10-09 mit 0,5 % Stärke nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) 11 - 12 unbeimpftes Medium mit 0,5 % Stärke nach Ammoniumsulfatfällung (siehe Kap. 2.3.3.3.) 13 - 14 - 15 zellfreier Übertand der Bacillus subtilis-Übernachtkultur (siehe Kap. 2.3.3.3.)

- = Tasche wurde nicht beladen

In Abb. 3.3. ist das SDS-Gel nach der Überschichtung mit Lugolscher Lösung dargestellt.

Abb. 3.3.: SDS-Gel nach Amylase-Aktivitätsfärbung mit Lugolscher Lösung. Auftragsschema der Proben im Gel ist in Tab. 3.3. dargestellt. Die Dokumentation des Gelbildes erfolgte mittels eines Scanners (Canon CanoScan 3200 F).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Ergebnisse 25

Wie man in Abb. 3.3. sieht, konnten in dem dunkel angefärbten SDS-Gel keine hellen

Hydrolyse-Zonen festgestellt werden. Somit konnte bei keiner der Proben Amylaseaktivität

nachgewiesen werden. Das gilt auch für den Überstand der Bacillus subtilis-Kultur (Spur 15),

der als Positivkontrolle dienen sollte.

3.2.4. Silbernitratfärbung der Proteine

Nach der Amylase-Aktivitätsfärbung wurden die Proteine im Gel mittels der

Silbernitratfärbung visualisiert. Das Gel ist in Abb. 3.4. dargestellt.

Abb.3.4.: SDS-Gel nach Silbernitratfärbung der Proteine. Die Molekulargewichte der Markerproteine befinden sich links in der Abbildung. Auftragsschema der Proben im Gel ist in Tab. 3.3. dargestellt. Die Dokumentation des Gelbildes erfolgte mittels eines Scanners (Canon CanoScan 3200 F).

Wie aus Abb. 3.4. ersichtlich, sind in den Spuren 4 und 10 zahlreiche Proteinbanden zu

erkennen. Das bedeutet, dass die Bakterien des Stamms Bo 10-09 in Anwesenheit von

Maltose (Spur 4) oder Stärke (Spur 10) Proteine ins Medium abgegeben haben. Aufgrund der

fehlenden Hydrolyse-Zonen bei der Amylase-Aktivitätsfärbung (siehe Kap. 3.2.3.) ist es

jedoch nicht möglich festzustellen, bei welchen Banden es sich um Amylasen handelt. Es ist

jedoch deutlich zu erkennen, dass in Spur 10 mehr Proteinbanden sind als in Spur 4. Im

Überstand der Bacillus subtilis-Kultur konnten keine Proteinbanden nachgewiesen werden

(Spur 15), was die nicht vorhandene Amylaseaktivität (siehe Kap. 3.2.3.) erklärt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 kDa 170 130 100 72 55 40 33 24 17 11

Diskussion 26

4. Diskussion

4.1. Extrazelluläre Enzyme aus marinen heterotrophen Bakterien

Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten 12 Stämme sind heterotrophe Begleitbakterien

mariner filamentöser Cyanobakterien. Diese heterotrophen Bakterien beziehen ihre Nährstoffe

wahrscheinlich aus der Biomasse der Cyanobakterien. Daher wurde angenommen, dass diese

Bakterien viele extrazelluläre Enzyme produzieren müssen, um Substrate wie Glykogen,

Membranlipide, Proteine, DNA u.a. spalten zu können.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die meisten der 12 getesteten marinen

heterotrophen Bakterienstämme zur Produktion von extrazellulären Enzymen fähig sind.

Dabei konnte nur bei einem Stamm extrazelluläre Peptidase nachgewiesen werden.

Lipaseaktivität konnte bei zwei Stämmen auf den Olivenöl-Rhodamin-B-Agarplatten

festgestellt werden. Beim Lipase-Nachweis erwies sich die Detektion mit UV-Licht als

problematisch, weil nur geringe Fluoreszenz am Kolonienrand zu sehen war. Zudem konnte

die Fluoreszenz nur in einem begrenzten Zeitraum der Inkubation detektiert werden.

Nach Benedik & Strych (1998) kommen extrazelluläre Nukleasen selten bei Bakterien vor. In

dieser Arbeit wurden bei drei von zwölf getesteten Stämmen extrazelluläre DNasen

nachgewiesen.

Es wurde festgestellt, dass extrazelluläre Amylasen weit verbreitet bei den cyanobakteriellen

Begleitbakterien sind. Cyanobakterien können Glykogen speichern. Vermutlich nutzen viele

Begleitbakterien Glykogen aus der partiell zersetzten cyanobakteriellen Biomasse als Energie-

und Kohlenstoffquelle, was die vermehrte Produktion von Amylasen erklären würde.

4.2. Untersuchungen zur Expression Amylase codierender Gene

In dieser Arbeit ist es nicht gelungen, die Amylaseaktivität im Gel nach der SDS-PAGE

nachzuweisen. Somit konnte nicht festgestellt werden, ob es sich bei den extrazellulären

Amylasen des Stamms Bo 10-09 (Muricauda aquimarina) um konstitutive oder induzierbare

Enzyme handelt. Vermutlich wurde keine ausreichende Menge an Amylasen ins Medium

abgegeben, denn die Proteinkonzentrationen in den zellfreien Kulturüberständen waren unter

der Detektionsgrenze. Auch nach der Fällung der Proteine mit Ammoniumsulfat waren die

Proteinkonzentrationen mit 1,74 µg/ml im Ansatz mit Stärke und 0,6 µg/ml im Ansatz mit

Maltose sehr niedrig. Dies könnte auf Verdünnungseffekte im Flüssigmedium zurück zu

führen sein, weil auf festen Medien dieser Stamm im Vergleich zu anderen in dieser Arbeit

untersuchten Stämmen die höchste Amylaseaktivität aufwies. Good und Hartman (1970)

Diskussion 27

haben nämlich beobachtet, dass von festen Medien mit Halobacterium halobium größere

Mengen an Amylasen erhalten werden als aus Flüssigkulturen.

Bei der Anreicherung der Amylasen mit Ammoniumsulfat wurde zusätzlich unerwünscht

Stärke mitgefällt, wodurch mengenmäßig betrachtet ein sehr viel größerer Pellet im Vergleich

zum Ansatz mit Maltose erhalten wurde. Dementsprechend musste das Pellet in einem

größeren Volumen Puffer resuspendiert werden, was wiederum zur Verdünnung der Proteine

in der Probe führte.

Vorversuche haben bereits gezeigt, dass Stärke mit Ammoniumsulfat gefällt wird, daher

wurde bei der Herstellung der Medien die Konzentration von Stärke niedriger gewählt als die

von Maltose. Zudem sollte die relativ lange Inkubationsdauer (drei Wochen) der Kulturen

gewährleisten, dass möglichst viel Stärke hydrolisiert und von den Bakterien verwertet wird

und daher weniger bei der Fällung ausfällt. Jedoch konnte das Ausfallen der Stärke trotz

dieser Maßnahmen nicht verhindert werden. Wahrscheinlich müsste man die Konzentration

der Stärke im Medium noch viel niedriger wählen. Außerdem kann eine zu lange Inkubation

der Kultur zur Abnahme der Amylaseaktivität führen. Nach Kim und Mitarbeitern (1995) tritt

dies bei der Amylase von Bacilluc sp. Stamm GM8901 ein.

In einer Arbeit von Kim und Mitarbeitern (1995) wurde eine Amylase von Bacilluc sp.

Stamm GM8901 aufgereinigt. Dazu wurde dieser Stamm im Medium mit 1 % löslicher Stärke

kultiviert. Nach der Fällung der Proteine mit Ammoniumsulfat (80 %) und einer

anschließenden Dialyse der Enzymlösung wurde diese bei 15.000 x g für 30 min zentrifugiert,

um unlösliche Substanzen zu entfernen. In der vorliegenden Arbeit wurde keine

Zentrifugation nach der Dialyse vorgenommen. Dieser zusätzliche Zentrifugationsschritt

könnte möglicherweise eine Trennung der Stärke von den Proteinen bewirken.

Weitere Optimierungen der Methoden konnten jedoch aus Zeitgründen nicht mehr

vorgenommen werden.

In der vorliegenden Arbeit sollten die heterotrophen Begleitbakterien der Cyanobakterien

hinsichtlich der Produktion extrazellulärer Enzyme gestestet werden. Außerdem sollte anhand

der in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse beurteilt werden, ob der Stamm mit der

höchsten Amylaseaktivität für einen möglichen biotechnischen Einsatz geeignet ist.

Nach Buchholz und Kasche (1997) sinken die Kosten der Enzymproduktion und

Aufarbeitung mit steigendem Enzymgehalt in den Enzymquellen. Dabei ist das Verhältnis

zwischen dem Preis eines Enzyms und seinen anwendungstechnischen Nutzen entscheidend

Diskussion 28

dafür, ob ein Enzym zum technischen Einsatz kommt (Schmid, 2006) (siehe auch Kap.

1.2.1.).

Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass Muricauda

aquimarina die extrazellulären Amylasen in sehr geringen Mengen produziert. Daher ist

dieser Stamm wahrscheinlich als Amylasequelle für den technischen Einsatz ungeeignet.

Nach Whitehead und Mitarbeiter (2001) kann die Produktion von extrazellulären Enzymen

bei bestimmten Gram-negativen Bakterien durch Quorum sensing reguliert werden. Bei

diesem Regulationsmechanismus werden von den einzelnen Bakterien bestimmte N-Acyl-

Homoserin-Laktone (AHLs) produziert und durch Diffusion in die Umgebung abgegeben. Bei

hoher Zelldichte steigt die Konzentration von AHLs in der Umgebung. Dadurch können die

AHLs in die Nachbarzellen diffundieren und die Expression bestimmter Gene induzieren

(Madigan et al., (2003).

In der vorliegenden Arbeit konnte nicht bestimmt werden, ob die Produktion der Amylasen

bei Muricauda aquimarina durch die Anwesenheit bestimmter Kohlenstoffquellen induziert

oder reprimiert wird. Es gibt jedoch Indizien dafür, dass die Produktion von Amylasen bei

diesem Stamm durch AHLs reguliert wird. Es wurde beobachtet, dass Muricauda aquimarina

in 500 ml Medium mit Stärke als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle nicht anwächst.

Jedoch wachsen diese Bakterien in demselben Volumen des gleichen Mediums, welches

Maltose als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle enthält. In kleinen Medienvolumen

wächst diese Bakterienart sowohl auf Stärke als auch auf Maltose. Dies kann dadurch erklärt

werden, dass in großen Volumina die AHLs stark verdünnt werden und daher keine Induktion

der Expression Amylase codierender Gene stattfindet. Ohne extrazelluläre Amylasen kann die

Stärke nicht in kleinere Moleküle gespalten werden, was zum „Verhungern“ der

Mikroorganismen führt.

Ein weiterer Grund für diese Beobachtung könnte auch nicht die Verdünnung der AHLs,

sondern die Verdünnung der extrazellulären Amylasen sein. Um festzustellen, ob die

Produktion der Amylasen von den AHLs abhängt, müsste dieser Stamm auf AHL-Produktion

getestet werden. Anschließend müsste überprüft werden, ob durch die Zugabe bestimmter

AHLs zum Medium dieser Stamm eine größere Menge an Amylasen produziert.

Literaturverzeichnis 29

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