~ ~

Leitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie 20 9 1980

(Institut fur bakterielle lierseuchenforschung Jena-Zwiitzen der Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR,

Direktor: OVR Prof. Dr. sc. TII. HUBRIG)

553-561

Untersuchungen zum Kohlenhydrat-Stoffwechsel bei Pasteurella multocida

K.-D. FLOSSMANN, H. FEIST und W. ERLER

(Eingegangen am 8. 2. 1980)

Die Hauptprodukte der Glucose-Fermentation von P. multocida-Stiimmen sind unter den ge- testeten Bedingungen Pyruvat, Succinat, Formiat, Acetat und Athanol. Diese Substanzen ent- stehen aus Hexosen und Pentosen, wobei nach Einsatz radioaktiver Monosaccharide (gepriift wur- den 1-, 6-, U-14C-D-Glc, 6-3H-D-Glc, 1-l4C-Man, U-14C-Rib und U-14C-Xyl) die Radioaktivitiit in unterschiedlichem MaSe in den Endprodukten auftritt. Anhand der Ergebnisse lassen sich als Hauptwege des Monosaccharid-Abbaus von P . multocida der Hexosemonophosphatweg, der Pen- tosephosphat- und der Citratzyklus feststellen.

Die fur eine repriisentative Stammauswahl gesicherte Endproduktbildung (Fehlen voqlac ta t , vermehrte Anreicherung von Pyruvat, Formiat und Succinat, Bildung von Acetat und Athanol) kann zur Taxonomie der Species P. multocida herangezogen werden.

Mit der Bildung von ca. 250 pMol Siiureiiquivalenten aus 100 pMol n-Glucose gleicht die Carbon- saure-Bildung der Methylrot-negativen Species P. multocida der vieler Methylrot-positiver Entero- bakterien.

In einer vorausgegangenen Mitteilung (FLOSSMA" et al. 1976) berichteten wir uber Ergebnisse zur Produktbildung bei der Glucose-Fermentation von Pasteurella multo- cida und P . haemolytica. Die dabei festgestellte Bildung von Ameisensaure, Essig- saure, Athanol und Brenztraubensaure fuhrte zur Aussage, da13 der Fermentationstyp dieser Species der ,,Gemischt-Sauren-Fermentation" anderer fakultativ anaerober Bakterien iihnelt. Da Pasteurellen nach BERGEY'S Manual of Determinative Bacterio- logy (1974) zu den Genera mit unsicherer Einordnung gehoren, sind derartige Aus- sagen auch taxonomisch bedeutsam. Wir haben deshalb unsere Untersuchungen an einer groBeren Stammauswahl mit Hilfe radiomarkierter Monosaccharide fortgesetzt, wobei uns neben anderen radiomarkierten Hexosen und Pentosen besonders 1-, 6- und U-14C-~-Glucose sowie 6-3H-~-Glucoae zur Verfugung standen.

Muteriul und Methoden

P. multocida-Stiimme (Serotyp, soweit bestimmbar, in Klammern, nach CARTER 1955 und NA- MIOKA 1970) Institut fur bakterielle Tierseuchenforschung: 35 (A), 55 (A), 383 (6:B), 383 6s (6:B), 12975,5345; National Institute of Animal Health, Tokyo: 989 ( l l : B ) , PM (7:A), Kobe 5 ( l :A) , P 8 (3: A) ; Central Public Health Laboratory, London: ROBERTS type I1 NCTC 10201 (9 :A), CAR- TERS group E NCTC 10326 (6 : E) ; Institut Pasteur, Bukarest : B 850 (2 : B).

Kultivierungsbedingungen und analytische Methoden wurden schon bei FLOSSMANN et al. (1976) beschrieben, weiterhin wurden fur Untersuchungen mit radiomarkierten Niihrsubstraten chemisch- definierte (PM-CDM) und teildefinierte (PM-THM) Niihrmedien nach FLOSSMANN et al. (1977) ein- gesetzt.

Als radioaktive Monosaccharide wurden verwendet: 6-3H-~-Glucose, spez. Aktivitiit 0,83 Ci/ mMol; l-14C-~-Glucose, spez. Aktivitat 2,3 bis 8,8 mCi/mMol ; l-14C-~-Glucose, spez. Aktivit%t 19,8 bis 37 mCi/mMol, alle von WO ISOTOP, UdSSR; 1-14C-~-Mannose, spez. Aktivitat 50,5 mCi/ mMol; U-laC-D-Xylose, spez. Aktivitiit 165 mCi/mMol, Inst. Nat. Radiochem., Fleurus, Belgien; 1-14C-~-Mannose, spez. Aktivitiit 48,8 bis 59 mCi/mMol, Radiochem. Centre, Amersham/Engl. ; U-l4c-~-Ribose, spez. Aktivitiit 93 mCi/mMol; U-14C-~-Glucose, spez. Aktivitiit 180-241 mCi/

554 K.-D. FLOSSMANN, H. FEIST und W. ERLER

0,57 0,37 0,61 0,62 0,73 0,56

0,68

0,63 0,72

mMol, Inst. Radioisotop, Prag/CSSR. Diese wurden zusammen niit den entsprechenden inaktiven Niihrsubstraten in radiochemisohen Konzentrationen bis zu 1 yCi/ml zur Kultivierung der Bak- terien als 3-ml-Standkulturen oder in Ruhezell-Suspensionen (0,l M Phosphatpuffer + Sub- strat + Bakterien, E,,, 0,5 bis 1 bei d = 1 cm) eingesetzt. Die Bestimmung der radioaktiven Abbauprodukte geschah diinnschicht- oder saulenohromatographisch.

Diinnschichtchromatographie: Kieselgel G (MERCK, Darmstadt), Laufmittel zur radiochromato- graphischen Bestimmung der Carbon- und Dicarbonsauren sowie Aminosauren (RF-Werte: Tab. 1) : 1) a-BuOH/AcOH/H,O, 4/l/l (v/v); 2) MeOH/5 N NH,, 4/1 (v/v); 3) (PhOH-H,O, 75/25 w/w)/AcOH 9/l (v/v); 4) EtOH/NH, conc., 7/3 (v/v) (stark schwankende RF-Werte) ; 5 ) Benzol/EtOH/85% wiiBr. HCOOH, 5/3/2, obere Phase (nach 1 d Stehen bei Raumtemperatur); 6) Ather/85% waBr. HCOOH/H,O, 40/10/3 (v/v).

Each ublicher Bestimmung der Carbonsauren mit Bromthymolblau-Spruhlosungen wurde die Radioaktivitat mit dem DC-, PC-Scanner LB 2723 (Fa. BERTHOLD, BRD) bzw. nach Elution der Fraktionen durch Fliissigszintillationsmessung (LKB WALLAC 81 000) bestimmt.

Die Saulenchromatographie wurde an Kieselgel-Saulen ausgefiihrt. Die Elution geschah mit CHCl,/Benzol/n-Butanol nach MOIILER u. PIRES (1969). Die Bestimmung der R,adioaktivitLt der Fraktionen erfolgte durch Liquid Scintillation Counting. Diese Methoden wurden angewendet zur Bestimmung von Athanol und der Carbonsluren.

Tabelle 1 Diinnschichtchromatographische Trennung von Carbon- und Aminosauren

0,25 0,65

0,3 0,4 0,15

0,6

_______

0,35 0,05

Substanz

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0,29 0,33

0,25

0,75 0,88 0,62 0,7 0,89 0,74

0,72 0,85 0,74 0,6 0,66

2

RF-Werte im Laufmittel

0,74 0,56 0,88 0,71 0,85

0,75 0,86 0,94

0,93

0,91

5

0 0

0

0,18 0,36 0,51 0,05 0,47 0,28 0,21 0,23

0,12 0,4

6

0,42

0,35 0,56 0,67 08 0,74

0,95

0,58

Ergebnisse und Diskussion

D-Glucose ist ein Schlusselbaustein im Stoffwechsel. Deshalb stellten wir vor allem diese Substanz in den Mittelpunkt der Untersuchungen. Um die Glucose-Bilanz bestimnien zu konnen, ermittelten wir zunachst die Einbauraten in die Bakterienzelle. Dabei ergab sich, daW im chemisch-definierten Nahrmedium sowohl bei U-14C-, als auch bei 1-14C-Glc und 6-14C-Glc ca. 4-10% der Radioaktivitat in die Bakterienzelle eingebaut werden (Tab. 2) . Das bedeutet fur alle C-Atome etwa gleiche Einbauraten (4% des Gesamt-C sind bei 25 mMol Glc pro C-Position 1 Grammatom; 4,7% C-l- Einbau entsprechen 1,18 Grammatome C und 3,7% C-6-Einbau 0,93 Grammatome C) mit leicht erhohter Einbaurate bei C-1 gegeniiber C-6. Im Kulturfiltrat wird die Aktivi- tiit je nach Art der Glucose-Markierung in unterschiedlicher Menge in Athanol, Essig- siiure, Ameiseneaure, Brenztraubensiiure’) und Bernsteinsaure wiedergefunden (Tab. 3).

1) Abkiirzungen fur Brenztraubensiiure (Pyruvat) = Pyr, Bernsteinsaurel (Succinat) = SUC; andere Dreibuchstaben-Symbole nach Empfehlungen der IUPAC

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556 K.-D. FLOSSMANN, H. FEIST und W. ERLER

Radioaktives CO, als Endprodukt konnte in keinem Falle nachgewiesen werden. Das entspricht der Beobachtung, daB Glucose ohne Gasbildung gespalten wird und vermehrt Ameisensaure als Fermentationsprodukt auftritt, und nicht, wie bei Entero- bakterien, H, und CO, (bei P. multocida fehlt die Hydrogenlyase). Die siiulenchroma- tographische Trennung der Endprodukte zeigte einige auffallende Unterschiede mit verschieden markierten Glucose-Derivaten, die auch durch Dunnschichtchroma- tographie bestatigt wurden (Abb. 1). Dunnschichtchromatographisch sind allerdings die leicht fluchtigen Substanzen unter unseren Bedingungen nicht nachweiebar (Athano], Ameisensaure, Essigsaure). AuSerdem gelingt eine Trennung der Substanzen wegen Uberlagerungen der R,-Werte (z. B. Pyruvat/Alanin) meist nur zweidimensio- nal.

Fronl Sfart I I

Pyr Suc

Amino - souren, 4

suc Pyc AlU S I

Abb. 1. Radiodiinnschichtchromatogramme der Filtrate von P. multocida 383 nach Kultivierung mit unterschiedlich radiomarkierter D-Glucose

Die Verteilung der C-1- und C-6-Aktivitat auf die Endprodukte ist ein Ma13 fur priisente Abbauwege (BRUBAKER 1968). Bei der Verwendung von U-14C-Glucose waren alle Endprodukte der Glucose-Fermentation radioaktiv und daher leicht zu identi- fizieren. In erwartetem MaSe trat Radioaktivitat in Succinat (20-30%), Formiat (20-25%), Acetat (10-15y0), &hano1 (10-15y0) auf. Daneben waren jedoch auch die im Kulturmedium auftretenden Aminosauren Alanin (4-8y0), und Valin (2-4y0) radioaktiv, Beweis fur ihre Bildung aus Brenztraubensaure. Auffallend ist das Fehlen von Milchsiiure (Widerspruch zu ISSALY u. STOPPANI 1964), die von uns in allen Fallen nur in vollig unbedeutenden Mengen gefunden wurde. Radioaktives Succinat wurde bei verschieden markierter Glucose isoliert, seine spezifische Aktivitat entsprach den Erwartungen. Bei lJ4C wurde eine epezifische Succinat-Aktivitat von 25,6, bei 6J4C von 21,O und bei UJ4C von 56,5 pCi/mMol gefunden. Das entspricht 16,4, 20,O bzw. 28,4 yo der Gesamtaktivitat der Glucose im Succinat. lJ4C- und 6-14C-Glucose- Aktivitat finden sich also etwa zu gleichen Teilen im Succinat wieder. Bei Einsatz von l-14C-Glucose tritt weniger Aktivitiit im Pyruvat auf als bei 6-14C-Glucose. Das bestatigt, daB einer der Hauptwege der Glucose-Fermentation tatsachlich der Hexose-

Kohlenhydrat-Stoffwechsel bei Paeteurella 557

monophosphatweg ist, wobei die aus C-1 gebildete Carboxylgruppe (Gluconat) nach Decarboxylierung unter Beteiligung van Pyruvat zu Bernsteinsaure umgesetzt wird. Die nach Abspaltung des C-1 aus den Hexosen gebildeten Pentosen werden iiber den Pentosephosphatzyklus abgebaut. Das wird auch durch das vermehrte Auftreten von Heptosen, die in dem Zyklus eine Rolle spielen, in den LPS von P. rnultocida bestiitigt (ERLER et al. 1977). Da aus dem C-1 der Glucose jedoch ebenfalls Pyruvat gebildet wird, sind neben dem HMP-Weg auch andere Abbauwege prlisent. Auf genaue Unter- suchungen dazu haben wir verzichtet, Zwischenprodukte und Enzyme des EMP-

989

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5-5-

Abb. 2. Radiodiinnachichtchromatogramme der Kulturfiltrate verschiedener P . multocida-Stamme (Subatrat: U-14C-~-Glucose; Laufmittel 5 der Tab. 1)

Weges wurden von ISSALY u. STOPPANI (1964) bereits nachgewiesen. Die nach den ver- schiedenen Abbauwegen gebildete Brenztraubensaure wird, ahnlich dem Gemischt- saure-Fermentationstyp, zu Ameisensaure, Essigsaure und Athanol umgesetzt. Die Beteiligung des Citronensiiurezyklus bei der Pyruvat-Respiration wird durch die Akkumulation von Bernsteinsaure, gebildet aus CO, und Pyruvat, bestatigt.

Obwohl wir die meisten Untersuchungen nur an wenigen Stammen durchfiihrten, belegt der diinnschichtchromatographische Vergleich von Kulturfiltraten einer re- prasentativen Stammauswahl die generelle Gultigkeit der Produktbildung fiir P. multocida (Abb. 2). Der Einsatz von Mannose, Ribose und Xylose, 14C-markiert, be- stfitigt die erhaltenen ErgebnisFe. Wiihrend bei Mannose die gleichen Endprodukte wie bei Glucose auftreten, ist bei den Pentosen zwar die Succinatbildung wegen der fehlenden C0,-Abspaltung (C-1 der Hexosen) zuriickgedrangt, jedoch tret'en die gleichen Produkte auf (Abb. 3). Damit wird die Giiltigkeit der diskutierten Abbauwege, auch unter Beteiligung des Pentosephosphatzyklus, bestiitigt. 36 Zeitschrift f . Allg. Mikrobiologie, d. 20, H. Q k

558 K. D. FLOSSMANN, H. FEIST und W. ERLER

O h , ifan. Rib,

Pyr Suc Apino-

Abb. 3. Radiodiinnschichtchromatogramme der Filtrate von P . multocida 383 nach Kultivierung mit radiomarkierten Hexosen und Pentosen

P. multocida fermentiert also Glucose nach Abbildung 4 u. a. uber den Hexose- monophosphat-Weg ( WARBURG-DICKENS-HORECKER-weg), wobei c-1 a] s co, abge- spalten und analog dem Citratzyklus zu Bernsteinsaure umgesetzt wird. Alle Umset- zungen der Glucose fiihren uber Brenztraubensaure, die sich in der Kultur anreichert bzw. zu Ameisensaure, Essigsiiure und Alkohal oder in bereits erwahnter Weise unter Beteiligung von CO, zu Bernsteinsiiure umgesetzt wird (Produktbildung : Tab. 3).

CH2 OH

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Abb. 4. Glucose-Abbau von P . multocida

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560 K.-D. FLOSSMANN, H. FEIST und W. ERLER

Die Bilanz der Glucose-Fermentation (Tab. 3, 4 und 5) steht im Widerspruch zur Methylrot-negativ-Reaktion von P. multocida und zu der von SMITH (1974) in BERGEY'S Manual angegebenen Produktion ,,geringer Sauremengen" aus Glucose. Die gebildeten Sauremengen sind denen der Enterobakterien durchaus vergleichbar. So stellte SEILER (1973) eine Bildung von 50 bis 160 pMol ,,Saureaquivalenten" bei MR-nega- tiven Enterobakterien nnd 90 bis 250 pMol bei MR-positiven fest. Die fur P. multocida beobachteten, aus 100 pMol Glucose gebildeten Slureaquivalente liegen zum Teil sogar hoher (Tab. 4). Damit ist die MR-negativ-Reaktion, die wir nur fur btstimmte Standardbedingungen bestatigen konnen, nur aus dem Saurebildungsgrad nicht er- kliirlich. Praktisch wird auf einigen Nahrmedien der pH-Umschlagbereich fur Methyl- rot (4,4-6,2) oft nicht erreicht. Durch das van P. multocida in den verschiedenen Me- dien gebildete Ammoniak (Reduktion von Nitraten, Fermentation von Asparagin- saure, Glutamin u. a.) wird ein Teil der Saure neutralisiert, und es komrnt nur bei Fehlen solcher NH,-bildenden Substrate zum Farbumschlag. In bestirrimten Medien sind P. multocida-Stamme ,,MR-positiv". Die MR-Reakt]ion ist daher hinsichtlich ihrer Aussage zur Saurebilduiig kritisch zu batrachten und nur auf standardisierte Kulturbedingungen anwendbar, die u. a. auch vom Grad der Abpufferung abhangen. Die Carbonsliurebildung bei der Glucosevergarung durch P. multocida ist durchaus der anderer fakultativer Anaerobier vergleichbar.

Die Gesamt-Glucose-C-Bilanz (Tab. 5 ) lafit erkennen, da5 alle Substanzen im wesentlichen erfa5t wurden. Auffallend ist, wie schon erwlihnt, das Fehlen von Lac- tat. Sowohl der Lactat-Mange1 und die bevorzugte Succinat-Bildung, als auch die charakteristische Anreicherung von Pyruvat bzw. Formiat ahne Gasbildung stellen unseres Erachtens Merkmale dar, die taxonomischen Wert haben. Allerdings steht das Fehlen von Lactat im Widerspruch zu Beobachtungen von ISSALY u. STOPPANI (1964). Ursache konnte, wie bei P. tulnrensis, das Fehlen einer NADH-abhangigen Lactatdehydrogenase sein (HILL u. MILLS 1954). Eine weitere mogliche Ursache ware die Anwtsenheit eines H,-Acceptors, der die Pyruvat-Reduktion verhindert. Das wurde z. B. bei Streptococcus faecalis (DEIBEL 11. KVETKAS 1964) bei Anwesenheit von Fumarat beobachtet. Fumarsaure ist auch bei P. multocida ein sehr guter H,- Akzeptor und ist als Zwischenprodukt des Aspartat-Abbaus (ERLER et al. 1979) vor- handen. Sein EinfluB auf die Glucose-Fermentation wurde von uns nicht untersucht.

Fur gewissenhafte technische Mitarbeit bedanken wir uns besonders bei Frau CHRISTINE GRA- JETZKI, fur die Messung der LSC-Proben bei Herrn Dip1.-Ing. L. FINSTERBUSCH.

L i t e r a t u r

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Kohlenhydrat-Stoffwechsel bei Pasteurella 561

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Anschrift: Dr. sc. net. K.-D. FLOSSMANN Institut fur bakterielle Tierseuchenforschung DDR 69 Jena, Naumburger Str. 96a