Untersuchungen zum Replikationsverhalten des Hepatitis C ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/00010690.pdf · Prinzip der PCR.....18 1.3.3. Real time PCR ... HAV Hepatitis A Virus

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der

Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Untersuchungen zum Replikationsverhalten

des Hepatitis C Virus (HCV) in

Zellkultursystemen mit manipuliertem

2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System

vorgelegt von Christina Röser

geboren in Erfurt/Thüringen

Februar 2007

Eingereicht im Fachbereich 2 (Biologie/Chemie) der Universität Bremen

Erster Gutachter: PD Dr. rer. nat. Andreas Dotzauer

Universität Bremen, Fachbereich 2

Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Reimer Stick

Universität Bremen, Fachbereich 2

Tag des öffentlichen Kolloquiums: 19. April 2007 (Universität Bremen)

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung.............................................................................................. 1 1.1. Hepatitis C Virus .................................................................................. 1

1.1.1. Taxonomie ............................................................................................ 1 1.1.2. Genomorganisation............................................................................... 2 1.1.3. Genotypen............................................................................................. 3 1.1.4. Verbreitung........................................................................................... 5 1.1.5. Replikation............................................................................................ 5 1.1.6. Übertragungswege ................................................................................ 7 1.1.7. Krankheitsbild und Therapie ................................................................ 7 1.1.8. Diagnostik............................................................................................. 9

1.1.8.1. Serologischer Antikörper Test.............................................................. 9 1.1.8.2. Virologische PCR Tests zum Nachweis von HCV RNA................... 10

1.1.9. Hepatitis C Virus in Zellkultur ........................................................... 11 1.2. Unspezifische Immunabwehr ............................................................. 13

1.2.1. 2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System und RNase L......................... 14 1.2.2. RNase L Inhibitor (RLI) ..................................................................... 16

1.3. Polymerase Kettenreaktion................................................................. 17 1.3.1. Historisches ........................................................................................ 17 1.3.2. Prinzip der PCR.................................................................................. 18 1.3.3. Real time PCR .................................................................................... 19 1.3.4. Fluoreszenzfarbstoffe ......................................................................... 20 1.3.5. ABI PRISM™ Systeme...................................................................... 21 1.3.6. RotorGene™....................................................................................... 22

1.4. Ziel der Arbeit .................................................................................... 24 2. Material und Methoden ...................................................................... 25

2.1. Materialien.......................................................................................... 25 2.1.1. Antikörper........................................................................................... 25 2.1.2. Bioreagenzien ..................................................................................... 25 2.1.3. Gebrauchsfertige Kits ......................................................................... 26 2.1.4. Geräte.................................................................................................. 26 2.1.5. Medien und Lösungen ........................................................................ 27 2.1.6. Oligonukleotide .................................................................................. 27 2.1.7. Plasmide.............................................................................................. 29 2.1.8. Restriktionsendonukleasen ................................................................. 30 2.1.9. Software.............................................................................................. 30 2.1.10. Verbrauchsmaterialien........................................................................ 31 2.1.11. virologische Materialien ..................................................................... 31 2.1.12. Zelllinien............................................................................................. 31

2.2. Methoden ............................................................................................ 32 2.2.1. Molekularbiologie .............................................................................. 32

2.2.1.1. Aufreinigung von Zell-RNA mit dem RNeasy® Mini Kit.................. 32 2.2.1.2. DNA-Auftrennung im Agarosegel ..................................................... 32 2.2.1.3. cDNA-Synthese .................................................................................. 32 2.2.1.4. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA ..................... 33 2.2.1.5. Full length Amplifikation des RNase L Inhibitor .............................. 34 2.2.1.6. Klonierung des RLI in pcDNA3.1/V5-His und Transformation

von E.coli............................................................................................ 35 2.2.1.7. Klonscreening mittels PCR ................................................................ 36 2.2.1.8. Präparation der rekombinanten Plasmide ........................................... 37 2.2.1.9. Sequenzierung .................................................................................... 37 2.2.1.10. Umklonierung des RLI aus pcDNA3.1/V5-His_RLI in pl.18............ 37 2.2.1.11. In vitro Transkription von HCV full length HCV RNA..................... 39 2.2.1.12. Entwicklung eines HCV RotorGene Nachweissystems ..................... 40

2.2.2. Zellkultur und virologische Methoden ............................................... 42 2.2.2.1. Kryokonservierung von Huh7- und FRhK-4-Zellen .......................... 42 2.2.2.2. Auftauen von Huh7- und FRhK-4-Zellen .......................................... 42 2.2.2.3. Passagieren von Huh7- und FRhK-4-Zellen ...................................... 42 2.2.2.4. Transfektion mit FuGene 6 Transfection Reagent ............................. 43 2.2.2.5. Transfektion mit jetPEI ...................................................................... 43 2.2.2.6. G418 Titration für Huh7-Zellen ......................................................... 43 2.2.2.7. Stabile Überexpression des RLI in Huh7- und FRhK-4-Zellen ......... 44 2.2.2.8. Immunfluoreszenz .............................................................................. 44 2.2.2.9. Stabilitätstest von HCV RNA in zellfreiem Medium......................... 45 2.2.2.10. HCV Infektion von FRhK-4-RLI-Klonen .......................................... 45 2.2.2.11. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Huh7- und FRhK-4-Zellen............................................................................. 46 2.2.2.12. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7-

und FRhK-4-Zellen............................................................................. 46 2.2.2.13. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in

transient RLI-transfizierten Huh7- und FRhK-4-Zellen..................... 47 2.2.2.14. Aufreinigung viraler RNA mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit .. 47

3. Ergebnisse........................................................................................... 48 3.1. Erstellung der real time PCRs ............................................................ 48

3.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA .................... 48

3.1.1.1. Effizienz.............................................................................................. 49 3.1.1.2. Spezifität ............................................................................................. 51

3.1.2. Real time RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HCV RNA ...... 52 3.1.2.1. Testung des HCV RotorGene Assay auf Kreuzreaktivität ................. 52 3.1.2.2. Sensitivität des HCV RotorGene Nachweissystems .......................... 53 3.1.2.3. Nachweis verschiedener HCV Subtypen............................................ 55

3.1.3. Zusammenfassung real time PCRs..................................................... 57 3.2. RNase L Inhibitor ............................................................................... 57

3.2.1. Sequenzierung RNase L Inhibitor ...................................................... 57 3.2.2. Transfektion mit jetPEI bzw. FuGene 6 Transfection Reagent .......... 59 3.2.3. RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI ............ 61 3.2.4. Vergleich der Expressionsraten von pcDNA3.1/V5-His_RLI

und pl.18_RLI..................................................................................... 62 3.2.5. Nachweis der RLI-Expression mittels Immunfluoreszenz ................. 64 3.2.6. Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen ......... 65 3.2.7. RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 .................................... 67 3.2.8. Kinetik der RLI-Expression stabil transfizierter FRhK-4-6er Klone . 68 3.2.9. Zusammenfassung RNase L Inhibitor ................................................ 70

3.3. HCV Infektion .................................................................................... 70 3.3.1. Titer- und Subtypenbestimmung von HCV-positivem Plasma

des Blutspendedienstes Hagen........................................................... 71

3.3.2. Stabilität von HCV RNA.................................................................... 72 3.3.3. HCV Infektion der RLI-Klone 4 und 5 .............................................. 74 3.3.4. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Zellen ............................. 76 3.3.5. Zusammenfassung HCV Infektion ..................................................... 78

3.4. Transfektion in vitro transkribierter HCV full-length RNA............... 79 3.4.1. In vitro Transkription von full length HCV RNA .............................. 80 3.4.2. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7-

und FRhK-4-Zellen............................................................................. 81 3.4.3. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in

transient RLI-transfizierten Zellen ................................................... 84 3.4.4. Zusammenfassung Transfektion in vitro transkribierter

HCV full length RNA......................................................................... 90 4. Diskussion .......................................................................................... 91

4.1. Real time PCRs................................................................................... 91 4.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA

von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA ..................... 91 4.1.2. Real time PCRs zum quantitativen Nachweis der HCV RNA ........... 93

4.2. RNase L Inhibitor ............................................................................... 95 4.2.1. Isolation und Analyse des RLI aus FRhK-4- und humaner

gesamt-Zell-RNA ............................................................................... 95 4.2.2. stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in Huh7-

und FRhK-4-Zellen............................................................................. 96 4.3. HCV Infektion und Transfektion von HCV full length RNA in RLI-transfizierte Zellen ...................................................................... 98

5. Zusammenfassung ............................................................................ 107 6. Literaturverzeichnis .......................................................................... 109 7. Anhang.............................................................................................. 117

7.1. Plasmidkarten ................................................................................... 117 7.2. Sequenzen und Alignments .............................................................. 121

8. Danksagung ...................................................................................... 1379. Publikationsliste................................................................................ 138 10. Lebenslauf ........................................................................................ 139 11. Erklärung .......................................................................................... 140

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Genomische Organisation des Hepatitis C Virus ........................................... 2Abbildung 2: Stammbaum der HCV Geno- und Subtypen sowie deren geographische

Verbreitung..................................................................................................... 4 Abbildung 3: Hepatitis C Prävalenz ..................................................................................... 5 Abbildung 4: Schematische Darstellung der HCV Replikation ........................................... 6 Abbildung 5: Darstellung von branched DNA Assay und reverser Transkriptase PCR.... 11 Abbildung 6: schematische Darstellung des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System ......... 15 Abbildung 7: Schematische Darstellung der PCR.............................................................. 18 Abbildung 8: Sequenz-unabhängige Fluoreszenzfarbstoffe............................................... 20 Abbildung 9: Sequenzspezifische TaqMan Sonde ............................................................. 21 Abbildung 10: TaqMan 7900HT ........................................................................................ 22 Abbildung 11: Optisches System des ABI PRISM™ 7700 ............................................... 22 Abbildung 12: RotorGene™ 3000...................................................................................... 22 Abbildung 13: Querschnitt der Reaktionskammer des RotorGene™ 6000 ....................... 22 Abbildung 14: Verdünnungsreihe der RNase L ................................................................ 50 Abbildung 15: Verdünnungsreihe der RLI......................................................................... 50 Abbildung 16: Verdünnungsreihe der 18S rRNA .............................................................. 51 Abbildung 17: Verdünnungsreihe von GAPDH................................................................. 51 Abbildung 18: Spezifität der real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von

RNase L, RLI, GAPDH sowie der 18S rRNA ........................................... 52 Abbildung 19: Kreuzreaktivitätstest des HCV RotorGene System.................................... 53 Abbildung 20: Analytische Sensitivität des HCV RotorGene System............................... 55 Abbildung 21: Nachweis verschiedener HCV Subtypen im HCV RotorGene Assay ....... 56 Abbildung 22: Sequenzierung der verwendeten RLI–Fragmente ...................................... 58 Abbildung 23: Vergleich der Transfektionsreagenzien jetPEI und FuGene 6 ................... 60 Abbildung 24: Einfluss der Transfektion auf die 18S rRNA ............................................. 61 Abbildung 25: RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI .................... 62 Abbildung 26: Vergleich der RLI-Transkriptionsraten nach Transfektion mit

pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI..................................................... 63 Abbildung 27: Immunfluoreszenzen gegen den His-Tag der transfizierten

pl.18_RLI Plasmide .................................................................................... 64 Abbildung 28: RLI-Expression in stabil transfizierten FRhK-4-Klonen ........................... 66 Abbildung 29: Bestimmung relativer Einheiten RLI-mRNA der FRhk-4-Klone 4 und 5. 67 Abbildung 30: RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 ............................................ 68 Abbildung 31: RLI-Expression in FRhK-4-6er Zellen....................................................... 69 Abbildung 32: Titerbestimmung und Genotypenanalyse HCV-positiven Frischplasmas.. 72 Abbildung 33: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (lineare Darstellung)........................ 74 Abbildung 34: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (logarithmische Darstellung)........... 74 Abbildung 35: RLI-Expression der FRhK-4-RLI-Klone bei HCV Infektion .................... 76 Abbildung 36: RNase L-Expression der Klone bei HCV Infektion................................... 76 Abbildung 37: Transkriptionsrate des RLI 3 Wochen nach HCV Infektion

mit dreimaliger RLI-Transfektion .............................................................. 78 Abbildung 38: Transkriptionsrate der RNase L 3 Wochen nach HCV Infektion

mit dreimaliger RLI-Transfektion .............................................................. 78 Abbildung 39: RotorGene Lauf der in vitro transkribierten HCV-RNA............................ 81 Abbildung 40: RNase L-Expression in IVT-transfizierten Zellen ..................................... 82 Abbildung 41: HCV RNA-Titer in IVT-transfizierten Zellen............................................ 83

Abbildung 42: RLI-Expression in IVT-transfizierten Zellen ............................................. 84 Abbildung 43: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen ................... 85 Abbildung 44: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen............... 86 Abbildung 45: HCV Titer in IVT- und RLI-transfizierten Zellen...................................... 88 Abbildung 46: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen ........... 89 Abbildung 47: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen ....... 89 Abbildung 48: schematische Darstellung der zellulären viralen Abwehr mit

Angriffsstellen des Hepatitis C Virus......................................................... 99 Abbildung 49: schematische Darstellung von genomischer HCV RNA und

subgenomischer Replikon RNA ............................................................... 106

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Taxonomie der Familie Flaviviridae ................................................................... 1 Tabelle 2: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer.......................................................... 27 Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete Plasmide ............................................................... 29 Tabelle 4: In dieser Arbeit verwendete Restriktionsenzyme.............................................. 30 Tabelle 5: PCR-Effizienz.................................................................................................... 49 Tabelle 6: Zusammenfassung der Daten der Sensitivitätsläufe......................................... 54 Tabelle 7: berechnete Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im HCV RotorGene

System nachgewiesen werden konnten ............................................................ 54 Tabelle 8: Darstellung der kalkulierten Konzentrationen der HCV Eluate und

berechneten Konzentrationen der auf 50 IU/ml eingestellten Plasmaproben... 56

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung bDNA branched / verzweigte DNA bp basepair / Basenpaar(e) BSA Rinderserumalbumin bp Basenpaar bzw. beziehungsweise ca. circa cDNA komplementäre DNA cm2 Quadratzentimeter CMV Cytomegalie Virus cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure ct cycle treshold / Zyklus, in dem die Fluoreszenz erstmals über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt cp crossing point / entspricht dem ct °C Grad Celsius cop copy / Kopie CO2 Kohlendioxid d Tag(e) DMEM Dulbeccos Modification of Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure dNTPs desoxy-Nukleotidtriphosphate dsRNA doppelsträngiger RNA EBV Epstein Barr Virus EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylethyl)-tetraessigsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EIA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest ELISA Enzyme Linked Immunosorbent AssayEMCV Enzephalomyokarditis Virus et al. et alteri / und andere Fa Firma FCS fetales calf serum / fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FRhK-4 fetal monkey rhesus kidney cellsg Gramm GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase G418 Geneticindisulfat h Stunde(n) HAV Hepatitis A Virus HBV Hepatitis B Virus HCC hepatozelluläres Karzinom / Leberzellkarzinom HCV Hepatitis C Virus HIV human immunodeficiency virus / menschliches Immunschwäche Virus HSV Herpex Simplex Virus HTLV humanes T-Zell-Leukämie Virus Huh7 humane Hepatoma-Zellen IFN Interferon

IF-2 Initialisierungsfaktor 2 IRF-3 interferon regulated factor 3 IRES internal ribosomal entry sideIVT in vitro Transkript IU international unit / internationale Einheit μ l Mikroliter kb Kilobasen min Minute(n) ml Milliliter MOI multiplicity of infection / Anzahl der Infektionen mRNA messenger Ribonukleinsäure NaCl Natriumchlorid NCBI biologische Datenbank ng Nanogramm nm Nanometer OA 2’ 5’ Oligoadenylate OAS 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System / Oligoadenylatsynthetase ORF open reading frame / offener Leserahmen PCR polymerase chain reaction / Polymerase Kettenreation PBS phosphat buffered saline / Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Ketten-Reaktion pH pondus hydrogenii = negativer dekatischer Logarithmus der H+-Konzentration pH = -log [H+] polyIC polyinosinic acidPKR Proteinkinase R RFLP Restriktions-Fragmente-Längen-PolymorphismusRG RotorGene RIBA Recombinant Immunoblot AssayRLI RNase L Inhibitor RNA Ribonukleinsäure RT Reverse Transkriptase RT-PCR Reverse Transkription mit anschließender Polymerase-Ketten-Reaktion Real time PCR s Sekunde(n) Sd Sonde Tab. Tabelle rpm rounds per minute / Umdrehungen pro Minute UTR untranslatierte Region VSV Vesikuläres Stomatitis Virus z.B. zum Beispiel % Prozent

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Hepatitis C Virus

1.1.1. Taxonomie

Bis zu ihrer molekularen Identifikation aus dem Serum eines Schimpansen 1989 (Choo et

al., 1989) wurden die Hepatitis C Viren (HCV) den NonA-NonB-Hepatitisviren

zugeordnet. Zu diesen Viren werden alle Erreger von Leberentzündungen gezählt, die

nicht durch die Hepatitis A oder B Diagnostik erfasst werden (Modrow et al., 2003). Die

kugelförmigen Viruspartikel besitzen einen Durchmesser von 55 – 65 nm mit

stachelförmigen Oberflächenproteinen und lassen sich mit Hilfe der Sucrose-

Dichtezentrifugation in der 1,14 – 1,16 g/ml Fraktion anreichern (Kaito et al., 1994). Das

Genom des Hepatitis C Virus besteht wie das der Pestiviren und Flaviviren aus einer

einzelsträngigen RNA in Plusstrangorientierung. Der ähnliche Genomaufbau von HCV,

Pestiviren und Flaviviren führte zur Einordnung des Hepatitis C Virus als eigenständiges

Genus Hepacivirus in die Familie der Flaviviridae (Major et al., 2001). Die Familie der

Flaviviridae umfasst die drei Genera Flavivirus, Pestivirus und Hepacivirus (siehe

Tabelle 1).

Tabelle 1: Taxonomie der Familie Flaviviridae und charakteristische Vertreter der Genera Familie Genus Vertreter Natürlicher Wirt

Flavivirus Gelbfieber-Virus

West-Nil-Virus

Denguevirus

Mensch, Affen

Mensch, Vögel

Mensch, Affen

Flaviviridae

Pestivirus Schweinepest-Virus

Border-Disease-Virus

Schweine

Schafe

Hepacivirus Hepatitis C Virus Mensch

Nichtklassifizierte

Flaviviridae

Hepatitis G Virus Affen

Einleitung

2

1.1.2. Genomorganisation

Das Hepatitis C Virus ist ein RNA Virus mit einem ca. 9600 Basen großen RNA

Einzelstrang in positiver Orientierung. Der RNA Einzelstrang enthält einen offenen

Leserahmen (ORF), welcher für ein Polyprotein mit über 3000 Aminosäuren kodiert.

Nach der Spaltung durch virale und wirtsspezifische Enzyme entstehen aus diesem

Polyprotein zehn Polypeptide (siehe Abbildung 1)(Lyra et al., 2004).

Abbildung 1: Genomische Organisation des Hepatitis C Virus (Lyra et al., 2004). UTRs am 5’ und 3’Ende der RNA flankieren ein ca. 3000 Aminosäuren großes Polyprotein, welches in die zehn Polypeptide Core, E1 und E2, P7, NS2, NS3, NS4A/B und NS5A/B gespalten wird. Die Nukleotidpositionen entsprechen dem HCV Stamm J4 (Acc.nr D10749).

Die 5’untranslatierte Region (UTR) ist hoch konserviert und wird daher häufig als

Targetregion für diagnostische Assays verwendet. Das Core-Protein stellt das virale

Nukleokapsid, die Glykoproteine E1 und E2 die viralen Hüllproteine des Virus dar.

Die Proteine E1 und E2, mit molekularen Massen von 31 und 70 kDa interagieren

miteinander und bilden Heterodimere. Die E1 Region wird in der klinischen Diagnostik

zur Genotypisierung genutzt (Lyra et al., 2004). Das Glykoprotein E2 besitzt

Bindungsstellen für das Membranprotein CD81 und wird mit dem Viruseintritt in die

Leberzelle in Verbindung gebracht (Pileri et al., 1998). Das P7-Protein zwischen E2 und

NS2 ist ein sehr hydrophobes Polypeptid mit unbekannter Funktion (Bartenschlager &

Lohmann, 2000).

Das NS2-Protein ist ein Transmembranprotein, welches mit der C-terminalen Region im

Lumen des endoplasmatischen Retikulums und mit der N-terminalen Region im

Zytoplasma lokalisiert ist (Santolini et al., 1995).

Einleitung

3

Das NS3-Protein ist ein Protein mit Eigenschaften als Serinprotease, NTPase und RNA-

Helikase. Die katalytischen Eigenschaften der Serinprotease sind notwendig für die

Spaltung der Nicht-Strukturproteine NS3, NS4 und NS5.

Die NS4-Region wird in die Proteine NS4A und NS4B gespalten. Diese gelten als

Kofaktoren der NS3-Serinprotease.

NS5 wird ebenfalls in zwei kleinere Proteine gespalten: NS5A und NS5B. Die genauen

Aufgaben von NS5A und B sind noch nicht vollständig aufgeklärt. NS5A könnte als

Komponente im viralen Replikationszyklus beteiligt sein. NS5B könnte als virale RNA

Replikase während der HCV-RNA Synthese involviert sein (Tomei et al., 1993).

1.1.3. Genotypen

Der Vergleich der HCV Genome verschiedenster Isolate zeigt eine große genetische

Heterogenität. Es existieren verschiedene Modelle zur Genotypisierung von Hepatitis C

Viren. Dazu zählen zum Beispiel die RFLP Analyse (Restriktions-Fragment-Längen-

Polymorphismus, Methode beschrieben in Alberts et al. (1995)) der 5’ UTR, reverse Dot

Blot (Methode beschrieben in Saiki et al. (1989)) Hybridisierungsanalysen der 5’ UTR

oder die nested PCR (Methode beschrieben in Gassen et al. (1994)) der Core Genregion.

Die bewährteste Methode, um Sequenzunterschiede zwischen HCV Isolaten verschiedener

Genotypen festzustellen, sind PCR Amplifikationen und Sequenzierung definierter

Genomabschnitte wie Core, E1 und NS5.

Auf der Grundlage von Sequenzunterschieden der kodierenden und nichtkodierenden

Regionen wurden im Laufe der Zeit verschiedene Klassifikationssysteme vorgeschlagen.

Eine 1990 von Enomoto vorgeschlagene Unterteilung der Hepatitis C Viren in HCV-K1

und HCV-K2 basiert auf der Sequenzanalyse eines 400 bp großen cDNA Fragmentes des

NS5-Gens (Enomoto et al., 1990) (siehe auch Kapitel 1.1.2). 1992 wurde auf der Basis

von Sequenzunterschieden innerhalb begrenzter Core Genregionen eine Einteilung des

Hepatitis C Virus in die Genotypen I, II, III und IV entwickelt (Okamoto et al., 1992).

Durch die phylogenetischen Eigenschaften der Genotypen I bis IV schlugen Chan et al.

(1992) eine neue Nomenklatur vor, in der die Genotypen I und II als 1a/1b, Genotyp III

und IV als 2a/2b zusammengefasst werden sollten. In einer Studie von 1993 wurde von 51

HCV Isolaten die gesamte Nukleotidsequenz des E1 bestimmt und aus den Unterschieden

12 verschiedene Genotypen generiert (Bukh et al., 1993). Ebenfalls 1993 wurde die

Einleitung

4

Einteilung des Hepatitis C Virus in 6 Haupt-Genotypen und eine Reihe von Subtypen

anhand der phylogenetischen Analyse des NS5 vorgeschlagen (Simmonds et al., 1993).

Relativ konservierte Regionen des HCV Genoms wie Core, E1 oder NS5 wurden

ausführlich studiert und als Grundlage der heutigen Klassifikation der Isolate verwendet.

Die Einteilung des Hepatitis C Virus erfolgt in 6 Genotypen und mehr als 50 Subtypen

(Major et al., 2001). Die Genotypen werden mit arabischen Ziffern bezeichnet (1, 2, …),

unterschiedliche Subtypen zusätzlich mit kleinen Buchstaben (1a, 1b, …) charakterisiert.

Mit Hilfe phylogenetischer Stammbäume und der kompletten Sequenzanalyse von Core,

E1 und NS5 fand eine Reklassifizierung der HCV-Typen 7, 8, 9 und 11 in den

gemeinsamen Subtyp 6a sowie der Eingruppierung von 10a zu Genotyp 3 statt (Simmonds

et al., 1996). Genotypen unterscheiden sich in 31 % bis 33 % ihrer Nukleotidsequenz

voneinander, Subtypen in 20 % bis 25 % (Simmonds et al., 2005). Anhand der

Nukleotidsequenzen des kompletten offenen Leserahmens wurde von Simmonds et al.

(Simmonds et al., 2005) der Stammbaum der verschiedenen HCV Genotypen und

Subtypen erstellt (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2: Stammbaum der HCV Geno- und Subtypen sowie deren geographische Verbreitung (Simmonds et al., 2005). Der Stammbaum ist aufgebaut auf den kompletten Sequenzen des offenen Leserahmens der verschiedenen HCV Genotypen.

Einleitung

5

1.1.4. Verbreitung

Das Hepatitis C Virus ist weltweit verbreitet, wobei ca. 3 % der Bevölkerung chronisch

mit dem Virus infiziert sind. Dabei sind, wie in Abbildung 3 ersichtlich, deutliche

regionale Unterschiede in der Durchseuchungsrate zu beobachten (Wasley & Alter, 2000).

Die Prävalenzraten reichen von 0,15 % in Skandinavien bis zu 44 % in Nordwest Ägypten

und Südkamerun. In Westeuropa, den USA, Indonesien und Japan liegen die

Prävalenzraten bei 0,2 - 2 %, in Südamerika und Asien bei 2,5 %. In den meisten

Afrikanischen Ländern liegt die Infektionsrate bei 5 % (Maertens & Stuyver, 1997). Die

einzelnen Genotypen sind weltweit unterschiedlich häufig zu finden. Genotyp 6 findet sich

beispielsweise fast ausschließlich in Vietnam, Genotyp 4 hauptsächlich in Ägypten und im

Nahen Osten. Genotyp 5 trat bisher lediglich in Südafrika auf. In Europa und den USA

findet sich am häufigsten der Genotyp 1, in Japan die Genotypen 1 und 2 (Dusheiko et al.,

1994). In Europa sind die Genotypen 1 und 3 am häufigsten vertreten, wobei Genotyp 3

vorwiegend bei Drogenabhängigen zu finden ist.

Abbildung 3: Hepatitis C Prävalenz. Quelle: WHO International Travel and Health 2003

1.1.5. Replikation

Aufgrund fehlender Zellkultursysteme und Tiermodelle ist der Replikationszyklus des

Hepatitis C Virus noch nicht vollständig bekannt. Auf der Basis verschiedener

Modellsysteme und den bekannten Replikationszyklen von Flaviviren und Pestiviren wird

die Replikation des Hepatitis C Virus wie in Abbildung 4 dargestellt vermutet.

Einleitung

6

Abbildung 4: Schematische Darstellung der HCV Replikation in Anlehnung an das Modell von Thomson & Liang (2000).

Als ein möglicher hepatozellulärer Rezeptor für das Hepatitis C Virus wurde das

Membranprotein CD81 identifiziert, da in vitro starke Wechselwirkungen zwischen CD81

und dem E2 festgestellt wurden (Bartosch et al., 2003; Lindenbach et al., 2005; Pileri et

al., 1998). Möglicherweise bindet das Hepatitis C Virus auch wie andere Vertreter der

Flaviviridae an den low-densitiy-lipoprotein (LDL) Rezeptor. Sowohl die Endozytose des

HCV-LDL-Rezeptorkomplexes als auch seine Inhibition durch einen Anti-LDL-Rezeptor-

Antikörper konnten in vitro bereits demonstriert werden (Major et al., 2001). Obwohl der

zelluläre Rezeptor für HCV bisher nicht eindeutig identifiziert werden konnte, ist die

Bedeutung des E2 unumstritten. Durch E2-spezifische Antikörper kann der Eintritt des

Virus in die Zelle verhindert werden (Rosa et al., 1996). Nach der Bindung an die

zelluläre Oberfläche wird das Virus mittels Endozytose aufgenommen. Durch Ansäuerung

des Endosoms verschmilzt die Endosomenmembran mit der Virushülle (uncoating). Das

HCV Genom wird direkt im Zytoplasma der Wirtszelle translatiert. Es ist nicht mit einer

Cap-Struktur versehen (Bartenschlager & Lohmann, 2000). Das HCV Genom besitzt eine

interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), welche die Translation am rauen

endoplasmatischen Retikulum vermittelt. An der Ausbildung eines Replikationskomplexes

sind alle Nicht-Strukturproteine des Virus beteiligt (Dimitrova et al., 2003). Es wird

zunächst ein Negativ-RNA-Strang produziert, der als Matritze für neue Plus-RNA-Stränge

Einleitung

7

dient. Die Hülle enthält das Virus durch Knospung vom endoplasmatischen Retikulum

(Bartenschlager & Lohmann, 2000).

1.1.6. Übertragungswege

Die Übertragung des Hepatitis C Virus erfolgt hauptsächlich durch Blut oder

Blutprodukte. Obwohl das Virus auch in diversen Körperflüssigkeiten nachweisbar ist,

schließen zahlreiche epidemiologische Studien eine Infektion durch Speichel, Schweiß,

Tränen, Sperma und Muttermilch nahezu aus (Schreier et al., 2003). Daher sind

intravenöse Injektionen (z.B. Drogenkonsum) oder Transfusionen die Hauptursache von

HCV Infektionen. Ein weiteres Infektionsrisiko geht von Organtransplantationen und

Dialysebehandlungen aus (Hepatitis C Ausbruch in der DDR 1978/79 (Roggendorf et al.,

2000)). In bis zu 30 % der HCV Infektionen lassen sich jedoch keine eindeutigen

Hinweise auf den Übertragungsweg feststellen (Hoofnagle, 1998). Der verbindliche HCV

Antikörpernachweis seit April 1991 für Vollblut und der HCV Genomnachweis mittels

Nukleinsäureamplifikation seit 1999 haben das Risiko bei Bluttransfusionen gesenkt

(Schreier & Höhne, 2001). Seit dem 1. Juli 1995 unterliegt außerdem nicht inaktiviertes

Plasma einer sechsmonatigen Quarantäne (Schreier et al., 2003). Nach dieser Zeit muss

der Spender erneut auf HCV getestet werden. Nur wenn dieser Test negativ ausfällt, darf

das tiefgefroren gelagerte Plasma als Frischplasma verwendet werden. Dadurch soll das

Restrisiko einer nicht erkannten Hepatitis C Infektion in der Fensterperiode minimiert

werden. Auch alle Organspender werden heute auf Hepatitis C Antikörper getestet.

1.1.7. Krankheitsbild und Therapie

Bei der Hepatitis C (griechisch hépar, hépatos = Leber, hépatitis = Leberentzündung)

handelt es sich um eine virale Leberinfektion, die zu Störungen der Leberzellen und deren

Organfunktion führen kann. Die Inkubationszeit des Hepatitis C Virus beträgt zwischen 3

und 12 Wochen. Innerhalb dieser Zeit ist der Infizierte symptomfrei. Die Ansteckung einer

weiteren Person ist jedoch bereits möglich. Bis zu 75 % der Infektionen verlaufen völlig

inapparent, lediglich bei einem kleinen Teil der Infizierten treten unspezifische Symptome

wie grippeähnliche Beschwerden, Müdigkeit oder Übelkeit auf. In ca. 25 % der

Erkrankungen tritt eine akute Gelbsucht auf. Bei der akuten Hepatitis C Infektion sind

schwere oder tödlich verlaufende Fälle selten (0,2 %). Das Risiko eines Übergangs in eine

Einleitung

8

chronische Hepatitis C Erkrankung liegt dagegen bei 50 bis 90 % (Wiese et al., 2000). Die

akute Hepatitis C ist durch negative Serologie und positive PCR gekennzeichnet.

Die chronische Hepatitis C ist durch positive Serologie, erhöhte Transaminasewerte und

positive PCR charakterisiert. Schätzungen des Center for Disease Control and Prevention

(CDC) zufolge entwickeln 20 - 50 % der chronisch infizierten Hepatitis C Patienten eine

Leberzirrhose, wobei sich die Leber verhärtet, schrumpft und in ihrer Funktionsfähigkeit

zunehmend eingeschränkt ist. Aus der Leberzirrhose entwickelt sich wiederum in 25 %

der Fälle ein Leberzellkarzinom (HCC) oder ein Leberversagen, welches eine

Lebertransplantation erfordert. Leberzellkarzinome entwickeln sich zum Teil erst nach

über 20 Jahren (Wiese et al., 2000).

Patienten mit einer akuten Hepatitis C haben gute Heilungschancen ohne zusätzliche

Behandlung. In einer Studie zeigte sich bei bis zu 52 % der Personen mit einer akuten

Hepatitis C innerhalb von 12 Wochen nach Ausbruch der Krankheit eine spontane

Viruselimierung. Dagegen entwickelten alle Hepatitis C Patienten ohne Symptome eine

chronische Hepatitis (Gerlach et al., 2003). Die Behandlung der chronischen Hepatitis C

erfolgt ab drei Monaten nach Ausbruch der Krankheit durch Interferon alpha (Protein mit

antiviraler Wirkung; Zytokin). Der Erfolg der Interferon-Monotherapie wird jedoch durch

Non-Responder (Patienten ohne Virusverringerung oder Eliminierung) und Rückfälle

herabgesetzt. Die Einführung der Kombinationstherapie von Interferon und Ribavirin

erhöhte die Therapieerfolge auf 30 – 40 %. Das Medikament Ribavirin ist unter den

Handelsnamen Copegus oder Rebetol erhältlich. Es handelt sich dabei um ein

Nukleosidanalogon mit virostatischer Wirkung. Gerade Patienten mit HCV Genotyp 1,

hoher Viruslast und ausgeprägter Fibrose oder Zirrhose reagierten deutlich besser auf die

Kombinationstherapie als auf Interferon-Monotherapie. Die heute eingesetzte

Kombinationstherapie aus pegyliertem Interferon und Ribavirin erreicht anhaltende

Therapieerfolgsraten von bis zu 60 % (Leung, 2002). Die Kopplung von Interferon an

Polyethylenglykol (= pegyliertes Interferon) bewirkt, dass die Interferonproteine eine

längere Verweildauer im Körper aufweisen. Pegyliertes Interferon ist unter dem

Handelsnamen PEGASYS erhältlich.

Eine standardisierte Therapiemethode für Patienten mit Hepatitis C existiert nicht.

Aufgrund der hohen Nebenwirkungen der Kombinationstherapie, fehlender Studien der

Ribavirinbehandlung bei Kindern oder der kontrainduzierenden Wirkung bei

Alkoholismus, Drogenabhängigkeit, Schilddrüsenfunktionsstörungen, Schwangerschaft

oder psychischen Erkrankungen muss die Behandlung individuell abgestimmt und

Einleitung

9

diskutiert werden. Für Patienten mit chronischer Hepatitis C wird generell eine Impfung

gegen Hepatitis A und B empfohlen, sofern noch keine spezifischen Antikörper dagegen

vorhanden sind (Schreier et al., 2003).

1.1.8. Diagnostik

Es existiert derzeit keine wirksame Schutzimpfung gegen das Hepatitis C Virus. Auch

eine überstandene Hepatitis C Infektion mit vollständiger Viruseliminierung stellt keinen

sicheren Schutz gegen eine erneute Infektion dar. Daher basieren alle Schutzmaßnahmen

auf der Vermeidung einer Ansteckung. Verschiedenste Tests werden verwendet, um

Patienten mit einer Hepatitis C zu erkennen und deren Therapieverläufe zu überwachen.

Serologische Tests wie Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA) bzw. Enzyme

Linked Immunosorbent Assay (ELISA) werden zum Screening von Blutprodukten

eingesetzt (Urdea et al., 1997). Der ELISA wurde 1971 und 1972 von Engvall und

Perlmann beschrieben (Engvall & Perlman, 1971; Engvall & Perlmann, 1972). Diese

Tests basieren auf der Detektion von Hepatitis C Antikörpern im Serum, welche in nahezu

allen Patienten mit einer chronischen Hepatitis C vorkommen. Antikörper gegen das Core-

Protein lassen sich wenige Tage bis Wochen nach Beginn der Infektion nachweisen,

Antikörper gegen NS3, NS4 oder NS5 erst später (Modrow et al., 2003). Innerhalb der

Fensterperiode, d.h. der Zeit zwischen Ansteckung und dem Auftreten von Antikörpern,

fallen die Tests jedoch negativ aus. Zur Diagnose von Patienten mit einer akuten Hepatitis

C werden daher PCR Tests verwendet, welche das RNA Genom des Virus detektieren

(Major et al., 2001).

1.1.8.1. Serologischer Antikörper Test

Im Rahmen einer Studie wurde das erste HCV ELISA System entwickelt (Fa. Ortho-

Chemical Diagnostics, Rochester, NY). Es beruhte auf dem rekombinanten Polypeptid

c100-3, welches in Hefen exprimiert wurde. Das Polypeptid besteht aus 363

viruscodierenden Aminosäuren der NS4 Region (Cuthbert, 1994) und dient der Detektion

zirkulierender viraler Antikörper. Sowohl bei 80 % der Patienten mit chronischer, als auch

bei 15 % der Patienten mit einer akuten Hepatitis C konnten diese zirkulierenden

Antikörper nachgewiesen werden (Kuo et al., 1989), was jedoch weder hinsichtlich

Sensitivität noch Spezifität ausreichend war.

Einleitung

10

Im ORTHO HCV 2.0 ELISA wurden weitere Antikörper gegen das Hepatitis C Virus

detektiert. Der zusätzliche Nachweis des strukturellen Epitops c22-3 (Core-Region) und

des nichtstrukturellen Epitops c33-c (NS3-Region) bewirkten eine Sensitivitätssteigerung

in der Detektion sowohl einer chronischen als auch akuten Hepatitis C (Lazizi et al.,

1992). Im Vergleich zum ELISA der ersten Generation ermöglicht dieser ELISA der

zweiten Generation bereits einen Antikörpernachweis nach 6 statt 9 Wochen (Cuthbert,

1994).

Der ELISA der dritten Generation enthielt ein weiteres zusätzliches Antigen der

NS5-Region, was die Sensitivität nochmals steigerte. In den Assays aller drei

Generationen werden die rekombinanten Antigene als Fusionsprotein der Superoxid-

Dismutase in Saccharomyces cerevisiae exprimiert (Polywka et al., 2000).

Ein ergänzender Test zum Ausschluss falsch negativer ELISA Ergebnisse ist das

Recombinant Immunoblot Assay (RIBA) der Firma Chiron. In diesem System werden 5

synthetische Antigenpeptide der NS4-Region und 3 der Core-Region auf einem

Teststreifen gebunden, mit welchem das Patientenserum getestet wird (Urdea et al., 1997).

Auch das RIBA durchlief analog zum ELISA die drei Generationen der Entwicklung. Eine

Genotypisierung anhand des Recombinant Immunoblot Assay ist ebenfalls möglich

(Schroter et al., 1999).

Die serologischen Nachweisverfahren der dritten Generation sind hochsensitiv und

spezifisch (98 - 100 %). Für Dialysepatienten wird jedoch eine Absicherung negativer

Ergebnisse mittels qualitativem HCV RNA Nachweis angeraten (Colin et al., 2001).

1.1.8.2. Virologische PCR Tests zum Nachweis von HCV RNA

Zum Nachweis der HCV RNA unterscheidet man zwei Methoden: die reverse

Transkriptase PCR (RT-PCR) und den Nachweis mittels branched DNA (bDNA) Assay

(siehe Abbildung 5).

Die Technik der RT-PCR beruht auf der Isolation viraler RNA und deren reverse

Transkription in komplementäre DNA (cDNA). Spezifische Nukleinsäuresequenzen dieser

cDNA werden anschließend amplifiziert, detektiert und quantifiziert (Urdea et al., 1997).

Die Detektion kann unter anderem durch konventionelle PCR mit anschließender

Agarosegelelektrophorese oder durch real time PCR (siehe Kapitel 1.3.3) erfolgen. Nur

bei negativer PCR ist ein zusätzlicher Antikörpertest notwendig. Fällt dieser positiv aus,

liegt eine ausgeheilte Hepatitis C vor (siehe 1.1.8). Zu den kommerziell erhältlichen HCV

Einleitung

11

PCR Nachweissystemen zählen das AMPLICOR HCV Monitor Assay der Firma Roche

Diagnostics (Major et al., 2001; Schroter et al., 2001) und das TM Versant HCV RNA

Assay der Bayer Corporation.

Bei der Technik der bDNA wird das Signal durch verzweigte DNA (engl. branched DNA)

verstärkt und nicht durch die Zielsequenz selbst. Eine der HCV RNA komplementäre

Sonde wird zunächst an das RNA Genom gebunden. An diese Sonde wird eine zweite

Sonde gebunden, welche viele Abzweigungen (engl. branches) mit Reportermolekülen

enthält. Diese Reportermoleküle ermöglichen die Detektion und Quantifizierung der HCV

RNA. Die bDNA Assays sind weniger sensitiv als die RT-PCR Systeme. Zu den

kommerziell erhältlichen bDNA Tests zählen die Versant HCV RNA Assays der Bayer

Corporation (http://www.mediwiss.de/Tests.htm, (Elbeik et al., 2004)).

Abbildung 5: Darstellung von branched DNA Assay und reverser Transkriptase PCR zur Detektion und Quantifizierung von HCV RNA (Quelle: Urdea et al., 1997)

1.1.9. Hepatitis C Virus in Zellkultur

Um die Replikation des Hepatitis C Virus, Wirtszell-Virus-Interaktionen oder mögliche

HCV-Therapieansätze genauer untersuchen zu können, ist ein effizientes Zellkultursystem

nötig. Bis vor kurzem war es nicht möglich, Hepatitis C Viren in Zellkultur zu züchten.

Um Informationen über den Verlauf von HCV Infektionen zu erhalten, wurden infizierte

Patienten (Lechner et al., 2000) oder experimentell infizierte Schimpansen (Thimme et al.,

2002) in die Studien einbezogen. Die heutigen Systeme zur Replikation viraler HCV RNA

in Zellkultur basieren auf Replikons. 1999 entwickelte Lohmann et al. auf der Grundlage

subgenomischer RNA das erste HCV Replikon (Lohmann et al., 1999). Dieses enthielt

Einleitung

12

zunächst nur die RNA der Nicht-Strukturproteine des HCV Genotyps 1 aus der Leber

eines chronisch infizierten Patienten. Die Replikationsrate der Replikons war sehr gering

und wurde durch verschiedene Mutationen in fast allen Nicht-Strukturproteinen erhöht

(Lohmann et al., 2001). Bis heute replizieren die hinsichtlich ihres Wachstums in

Zellkultur veränderten HCV Replikons nur effizient in der humanen Hepatomazelllinie

Huh7 (Bartenschlager et al., 2003). 2003 wurde zwar die Etablierung der HCV Replikons

in Hela-Zellen (Gebärmutterhalskrebszelllinie) und in Hepa1-6-Zellen (Maus-

Krebszelllinie) beschrieben (Zhu et al., 2003), jedoch enthielten auch diese Replikons

adaptive Mutationen in den NS4A- und NS4B-Genregionen. Durch zahlreiche adaptive

Mutationen in den Sequenzen von NS3, NS4B, NS5A und NS5B wurde die Effizienz der

ersten Replikonsysteme in Huh7-Zellen im Laufe der Zeit deutlich verbessert (Lohmann et

al., 2003), die HCV Sequenzen jedoch immer weiter von der natürlichen vorkommenden

HCV RNA entfernt. Experimente mit HCV Replikons müssen daher nicht einer Infektion

mit natürlichen Isolaten entsprechen.

2001 isolierten Kato et al. den hochinfektiösen HCV Stamm JFH-1 aus einem Patienten

mit einer fulminanten Hepatitis C (Kato et al., 2001). Die fulminante Hepatitis ist eine

seltene Ausnahme bei der HCV Infektion. Im Verlauf der fulminanten Hepatitis C

Infektion kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einer dramatischen Verschlechterung des

Allgemeinzustandes bis hin zum Versagen der Leberfunktion. In der akuten Phase wurde

der Patient im Serum PCR positiv getestet, nach Auftreten von HCV Antikörpern negativ.

Phylogenetisch wurde JFH-1 als Subtyp 2a klassifizert, unterschied sich jedoch in 5’UTR,

Core, NS3 und NS5A deutlich zu den bisher bekannten Subtyp 2a Hepatitis C Viren. Im

subgenomischen Replikon replizierte diese RNA ohne anpassende Mutationen sehr

effizient in Zellkultur. 2005 wurden nach Transfektion der full length RNA von

JFH-1 in Huh7-Zellen die RNA repliziert und neue virale Partikel produziert (Kato &

Wakita, 2005). Mit Hilfe dieses Systems kann der gesamte Ablauf einer HCV Infektion

vom Viruseintritt bis hin zur Bildung neuer infektiöser Viruspartikel betrachtet werden.

Lindenbach et al. zeigten, dass die Virusnachkommen aus dem JFH-1-Replikon mit Hilfe

von Antikörpern gegen das Glykoprotein E2 neutralisiert werden (Lindenbach et al.,

2005). Sie zeigten weiterhin, dass die Virusreplikation unter anderem durch Interferon

alpha gehemmt wird.

Die Replikation des Hepatitis C Virus gelang bis heute jedoch nur in Huh7-Zellen und nur

mit dem HCV Stamm JFH-1. Es ist daher anzunehmen, dass diese Zellen eine bestimmte

Eigenschaft besitzen, welche die Replikation der HCV RNA ermöglicht. Bartenschlager et

Einleitung

13

al. vermuten die besondere Eignung der Huh7-Zellen für HCV-Replikationen in einem

Defekt der Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren (Bartenschlager et al., 2003).

Verschiedene Versuche weisen zwar auf mögliche Defekte der Zellen im Signalweg für

dsRNA hin, diese konnten jedoch nicht genauer charakterisiert werden (Cheng et al.,

2006; Lanford et al., 2003). Was diese Zellen für die HCV Replikonsysteme präferiert ist

damit nicht bekannt. Da alle Replikonsysteme aktiv in die Zelle gebracht werden müssen

(Transfektion), ist die Analyse des Zelleintritts weiterhin nur begrenzt möglich. Die

effiziente Replikation von JFH-1 verläuft wie die der Replikons nur in Huh7-Zellen.

Jedoch liefert JFH-1 die Möglichkeit, HCV Infektionen vom Viruseintritt bis hin zum

Virusaustritt zu untersuchen. Problematisch ist, dass JFH-1 zum Subtypen 2a gehört,

jedoch zu allen bekannten 2a Sequenzen deutliche Unterschiede aufweist. Erkenntnisse

durch Infektionen mit JFH-1 beziehen sich nur auf diesen speziellen, extrem virulenten

Virusstamm und können nicht unbedingt generalisiert werden. Es ist weiterhin nicht

möglich, natürliche Isolate aller Subtypen in Zellkultur anzuziehen. Die klinische

Relevanz liegt aufgrund seiner weltweiten Verbreitung und der schlechteren Reaktion auf

die Interferon-Therapie bei Genotyp 1. Subtypenspezifische Erkenntnisse sind bisher nur

durch Versuche entsprechender Replikons möglich. Die Korrelation experimenteller

Ergebnisse mit einer natürlichen Infektion kann nicht unbedingt vorausgesetzt werden.

Noch immer ist unklar, warum JFH-1 als einziges Isolat so infektiös ist. Die Unterschiede

in den Genomanalysen von JFH-1 und anderen Isolaten könnten erklären, warum einige

HCV Stämme unkultivierbar sind.

1.2. Unspezifische Immunabwehr

Die unspezifische Immunabwehr wird auch als natürliches oder angeborenes

Immunsystem bezeichnet. Sie besteht aus einer Vielzahl löslicher Stoffe, den Zytokinen.

Diese können zum einen Fremdstoffe (Erreger) direkt abwehren oder durch ihre Bindung

an Zellen Proliferation, Differenzierung und Apoptose auslösen. Zu den Zytokinen

gehören u.a. Interferone, Interleukine und der Tumor-Nekrose-Faktor. Die Interferone

wurden 1957 als antiviral wirkende Substanzen erstmals durch Isaacs und Lindenmann

beschrieben (Lindenmann & Isaacs, 1957). Sie können von den Zelltypen Fibroblasten, T-

Lymphozyten und Makrophagen produziert werden. Interferone werden in die Gruppen

Typ I und Typ II Interferone eingeteilt. Die Typ I Interferone werden auch virale

Interferone genannt, da sie durch virale Infektionen induziert werden. Zu ihnen zählen

Einleitung

14

unter anderem die Interferone α (Leukozyteninterferon) und β (Fibroblasteninterferon).

Das Typ II Interferon genannte Interferon γ wird als Immun-Interferon bezeichnet und

durch Mitogen- oder Antigenstimulierte T-Lymphozyten produziert (Samuel, 2001). Die

Produktion von Interferon α und β stellt eine frühe Reaktion der Zelle dar und besitzt

daher eine Schlüsselrolle in der viralen Abwehr.

Ein entscheidendes intrazelluläres Signal zur Produktion von Interferon ist das

Vorhandensein von doppelsträngiger RNA (dsRNA). Gesunde Zellen enthalten

normalerweise keine dsRNA, welche jedoch während vielen viralen Infektionen gebildet

wird (Biron, 1998). Die Anwesenheit von dsRNA führt in der Zelle zur Transkription und

Translation von Interferonen. Interferone agieren nicht direkt mit dem Virus, sondern

induzieren die Synthese von Proteinen, welche den antiviralen Status der Zelle vermitteln.

Interferone können zum einen die Expression der RNA abhängigen Proteinkinase (PKR),

zum anderen das 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System (OAS) stimulieren (Dougherty et

al., 1981). Die Expression der PKR wird vorwiegend durch Interferon α und β stimuliert.

Nach Bindung der PKR an dsRNA kommt es intrazellulär zur Aktivierung der PKR durch

Autophosphorylierung. Die aktivierte Proteinkinase phosphoryliert den eukaryontischen

Initiationsfaktor 2 (IF-2) der Proteinbiosynthese. IF-2 hat die Aufgabe, Met-tRNA zur 40S

Untereinheit des Ribosoms zu transportieren und dadurch die Translation zu initiieren.

Dabei wird jeweils an IF-2 gebundenes GDP durch GTP ausgetauscht. Durch die

Phosphorylierung des IF-2 entsteht ein inaktiver Komplex aus IF-2 und GDP, wodurch die

Translation gehemmt wird. Es scheint jedoch eine relative Selektivität für die Hemmung

der viralen Translation zu bestehen (Zeuzem et al., 2001).

1.2.1. 2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System und RNase L

Das RNase L System oder OAS ist neben der Hemmung der Proteinsynthese durch die

PKR ein wichtiger antiviraler Signalweg und setzt sich aus den drei folgenden

enzymatischen Aktivitäten zusammen: der Oligadenylatsynthetase, der

2’-5’-Phosphodiesterase und der RNase L (siehe Abbildung 6). Während Interferon die

Expression der Oligoadenylatsynthetase erhöht, ist dsRNA als Kofaktor für die

Aktivierung der Synthetase erforderlich (Han & Barton, 2002). Die OAS katalysiert die

Polymerisierung von ATP zu 2’-5’Oligoadenylaten (OA). Diese 2’-5’Oligoadenylate

aktivieren das Hauptenzym des 2’-5’OAS - die 2’-5’Oligoadenylatabhängige

Endoribonuclease L oder RNase L (Bisbal et al., 1995).

Einleitung

15

Abbildung 6: schematische Darstellung des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System

Die RNase L wurde 1979 von Slattery als 185 kDa großes Protein mit einem

isoelektrischen Punkt von 5.5 beschrieben, wobei das Molekulargewicht durch die

Analysemethoden, Proteinkonzentrationen oder die Herkunft der Zellextrakte stark

schwanken kann (Slattery et al., 1979). Das Enzym kann mit nanomolaren Mengen von

2’-5’Oligoadenylate mit Kettenlängen von drei bis vier Adenylaten reversibel aktiviert

werden. Diadenylaten scheint die Fähigkeit der RNase L Aktivierung zu fehlen

(Dougherty et al., 1981). 1993 wurde ein 80 kDa großes Polypeptid kloniert, welches

2’-5’Oligoadenylate binden und RNA spalten kann (Zhou et al., 1993). Ein monoklonaler

Antikörper, welcher dieses 80 kDa Protein erkennt, neutralisiert die RNase L Aktivität

(Bisbal et al., 1995). Die Arbeitsgruppe um C. Bisbal vermutete, dass es sich bei dem

185 kDa großen Protein, welches Slattery als RNase L beschrieben hatte, um einen

Proteinkomplex aus mehreren Polypeptiden handelt.

Die RNase L wird durch ein einzelnes Gen kodiert und konstitutiv in den Zellen

exprimiert. Das latent vorliegende Enzym wird nicht durch Interferon reguliert (Player &

Torrence, 1998). An der reversiblen Aktivierung scheint die Bindung von

2’-5’Oligoadenylaten beteiligt zu sein. In Abwesenheit von 2’-5’Oligoadenylaten liegt die

RNase L als Monomer und inaktiv vor (Han & Barton, 2002). Nach der Bindung von

Einleitung

16

2’-5’Oligoadenylaten dimerisieren die Monomere, was zur Aktivierung des Enzyms führt

(Cole et al., 1997). Die aktive RNase L spaltet virale RNA hauptsächlich an den 3’Enden

von UA, UG oder UU Sequenzen in Regionen ohne Wasserstroffbrückenbindung

(Dougherty et al., 1981). Die 2’-5’Phosphodiesterase baut 2’-5’Oligoadenylate zu ATP

und AMP ab (Han & Barton, 2002), wodurch die Aktivität der RNase L reguliert wird.

Die Regulation der RNase L erfolgt sowohl durch die 2’-5’Phosphodiesterase als auch mit

Hilfe des RNase L Inhibitors (Benoit De Coignac et al., 1998).

1.2.2. RNase L Inhibitor (RLI)

1995 charakterisierten und klonierten Bisbal et al. ein Polypeptid, welches die RNase L

inhibiert (Bisbal et al., 1995). Dieses Polypeptid wurde RNase L Inhibitor (RLI) genannt.

Das Protein besitzt eine Größe von 68 kDA und bindet spezifisch an die RNase L.

Sequenzanalysen des RLI zeigen, dass die cDNA aus einer 5’ nicht kodierten Region von

118 Nukleotiden besteht, sowie einem ORF bis zu Nukleotid 1914 und einer 3’ nicht

translatierten Region von 1654 bp. In der Zelle existieren zwei RLI mRNAs verschiedener

Längen. Die mRNAs von 2.8 kb bzw. 3.5 kb unterscheiden sich lediglich in der Länge

ihrer 3’ nicht translatierten Region, kodieren jedoch für das gleiche RLI-Protein (Aubry et

al., 1996). Möglicherweise ist die 3’-UTR durch ihre Sekundärstruktur und Protein-RNA-

Interaktion an der Stabilität der mRNA beteiligt. Die biologische Relevanz der beiden

mRNAs ist nicht erforscht (Bisbal et al., 1995). Es wird angenommen, dass das RLI als

Regulatorprotein dient, welches die Bindung von 2’-5’Oligoadenylaten an die RNase L

inhibiert. Dabei geht das RLI möglicherweise eine direkte Verbindung mit der RNase L

ein, um die Bindungsstellen der OA zu blockieren (siehe Abbildung 6). Das RLI fördert

weder den Abbau der 2’-5’Oligoadenylate noch ist es selbst daran beteiligt (Bisbal et al.,

2001).

In Zellkulturversuchen mit dem Enzephalomyokarditis Virus (EMCV) wurde eine

verminderte Aktivität der RNase L detektiert (Cayley et al., 1982). Diese Inhibition

könnte das Resultat einer erhöhten RLI-Expression während der EMCV Infektion sein.

Western-Blot-Analysen der RNase L während der EMCV Infektion zeigten keine

verringerten Mengen an RNase L-Protein, während bereits 4 Stunden nach Infektion

gesteigerte Mengen RLI-Protein nachweisbar waren. Die stabile Transfektion eines RLI-

Antisense-Kontrukts führte zur Hemmung der RLI Inhibition und RNase L Inaktivierung

Einleitung

17

(Martinand et al., 1998). Das EMC-Virus scheint die Produktion des RLI-Proteins aktiv zu

steigern und dadurch die Aktivierung der RNase L zu hemmen.

Auch für das HI-Virus wurde ein Einfluss auf die Expression des RLI beschrieben

(Martinand et al., 1999). In Infektionsversuchen mit HIV in Zellkultur wurden erhöhte

Mengen an RLI-Protein nachgewiesen (Martinand et al., 1999). Strukturanalysen des

Proteins lassen vermuten, dass das RLI als ein ATP-angetriebenes Enzym an der

ribosomalen Biogenese und dem HIV Zusammenbau beteiligt ist (Karcher et al., 2005). In

klinischen Studien wurde ebenfalls festgestellt, dass die RNase L in Blutzellen von AIDS

Patienten inaktiv ist, obwohl 2’-5’Oligoadenylate als Aktivatoren der RNase L vorhanden

sind (Carter et al., 1987). Diese Hemmung der Aktivität der RNase L könnte auf das RLI

zurückzuführen sein.

In klinischen Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitis C Patienten wurde

dagegen eine signifikante Reduktion der Expression des RNase L Inhibitors festgestellt

(Yu et al., 2000). Es könnte daher eventuell ein Einfluss des RLI und der RNase L auf die

HCV Infektion vorliegen. Möglicherweise führt eine Reduktion des RLI durch die

Replikation des Hepatitis C Virus zu einer Aktivität der RNase L. Ein Gleichgewicht

zwischen Virusreplikation und RNase L-Aktivität könnte möglicherweise zur Ausbildung

der chronischen Hepatitis führen.

Für das Hepatitis C Virus wurden noch keine Zellkulturversuche unter Betrachtung des

RLI durchgeführt. Die Transkriptionsraten des RLI unter den experimentellen

Bedingungen der HCV Infektion sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert

werden. Die experimentelle Überexpression des RLI sollte eine potentielle Aktivierung

der RNase L verhindern und eine initiale Replikation des Virus in Zellkultur ermöglichen.

1.3. Polymerase Kettenreaktion

1.3.1. Historisches

Bereits 1971 führte der Norweger Kjell Kleppe Versuche zur Vervielfältigung von DNA

mit Hilfe von Primern durch, welche jedoch nicht weiter verfolgt wurden (Kleppe et al.,

1971). 1982 wurde die eigentliche Polymerase Kettenreaktion (PCR) von Kary Mullis

erfunden, der 1993 für diese Technik den Nobelpreis erhielt. Mullis verwendete zunächst

eine DNA Polymerase, welche bei jedem Denaturierungsschritt zerstört und anschließend

neu hinzugefügt werden musste. Später wurde eine hitzestabile Polymerase aus

Einleitung

18

Thermophilus aquaticus (Taq) eingesetzt, wodurch die PCR deutlich vereinfacht werden

konnte. Kary Mullis arbeitete für die Firma Cetus Corporation, welche 1992 die Technik

sowie das Patent der Taq-Polymerase an die Firma Roche für 300 Millionen Dollar

verkaufte (Mullis, 1998). Sowohl in den USA als auch vor dem Europäischen Gerichtshof

wurde der Firma Hoffmann-La Roche das Patent für die hitzestabile Taq-Polymerase

wieder aberkannt, da die Polymerase aus Thermophilus aquaticus bereits 1980

beschrieben wurde (Kaledin et al., 1980). Das US-Patent für die eigentliche Technik der

PCR lief am 28. März 2005 aus.

1.3.2. Prinzip der PCR

Die PCR ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Amplifikation von DNA-Bereichen

definierter Länge, die von zwei bekannten Sequenzen flankiert werden. Das

Originalprotokoll der PCR wurde 1985 in der Zeitschrift Science veröffentlicht. Saiki et

al. beschreiben in dieser Arbeit die Vervielfältigung des β-Globin Gens, welches zur

Diagnostik der Sichelzellanämie verwendet wurde (Saiki et al., 1985).

Das Prinzip der PCR basiert auf der Verdopplung der DNA. Jeder PCR-Zyklus setzt sich

aus drei Teilschritten mit verschiedenen Temperaturen zusammen, welche in mehreren

Zyklen wiederholt werden (siehe Abbildung 7).

Abbildung 7: Schematische Darstellung der PCR

Im ersten Schritt erfolgt die Auftrennung der Doppelstränge bei 90°C - 95°C in

Einzelstränge (Denaturierung). Beim zweiten PCR-Schritt hybridisieren spezifische

Einleitung

19

Primer bei 55°C - 65°C an die Einzelstränge (Annealing). Eine Taq-Polymerase

vervollständigt im dritten Schritt bei 72°C den neuen Doppelstrang (Amplifikation). Der

entstandene Doppelstrang wird im nächsten Zyklus zum Ausgangsmaterial. Durch die

mehrfache Wiederholung der Reaktionsfolge von Denaturierung, Hybridisierung und

Amplifikation kommt es in jedem Zyklus zu einer Verdoppelung der DNA. Nach n

Zyklen sollte die gesuchte DNA theoretisch 2n-fach vervielfacht worden sein. Die

Effizienz der PCR ist von Matrize zu Matrize unterschiedlich und vom Optimierungsstatus

der Methode abhängig.

1.3.3. Real time PCR

Die real time PCR basiert auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion und wurde 1992

von Higuchi et al. entwickelt (Higuchi et al., 1992). Konventionelle PCRs detektieren die

Amplifikationsprodukte am Ende der Kettenreaktion z.B. mittels Gelelektrophorese,

während die real time PCR die Menge der Amplifikate innerhalb der exponentiellen Phase

bestimmt. Der Einsatz interkalierender Farbstoffe oder fluoreszenzmarkierter Sonden

ermöglicht die direkte Beobachtung des Reaktionsverlaufes. Dadurch ist in der real time

PCR eine Quantifizierung des Ausgangsmaterials möglich. Die Quantifizierung basiert auf

der Grundlage, dass eine quantitative Beziehung zwischen der Menge des

Ausgangsmaterials und der Menge des Amplifikates während der exponentiellen Phase

besteht (Bustin, 2004). Nach n Zyklen sollte die gesuchte DNA 2n-fach vervielfacht

worden sein, vorausgesetzt die Ausbeute beträgt in jedem Zyklus 100 %.

Zu Beginn der Reaktion liegt der Farbstoff nicht-fluoreszierend vor oder fluoresziert nur

so schwach, dass das Signal nicht vom Hintergrund unterschieden werden kann (Kubista

et al., 2006). Die Fluoreszenz nimmt proportional zur Menge der PCR-Produkte zu (siehe

Abbildung 8 und Abbildung 9). Entscheidend für die Quantifizierung ist der cycle

threshold oder auch crossing point (ct – oder cp Wert). Dieser Wert beschreibt den Zyklus,

in dem die Fluoreszenz erstmals die Hintergrund-Fluoreszenz übersteigt. Die Berechnung

der eingesetzten DNA-Menge mit Hilfe einer Standardreihe sowie die Berechnung der

PCR-Effizienz werden in Kapitel 2.2.1.4 beschrieben.

Vorteile der real time PCR sind die schnelle Durchführbarkeit, der Nachweis der

Amplifikation in Echtzeit und die Quantifizierung des Ausgangsmaterials durch eine

mitgeführte Standardreihe. Das kleine Reaktionsvolumen in verschlossenen

Einleitung

20

Reaktionsgefäßen vermindert außerdem die Kontaminationsgefahr. Verglichen mit

ELISA’s sind real time PCRs ebenso spezifisch und sensitiv (Klein et al., 2003).

1.3.4. Fluoreszenzfarbstoffe

Die Detektion der Amplifikate kann in der real time PCR mit Hilfe sequenz-

unspezifischer Farbstoffe (siehe Abbildung 8) oder sequenz-spezifischer Sonden (siehe

Abbildung 9) erfolgen. Zu den sequenz-unspezifischen Farbstoffen zählen

Ethidiumbromid und SybrGreen. Diese Farbstoffe interkalieren zwischen den

Basenpaaren der DNA, wodurch nach Anregung mit ultraviolettem Licht die PCR-

Amplifikate fluoreszieren. Ein Nachteil interkalierender Substanzen wie Ethidiumbromid

oder SybrGreen ist die geringe Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten

nicht unterschieden werden kann. Es werden sowohl spezifische als auch unspezifische

Amplifikate detektiert. Aus diesem Grund sind auch Multiplex-Reaktionen (Nachweis

verschiedener spezifischer Templates in einem PCR Reaktionsansatz) mit Hilfe

interkalierender Substanzen nicht möglich.

Abbildung 8: Sequenz-unabhängige Fluoreszenzfarbstoffe. Interkalierung von SybrGreen in doppelsträngige DNA

Spezifische Sonden sind teurer als interkalierende Farbstoffe, gewährleisten jedoch die

nötige Spezifität und ermöglichen Multiplex-PCR Analysen. Es existieren verschiedene

Sondenformate, z.B. HyProbes, TaqMan-Sonden, Molecular Beacons oder MGB Sonden

(Eurogentec, 2004; Kubista et al., 2006). Da in dieser Arbeit lediglich TaqMan-Sonden

verwendet wurden, sollen nur diese kurz erläutert werden (siehe Abbildung 9). TaqMan-

Sonden, auch Hydrolyse-Sonden genannt, sind sequenzspezifische Oligonukleotide,

welche an einem Ende mit einem sogenannten Quencher-Farbstoff (z.B. BHQ oder

Einleitung

21

Tamra), am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff markiert sind (z.B.

Fam oder Joe). Durch die räumliche Nähe des Quenchers zum Farbstoff wird keine

Fluoreszenz detektiert. Während der Amplifikation wird die Sonde durch die

Endonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase stückchenweise abgebaut. Dadurch werden

Quencher und Fluoreszenzfarbstoff voneinander getrennt. Die Wirkung des Quenchers

zum Farbstoff wird aufgehoben und ein Anstieg der Fluoreszenz gemessen.

Abbildung 9: Sequenzspezifische TaqMan Sonde. Die Trennung von Fluorophor und Quencher durch Hydrolyse der Sonde führt zur Entstehung von Fluoreszenz.

1.3.5. ABI PRISM™ Systeme

Die ABI PRISM™ Systeme, auch TaqMan genannt, der Firma Applied Biosystems

verwenden 0,2 ml tubes (Reaktionsgefäße) oder 96-well-Platten. Die Beleuchtung der

Proben erfolgt in allen Geräten mit Hilfe einer Wolframlampe durch einen einzelnen

Anregungsfilter (siehe Abbildung 11). Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt mittels

Spektograph und einer gekühlten CCD Kamera. Die Laser- oder Halogen-basierenden

ABI Systeme sind lediglich zur Detektion von TaqMan oder SybrGreen Chemie

entwickelt worden (Bustin, 2004).

Der TaqMan 7900HT (siehe Abbildung 10) gehört zur zweiten Generation der real time

Systeme von Applied Biosystems. Es ist das einzige Gerät, welches sowohl 96- als auch

384-well-Platten verwenden kann. Außerdem ist es möglich, die Beladung des Geräts

Einleitung

22

vollautomatisch durchführen zu lassen. Ein Laser scannt die wells der Reaktionsplatte und

regt alle Farbstoffe mit einer kontinuierlichen Wellenlänge von 500 bis 660 nm an.

(http://keck.med.yale.edu/affymetrix/rtpcr/quantitative/7900HTbrochure.pdf)

Abbildung 10: TaqMan 7900HT Abbildung 11: Optisches System des ABI PRISM™ 7700

1.3.6. RotorGene™

Der RotorGene™ der Firma Corbett Research (siehe Abbildung 12) unterscheidet sich

hauptsächlich durch sein rotierendes Probenkarussel von anderen real time PCR

Systemen.

Abbildung 12: RotorGene™ 3000 (Quelle: Operator Manual)

Abbildung 13: Querschnitt der Reaktionskammer des RotorGene™ 6000 (Quelle: Operator Manual)

Einleitung

23

Das Gerät verwendet entweder einen 32er Rotor für 0,2 ml PCR-Gefäße oder einen 72er

Rotor für spezielle 0,1 ml tubes. Alle Reaktionsgefäße rotieren mit ca. 500 rpm durch eine

luftgefüllte Kammer (Bustin, 2004). Temperaturunterschiede zwischen den einzelnen

Reaktionsgefäßen (edge effect), wie sie bei Plattensystemen vorkommen, treten im

RotorGene nicht auf. Zur Anregung und Detektion der Fluoreszenz bewegen sich alle

tubes über die gleiche Optik, wodurch eine Kalibrierung unnötig ist (siehe Abbildung 13).

Auch eine passive Referenz wie beispielsweise ROX ist aus diesem Grund nicht nötig

(http://www.corbettlifescience.com/shared/images/flash/rotor-gene_brochure_

a4_72dpi.pdf). Der RotorGene kann jede derzeitig verfügbare real time Sondenchemie

detektieren. Dabei verwendet das Gerät vier LEDs, welche die Farbstoffe mit den

Wellenlängen 470, 530, 585 und 625 nm anregen können. Der Detektionsfilter besitzt 6

Filter zwischen 510 und 660 nm (Bustin, 2004).

Einleitung

24

1.4. Ziel der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine initiale Replikation des Hepatitis C Virus in

Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die eingesetzte virale RNA nicht zu

verändern. In der Annahme, dass bei der HCV Infektion oder Transfektion von full length

RNA doppelsträngige Intermediate entstehen, welche die zelluläre RNase L über den

OAS-Weg aktivieren, sollte diese mit Hilfe der Überexpression des RLI ausgeschaltet

werden. Aktive RNase L degradiert doppelsträngige RNA und verhindert dadurch die

virale Replikation.

Es sollten Huh7- und FRhK-4-Zellen werden. Humane Leberzellen (Huh7) sind die

natürlichen Wirtszellen des Hepatitis C Virus und die Zellen, in denen HCV Replikons

und JFH-1 bereits effizient replizieren. Für Klone von FRhK-4-Zellen, welche mit dem

RLI transfiziert wurden, konnte in einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein

gesteigertes HAV Wachstum beobachtet werden (Gotter, 1999). HAV ist wie das

Hepatitis C Virus ein einzelsträngiges RNA Virus in Plusstrangorientierung. Es sollte

analysiert werden, ob die Zelleigenschaft der FRhK-4-Klone auch auf die Replikation des

Hepatitis C Virus einen positiven Einfluß ausübt.

Der RNase L Inhibitor sollte aus humaner- und Affen-gesamt-Zell-RNA amplifiziert und

in einen Transfektionsvektor kloniert werden. Nach Transfektion in FRhK-4- und Huh7-

Zellen sollte die Expressionsrate mittels real time PCR nachgewiesen werden. Für den

Nachweis auf Genexpressionsebene sollten zunächst real time PCRs für die Analyse der

mRNAs von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA entwickelt werden. Es

sollte versucht werden, Transfektanten von Huh7- und FRhK-4-Zellen heranzuziehen,

welche das RLI stabil überexprimieren. Diese Zellen sollten mit HCV-positivem und

infektiösem Frischplasma infiziert werden. Zur Umgehung des kritischen Viruseintritts in

die Zellen sollte HCV full length RNA transfiziert werden. Zur Analyse der HCV RNA

sollte auf Basis eines existierenden HCV Primer- und Sondensystems der Firma QIAGEN

Hamburg GmbH (ehemals artus GmbH) ein neues real time RT-PCR System entwickelt

und optimiert werden. Aufgrund qualitativer Schwankungen verwendeter Enzyme im

bestehenden HCV Nachweissystem sollte eine Umstellung der Puffer und Enzyme

erfolgen. Hinsichtlich einer potentiellen kommerziellen Nutzung des HCV Assays waren

neben Spezifität und Sensitivität die Herstellungskosten des Systems ebenfalls Kriterium

der Neuentwicklung.

Material und Methoden

25

2. Material und Methoden

2.1. Materialien

2.1.1. Antikörper

Anti His(C-term)-FITC Antibody, Invitrogen, Karlsruhe, Catalog no. R933-25

2.1.2. Bioreagenzien

Alkalische Phosphatase Roche, Mannheim

Agarose analytical grade Gibco, Karlsruhe

β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

CIP-Puffer (Dephosphorylation buffer) Roche, Mannheim

DMEM Sigma, Deisenhofen

DNA-Marker, 100 bp MBI Fermentas, St. Leon-Roth

DNA-Marker, 1 kb MBI Fermentas, St. Leon-Roth

DNA-Marker, 100 bp ladder plus MBI Fermentas, St. Leon-Roth

DNA-Marker, Hyperladder V Bioline, USA

DNA-Marker, 1 kb Invitrogen, Karlsruhe

DNase I QIAGEN, Hilden

Ethanol p.a. Carl Roth, Karlsruhe

Ethidiumbromid Merck, Darmstadt

FCS Gibco, Karlsruhe

FuGene 6 Transfection Reagent Roche, Mannheim

Geneticin (G418) Gibco, Karlsruhe

Glycerol p.a. Roth, Karlsruhe

ISIS DNA Polymerase™ 5U/μ l QBiogene, USA

LB-Agar (Lennox L Agar) Invitrogen, Karlsruhe

LB Broth Base (Lennox Broth Base) Invitrogen, Karlsruhe

L-Glutamin Sigma, Deisenhofen

MgSO4 1M Sigma, Deisenhofen

NaHCO3 Sigma, Deisenhofen


26

Penicillin10000 U/ml /Streptomycin 10mg/ml Gibco, Karlsruhe

Platinum® Taq DNA Polymerase 5U/μ l Invitrogen, Karlsruhe

Pu3-5x-PCR-Puffer QIAGEN, Hamburg

Takara Taq HS 5U/μ l Takara, Japan

TaqMan® 2x Universal PCR Master Mix (ABI 2x Puffer) Applied Biosystem, USA

Tetrazyklinhydrochlorid Sigma, Deisenhofen

Trypsin-EDTA (2,5 mg/ml Trypsin + 1,25 mg/ml EDTA) Sigma, Deisenhofen

jetPEI QBiogene, USA

human liver total RNA Ambion, Austin / USA

human kidney total RNA Ambion, Austin / USA

2.1.3. Gebrauchsfertige Kits

Endofree Plasmid Maxi Kit QIAGEN, Hilden

MEGAscript® High Yield Transcription Kit Ambion, Austin / USA

NucleoSpin® Plasmid Kit Machery-Nagel, Düren

pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA Expression Kit Invitrogen, Karlsruhe

Rapid DNA Ligation Kit MBI Fermentas, St. Leon-Roth

RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit MBI Fermentas, St. Leon-Roth

RNeasy® Mini Kit QIAGEN, Hilden

QIAamp®Viral RNA Mini Kit QIAGEN, Hilden

QIAGEN® Plasmid Mini Kit QIAGEN, Hilden

QIAprep® Mini Kit QIAGEN, Hilden

QIAquick® Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden

RealArt TM HAV LC RT PCR Reagents QIAGEN, Hamburg

2.1.4. Geräte

ABI PRISM™ 7900HT Applied Biosystem, USA

Artus 3000/RotorGene™ 3000 Corbett, Research, Australia

BioPhotometer Eppendorf, Hamburg

Brutschrank Heraeus, Hanau

Elektrophoresekammer Bio-Rad, Herculas, CA, USA

Fluoreszenzmikroskop "Axioskop 2" Carl Zeiss, Jena


27

Geldokumentationsanlage Kodak, Stuttgart

Kolbenhubpipetten (verschiedene Größen) Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifugen Eppendorf und Heraeus

Schüttler LTF-Labortechnik, Wasserburg

Mastercycler 5330 Eppendorf, Hamburg

2.1.5. Medien und Lösungen

DMEM: DMEM Pulver für 500 ml, 2mM L-Glutamin, 26 mM NaHCO3, 50 ml FCS,

5 ml Penicillin/Streptomycin

Im Folgenden bezieht sich die Bezeichnung Medium oder DMEM immer auf das

komplette Medium mit allen zugefügten Komponenten.

PBS (Phosphat buffered saline/Phosphat-gepufferte Salzlösung): 1xPBS: 8 g NaCl, 0,2 g

KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 , 1l destilliertes Wasser, autoklaviert.

Einfriermedium: 10%DMSO in FCS

LB-Medium: 20 g LB Broth Base, 1l destilliertes Wasser, autoklavieren

LB-Agarplatte: 32 g LB-Agar, 1l destilliertes Wasser, autoklavieren

Nach dem Autoklavieren ca. 25 ml LB-Agar pro Platte gießen und erkalten lassen

2.1.6. Oligonukleotide

Tabelle 2: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer (Metabion, Martinsried). Name Sequenz und Nukleotidposition Anwendung

RNase L for 5`-GAC CTG CTG GGT CAT CCC TT-3´

Nukleotidposition 1901-1920 NCBI NM_021133

Vorwärtsprimer RNase L

RNase L rev 5´-CAT TTC CCA CAT TCC GAA GC -3`


Rückwärtsprimer RNase L

RNase L Sd 5´-FAM-TTT TGG ACT TGG GAG AGC CGC

TAT AGG A-TAMRA-3´


Sonde RNase L


28

RLI for 5`-AAG ACT GAT GGC AGC TCG AGT T -3´

Nukleotidposition 898-919 NCBI X74987

Vorwärtsprimer RLI

RLI rev 5´- ATG ACG CGA TCC GCT AGA TAG -3`


Rückwärtsprimer RLI

RLI Sd 5´-FAM-CGT TTC ATA CTC CAT GCA AAA

AAG ACA GCC TTT -TAMRA-3´


Sonde RLI

RLI full nah

for

5’ – TCG TTT CTC CAG AAG AGC TGG ATA

T – 3’


Vorwärtsprimer für die full-

lenght Amplifikation des

RLI full nah

rev

5’ – GTA AAT ACT CCT TTT AAT AAA TGG

CTT ATC AAT – 3’


Rückwärtsprimer für die

full- lenght Amplifikation

des RLI

RLI full for

direkt

5’ – ATG GCA GAC AAG TTA ACG AGA

ATT GCT – 3’


Vorwärtsprimer für die full-

lenght Amplifikation des

RLI

RLI full rev

ohne Stop

5’ – CGA ATC ATC CAA GAA AAA GTA

GTT TCC ACT – 3’


Rückwärtsprimer für die

full- lenght Amplifikation

des RLI ohne Stop-Codon

18S rRNA

for

5`- ACG GCT ACC ACA TCC AAG GA -3’

Nukleotidposition 550-569 NCBI M10098

Vorwärtsprimer 18S rRNA

18S rRNA

rev

5´- CCA ATT ACA GGG CCT CGA AA -3`


Rückwärtsprimer 18S rRNA

18S rRNA

Sd

5´-FAM- CAG GCG CGC AAA TTA CCC ACT

CC -TAMRA-3´


Sonde 18S rRNA

GAPDH for 5`- CCT GCA CCA CCA ACT GCT TAG -3´

Nukleotidposition 512-532 NCBI BC025925

Vorwärtsprimer GAPDH

GAPDH rev 5´- CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA -3`


Rückwärtsprimer GAPDH

GAPDH Sd 5´-FAM- ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG

GAC TCA TGA CC -TAMRA-3´


Sonde GAPDH


29

T7 5’ –TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3’ Vorwärtsprimer zur

Sequenzierung des Inserts

aus pcDNA3.1/V5-His

BGH rev 5’ –TAG AAG GCA CAG TCG AGG –3’ Rückwärtsprimer zur

Sequenzierung aus

pcDNA3.1/V5-His

2.1.7. Plasmide

Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete Plasmide.

Plasmid Charakteristika Herkunft

pcDNA3.1/V5-His

Topo TA

Vektor zur Klonierung von PCR-

Fragmenten in E.coli

Invitrogen, Karlsruhe

pcDNA3/RLI 3’ Klonierungsvektor, abgeleitet von

pcDNA3.1, der das humane RLI enthält

(Bisbal et al., 1995)

pcDNA3.1/V5-His-

m_RLI

Klonierungsvektor, abgeleitet von

pcDNA3.1/V5-His, der das Affen

(monkey) -RLI enthält

Teil dieser Arbeit

pcDNA3.1/V5-His-

h_RLI

Klonierungsvektor, abgeleitet von

pcDNA3.1/V5-His, der das humane-RLI

enthält

Teil dieser Arbeit

pl.18 Vektor zur Klonierung von PCR-

Fragmenten in E.coli

Jim Robertson; NCBI

pl.18-m_RLI Klonierungsvektor, abgeleitet von pl.18,

der das Affen (monkey) -RLI mit His-

Tag enthält

Teil dieser Arbeit

pl.18-h_RLI Klonierungsvektor, abgeleitet von pl.18,

der das humane-RLI mit His-Tag enthält

Teil dieser Arbeit

P90/HCV FL-long PU Klonierungsvektor, abgeleitet von

pBR322, der die komplette Konsensus

cDNA des HCV-Isolats H77

(Kolykhalov et al., 1997) vom Genotyp

1a unter der Kontrolle eines T7

Promoters enthält

Ph.D. C. M. Rice

(Washington University in

St. Louis, School of

Medicine, Department of

Molecular Microbiology)


30

pSV2neo Vektor mit G418 Resistenzgen zur

Kotransfektion von pl.18

Clontech, U.S.A

ZC-5.1 pBluescript abgeleiteter Vektor mit der

RNase L als Insert

zur Verfügung gestellt von

R.Silverman (Cleveland

Clinic Foundation)

2.1.8. Restriktionsendonukleasen

Tabelle 4: In dieser Arbeit verwendete Restriktionsenzyme.

Restriktionsenzym Schnittstelle Firma

EcoRI G↓AATTC Roche, Mannheim

EcoRV GAT↓ATC Roche, Mannheim

Hind III A↓AGCTT MBI Fermentas, St. Leon-Roth

Kpn I GGTAC↓C Roche, Mannheim

Mss I (Pme I) GTTT↓AAAC MBI Fermentas, St. Leon-Roth

Mva1269I (Bsm I) GAATGC(N)1/-1↓ MBI Fermentas, St. Leon-Roth

Xba I T↓CTAGA Roche, Mannheim

Xho I C↓TCGAG MBI Fermentas, St. Leon-Roth

2.1.9. Software

ABI 7900HT SDS 2.1 Applied Biosystem, USA

DNASTAR: MegAlign und EditSeq Vers 5.06 DNASTAR Inc., Madison

EndNote 5.0 Thomson Scientific, London

Kodak ds 1D Vers. 2.0.3 Kodak digital science,

Rochester, USA.

Microsoft Word/Exel 2002 Microsoft GmbH,

Unterschleißheim

Plasmid Processor 1.02 University of Kuopio, Finnland

Primer Express Version 2.0.0 Applied Biosystem, USA

PriProbit Vers. 1.63 Kyoto University, Kyoto, Japan

RotorGene Software Version 5.0.63 Corbett Research, Australia

Sequence Navigator Version 1.0.1 Perkin Elmer, USA


31

2.1.10. Verbrauchsmaterialien

Pipetten 10 ml, 25 ml Sarstedt, Nümbrecht

Zellkulturflaschen 75 cm2 Nunc, Wiesbaden

Zellkultkurplatten 6-well, 24-well, 96-well Nunc, Wiesbaden

Eppendorfgefäße 1,5 ml, 2 ml Eppendorf, Hamburg

Schalen 6 cm, 10 cm Nunc, Wiesbaden

Falkons 15 ml, 50 ml Sarstedt, Nümbrecht

0,5 ml Thermo-tubes Abgene, UK

96-well optical reaction plate Applied Biosystem, USA

RotorGene 0,1 ml tubes Corbett Research, Australia

2.1.11. virologische Materialien

Hepatitis C Panel Referenzzentrum für Hepatitis C, Universität Essen,

Virologisches Institut, Prof. Dr. M. Roggendorf

http://www.hepatitis-c-referenzzentrum.de/html/hcvpanel.htm

Hepatitis C Plasma Blutspendedienst Hagen, Frischplasma, infektiös

2.1.12. Zelllinien

FRhK-4-Zellen: Zelllinie von fetalen Rhesusaffennierenzellen, Center für Biologics

Evaluation and Research (CBER/FDA) Abteilung für Virologie, Bethesda, Maryland,

USA. FRhK-4-Zellen reagieren nicht auf Interferon, zeigen aber eine konstitutive

Expression der OAS und RNase L (Brack, 1999).

FRhK-4-6er Klone: Zelllinie von fetalen Rhesusaffennierenzellen stabil mit dem humanen

RNase L Inhibitor aus pcDNA3/RLI 3’ transfiziert, Diplomarbeit Jörn Gotter (1999),

Universität Bremen. In diesen Zellen zeigt das Hepatitis A Virus ein stärkeres Wachstum

als in FRhK-4-Zellen (Gotter, 1999).

Huh7-Zellen: Zelllinie von humanen Leberzellkarzinomzellen, Universität Bremen. Nur in

dieser Zelllinie war bisher die Anzucht des Hepatitis C Virus JFH-1 oder die Replikation

von HCV-RNA durch Replikonsysteme möglich (Bartenschlager et al., 2003; Kato &

Wakita, 2005)


32

2.2. Methoden

2.2.1. Molekularbiologie

2.2.1.1. Aufreinigung von Zell-RNA mit dem RNeasy® Mini Kit

Die Aufreinigung der zellulären RNA erfolgte nach Protokollangaben des Herstellers. Für

die Aufarbeitung transient transfizierter Zellen war ein zusätzlicher DNase Verdau zum

Abbau von Plasmid DNA nötig. Die Zellen wurden zunächst nach Protokoll aufgereinigt

und die QIAamp Säulen aufbewahrt. Das Eluat wurde erneut in 350 μ l RLT-Puffer

aufgenommen, mit 250 μ l Ethanol gemischt und auf die Säule gegeben. Nach dem RW1-

Wasch- und Zentrifugationsschritt erfolgt der DNase Verdau. Hierzu wurden 15 μ l

DNase I mit 90 μl RDD-Puffer gemischt, auf die Säule gegeben und bei Raumtemperatur

(20°C - 30°C) für mindestens 60 min inkubiert. Die weitere Aufarbeitung wurde nach

RNeasy® Protokoll ab dem RW1-Waschschritt durchgeführt.

2.2.1.2. DNA-Auftrennung im Agarosegel

Die Auftrennung von PCR-Produkt bzw. Plasmid-DNA erfolgte durch Agarosegel-

Elektrophorese. Je nach Fragmentgröße der zu trennenden DNA wurde ein 1, 2 oder

3%iges Agarosegel verwendet. 8 μ l DNA wurden mit 2 μl Ladepuffer (6x Loading Dye

MBI Fermentas, St. Leon-Roth) versetzt und bei 80 V elektrophoretisch analysiert. Je

nach Fragmentgröße wurden verschiedene Marker verwendet.

2.2.1.3. cDNA-Synthese

Die cDNA-Synthese wurde nach Protokoll des RevertAidTM H Minus First Strand cDNA-

Synthesis Kit durchgeführt. Es wurden 5 μ l der RNeasy® aufgereinigten Zell-RNA

eingesetzt und mit random hexamer Primern in cDNA umgeschrieben (Ausnahme:

cDNA-Synthese für die full length Amplifikation des RLI. Hier wurden oligodT-Primer

verwendet). Zur Kontrolle des DNase Verdaus wurde die Synthese sowohl mit als auch

ohne Reverse Transkriptase durchgeführt.


33

2.2.1.4. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI

und GAPDH sowie der 18S rRNA

Zur Kontrolle der RNA-Aufreinigung und des DNase Verdaus wurde die cDNA-Synthese

jeweils mit und ohne Reverse Transkriptase durchgeführt. Der Einsatz von cDNA ohne

Reverse Transkriptase in die PCR zeigte mindestens eine log-Stufe weniger Amplifikate

als der Einsatz von cDNA mit Reverser Transkriptase. Je später PCR-Signale von cDNA-

Templates ohne Reverser Transkriptase detektiert werden, desto erfolgreicher und

sauberer sind die RNA-Aufreinigung und der DNase Verdau verlaufen.

PCR-Ansatz:

Wasser 10,1 μ l

ABI 2x Puffer 12,5 μ l

Primer for (10 μM) 0,1 μ l

Primer rev (10 μM) 0,1 μ l

Platinum (5 U/μ l) 0,1 μ l

Template cDNA 2 μ l

Real time PCR Temperaturprofil:

Initiale Denaturierung 10 min, 95 °C

Denaturierung 15 sec, 95°C

Amplifikation 1 min, 55°C

Zyklenanzahl: 40

Spezifität der PCR: Die Spezifität ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit eines falsch-

positiven Ergebnisses.

Um unspezifische Amplifikationen durch die eingesetzten Primer auszuschließen, wurde

gesamt-Zell-RNA in cDNA umgeschrieben und als Template in die verschiedenen real

time PCRs (RLI, RNase L, 18S rRNA, GAPDH) eingesetzt. Die PCR-Amplifikate wurde

im 3%igen Agarosegel aufgetrennt und auf unspezifische Bandenmuster überprüft.

PCR-Effizienz: Die PCR-Effizienz ist ein Maß für das Verhältnis von Amplifikat- und

eingesetzter Probenmenge. Im Idealfall liegt eine Verdopplung der Amplifikate pro

Zyklus vor. In diesem Fall beträgt die PCR-Effizienz 100 %.


34

Zur Berechnung der PCR-Effizienz wurde die „slope“-Methode (Anstiegsmethode)

verwendet. Für diese Methode wird eine Verdünnungsreihe für jedes Template generiert

und der ct-Wert jedes Verdünnungspunktes bestimmt. In einem Diagramm werden die ct-

Werte gegen die jeweiligen logarithmischen Konzentrationen der cDNA aufgetragen. Eine

lineare Regressionsgerade (y = ax + b) wird berechnet und ihr Anstieg bestimmt. Der

erwartete Anstieg (a) einer logarithmischen Verdünnungsreihe beträgt -3,32, wenn die

PCR-Effizienz bei (E) = 1,0 (100 %) liegt. Die PCR-Effizienz berechnet sich mit der

Anstiegsmethode der linearen Regressionsgeraden nach der Formel: E = 10(-1/Anstieg) -1

(Eurogentec, 2004). Beispiel: Beträgt der Anstieg einer Regressionsgeraden -3,33, so

berechnet sich die PCR-Effizienz durch E = 10(-1/-3,33) -1. E = 1,995-1. Die PCR-Effizienz

beträgt somit 0.995 oder 99,5%.

Quantifizierung: Mit Hilfe der Regressionsgeraden oder Standardkurve erfolgt auch die

Quantifizierung der unbekannten Proben. Die Konzentrationen der Verdünnungspunkte

der Standardreihe werden definiert. Die RNA-Menge der unbekannten Proben wird

anschließend durch die Software des ABI 7900HT anhand der Standardkurve berechnet.

Es wird davon ausgegangen, dass das Verhältnis der eingesetzten cDNA proportional zur

mRNA ist, d.h. für jede spezifische mRNA während der cDNA Synthese in einem

konstanten Verhältnis entsprechend viel cDNA entsteht.

2.2.1.5. Full length Amplifikation des RNase L Inhibitor

Aus FRhK-4-Zellen wurde die RNA mit dem RNeasy® Mini Kit nach Protokoll

aufgereinigt und 5 μ l des Eluates in die cDNA-Synthese eingesetzt. Bei der Verwendung

humaner Nieren-gesamt-Zell-RNA von Ambion wurde 1 μl Probe in die cDNA-Synthese

eingesetzt. 2 μ l der cDNA wurden anschließend in die long-range PCR zur full length

Amplifikation des RLI verwendet. Für die Amplifikation des RLI wurden die Vor- und

Rückwärtsprimer „RLI full nah“ eingesetzt. Um den His-Tag des pcDNA3.1/V5-His zu

exprimieren, wurden in einer weiteren full length Amplifikation die Primer „RLI full

direkt for“ und „RLI full direkt rev ohne Stop“ verwendet, um das Stop-Codon

auszuschalten. Die long-range PCR wurde im Eppendorf Mastercycler durchgeführt.


35

PCR-Ansatz:

Wasser 34,35 μ l

Pu3-Puffer (5x) 10 μ l

dNTP (5 mM) 1,5 μ l

MgSO4 (50 mM) 1,5 μ l

Takara (5 U/μ l) 0,35 μ l

ISIS Taq (1 IU/μ l) 0,1 μ l

Primer for (10 μM) 0,1 μ l

Primer rev (10 μM) 0,1 μ l

Template cDNA 2 μ l

Long-range PCR Temperaturprofil:

Initiale Denaturierung 2 min, 95 °C

Denaturierung 1 min, 95°C


5 min, 72°C

10 min, 72°C

Zyklenanzahl: 40

Die Kontrolle der full length Amplifikation erfolgte im 1%igen Agarosegel.

2.2.1.6. Klonierung des RLI in pcDNA3.1/V5-His und Transformation von E.coli

Die Klonierung von humanem und Affen RNase L Inhibitor erfolgte mit dem

pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA Expression Kit nach den Protokollangaben des

Herstellers. Je 4 μ l PCR-Produkt wurden mit 1 μ l Salt-Solution und 1 μ l pcDNA3.1/V5-

His versetzt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transformation wurde nach

der Hitzeschock-Methode (Hanahan, 1983) durchgeführt. Ein Röhrchen Top10 E.coli

Zellen wurde auf Eis aufgetaut und mit 2 μ l des Ligationsansatzes versetzt. Nach

3-minütiger Inkubation auf Eis erfolgte der Hitzeschock bei 42°C für 30 sec im

Wasserbad. Die Zellen wurden für 2 min auf Eis gestellt und anschließend mit 250 μl

SOC-Medium versetzt. Nach 1 h Inkubation im Schüttler bei 37°C und 500 rpm wurde der

komplette Transformationsansatz auf LB-Agar mit Ampicillin (100 μg/ml) ausgestrichen.

Über Nacht wurden die Agarplatten bei 37°C inkubiert. Die Klone wurden mit sterilen


36

Pipettenspitzen in 96-well-Mikrotiterplatten gepickt, welche pro Vertiefung 200 μ l LB

Medium 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Nach 24 h Inkubation bei 37°C wurden die

Klone per PCR auf das Insert (RLI) getestet. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte

wurden je 75 μ l 66%iges steriles Glycerol gegeben, vorsichtig gemischt und die Platte bei

-70°C eingefroren.

2.2.1.7. Klonscreening mittels PCR

In einer TaqMan Platte wurde in jede Vertiefung 10 μ l Wasser vorgelegt. Mit einer

Multipipette wurden die Bakterienkulturen der 96-well-Mikrotiterplatte einmal

aufgezogen und wieder in die Vertiefungen entlassen. Die Pipettenspitzen wurden

anschließend in den vorgelegten 10 μ l Wasser gespült. Jeder Vertiefung wurde 15 μ l PCR-

Mastermix zugegeben, die Platte verschlossen und die PCR im Eppendorf Mastercycler

durchgeführt.

PCR-Ansatz:

Wasser 8,2 μ l

Pu3-Puffer (5x) 5 μ l

dNTP (5 mM) 0,75 μ l

MgSO4 (50 mM) 0,75 μ l

Takara (5 U/μ l) 0,2 μ l

T7 Primer (10 μM) 0,05 μ l

RLI rev (10 μM) 0,05 μ l

PCR Temperaturprofil:

Initiale Denaturierung 10 min, 95°C

Denaturierung 1 min, 95°C


3 min, 72°C

10 min, 72°C

Zyklenanzahl: 35

Die Kontrolle der full length Amplifikation erfolgte im 1%igen Agarosegel.


37

2.2.1.8. Präparation der rekombinanten Plasmide

Einige ausgewählte E.coli Klone, welche das Insert enthalten, wurden über Nacht in 5 ml

LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C angezogen. Je 850 μ l Bakterienkultur

wurde mit 150 μ l sterilem Glycerol gemischt und bei -70°C eingefroren. Zur Aufreinigung

der Plasmid-DNA wurden je 3 ml Bakterienkultur in das NucleoSpin® Plasmid Kit

eingesetzt. Die Aufarbeitung erfolgt nach Protokollangaben des Herstellers. 1 μ l Eluat

wurde mit 50 μ l sterilem Wasser gemischt und die Konzentration der enthaltenen DNA im

Eppendorf BioPhotometer gemessen. Zur Kontrolle der Orientierung des Inserts wurden

die Plasmide einem Restriktionsverdau unterzogen. Je 8 μ l pcDNA3.1/V5-His-m_RLI

bzw. 8 μl pcDNA3.1/V5-His-h_RLI wurden mit 0,2 μ l Wasser, 1 μ l 10x Puffer R+ und je

0,4 μ l HindIII (10 U/μ l) und XhoI (10 U/μ l) versetzt. Die Restriktion erfolgte 90 min bei

37°C im Eppendorf Mastercyler.

Zur Transfektion von Plasmid-DNA in FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden endotoxinfreie

Plasmide verwendet. Dazu wurden je 150 - 200 ml Bakterienkultur mit dem Endofree

Plasmid Maxi Kit nach Protokollangaben des Herstellers aufgereinigt. Die Plasmide

wurden photometrisch vermessen und mittels Restriktion kontrolliert.

2.2.1.9. Sequenzierung

Die Sequenzierung des humanen- und FRhK-4-RLI-Inserts der verwendeten Plasmide

pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI wurde von Dr. H. Schmidt vom DNA-Cloning-

Service (Ohnhorststrasse 18, 22609 Hamburg) durchgeführt. Es wurden folgende Primer

verwendet: T7, BGH rev (beide nur für pcDNA3.1/V5-His_RLI), RLI for, RLI rev, RLI

full rev ohne Stop (nur für Plasmide mit ausgeschaltetem Stopcodon).

Die Auswertung der Sequenzdaten erfolgte mit dem Sequence Navigator Version 1.0.1.

2.2.1.10. Umklonierung des RLI aus pcDNA3.1/V5-His_RLI in pl.18

Restriktion: Das humane und das Affen RLI sollten mit dem His-Tag aus den

entsprechenden pcDNA3.1/V5-His_RLI Vektoren herausgeschnitten werden.

Restriktionsansatz 1. Schnitt: 2 μ l Puffer B + 1,4 μ l pcDNA3.1-V5/His_RLI

(2 μg) + 12,6 μ l H2O + 4 μ l MssI (5 U/μ l). Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die

Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Restriktionsansatz 2. Schnitt: Dem


38

ersten Restriktionsansatz wurden 2 μ l KpnI (10 U/μ l) zugegeben. Die Restriktion erfolgte

für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min.

Der Klonierungsvektor pl.18 wurde ebenfalls mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten.

Restriktionsansatz 1. Schnitt: 2 μ l Puffer L + 10 μl pl.18 (2 μg) + 2 μ l BSA (1 mg/ml) +

4 μ l H2O + 2 μ l KpnI (10 U/μ l). Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die

Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Restriktionsansatz 2. Schnitt: Dem

ersten Restriktionsansatz wurden 0,8 μ l 2,5 M NaCl und 2 μ l EcoRV (10 U/μ l)

zugegeben. Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung

anschließend bei 65°C für 20 min.

Dephosphorylierung von pl.18: Um das Religationsvermögen von pl.18 zu verringern,

wurde der geschnittene Vektor dephosphoryliert. Dephosphorylierungsansatz: pl.18

Restriktionsansatz + 2,2 μ l Dephophorylationbuffer + 2 μ l Alkalische Phophatase. Die

Inkubation erfolgte 30 min bei 37°C. Zur Inaktivierung der Alkalischen Phosphatase

wurden 4 μ l 100 mM EGTA zugegeben und 10 min bei 65°C inkubiert.

Aufreinigung des restringierten RLI: Die geschnittenen Vektoren pcDNA3.1/V5-His-

m_RLI und pcDNA3.1-V5/His-h_RLI wurden im 1%igen Agarosegel aufgetragen und die

Restriktion kontrolliert. Die RLI-Banden bei 18 kb wurden aus dem Gel ausgeschnitten

und mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers aufgereinigt.

Die DNA-Fragmente wurde in je 30 μ l EB Puffer eluiert.

Ligation: Die Ligation von pl.18 und RLI erfolgt mittels Rapid DNA Ligation Kit nach

den Angaben des Herstellers. Ligationsansatz: je 13,6 μ l humanes- bzw. FRhk-4-RLI_His

+ 2,4 μ l pl.18 + 4 μ l 5x Rapid ligation buffer + 1 μ l T4 DNA Ligase (5 U/μ l). Nach

kurzem Vortexen und Zentrifugieren wurde 30 min bei 22 °C inkubiert.

Transformation: 50 μ l E.coli C600 wurden 10 min auf Eis aufgetaut und anschließend mit

2 μ l Ligationsansatz versetzt. Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis wurde 2 min bei 42°C

im Wasserbad ein Hitzeschock durchgeführt, 2 min auf Eis inkubiert, danach 200 μ l LB++

Medium zugegeben. Nach 1 h bei 37°C auf dem Schüttler wurde der

Transformationsansatz auf LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Die Inkubation

erfolgte über Nacht bei 37°C. Je 8 Klone (humanes bzw. FRhK-4 pl.18_RLI) wurden in je

3 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) gepickt und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Die Aufreinigung von je 1,5 ml Bakterienkultur erfolgte mit dem QIAprep® Mini Kit

nach Protokoll des Herstellers.


39

Kontrollrestriktion: Zur Kontrolle von pl.18_RLI wurden 20 μ l Eluat der

Plasmidpräparation mit 3 μ l Puffer H und 0,3 μ l XhoI versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert.

Die Kontrolle der Restriktionen erfolgte im 1%igen Agarosegel.

2.2.1.11. In vitro Transkription von HCV full length HCV RNA

Transformation: Die Transformation wurde nach der Hitzeschock-Methode (Hanahan,

1983) durchgeführt. Ein Röhrchen Top10 E.coli Zellen wurde auf Eis aufgetaut und mit

2 μ l p90/HCV FL-long pU (100 ng/μ l) versetzt. Nach 3minütiger Inkubation auf Eis

erfolgte der Hitzeschock bei 42°C für 30 sec im Wasserbad. Die Zellen wurden für 2 min

auf Eis gestellt und anschließend mit 250 μ l SOC-Medium versetzt. Nach 1 h Inkubation

im Schüttler bei 37°C und 500 rpm wurde der komplette Transformationsansatz auf LB-

Agar mit Tetrazyklin (10 μg/ml) ausgestrichen. Über Nacht wurden die Agarplatten bei

37°C inkubiert. Sieben Klone wurden mit sterilen Pipettenspitzen in je 7 ml LB Medium

mit 10 μg/ml Tetrazyklin gepickt.

Miniprep und Kontrollrestriktion: Nach 24 h Inkubation bei 37°C wurden die Plasmide

mit dem QIAGEN® Plasmid Mini Kit aufgereinigt. Je 15 μ l der Plasmidpräparation

wurden mit 3 μl Puffer H, 0,3 μ l Xba I (10 U/μ l) und 0,3 μ l EcoR I (10 U/μ l) versetzt und

2 h bei 37°C inkubiert. Die Kontrolle der Restriktionen erfolgte im 1%igen Agarosegel.

Linearisierung des Plasmides: Für die in vitro Transkription war eine Linearisierung des

Plasmides nötig. Dazu wurden 10 μ l der Plasmidpräparation mit 1 μl Puffer R, 8,4 μ l H2O

und 0,6 μ l Bsm I (10 U/μ l) versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert.

Gelkontrolle und Aufreinigung: Bsm I schneidet zweimal in p90/HCV FL-long pU,

wodurch Fragmente von 1427 bp und 11553 bp entstehen. Die Restriktionskontrolle

erfolgte im 1%igen Agarosegel. Die das HCV Insert enthaltene Bande von 11553 kb

wurde mit dem QIAquick® Gel Extraktion Kit nach Protokoll aufgereinigt. Eluiert wurde

in 30 μ l EB-Puffer. Die Kontrolle der Aufreinigung erfolgte ebenfalls im 1%igen

Agarosegel.

In vitro Transkription: Die in vitro Transkription wurde nach Protokoll des MEGAscript®

High Yield Transcription Kit durchgeführt. Je 2 μ l ATP, CTP, UTP und GTP wurden mit

2 μ l Puffer, 2 ml Enzymmix und 8 μ l linearisiertem Plasmid versetzt. Die in vitro

Transkription erfolgte für 4 h bei 37°C.

Aufreinigung der RNA, Gelkontrolle und Konzentrationsbestimmung: Um DNA-freie

RNA zu erhalten, wurde 1 μ l TURBO DNase zum Transkriptionsansatz gegeben und


40

20 min bei 37°C inkubiert. Die Aufreinigung der in vitro Transkription erfolgte mit Hilfe

des RNeasy® Mini Kit nach Protokoll. Nach Elution in 50 μ l RNase freiem Wasser

erfolgte die Kontrolle im 1%igen Agarosegel.

Zur Konzentrationsbestimmung der in vitro transkribierten RNA wurden 10 μ l des

Transkripts 10-6 verdünnt. 10 μ l dieser 10-6 Verdünnung wurde in das HCV RotorGene

Assay eingesetzt. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen der IVT-Ansätze durchgeführt.

Mit Hilfe der mitgeführten Standardreihe wurde die Konzentration des HCV IVTs (in

vitro Transkripts) berechnet.

2.2.1.12. Entwicklung eines HCV RotorGene Nachweissystems

Die Primer und Sondensequenzen wurden von einem bestehenden HCV RotorGene Assay

der Firma artus GmbH (seit 2002 QIAGEN Hamburg) übernommen, welches in Puffer-

und Enzymzusammensetzung vollständig umgestellt, optimiert und validiert werden

sollte. Probleme des bestehenden Systems mit starken Qualitätsschwankungen der

Reversen Transkriptase sollten durch Umstellung auf Enzyme anderer Hersteller

eliminiert werden. Das neue System sollte außerdem kostengünstiger produziert werden

können, als das existierende HCV RotorGene System. Die finale Version des neu

entwickelten Nachweissystems für HCV RNA soll von der QIAGEN Hamburg GmbH als

Kit vertrieben werden. Die genaue Zusammensetzung der einzelnen Kit Komponenten

sowie die Sequenzen der Primer und Sonden unterliegen damit der Geheimhaltung und

werden in dieser Arbeit nicht veröffentlicht.

Optimierung: Auf Basis eines 5x in-house-Puffers sollte das HCV Nachweissystem unter

Verwendung der bereits existierenden Primer und Sonden entwickelt werden. Die

Optimierungsversuche wurden mit einer Standardreihe (in vitro Transkript) sowie bereits

aufgereinigten Positivkontrollen des Blutspendedienstes in Springe durchgeführt. Es

wurden verschiedene pH-Werte des Puffers ausgetestet, sowie diverse Enzyme

verschiedener Hersteller. Nach Auswahl des Puffer pH-Wertes folgten Titrationen der

verwendeten Enzyme, dNTPs, Magnesium, Primer und Sonden.


41

RT-PCR-Temperaturprofil:

Reverse Transkription: 10 min. 50°C

Aktivierung HotStart Enzym: 50 sec, 95°C

Touch down 8 sec, 95°C

20 sec, 65°C → Fluoreszenzmessung

20 sec, 72°C

10 Zyklen, bei jedem Zyklus wird die Annealing-Temperatur um 1°C abgesenkt

Amplifikation: 8 sec, 95°C

20 sec, 55°C → Fluoreszenzmessung

20 sec, 72°C

Zyklenanzahl: 45

Gesamtzyklenzahl: 55

Spezifität: Zur Kontrolle der RT-PCR-Spezifität wurden verschiedene ebenfalls in Blut

oder Plasma vorkommende Erregergenome (HIV, HAV, HBV, Parvo B19, HSV1+2, M.

pneumophiae, Enterovirus, WestNil-Virus, HHV6+7, CMV, EBV, HTLV1+2) in das

HCV System eingesetzt und auf unspezifische Amplifikation getestet. Zur Kontrolle der

spezifischen Amplifikation wurde die HCV in vitro Transkript-Standardreihe (5x100-

5x103 IU/ml) mitgeführt.

Sensitivität: die Sensitivität beschreibt die Nachweisgrenze eines Systems. Die

Nachweisgrenze einer PCR wird unterschiedlich definiert. In Anlehnung an die

Monographie „PCR“ der Europäischen Pharmakopöe wird als „positiver Grenzwert“ die

Konzentration der Zielnukleinsäure definiert, die in 95 % der Experimente noch

amplifiziert wird. Die Bestimmung dieses Wertes erfolgt durch Anwendung der Probit-

Analyse, einem statistischen Verfahren zur Beschreibung von alternativen und

quantitativen "Dosis-Wirkung"-Beziehungen.

Zur Bestimmung der Sensitivität wurden 6 Verdünnungsstufen von HCV positiven Plasma

des Blutspendedienstes aus Hagen in DMEM angesetzt und zu je 8 Replikaten mit dem

QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt. Die Elution der HCV RNA erfolgte in je 50 μ l

AVE-Puffer. Jedes Replikat der Verdünnungsstufen wurde in 3 unabhängigen RT-PCR-

Läufen analysiert. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe der Software

PriProbit.


42

2.2.2. Zellkultur und virologische Methoden

In dieser Arbeit wurden FRhK-4-Zellen, FRhK-4-Klone und Huh7-Zellen verwendet. Alle

Zellen wurden mit DMEM 10 % FCS, 1% Penicillin, 1 % Streptomycin in 75 cm2

Zellkulturflasche bei 37°C, 5 % CO2 kultiviert.

Die virologischen Arbeiten mit dem Hepatitis C Virus wurden unter der Sicherheitsstufe 3

durchgeführt.

2.2.2.1. Kryokonservierung von Huh7- und FRhK-4-Zellen

In einer konfluent gewachsenen 75 cm2 Zellkulturflasche befinden sich ca. 2x107 Zellen.

Diese wurden mit 1xPBS gewaschen. Nach dem Ablösen mit 2 ml Trypsin wurden dem

Trypsin-Zellgemisch 8 ml DMEM 10 % FCS zugegeben. Die Zellen wurden bei 500 rpm

pelletiert und der Überstand verworfen. In ca. 10 ml FCS resuspendiert, wurde die Zell-

Suspension zu je 1,8 ml pro Kryoröhrchen aliquotiert und in einem Styroporgefäß bei

-70°C langsam eingefroren. Nach ca. 24 h wurden die Kryoröhrchen in den

Stickstoffbehälter überführt.

2.2.2.2. Auftauen von Huh7- und FRhK-4-Zellen

Die eingefrorenen Zellen wurden aus dem Stickstofftank geholt und bei 37°C im

Wasserbad aufgetaut. Mit 8 ml frischem DMEM wurden diese Zellen in eine

25 cm2 Zellkulturflasche gegeben und bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Nach ca. 24 h wurde

ein Mediumwechsel durchgeführt, um das restliche Einfriermedium zu entfernen.

2.2.2.3. Passagieren von Huh7- und FRhK-4-Zellen

Das Medium von konfluent gewachsenen Huh7- bzw. FRhK-4-Zellen in einer 75 cm2

Zellkulturflasche wurde abgenommen und die Zellen einmal mit 1xPBS gewaschen.

Anschließend wurden 2 ml Trypsin auf die Zellen gegeben, wobei das Ablösen der Zellen

im Mikroskop kontrolliert und durch Inkubation bei 37°C oder Klopfen der Flasche

unterstützt wurde. Nachdem alle Zellen in Lösung waren, wurde die Proteolyse durch

Zugabe von 8 ml Medium abgestoppt. Es wurde eine definierte Menge Zellen in eine neue


43

75 cm2 Zellkulturflasche überführt und nach Hinzufügen von ca. 18 ml frischem DMEM

bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert.

2.2.2.4. Transfektion mit FuGene 6 Transfection Reagent

Für eine 6-well-Platte wurden 2x106 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2

inkubiert. Pro Transfektionsansatz wurden 100 μ l serumfreies Medium in sterile

Eppendorfgefäße abgefüllt und 15 μl FuGene so in die Flüssigkeit gegeben, dass das

Plastikgefäß nicht berührt wurde. Anschließend wurden 5 μg Plasmid-DNA zugegeben

und durch pipettieren gemischt. Das Medium der Zellen wurde abgenommen und durch je

3 ml serumfreies DMEM ersetzt. Nach 20 min Inkubationszeit wurde der

Transfektionsansatz tropfenweise auf die Zellen gegeben. Durch leichtes Schwenken der

Platte wurde gemischt. Nach 4 h 37°C, 5 % CO2 wurde das Transfektionsmedium durch je

5 ml DMEM mit allen Zusätzen ausgetauscht.

2.2.2.5. Transfektion mit jetPEI

Für eine 6-well-Platte wurden 2x106 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2

inkubiert. Pro Transfektionsansatz wurden zwei Eppendorfgefäße benötigt. In jedes

Eppendorfgefäß wurden 250 μ l sterile 150 mM NaCl vorgelegt. In ein Gefäß wurden 5 μg

Plasmid-DNA pipettiert, 10 s gevortext und abzentrifugiert. In das andere Gefäß wurden

10 μ l jetPEI gegeben und ebenfalls 10 s gevortext und zentrifugiert. Die jetPEI-Lösung

wurde anschließend zur DNA-Lösung gegeben, 10 s gevortext, zentrifugiert und alles

20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium der Zellen wurde abgenommen und

durch je 4,5 ml serumfreies DMEM ersetzt. Nach der Inkubationszeit wurde der jetPEI-

DNA-Komplex tropfenweise auf die Zellen gegeben. Durch leichtes Schwenken der Platte

wurde gemischt. Nach 4 h 37°C, 5 % CO2 wurde das Transfektionsmedium durch je 5 ml

DMEM mit allen Zusätzen ausgetauscht.

2.2.2.6. G418 Titration für Huh7-Zellen

Auf eine 24-well-Platte wurden 106 Huh7-Zellen ausgesät und direkt mit der G418

Titration begonnen. Es wurden zwei wells mit DMEM als Kontrolle mitgeführt, alle

anderen wells wurden mit G418 von 0,2 mg/ml bis 4 mg/ml in 0,2er Verdünnungsschritten


44

versetzt. Alle 3 Tage wurde das Medium durch frisches DMEM mit entsprechender G418

Menge ersetzt. In den höheren Antibiotikakonzentrationen war bereits nach 2 Tagen ein

Absterben der Zellen zu beobachten. Nach 14 Tagen waren ab einer Konzentration von

0,4 mg/ml G418 alle Huh7 Zellen abgestorben. Es wurde daher für die Selektion G418-

resistenter Klone eine Konzentration von 0,6 mg/ml G418 eingesetzt. Diese Menge wurde

ebenfalls für die Selektion resistenter FRhK-4-Zellen verwendet. Die Titration von FRhK-

4-Zellen wurde bereits von Jörn Gotter in Rahmen seiner Diplomarbeit durchgeführt

(Gotter, 1999).

2.2.2.7. Stabile Überexpression des RLI in Huh7- und FRhK-4-Zellen

In 6 cm Schalen wurden 106 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert.

Die Transfektion erfolgte mit 10 μg der entsprechenden Plasmid-DNA. Da die pl.18_RLI

Plasmide kein Resistenzgen tragen, wurde mit pSV2neo nach Protokoll kotransfiziert

(Transfektionsansatz: je 8 μg pl.18-m_RLI bzw. pl.18-h_RLI, 2 μg pSV2neo, 30 μl

FuGene). 48 h nach Transfektion wurde das Medium gegen 4 ml Medium mit 0,6 mg/ml

G418 ausgetauscht. Die Kultivierung der Zellen erfolgt im Folgenden durchgehend mit

DMEM 0,6 mg/ml G418. Zellen, die kein Plasmid mit Geneticin-Resistenz aufgenommen

haben, sterben im Verlauf der Zeit ab. Alle 3 bis 4 Tage wurde das Medium gewechselt.

Nach Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen in hohen Verhältnissen

umgesetzt (1:1.000 bis 1:10.000), um einzelne Kolonien zu erhalten. Zum Selektieren der

Klone wurden ausreichend gewachsene Kolonien markiert, das Medium abgenommen und

Klonierungszylinder (abgeschnittene Eppendorfhütchen) mit Silicon Grease (Beckmann)

aufgesetzt. Mit 100 μ l Trypsin wurden die Zellen innerhalb der Zylinder abgelöst und in

24-well-Platten vereinzelt. Zellen konfluent bewachsener Vertiefungen wurden in 6-well-

Platten überführt. Die Kontrolle der Klone auf RLI-Überexpression erfolgte mittels PCR.

2.2.2.8. Immunfluoreszenz

In jede Vertiefung einer 6-well-Platte wurden drei runde, autoklavierte Deckgläschen

gelegt, darauf die Zellen ausgesät und bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion

wurde ca. 16 - 24 h nach Protokoll durchgeführt. Als Negativkontrolle dienten nicht

transfizierte Zellen. Die Auswertung mittels Immunfluoreszenz erfolgte 3 Tage nach

Transfektion.


45

Nach Abnahme des Mediums und zweimaligem Waschen der Zellen mit je 1 ml 1xPBS

wurden die Zellen durch 2 ml Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur fixiert. Die Fixierzeit

von 5 Minuten sollte nicht überschritten werden. Es wurde 5-mal mit je 2 ml 1xPBS für je

2 Minuten gewaschen. Durch 20 min Inkubation mit 2 ml PBS 10 % FCS wurde geblockt.

1 ml 1xPBS 10 % FCS wurde mit 0,2 μ l Trypanblau und 2 μ l Anti His(C-term)-FITC

Antikörper gemischt und auf die Zellen gegeben. Nach 1 h Inkubation im Dunkeln bei

Raumtemperatur wurden die Zellen zweimal mit je 4 ml 1xPBS gewaschen. Die

Deckgläschen wurden aus den Vertiefungen entnommen, an der Luft getrocknet und mit

den Zellen nach unten auf Objektträger mit einem Tropfen Glycerin gegeben. Mit Hilfe

von Nagellack wurden die Deckgläschen auf dem Objektträger fixiert und anschließend

im Fluoreszenzmikroskop analysiert.

2.2.2.9. Stabilitätstest von HCV RNA in zellfreiem Medium

Es wurden 4 μ l HCV positives Plasma in 4 ml DMEM gegeben und zu je 1 ml auf 4 wells

einer 12-well-Platte verteilt. Die Zellkulturplatte wurde im Brutschrank bei konstanten

Bedingungen (37°C, 5 % CO2) inkubiert. Im Abstand von 2 Tagen wurden je 140 μl

Medium abgenommen und mittels RT-PCR der Virus RNA-Titer bestimmt. Die

Aufreinigung der HCV RNA erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach

Protokoll. Eluiert wurde in 50 μ l AVE-Puffer. Die entnommene Mediumsmenge wurde

mit 140 μ l DMEM aufgefüllt.

2.2.2.10. HCV Infektion von FRhK-4-RLI-Klonen

2x106 Zellen der FRhK-4-RLI-Klone wurden in einer 6-well-Platte ausgesät und bei 37°C,

5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium entnommen und pro well

150 μ l HCV positives Frischplasma zugegeben (MOI = 1). Nach 2 h Inkubation im

Brutschrank wurde das Inokulum abgenommen und dreimal mit 1xPBS gewaschen.

Anschließend wurde frisches Medium zugegeben. 140 μl Überstand wurden als 0 d - Wert

zur Bestimmung der HCV RNA herangezogen. Die entnommenen 140 μ l wurden durch

frisches Medium aufgefüllt.


46

2.2.2.11. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Huh7- und FRhK-4-Zellen

2x106 Zellen Huh7 bzw. FRhK-4 wurden in einer 24-well-Platte ausgesät und bei 37°C,

5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die wells mit je 3 μg des entsprechenden

pl.18_RLI-Plasmides nach Protokoll transfiziert. 48 h nach Transfektion wurde das

Medium entnommen und pro well 150 μ l HCV Frischplasma zugegeben (MOI = 1). Nach

2 h Inkubation im Brutschrank wurde das Inokulum abgenommen und dreimal mit 1xPBS

gewaschen. Anschließend wurde frisches Medium zugegeben. 140 μ l Überstand wurden

als 0 d - Wert zur Bestimmung der HCV RNA herangezogen. Die entnommenen 140 μ l

wurden durch frisches Medium aufgefüllt. 5 Tage nach Infektion (6 Tage nach

Transfektion) wurden die Zellen in eine 12-well-Platte überführt. Der Überstand wurde

zuvor abgenommen und 140 μ l zur Bestimmung der HCV-RNA eingesetzt. Die

Aufreinigung der HCV RNA erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach

Protokoll. Eluiert wurde in 50 μ l AVE-Puffer. 24 h nach Umsetzung wurden die Zellen

zur Aufrechterhaltung der RLI-Expression erneut wie beschrieben transfiziert (Einsatz von

5 μg des entsprechenden pl.18_RLI-Plasmides). Weitere 6 Tage später wurden die Zellen

in eine 6-well-Platte überführt und am folgenden Tag mit 5 μg des entsprechenden RLI-

Plasmides transfiziert.

2.2.2.12. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen

Für die Transfektion von in vitro transkribierter HCV RNA (IVT) in FRhK-4- oder Huh7-

Zellen war die Angabe der IVT Konzentration in [ng/μ l] notwendig. Die Umrechnung von

[IU/μ l] in [g/μ l] wurde folgendermaßen berechnet:

Konz [g/μ l] = cop/μ l*330 g/mol*10 kb/6*1023

Dabei entsprachen 330 g/mol dem Gewicht der RNA und 10 kb der Länge des IVT.

Die Angabe der HCV Viruslast in Internationale Einheit (IU) ist eine mehr oder weniger

willkürlich festgesetzte Einheit. Der Umrechnungsfaktor von IU zu Kopien liegt zwischen

2 und 5. Für die Umrechnung von HCV Internationalen Einheiten in Kopien wurde in der

vorliegenden Arbeit der Faktor 3 verwendet (http://www.hepatitis-c.de/titer.htm).


47


5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag erfolgte die Transfektion von IVT ebenfalls mit

dem FuGene 6 Transfection Reagent nach bereits beschriebenem Protokoll. Pro well der

24-well-Platte wurden 250 ng IVT für die Transfektion eingesetzt. Nach 4stündiger

Inkubationszeit wurde der IVT-haltige Überstand abgenommen, zweimal mit 1xPBS

gewaschen und frisches DMEM auf die Zellen gegeben.

2.2.2.13. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient

RLI-transfizierten Huh7- und FRhK-4-Zellen


5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die wells mit je 3 μg des entsprechenden

pl.18_RLI-Plasmides nach Protokoll transfiziert. Um den Zellen die RLI Expression zu

ermöglichen, wurde 48 h bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion von HCV full

length IVT erfolgte ebenfalls mit dem FuGene 6 Transfection Reagent nach bereits

beschriebenem Protokoll. Pro well der 24-well-Platte wurden 250 ng HCV IVT zur

Transfektion eingesetzt. Nach vierstündiger Inkubation wurde der HCV IVT-haltige

Überstand abgenommen, zweimal mit 1xPBS gewaschen und frisches DMEM auf die

Zellen gegeben.

2.2.2.14. Aufreinigung viraler RNA mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit

Die Aufreinigung der viralen RNA aus Zellkulturüberstand oder virushaltigem Medium

erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach Protokollangaben des Herstellers.

Eluiert wurde in 50 μ l AVE-Puffer. Die Berechnung der RNA-Konzentration der

eingesetzten Probe errechnet sich nach folgender Formel:

RNA-Konz. der eingesetzten Probe [IU/μ l]= calc. Konz. [IU/μ l] * 50 μ l / 140 μ l

calc. Konz. = kalkulierte Konzentration der Probe durch die Software der RotorGene™

anhand der mitgeführten Standardreihe

50 μ l = Menge des Eluates

140 μ l = Menge der eingesetzten Probe

Ergebnisse

48

3. Ergebnisse

3.1. Erstellung der real time PCRs

Unter den Bedingungen der experimentellen HCV Infektion wurden die Expressionsraten des

RLI und der RNase L analysiert. Zur Analyse und Auswertung der mRNA Transkription von

RNase L und RNase L Inhibitor war daher die Erstellung spezifischer und quantitativer real

time PCRs notwendig. Ebenfalls wurden real time PCRs für die konstitutiv in Zellen

exprimierten Referenzgene 18S rRNA und GAPDH entwickelt.

Zum Nachweis und zur Quantifizierung von HCV RNA wurde ein HCV RotorGene System

auf der Basis eines bestehenden Systems entwickelt. Vorhandene Primer und Sonden der

Firma QIAGEN Hamburg wurden in einem neuen Puffer- und Enzymsystem optimiert und

validiert. Wegen großer Probleme des alten Systems aufgrund qualitätiver Schwankungen der

reversen Transkriptase erfolgte eine Umstellung der bisher verwendeten Enzyme auf Enzyme

anderer Hersteller. Das neue System kann außerdem kostengünstiger als das bisherige System

produziert werden.

3.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI


Die Analyse der mRNA Transkription von RNase L, RLI, und GAPDH sowie der 18S rRNA

erfolgte mit Hilfe einer two-step PCR. Nach der cDNA Synthese zellulärer RNA mit random

hexamer Primern erfolgte in der real time PCR die spezifische Amplifikation der zu

analysierenden Gene. Nach Design und Auswahl spezifischer Primer und Sonden für die

RNase L, das RLI sowie die Referenzgene 18S rRNA und GAPDH (sieheTabelle 2) erfolgte

die Optimierung der real time PCRs auf dem ABI 7900HT. Zum PCR-Ansatz von 10,1 μl

Wasser, 12,5 μ l ABI 2x Puffer, je 0,1 μ l Primer und Sonde sowie 0,1 μ l Platinum Taq wurden

2 μ l cDNA Template gegeben und im TaqMan amplifiziert (initiale Denaturierung: 10 min -

95°C;

40 Zyklen: Denaturierung 15 sec - 95°C, Amplifikation 1 min - 55°C). Zur relativen

Quantifizierung der eingesetzten Proben, wurden logarithmische Verdünnungsreihen aus

ZC-5.1 (RNase L), pcDNA3.1/RLI 3’ (RLI) und cDNA aus Nieren gesamt-Zell-RNA

(18S rRNA und GAPDH) mitgeführt. Mit Hilfe dieser definierten Standardreihen berechnete

Ergebnisse

49

die ABI 7900HT SDS 2.1 Software die in den unbekannten Proben enthalte RNA. Dabei wird

davon ausgegangen, dass das Verhältnis der cDNA proportional zur mRNA ist. Für jede

spezifische mRNA entsteht während der cDNA Synthese in einem konstanten Verhältnis

entsprechend viel cDNA.

3.1.1.1. Effizienz

Die PCR-Effizienz ist ein Maß für das Verhältnis von Amplifikat- und eingesetzter

Probenmenge. Im Idealfall liegt eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus vor, was einer

PCR-Effizienz von 100 % entsprechen würde. Zur Berechnung der PCR-Effizienz wurde die

„slope“-Methode (Anstiegsmethode) verwendet. Bei dieser Methode wird eine logarithmische

Verdünnungsreihe für jedes Template (RNase L, RNase L Inhibitor, 18S rRNA, GAPDH)

hergestellt und der ct-Wert jedes Verdünnungspunktes bestimmt. Da in humaner gesamt-Zell-

RNA zu wenig RNase L und RLI vorhanden sind, um Verdünnungsreihen über mehrere

Logstufen herzustellen, wurden für diese Parameter die entsprechenden Plasmide ZC-5.1

(RNase L) und pcDNA3/RLI 3’ (RLI) verwendet. Für die Erstellung der Verdünnungsreihen

von 18S rRNA und GAPDH wurde cDNA aus humaner Nieren (kidney) gesamt-Zell-RNA

verwendet.

In Abbildung 14 bis Abbildung 17 wurden die ct-Werte der einzelnen Verdünnungspunkte

gegen die jeweiligen logarithmischen Konzentrationen der cDNA aufgetragen. Eine lineare

Regressionsgerade (y = ax + b) wurde durch die ABI 7900HT SDS Software generiert und ihr

Anstieg bestimmt. Liegt die PCR-Effizienz bei (E) = 1,0 (100 %), würde der erwartete

Anstieg (a) einer logarithmischen Verdünnungsreihe -3,32 betragen. Die PCR-Effizienz

berechnet sich mit der Anstiegsmethode der linearen Regressionsgeraden nach der Formel:

E = 10(-1/Anstieg) -1 (Eurogentec, 2004). Nach Ermittlung des Anstiegs der Regressionsgeraden

ergab sich für die erstellten PCRs von RNase L, RLI, 18S rRNA und GAPDH eine Effizienz

von über 99 %. (siehe Tabelle 5)

Tabelle 5: PCR-Effizienz Anstieg E = 10(-1/Anstieg) -1 PCR-Effizienz

RLI -3,34 E = 10(0.299) -1 99,2%

RNase L -3,3 E = 10(0,3) -1 100%

18S rRNA -3,33 E = 10(0,3) -1 99,7%

GAPDH -3,169 E = 10(0,31) -1 101%

Ergebnisse

50

Abbildung 14: Verdünnungsreihe der RNase L aus dem Plasmid ZC-5.1. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration des Plasmides aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.

Abbildung 15: Verdünnungsreihe der RLI aus dem Bisbal-Plasmid. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration des Plasmides aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.

Ergebnisse

51

Abbildung 16: Verdünnungsreihe der 18S rRNA aus kidney cDNA. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration der cDNA aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.

Abbildung 17: Verdünnungsreihe von GAPDH aus kidney cDNA. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration der cDNA aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.

3.1.1.2. Spezifität

Um unspezifische Amplifikate mit positivem Signal im TaqMan auszuschließen, wurde

gesamt-Zell-RNA in cDNA umgeschrieben und als Template in die verschiedenen real time

PCRs (RLI, RNase L, 18S rRNA, GAPDH) eingesetzt. Die PCR-Amplifikate wurden im

3%igen Agarosegel überprüft (siehe Abbildung 18). Es konnten keine unspezifischen Banden

beobachtet werden. Die spezifischen Proben zeigten Banden der erwarteten Größen von 60 bp

für die RNase L, 111 bp für das RLI, 110 bp für die 18S rRNA und 100 bp für GAPDH.. Alle

Wasserkontrollen zeigten weder ein Signal in der real time PCR noch eine Bande im

Agarosegel.

Ergebnisse

52

60 bp →← 100 bp

Abbildung 18: Spezifität der real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von RNase L, RLI, GAPDH sowie der 18S rRNA: Spur 1-2: RNase L aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 60 pb); Spur 3-4: RNase L Wasserkontrolle; Spur 5-6: RLI aus pcDNA3.1_RLI (Fragmentgröße 111 bp); Spur 7-8: RLI Wasserkontrolle; Spur 9-10: 18S rRNA aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 110 bp); Spur 11-12: 18S rRNA Wasserkontrolle; Spur 13-14: GAPDH aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 100 bp), Spur 15-16: GAPDH Wasserkontrolle; M: 100 pb Marker Fermentas

3.1.2. Real time RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HCV RNA

Auf der Basis existierender Primer und Sonden der Firma QIAGEN Hamburg (ehemals artus

GmbH) wurde ein neues one-step HCV Nachweissystem für den RotorGene entwickelt. Es

wurden verschiedene pH-Werte eines 5x-in-house-Puffers ausgetestet, sowie diverse Enzyme

verschiedener Hersteller. Nach Auswahl des Puffer-pH-Wertes wurden Enzyme, dNTPs,

Magnesium, Primer und Sonden titriert. Die finale Version des neu entwickelten HCV RT-

PCR Nachweissystems soll von der QIAGEN Hamburg GmbH als Kit vertrieben werden. Die

genaue Zusammensetzung der einzelnen Kit Komponenten sowie die Sequenzen von Primer

und Sonden unterliegen der Geheimhaltung und werden deshalb in dieser Arbeit nicht

veröffentlicht. Die Optimierungsversuche wurden mit in vitro transkribierter RNA sowie

bereits aufgereinigten Positivkontrollen des Blutspendedienstes in Springe durchgeführt. In

einem RT-PCR-Ansatz von 25 μ l (15 μ l Master + 10 μ l Probe) wurden die Proben dieser

Arbeit im RotorGene amplifiziert (Temperaturprofil siehe 2.2.1.12).

3.1.2.1. Testung des HCV RotorGene Assay auf Kreuzreaktivität

Um falsch positive Ergebnisse im RotorGene auszuschließen, wurden verschiedene Erreger-

Genome auf mögliche Amplifikation im HCV Assay getestet (siehe Abbildung 19): Unter

Ergebnisse

53

anderem wurden aufgereinigte Erregermaterialien wie HAV, HIV, Parvo, HSV 1 und 2, VZV,

und CMV getestet, die wie das Hepatitis C Virus in Blutprodukten oder Plasma vorkommen

können (weitere getestete Erregermaterialien siehe Abbildung 19). Bei keinem der

eingesetzten Erregermaterialien konnte ein positives Signal in der RT-PCR nachgewiesen

werden. Zur Kontrolle der RT-PCR wurde die HCV Standardreihe mitgeführt.

Abbildung 19: Kreuzreaktivitätstest des HCV RotorGene System: Es wurden verschiedene Erreger-Genome ins HCV RG System eingesetzt und auf potentielle Amplifikation getestet. Es wurde lediglich die HCV Standardreihe amplifiziert.

3.1.2.2. Sensitivität des HCV RotorGene Nachweissystems

Zur Bestimmung der Senstitivität des HCV RotorGene Systems wurde eine Probit-Analyse

durchgeführt. Es wurden 6 Verdünnungsstufen von HCV-positivem Frischplasma des

Blutspendedienstes aus Hagen in DMEM angesetzt und zu je 8 Replikaten mit dem

QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt. Die Elution der HCV RNA erfolgte in je 50 μl

AVE-Puffer. Jedes Replikat der Verdünnungsstufen wurde in drei unabhängigen RT-PCR-

Läufen analysiert. Die Daten der drei Sensitivitätsläufe wurden mit Hilfe des Programms

PriProbit Vers. 1.63 analysiert. Die von dem Programm berechneten Daten wurden mit Excel

graphisch ausgewertet (siehe Abbildung 20). Dabei wurden die Wahrscheinlichkeiten, mit

denen eine Anzahl an Internationalen Einheiten (IU, dose) noch nachgewiesen werden kann,

gegen den Logarithmus der entsprechenden IUs aufgetragen. Durch die Datenpunkte wurde

anschließend eine Sigmoidalkurve gelegt und der 95 % Wert durch zwei sich kreuzende

Ergebnisse

54

Linien gekennzeichnet. Das Programm PriProbit errechnet diesen 95 % Wert aus der

Gleichung für die Sigmoidalkurve. Die Zusammenfassung der Daten ist in Tabelle 6

dargestellt. Die berechneten Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im RotorGene

Assay detektiert werden können, sind in Tabelle 7 aufgeführt. Die graphische Auswertung der

Probitanalyse ist in der darauf folgenden Abbildung 20 dargestellt. Die Probit-Analyse ergab

eine Nachweisgrenze von 35 IU/ml auf einem Signifikanzniveau von 0,05. Das heißt, in dem

entwickelten HCV RotorGene System können 35 IU/ml mit einer Wahrscheinlichkeit von

95 % nachgewiesen werden.

Die Menge an Viren, die in einer definierten Menge Plasma vorkommt wird als Viruslast

bezeichnet. Die Angabe der Viruslast erfolgt in IU/ml. Diese Einheit ist mehr oder weniger

willkürlich festgesetzt. Für die Umrechnung von Internationalen Einheiten (IU) in

Viruskopien werden verschiedene Faktoren verwendet. Diese liegen zwischen 2 und 5 Viren

pro IU. Für diese Arbeit wurde der Faktor 3 verwendet. Das bedeutet, bei einer analytischen

Nachweisgrenze von 35 IU/ml können im HCV RotorGene System noch 105 cop/ml mit einer

Wahrscheinlichkeit von 95 % detektiert werden.

Tabelle 6: Zusammenfassung der Daten der Sensitivitätsläufe

Tabelle 7: berechnete Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im HCV RotorGene System nachgewiesen werden konnten

IU/ml N Anzahl positiver Proben

100 24 24

50 24 24

25 24 21

12.5 24 18

6.25 24 16

3.125 24 10

N: Gesamtprobenzahl

A

Log (dose) Wahrscheinlichkeit

2.000 1.000

1.699 1.000

1.398 0.875

1.097 0.750

0.796 0.667

0.495 0.417

Geradengleichung: Y = -1.119 + 1.791X

B

Ergebnisse

55

Probit-Analyse: Hepatitis C Virus (RotorGene 3000)

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3log (dose)

Pro

port

ions

1.54363 ~ 34.965 IU/ml (95%)

95%

Abbildung 20: Analytische Sensitivität des HCV RotorGene System. Aufgetragen sind die logarithmischen Konzentrationen der gesteteten Proben gegen die Wahrscheinlichkeiten, mit denen diese im HCV RotorGene System nachgewiesen werden konnten. Die Nachweisgrenze (95 % -Wert) lag bei 35 IU/ml. Für eine Angabe der HCV RNA in Viruskopien ergab sich eine Nachweisgrenze von 105 cop/ml.

3.1.2.3. Nachweis verschiedener HCV Subtypen

Um sicherzustellen, dass mit dem HCV RotorGene Assay alle HCV Subtypen detektiert

werden, wurde das Subtypenpanel der Universität Essen aufgereinigt und im HCV RotorGene

System getestet. Das Subtypenpanel umfasst die Subtypen 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2i, 3a, 4, 5a und

6. Die Konzentrationen der verschiedenen Plasmaproben waren vom Hersteller bekannt. Alle

Plasmaproben wurden auf eine Konzentration von 50 IU/ml eingestellt, mit dem

QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt und 10 μ l Eluat im HCV RotorGene Assay

eingesetzt. Es wurden alle HCV-positiven Proben im RotorGene Assay detektiert (siehe

Abbildung 21), während die Negativkontrolle kein Signal lieferte. Anhand der mitgeführten

Standardreihe wurde durch die RotorGene Software die Konzentration der eingesetzten Eluate

kalkuliert. Aus diesen Werten wurden die Konzentrationen der Plasmaproben berechnet (siehe

Tabelle 8). Die berechneten Konzentrationen der Proben lagen zwischen 27 IU/ml (Subtyp

3a) und 143 IU/ml (Subtyp 4). Die Konzentrationen unter 50 IU/ml ergeben sich aufgrund

von Aufreinigungsverlusten oder Pipettierschwankungen. Ein Faktor von 2 ist durch

Pipettierschwankungen sowohl bei der Aufreinigung als auch der RT-PCR möglich und

akzeptabel. Da die Standardreihe aus in vitro Transkripten von Subtyp 1a besteht, sind

Schwankungsfaktoren auch durch unterschiedliche Sensitivitäten und Spezifitäten in der

Ergebnisse

56

Detektion anderer Subtypen möglich. Um dies auszuschließen, müsste zur genauen

Quantifizierung der einzelnen Subtypen für jeden Subtyp eine spezifische Standardreihe

mitgeführt werden. Da für alle Versuche die gleiche Standardreihe verwendet wird, ist dies

nicht nötig. Ein möglicher Faktor würde für alle Proben gleichermaßen gelten.

Abbildung 21: Nachweis verschiedener HCV Subtypen im HCV RotorGene Assay. Getestet wurden die Subtypen 1 bis 6. Alle Subtypen wurden detektiert, während die Wasserkontrolle kein Signal zeigte.

Tabelle 8: Darstellung der kalkulierten Konzentrationen der HCV Eluate und berechneten Konzentrationen der auf 50 IU/ml eingestellten Plasmaproben

Subtyp calc. IU/μl IU/ml Probe 1a 0.2438 87.07 1b 0.2455 87.68 2a 0.3486 124.50 2b 0.1199 42.82 2c 0.2199 78.54 2i 0.1175 41.96 3a 0.0746 26.64 4 0.4004 143.00 5a 0.2612 93.29 6 0.1465 52.32

Ergebnisse

57

3.1.3. Zusammenfassung real time PCRs

Es wurden quantitative real time PCRs zum spezifischen Nachweis der mRNAs von

RNase L und RLI entwickelt. In two-step Reaktionen erfolgten zunächst die cDNA Synthese

aus gesamt-Zell-RNA mit random hexamer Primern und anschließend die spezifischen real

time PCRs. Zur relativen Quantifizierung wurden die zellulären Housekeeping-Gene

18S rRNA und GAPDH verwendet, für welche ebenfalls spezifische real time PCRs

entwickelt wurden. Keine der erstellten real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von

RNase L, RLI und GAPDH sowie von 18S rRNA zeigte unspezifische Amplifikationen. Alle

PCR-Effizienzen betrugen mindestens 99 %.

Ebenfalls wurde ein neues HCV RotorGene Nachweissystem entwickelt und optimiert. Der

Nachweis der HCV RNA erfolgte in einer one-step RT-PCR. Auf der Basis existierender

Primer und Sonden wurde nach Umstellung des gesamten Puffer- und Enzymsystems ein in

seiner Herstellung kostengünstiges und in seiner Anwendung reproduzierbares Assay

entwickelt. Die Probleme des vorangegangenen HCV Systems durch Qualtitätsschwankungen

der Reversen Transkriptase wurden durch die Verwendung der RT eines anderen Herstellers

eliminiert. Das neue System zeigte keinerlei Kreuzreaktivität mit verschiedenen RNA- oder

DNA-Erregermaterialien. Die analytische Nachweisgrenze des HCV RotorGene Systems lag

bei 35 IU/ml bzw. 105 cop/ml.

3.2. RNase L Inhibitor

Um eine potentielle Aktivität der RNase L auszuschalten, wurde in der vorliegenden Arbeit

der RNase L Inhibitor sowohl in FRhK-4- als auch in Huh7-Zellen überexprimiert. Da das

Referenzplasmid pcDNA3/RLI 3’ die Sequenz des humanen RLI enthielt, wurde das RLI aus

FRhK-4 Zellen full length amplifiziert und kloniert. Parallel zu dieser Amplifikation wurde

das humane RLI aus Nieren-gesamt-Zell-RNA erneut full length amplifiziert und ebenfalls

kloniert. In einer weiteren full length Amplifikation wurde das Stop-Codon des RLI

ausgeschaltet, um den His-Tag des Klonierungsverktors pcDNA3.1/V5-His zu exprimieren

3.2.1. Sequenzierung RNase L Inhibitor

Nach Isolation, full length Amplifikation und Klonierung des RNase L Inhibitors wurde

dieser in den pcDNA3.1/V5-His-Plasmiden sequenziert und anhand der Datenbanksequenz

Ergebnisse

58

Acc.nr. X74987 (Bisbal et al., 1995) analysiert. Gegenüber der Datenbanksequenz zeigten

sowohl das humane als auch das FRhK-4 RLI gehäufte Nukleotidaustausche in den

Abschnitten 520 bp bis 540 bp und 1412 bp bis 1422 bp (siehe Abbildung 22 A und B). Die

Nukleotidunterschiede bewirken eine Veränderung der Aminosäuresequenz innerhalb dieser

Bereiche (siehe Abbildung 22 C und D). Um Mutationen durch full length Amplifikation und

Klonierung auszuschließen, wurde das RLI im Referenzplasmid pcDNA3/RLI 3’ von C.

Bisbal sequenziert. Das RLI-Insert des pcDNA3/RLI 3’ zeigte ebenfalls die Nukleotid- und

Aminosäuresequenz der full length amplifizierten RLI-Gene aus humaner- bzw. FRhK-4-

gesamt-Zell-RNA. Damit unterschieden sich sowohl die Sequenz des Referenzplasmides

pcDNA3/RLI 3’ als auch die in dieser Arbeit amplifizierten RLI-Genabschnitte von der

Datenbanksequenz. Es ist anzunehmen, dass ein Sequenzierfehler zu der in der Datenbank

angegebenen Sequenz geführt hat. Sequenzen und Alignments des kompletten RNase L

Inhibitors aus humaner- bzw. FRhK-4-gesamt-Zell-RNA sowie des Bisbal-Plasmides und der

NCBI Referenz befinden sich im Anhang dieser Arbeit (siehe Kapitel 7.2).

1

2

3

4

A

1

2

3

4

B

1

2

3

4

C

1

2

3

4

D

Abbildung 22: Sequenzierung der verwendeten RLI–Fragmente: A und B: Nukleotidsequenz und Alignment; C und D: Aminosäuresequenz im Einbuchstaben-Code und Alignment; 1 = RLI Sequenz NCBI Acc.nr X74987, 2 = RLI aus pcDNA3/RLI 3’, 3 = RLI full lengthamplifiziert aus humaner gesamt-RNA, 4 = RLI full length amplifiziert aus FRhK-4-gesamt-Zell-RNA

Ergebnisse

59

3.2.2. Transfektion mit jetPEI bzw. FuGene 6 Transfection Reagent

Für die Transfektion des klonierten RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden die

Transfektionsreagenzien jetPEI der Firma QBiogene und FuGene 6 Transfection Reagent der

Firma Roche getestet.

Das kationische Polymer jetPEI (Polyethylenimin) bildet Komplexe mit der Plasmid-DNA.

Die positive Nettoladung dieser Komplexe ermöglicht die Interaktion mit anionischen

Glykoproteinen auf der Zelloberfläche und anschließend die Aufnahme der jetPEI-DNA-

Komplexe in die Zelle durch Endocytose. Auch die Transfektion mit FuGene 6 erfolgt durch

Komplexbildung. Die kationischen Lipide des FuGene 6 Transfection Reagent binden an die

negativ geladene Plasmid-DNA und können als Liposomen-Nukleinsäure-Komplex mit der

Plasmamembran der Zelle fusionieren.

Die Transfektion wurde sowohl mit jetPEI als auch mit dem FuGene 6 Transfection Reagent

und den RLI-Plasmiden pcDNA3.1/V5-His-m_RLI für FRhK-4- und pcDNA3.1/V5-His-

h_RLI für Huh7-Zellen durchgeführt und die Zellen nach 24 h geerntet. Die verschiedenen

Transfektionsreagenzien wurden mit und ohne Plasmid getestet. Dadurch wurde

ausgeschlossen, dass die Transfektionsreagenzien einen regulativen Einfluss auf die mRNA-

Transkription des konstitutiv exprimierten zellulären RLI ausüben. Die zelluläre RNA wurde

mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und DNase I verdaut. Mittels real time PCR wurden

die RLI-Transkriptionsraten bestimmt (siehe Abbildung 23). Mit jetPEI zeigten die FRhK-4-

und Huh7-Zellen eine sechsfach erhöhte Transkription des RNase L Inhibitors. Der Einsatz

von FuGene 6 führte zu einer fünffachen Überexpression des RLI in FRhK-4-Zellen und zu

einer siebenfachen Überexpression des RLI in Huh7-Zellen. Ohne Zusatz des pcDNA3.1/V5-

His_RLI konnte keine erhöhte RLI-Expression detektiert werden. Mit diesem Ergebnis wurde

ein potentieller Einfluss von jetPEI oder FuGene 6 auf die Transkription des zellulären RLI

ausgeschlossen. Die Grenzwerte der Genexpression wurden bei 0,5 und 2 definiert. Diese

Werte entsprechen Transkriptionsabweichungen um Faktoren von -/+ 2 und gelten damit als

nicht reguliert.

Ergebnisse

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0

1

2

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4

5

6

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8re

lati

ve E

inh

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NA

in R

elat

ion

zur

18S

rR

NA

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d un

beha

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ter

Kon

trol

le

jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLIjetPEIFuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLIFuGene

A

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I-m

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NA

und

unb

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r K

ontr

olle


B

Abbildung 23: Vergleich der Transfektionsreagenzien jetPEI und FuGene 6 hinsichtlich der relativen Einheiten an RLI-mRNA. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA. Es wurden sowohl die Transfektionsreagenzien mit RLI-Plasmid als auch ohne Plasmid getestet. Die Auswertung der Expressionsdaten erfolgte 24 h nach Transfektion. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. Der Einsatz der Transfektionsreagenzien ohne Plasmid hatte keinen Einfluss auf die RLI-Expression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

Der Einfluss der Transfektion mit und ohne RLI-Plasmid auf die 18S rRNA der Zellen ist in

Abbildung 24 dargestellt. Weder jetPEI noch FuGene 6 hatten innerhalb von 24 h einen

quantitativen Einfluss auf die 18S rRNA der Zellen. In Transfektionsversuchen mit jetPEI

über längere Inkubationszeiten, zeigte sich eine übermäßig starke Zunahme toter Zellen

(Daten nicht gezeigt, da mikroskopische Beobachtungen). Diese Beobachtungen waren

unabhängig davon, ob die Transfektionen mit oder ohne Zusatz der RLI-Plasmide

durchgeführt wurden. Aus diesem Grund ist davon auszugehen, dass jetPEI einen Einfluss auf

die Vitalität und Lebensfähigkeit der Zellen hat. Diese Langzeit-Auswirkungen konnten bei

der Verwendung von FuGene 6 Transfection Reagent nicht beobachtet werden, so dass in den

weiteren Versuchen FuGene 6 als Transfektionsreagenz verwendet wurde.

Ergebnisse

61

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600re

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B

Abbildung 24: Einfluss der Transfektion auf die 18S rRNA. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten 18S rRNA. Es wurden sowohl der Einsatz der Transfektionsreagenzien mit RLI-Plasmid als auch ohne Plasmid im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen getestet. Die Auswertung der Expressionsdaten erfolgte 24 h nach Transfektion. Die Berechnung der relativen 18S rRNA Einheiten erfolgte durch eine externe Verdünnungsreihe von cDNA aus Nieren-gesamt-Zell-RNA A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

3.2.3. RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI

Die Überexpression des RLI sollte über eine möglichst lange Inkubationszeit mit möglichst

hohen Expressionsraten erfolgen. Um den Verlauf der transienten Transkription des RLI zu

analysieren, wurde eine Kinetik erstellt. RLI-transfizierte Zellen wurden 1 bis 4 Tage nach

Transfektion geerntet, die RNA mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und DNase I verdaut.

Die Bestimmung der Transkriptionsraten erfolgte mittels real time PCR (siehe Abbildung 25).

Nach 24 h wurde in den FRhK-4-Zellen eine leicht erhöhte RLI-Transkription um den Faktor

3 detektiert. Der Höhepunkt der Überexpression wurde nach 2 Tagen mit einer gesteigerten

relativen RLI-mRNA-Menge um den Faktor 6 gemessen. Nach 3 Tagen überschritt die

Transkriptionsrate gerade noch den Grenzwert der nicht-regulierten Genexpression von

zweifach und war nach 4 Tagen nicht mehr nachweisbar. Die Huh7-Zellen erreichten bereits

nach 24 h die maximale Steigerung der RLI-mRNA-Menge um den Faktor 5. In den weiteren

Tagen nahm die relative mRNA-Menge des RLI stetig ab. Nach 4 Tagen konnte nur noch eine

erhöhte Expression des RNase L Inhibitors um den Faktor 3 nachgewiesen werden. Die

Ergebnisse der Expressionshöhe und der Expressionsdauer des RLI waren weder für die

FRhk-4- noch für die Huh7-Zellen zufriedenstellend. Die maximalen Transkriptionsraten und

die Dauer der erhöhten Expression von 4 Tagen waren viel zu gering. Aus diesen Gründen

Ergebnisse

62

wurden sowohl die Möglichkeiten eines anderen Expressionsvektors (pl.18) als auch der

stabilen Transfektion (statt transiente Transfektion) zur Steigerung der Transkriptionsraten

und Expressionsdauer herangezogen.

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A

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24 h 48 h 72 h 96 h

B

Abbildung 25: RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Zeit. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

3.2.4. Vergleich der Expressionsraten von pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI

Da die maximalen Transkriptionsraten des pcDNA3.1/V5-His_RLI sehr gering ausfielen und

bereits nach 4 Tagen kaum eine erhöhte Transkription mehr nachgewiesen werden konnte,

wurde das RLI mit angehängten His-Tag in den Vektor pl.18 umkloniert. Dieser Vektor

zeichnet sich durch besonders hohe Expressionsraten aus und sollte eine stärkere und länger

anhaltende Expression des RLI ermöglichen. Um die Transkriptionsraten der Plasmide zu

vergleichen, wurden Huh7- und FRhK-4-Zellen zum einen mit den entsprechenden

pcDNA3.1/V5-His_RLI, zum anderen mit den entsprechenden pl.18_RLI transfiziert (siehe

Abbildung 26).

Ergebnisse

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pcDNA3.1V5-His/RLI pl.18-m_RLI

B

Abbildung 26: Vergleich der RLI-Transkriptionsraten nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

Bereits nach 24 h zeigten die Transfektionsansätze mit den pl.18_RLI Plasmiden eine deutlich

stärkere RLI-Transkription als die Ansätze mit den entsprechenden pcDNA3.1/V5-His_RLI.

Bei Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI wiesen die FRhK-4-Zellen eine gesteigerte

RLI-mRNA-Menge um den Faktor 4, die Huh7-Zellen um den Faktor 8 auf. Demgegenüber

lag die Erhöhung der RLI-mRNA-Menge durch pl.18_RLI für die FRhK-4-Zellen um einen

Faktor von 20 und für die Huh7-Zellen um einen Faktor von 38. Im Vergleich zum 24 h –

Wert (1 d) zeigte der 72 h – Wert (3 d) für die Transfektionen mit pcDNA3.1/V5-His_RLI

keine weitere Steigerung der RLI-Transkription. Durch Transfektion mit pl.18_RLI wurde

nach 3 Tagen für beide Zelllinien eine Überexpression um Faktoren oberhalb von 40 erreicht.

Nach 120 h (5 d) sanken die Transkriptionsraten mit pl.18_RLI wieder ab, lagen jedoch für

beide Zelllinien noch um den Faktor 10 höher als in den transfizierten Kontrollzellen. Unter

dem Einfluss von pcDNA3.1/V5-His_RLI war die Expression sowohl für FRhK-4- als auch

für Huh7-Zellen nur noch um den Faktor 2,5 erhöht. Aufgrund der deutlich besseren

Transkriptionsraten der pl.18_RLI Plasmide im Vergleich zu den pcDNA3.1/V5-His_RLI

Plasmiden wurden in den weiteren Versuchen die pl.18_RLI Plasmide verwendet.

Ergebnisse

64

3.2.5. Nachweis der RLI-Expression mittels Immunfluoreszenz

Um nachzuweisen, ob die hohen RLI-Transkriptionsraten mit der RLI-Proteinsynthese

korrelieren, wurden diese mittels Immunfluoreszenz kontrolliert. Dazu wurden FRhK-4- und

Huh7-Zellen auf Deckgläschen angezogen und mit den entsprechenden pl.18_RLI Plasmiden

transfiziert. 3 Tage nach Transfektion wurden die Zellen mit Ethanol auf den Deckgläschen

fixiert und die synthetisierten RLI-Proteine mit Hilfe eines spezifischen FITC-gekoppelten

Antikörper gegen den angefügten His-Tag im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht (siehe

Abbildung 27).

A1

A2

B1

B2 Abbildung 27: Immunfluoreszenzen gegen den His-Tag der transfizierten pl.18_RLI Plasmide. Aufgenommen unter Blaulicht mit 40x Vergrößerung. A: Huh7-Zellen: A1 ohne RLI, A2 mit RLI, B: FRhK-4-Zellen: B1 ohne RLI, B2 mit RLI

In den nicht transfizierten Kontrollzellen waren weder bei FRhK-4- noch bei Huh7-Zellen

fluoreszierende Zellen zu finden (siehe Abbildung 27 A1 und B1). Die transfizierten Huh7-

Zellen zeigten sehr wenige leuchtende Zellen (siehe Abbildung 27 A2). Die transfizierten

FRhK-4-Zellen wiesen im Vergleich zu den Huh7-Zellen eine größere Anzahl und deutlich

Ergebnisse

65

stärker leuchtende Zellen auf. Generell gab es jedoch keine nebeneinanderliegenden

fluoreszierenden Zellen. Die Transfektionsrate betrug maximal 10 %. Nach der Messung

erhöhter RLI-mRNA um Faktoren von bis zu 40 nach 3 Tagen (siehe Abbildung 26) wurden

deutlich mehr leuchtende Zellen in der Analyse der Immunfluoreszenz erwartet. Es kann nicht

beurteilt werden, ob lediglich diese geringe Anzahl an Zellen transfiziert wurde oder die

Proteindichte für den Nachweis durch die Immunfluoreszenz noch oder nicht mehr

ausreichend war.

3.2.6. Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen

Da in transient RLI-transfizierten Zellen bereits nach 1 Woche keine erhöhte Menge an RLI-

mRNA mehr nachweisbar war, sollte das RLI stabil in FRhK-4- und Huh7-Zellen

überexprimiert werden. Dadurch sollte eine dauerhafte und konstante Transkriptionsrate des

RLI erreicht werden. FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden mit den entsprechenden pl.18_RLI

Plasmiden transfiziert und potentielle Klone mit Hilfe von G418 selektiert. Eine Woche nach

Transfektion wurden die Zellen in Ansätzen von 1:500 bis 1:5000 gesplittet und das

Wachstum einzelner Klonkolonien beobachtet. Die Selektion stabil transfizierter Huh7-Klone

war nicht möglich, da Huh7-Zellen bei dem sehr hohen Umsetzungsverhältnis im Rahmen der

Klonselektion ihr Wachstum komplett einstellten. Es konnten lediglich Mischklone selektiert

werden, bei denen jedoch nach kurzer Zeit keine erhöhte RLI-Transkriptionsrate mehr

nachgewiesen werden konnte. Von den FRhK-4-Zellen wurden 11 Klonkolonien selektiert

und auf RLI-Überexpression untersucht. 5 Wochen nach Transfektion zeigten noch 6 dieser

11 Klone eine erhöhte Menge an RLI-mRNA (siehe Abbildung 28 A). Die Klone 4, 5 und 8

zeigten gesteigerte Transkriptionsraten um Faktoren von 5 bis 6,5. Die Klone 1, 7 und 11

zeigten erhöhte Transkriptionen um Faktoren von 7,5 bis 8,5. Gegenüber der relativen

Mengen an RLI-mRNA von Tag 3 bis 5 bei einer transienten Transfektion (siehe Abbildung

26 B) zeigten alle stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone vergleichsweise geringe

Überexpressionswerte des RNase L Inhibitors. 8 Wochen nach Transfektion wurden Aliquots

der Klone eingefroren und zu diesem Zeitpunkt die Transkriptionsraten erneut bestimmt

(siehe Abbildung 28 B). Es zeigte sich, bis auf Klon 5, eine Abnahme der relativen Mengen

an RLI-mRNA gegenüber den relativen Mengen an RLI-mRNA 5 Wochen nach Transfektion.

Die Transkriptionsraten der Klone 8 und 11 überschritten kaum noch den Grenzwert von 2.

Alle anderen Klone zeigten nur noch leicht erhöhte Transkriptionen um Faktoren von 4 bis 6.

Ergebnisse

66

Lediglich Klon 5 zeigte noch eine RLI-Überexpression um den Faktor 8, was gegenüber dem

5 Wochen-Wert eine Steigerung der Transkription bedeutete.

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B

Abbildung 28: RLI-Expression in stabil transfizierten FRhK-4-Klonen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Nummer der Klone. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: 5 Wochen nach Transfektion; B: 8 Wochen nach Transfektion

Die Klone 4 und 5 wurden zur Weiterkultivierung ausgewählt. Klon 4 mit einer

vergleichsweise niedrigen RLI-Überexpression und Klon 5 mit einer höheren

Transkriptionsrate. Die Zellen wurden geteilt, umgesetzt und die RLI-Transkriptionsrate nach

einer weiteren Woche erneut analysiert (siehe Abbildung 29). Klon 4 zeigte noch immer eine

leicht erhöhte RLI-mRNA-Menge um einen Faktor von ca. 4. Für Klon 5 konnte keine

Überexpression des RNase L Inhibitor mehr nachgewiesen werden. Somit konnten auch für

die FRhK-4 Zellen keine Klone mit konstant stabiler Überexpression des RNase L Inhibitors

gewonnen werden.

Durch mikroskopische Betrachtung wurden weder morphologische Veränderung der Zellen

noch ein erhöhtes Maß an toten Zellen festgestellt. Trotzdem ist nicht auszuschließen, dass

eine erhöhte RLI-Transkription mit anschließender RLI-Proteinsynthese toxisch auf die

Zellen wirkt und diese dadurch absterben.

Ergebnisse

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Abbildung 29: Bestimmung relativer Einheiten RLI-mRNA der FRhk-4-Klone 4 und 5. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Nummer der Klone. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. 10 Wochen nach RLI-Transfektion

3.2.7. RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5

Die RLI-Expression der stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 wurde genauer

analysiert. Zur Erstellung einer RLI-Kinetik wurden Aliquots der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5

aufgetaut und angezogen. Die Klone sowie nichttransfizierte FRhK-4-Zellen wurden in 6-

well-Platten ausgesät und nach 0, 2, 4, 6, 10 und 14 Tagen geerntet. Mittels real time PCR

wurden die relativen Mengen an RLI-mRNA in den aufgereinigten RNAs bestimmt. Die

stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 zeigten über einen Zeitraum von 14 Tage

keine gleichbleibende Transkription des RLI sondern deutliche Schwankungen (siehe

Abbildung 30). Sowohl Klon 4 als auch Klon 5 wiesen RLI-Transkriptionsraten um Faktoren

von unter 2 bis über 8 auf. Je nach Inkubationszeit der Zellen schwankten die relativen

mRNA-Mengen des RLI in den FRhK-4-RLI-Klonen 4 und 5 sehr stark. Die maximale

relative Steigerung des RLI-mRNA-Gehalts um Faktoren von 8 bis 10 konnte in mehrfachen

Versuchsansätzen nicht reproduziert werden. In manchem Versuchsansatz war die maximale

Menge an relativer RLI-mRNA bereits bei einem Faktor von 4 erreicht. Aus diesem Grund

wurde in Abbildung 30 lediglich ein Einzelexperiment abgebildet. Die Messung der mRNA-

Mengen von RLI sowie der 18S rRNA wurde mit der real time PCR in Doppelbestimmung

durchgeführt. Eine stabil und gleichmäßig erhöhte Expression des RNase L Inhibitors in

FRhK-4-Klonen konnte nicht gezeigt werden. Auch mit Hilfe der Immunfluoreszenz zum

Nachweis von RLI-Protein konnten keine leuchtenden Zellen in den FRhK-4-Klon 4-Zellen

Ergebnisse

68

detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Trotz erhöhter RLI-Transkription lag die Menge an

produziertem RLI mit angehängtem His-Tag deutlich unter der Nachweisgrenze. Auch in

diesem Fall konnte nicht unterschieden werden, ob Zellen mit gesteigerter RLI-Expression

und möglicherweise erhöhtem RLI-Proteinanteil absterben oder die Menge an RLI-Protein für

den Nachweis mittels Immunfluoreszenz nicht ausreichend war.

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B

Abbildung 30: RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5

3.2.8. Kinetik der RLI-Expression stabil transfizierter FRhK-4-6er Klone

Da eine stabile Transfektion des RLI in FRhK-4-Zellen nicht möglich schien, wurde die RLI-

Transkription in einem bereits vorhandenen potentiellen RLI-Klon analysiert. 1999 wurden

von Jörn Gotter im Rahmen seiner Diplomarbeit (Gotter, 1999) FRhK-4-Zellen mit dem

pcDNA3/RLI 3’ Plasmid stabil transfiziert. Eine Analyse der RLI-Transkription wurde jedoch

nie durchgeführt. In Infektionsversuchen mit HAV wurde eine gesteigerte Replikationsrate

von HAV in den gewonnenen FRhK-4-6er Klonen gegenüber nicht transfizierten FRhK-4-

Zellen festgestellt. Das führte zu der Annahme, dass die FRhK-4-6er-Zellen das RLI

überexprimieren. Die FRhK-4-6er Zellen wurden im Stickstofftank aufbewahrt. Ein Aliquot

dieser Zellen wurde aufgetaut und angezogen. Es wurden 6-well-Platten mit FRhK-4-6er

Zellen ausgesät und die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Die zelluläre RNA

Ergebnisse

69

wurde mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und nach der cDNA-Synthese die relativen

RLI-mRNA-Mengen mittels real time PCR bestimmt (siehe Abbildung 31).

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Abbildung 31: RLI-Expression in FRhK-4-6er Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zu FRhK-4-Zellen als Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression.

Es waren Transkriptionsraten des RNase L Inhibitors zwischen Faktoren von 0,3 und 2,7 zu

detektieren. Lediglich für die Tage 1 und 5 der Probennahme wurden die Grenzen der

Genexpression überschritten. Diese Tage entsprechen den Tagen nach Aussaat und

Mediumwechsel. Über den Inkubationszeitraum von 14 Tagen konnten keine stabil erhöhten

Mengen an RLI-mRNA in den FRhK-4-6er Klonen festgestellt werden. Die gesteigerte HAV-

Replikationsrate in diesen Zellen ist nach diesem Ergebnis mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht

auf eine Überexpression des RNase L Inhibitors zurückzuführen, sondern auf eine nicht

definierte Eigenschaft der FRhK-4-6er Klone. Möglicherweise zeigten die FRhK-4-6er-Klone

nach Transfektion mit pcDNA3/RLI 3’ zunächste eine Überexpression des RLI, welche

jedoch wie bei den FRhK-4 Klon 4- und Klon 5-Zellen der vorliegenden Arbeit nicht

aufrechterhalten wurde.

Ergebnisse

70

3.2.9. Zusammenfassung RNase L Inhibitor

Aus humaner- und Rhesusaffen-gesamt-Zell-RNA wurde der RNase L Inhibitor full length

amplifiziert. Dabei wurde das Stop-Codon ausgeschaltet, um die Expression des RLI mit dem

His-Tag des Klonierungsvektors zu ermöglichen. Nach Klonierung des RLI in das Plasmid

pcDNA3.1-V5/His zeigten sowohl die FRhK-4- als auch die Huh7-Zellen eine gesteigerte

RLI-Transkription um Faktoren von maximal 7, welche jedoch bereits nach 4 Tagen nicht

mehr nachweisbar war. Zur Steigerung der RLI-Expression wurde das RLI in den Vektor

pl.18 umkloniert und zeigte in beiden verwendeten Zelllinien eine gesteigerte RLI-Expression

um Faktoren von bis zu 45. Allerdings konnte auch mit Hilfe der entsprechenden pl.18_RLI-

Plasmide eine erhöhte Transkription nicht länger als 1 Woche nachgewiesen werden. Aus

diesem Grund sollte das RLI stabil in die Zellen transfiziert werden. Eine stabile Transfektion

des RLI war weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen erfolgreich. Die Huh7-Zellen stellten bei

dem hohen Umsetzungsverhältnis, welches Vorrausetzung für die Selektion von potentiellen

RLI-Klonen war, ihr Wachstum komplett ein. Auch durch die Selektion transfizierter FRhK-

4-Zellen konnten keine Klone gewonnen werden, die das RLI stabil und dauerhaft

überexprimieren. Die relativen Mengen an RLI-mRNA der FRhK-4-Klone 4 und 5 unterlagen

starken Schwankungen oder waren häufig nicht erhöht. Es wurde angenommen, dass FRhK-

4-6er Zellen, welche in einer vorangegangenen Diplomarbeit aus der stabilen Transfektion

von FRhK-4-Zellen mit pcDNA3/RLI 3’ gewonnen wurden, das RLI überexprimieren. Im

Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte auch in diesen Zellen keine gesteigerte Menge an

RLI-mRNA gegenüber nicht transfizierten FRhK-4-Zellen nachgewiesen werden.

3.3. HCV Infektion

In diesem Teil der Arbeit wurden RLI überexprimierende Huh7- und FRhK-4-Zellen mit dem

Hepatitis C Virus aus infektiösem Frischplasma infiziert. Das für die Infektion verwendete

Frischplasma wurde zunächst mit Hilfe des HCV RotorGene Systems und durch

Sequenzierung genauer charakterisiert. Die Infektion erfolgte sowohl bei den FRhK-4-RLI-

Klonen 4 und 5 (siehe Kapitel 3.2.6) als auch bei transient RLI-transfizierten Huh7- und

FRhK-4-Zellen. Huh7-Zellen sind derzeitig die einzige Zelllinie, in der das Hepatitis C Virus

JFH-1 oder HCV-Replikons effizient replizieren, so dass aus diesem Grund Huh7-Zellen in

dieser Arbeit verwendet wurden. In HAV-Infektionsversuchen mit RLI-transfizierte FRhK-4-

Zellen zeigte sich ein stärkeres Viruswachstum. Es wurde daher versucht, diese Eigenschaft

Ergebnisse

71

der RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen auf das Hepatitis C Virus zu übertragen. Neben der

Bestimmung der HCV-RNA wurde die Expression von RNase L und RLI analysiert. Obwohl

bisher keine Regulation der RNase L in der Literatur beschrieben wurde, wurde diese

ebenfalls analysiert. In Infektionsversuchen mit HAV einer parallel laufenden Arbeit zeigte

die Datenlage zwischenzeitlich eine mögliche gesteigerte Expression der RNase L. Aus

diesem Grund wurde auch die Expression der RNase L im Rahmen der vorliegenden Arbeit

unter den Bedingungen einer HCV-Infektion analysiert. Es wurde überprüft, ob das Virus

möglicherweise einen Einfluss auf die RNase L ausübt und ob sich die Überexpression des

RLI positiv auf die Replikation des HCV auswirkt.

3.3.1. Titer- und Subtypenbestimmung von HCV-positivem Plasma des

Blutspendedienstes Hagen

HCV-positives und infektiöses Frischplasma vom Blutspendedienst Hagen (in der RotorGene

Beschriftung Abbildung 32 A Hagenplasma genannt) wurde für die Infektion von Huh7- und

FRhK-4 Zellen verwendet. Zunächst wurde der Virustiter des Plasmas im HCV RotorGene

System quantifiziert und durch Sequenzierung des Amplifikates der Subtyp des Virus

bestimmt (siehe Abbildung 32). Anhand der mitgeführten Standardreihe wurde die

Konzentration des eingesetzten Eluates durch die RotorGene Software kalkuliert und

anschließend ein HCV Titer im Plasma von ca. 2,76 x 106 IU/ml berechnet. Die Auswertung

der Sequenz des PCR Amplifikates mit Hilfe der HCV Datenbank http://hcv.lanl.gov/cgi-

bin/BASIC_BLAST/basic_blast.cgi ergab eine 100%ige Übereinstimmung mit dem HCV

Subtyp 3a (siehe Abbildung 32 B). Der Subtyp 3a ist wie 1a und 1b weltweit verbreitet, findet

sich jedoch hauptsächlich bei Drogenabhängigen.

Ergebnisse

72

A

5’ - GCC CCC CCC TCC CGG GAG AGC CAT AGT GGT CTG CGG AAC CGG TGA GTA CAC CGG AAT CGC TGG GGT GAC CGG GTC CTT TCT TGG AAC AAC CCG CTC AAT ACC CAG AAA TTT GGG CGT GCC CCC GCA AGA TCA CTA GCC GAG TAG TGT TGG GTC GCG AAA GGC CTT GTG GTA CTG CCT GAT AGG GTG CTT GCG AGA – 3’

B

Abbildung 32: Titerbestimmung und Genotypenanalyse HCV-positiven FrischplasmasA: Amplifikation des aufgereinigten Plasmas im HCV RotorGene System. blau: Standardreihe, rot: HCV Eluat in 10fach-Bestimmung; grün: Wasserkontrolle; B: Sequenz des Amplifikates.

3.3.2. Stabilität von HCV RNA

Um die Ergebnisse der HCV RNA-Bestimmung von infizierten Zellen nach verschiedenen

Inkubationszeiten beurteilen zu können, wurde zunächst die Stabilität von Hepatitis C Virus

RNA im Viruskapsid bestimmt. Die Stabilität der RNA wurde in Medium und unter

Brutschrankbedingungen, jedoch ohne den Einfluss zellulärer Enzyme bestimmt. Anhand der

Inkubationszeit nachweisbarer RNA im zellfreien Medium wurde beurteilt, ob die detektierte

HCV RNA in den Infektionsversuchen noch vom Inokulum an den Zellen haften könnte oder

repliziert wurde. Durch die zusätzlichen zellulären RNasen in den Infektionsversuchen wurde

davon ausgegangen, dass die zeitliche Nachweisgrenze von Inokulum RNA deutlich vor dem

Zeitpunkt liegt, an dem die Nachweisgrenze der HCV RNA im zellfreien Medium erreicht

wurde.

Für den Stabilitätstest wurden 4 μ l HCV-positives Frischplasma (entspricht ca. 104 IU) in

4 ml DMEM gegeben und zu je 1 ml auf 4 wells einer 12-well-Platte verteilt. Die

Konzentration pro well betrug somit ca. 2500 IU/ml. Die Zellkulturplatte wurde im

Ergebnisse

73

Brutschrank bei konstanten Bedingungen (37°C, 5 % CO2) inkubiert. Im Abstand von 2

Tagen wurden je 140 μ l Medium abgenommen und mittels real time RT-PCR die

Konzentration der Virus RNA bestimmt. Zur besseren Veranschaulichung wurden die RNA-

Konzentrationen sowohl linear (siehe Abbildung 33Abbildung 34) als auch logarithmisch

(siehe Abbildung 34) dargestellt. Nach 30 Tagen waren in den einzelnen wells lediglich noch

300 μ l Medium vorhanden. Aufgrund der konstanten Inkubationsbedingungen und

gleichbleibender Mediumoberfläche wird eine Verdunstung von ca. 23 μ l pro Tag (entspricht

700 μ l in 30 Tagen) angenommen. Diese Verdunstungsmenge wurde in die Berechnung der

Virusmenge pro ml einbezogen. Bis zu Tag 18 (432 h) konnte für alle Proben ein

reproduzierbar positives Signal in der real time RT-PCR detektiert werden. Die Virusmenge

sank innerhalb dieser Tage stetig von ursprünglichen 2800 IU auf 20 IU pro ml Medium.

Ohne den rechnerischen Faktor der Verdunstung enthielten die aufgereinigten

Mediumsproben von Tag 18 eine RNA-Konzentration von durchschnittlich 34 IU/ml. Diese

RNA-Konzentration korreliert mit dem 95 % Wert der Sensitivitätsbestimmung (siehe

Abbildung 20) und entspricht der Konzentration, die noch zu 95 % mit dem RotorGene

System nachgewiesen werden kann. D.h. an Tag 18 wurde die Nachweisgrenze des HCV

RotorGene Systems erreicht. Niedrigere HCV Konzentrationen im Medium waren nicht mehr

reproduzierbar detektierbar. In den Versuchstagen nach Tag 18 nahm die Anzahl der

Signalausfälle stetig zu. Nach 30 Tagen waren alle Proben RT-PCR negativ. In keinem der 4

Ansätze war noch HCV-RNA nachweisbar. Ohne RNA-Abbau hätte sich die Anzahl der

Internationalen HCV Einheiten alle 2 Tage lediglich um die Anzahl der in 140 μ l Probe

enthaltenen Internationalen Einheiten verringern müssen (siehe Abbildung 33 und Abbildung

34 blaue Balken). Die entnommenen HCV-Mediumsuspensionen von je 140 μ l wurden durch

je 140 μ l Medium aufgefüllt, so dass ohne RNA-Abbau nach 30 Tagen rechnerisch noch eine

RNA-Konzentration von 90 IU/ml vorhanden gewesen wäre. Durch den Abbau der HCV

RNA in DMEM im Brutschrank war jedoch nach 30 Tagen im HCV RotorGene System keine

RNA mehr nachweisbar. Durch das zusätzliche Vorhandensein zellulärer RNasen in den

Infektionsversuchen, ist davon auszugehen, dass die Nachweisgrenze von 35 IU/ml HCV

RNA im RotorGene System bereits vor Ablauf von 18 Tagen Inkubationszeit erreicht sein

wird. Nach maximal 30 Tagen Inkubationszeit ist ein Nachweis von HCV Inokulum-RNA in

den Infektionsversuchen sehr unwahrscheinlich.

Ergebnisse

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berechnete IU/ml theoretische IU/ml ohne Abbau

Abbildung 33: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (lineare Darstellung). Aufgetragen wurde die Menge an HCV-RNA gegen die Inkubationszeit. blau: therotische IU/ml HCV ohne RNA Abbau, dunkelgrau: berechnete IU/ml HCV RNA im Versuchsansatz.

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690

h

HC

V-R

NA

[IU

/ml]

berechnete IU/ml theoretische IU/ml ohne Abbau

Abbildung 34: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (logarithmische Darstellung): Aufgetragen wurde die Menge HCV-RNA gegen die Inkubationszeit. blau: therotische IU/ml HCV ohne RNA Abbau, dunkelgrau: berechnete IU/ml HCV RNA im Versuchsansatz.

3.3.3. HCV Infektion der RLI-Klone 4 und 5

Die FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 wurden trotz möglicherweise niedriger Expression des

RNase L Inhibitors mit infektiösem, HCV-positivem Frischplasma infiziert. Es wurden Zellen

der RLI-Klone 4 und 5 in 6-well-Platten ausgesät und nach 24 h mit 150 μ l HCV-positivem

Frischplasma (MOI = 1) infiziert. Nach 2 Stunden Inkubation wurden die Zellen gewaschen

Ergebnisse

75

und mit frischem Medium versehen. Durch diesen Waschschritt wurde die in Kapitel 3.3.2

bestimmte maximale zeitliche Nachweisgrenze der HCV RNA von 30 Tagen nochmals

verringert. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 d), nach 2 d, 4 d, 6 d, 10 d und nach 14 d

wurden die Zellen von je einem well des Infektionsversuchsansatzes geerntet. Aus Zellen und

Zellüberstand wurde die RNA aufgereinigt. Die Eluate der aufgereinigten Zellen wurden nach

der cDNA-Synthese in den entsprechenden real time PCRs auf die relativen Mengen an

mRNA von RNase L und RLI bzw. HCV RNA untersucht. Die Normalisierung der relativen

mRNA-Mengen von RNase L und RLI erfolgte auf die 18S rRNA und auf die nicht

transfizierten Kontrollzellen. Klon 4 zeigte für die 4 d -, 6 d - und 14 d - Werte eine

gesteigerte RLI-Transkription um Faktoren von 3 bis 7 (siehe Abbildung 35 A) im Vergleich

zu den nicht transfizierten Kontrollen. Der 10 d - Wert zeigte keine erhöhte relative Menge an

RLI-mRNA. Da alle Zeitpunkte Probennahmen einzelner unabhängiger wells waren,

verdeutlich dieser Wert ein weiteres Mal die starken Schwankungen der RLI-Expression in

den transfizierten Klonen. Für alle anderen Zeitpunkte entsprechen die relativen Einheiten an

RLI-mRNA für Klon 4 nahezu den relativen Einheiten der in Abbildung 30 A dargestellten

Kinetik. Die Expression des RNase L Inhibitors während der HCV Infektion war für Klon 5

zu keinem Zeitpunkt deutlich erhöht (siehe Abbildung 35 B). Lediglich der 14 d - Wert

(336 h) zeigt eine leicht gesteigerte relative Menge an RLI-mRNA um den Faktor 2,8.

Aufgrund der Schwankungen der relativen Mengen an RLI-mRNA zwischen den

Experimenten wurde in Abbildung 35 lediglich ein Einzelexperiment dargestellt. Die

Messung der mRNA-Mengen von RLI sowie der 18S rRNA wurde mit der real time PCR in

Doppelbestimmung durchgeführt.

Die Transkriptionsraten der RNase L lagen über den gesamten Zeitraum der Probennahmen

für beide Klone innerhalb der Schwankungsgrenzen (siehe Abbildung 36).

Die Eluate der RNA-Aufreinigung der Zellen und der Zellkulturüberstände wurden im HCV

RG System auf HCV RNA getestet. Sowohl die nicht infizierten FRhK-4-Kontrollzellen als

auch die FRhK4-RLI-Klon 4- und Klon 5 - Zellen waren nach 4 Tagen intrazellulär und

extrazellulär HCV negativ. Da keine virale Replikation in den Zellen stattgefunden hat, kann

über einen potentiellen Einfluss des HCV auf die Expression der RNase L keine Aussage

getroffen werden.

Ergebnisse

76

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B

Abbildung 35: RLI-Expression der FRhK-4-RLI-Klone bei HCV Infektion. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5

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B

Abbildung 36: RNase L-Expression der Klone bei HCV Infektion. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5

3.3.4. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Zellen

Da es nicht möglich war, RLI-Klone von FRhK-4- und Huh7-Zellen zu etablieren, welche das

RLI stabil überexprimieren, wurde der Verlauf einer HCV Infektion in transient transfizierten

Zellen untersucht. 2 Tage nach Transfektion erfolgte die Infektion mit HCV-positivem und

infektiösem Frischplasma (siehe Kapitel 2.2.2.10). Um eine Überexpression des RNase L

Ergebnisse

77

Inhibitors über einen Zeitraum von 4 Wochen zu garantieren, wurden die Zellen dreimal im

Abstand von je einer Woche mit dem Plasmid pl.18_RLI transfiziert. Nach je einer Woche

wurden alle Zellen eines wells in ein neues gegebenenfalls größeres well überführt und nach

24 h Inkubationszeit transfiziert. Während des Versuches wurden keine Zellen abgenommen,

um die RLI-Transkriptionsrate zu bestimmen. Aus den Ergebnissen der vorangegangenen

Versuche wurde davon ausgegangen, dass nach einer Woche noch eine erhöhte Menge an

RLI-mRNA in den Zellen vorhanden war. Das Aufrechterhalten der erhöhten Transkription

über einen längeren Inkubationszeitraum als eine Woche erfolgte durch die erneute

Transfektion. Die Bestimmung der relativen Mengen an RLI-mRNA mit Hilfe der real time

PCR wurde am Ende des Versuches durchgeführt.

Der mehrfache Austausch des Zellkulturüberstandes durch Transfektionsansatz, 1xPBS und

frisches Medium führte bereits nach einer Woche dazu, dass keine HCV RNA im Überstand

mehr nachgewiesen werden könnte. Nach insgesamt 4 Wochen wurden alle Zellen geernten.

Die zelluläre RNA wurde mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und die Eluate in den

entsprechenden real time PCRs auf die relativen Mengen an mRNA von RNase L und RLI

bzw. HCV RNA untersucht.

Auf Genexpressionsebene wurden sowohl die Transkriptionsraten des RLI (siehe Abbildung

37) als auch der RNase L analysiert (siehe Abbildung 38). Die FRhK-4- und die Huh7-Zellen

zeigten 4 Wochen nach Versuchsbeginn noch eine deutliche Überexpression des RNase L

Inhibitors. Sowohl auf das Referenzgen 18S rRNA als auch auf GAPDH bezogen, wiesen die

Huh7-Zellen erhöhte Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von 32 bis 40 auf (siehe

Abbildung 37 A). Für die FRhK-4-Zellen konnten mit Hilfe der real time PCR gesteigerte

relative mRNA-Einheiten des RNase L Inhibitors um Fakoren von 17 bis 30 detektiert werden

(siehe Abbildung 37 B).

Weder in den FRhK-4- noch in den Huh7-Zellen wurde eine gesteigerte Transkription der

RNase L detektiert (siehe Abbildung 38). Für beide Zelllinien lagen die relativen Einheiten

der RNase L-mRNA innerhalb der Schwankungsgrenzen von 0,5 bis 2.

Intrazellulär und extrazellulär konnte 4 Wochen nach Infektion keine HCV RNA mehr

nachgewiesen werden. Die Überexpression des RLI hatte auch in diesem Fall keinen positiven

Einfluss auf die HCV Replikation.

Ergebnisse

78

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Referenzgen 18S RNA Referenzgen GAPDH

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Referenzgen 18S rRNA Referenzgen GAPDH

B

Abbildung 37: Transkriptionsrate des RLI 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA bzw. der mRNA von GAPDH und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

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B

Abbildung 38: Transkriptionsrate der RNase L 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA bzw. der mRNA von GAPDH und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

3.3.5. Zusammenfassung HCV Infektion

Die Charakterisierung des HCV-positiven und infektiösen Frischlasmas vom

Blutspendedienst Hagen erfolgte im HCV RotorGene System. Mit einer Viruskonzentration

Ergebnisse

79

von 2,76x106 IU/ml ist das Plasma als sehr hoch positiv einzuschätzen. Nach Sequenzierung

des Amplifikates konnte das Virus im Plasma dem HCV Subtypen 3a zugeordnet werden.

Im Stabilitätstest der HCV RNA konnte gezeigt werden, dass ohne den Einfluss zellulärer

Enzyme HCV RNA bis zu 30 Tagen bei 37°C nachweisbar ist. Dieser Versuch diente dazu,

den Inkubationszeitraum zu bestimmen, in dem HCV Inokulum mit Hilfe des HCV

RotorGene Systems noch nachgewiesen werden kann. In den HCV Infektionsversuchen sollte

die maximale Nachweisgrenze von 30 Tagen durch das Waschen der Zellen und das

Vorhandensein zellulärer RNasen deutlich unterschritten werden. Reproduzierbar positive

Nachweisbarkeit von HCV Inokulum wird in den Infektionsversuchen nur unter 18 Tagen

erwartet.

Nach HCV Infektion der FRhK-4-Klon 4 und 5 Zellen konnte keine Replikation der Viren

festgestellt werden. 4 Tage nach Infektion waren intrazellulär und extrazellulär alle Proben

HCV negativ. Klon 4 wies innerhalb des Infektionsversuches erhöhte relative Mengen an

RLI-mRNA um Faktoren von 2 bis 6 auf. In Klon 5 konnte keine gesteigerte RLI-Expression

nachgewiesen werden. Obwohl für die RNase L in der Literatur keine Regulation auf

Genexpressionsebene beschrieben wurde, wurde diese im Rahmen der Manipulation des

2’-5’Oligoadenylatsynthetasesystem ebenfalls analysiert. Die relativen Mengen an mRNA der

RNase L zeigten in HCV infizierten FRhK-4-Klon 4 und 5 Zellen keinen Unterschied zu nicht

infizierten Zellen. Da keine virale Replikation in den Zellen stattgefunden hat, kann keine

Aussage über einen potentieller Einfluss des HCV auf die Expression der RNase L getroffen

werden.

Die Analyse der relativen Mengen an mRNA des RNase L Inhibitors in transient RLI-

transfizierte Huh7- und FRhK-4-Zellen zeigte erhöhte Transkriptionen um Faktoren bis zu 40.

Durch dreimalige Transfektion mit den entsprechenenden pl.18_RLI Plasmiden wurde die

Überexpression über einen Inkubationszeitraum von 4 Wochen aufrecht erhalten. Nach

Ablauf der 4 Wochen konnte weder in den Huh7- noch in den FRhK-4-Zellen intrazellulär

oder extrazellulär HCV RNA nachgewiesen werden. Die Expression der RNase L wurde auch

in transient RLI-transfizierte Huh7- und FRhK-4-Zellen nicht durch die HCV Infektion

beeinflusst.

3.4. Transfektion in vitro transkribierter HCV full-length RNA

Um zu gewährleisten, dass die Aufnahme der HCV RNA in das Zytoplasma der Zellen

erfolgt, wurde der Schritt des Viruseintritts experimentell umgangen und HCV full length

Ergebnisse

80

RNA transfiziert. Dazu wurde zunächst das Plasmid p90/HCV FL-long pU angezogen,

welches die full length RNA vom HCV Subtyp 1a enthält. Nach Linearisierung des Plasmids

erfolgte die in vitro Transkription der HCV full length RNA. Um einen Einfluss der

Transfektion von in vitro Transkript (IVT) auf die Transkription der RNase L und des

zellulären RLIs auszuschließen, sollte ein möglichst langes nicht virales IVT im Vergleich

zum HCV IVT in FRhK-4- und Huh7-Zellen transfiziert werden. Daher wurde der 2 kb lange

Elongationsfaktor von Xenopus (Krallenfrosch) aus dem Plasmid pTRI, welches als

Kontrollplasmid im MEGAscript® High Yield Transcription Kit enthalten ist, ebenfalls in

vitro transkribiert. Der potentielle Einfluss der Transfektion von HCV IVT auf die

Transkription der RNase L und des zellulären RLI wurden analysiert. Die Auswertung der

HCV RNA erfolgte neben den zellulären Standardbedingungen auch unter den Bedingungen

erhöhter RLI-Expression durch Transfektion von pl.18-RLI.

3.4.1. In vitro Transkription von full length HCV RNA

Nach der Transformation von Plasmid p90/HCV FL-long pU, wurden E.coli Klone

herangezogen. Mit Hilfe des QIAGEN® Plasmid Mini Kit wurde das Plasmid aufgereinigt und

für die full length Transkription mit dem Restriktionsenzym Bsm I linearisiert. Dieses Enzym

schnitt zweimal in p90/HCV FL-long pU, wodurch Fragmente von 1427 bp und 11553 bp

enstanden. Der komplette Linearisationsansatz wurde im Agarosegel aufgetrennt und die das

HCV Insert enthaltene Bande von 11553 bp aufgereinigt. Die Kontrolle dieser Aufreinigung

im 1%igen Agarosegel zeigte eine saubere Bande bei 11553 bp ohne weitere Nebenbanden.

Die in vitro Transkription wurde nach Protokoll des MEGAscript® High Yield Transcription

Kit für 4 h bei 37°C durchgeführt. Die Kontrolle des IVT im 1%igen Agarosegel zeigte

deutlich die DNA-Bande des linearisierten Plasmides. Nach DNase-Verdau und RNA-

Aufreinigung war die DNA vollständig abgebaut und ein sauberes IVT im Eluat enthalten.

Zur Konzentrationsbestimmung wurde die 10-6 Verdünnung der in vitro transkribierte RNA in

das HCV RotorGene Assay eingesetzt (siehe Abbildung 39). Es wurden jeweils

Doppelbestimmungen der IVT-Ansätze durchgeführt. Mit Hilfe der mitgeführten

Standardreihe wurden die Konzentrationen der HCV IVTs berechnet. Für alle Ansätze der in

vitro transkribierten RNA ergab sich eine Konzentration von 104 IU/μ l. Nach der in Kapitel

2.2.2.12 angegebenen Formel für die Umrechnung von IU/μ l in g/μ l ergaben sich für die

einzelnen in vitro Transkripte Mengen zwischen 115 ng/μ l und 175 ng/μl.

Ergebnisse

81

Abbildung 39: RotorGene Lauf der in vitro transkribierten HCV-RNA. rot: Standardreihe; schwarz: HCV IVTs in Doppelansätzen; grün: Wasserkontrolle

3.4.2. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen

Obwohl bekannt ist, dass Antikörper gegen CD81 die HCV Infektion in Huh7-Zellen

hemmen (Zhong et al., 2005), d.h. die Huh7-Zellen den CD81-Rezeptor exprimieren, wurde

der Viruseintritt umgangen und die HCV RNA transfiziert. In der Literatur gibt es jedoch

keine Angaben über das Vorhandensein des CD81-Rezeptors in FRhK-4-Zellen. Es besteht

sowohl für die FRhK-4- als auch für die Huh7-Zellen die Möglichkeit, dass in den

Infektionsversuchen das Hepatitis C Virus nicht in die Zellen gelangt ist. Daher wurde die

Rezeptor-abhängige Virusaufnahme umgangen und die HCV RNA in die Zellen transfiziert.

Mit Hilfe der Transfektion wurde sichergestellt, dass die HCV RNA in das Zytoplasma der

Zellen gelangt. Durch einen Vergleichsversuch (Transfektion von HCV IVT bzw. IVT des

Elongationsfaktors II von Xenopus = pTRI IVT) wurde ein potentieller Einfluss der

Transfektion von IVT auf die Transkription der RNase L und des zellulären RLI überprüft.

Nach vierstündiger Inkubation der Transfektionsansätze mit den Zellen wurden diese

gewaschen und mit frischem Medium versehen. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 h),

nach 3 h, 6 h, 9 h, 12 h und nach 24 h wurden die Zellen von je einem well geerntet.

Intrazelluläre und extrazelluläre RNA wurden aufgereinigt und die Eluate in den

entsprechenden real time PCRs auf die Menge an mRNA von RNase L, RLI sowie der

Ergebnisse

82

18S rRNA bzw. auf die Menge an HCV RNA untersucht. Die relativen mRNA-Mengen der

RNase L der Huh7-Zellen lagen sowohl bei der Transfektion mit HCV IVT als auch mit pTRI

IVT über den gesamten Inkubationszeitraum von 24 h innerhalb der Schwankungsgrenzen der

nicht regulierten Genexpression von 0,5 bis 2 (siehe Abbildung 40 A). Auch in den FRhK-4-

Zellen konnte keine signifikante Erhöhung der RNase L-Expression festgestellt werden.

Lediglich der 24 h - Wert zeigte eine leicht erhöhte Transkription der RNase L um den Faktor

2,5 (siehe Abbildung 40 B). In den folgenden Abbildungen werden jeweils Einzelexperimente

dargestellt. Die Analyse der verschiedenen mRNAs sowie der HCV RNA erfolgten in

Einzelbestimmungen.

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Abbildung 40: RNase L-Expression in IVT-transfizierten Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

Die Konzentration der HCV RNA nahm sowohl intrazellulär als auch extrazellulär über die

Inkubationszeit kontinuierlich ab. Die Transfektion erfolgte mit 250 ng HCV IVT, was nach

der in Kapitel 2.2.2.12 angegebenen Formel 4,5*104 Kopien bzw. 1,5*104 IU entspricht. Für

die Huh7-Zellen waren nach 24 Stunden extrazellulär noch 43 IU/μ l Probe nachweisbar. In

einem Milliliter Zellkulturüberstand enspricht diese Konzentration 4,3*104 Internationalen

Einheiten HCV RNA. Diese Menge an HCV RNA ist größer als die rechnerisch eingesetzte

Menge von 1,5*104 IU. Da die Abnahme der HCV RNA im Verlauf der Probennahme gegen

eine Zunahme der HCV RNA innerhalb von 24 Stunden spricht, ist diese RNA-Menge sehr

wahrscheinlich durch Pipettierungenauigkeiten bei der IVT Transfektion zu erklären. Bereits

Ergebnisse

83

1 μ l Pipettierungenauigkeit bewirken einen Unterschied von 7,5*103 IU HCV RNA. Es ist

daher davon auszugehen, dass im Inokulum mehr als 1,5*104 IU HCV RNA eingesetzt

wurden. Anhand der in Abbildung 41 A dargestellten extrazellulären RNA-Konzentration des

0 h - Wertes, betrug die tatsächliche Inokulummenge mindestens 5*105 IU. Intrazellulär war

nach 24 Stunden noch HCV RNA von 180 IU/μ l pro relative 18S rRNA-Einheiten zu

detektieren (siehe Abbildung 41 A). Das entsprach in 50 μ l gesamt-Zelleluat einer HCV-

Menge von 9*103 IU bzw. 2,7*104 Kopien. In den RNA-Eluaten der FRhK-4-

Zellkulturüberstände wurden nach 24 h noch 60 IU/μ l nachgewiesen, d.h. im

Zellkulturüberstand von einem Milliliter wurden noch 6*104 IU HCV RNA detektiert.

Intrazellulär lag die RNA-Konzentration bei 17 (IU/μ l)/relative 18S rRNA-Einheiten. In 50 μ l

gesamt-Zelleluat ensprach das einer HCV-Menge von 850 IU oder 2,55*103 Kopien. Die

intrazellulären 0 h - Werte der Analyse der HCV RNA von 5,6*104 (Huh7-Zellen) bzw.

1,4*104 (Frhk4-Zellen) weisen auf eine gelungene Transfektion der RNA in das Zytoplasma

der Zellen hin. Eine Replikation der RNA konnte jedoch nicht beobachtet werden.

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extrazellulär [IU/μl]intrazellulär [(IU/μl)/18S rRNA]

B

Abbildung 41: HCV RNA-Titer in IVT-transfizierten Zellen. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten HCV-RNA gegen die Zeit. A: Huh7, B: FRhK-4

Die Transkription des zellulären RLI wurde unter den Bedingungen der IVT-Transfektion

(siehe Abbildung 42) ebenfalls analysiert. Weder bei den Huh7- noch bei den FRhK-4-Zellen

konnte eine RLI-Expression ausserhalb der Schwankungsbereiche festgestellt werden. Weder

die Transfektion von HCV full length RNA noch die Transfektion der RNA des Xenopus

Elongationsfaktors hatte einen Einfluss auf die Transkription des zellulären RLI.

Ergebnisse

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HCV IVT pTRI IVT

B

Abbildung 42: RLI-Expression in IVT-transfizierten Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

3.4.3. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient

RLI-transfizierten Zellen

Um den Einfluss des überexprimierten RLI auf die Replikation von in vitro transkribierter

HCV full length RNA zu untersuchen, wurden FRhK-4- und Huh7-Zellen in 24-well-Platten

ausgesät und nach 24 Stunden Inkubationszeit mit den entsprechenden pl.18-RLI Plasmiden

bzw. dem pl.18-Leervektor transfiziert. 2 Tage nach RLI-Transfektion erfolgte die

Transfektion mit in vitro transkribierter HCV full length RNA bzw. dem pTRI IVT. Nach

vierstündiger Inkubation der IVT-Transfektionsansätze wurden die Zellen gewaschen und mit

frischem Medium versehen. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 h), nach 3 h, 6 h, 9 h,

12 h, 24 h, 36 h, 2 d, 3 d und nach 4 d wurde je ein well der Zellen geerntet und die

intrazelluläre und extrazelluläre RNA aufgereinigt. Die intrazellulären RNA Eluate wurden

hinsichtlich HCV RNA und relativer mRNA-Mengen an RNase L bzw. RLI analysiert. In den

extrazellulären RNA Eluaten wurde lediglich die Menge an HCV RNA bestimmt. Der

gesamte Zellansatz eines weiteren wells wurde nach 4 Tagen in eine 6-well-Platte umgesetzt

und nach 24 h Inkubationszeit erneut mit den entsprechenden pl.18 Plasmiden transfiziert.

Nach einer weiteren Woche (11 Tage nach HCV-Transfektion) wurde der Zellansatz dieses

wells gesplittet. Ein Teil der Zellen wurde im Brutschrank weiter inkubiert und nach 24 h

Inkubationszeit erneut mit den entsprechenden pl.18 Plasmiden transfiziert. Die RNA der

Ergebnisse

85

zweiten Splithälfte wurde aufgereinigt und hinsichtlich HCV RNA und relativer mRNA-

Mengen an RNase L bzw. RLI analysiert. Ein weiterer Split mit anschließender Transfektion

oder RNA-Aufreinigung erfolgte nach insgesamt 3 Wochen (26 d / 624 h). 33 Tage nach

Versuchsbeginn wurden die Zellen erneut geteilt, jedoch nicht mehr transfiziert.

Die relativen Einheiten an RLI-mRNA der Huh7-Zellen sanken innerhalb von 4 Tagen nach

HCV-Transfektion von einem erhöhten Faktor von 180 auf einem Faktor von 16 (siehe

Abbildung 43). Nach 11 Tagen war die Transkriptionsrate des RNase L Inhibitors noch um

einen Faktor von 18 erhöht, nach 26 Tagen um einen Faktor von 8. 33 Tage nach

Versuchsbeginn konnte in den Huh7-Zellen keine Überexpression des RLI mehr

nachgewiesen werden.

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0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 264 h 624 h 792 h

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Rel

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n zu

r 18

S r

RN

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und

unbe

hand

elte

r K

ontr

olle

pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV

Abbildung 43: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Es wurde entweder das pl.18-h_RLI oder der pl.18 Leervektor transfiziert.

Die Expressionsrate des RNase L Inhibitors der FRhK-4-Zellen nahm von einer maximalen

Erhöhung um den Faktor von 180 stetig bis auf einen Faktor von 34 nach 4 Tagen ab (siehe

Abbildung 44). Dabei zeigten die RLI Transkriptionsraten keinen so schönen kinetischen

Verlauf wie die Daten der relativen Einheiten an RLI-mRNA der Huh7-Zellen. Die maximale

Überexpession des RLI der FRhK-4-Zellen wurde erst 6 h nach IVT-Transfektion erreicht.

Nach einer Woche erfolgte eine zweite RLI-Transfektion, wodurch die relative Menge an

RLI-mRNA nach insgesamt 11 Tagen sogar noch um einen Faktor von 120 erhöht war. 26

Ergebnisse

86

Tage nach Versuchsbeginn und nach der dritten Transfektion zeigte der RNase L Inhibitor

noch eine leicht erhöhte Expression um einen Faktor von 5. 33 Tage nach Versuchsbeginn

konnte in den FRhK-4-Zellen keine Überexpression des RLI mehr nachgewiesen werden.

0

20

40

60

80

100

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140

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200

0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 264 h 624 h 792 h

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Ein

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A

in R

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ter

Kon

trol

le


Abbildung 44: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Es wurde entweder das pl.18-m_RLI oder der pl.18 Leervektor transfiziert.

Der HCV RNA Titer nahm sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-Zellen extrazellulär

und intrazellulär über die Inkubationszeit kontinuierlich ab. Unterschiedliche

Ausgangsmengen an HCV RNA im Überstand zwischen RLI-transfiziertem Ansatz und dem

Vergleichsansatz mit dem pl.18-Leervektor sind auf verschieden gute Wascheffekte nach der

Transfektion zurückzuführen (siehe Abbildung 45 A2 und B2). Der mehrfache Austausch des

Zellkulturüberstandes durch Transfektionsansatz, 1xPBS und frisches Medium führten nach

dem Umsetzen der Zellen in die 6-well-Platte zur vollständigen Entfernung der HCV RNA im

Zellkulturüberstand.

Intrazellulär nahm die HCV RNA Menge der RLI-transfizierten Huh7-Zellen von

0,55 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA bis auf 0,06 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA nach

11 Tagen ab (siehe Abbildung 45 A1). Für das gesamt-Zelleluat von 50 μ l entsprachen diese

Werte 22 IU (3 h nach Infektion) und 3 IU (11 Tage / 254 h nach Infektion). Direkt nach

Abnahme des Inokulums wurden intrazellulär 2,76 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA, d.h.

135 IU in 50 μ l gesamt-Zelleluat detektiert (Datenpunkt in Abbildung 45 A1 nicht

Ergebnisse

87

abgebildet). Da für die Transfektion 1,5*104 IU (250 ng) HCV RNA eingesetzt wurden, weist

der 0 h - Wert von 135 IU in der Zelle auf eine nur sehr geringe Aufnahme der RNA hin.

Auch in den Kontrollzellen mit dem pl.18-Leervektor konnte für den 0 h - Wert nur eine sehr

geringe intrazelluläre HCV RNA Menge von 185 IU in 50 μ l gesamt-Zelleluat detektiert

werden (Datenpunkt in Abbildung 45 A1 nicht abgebildet). Warum in diesem

Transfektionsversuch nur sehr wenig HCV RNA in die Huh7-Zellen aufgenommen wurde ist

unklar. 3 h nach HCV Transfektion wurden noch 0,6 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA

nachgewiesen, was in 50 μ l gesamt-Zelleluat einer Menge von 30 IU entsprach. Die RNA-

Konzentration nahm wie bei der Transfektion mit dem humanen RLI-Plasmid innerhalb von

11 Tagen auf 0,07 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA ab.

Die HCV RNA Menge der RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen nahm von 0,16 (IU/μ l)/relative

Einheit 18S rRNA auf 0,02 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA ab (siehe Abbildung 45 B1).

Diese Konzentrationen entsprachen schon ab dem 3 h - Wert in 50 μ l gesamt-Zelleluat

weniger als 0,4 IU und damit weniger als einer HCV Kopie. Im Kontrollansatz mit dem pl.18-

Leervektor konnten 3 Stunden nach HCV Transfektion 0,4 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA

nachgewiesen werden, was 18 IU in 50 μ l gesamt-Zelleluat entsprach. Für den 0 h - Wert

wurden im gesamt-Zelleluat der Kontrollzellen 2200 IU HCV RNA detektiert, während in den

transfizierten Zellen mit dem Affen RLI-Plasmid 1770 IU HCV RNA detektiert wurden

(Datenpunkte in Abbildung 45 B1 nicht abgebildet). Die für die Transfektion eingesetzte

HCV RNA von 1,5*104 IU (250 ng) wurde von den FRhK-4-Zellen besser aufgenommen als

von den Huh7-Zellen. Ob die starke Abnahme der HCV RNA innerhalb der ersten drei

Inkubationsstunden auf den Abbau der HCV RNA oder auf absterbende, transfizierte Zellen

zurückzuführen ist, ist unklar. Es wurden mikroskopisch einige tote Zellen beobachtet, jedoch

nicht in unerwartet hoher Zahl. 11 Tage nach HCV Transfektion konnten sowohl in den RLI-

transfizierten FRhK-4-Zellen als auch in den Kontrollzellen nur noch weniger als

0,5 IU HCV RNA in 50 μ l gesamt-Zellelulat detekiert werden. In den Proben der Tage 26 und

33 konnte weder in den Huh7- noch in den FRhK-4-Zellansätzen noch HCV RNA

nachgewiesen werden. Der intrazelluläre 0 h - Wert der HCV RNA lag für alle Ansätze 1,5

Logstufen über dem 3 h - Wert. Zur besseren grafischen Darstellung der niedriger

konzentrierten HCV-Zellproben ab dem 3 h – Wert, wurden die 0 h - Werte nicht in die

Abbildungen einbezogen.

Ergebnisse

88

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

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3 h

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24 h

36 h

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IU/μ

l]


B2Abbildung 45: HCV Titer in IVT- und RLI-transfizierten Zellen. Aufgetragen wurden die relativen RNA Einheiten gegen die Zeit. A: Huh7, B: FRhK-4, A1/B1: intrazellulärer HCV Titer, A2/B2: HCV Titer im Überstand

Die relativen Einheiten an RNase L-mRNA lagen sowohl für die FRhK-4- als auch für die

Huh7-Zellen über den gesamten Zeitraum der Probennahmen innerhalb der definierten

Grenzen der Genexpression (siehe Abbildung 46 und Abbildung 47). Die mit dem pl.18-

Leervektor transfizierten Huh7-Zellen zeigten nach 3 und 4 Tagen eine leicht verringerte

RNase-L Transkription mit Faktoren von 0,4 und 0,3. Die mit dem Leervektor transfizierten

FRhK-4-Kontrollzellen zeigten ein ähnliches Ergebnis 3 Stunden nach HCV-Transfektion mit

relativen Einheiten an RNase L-mRNA von 0,35. Die Verringerung der RNase L-mRNA-

Mengen hatte weder in den FRhK-4- noch in den Huh7-Zellen eine Auswirkung auf die

kontinuierliche Abnahme der HCV-Konzentration (siehe Abbildung 45). Insgesamt zeigten

Ergebnisse

89

weder die RLI-transfizierten Zellen noch die Kontrollzellen mit dem Leervektor eine

signifikante Erhöhung oder Verringerung der RNase L-Transkription.

0.0

0.2

0.4

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0.8

1.0

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Abbildung 46: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression.

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Abbildung 47: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression.

Ergebnisse

90

3.4.4. Zusammenfassung Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA

Es wurde HCV full length RNA sowie die RNA des Elongationsfaktors von Xenopus in vitro

transkribiert und in FRhK-4- bzw. Huh7-Zellen transfiziert. Die Transfektion von IVT hatte

keinen Einfluss auf die endogene Expression der RNase L oder des zellulären RNase L

Inhibitors. 24 h nach Transfektion konnte in beiden Zelllinien sowohl extrazellulär als auch

intrazellulär nur noch sehr geringe Konzentrationen an HCV RNA nachgewiesen werden. Die

Transfektion von in vitro transkribierter HCV full length RNA hatte auch in RLI-

transfizierten Zellen keinen Einfluss auf die Expressionsrate der RNase L. Die

Überexpression des RNase L Inhibitors sank von Faktoren von 140 innerhalb einer Woche auf

Faktoren von 10. Durch dreimalige Transfektion wurde die erhöhte Expression des RLI über

einen Inkubationszeitraum von 4 Wochen erhalten. Trotz erhöhter RLI-Expression konnte in

den Zellkulturüberständen von FRhK-4- und Huh7-Zellen 96 h nach Transfektion keine HCV

RNA mehr nachgewiesen werden. Intrazellulär war 11 Tage nach Transfektion keine HCV

RNA mehr im HCV RotorGene System zu detektieren. Damit scheint die Überexpression des

RNase L Inhibitors keinen Einfluss auf die Replikation der transfizierten full length HCV

RNA zu haben.

Diskussion

91

4. Diskussion

4.1. Real time PCRs

4.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI


In der vorliegenden Arbeit sollten die Expressionsraten des RLI sowie der RNase L unter den

experimentellen Bedingungen einer HCV Infektion analysiert werden. Es sollte sowohl der

Einfluss der HCV RNA auf die Expression des zellulären RLI als auch der Einfluss des

überexprimierten RLI auf die potentielle Replikation von HCV RNA untersucht werden.

Obwohl bisher keine Regulation der RNase L in der Literatur beschrieben wurde, sollte diese

ebenfalls analysiert werden. In Infektionsversuchen mit HAV in einer parallel laufenden

Arbeit zeigte die Datenlage zwischenzeitlich eine mögliche Steigerung der Expression der

RNase L. Aus diesem Grund sollte auch die Expression der RNase L unter den Bedingungen

einer HCV Infektion im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert werden.

Um die Transkriptionsraten von RNase L und RLI detektieren und auswerten zu können,

mussten die entsprechenden real time PCRs erstellt werden. Zur Messung der relativen

Genexpression mit Hilfe der real time PCR wurde zunächst eine geeignete endogene

Kontrolle ausgewählt. Die endogene Kontrolle wird, wie das zu untersuchende Gen, von der

Proben-cDNA amplifiziert. Sie wird genutzt, um die Menge der in der Reaktion eingesetzten

RNA zu standardisieren (Eurogentec, 2004). Häufig werden Housekeeping-Gene wie GAPDH

oder 18S rRNA als endogene Kontrollen verwendet. Idealerweise sollte das Kontrollgen stabil

exprimiert und nicht durch die experimentellen Bedingungen beeinflusst werden. In

verschiedenen Versuchen mit Hepatitis C Viren oder viraler RNA wurde GAPDH als

endogene Kontrolle verwendet (Kapadia et al., 2003; Uprichard et al., 2006), so dass in dieser

Arbeit real time PCRs sowohl für GAPDH als auch für 18S rRNA erstellt wurden.

Verschiedene Untersuchungen mit Tumorzelllinien oder Zellkulturen zeigten

widersprüchliche Ergebnisse mit GAPDH, während 18S rRNA sehr gute Ergebnisse lieferte

(Aerts et al., 2004). Für GAPDH wurden RNA-bindende Eigenschaften festgestellt. Es bindet

an untranslatierte RNA-Sequenzen verschiedener Viren wie beispielsweise Influenza, HAV

oder HBV (Yi et al., 2000). Die von Yi et al. nachgewiesene Interaktion von GAPDH mit

viraler RNA wurde sowohl mit den in dieser Arbeit verwendeten FRhK-4- als auch den

Diskussion

92

Huh7-Zellen gezeigt (Yi et al., 2000). Für das Hepatitis C Virus konnten bisher, auch

aufgrund fehlender Zellkultursysteme, keine Wechselwirkungen mit GAPDH belegt werden.

Um einen möglichen Einfluss von Hepatitis C Virus RNA oder HCV IVT auf GAPDH

auszuschließen, wurde für alle Versuche 18S rRNA als endogene Kontrolle zur Auswertung

der Genepression herangezogen. Lediglich in Kapitel 3.3.4 „HCV Infektion transient RLI-

transfizierter Zellen“ wurden die Expressionsraten von RNase L und RLI sowohl auf GAPDH

als auch auf 18S rRNA normalisiert. Weder die relativen Einheiten der RNase L-mRNA noch

die relativen Einheiten der RLI-mRNA zeigten durch die Normalisierungen auf GAPDH bzw.

18S rRNA signifikante Unterschiede. Bezogen auf beide Referenzgene zeigten sowohl die

FRhK-4- als auch die Huh7-Zellen nach RLI Transfektion eine deutlich erhöhte RLI-

Expression um Faktoren oberhalb von 20 (siehe Abbildung 37). Für beide Zelllinien waren

die detektieren relativen Mengen an RNase L-mRNA weder durch die Normalisierung auf

GAPDH noch auf 18S rRNA außerhalb der Grenzen der nicht regulierten Genexpression von

0,5 und 2 (siehe Abbildung 38).

Da jedoch zum Zeitpunkt der Auswertung keine HCV RNA nachgewiesen werden konnte,

kann über einen möglichen Einfluss viraler HCV RNA auf GAPDH keine Aussage getroffen

werden.

Um reproduzierbare Ergebnisse in der Auswertung der Genepressionsdaten zu generieren,

sollten die Effizienzen der real time PCRs bei nahezu 100 % liegen. Die Effizienz wird neben

dem GC-Gehalt der Amplifikate oder der Sekundärstrukturen von Primern und Sonden

maßgeblich durch die Länge der Amplifikate beeinflusst. Je kürzer das zu bildende

Amplifikat, desto höher die Effizienz der PCR. Aus diesem Grund werden für die

Quantifizierung mit dem TaqMan Amplifikatlängen von bis zu 150 bp empfohlen

(Eurogentec, 2004; Schield, 1998). Die zu amplifizierenden Genabschnitte der vorliegenden

Arbeit hatten Längen von 60 bp (RNase L) und 111 bp (RLI). Aus dem Anstieg der

Standardgeraden konnte die Effizienz der PCR berechnet werden. Alle Effizienzen der im

Rahmen dieser Arbeit erstellten real time PCRs zum Nachweis der Genepressionen betrugen

mindestens

99 % (siehe Tabelle 5). Mit Hilfe der Standardkurve erfolgte auch die Quantifizierung der

RNA. Für jede Probe wurde die Menge der enthaltenen RNA anhand dieser Standardkurve

berechnet (Eurogentec, 2004). Der Faktor von spezifischem Signal (RNase L, RLI) und

endogener Kontrolle (18S rRNA) konnte für jede Probe bestimmt und damit normalisiert

werden. Eine weitere Methode der relativen Quantifizierung ist die ΔΔct-Methode (Pfaffl,

Diskussion

93

2001). Die ct-Werte von spezifischer Probe und endogener Kontrolle werden bei dieser

Methode voneinander abgezogen. Voraussetzung dieser Auswertung ist eine gleiche Effizienz

der beteiligten PCR-Reaktion. Auch wenn die PCR-Effizienzen der real time PCRs von

RNase L, RLI, GAPDH und 18S rRNA nahezu gleich waren, wurde die

Standardkurvenmethode gewählt, um mögliche Schwankungen zwischen den einzelnen PCR-

Läufen auszuschließen. Die in dieser Arbeit erstellten und optimierten real time PCRs

lieferten sehr genaue und reproduzierbare Ergebnisse in den Messungen der zellulären

Expressionsraten von RNase L und RLI.

4.1.2. Real time PCRs zum quantitativen Nachweis der HCV RNA

Ziel der Arbeit war es, die initiale Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu

ermöglichen. Dafür sollte nicht verändertes Virus bzw. in vitro transkribierte full length RNA

zur Infektion oder Transfektion von FRhK-4- bzw. Huh7-Zellen und Zellen mit

überexprimiertem RLI eingesetzt werden. Um eine potentielle Replikation der HCV RNA zu

detektieren, war es notwenig, ein sensitives und quantitatives Nachweissystem für die

Hepatitis C Virus RNA zu entwickeln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein real

time System zum Nachweis der HCV RNA auf der Basis existierender Primer und Sonden der

Firma QIAGEN Hamburg in einem neuen Puffer- und Enzymsystem hinsichtlich Sensitivität,

Spezifität und Herstellungskosten optimiert. Die Probleme des vorangegangenen Systems mit

Qualitätsschwankungen der Reversen Transkriptase wurden durch den Einsatz von Reverser

Transkriptase eines anderen Herstellers eliminiert. Eine hohe Sensitivität des Systems war

neben dem potentiellen kommerziellen Einsatz des HCV RotorGene Nachweissystems durch

die QIAGEN Hamburg für die durchgeführten Zellkulturexperimente dieser Arbeit

entscheidend, um auch geringe Mengen replizierter RNA detektieren zu können

Mit Hilfe der Probit-Analyse wurde für das entwickelte HCV RotorGene Assay eine

Nachweisgrenze von 35 IU/ml bestimmt. Für Assays zum qualitativen Nachweis von HCV

RNA besteht die Vorgabe, Konzentrationen von 50 IU/ml oder weniger nachweisen zu

können. Ebenso muß die Detektion aller Subtypen gewährleistet sein (Chevaliez &

Pawlotsky, 2006). Sowohl der Nachweis von mindestens 50 IU/ml als auch die Detektion

aller Subtypen waren mit dem entwickelten HCV RotorGene System gegeben (siehe Kapitel

3.1.2). Die Nachweisgrenze ist von der eingesetzten Probenmenge und deren

Aufkonzentrierung durch die Aufreinigung abhängig. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit

wurde für die Aufreinigung der Zellkulturüberstände das QIAamp®Viral RNA Mini Kit

Diskussion

94

genutzt. Durch die Kooperation der Universität Bremen und der QIAGEN Hamburg GmbH

sollte eine auf QIAGEN-Produkten basierende Aufreinigung verwendet werden. Für eine

möglichst breite Einsetzbarkeit der Aufreinigung, standen die manuellen

Aufreinigungssysteme QIAamp®Viral RNA Mini Kit und QIAamp®DSP Virus Kit zur

Auswahl. Das QIAamp®DSP Virus Kit basiert auf einem Vakuum-System, was für den

Anwender einen höheren Anschaffungsaufwand bedeutet als das QIAamp®Viral RNA Mini

Kit. Für dieses Kit wird lediglich eine in allen Laboratorien vorhandene Zentrifuge benötigt.

In die Aufreinigung mit dem QIAamp®DSP Virus Kit werden im Vergleich zum

QIAamp®Viral RNA Mini Kit 500 μ l statt 140 μ l Probe eingesetzt. Da in den, für diese

Arbeit, verwendeten 24-well-Zellkulturplatten maximal 1 ml Zellkulturüberstand pro well

vorhanden war, mußte ein Aufreinigungssystem verwendet werden, das möglichst wenig

Zellkulturmaterial verbraucht. Die Auswertung der Proben sollte in Doppelbestimmung

möglich sein, und bei einer potentiellen HCV Replikation sollte eine Reinfektion mit den

Zellkulturüberständen erfolgen. Aus diesen Gründen wurde das QIAamp®Viral RNA Mini

Kit für die Aufreinigung der Zellkulturüberstände verwendet. Es wurden 140 μ l

Zellkulturüberstand in die Aufreinigung eingesetzt und in einem Volumen von 50 μ l eluiert.

Das entsprach einem Aufkonzentrierungsfaktor von 3. Von diesem Eluat wurden 10 μ l, d.h.

ein fünftel in die PCR eingesetzt. Für einen möglichen Einsatz des HCV RotorGene System

zum Monitoring von HCV Therapien, könnte die Sensitivität durch Änderung der

Aufreinigung (QIAamp®DSP Virus Kit oder Aufreinigungsroboter) mit stärkerer

Aufkonzentrierung der Proben gesteigert werden. Für die Auswertung der Versuche der

voliegenden Arbeit war die erzielte Nachweisgrenze von 35 IU/ml jedoch hervorragend

geeignet, da eine Replikation des Virus eine Erhöhung der RNA-Konzentration zur Folge

gehabt hätte. Eine gesteigerte Sensitivität des Assays hätte lediglich den Zeitpunkt

verschoben, an dem die HCV RNA in den durchgeführten Versuchen nicht mehr nachweisbar

gewesen wäre. Da im Falle einer potentiellen Replikation des Viruses nur sehr geringe

Mengen replizierter RNA erwartet wurde, hätten niedrigere Sensitivitäten des HCV

RotorGene Systems zu falschen Versuchsergebnissen führen können. Um eine Zunahme der

RNA detektieren zu können war ein quantitatives Assay notwendig. Durch den Nachweis der

HCV RNA mittels konventioneller PCR und anschließender Geldokumentation wäre eine

quantitative Analyse der RNA nicht möglich gewesen. Die Erstellung und Optimierung eines

spezifischen, sensitiven und quantitativen HCV Nachweissystem war somit Voraussetzung

für die Auswertung der HCV Infektions- und Transfektionsversuche der vorliegenden Arbeit.

Diskussion

95

4.2. RNase L Inhibitor

4.2.1. Isolation und Analyse des RLI aus FRhK-4- und humaner gesamt-Zell-RNA

Das in dieser Arbeit aus FRhK-4- und humaner gesamt-Zell-RNA isolierte und full length

amplifizierte RLI-Gen wurde sequenziert und mit der Referenzsequenz Accesion nr. X74987

verglichen (siehe Abbildung 22). Es wurden Unterschiede innerhalb der Basensequenz des

RLI in den Bereichen von 520 bp bis 540 bp und 1412 bp bis 1422 bp nachgewiesen, welche

Veränderungen der Aminosäuresequenz zur Folge haben. Das Referenzplasmid (Bisbal et al.,

1995), auf welchem die veröffentlichte RLI-Sequenz beruht, wurde daraufhin ebenfalls

sequenziert und zeigte analoge Ergebnisse zu den Sequenzen des isolierten und full length

amplifizierten RNase L Inhibitors. Die unter NCBI angegebene Referenzsequenz X74987

entstand höchstwahrscheinlich durch Sequenzierfehler. Bei 521 bp fehlt in der

Referenzsequenz ein Adenin, wodurch sich die folgenden Basen verschieben. Bei 538 bp ist

dagegen ein Guanin zu viel, wodurch die Sequenzen von Referenzplasmid und full length

Amplifikat des RLI anschließend wieder übereinstimmten. Zwischen 1412 bp und 1422 bp

sind jeweils die Basen Guanin und Cytosin vertauscht, was ebenfalls auf einen Fehler in der

Auswertung der Sequenzierung von Bisbal et al. (1995) schließen lässt. Da alle Ergebnisse

durch Sequenzierung überlappender Abschnitte bestätigt wurden, sind Fehler in den

Sequenzdaten der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen. 1996 führten Aubry et al. Versuche

zur chromosomalen Lokalisation das RLI durch (Aubry et al., 1996). Im Rahmen dieser

Arbeit wurden die Sequenzunterschiede, welche in der vorliegenden Arbeit zum Referenz-

RLI festgestellt wurden, ebenfalls detektiert. Eine Aktualisierung der Sequenz in der

Datenbank ist jedoch nicht erfolgt. Die Sequenzierung der RLI-Referenzsequenz X74987

wurde 1995 nach der Didesoxymethode (Sanger et al., 1977) mit Hilfe des T7 Sequencing

Kits der Firma Pharmacia durchgeführt. Auch Aubry et al. verwendeten das T7 Sequencing

Kit. Die Sequenzunterschiede der Ergebnisse von Bisbal et al. (1995) und Aubry et al. (1996)

weisen auf eine Anfälligkeit der Sequenzierergebnisse mit diesem Kit hin. Nach Auftrennung

der DNA-Fragmente im Polyacrylamidgel erfolgte die Auswertung der Radioaktivität mittels

Audioradiographie (Amersham-Pharmacia, 1994). Heute existieren optimiertere Methoden

zur Sequenzierung. Neben der radioaktiven Markierung der DNA-Fragmente werden mit

Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleotidtriphosphate eingesetzt, wodurch der

Umgang mit Radioisotopen entfällt. Die gelelektrophoretischen Auftrennungen wurden

Diskussion

96

optimiert und in ihrer Auflösung deutlich verbessert. Die Sequenzierungen der vorliegenden

Arbeit wurden von Dr. H. Schmidt vom DNA-Cloning-Service durchgeführt. PCR-

Amplifikate des RLI wurden zunächst mit den Restriktionsenzymen Exonuklease I und

Shrimp-Alkaline-Phosphatase (Exo/SAP) verdaut, um Primer- und dNTPs zu beseitigen.

Anschließend erfolgte die Sequenzierung ebenfalls nach der Sanger-Methode mit dem

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit der Firma Applied Biosystems. Mit dem

3100 Genetic Analyzer von ABI wurden die DNA-Fragmente aufgetrennt und detektiert. Der

3100 Genetic Analyzer ist ein automatisches Kapillarelektrophorese-System, in dem bis zu 16

Kapillaren analysiert und detektiert werden können. Die Fluoreszenz der markierten

Fragmente wird durch eine CCD Kamera aufgenommen, zum Computer übertragen und von

diesem mit Hilfe der Sequenzier-Software ausgewertet (ABI, 2001). Es ist davon auszugehen,

dass die in der vorliegenden Arbeit verwendete optimierte Sequenziermethode im Vergleich

zu den früher verwendeten Verfahren genauer ist. Die vorliegenden Ergebnisse werden neben

reproduzierten Sequenzdaten durch die Arbeit von Aubry et al. (1996) bestätigt. Eine

Revision der in der Datenbank NCBI angegeben Sequenz des RNase L Inhibitors wäre daher

anzustreben. Die Aminosäuresequenzen der in der vorliegenden Arbeit isolierten RLI-Gene

aus Rhesusaffe und Mensch zeigten keinerlei Unterschiede. Einzelne Basenaustausche hatten

keine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz der entsprechenden RLI-Proteine. Es ist nicht

auszuschließen, dass einzelne Basenaustausche im Rahmen der Klonierung oder

Sequenzierung eingebaut wurden. Aufgrund der gleichen Aminosäuresequenz wird das

humane RLI auch in Affenzellen aktiv sein und das FRhK-4-RLI auch in humanen Zellen

wirken.

4.2.2. stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in Huh7- und FRhK-4-Zellen

Um einen möglichen Einfluss des RNase L Inhibitors auf die experimentelle zelluläre

Infektion mit dem Hepatitis C Virus zu testen, sollte der Inhibitor stabil transfiziert werden.

Wie in Kapitel 3.2.6 „Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen“

dargestellt, konnte der RNase L Inhibitor nicht in konstantem Maße und dauerhaft

überexprimiert werden. 8 Wochen nach Transfektion konnten nur noch in 4 von 6 selektierten

FRhK-4-RLI-Klonen erhöhte relative Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von 4 bis 8

nachgewiesen werden (siehe Abbildung 28). Die Kinetik von zwei ausgewählten RLI-Klonen

(Klon 4 und Klon 5) zeigte deutliche Transkriptionsunterschiede des RNase L Inhibitors im

Versuchszeitraum von 14 Tagen. Innerhalb dieser Inkubationszeit wurden relative Mengen an

Diskussion

97

RLI-mRNA um Faktoren von 2 bis zu Faktoren von 10 detektiert (siehe Abbildung 30). Eine

stabile und konstante Überexpression des RLI konnte nicht erreicht werden. Für die Huh7-

Zellen war eine Selektion potentieller RLI-Klonen nicht möglich, da die Zellen bei dem sehr

hohen Umsetzungsverhältnis im Rahmen der Klonselektion ihr Wachstum eingestellt haben.

Möglicherweise wäre eine schrittweise Selektion mit kleineren Umsetzungsverhältnissen

erfolgversprechender gewesen. In Huh7-RLI-Mischklonen konnte jedoch bereits nach kurzer

Zeit keine RLI-Überexpression mehr nachgewiesen werden.

Ob die Zellen das Gen eliminieren oder überexprimierende Zellen frühzeitig absterben ist

völlig unklar. Eine möglicherweise letale Wirkung gesteigerter Mengen an RLI-Protein kann

nicht beurteilt werden. Ob die Verwendung von pcDNA3.1/V5-His_RLI wegen seiner

geringeren Überexpressionsraten für eine stabile Transfektion gegenüber pl.18_RLI günstiger

gewesen wäre, ist nicht auszuschließen. Potentiell letal wirkende hohe Mengen an RLI-

Protein hätten durch die geringen Transkriptionsraten der pcDNA3.1/V5-His_RLI Plasmide

mit maximalen relativen Einheiten an RLI-mRNA um Faktoren von 6 möglicherweise

unterschritten werden können. Jedoch wurde bereits 1999 im Rahmen einer Diplomarbeit

schon einmal versucht, FRhK-4-Zellen stabil mit dem pcDNA3/RLI 3’ zu transfizieren

(Gotter, 1999). Die dadurch gewonnenen FRhK-4-6er Klone zeichneten sich in HAV

Infektionsexperimenten durch eine stärkere Replikation des HAV aus, wodurch von einer

Überexpression des RLI ausgegangen wurde. Ein Nachweis der RLI-Transkription auf

Genexpressionsebene ist nicht erfolgt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die FRhK-

4-6er Klon-Zellen auf ihre RLI-Transkriptionsrate getestet und zeigten keine erhöhten

Mengen relativer Einheiten an RLI-mRNA (siehe Abbildung 31). Diese Ergebnisse

unterstützen die Vermutung, dass auch bei dem Versuch einer stabilen Überexpression des

RLI mit pcDNA3.1/V5-His_RLI keine dauerhaft stabilen Transfektanten gewonnen werden

können.

In der Literatur gibt es keine Daten zur Überexpression des RNase L Inhibitors in FRhK-4-

oder Huh7-Zellen. Generell gibt es nur sehr wenig Arbeiten mit Bezug zum RNase L

Inhibitor. Diese wenigen Arbeiten wurden fast ausschließlich mit Hela-Zellen (Epithelzellen

aus Gebärmutterhalskrebs) durchgeführt (Bisbal et al., 1995; Martinand et al., 1998).

Ausnahme bilden zwei Arbeiten, in denen H9- (humane T Lymphozytenzellen) bzw. Daudi-

Zellen (Burkitt-Lymphomzellen) verwendet wurden (Bisbal et al., 2001; Martinand et al.,

1999). In diesen Arbeiten wurde die Überexpression des RLI zwar benannt, jedoch nicht mit

Daten belegt. Auch ist in den Arbeiten häufig unklar, ob für die Versuche stabil transfizierte

Zellen verwendet wurden oder eine transiente Transfektion durchgeführt wurde. Fehlende

Diskussion

98

Angaben über die Herkunft der verwendeten stabil transfizierten RLI-Klone in den

verschiedenen Arbeiten lassen mutmaßen, dass die stabil transfizierten Zellen für jede Arbeit

neu hergestellt wurden. Dies wäre ein Hinweis auf eine nicht mögliche, dauerhafte

Überexpression des RNase L Inhibitors. Aus diesen Gründen wurden für die Versuche der

vorliegenden Arbeit transiente RLI-Transfektionen durchgeführt. Mit Hilfe der transienten

RLI-Transfektion konnte die Überexpression des RNase L Inhibitors für mindestens 5 Tage

mit erhöhten relativen Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von mindestens 10 sichergestellt

werden (siehe Abbildung 26). Durch Mehrfachtransfektion konnte die Dauer der RLI

Überexpression über einen beliebig langen Inkubationszeitraum verlängert werden.

4.3. HCV Infektion und Transfektion von HCV full length RNA in RLI-transfizierte

Zellen

Ziel der HCV Infektions- und Transfektionsversuche der vorliegenden Arbeit war es, mit

Hilfe der Überexpression des RLI die RNase L auszuschalten und dadurch eine initiale

Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die

eingesetzte virale RNA nicht zu verändern. Das Passagieren geringer Mengen an

Virusnachkommen sollte eine Anpassung der Viren an die Zellkultur bewirken.

Der gewählte Versuchsansatz, durch Überexpression des RLI die RNase L auszuschalten und

dadurch eine initiale Replikation des HCV zu ermöglichen, soll kurz erläutert werden. Dazu

werden bekannte inhibitorische Effekte des Hepatitis C Virus auf zelluläre antivirale

Abwehrmechanismen in die Betrachtung einbezogen.

Cheng et al. vermuten, dass das Hepatitis C Virus den antiviralen Signalweg nach dessen

Aktivierung blockiert (Cheng et al., 2006). Die Transfektion von polyIC in JFH-1 infizierten

Zellen hat gezeigt, dass Hepatitis C Viren die Aktivierung von IRF-3 (interferon regulated

factor 3) durch dsRNA blockieren. Auch Foy et al. zeigten in ihrer Arbeit, dass die viralen

Proteine NS3/4A die intrazelluläre virale Antwort unterbrechen, welche die IFN β-Expression

induzieren (Foy et al., 2005). Die Blockade der Interferon-Produktion verhindert somit die

Induktion der Oligoadenylatsynthetase-Expression (siehe Abbildung 48). Ebenfalls wurde

bereits 2000 die Fähigkeit des Hepatitis C Virus beschrieben, durch Bindung des NS5A-

Proteins an die Proteinkinase R dessen Aktivierung zu verhindern (Francois et al., 2000).

Auch das E2-Protein blockiert die Kinase Aktivität der PKR und dadurch deren hemmenden

Effekt auf die Proteinsynthese (Taylor et al., 1999). Durch das Verhindern der Induktion der

Oligoadenylatsynthetase und durch die Inaktivierung der PKR werden sowohl das

Diskussion

99

2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System als auch die PKR als Interferon-induzierte antivirale

Signalweges durch das Hepatitis C Virus unterwandert (siehe Abbildung 48). In klinischen

Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitis C Patienten wurde eine signifikante

Reduktion der Expression des RNase L Inhibitors festgestellt (Yu et al., 2000). Es könnte

daher eventuell ein Einfluss des RLI oder der RNase L auf die HCV Infektion vorliegen.

Möglicherweise führt eine Reduktion des RLI durch die Replikation des Hepatitis C Virus zu

einer Aktivität der RNase L. Ein Gleichgewicht zwischen Virusreplikation und RNase L-

Aktivität könnte möglicherweise zur Ausbildung der chronischen Hepatitis führen. Ob die

Expression der latent vorliegenden RNase L oder des zellulären RLI durch das Hepatitis C

Virus bei der experimentellen Infektion von FRhK-4- und Huh7-Zellen beeinflusst werden,

wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. Eine potentielle Aktivierung der RNase

L wurde durch die Überexpression des RLI verhindert.

Abbildung 48: schematische Darstellung der zellulären viralen Abwehr mit Angriffsstellen des Hepatitis C Virus

Man muss bedenken, dass alle Erkenntnisse über die Interaktion der HCV-Proteine auf

Versuchen mit Replikonsystemen oder dem HCV Stamm JFH-1 beruhen. Ohne adaptive

Diskussion

100

Mutationen der HCV-Replikons an die Bedingungen der verwendeten Zellen war eine

Replikation nicht möglich (Bartenschlager et al., 2003). Diese adaptiven Mutationen sowie

die Unterschiede von JFH-1 in 5’UTR, Core-Protein und verschiedenen Nicht-

Strukturproteinen zu allen bekannten HCV Sequenzen spiegeln deshalb nicht zwangsläufig

die zelluläre Replikation des Hepatitis C Virus wider. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit

wurde daher unabhängig von Adaptionen oder dem besonders virulenten HCV-Stamm JFH-1

ein möglicher Einfluss der HCV Infektion auf die zellulären antiviralen Signalwege

analysiert. In klinischen Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitispatienten

wurden sowohl auf mRNA-Ebene als auch immunohistochemisch erhöhte Expressionen der

Proteinkinase R festgestellt (Shimada et al., 1998; Yu et al., 2000). Die Ergebnisse einer

gesteigerten aktiven PKR widersprechen der experimentell festgestellten Fähigkeit des

Hepatitis C Virus, die Proteinkinase R zu inhibieren (Francois et al., 2000; Taylor et al.,

1999). Yu et al. beobachteten weiterhin eine signifikante Reduktion der RLI-mRNA, jedoch

keine Veränderung des RNase L-Expressionsmusters (Yu et al., 2000). Keiner der

Studienpatienten erhielt eine zusätzliche Interferontherapie, so dass Expressionsunterschiede

zu Leberbiopsieproben gesunder Personen aufgrund der Gabe von Interferon ausgeschlossen

werden können. Die manuelle Zugabe von Interferon erhöht innerhalb der Zellen deutlich den

Anteil an 2’-5’Oligoadenylaten. Auf der dadurch gesteigerten Aktivität der RNase L und der

anschließenden Spaltung viraler RNA beruht der Erfolg der Interferonbehandlung zahlreicher

Virusinfektionen (Williams et al., 1979). Für HCV Infektionen wird angenommen, dass der

Erfolg der Interferontherapie direkt mit der Fähigkeit der Spaltung von HCV RNA durch die

RNase L korreliert (Han & Barton, 2002). Einige HCV Typen wie beispielsweise Subtyp 1a

zeigen sich gegenüber Interferon weniger sensitiv als andere HCV Subtypen. Wie jedoch in

der Arbeit von Han und Barton gezeigt werden konnte, werden die RNAs aller HCV

Subtypen effektiv durch die RNase L gespalten (Han & Barton, 2002). Die Ausschaltung der

RNase L-Aktivität mit Hilfe der Überexpression des RLI stellt daher einen Versuch dar, die

Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen.

Um die Ergebnisse der HCV RNA-Bestimmung infizierter Zellen nach verschiedenen

Inkubationszeiten beurteilen zu können, wurde zunächst die Stabilität von Hepatitis C Virus

RNA im Viruskapsid bestimmt. Dieser Versuch diente dazu, abschätzen zu können, wie lange

Hepatitis C Virus RNA des Inokulums nachgewiesen werden kann. Die Nachweisgrenze von

35 IU/ml wurde bereits 18 Tage nach Versuchsbeginn erreicht. In den nachfolgenden

Probennahmen konnte die HCV RNA nicht mehr reproduzierbar detektiert werden. In

Diskussion

101

Zellkulturmedium und unter Brutschrankbedingungen, jedoch ohne den Einfluss zellulärer

Enzyme, konnte bis zu maximal 30 Tagen nach Versuchsbeginn in einzelnen Proben HCV

RNA detektiert werden. Nach 30 Tagen Inkubationszeit waren alle Proben im HCV

RotorGene System negativ (siehe 3.3.2). Gegen ubiquitär vorkommende RNasen ist die HCV

RNA durch die virale Hülle relativ geschützt, während zelluläre RNasen in diesem

Versuchsansatz keine Rolle spielten. Für die HCV Infektionsversuche wird aufgrund

vorhandener zellulärer RNasen angenommen, dass die zeitliche Nachweisgrenze der

Inokulum-RNA deutlich unter 30 Tagen liegt. Reproduzierbare positive Ergebnisse für HCV

Inokulum-RNA sollten sogar unter 18 Tagen liegen. Auch durch das Waschen der Zellen

nach Infektion und durch Mediumwechsel werden die Mengen an Inokulum-RNA weiter

deutlich herabgesetzt. Dadurch wird der Zeitraum der Detektierbarkeit von Inokulum-RNA

stark reduziert. Es ist daher davon auszugehen, dass ab 30 Tagen nach Infektion mit sehr

hoher Wahrscheinlichkeit keine Inokulum-RNA mehr nachgewiesen werden kann. Durch die

Erstellung eines sensitiven und quantitativen Nachweises für HCV RNA im Rahmen der

vorliegenden Arbeit ist bei einem Anstieg der HCV RNA Konzentrationen in den

Zellkulturproben mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer Replikation auszugehen.

Alle bisherigen Versuche, natürliche HCV Isolate verschiedener Subtypen in Zellkultur

anzuzüchten, verliefen erfolglos (Ausnahme JFH-1). Die effiziente Replikation des Hepatitis

C Virus gelang bis heute nur in Huh7-Zellen und nur mit Replikonsystemen oder mit dem

hochinfektösen HCV Stamm JFH-1 (Bartenschlager et al., 2003; Kato et al., 2001). Die

Infektionsversuche der vorliegenden Arbeit wurden parallel mit FRhK-4- und Huh7-Zellen

durchgeführt. Huh7-Zellen stellen als Vertreter der humanen Leberzellen die natürlichen

Wirtszellen des Hepatitis C Virus dar. Für Klone von FRhK-4-Zellen konnte im Rahmen

einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein gesteigertes HAV Wachstum gezeigt werden

(Gotter, 1999). Aus diesem Grund wurden die FRhK-4-Zellen parallel zu den Huh7-Zellen

verwendet.

Bartenschlager et al. vermuten die besondere Eignung der Huh7-Zellen für HCV-

Replikationen in einem Defekt der Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren und die

dsRNA-abhängigen antiviralen Signalwege zu aktivieren (Bartenschlager et al., 2003).

Allerdings wurde die Fähigkeit der Huh7-Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren,

durch Cheng et al. mit Hilfe von polyIC (synthetischer dsRNA) gezeigt (Cheng et al., 2006).

16 Stunden nach Transfektion von polyIC war die Interferon-β Expression induziert. Auch die

Diskussion

102

Versuche von Lanford et al. mit Huh7-Zellen weisen zwar auf einen Defekt der Zellen in

einigen Teilen des Signalweges für dsRNA hin, diese beeinflussen jedoch nicht die Reaktion

auf Interferon α oder Interferon γ (Lanford et al., 2003). Ob der nicht genauer beschriebene

Defekt einen Einfluss auf die Replikationsfähigkeit von JFH-1 oder HCV-Replikons besitzt

ist nicht bekannt.

Doppelsträngige RNA aktiviert als Kofaktor die Oligoadenylatsynthetase. Gesteigerte

Interferon β-Expression und ein aktiviertes Oligoadenylatsynthetase-System führen zur

Aktivierung der RNase L. Eine Regulation der RNase L-Expression wurde in der Literatur

bisher nicht beschrieben. In HAV Infektionsversuchen einer parallel verlaufenden

Doktorarbeit sah die Datenlage zwischenzeitlich jedoch so aus, als ob eine gesteigerte

Expression der RNase L durch HAV erfolgen würde. Aus diesem Grund wurde die

Expression der RNase L während der Infektionsversuche mit HCV ebenfalls analysiert. Eine

Regulation der RNaseL-mRNA-Mengen durch das Hepatitis C Virus konnte nicht festgestellt

werden (siehe Abbildung 38). Man muß jedoch beachten, dass die Analyse der mRNA der

RNase L erst 4 Wochen nach der HCV Infektion erfolgt ist. Um alle potentiell HCV

infizierten Zellen über einen möglichst langen Zeitraum mit überexprimiertem RLI zu

kultivieren, wurden während des Versuches keine Zellen zur Analyse der mRNA-Menge von

RNase L bzw. RLI abgenommen. Aus diesem Grund könnte eine potentiell erhöhte

Expression der RNase L zu Beginn der Inkubationszeit bereits wieder abgeklungen sein. Da

jedoch keine HCV Replikation in den infizierten Zellen stattgefunden hat, kann über einen

potentiellen Einfluss des Hepatitis C Virus auf die Expression der RNase L keine Aussage

getroffen werden.

Zu den FRhK-4-Zellen ist bekannt, dass sie nicht auf Interferon reagieren. Trotz Anwesenheit

des von ihnen produzierten Interferons bleiben diese Zellen permissiv für eine VSV Infektion,

was auf eine Blockade innerhalb der Interferon-Signaltransduktion hindeutet (Brack, 1999).

Oligoadenylatsynthetase und RNase L werden jedoch konstitutiv in diesen Zellen exprimiert

(Brack, 1999). In den HCV Infektionsversuchen der vorliegenden Arbeit konnte auch für die

FRhK-4-Zellen keine Regulation der RNase L-Expression festgestellt werden. Die relativen

Einheiten der RNase L-mRNA der stabil RLI-transfizierten FRhK-4-Klone 4 und 5 sowie der

transient RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen lagen innerhalb der Grenzen nicht regulierter

Genexpression (siehe Abbildung 36 und Abbildung 38). Auch die Analyse der RNase L-

Expression in transient RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen erfolgte erst 4 Wochen nach

Infektion. Aus diesem Grund könnte wie bereits für die Huh7-Zellen beschrieben eine

potentiell erhöhte Expression der RNase L zu Beginn der Inkubationszeit bereits wieder

Diskussion

103

abgeklungen sein. Da auch in den FRhK-4 Zellen keine HCV Replikation erfolgt ist, kann

über einen möglichen Einfluss des Hepatitis C Virus auf die Expression der RNase L auch in

diesem Fall keine Aussage getroffen werden.

Sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-Zellen kann latent vorhandene RNase L durch

doppelsträngige RNA während der HCV Infektion aktiviert werden. Diese Aktivierung ist

mittels real time PCR nicht messbar. Versuche, die RNase L im Western-Blot nachzuweisen

scheiterten an vermutlich viel zu geringen Konzentrationen an RNase L-Protein in den

Versuchsansätzen. Die Überexpression des RLI hatte weder in den FRhK-4- noch in den Huh-

Zellen einen positiven Einfluss auf eine potentielle Replikation des Hepatitis C Virus. In

transient RLI-transfizierten Zellen ergab die Analyse der RLI-mRNA 4 Wochen nach HCV

Infektion noch ein Erhöhung um Faktoren von über 30 für Huh7- und FRhK-4-Zellen (siehe

Abbildung 37). Weder intrazellulär noch extrazellulär konnte jedoch HCV RNA

nachgewiesen werden. Es ist daher davon auszugehen, dass das

2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System mit dem Effektorenzym RNase L höchstwahrscheinlich

keinen Einfluss auf die experimentelle HCV Infektion in Huh7- bzw. FRhK-4-Zellen ausübt.

Im Rahmen der Infektionsversuche stellt der Viruseintritt in die Zellen einen wichtigen

Aspekt dar. Der CD81-Rezeptor wird mit dem Eintritt des Hepatitis C Virus in die

Leberzellen in Verbindung gebracht (Bartosch et al., 2003; Pileri et al., 1998). Es ist bekannt,

dass Antikörper gegen CD81 die HCV Infektion in Huh7-Zellen hemmen (Zhong et al.,

2005), d.h. die Huh7-Zellen den CD81-Rezeptor exprimieren. In der Literatur gibt es jedoch

keine Angaben über das Vorhandensein des CD81-Rezeptors in FRhK-4-Zellen. Es ist daher

möglich, dass diese Zellen den Rezeptor nicht besitzen und bei den Infektionsversuchen kein

Viruseintritt in die Zellen erfolgt ist. Trotz Expression des CD81 in Huh7-Zellen kann auch

für die Infektionsversuche dieser Zellen nicht davon ausgegangen werden, dass die Aufnahme

des Hepatitis C Virus in die Zellen erfolgt ist. Aus diesen Gründen wurde der Viruseintritt

umgangen und HCV full length RNA in die Zellen transfiziert. Dadurch wurde sichergestellt,

dass die HCV RNA in das Zytoplasma der Zellen gelangt. Ein möglicher Einfluss der

Transfektion von RNA in vitro Transkript auf die Expression von RNase L und zellulärem

RLI wurde durch die Transfektion von in vitro transkribierter RNA des Elongationsfaktors II

von Xenopus ausgeschlossen. Weder die Transfektion von HCV IVT noch von Xenopus IVT

führten zu einer erhöhten Expression der RNase L in FRhK-4- oder Huh7-Zellen (siehe

Abbildung 40). Die Expression des zellulären RLI wurde durch die Transfektion von IVT

ebenfalls nicht beeinflusst. In einem Inkubationszeitraum von 24 Stunden nach Transfektion

Diskussion

104

lagen die relativen Mengen an RLI-mRNA sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-

Zellen innerhalb der Grenzen nicht regulierter Genexpression (siehe Abbildung 42). Die

Expression der RNase L wurde auch durch die Transfektion von HCV IVT in transient RLI-

transfizierte FRhK-4- oder Huh7-Zellen nicht reguliert (siehe Abbildung 46 und Abbildung

47). Die relativen Mengen an RLI-mRNA waren aufgrund der transienten RLI-Transfektion

bis zu 26 Tagen nach HCV Transfektion um Faktoren von mindestens 5 erhöht. Zum

Zeitpunkt der HCV Transfektion waren die relativen mRNA-Einheiten des RLI sogar um

Faktoren von 140 (FRhK-4-Zellen) bzw. 180 (Huh7-Zellen) erhöht (siehe Abbildung 43 und

Abbildung 44). 26 Tage nach HCV Transfektion konnte jedoch weder für die FRhK-4- noch

für die Huh7-Zellen intrazellulär oder extrazellulär HCV RNA nachgewiesen werden (siehe

Abbildung 45). Die Überexpression des RLI hatte daher keinen positiven Effekt auf die

potentielle HCV Replikation. Eine Replikation der HCV RNA ist offensichtlich nicht erfolgt.

Ob die in vitro transkribierte HCV RNA möglicherweise bereits vor der Transfektion

abgebaut wurde, ist nicht bekannt. Ohne Proteinhülle sind die „nackt“ vorliegenden in vitro

Transkripte gegenüber RNasen sehr ungeschützt. Die Stabilität von RNA ist von der Länge

des polyA-Anhangs oder besonderer Sequenzen in der 3’-UTR abhängig (Alberts et al.,

1995). Durch das Einfrieren und Auftauen könnte der polyA-Anhang der IVTs bereits

verkürzt oder abgebaut und dadurch die Stabilität der RNA stark beeinträchtigt worden sein.

Eine Stabilitätsbestimmung der in vitro transkribierten RNA ist im Rahmen der vorliegenden

Arbeit nicht durchgeführt worden. Da im HCV RotorGene System lediglich ein kurzer

Genabschnitt der 5’-UTR amplifiziert wird, ist eine Aussage über die Länge oder Qualität der

Ausgangs-RNA nicht möglich. In vitro transkribierte RNA besitzt jedoch eine hohe

Empfindlichkeit gegenüber ubiquitär vorkommenden RNasen. Auch wenn das

Transfektionsreagenz einen Schutz vor RNasen bieten sollte, ist ein Abbau der RNA während

der 20minütigen Inkubation von IVT und Transfektionsreagenz nicht auszuschließen.

Intrazellulär wäre der Abbau des IVTs durch latent vorliegende unnd möglicherweise aktive

RNase L zu erklären. Eine Aktivierung der RNase L wurde jedoch durch die Überexpression

des RLI ausgeschlossen. In der Arbeit von Han und Barton wurde ausserdem eine minimale

HCV RNA Konzentration von 20nM zur Aktivierung der Oligoadenylatsynthetase und RNase

L bestimmt. Geringere RNA Mengen waren innerhalb des Versuchsaufbaus stabil. Größere

Mengen an RNA führen zur schnellen und effektiven Spaltung durch die RNase L (Han &

Barton, 2002). Die in dieser Arbeit für die Transfektion eingesetzten 250 ng IVT entsprechen

einer Konzentration von ca. 8 nM. Diese Konzentration liegt deutlich unter der von Han und

Barton bestimmten minimalen Aktivierungkonzentration von 20nM, so dass eine Aktivierung

Diskussion

105

der RNase L durch das IVT nicht erfolgt sein sollte. Die Abnahme der in vitro transkribierten

RNA-Konzentration ist in diesem Falle auf ubiquitär vorkommende RNasen und nicht auf

eine Aktivierung der RNase L zurückzuführen. Eine Aktivierung der RNase L wäre erst bei

einer erhöhten RNA Menge nach einer Replikation der HCV RNA erfolgt. In diesem Fall

hätte die Überexpression des RNase L Inhibitors dieser Aktivierung jedoch entgegengewirkt

und eine weitere Replikation der HCV RNA ermöglicht. Da keine Replikation des Hepatitis C

Virus in Zellkultur erfolgt ist, ist eine Aktivierung der RNase L durch HCV RNA sehr

unwahrscheinlich. Die Überexpression des RLI hatte auf die potentielle Replikation der HCV

RNA keinen positiven Einfluss.

Es ist weiterhin nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob die transfizierte RNA

innerhalb der Zelle translatiert wurde. Wie in Kapitel 1.1.9 „Hepatitis C Virus in Zellkultur“

beschrieben, existieren derzeitig keine Zellkultursysteme zur Anzucht des Hepatitis C Virus

aus Patientenmaterial oder full length RNA (Sonderfall JFH-1 mit deutlichen

Sequenzunterschieden zu den bekannten Hepatitis C Viren in fast allen Nicht-

Strukturproteinen). Replikationen sind bisher lediglich auf der Basis von Replikonsystemen

möglich (Lohmann et al., 1999). Alle diese Replikonsysteme enthalten eine zusätzliche

internal ribosomal entry side des Enzephalomyokarditis Virus (EMCV-IRES). Diese

zusätzlich eingebrachte IRES ermöglicht die Translation der nachfolgenden Sequenzen der

HCV Nicht-Strukturproteine (siehe Abbildung 49). Möglicherweise erfolgt die HCV-IRES-

induzierte Translation der HCV RNA in geringerem Maße als durch die EMCV-IRES. Eine

potentielle sehr geringe Replikation wäre in diesem Falle nicht detektiert worden.

Möglicherweise wurde für den Fall einer sehr schwachen Translation durch die HCV-IRES

auch zu wenig RNA transfiziert, um die sehr geringen Mengen HCV RNA einer potentiellen

Replikation zu detektieren.

Diskussion

106

Abbildung 49: schematische Darstellung von genomischer HCV RNA und subgenomischer Replikon RNA (Uprichard et al., 2006). Im Gegensatz zum full length Replikon enthält das subgenomische Replikon lediglich die Core-Sequenz der HCV IRES, nicht jedoch die Sequenzen für die Strukturproteine.

In möglicherweise folgenden Versuchen sollte die Transfektion mit größeren Mengen viraler

RNA durchgeführt werden. Geringe Mengen transfizierter RNA führen eventuell dazu, dass

die sehr kleinen Mengen replizierter HCV RNA nicht detektiert werden. Potentiell aktivierte

RNase L kann durch die Überexpression des RLI gehemmt werden. Aufgrund der Ergebnisse

der vorliegenden Arbeit ist ein Einfluss des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-Systems mit dem

Effektorenzym RNase L auf die experimentelle HCV Infektion sehr unwahrscheinlich.

Ausserdem ist anzuraten, die Transfektions- und Infektionsversuche in weiteren Zelllinien

durchzuführen. Möglicherweise könnte die stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in

anderen Zelllinien erfolgversprechender verlaufen. Da ein Einfluss der RNase L und ihrer

Ausschaltung aufgrund gesteigerter RLI-Expression auf die experimentelle HCV Infektion

sehr unwahrscheinlich ist, sollte ein Schwerpunkt folgender Arbeiten möglicherweise auf die

Betrachtung der Proteinkinase R gerichtet werden. Unterschiedliche Erkenntnisse aus in vivo

(Shimada et al., 1998; Yu et al., 2000) und in vitro Studien (Francois et al., 2000; Taylor et

al., 1999) geben möglicherweise einen Anlass, die Proteinkinase R unter den experimentellen

Bedingungen der HCV Infektion detaillierter zu analysieren.

Zusammenfassung

107

5. Zusammenfassung

Das Hepatitis C Virus ist weltweit verbreitet, wobei ca 3 % der Bevölkerung chronisch mit

dem Virus infiziert sind. Nach Schätzungen des CDC entwickeln 20 – 50 % der chronisch

infizierten Hepatitis C Patienten eine Leberzirrhose. Aus der Leberzirrhose entwickeln sich

wiederum in 25 % der Fälle ein Leberzellkarzinom oder ein Leberversagen. Patienten einer

akuten Hepatitis C haben gute Heilungschancen ohne zusätzliche Behandlung, während

Patienten mit einer chronischen Hepatitis heute mit einer Kombinationstherapie aus

pegyliertem Interferon und Ribavirin behandelt werden. Diese Behandlung erreicht

langanhaltende Therapieerfolgsraten von bis zu 60 %. Standardisierte Therapiemethoden oder

Erfolgsgarantien der Therapie für Patienten mit Hepatitis C existieren nicht.

Das Hauptproblem der Erforschung des Hepatitis C Virus liegt bis heute in einem fehlenden

Zellkulturmodell. Bisher ist es nicht gelungen, natürliche Isolate aller Hepatitis C Subtypen in

Zellkultur anzuziehen. Effektive Replikationen des Hepatitis C Virus gelangen bisher nur mit

HCV Replikonsystemen oder dem hochinfektiösen Virustyp JFH-1. Alle existierenden HCV

Replikons enthalten jedoch adaptive Mutationen in fast allen Nicht-Strukturproteinen. Und

auch JFH-1 weist zu allen bekannten HCV Subtyp 2a Sequenzen deutliche Unterschiede auf.

Aus diesen Gründen sollte das Ziel der vorliegenden Arbeit sein, eine initiale Replikation des

Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die virale RNA nicht

zu verändern. Eine Manipulation sollte auf Seiten der zellulären viralen Abwehr durch

Überexpression des RLI erfolgen. Dadurch sollte die RNase L als Effektorenzym des

2’-5’Oligoadenylatsynthetase-Systems ausgeschaltet werden.

Zur Analyse der HCV RNA wurde auf der Basis existierender Primer und Sonden ein

spezifisches, sensitives und quantitatives HCV RotorGene Nachweissystem entwickelt. Zur

Analyse der zellulären Genexpression wurden spezifische und quantitative real time PCRs

zum Nachweis der mRNA-Mengen von RLI, RNase L und GAPDH sowie der 18S rRNA

entwickelt.

Die Infektionsversuche wurden sowohl in Huh7- als auch in FRhK-4-Zellen durchgeführt.

Humane Leberzellen (Huh7) sind die natürlichen Wirtszellen des Hepatitis C Virus und die

Zellen, in denen HCV Replikons und JFH-1 bereits effizient replizieren. Für Klone von RLI-

transfizierten FRhK-4-Zellen konnte in einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein

gesteigertes HAV Wachstum beobachtet werden. Es sollte analysiert werden, ob diese

Eigenschaft auch auf die Replikation von HCV einen positiven Einfluss ausübt.

Zusammenfassung

108

Der RNase L Inhibitor wurde aus humaner- und Affen-gesamt-Zell-RNA isoliert und

sequenziert. Die Auswertungen der RLI-Sequenzen ergaben Unterschiede in den Nuklein-

und Aminosäuresequenzen zur RLI-Referenzsequenz der NCBI Datenbank. Die Ergebnisse

der vorliegenden Arbeit wurden jedoch durch Reproduktion und eine existierende Publikation

von 1999 bestätigt. Die RNase L Inhibitoren von Mensch und Affe sind in ihren

Aminosäuresequenzen vollkommen identisch.

Die stabile Überexpression des RLI ist weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen gelungen. Ob

das RLI-Gen aus den Zellen elimiert wird oder das Vorhandensein größerer Mengen an RLI-

Protein letal auf die Zellen wirkt ist unklar. Transiente Überexpressionen des RLI waren um

Faktoren von bis zu 200 möglich. Nach einer Woche Inkubationszeit konnte noch eine

erhöhte RLI-mRNA-Menge um Faktoren von mindestens 6 detektiert werden. Durch

Mehrfachtransfektion konnte die Dauer der RLI-Überexpression beliebig verlängert werden.

Es wurden sowohl HCV Infektionsversuche, als auch Transfektionsversuche mit in vitro

transkribierter HCV RNA durchgeführt. Durch Transfektion der HCV RNA wurde der

kritische Schritt des Viruseintritts in die Zelle umgangen. Weder die HCV Infektion noch die

Transfektion von in vitro transkribierter full length RNA hatten einen Einfluss auf die

Expression des zellulären RLI. Die Überexpression des RLI hatte wiederum keinen positiven

Effekt auf die Replikation der HCV RNA. Weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen ist die

initiale Replikation des Hepatitis C Virus mit Hilfe der Überexpression des RLI gelungen. Da

eine Replikation von Hepatitis C Virus RNA weder in RLI-transfizierten noch in nicht

transfizierten Zellen erfolgt ist, kann über einen potentiellen Einfluss der HCV RNA auf die

Expression der RNase L keine Aussage getroffen werden. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich,

dass das 2’-5’Oligoadenylatsynthetases-System mit dem Effektorenzym RNase L keinen

Einfluss auf die Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur hat.

Anhang

109

6. Literaturverzeichnis

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Anhang

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7. Anhang

7.1. Plasmidkarten

pcDNA3/RLI 3’

Dieses Plasmid ist von pcDNA3 (Invitrogen) abgeleitet und enthält die Sequenz der humanen

RLI cDNA (Bisbal et al., 1995).

pcDNA 3.1/V5-His Topo TA (Invitrogen)

Dieses Plasmid der Firma Invitrogen dient als Klonierungvektor von PCR-Fragmenten in

E.coli.

Anhang

118

pcDNA3.1/V5-His_RLI

Dieses Plasmid ist abgeleitet von pcDNA3.1/V5His TOPO TA und enthält die Sequenz des

RNase L Inhibitors. pcDNA3.1/V5-His-m_RLI enthält die Sequenz des FRhk-4-RLI

(monkey-RLI) und pcDNA3.1/V5-His-h_RLI enthält die Sequenz des humanen RLI.

pl.18

Dieses Plasmid dient als Klonierungvektor von PCR-Fragmenten in E.coli.Es zeichnet sich

durch seine sehr hohe Expressionrate aus.

Anhang

119

pl.18_RLI

Dieses Plasmid ist abgeleitet von pl.18 und enthält die RLI Sequenz mit angehängtem V5-

His. Das Insert wurde mit Hilfe von KpnI und MssI/PmeI aus pcDNA3.1/V5His_RLI

herausgeschnitten und in pl.18 einkloniert. pl.18-m_RLI enthält die Sequenz des FRhk-4-RLI

(monkey-RLI) und pl.18-h_RLI enthält die Sequenz des humanen RLI.

p90/HCV FL-long pU

p90/HCV FL-long pU ist ein Klonierungsvektor, abgeleitet von pBR322, der die komplette

Konsensus cDNA des HCV-Isolats H77 (Kolykhalov et al., 1997) vom Genotyp 1a unter der

Kontrolle eines T7 Promoters enthält.

Anhang

120

ZC-5.1

Dieses Plasmid ist abgeleitet von ZC-5.1 und enthält die Sequenz des humanen RNase-L-

Gens. Die angegebenen Basen im Hind-III-Fragment der Rnase L entspricht den Positionen

im RNase L Gen. Die Positionen im Vektor sind durch einen hochgestellten *

gekennzeichnet.

Anhang

121

7.2. Sequenzen und Alignments

H.sapiens mRNA for 2'-5' oligoadenylate binding protein (RLI); NCBI Accesion nr. X74987

humanes RLI mit angehängtem His-Tag aus Plasmid 8_14_27

FRhK-4 RLI mit angehängtem His-Tag aus Plasmid 6_5_2

Anhang

122

nachsequenziertes RLI aus dem Plasmid von C. Bisbal (Bisbal et al., 1995)

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1 A T G G C A G A C A A G T T A A C G A G A A T T G C T A T T G T C A A C C A T G A C A A A T G T A A A C C T A A G A A A X74987

1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

70 80 90 100 110 120

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

61 T G T C G A C A G G A A T G C A A A A A G A G T T G T C C T G T A G T T C G A A T G G G A A A A T T A T G C A T A G A G X74987

61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

130 140 150 160 170 180

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

121 G T T A C A C C C C A G A G C A A A A T A G C A T G G A T T T C C G A A A C T C T T T G T A T T G G T T G T G G T A T C X74987

121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

190 200 210 220 230 240

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

181 T G T A T T A A G A A A T G C C C C T T T G G C G C C T T A T C A A T T G T C A A T C T A C C A A G C A A C T T G G A A X74987

181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 8-14-27+His

181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 6-5-2+His

250 260 270 280 290 300

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

241 A A A G A A A C C A C A C A T C G A T A T T G T G C C A A T G C C T T C A A A C T T C A C A G G T T G C C T A T C C C T X74987

241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

310 320 330 340 350 360

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

301 C G T C C A G G T G A A G T T T T G G G A T T A G T T G G A A C T A A T G G T A T T G G A A A G T C A G C T G C T T T A X74987

301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . 8-14-27+His

301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

370 380 390 400 410 420

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

361 A A A A T T T T A G C A G G A A A A C A A A A G C C A A A C C T T G G A A A G T A C G A T G A T C C T C C T G A C T G G X74987

361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

430 440 450 460 470 480

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

421 C A G G A G A T T T T G A C T T A T T T C C G T G G A T C T G A A T T A C A A A A T T A C T T T A C A A A G A T T C T A X74987

421 . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . G . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His

421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

Anh

ang

124

490 500 510 520 530 540

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

481 G A A G A T G A C C T A A A A G C C A T C A T C A A A C C T C A A T A T G T A G C C A G A T T C C T A A G G C T G G C A X74987

481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . G C T . . . 8-14-27+His

481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . 6-5-2+His

550 560 570 580 590 600

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

541 A A G G G G A C A G T G G G A T C T A T T T T G G A C C G A A A A G A T G A A A C A A A G A C A C A G G C A A T T G T A X74987

541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

610 620 630 640 650 660

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

601 T G T C A G C A G C T T G A T T T A A C C C A C C T A A A A G A A C G A A A T G T T G A A G A T C T T T C A G G A G G A X74987

601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

670 680 690 700 710 720

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

661 G A G T T G C A G A G A T T T G C T T G T G C T G T C G T T T G C A T A C A G A A A G C T G A T A T T T T C A T G T T T X74987

661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His

661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 6-5-2+His

730 740 750 760 770 780

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

721 G A T G A G C C T T C T A G T T A C C T A G A T G T C A A G C A G C G T T T A A A G G C T G C T A T T A C T A T A C G A X74987

721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

790 800 810 820 830 840

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

781 T C T C T A A T A A A T C C A G A T A G A T A T A T C A T T G T G G T G G A A C A T G A T C T A A G T G T A T T A G A C X74987

781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 8-14-27+His

781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 6-5-2+His

850 860 870 880 890 900

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

841 T A T C T C T C C G A C T T C A T C T G C T G T T T A T A T G G T G T A C C A A G C G C C T A T G G A G T T G T C A C T X74987

841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

910 920 930 940 950 960

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

901 A T G C C T T T T A G T G T A A G A G A A G G C A T A A A C A T T T T T T T G G A T G G C T A T G T T C C A A C A G A A X74987

901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

970 980 990 1000 1010 1020

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

961 A A C T T G A G A T T C A G A G A T G C A T C A C T T G T T T T T A A A G T G G C T G A G A C A G C A A A T G A A G A A X74987

961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

Anh

ang

125

1030 1040 1050 1060 1070 1080

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1021 G A A G T T A A A A A G A T G T G T A T G T A T A A A T A T C C A G G A A T G A A G A A A A A A A T G G G A G A A T T T X74987

1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 8-14-27+His

1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 6-5-2+His

1090 1100 1110 1120 1130 1140

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1081 G A G C T A G C A A T T G T A G C T G G A G A G T T T A C A G A T T C T G A A A T T A T G G T G A T G C T G G G G G A A X74987

1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1150 1160 1170 1180 1190 1200

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1141 A A T G G A A C G G G T A A A A C G A C A T T T A T C A G A A T G C T T G C T G G A A G A C T T A A A C C T G A T G A A X74987

1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1210 1220 1230 1240 1250 1260

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1201 G G A G G A G A A G T A C C A G T T C T A A A T G T C A G T T A T A A G C C A C A G A A A A T T A G T C C C A A A T C A X74987

1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1270 1280 1290 1300 1310 1320

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1261 A C T G G A A G T G T T C G C C A G T T A C T A C A T G A A A A G A T A A G A G A T G C T T A T A C T C A C C C A C A A X74987

1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . 8-14-27+His

1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1330 1340 1350 1360 1370 1380

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1321 T T T G T G A C C G A T G T A A T G A A G C C T C T G C A A A T T G A A A A C A T C A T T G A T C A A G A G G T G C A G X74987

1321 . . . . . . . . A . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1321 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1390 1400 1410 1420 1430 1440

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1381 A C A T T A T C T G G T G G T G A A C T A C A G C G A G T A C G T T T A C G C C T T T G C T T G G G C A A A C C T G C T X74987

1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1450 1460 1470 1480 1490 1500

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1441 G A T G T C T A T T T A A T T G A T G A A C C A T C T G C A T A T T T G G A T T C T G A G C A A A G A C T G A T G G C A X74987

1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1510 1520 1530 1540 1550 1560

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1501 G C T C G A G T T G T C A A A C G T T T C A T A C T C C A T G C A A A A A A G A C A G C C T T T G T T G T G G A A C A T X74987

1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

Anh

ang

126

1570 1580 1590 1600 1610 1620

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1561 G A C T T C A T C A T G G C C A C C T A T C T A G C G G A T C G C G T C A T C G T T T T T G A T G G T G T T C C A T C T X74987

1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1630 1640 1650 1660 1670 1680

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1621 A A G A A C A C A G T T G C A A A C A G T C C T C A A A C C C T T T T G G C T G G C A T G A A T A A A T T T T T G T C T X74987

1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1690 1700 1710 1720 1730 1740

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1681 C A G C T T G A A A T T A C A T T C A G A A G A G A T C C A A A C A A C T A T A G G C C A C G A A T A A A C A A A C T T X74987

1681 . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1681 . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1750 1760 1770 1780 1790 1800

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-

1741 A A T T C A A T T A A G G A T G T A G A A C A A A A G A A G A G T G G A A A C T A C T T T T T C T T G G A T G A T T A G X74987

1741 . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . 8-14-27+His

1741 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . 6-5-2+His

1800 X74987

1801 A A G G G C A A T T C T G C A G A T A T C C A G C A C A G T G G C G G C C G C T C G A G T C T A G A G G G C C C G C G G 8-14-27+His

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10 20 30 40 50 60

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1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

70 80 90 100 110 120

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


61 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

130 140 150 160 170 180

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

Anh

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190 200 210 220 230 240

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181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

250 260 270 280 290 300

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


241 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

310 320 330 340 350 360

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

370 380 390 400 410 420

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

430 440 450 460 470 480

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

490 500 510 520 530 540

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . Bisbal-Plasmid

550 560 570 580 590 600

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

610 620 630 640 650 660

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

670 680 690 700 710 720

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

730 740 750 760 770 780

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

790 800 810 820 830 840

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

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128

850 860 870 880 890 900

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


841 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

910 920 930 940 950 960

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

970 980 990 1000 1010 1020

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1030 1040 1050 1060 1070 1080

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1090 1100 1110 1120 1130 1140

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1150 1160 1170 1180 1190 1200

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1210 1220 1230 1240 1250 1260

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1270 1280 1290 1300 1310 1320

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1330 1340 1350 1360 1370 1380

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1321 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1390 1400 1410 1420 1430 1440

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1450 1460 1470 1480 1490 1500

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

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1510 1520 1530 1540 1550 1560

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1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1570 1580 1590 1600 1610 1620

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1630 1640 1650 1660 1670 1680

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1690 1700 1710 1720 1730 1740

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1681 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

1750 1760 1770 1780 1790 1800

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


1741 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid

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1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

70 80 90 100 110 120

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61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

61 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

130 140 150 160 170 180

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121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

190 200 210 220 230 240

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 8-14-27+His

181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 6-5-2+His

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250 260 270 280 290 300

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

241 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

310 320 330 340 350 360

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . 8-14-27+His

301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

370 380 390 400 410 420

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361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

430 440 450 460 470 480

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


421 . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . G . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His

421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

490 500 510 520 530 540

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481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . G C T . . . 8-14-27+His

481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . 6-5-2+His

481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . Bisbal-Pl.seq

550 560 570 580 590 600

------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-


541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

610 620 630 640 650 660

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601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

670 680 690 700 710 720

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661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His

661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 6-5-2+His

661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

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721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

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781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 8-14-27+His

781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 6-5-2+His

781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

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841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

841 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

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901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

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1081 E L A I V A G E F T D S E I M V M L G E N G T G K T T F I R M L A G R L K P D E G G E V P V L N V S Y K P Q K I S P K S X74987

1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His

1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq

1261 T G S V R Q L L H E K I R D A Y T H P Q F V T D V M K P L Q I E N I I D Q E V Q T L S G G E L Q R V R L R L C L G K P A X74987

1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . A . . . . . . . 8-14-27+His

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1441 D V Y L I D E P S A Y L D S E Q R L M A A R V V K R F I L H A K K T A F V V E H D F I M A T Y L A D R V I V F D G V P S X74987

1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His

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1798 Bisbal-Pl.seq

136

8. Danksagung

Mein Dank geht zunächst an PD Dr. rer. nat. Andreas Dotzauer für die Bereitstellung

dieses interessanten Themas und seiner Diskussionsbereitschaft und Unterstützung bei

Fragen und Problemen.

Danken möchte ich der QIAGEN Hamburg GmbH (ehemals artus GmbH) für die Stellung

meines Arbeitsplatzes, was mir diese Arbeit und die vielen Erfahrungen sowohl in der

Wirtschaft als auch in der Wissenschaft überhaupt erst ermöglicht hat.

Vielen Dank an alle Mitarbeiter der Qiagen Hamburg GmbH, in der ein supernettes

Arbeitsklima herrscht und ich mich immer wohlgefühlt habe. Danke für die vielen

Gespräche auf dem Flur und gemeinsame Kaffee- und Mittagspausen.

Mein ganz persönlicher und besonderer Dank geht an Dr. Meike Eickhoff, die trotz

eigenem vollen Terminplan immer ein offenes Ohr für meine Fragen und Probleme hatte.

Mein besonderer Dank geht auch an Oliver Janssen-Weets, für die gute Zusammenarbeit

und die ständige Hilfsbereitschaft bei allen Fragen und Unklarheiten. Für die baldige

Beendigung seiner Doktorarbeit wünsche ich ihm ganz viel Glück und Erfolg.

Nicht zuletzt geht mein Dank natürlich auch an meine Freunde und meine Familie, die

mich all die Jahre unterstützt haben und mir dadurch diese Arbeit ermöglicht haben.

Ein ganz persönlicher Gruß geht an die Menschen, die mir in meinem Leben sehr viel

bedeutet haben, aber diesen Lebensabschnitt leider nicht mehr miterleben dürfen. Oma,

Opa, Tante Inge – ich hab euch nicht vergessen

137

9. Publikationsliste

Günther, S., Asper, M., Röser, C., Luna, L. K., Drosten, C., Becker-Ziaja, B.,

Borowski, P., Chen, H.M. & Hosmane R.S. (2004). Application of real-time PCR for

testing antiviral compounds against Lassa virus, SARS coronavirus and Ebola virus in

vitro. Antiviral Research. 63, 209-215

Posterbeiträge:

Röser, C., Asper, M., Borowski, P. & Günther, S. (2003). Cell culture system für

screening antiviral compounds against Lassa virus. Kongress der Gesellschaft für Virology

e.V.

Röser, C., Laue, T. & Dotzauer, A. (2005). Cloning of the RNase L inhibitor (RLI) for

manipulation of the 2’-5’oligoadenylate synthetase (OAS) assay in virus infected cells.

Kongress der Gesellschaft für Virology e.V.

138

10. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Christina Röser

Anschrift Münchener Strasse 150 28215 Bremen

geboren am 07.07.1978 in Erfurt

Familienstand ledig

Schulausbildung

09.1985 – 08.1991 Grundschule Erfurt

09.1991 – 07.1997 Kooperative Gesamtschule am Schwemmbach Erfurt

Abschluß: Abitur (Notendurchschnitt 1,9)

Hochschulstudium

10.1997 - 06.2003 Biologiestudium an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster

Diplomarbeit am Bernhard-Nocht-Institut Hamburg

Thema: „Etablierung eines Zellkultursystems und Testung potentieller Inhibitoren des Lymphocytären Choriomeningitis Virus und Lassa-Virus“

Abschluss: Diplom (Notendurchschnitt 1,6)

Praktika

17.09.2001 – 31.10.2001 Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut Hamburg

Thema: „Untersuchung zur bakteriellen Expression und Aufreinigung von Nukleoprotein und Polymerase des Lassa-Virus“

Berufliche Weiterbildung

01.05.2003 - 30.6.2003 Promotionsstudium an der Universität Gießen

seit 01.07.2003 Promotionstudent bei der artus GmbH Hamburg in

Kooperation mit der Universität Bremen Abt. Virologie

(1.10.2005 Umbenennung der artus GmbH Hamburg in Qiagen Diagnostics Hamburg)

Fremdsprachen Englisch

Weiterbildung

10.-11.10.2005 Ausbildung zum Ersthelfer/Betriebshelfer

139

11. Erklärung

Hiermit erkläre ich nach §6 (5) der Promotionsordnung,

1) die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertig zu haben.

2) keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt zu haben.

3) die den benutzen Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche

kenntlich gemacht zu haben.

Ort, Datum Unterschrift

Documents

Untersuchungen zum Replikationsverhalten des Hepatitis C ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/00010690.pdf · Prinzip der PCR.....18 1.3.3. Real time PCR ... HAV Hepatitis A Virus