Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen ...Untersuchungen+erblich...Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen erblich bedingter Erkrankungen des zentralen

Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen erblich bedingter Erkrankungen

des zentralen Nervensystems

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Laura-Kristina van Diepen

geboren am 02.01.1986

in Stade

Greifswald , 24.11.2017

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Werner Weitschies

1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Kuss

2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Herbert Hildebrandt

Tag der Promotion: 24.11.2017

Inhaltsverzeichnis III

I. Inhaltsverzeichnis

I. Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................................... III

II. Abbildungsverzeichnis .................................................................................................................... V

III. Tabbellenverzeichnis .................................................................................................................. VI

IV. Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. VII

Abstract ................................................................................................................................................... 1

Zusammenfassung .................................................................................................................................. 2

1. Einleitung ........................................................................................................................................ 3

1.1 Krankheitsbild geistige Behinderung ...................................................................................... 3

1.2 Glycosyltransferasen und “Congenital Disorders of Glycosylation“ ....................................... 5

1.3 Pluripotente Stammzellen .................................................................................................... 10

1.4 Embryonale Neurogenese..................................................................................................... 15

2. Ergebnisse ..................................................................................................................................... 18

2.1 Subzellulare Lokalisierung verschiedener ST3GAL3 Mutationsvarianten ............................ 18

2.2 Etablierung patientenspezifischer iPS ................................................................................... 22

2.3 Differenzierung zu Kortexneuronen ..................................................................................... 34

2.4 Funktionelle Analysen ........................................................................................................... 41

3. Diskussion ..................................................................................................................................... 56

3.1 Etablierung und Validierung eines patientenspezifischen iPS-Modells ................................ 56

3.2 Kortikale Differenzierung nach Yichen Shi et al. ................................................................... 61

3.3 Glycosylierung und zelluläre Adhäsion ................................................................................. 66

3.4 Die Neurogenese kortikaler Projektionsneuronen ................................................................... 72

3.4 Zusammenfassung/Ausblick ................................................................................................. 75

4. Material und Methoden................................................................................................................ 80

4.1 Nukleinsäurearbeiten ........................................................................................................... 80

4.2 Vektorarbeiten .................................................................................................................... 113

4.3 Stammlösungen .................................................................................................................. 123

IV Inhaltsverzeichnis

4.4 Säuger-Zellkultur Einführung .............................................................................................. 127

4.5 Reprogrammierung humaner primärer Fibroblasten ......................................................... 150

4.6 Kortikale Differenzierung .................................................................................................... 158

4.7 Funktionelle Analysen ......................................................................................................... 163

5. Literaturverzeichnis .................................................................................................................... 181

Abbildungsverzeichnis V

II. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1 ST3GAL3 Aufbau und Funktion ........................................................................... 6

Abbildung 1.2: Gastrulation und Neuralrohrbildung ............................................................... 16

Abbildung 1.3: Entwicklung des humanen Kortex ................................................................... 17

Abbildung 2.1: Mutationsvalidierung. ..................................................................................... 20

Abbildung 2.2: ST3GAL3-Lokalisierung .................................................................................... 21

Abbildung 2.3: Bindungsepitope der ST3GAL3-Antikörper ..................................................... 22

Abbildung 2.4: Schematischer Ablauf einer Reprogrammierung ............................................ 23

Abbildung 2.5: Morphologische Veränderungen während einer Reprogrammierung ........... 25

Abbildung 2.6: Vereinfachter Stammbaum und Sangerchromatogramme ............................ 26

Abbildung 2.7: Expressionsänderung der Pluripotenzmarker. ................................................ 28

Abbildung 2.8: Immunfluoreszenzfärbung der Pluripotenzmarker ......................................... 30

Abbildung 2.9: Hauptkomponentenanalyse ............................................................................ 32

Abbildung 2.10: Mengendiagramm differentiell exprimierter Gene ...................................... 33

Abbildung 2.11: Schematischer Ablauf des neuronalen Differenzierungsprotokolls ............. 36

Abbildung 2.12: Wichtige Entwicklungsstadien während der Differenzierung ....................... 37

Abbildung 2.13: Durchlichtbilder kortikaler Zellen in der Langzeitkultur ............................... 38

Abbildung 2.14: Expression Kortex assoziierter Marker. ......................................................... 40

Abbildung 2.15: Immunfluoreszenzfärbung kortexassoziierter Marker ................................. 41

Abbildung 2.16: Mittlere ST3GAL3-Expression mittels dPCR .................................................. 43

Abbildung 2.17: Differentielle Genexpression. ........................................................................ 44

Abbildung 2.18: Mengendiagramm der RNASeq Vergleiche ................................................... 46

Abbildung 2.19: Zelladhärenz .................................................................................................. 48

Abbildung 2.20: Neuronales Zell-Adhäsions-Molekül. ............................................................ 49

Abbildung 2.21: Polysialylierung von kortikalen Neuronen .................................................... 50

Abbildung 2.22: Lektinblots der Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal3 ............................................. 51

Abbildung 2.23: Projektionsneuronen im sich entwickelnden Kortex. ................................... 52

Abbildung 2.24: Quantifizierung der Projektionsneuronen .................................................... 53

Abbildung 2.25: Neuronale Stammzellen ................................................................................ 55

Abbildung 3.1: Projektionsneuronen des Kortexes ................................................................. 73

Abbildung 4.1: DNA Adsorption an einer Kieselgel Festphase ................................................ 84

VI Tabbellenverzeichnis

Abbildung 4.2 Phasentrennung TriZOL Aufreinigung .............................................................. 86

Abbildung 4.3 DNA Phase der TriZOL Aufreinigung ................................................................. 86

Abbildung 4.4: RNA Phase TriZOL Aufreinigung ...................................................................... 88

Abbildung 4.5: RNA Phase TriZOL Aufreinigung ...................................................................... 89

Abbildung 4.6: Typische Fluoreszenzkurven einer quantitativen PCR .................................... 97

Abbildung 4.7 „Quant Studio TM 3D Digital PCR System“ ...................................................... 101

Abbildung 4.8 Typisches Sequenzchromatogramm einer Sangersequenzierung ................. 106

Abbildung 4.9: Ablauf der FPNI PCR ...................................................................................... 110

Abbildung 4.10: Evolution der lentiviralen Vektorsysteme ................................................... 151

Abbildung 4.11: Zeitlicher Ablauf einer Reprogrammierung ................................................ 158

Abbildung 4.12: Proteinphase TriZOL Aufreinigung .............................................................. 166

Abbildung 4.13 Schematischer Aufbau eines Western Blots ................................................ 170

Abbildung 4.14 Schematischer Ablauf einer Immunfärbung ................................................ 170

Abbildung 4.15 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved. .......................... 174

Abbildung 4.16 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved. .......................... 176

III. Tabbellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Sialyltransferaseexpression in verschiedenen Gehirnarealen ............................. 35

Tabelle 2.2 DAVID-Gen-Onthologie-Anreicherungsanalyse .................................................... 46

Tabelle 4.1 Primerliste ............................................................................................................. 82

Tabelle 4.2: Verwendete Vektoren ........................................................................................ 114

Tabelle 4.3: Verwendete Bakterienstämme .......................................................................... 115

Tabelle 4.4 Verwendete Zelllinien und Patientenmaterial .................................................... 128

Tabelle 4.5: Normales Gehirn Probenmaterial ...................................................................... 129

Tabelle 4.6 Primärantikörper ................................................................................................. 163

Tabelle 4.7 Sekundärantikörper............................................................................................. 164

Tabelle 4.8: Layout Vorschlag für einen Adhärenzassay ....................................................... 178

Abkürzungsverzeichnis VII

IV. Abkürzungsverzeichnis

Amp Ampicillin

AS Fibroblasten Referenzzelllini e

ASC23 Stammzellklon der Referenzzelllinie

bFGF „basic fibroblast growth factor“ humaner Wachstumsfaktor

CaCl2 Calciumdichlorid

DNA Desoxyribonukleinsäuren

DMEM „Dulbeccos modified Eagle Medium“ Basalmedium

DMEM/F12 1:1 Mischung aus DMEM und Ham‘s F12

DMSO Dimethylsulfoxid

DPBS „Phosphate buffered saline“ Phosphatpuffer

ECM Extrazellulärematrix

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EPC Diethyldicarbonat

EtOH Ethanol

FCS fetales Kälberserum

HD2 Stammzellreferenzlinie

HEPES Hydroxyethylpiperazinylethansulfonsäure Puffer

KCl Kaliumchlorid

KOSR Knock-out Serum Replacement

LB „Lysogeny broth“, Bakterienmedium

MEM-NEAA !Minimum Essential Medium“ „non-essential amino acids“

MEF embryonale Mausfibroblasten

MgCl2 Magnesiumdichlorid

MiliQ destiliertes, gefiltertes Wasser

MMC Mitomycin

NaCitrat Natrium-Citrat

NaOH Natronlauge

NaCl Natriumchlorid

NaN3 Natriumazid

NI dx Neuronal induziert Tag X

VIII Abkürzungsverzeichnis

NIM neuronales Induktionsmedium

NMM Neuronenmedium

NTP Nukleotidtriphosphat

PFA Paraformaldehyd

P/S Penicillin, Streptomycin

PVDF Polyvinylidenfluorid

RNA Ribonukleinsäuren

rpm „rounds per minute“ Umdrehungszahl

SCM Stammzellmedium

SDS „Sodiumdodecylsulfat“ Natriumlaurylsulfat

ST3GAL3 Gen CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-

sialyltransferase

ST3GAL3 Protein CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-

sialyltransferase

ΔSt3Gal3-HF Patientenfibroblastenlinie mit Punktmutation im ST3GA3I Gen

ΔSt3Gal3 Patientenstammzelllinie mit Punktmutation im ST3GAL3 Gen

TBE „Tris-Bor-EDTA“ Puffer

TBS Tris-Puffer

ÜN über Nacht

UPL „Universal probe library“ Sonden von Roche

VPA Valproinsäure

Abstract 1

Abstract

Intellectual disability (ID) is a cognitive impairment disorder characterized by an intelligence quotient

(IQ) below 70 and is one of the most common forms of cognitive handicaps resulting from genetic

aberrations [1]. Hereditary forms of ID are genetically heterogeneous but a considerable number

involve genes participating in the build-up and maintenance of the glycocalyx [2]. The glycocalyx is

composed of carbohydrates that are part of the cell surface exposed lipids and proteins (including

proteoglycans) or part of the extracellular matrix. We recently demonstrated that mutations in

ST3GAL3 (NM_006279.2), which encodes the Golgi enzyme β-galactoside-α2,3-sialyltransferase-III,

lead to varying clinical manifestations. Two independent mutations (p.Ala13Asp and p.Asp370Tyr)

identified in Iranian pedigrees were associated with mild forms of non-syndromic autosomal

recessive intellectual disability (NSARID)[3]. However, a third point mutation (p.Ala320Pro) identified

in a Palestinian family caused West Syndrome (WS), an age-dependent epileptic encephalopathic

syndrome associated with developmental arrest or, as in the case of our patients [3], regression[4].

In humans ST3GAL3 forms, among others, the sialyl Lewis a (sLea) epitope on proteins. Ectopic

expression of full-length-c-MYC fusion proteins with the respective mutations in LMTK- cells showed

severe functional impairment and subcellular mislocalization of all mutant gene products [5]. To

further elucidate the molecular and cellular mechanisms causing West Syndrome due to the lack of

ST3GAL3 function, we successfully generated induced pluripotent stem cell lines from fibroblasts

obtained from a patient with West Syndrome, carrying a mutation in exon 12 (c.958G>C,

p.Ala320Pro) of ST3GAL3, and a healthy sibling using lentiviral reprogramming.

Since ST3GAL3 showed highest expression in the frontal cortex, which is also in accordance with the

source of epileptic seizures, a differentiation protocol to cortical neurons was established and

successfully accomplished for both cell lines. One of its advantages is mimicking the in vivo

neurogenesis in vitro, enabling us to investigate temporal processes. IPSCs and cortical neurons

derived thereof were analysed by lectin blots, mRNA sequencing, adherence assays, and FACS. While

no significant difference was observed at stem cell or fibroblast level between patient and control

cells, patient-derived cortical neurons displayed an additional band (70 kDa) in the lectin blot

staining, enhanced adherence to a poly-L-ornithine/laminin coated surface and decreased levels of

neurons expressing T-box transcription factor brain 1 (2.28 fold).

Thus, our results indicate that ST3GAL3 function is important for the normal development and

functioning of the brain.

2 Zusammenfassung

Zusammenfassung

Geistige Behinderung ist eine der häufigsten Formen von erblich bedingten kognitiven

Beeinträchtigungen. Definiert wird sie durch einen Intelligenzquotienten unter 70 und obwohl ihre

genetischen Ursachen sehr heterogen sein können, gibt es unter ihnen eine beachtliche Menge

Gene, die am Aufbau der Glycocalyx beteiligt sind [1, 2]. Die Glycocalyx besteht aus

Zuckerbausteinen, die Teil von Lipiden und Proteinen der Zelloberfläche oder der extrazellulären

Matrix sind. Vor kurzem konnten wir belegen, dass Mutationen im ST3GAL3-Gen, welches für die

Golgi-lokalisierte β-Galactosid-α2,3-sialyltransferase-III codiert, zu verschiedenen klinischen

Befunden führt. Zwei unabhängige Mutationen (p.Ala13Asp and p.Asp370Tyr), gefunden in

iranischen Familien, konnten mit relativ milden Formen nicht-syndromaler geistiger Behinderung

(NSARID) in Verbindung gebracht werden [5]. Eine dritte Punktmutation (p.Ala320Pro), gefunden in

einer palästinensischen Familie, verursachte hingegen eine schwere, altersabhängige epileptische

Enzephalopathie, das West-Syndrom. Dieses Syndrom ist mit einem Arrest der geistigen Entwicklung

oder sogar, wie in unserem Fall, einer Regression assoziiert [3, 4]. ST3GAL3 bildet im Menschen

unter anderem das Sialyl Lewis-a (sLea)-Epitop auf Proteinen. Exogene Expression der Volllängen-c-

MYC-Fusionsproteine, der Mutationsvarianten in LMTK—Zellen, zeigte, dass alle Varianten eine

gestörte subzellulare Lokalisierung zeigen und zwei von ihnen (p.Ala13ASp und p.ALA320Pro) kaum

mehr messbare Aktivität besitzen [5]. Um die molekularen und zellulären Mechanismen näher zu

beleuchten, die dem ST3GAL3-bedingten West-Syndrom zugrunde liegen, haben wir erfolgreich ein

patientenspezifisches, induzertes pluripotentes Stammzellmodell etabliert. Hierfür wurden

Fibroblasten der Patientin, die eine Mutation im Exon 12 (c.958G>C, p.Ala320Pro) des ST3GAL3-Gens

trägt, und einer gesunden Schwester mittels eines lentiviralen Vektorsystems reprogrammiert. Da

ST3GAL3 die höchsten Expressionswerte im frontalen Kortex zeigte, und dies auch in

Übereinstimmung mit dem vorgeschlagenen Ursprung epileptischer Anfälle steht, wurde ein

Differenzierungsprotokoll für kortikale Neuronen etabliert und erfolgreich für beide Zelllinien durch

geführt. Einer der größten Vorteile dieses Protokolls ist, dass hier die Neurogenese in vitro nach

demselben temporalen Muster abläuft wie die Neurogenese in vivo. Die iPSC und die daraus

differenzierten Neuronen wurden anschließend mittels Lectinblot, mRNA-Sequenzierung,

Adhärenzassays und FACS untersucht. Während keine Unterschiede zwischen den iPSC und den

Fibroblasten festgestellt wurden, konnten für die kortikalen Neuronen der Patientin eine zusätzliche

Bande im Lektinblot (70 kDa), ein verändertes Adhärenzverhalten auf poly-L-Orinithin/Laminin-

beschichteter Oberfläche und eine deutlich reduzierte Menge T-box-transcription factor-brain-1-

exprimierende Neuronen festgestellt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die ST3GAL3-Aktivität

wichtig für die normale Entwicklung und Funktion des Gehirns ist.

Einleitung 3

1. Einleitung

1.1 Krankheitsbild geistige Behinderung

Wenn bei einem Patienten vor dem 18. Lebensjahr Defizite in einer oder mehreren

adaptiven oder intellektuellen Funktionen neben einem Intelligenzquotienten (IQ) von unter

70 festgestellt werden, gelten sie als geistig behindert (ICD-10). Unter adaptiven Fähigkeiten

versteht man die Anpassungsfähigkeit an äußere Einflüsse, wie das Erlernen von Sprache,

interpersonelle Fähigkeiten oder die Einhaltung von Routinen (z. B. Hygiene). Intellektuelle

Fähigkeiten betreffen basalere Abläufe, wie Lernen, logisches Denken oder Lösungen für

Probleme zu finden [6]. Die Prävalenz geistiger Behinderung liegt in der kaukasischen

Population bei ca. 1 - 3 %. Bei schlechterer Nahrungsverfügbarkeit, Schwächen im

Gesundheitswesen und elterlicher Prädisposition kann sie aber eine deutlich höhere

Prävalenz zeigen [7]. Sie wird anhand der verschiedenen Symptome in milde (IQ 55 - 69),

mäßige (IQ 40 - 54), schwere (IQ 25 - 39) und schwerste (IQ < 25) geistige Behinderung

unterteilt [6]. Viele dieser Patienten leiden neben der geistigen Behinderung auch noch an

anderen Symptomen, weshalb sie häufig einem bestimmten Syndrom zugeordnet werden

können. So ist die geistige Behinderung ein Teilsymptom von über 100 verschiedenen

syndromalen Erkrankungen, wobei die Heterogenität und variable Ausprägung der

Symptome eine eindeutige Diagnose deutlich erschweren können [8]. In 30 - 50 % aller Fälle

hingegen liegt eine nicht syndromale oder idiopathische geistige Behinderung vor. Die

Ursachen dieser Behinderung sind sehr heterogen. Neben den äußeren Einflüssen, wie

infektiösen Erkrankungen, dem fetalen Alkoholsyndrom oder Frühgeburten werden ca. 25 %

aller Fälle durch eine oder mehrere genetische Mutationen verursacht [9].

Auf Grund der vielfältigen Ursachen, muss der kausale Zusammenhang zwischen Genotyp

und Phänotyp für jeden Fall einzeln untersucht werden. Dies gelang bisher nur in wenigen

Fällen [10]. Eine der Limitationen dieser Untersuchungen ist sicherlich die Verfügbarkeit

eines adäquaten Modells. Für in-vivo-Untersuchungen zu Erkrankungen der neuronalen

Entwicklung wurden bisher hauptsächlich Mäuse oder Ratten herangezogen. Da sie aber nur

unzureichend die Komplexität des humanen Zerebrums darstellen können, konnten nur in

wenigen Fällen mit diesen Modellen die molekularen Ursachen ermittelt werden [11].

Genetische Untersuchungen idiopathischer Erkrankungen haben sich bisher hauptsächlich

4 Einleitung

auf x-chromosomale geistige Behinderungen fokussiert. Neuere Studien konnten aber die

Zahl der autosomalen genetischen Ursachen z. B. mittels „Next-Generation-Sequencing“ in

konsanguinen Familien deutlich erhöhen [12]. So konnte, unter anderem, für vier Patienten,

drei männliche (Abb. 2.6: 4713, 4696, 4694) und eine weibliche (Abb. 2.6: 4695), aus einer

konsanguinen palästinensischen Familie gezeigt werden, dass eine Mutation im ST3GAL3-

Gen ursächlich für ihre schwere Form des autosomal rezessiven West-Syndroms ist. Neben

den frühkindlich auftretenden epileptischen Anfällen, hauptsächlich des Flexortyps, leiden

diese Patienten an einer schwersten geistigen Behinderung, die noch vor den ersten

Anfällen erkennbar wurde. Der allgemeine Gesundheitszustand und die

Wachstumsparameter waren normal, darüber hinaus gab es keine Hinweise auf die

Beteiligung anderer Systeme. Eine Magnetresonanztomografie der Patienten (1.5T MRT)

zeigte keine Auffälligkeiten. Die Medikation mit verschiedenen antikonvulsiven Mitteln

konnte nur bei einem mild betroffenen Patienten eine Verbesserung herbeiführen. Alle

anderen Patienten entwickelten das Lennox-Gastaut-Syndrom, welches durch mehrfache

Anfälle und Anfallsformen am Tag und während der Nacht charakterisiert ist [3].

Um die molekularen Ursachen dieses schweren Krankheitsverlaufes genauer untersuchen zu

können, wurde uns Zellmaterial der Patientin (Abb.2.6: 4695) zur Verfügung gestellt. Die

hier vorgelegten Forschungsarbeiten beschäftigen sich deshalb vorrangig mit den

molekularen Konsequenzen dieser ST3GAL3-Mutation.

In zwei Fällen von nicht-syndromaler geistiger Behinderung konnten ebenfalls Mutationen

im ST3GAL3-Gen identifiziert werden [5].

West-Syndrom ist die häufigste Form einer generellen infantilen epileptischen

Enzephalopathie und manifestiert sich schon vor dem 12. Lebensmonat. Neben den in

Serien auftretenden axialen Spasmen, psychomotorischer Retardierung und einem inter-

iktalen EEG mit Hypsarrythmien, sind viele der Betroffenen geistig behindert [13]. West-

Syndrom zählt mit seiner Prävalenz von 1-1,6:100.000 zu den seltenen Erkrankungen. Die

Ursachen dieses Syndroms sind sehr heterogen. In 70 - 80 % aller Fälle werden

Hirnanomalien, zumeist Fehlbildungen (wie z. B. Tuberöse Sklerose, Bourneville Pringle)

gefunden. Andere Ursachen für diese Anomalien können Ischämien, Meningoenzephalitis

oder genetische Aberrationen, wie Trisomie 21 sein. Nur in seltenen Fällen konnte bisher

eine monogene Ursache gefunden werden [14].

Einleitung 5

1.2 Glycosyltransferasen und “Congenital Disorders of Glycosylation“

Um die molekularen Ursachen dieses Auslösers des West-Syndroms untersuchen zu können,

ist es zunächst notwendig, die möglichen Funktionen des betroffenen Gens zu betrachten.

Das ST3GAL3-Gen codiert für die β-Galactosidase-α-2,3-sialinsäuretransferase 3 und gehört

zur Glycosyltransferase-Familie 29 (EC 2.4). Glycosyltransferasen sind hauptsächlich im

Golgi-Apparat und Endoplasmatischen Reticulum (ER) zu finden, und am Aufbau der

Glycocalyx, einer dichten komplexen Zuckerhülle, auf einer jeden Zelle beteiligt [15]. Diese

Schicht besteht aus Glycoproteinen, Glycolipiden und Proteoglycanen, deren Glycosylierung

hauptsächlich im Golgi-Apparat und dem ER vollzogen wird. Die verwendeten

Zuckerbausteine sind hauptsächlich Glucose, Galactose, Fucose und Sialinsäure. Glycane

können in zwei Konfigurationen, α oder β, mehrfach modifiziert (z. B. N-Acetyl- oder

Hydroxygruppen), und in verschiedensten Verzweigungen vorkommen. So kann aus einer

relativ kleinen Anzahl an Zuckerbausteinen eine hoch komplexe Vielfalt an Oligosacchariden

entstehen. Die Diversität der Glycocalyx kann für jede Zellart, Gewebe und Zeitpunkt

unterschiedlich auf die momentanen Bedingungen angepasst werden. Da Glycane häufig

sehr groß, hydratisiert und anionisch sind, beeinflussen sie die physischen Eigenschaften der

Zelloberfläche deutlich. Sie bestimmen die Spannkraft, Stärke und Elastizität, extrazelluläre

Homöostase, Morphologie und physiologische Funktion des Gewebes [16]. Zusätzlich stellen

sie die kommunikative Schnittfläche der Zelle mit der Außenwelt dar und sind an der Zell-

Zell-Erkennung sowie der lokalen Interaktion der Zelle beteiligt [17]. Veränderungen in der

Glycosylierung, wie durch den Verlust der ST3GAL3-Aktivität, können somit dramatische

Folgen, wie Fehlfaltungen, Transportfehler oder sogar Funktionsverlust, haben.

So ist es auch nicht verwunderlich, dass es eine immer schneller wachsende Gruppe an

genetischen Erkrankungen gibt, die durch Mutationen in Genen des Glycometabolismus

verursacht werden. Diese Erkrankungen gehören zu den „Congenital Disorders of

Glycosylation“ (CDG). Bisher sind über 70 verschiedene erblich bedingte Erkrankungen die

den Glycometabolismus beeinflussen bekannt. Die Symptome der verschiedenen CDGs sind

äußerst heterogen und können nahezu jedes Organ betreffen [18]. Sie reichen über

Leberschäden, Herzinsuffizienzen und Wachstumsverzögerungen bis hin zu

Gesichtsmalformationen. Bei fast allen CDGs ist allerdings eine Beeinträchtigung der

neurologischen Entwicklung in Form von epileptischen Anfällen, Neuropathien und/oder

6 Einleitung

geistiger Behinderung vorhanden [19].

Die Nomenklatur der CDG richtet sich nach den verschiedenen betroffenen

Glycosylierungswegen. Insgesamt sind acht Hauptreaktionswege bei Säugern bekannt, die

innerhalb des ER und Golgi-Apparats katalysiert werden [20]. Hierzu zählen N- und O-

glycosidische Reaktionen sowie Reaktionen mit Glycosylphosphatidylinositol (GPI) -Ankern

und Glycosphingolipiden. Typ I CDGs umfassen Mutationen, die Glycosylierungen an GPI-

Ankern betreffen. Mutationen, die Defekte in der Glycosylierung von Proteinen betreffen,

sind Typ II CDGs und Defekte der α-Dystroglycan O-Mannosylierung werden als Typ III

klassifiziert [8]. Da wir die Reaktionspartner der ST3GAL3 bisher nicht kennen, konnte noch

keine Eingrenzung innerhalb der CDG-Klassen erfolgen. Eine der prominentesten CDGs, die

CDG Ia (früher Jaeken-Syndrom), wird durch Mutationen im PMM2-Gen verursacht. Die

Phosphomannomutase 2 (PMM2) katalysiert die Isomerisierung von Phospho-6-mannose zu

Phospho-1-mannose. Mutationen in diesem Gen führen zur gestörten GDP-Mannose-

Synthese, die einen wichtigen Baustein innerhalb der Glycosylierung darstellt. Der Phänotyp

der Patienten ist sehr heterogen und beinhaltet unter anderem Immunsystemdefekte,

Hypotonie und geistige Behinderung [21].

Abbildung 1.1 ST3GAL3 Aufbau und Funktion: (A) ST3GAL3-Gen- und Proteinstruktur. Dunkelgrau: proteincodierende Exons, hellgrau: 3‘- und 5‘-UTR. Bisher bekannte Mutationen sind auf cDNA- und Proteinebene benannt. Funktionale Domänen des Proteins, grün: Transmembrandomäne (TMD), orange: Sialyl-Motive „large“ (L), „small“ (S), „3“ und „very small“ (VS). (B) ST3GAL3-Akzeptorstrukturen Typ I und II sowie ein mögliches Produkt, Sialyl-Lewis a (sLe

a);

Zuckerbausteine: N-Acetyl-Glucosamin (GlcNAc), Sialinsäure (Sia), Galactose (Gal) und Fucose (Fuc). (Angelehnt an [5])

Einleitung 7

Nun zur genauen Funktion der ST3GAL3. Sie ist eine β-Galactosidase-α-2,3-sialyltransferase,

von denen es beim Menschen sechs bekannte Vertreter gibt (ST3GAL1 bis -6). Diese Enzyme

reagieren bevorzugt mit β-1,3-gebundener Galactose. Sie können unter anderem das bei

Säugern häufig vertretene Sialyl-Lewis-Epitop a (sLea) bilden (Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-

GlcNAc(-1,4-Fucose)-β1,3-Galctose) [22] (Abb. 1.1 B). Die von Weinstein et al. [22]

untersuchte Sialyltransferase aus Rattenleber zeigte aber ebenso Aktivität mit β-1,4-

Galactose-β-1,3-N-Acetyl-Glucosamin. SLea-Epitope kommen beim Menschen hauptsächlich

auf Glycoproteinen in N-glycosidisch gebundener Form an Asparagin vor. ST3GAL3

katalysiert die Bindung von CMP-aktivierter Sialinsäure (CMP-Neu5Ac) auf eine β-1,3- oder

β-1,4-gebundene Galactose (Gal), ihre Substratspezifität ist dabei relativ breit. Es können

nicht nur sLea-Epitope gebildet werden [23].

Das ST3GAL3 Gen umfasst 15 Exons. Bisher konnten 39 Transkriptvarianten isoliert werden,

wobei sieben davon ausschließlich im Gehirn vorkommen [24] und 22 von ihnen

proteincodierend sind. Die Hauptisoform (B1, RefSeq accession number NM_006279.4) des

ST3GAL3-Gens umfasst die Exons 2, 4 ,5 ,7 ,8 ,9 ,10 ,11 ,12 ,13 und 14. Das translatierte

Enzym ist 375 Aminosäuren lang und enthält eine Transmembran-Domäne sowie vier Sialyl-

Motive, „Large“ (L), „small“ (S), „3“ und „very small“ (VS) die entscheidend zur Donor-

Erkennung und -Aktivität beitragen (Abb. 1.1A). Das Gen ist hoch konserviert und kommt

sowohl beim Schimpansen, Rhesusaffen, Hund, Kuh, Maus, Ratte, Huhn, Zebrafisch und

Frosch vor [25]. Bisher konnten drei verschiedene Variationen in diesem Gen mit geistiger

Behinderung assoziiert werden. Zwei von ihnen wurden in konsanguinen Familien aus dem

Iran gefunden. Hierbei sind die cDNA-Positionen c.38C>A und c.1108G>T (gDNA Positionen

g.44201971C>A und g.44395873G>T (GRCh37/hg19)) verändert. Sie verursachen einen

Aminosäureaustausch im Protein an den Positionen p.Ala13Asp und p.Asp370Tyr und

beeinträchtigen damit die Transmembrandomäne (TMD) und den C-terminalen (CD)

Bereich. Die betroffenen Patienten zeigen eine nicht-syndromale geistige Behinderung. Die

Variation der Patienten mit West-Syndrom wurde an der cDNA Position c.958G>C (gDNA

Position g.44386520G>C (GRCh37/hg19)) gefunden und verursacht im Protein einen

Aminosäureaustausch im Sialyl-Motiv S (SMS) an der Position p.Ala320Pro. Funktionale

Untersuchungen zeigten, dass die CD- und SMS-Varianten keine enzymatische Aktivität

mehr besitzen und die CD- als auch die TMD-Variante eine gestörte subzellulare Lokalisation

8 Einleitung

zeigen [5]. Für die SMS-Variante konnte bisher nur eine gestörte Sekretion bewiesen

werden [3], die Lokalisierung wurde noch nicht untersucht.

Über die Substratspezifität der ST3GAL3 beim Menschen ist bisher nichts bekannt, eine

Studie an St3gal3-Knockout-Mäusen zeigte jedoch eine drastisch reduzierte Menge an

Sialoglycoproteinen im Gehirn, wohingegen die Menge an Gangliosiden nur bei einem

Doppel-Knockout mit St3Gal2 signifikant war. In Folge dessen zeigte sich eine starke

Dysmyelinierung, deren Ursache in der verminderten Oligodenrocyten-Proliferation

postuliert wurde[26]. Die Auswirkung des ST3GAL3 Funktionsverlustes beim Menschen

sollte deshalb auf zellulärer Ebene in dieser Arbeit genauer untersucht werden. Auf Grund

seiner enzymatischen Aktivität und des Phänotyps unserer Patienten wären aber Defekte im

Sialinsäuremetabolismus und Störungen der Sialylierung der Glycocalyx des sich

entwickelnden Gehirns wahrscheinlich.

Das Gerüst der Sialinsäure, oder auch Neuraminsäure, besteht aus neun Kohlenstoffen und

hat somit etliche mögliche Modifikationsstellen. Die häufigste Modifikation ist eine N-

Acetylierung am C-5-Kohlenstoff. N-Acetylneuraminsäure (NeuAc) ist eine starke Säure (pKa

2,6), die über ihre exozyklischen Glycerinseitenketten stark hydratisiert sein kann [27].

Sialinsäuren kommen gehäuft in Vertebraten und einigen höheren Invertebraten vor [28]. In

Bakterien, Pflanzen und Pilzen kommen sie nur in einem sehr geringen Ausmaß vor [29]. Im

Gegensatz zu Affen (Schimpanse) produzieren Menschen nur NeuAc und keine N-

Glycolneuraminsäure (NeuGc) [30]. Interessanterweise ist NeuAc auch die im Gehirn

bevorzugte Sialinsäure bei Arten, die noch NeuGc produzieren können [31]. Innerhalb der

Glycocalyx können Sialinsäuren nur in nicht reduzierenden Endpositionen gefunden werden

[32]. Sie kommen als einzelne Sialinsäuren oder Sialinsäure-Oligomere von bis zu über 90

Sialinsäuren vor [33]. Ihre Funktion ist dabei immer abhängig vom darunter liegenden

Oligosaccharidgeäst und den Glycoprotein- oder -lipidstämmen [34].

In den meisten Geweben kommen Sialinsäuren auf Glycoproteinen, hauptsächlich N-

(Asparagin) oder O-glycosidisch (Serin oder Threonin), gebunden vor. Die häufigste Form der

N-gebundenen Glycane ist „NeuAc-α-2,3- (oder -α-2,6) Gal-β-1,4-GlcNAc“ [35]. Die meisten

O-glycosidisch gebundenen Glycane fangen mit einer GalNAc-Serin/Threonin-Bindung an

[36]. Im menschlichen Gehirn hingegen sind Sialinsäure am häufigsten auf Sialoglycolipiden,

auch Ganglioside genannt, zu finden [37].

Ganglioside bestehen aus einem Ceramid, an das ein Glycanbaum synthetisiert wird. Die

Einleitung 9

Synthese der Glycane wird in die „a“, „b“, „0“ und „α“-Serien unterteilt. Umso höher das

Gangliosid, desto länger und komplexer die Glycanstruktur. Das einfachste sialylierte

Gangiolisd ist das GM3, welches durch die ST3GAL5 synthetisiert wird. Während der frühen

Phase embryonaler Neurogenese in Ratten sind hauptsächlich die Ganglioside GM3 und

GD3 vorhanden und werden nach und nach durch höhere Ganglioside ersetzt (GM1, GD1a,

GD1b, und GT1b) [38, 39]. Die Sialylierung der höheren Ganglioside GD1a und GT1b werden

in Mäusen durch St3gal2 und St3gal3 katalysiert, interessanterweise zeigte aber nur die

St3Gal2-Einzel-Knockout-Maus einen deutlichen Phänotyp [40]. Ein Funktionsverlust der

St3gal3 hingegen kann hier offenbar kompensiert werden und steht damit in

Übereinstimmung mit den neuesten Ergebnissen, dass St3Gal3-Knockout-Mäuse

hauptsächlich eine Reduzierung der Sialoglycoproteinen zeigen [26]. Im menschlichen

Gehirn erhöht sich die Gangliosiddichte und -komplexität im letzten Trimester und den

ersten beiden Lebensjahren [41]. Ganglioside sind unter anderem an der Zell-Zell-

Kommunikation beteiligt und Mutationen im ST3GAL5-Gen verursachen unter anderem das

„Amish Infantile Epilepsy“-Syndrom [42].

Eines der prominentesten Glycoproteine der humanen zerebralen Entwicklung ist das poly-

sialylierte neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM). Hierbei wird an eine primäre α-2,3-

oder α-2,6-gebundene Sialinsäure eine mehr als 8 α-2,6-gebundene Sialinsäure lange Kette

durch die ST8SIA2 oder ST8SIA4 ligiert [43] [44]. Durch die hohe Flexibilität [45], starke

negative Ladung und Hydrophilie der PolySia-Ketten nehmen sie ein deutlich größeres

Volumen ein, so dass dies zu einer stereochemischen Abstoßung zwischen Zellen führt [46].

Welche ST3GAL-Transferase die Synthese der primären α-2,3-gebundenen Sialinsäure

katalysiert ist bisher nicht bekannt. Während der embryonalen Neurogenese wird PolySia

auf fast allen neuronalen Zellen z. B. auf radialen Gliazellen des Cortexes, gefunden. Hier ist

es unter anderem an der radialen Migration beteiligt [47, 48]. Andere Funktionen können

die negative Regulation der Zell-Zell-Anlagerung, -Signalweiterleitung, Zelladhäsion und

Zellplastizität sein.

Im Menschen gibt es 20 verschiedene hoch konservierte Sialyltransferasen, die alle zwei

größere und zwei kleinere Sialyl-Motive enthalten, die an der Donor (CMP-Sialinsäure)-

Bindung beteiligt sind [49]. Je nach Akzeptor (Galactose, N-Acetyl-Galactose oder

Sialinsäure) und katalysierter Bindung (α-2,3, α-2,6 oder α-2,8) können sie in vier

verschiedene Familien eingeteilt werden (ST3GAL, ST6GAL, ST6GALNAC oder ST8SIA). In

10 Einleitung

Vertebraten gibt es sechs verschiedene ST3GAL, zwei ST6GAL, sechs ST6GALNAC und sechs

ST8SIA Enzyme, die alle im Golgi-Apparat lokalisiert sind. Möglicherweise gibt es die

verschiedenen Enzyme für die gleiche Katalyse, da sie unterschiedliche Spezifitäten für den

vorhandenen Zuckerbaum, oder sogar das Glycoprotein, aufweisen könnten, aber auch das

Expressionsmuster kann von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich sein. Beim Menschen sind

bisher krankheitsassoziierte Mutationen im ST3GAL3, ST3GAL5 und ST8SIA2 Gen bekannt.

Polymorphismen im Promotorbereich des ST8SIA2 Gens konnten mit einem erhöhten Risiko

für Schizophrenie assoziiert werden [50]. Mutationen in Sialinsäuremetabolismus-Genen,

wie dem Zuckertransporter SLC17A5 und der lysosomalen Sialidase NEU1 verursachen

Sialinsäure-Speicherkrankheiten, die eine starke kognitive Beeinträchtigung zeigen [51, 52].

1.3 Pluripotente Stammzellen

So heterogen wie die Ursachen nicht-syndromaler geistiger Behinderung sind, so heterogen

können auch ihre Konsequenzen auf molekularer, zellulärer oder Entwicklungsbiologischer

Ebene sein. Während bei Untersuchungen auf systemischer Ebene durch die Verbesserung

von bildgebenden und elektrophysiologischen Methoden deutliche Fortschritte erzielt

wurden, gestaltete sich die Aufklärung gestörter zerebraler Entwicklung und Funktion,

verursacht durch die veränderte molekulare Interaktion zwischen einzelnen neuronalen

Zelltypen, als deutlich schwieriger. In-vivo-Arbeiten zu den Ursachen zerebraler

Entwicklungsstörungen umfassten, neben Patientenuntersuchungen, bisher größtenteils

Ratten- oder Mausmodelle und konnten hauptsächlich in Fällen mit deutlichen

morphologischen Veränderungen, wie Mikrozephalien [53], einen Beitrag zur

Ursachenermittlung leisten. Die molekularen Quellen geistiger Behinderung, und vor allem

Epilepsien, hingegen, konnten anhand dieser Modelle nur wenig aufgeklärt werden [11]. Ein

Grund hierfür könnte die deutlich geringere zerebrale Komplexität eines Nagergehirns im

Gegensatz zum menschlichen sein. Neben den strukturellen Unterschieden, z. B. der

geringeren kortikalen Dicke, ist auch die Zusammensetzung der Strukturen mit

verschiedenen Zellsubtypen anders [54]. Da es kaum möglich ist, betroffenes Gewebe in

vitro zu untersuchen, stellen patientenspezifische induzierte pluripotente Stammzellen (iPS)

die momentan beste Alternative dar. Seitdem es Yamanaka und Kollegen 2006 gelungen ist,

durch die exogene Expression eines Sets an Transkriptionsfaktoren somatische Mauszellen

in einen pluripotenten stammzellähnlichen Zustand zurückzuversetzen (zu

Einleitung 11

reprogrammieren), erfuhr die Erforschung monogener Erkrankungen durch den Einsatz

patientenspezifischer iPS eine wahre Revolution [11, 55]. Patientenspezifische iPS bringen

die Hauptvorteile embryonaler Stammzellen mit, ohne die ethischen Bedenken. Sie sind

pluripotent und fähig zur Langzeitregeneration. Durch die immer besser und vielfältiger

werdenden Differenzierungsprotokolle stellen sie somit eine fast unendliche Quelle für

somatische Zellen aller drei Keimblätter dar. Insbesondere die Differenzierung zu

neuronalen Zelllinien wurde hierbei ergiebig erforscht und ermöglicht uns mit einem iPS-

Modell die Auswirkungen geistiger Behinderung in vitro zu untersuchen. Bisher konnte dies

für etliche neurodegenerative und entwicklungsbedingte Erkrankungen des zentralen

Nervensystems angewendet werden. Hierzu zählen unter anderem Morbus Alzheimer [56],

die Parkinson Erkrankung [57] und das Rett-Syndrom [58]. Für nicht-syndromale geistige

Behinderung konnte bisher kein Phänotyp in vitro mittels iPS abgebildet werden.

Grundsätzliches Prinzip der Reprogrammierung ist es, verschiedene Transkriptionsfaktoren

(TF) exogen in einer somatischen Zelle zu exprimieren. Diese Faktoren stoßen epigenetische

Veränderungen an, die es der Zelle ermöglichen, in einen „Genexpressions-Grundzustand“

zurückzukehren, der dem einer Stammzelle ähnelt. Die Erforschung der genauen

Wirkmechanismen sowie der molekularen und zeitlichen Abläufe hierbei präsentiert sich

allerdings bisher als sehr komplex und bedarf weiterer Arbeiten [59]. Es wurden bisher

verschiedene Kombinationen an TF verwendet. Neben den ursprünglichen Faktoren OCT4,

c-MYC, SOX2 und KLF4 wurden einzelne gegen NANOG oder LIN28a ausgetauscht [60].

Gerade der Verzicht auf das Protoonkogen c-MYC wurde hierbei untersucht [61]. Die

Methode konnte bisher für etliche Spezies, unter anderem den Menschen, und

verschiedenste somatische Zelltypen wiederholt werden [62, 63]. Die Verwendung von

peripheren Blutzellen bietet bisher die am wenigsten invasive Möglichkeit,

Patientenmaterial zu verwenden [64], die am häufigsten verwendeten Zellen sind allerdings

immer noch Hautfibroblasten. Für die exogene Expression der Faktoren wurden bisher

verschiedenste Wege genutzt. Die am weitesten verbreitete Methode nutzt ein lentivirales

Vektorsystem, um die Faktoren unter Kontrolle eines retroviralen Promotors persistent in

das Genom zu integrieren. Für die Anwendung der iPS in regenerativen Fragestellungen ist

es notwendig, eine nicht integrative Methode zu wählen. Etliche Ansätze gehen hierbei über

die kontinuierliche Zugabe an mRNA [65] oder die Verwendung von episomalen [66] oder

Sendai-Vektoren [67]. Für Anwendungen im nicht-regenerativen Bereich, wie auch in dieser

12 Einleitung

Arbeit, ist die Verwendung eines lentiviralen Systems die robusteste und günstigste

Variante.

Da die Integration des Vektorsystems und die Expression der TF drastische Eingriffe in die

Zellphysiologie darstellen, kann es häufig zu unbeabsichtigten oder unvollständigen

Veränderungen während der Reprogrammierung kommen. Für komparative Studien ist

deshalb die strikte Qualitätskontrolle der neu erhaltenen Zelllinien an mehreren Punkten

wichtig. Neben der Validierung der Pluripotenz der Zellen müssen auch genetische und

epigenetische Veränderungen überprüft werden. Die Pluripotenz der Zellen wird durch den

Nachweis verschiedener pluripotenzassoziierter Faktoren auf transkriptionaler und

translationaler Ebene überprüft. Die Fähigkeit zur Differenzierung in alle drei Keimblätter,

Mesoderm, Endoderm und Ectoderm, wurde meist über einen Teratom-Assay in Mäusen

überprüft [68]. In neueren Studien werden diese tierschutzrechtlich bedenklichen

Maßnahmen häufig durch die Verwendung eines RNA-Array-basierenden Ansatzes (z. B.

PluriTest) und der in-vitro-Differenzierung in alle drei Richtungen ersetzt [69]. Innerhalb des

PluriTests wird das RNA-Expressionsprofil der neuen iPS-Linie mit einer Datenbank

verschiedener iPS und embryonaler Stammzellen verglichen. Neben der Pluripotenz ist auch

gerade für komparative Studien die Vergleichbarkeit der Patientenlinie mit der Referenzlinie

wichtig. Die genetische Integrität der Zellen wurde anhand Karyotypisierung oder

„comparative genomic hybridization“ (Array-CGH) im Vergleich zum unbehandelten

somatischen Ausgangsmaterial überprüft [61] [70]. Untersuchungen der DNA-

Methylierungsmuster und RNA-Sequenzierungen geben Aufschluss über die epigenetische

Varianz der verschiedenen Linien [59]. Über diese Methoden hinaus sind auch

Standardqualitätskontrollen, wie der Test auf Mycoplasmen-Kontaminationen, wichtig. Die

Integration der verschiedenen TF in das Genom stellt den größten Eingriff in die genomische

Integrität der Zellen dar. Bei der Verwendung des retroviralen Vektorsystems kam es durch

die Mehrzahl an Integrationsereignissen, für jeden Faktor eine Integration, häufig zu

schwereren genomischen Anomalien. Bei Verwendung eines multicistronischen lentiviralen

Vektors der dritten Generation konnte die Stöchiometrie deutlich verbessert werden.

Vektoren dieser Art fehlen alle viralen, proteincodierenden Gene. Durch die starke

Verkürzung der die Transkriptionskasette einfassenden long terminal repeats (LTRs) ist nur

noch die Insertion in das Wirtsgenom, aber keine erneute Exzision mehr möglich. Anhand

der Codonoptimierung der Sequenzen ist eine spezifische Unterscheidung im Nachweis

Einleitung 13

exogener und endogener Faktoren erreichbar. Von diesem Vektor werden alle vier Faktoren

gleichzeitig exprimiert und über selbstschneidende Hydrolase-Schnittstellen vor der

Translation separiert. Darüber hinaus enthält er einen Reporterfarbstoff, der es ermöglicht,

die Expression der TF simultan nachzuverfolgen. Für eine erfolgreiche Reprogrammierung ist

somit nur noch eines anstatt vier Integrationsereignissen notwendig [71]. Epigenetische

Anomalien konnten erfolgreich durch den Einsatz von Histon-Deacetylase-Inhibitoren, wie

Valproinsäure [72] und Ascorbinsäure [73] direkt nach der Transduktion, abgemildert

werden. Trotz der steten Optimierung der Anwendung kommt es immer noch zu deutlichen

Unterschieden zwischen verschiedenen Klonen derselben Reprogrammierung. Besondere

Beachtung stellt deshalb neben der genomischen und epigenetischen Integrität auch die

Vergleichbarkeit zwischen Kontrolle und Patientin sowie den verschiedenen Klonen dar.

Für die regenerative und translationale Medizin, aber auch die Grundlagenforschung

monogener Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), ist die Verwendung von iPS

nur der Startpunkt vieler Studien. Erst die erfolgreiche und reproduzierbare Differenzierung

der Zellen zu einem speziellen adulten, neuronalen Subtyp oder Gewebe ist der Schlüssel

zur Beantwortung vieler Fragestellungen. Die Differenzierung von iPS zu neuronalen Zellen

verlief früher entweder über die Kokultur mit Stromazelllinien oder die Generierung von

„Embryoid Bodies“ (EB), also kleiner embryonaler Körperchen [74, 75]. Beide Methoden sind

allerdings kompliziert, zeitintensiv und uneffektiv, so dass die Variabilität der Ergebnisse

relativ groß ist. In der Erforschung der verschiedenen Differenzierungsmöglichkeiten

konnten jedoch deutliche Fortschritte erzielt werden. Der Trend geht momentan zur

Verwendung eines chemisch definierten Kulturmilieus und zeitlich angepasster Zugabe

sogenannter „small molecules“, neuronaler Induktoren. Diese kleinen Moleküle sind

kosteneffektiv, stabil und reduzieren die experimentelle Variabilität. Darüber hinaus zeigen

sie einen schellen reversiblen, biologischen Effekt, der durch die Variation in Zeitpunkt und

Konzentration einfach anzupassen ist. Die Grundlage neuronaler Differenzierung ist

hauptsächlich ein Wechselspiel aus Aktivierung und Inhibition verschiedener

entwicklungsspezifischer Signalwege, die durch Cytokine, Wachstumsfaktoren und

Epigenetik gesteuert werden [76]. Das steigende Verständnis des Zusammenspiels dieser

Signalwege im Kontext der Differenzierung erlaubt es, gezielter in diese einzugreifen. Etliche

Veröffentlichungen über den Einsatz kleiner Moleküle für die Differenzierung von iPS zu

14 Einleitung

neuronalen Zellen beweisen dies. So zeigt sich der definierte Einsatz der beiden Inhibitoren

SB 431542 und Dorsomorphin, zwei SMAD-Inhibitoren, die den TGF-β/Actvin/Nodal-

Signalweg und den „bone morphongenic pathway“ (BMP) blockieren, als äußert effektiv für

die Differenzierung zu neuronalen Stammzellen [77, 78]. Neuronale Stammzellen können

dann im folgenden Verlauf zu verschiedenen Neuronen und Gliazell-Subtypen mit

verschiedener Regionalisierung differenziert werden. Während der Entwicklung des

zentralen Nervensystems kommt es zu einer Regionalisierung, unter anderem zum

Telencephalon, Mesencephalon und dem Rhombencephalon, unter Kontrolle verschiedener

Faktoren. Die wichtigsten hierbei sind Retinolderivate, fibroblastische Wachstumsfaktoren

(„Fibroblast Growth Factor“, FGF), das Sonic-Hedgehog-Protein und das Wnt-Protein 1 [79].

Die einzelnen Faktoren wirken konzentrations- oder aktivitätsabhängig entlang der

rostro/caudalen bzw. dorsal/ventralen Achsen [80, 81]. Durch gezielten Einsatz und

Kombination der verschiedenen Faktoren soll es möglich sein, spezifische neuronale

Subtypen einer bestimmten Region zu differenzieren. So konnten bisher die verschiedenen

neuronalen Subtypen, dopaminerge-, serotonerge-, GABAerge-, und cholinerge- Neuronen

bzw. Motorneuronen differenziert werden [77, 82-84]. Aber auch die Differenzierung zu

Interneuronen und verschiedene Gliazell-Subtypen, wie Astrocyten und Oligodendrocyten

konnte bereits realisiert werden [85-87]. Auch die Unterscheidung der verschiedenen

neuronalen Subtypen in zerebrale Regionen, wie Prosencephalon [88], Mesencephalon [79]

oder Rhombencephalon [89] konnte schon verwirklicht werden.

Dank der immer größeren Anzahl definierter und effektiver Differenzierungsprotokolle

konnten immer mehr Forschergruppen neurodegenerative Erkrankungen und Störungen

während der ZNS-Entwicklung in vitro untersuchen. Mesencephalische dopaminerge

Neuronen konnten bisher schon für die in vitro- und in vivo-Untersuchungen von Parkinson

eingesetzt werden [90, 91]. Darüber hinaus konnten etliche andere neurodegenerative

Erkrankungen, wie Alzheimer [56], Huntington [92] oder spinale Muskelatrophie [93] mittels

aus iPS differenzierter Neuronen untersucht werden.

Die molekularen Ursachen geistiger Entwicklungsstörungen hingegen wurden bisher

deutlich weniger intensiv mittels iPS erforscht. Trotzdem konnten erste Erfolge z. B. für das

Rett-Syndrom [94] oder das Fragiles-X-Syndrom-assoziiertes-Tremor/Ataxia-Syndrom

(FXTAS) [95] gezeigt werden. IPS-basierte Untersuchungen zum West-Syndrom wurden noch

gar nicht unternommen. Das Dravet-Syndrom ist das bisher untersuchte Syndrom mit der

Einleitung 15

größten Phänotypüberschneidung. Es zeichnet sich durch eine schwere und maligne Form

frühkindlicher myokloner Epilepsien, häufig begleitet durch geistige Behinderung, aus und

wird oft durch Mutationen im SCN1A-Gen verursacht. Studien an patientenspezifischen

GABAergen prosencephalischen Neuronen konnten hierbei zeigen, dass diese verminderte

Aktionspotentiale unter starken depolarisierenden Impulsen [96] sowie eine erhöhte Anzahl

an Natriumkanälen und Übererregbarkeit aufwiesen [95]. Diese Eigenschaften ermöglichen

es, die Zellen als ein Modell für die Wirkstoffsuche personalisierter antikonvulsiver

Therapien einzusetzen [97]. Mitarbeitern des Labors von Jürgen Knoblich gelang es mittels

zerebraler Organoide, die gestörte unreife Neurogenese von CDK5RAP2-abhängiger

Mikrozephalie in vitro abzubilden und konnten somit den Wert der Verwendung

dreidimensionaler Organoide zur verbesserten Annäherung an physiologische Bedingungen

beweisen [98]. Gerade die Erforschung komplexer Erkrankungen, wie geistiger Behinderung

oder Epilepsien, könnte durch die Verwendung zerebraler Organoide große Fortschritte

erzielen.

1.4 Embryonale Neurogenese

Um die Ursachen geistiger Entwicklungsstörung in vitro untersuchen zu können, ist es

notwendig, die basalen Abläufe während der embryonalen Entwicklung und Neurogenese

zu verstehen. Für das weitere Verständnis soll hier deshalb ein kurzer Überblick über

Gastrulation, Neuralrohrbildung und Neurogenese des humanen Kortexes gegeben werden.

Während der Embryogenese kommt es nach der Bildung der Blastocyste zur Einstülpung

und Entwicklung der drei Keimblätter, dieser Vorgang wird als Gastrulation bezeichnet

(Verlauf während der Embryogenese zwischen Tag E 13-20). Hierbei liegt das Endoderm

innen, in der Mitte das Mesoderm und die äußerste Schicht bildet das Ectoderm (Abb. 1.2A).

Aus dem äußersten, dorsalsten Teil, dem Neuroectoderm, entwickelt sich die Neuralplatte

aus der sich das Neuralrohr und schließlich das zentrale Nervensystem bilden (E 21-29). Aus

den ventralsten ectodermalen Zellen bilden sich Zellen der Neuralleiste, aus denen sich das

periphere Nervensystem bildet. Die Polarisierung des Neuralrohres wird durch einen

ventralen Sonic-Hedgehog (SHH) und einen dorsalen BMP-Konzentrationsgradienten

verursacht (Abb. 1.2B).

16 Einleitung

Abbildung 1.2: Gastrulation und Neuralrohrbildung (A) Gastrulation: Aus der Blastocyste bildet sich das Ectoderm (gelb) Endoderm (grün) und Mesoderm (im Zwischenraum) heraus. (B) Der Initialschritt der Bildung des Neuralrohres (Querschnitt aus A) ist die Bildung des Notochords (rot). Aus dem in dorsal (lila) und ventral (magenta) polarisierten Neuralrohr bildet sich das zentrale Nervensystem und aus den ventralsten Zellen des Ectoderms bilden sich die Zellen der Neuralleiste (blau), aus denen das periphere Nervensystem entsteht. Frei adaptiert nach [99].

Kurz vor Schließung des Neuralrohres bilden sich im anterioren Teil die drei Hauptvesikel

des späteren humanen Gehirns, Prosencephalon, Mesencephalon, Rhombencephalon. Der

posteriore Teil entwickelt sich zum Rückenmark. Aus dem Prosencephalon entwickelt sich

das Vorderhirn. Zunächst stülpen sich hieraus neben dem Diencephalon die

telencephalischen Ventrikel heraus, aus deren dorsalsten Teilen sich wiederum der

zerebrale Kortex entwickelt (zusammengefasst u.a. von [99]). Der humane Neokortex, der

den größten Teil des humanen Kortexes ausmacht, besteht im adulten Zustand aus sechs

distinkten Neuronenschichten. In diesem frühen Stadium liegt aber zunächst nur eine dünne

Schicht neuroectodermaler Zellen vor, die die dorsale Wand der Ventrikel bilden. Diese

erste Schicht wird ventrikuläre Zone (VZ) genannt. Aus diesen neuroectodermalen Zellen

bilden sich über asymmetrische Zellteilung die radialen Gliazellen (RG), die ersten

neuronalen Stammzellen. Diese ordnen sich nebeneinander an und bilden so die

Röhrenform des Neuralrohres. Dieses Verhalten führt bei RGs in vitro zum typischen

Wachstum in Rosettenform. Diese Schicht mitotischer neuronaler Stammzellen ist viel zu

gering, um die Masse an post-mitotischen Neuronen des adulten Gehirns zu produzieren,

weshalb es zunächst zu einer symmetrischen Vervielfältigung des Stammzellpools kommt (E

25-42). Während dieser teilungsreichen Phase kommt es neben der Anreicherung an RGs

auch zur asymmetrischen Teilung zu intermediären neuronalen Stammzellen (IPC) und

äußeren radialen Gliazellen (oRG) [100, 101]. Die IPC migrieren dorsal entlang der RGs und

bilden über ihnen die subventrikuläre Zone (SVZ). Die oRGs bilden die darüber liegende,

äußere subventrikuläre Zone (OSVZ). Beide Zellpopulationen sind in einem geringeren

Einleitung 17

Ausmaß als RGs zur symmetrischen Zellteilung fähig, hauptsächlich potenzieren sie aber die

Anzahl an Neuronen über asymmetrische oder sogar symmetrische Zellteilung [102] (Abb.

1.3). Die „intermediate progenitor Hypothese“ postuliert, dass die Menge an IPC mit der

evolutionären Expansion des Kortexes in gyrencephalischen Säugern einhergeht [103]. Die

ersten Neuronen migrieren entlang der radialen Gilazellen und bilden die „Preplate“ (PP),

die sich später in die obere Marginalzone (SMZ) und tiefere Subplatte (SP) aufspaltet.

Anschließend folgt die Bildung der spezifischen Projektionsneuronen (PN), welche die sechs

distinkten kortikalen Schichten (Lamina) bilden. Diese werden in überlappenden Wellen

nach einem strengen temporalen Muster von innen nach außen gebildet [104].

Abbildung 1.3: Entwicklung des humanen Kortex. Bildung des polarisierten Neuralrohres zwischen Tag 19 und 29 der embryonalen Entwicklung (E 19-29). Ectoderm (gelb), Endoderm (grün), Neuralleiste (blau), Neuralrohr (lila/magenta). Regionalisierung des Neuralrohres zu Telencephalon, Diencephalon, Mesencephalon und Rhombencephalon bis Tag 49 der embryonalen Entwicklung (E 27-49). Aufbau der kortikalen Schichten ab Tag 42 der embryonalen Entwicklung. Neuroectodermale Zellen (grün) teilen sich zu neuronalen Stammzellen. Zunächst zu radialen Gliazellen (blau), die die ventrikuläre Zone (VZ) bilden. Aus den radialen Gliazellen entwickeln sich über asymmetrische Zellteilung die intermediären neuronalen Stammzellen (orange), die in die subventrikuläre Zone (SVZ) migrieren und die äußeren radialen Gliazellen (türkis), die in die äußere SVZ migrieren. Alle drei Stammzellpopulationen tragen über asymmetrische und symmetrische Zellteilung zum Aufbau des neuronalen Zellpools (rot) bei. Im humanen adulten Gehirn besteht der Neokortex aus sechs distinkten Schichten (Lamina), die während der embryonalen Neurogenese in aufeinanderfolgenden Wellen von innen nach außen gebildet werden. Frei adaptiert nach [99, 105] [88].

Somit werden die Neuronen der Schicht VI zuerst gebildet, die der Schicht I zuletzt. Die

ersten PNs sind corticothalamische Projektionsneuronen und regulieren die Spaltung der PP.

Sie unterstützen sowohl die Migration der folgenden PNs, und somit die korrekte

Laminierung, als auch die Leitung der Axone der callosalen PNs über die Mittellinie, um das

Corpus Callosum zu bilden [106, 107]. Diese PNs sind TBR1-positiv und werden über eine

Kaskade aus radialen Gliazellen direkt aus den intermediären Stammzellen (IPC) gebildet

[108].

18 Ergebnisse

2. Ergebnisse

Grundlage dieser Forschungsarbeiten bildeten vier Patienten einer konsanguinen

palästinensischen Familie, die an einer schweren Form des West-Syndroms leiden. Die

Symptome dieses Syndroms sind frühinfantile epileptische Anfälle und eine geistige

Entwicklung, die im Bereich einer schweren geistigen Behinderung liegt. Bei allen vier

Patienten konnte die Basensubstitution c958G>C im ST3GAL3-Gen festgestellt werden, die

den Aminosäureaustausch p.320A>P in der CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-

galactosid-alpha-2,3-sialyltransferase verursacht [3](Abb. 2.6). Um die Auswirkungen und

somit die molekulare Ursache der Mutation genauer untersuchen zu können, wurde ein

patientenspezifisches in-vitro-Modell aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS)

etabliert. Patientenspezifische iPS bildeten hierbei mit ihrer Fähigkeit zur

Langzeitregeneration und der Möglichkeit, sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren,

eine nahezu unendliche Quelle für fast jedes reife humane Gewebe. Innerhalb dieser Arbeit

wurden Fibroblasten eines gesunden Geschwisterkindes zu iPS reprogrammiert und konnten

somit als Referenzlinie für eine bestehende Patienten-iPS-Linie genutzt werden. Dem

Phänotyp der Patientinen entsprechend wurde eine Differenzierung nach dem Protokoll von

Yichen Shi et al., zu Kortexneuronen etabliert [112]. Einer der Vorteile dieses

Differenzierungsprotokolls ist, dass die Zellen wichtige Stadien der embryonalen

Neurogenese in vitro nachbilden. So war es nicht nur möglich, die stationären Auswirkungen

der Mutation innerhalb einer Zellpopulation zu untersuchen, sondern auch die temporär

innerhalb der Entwicklung auftretenden Unterschiede. Die so etablierten Zelllinien wurden

als Fibroblasten, als iPS und während der kortikalen Entwicklung an den Tagen 12, 30, 35, 50

und 90 näher untersucht.

2.1 Subzellulare Lokalisierung verschiedener ST3GAL3 Mutationsvarianten

Die CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-sialyltransferase umfasst

eine Transmembrandomäne sowie vier Sialylmotive L (large), S (small), 3 und VS (very small)

(Abb. 2.1) und ist im Wildtypteil der Membran des Golgi-Apparates. Bisher sind drei

verschiedene Mutationsvarianten im ST3GAL3-Gen bekannt. Die Mutationen in der

Transmembrandomäne (p.Ala13Asp; TMD) sowie im C-terminalen Bereich (p.Asp370Tyr;

Ergebnisse 19

CD) verursachen eine schwere geistige Behinderung. Die Mutation im Sialylmotiv-S

(p.Ala320Pro) unseres Patientinen verursacht darüber hinaus starke epileptische Anfälle. In

vorhergehenden funktionellen Untersuchungen der drei Mutationsvarianten konnte mittels

eines radioaktiven in-vitro-Aktivitätsassays gezeigt werden, dass die TMD-Mutante eine

ähnliche enzymatische Aktivität wie das Wildtypenzym aufwies. Sowohl die CD-Mutante als

auch die Sialylmotiv-S-Mutante zeigten hingegen einen vollständigen Verlust der

enzymatischen Aktivität. Überexpression von c-Myc-fusionierten TMD- und CD-

Mutationsvarianten in LMTK--Zellen zeigten eine gestörte subzellulare Lokalisierung [5]. Die

bis dahin nicht erfolgte Untersuchung der subzellularen Lokalisierung der Sialylmotiv-S-

Mutationsvariante wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt.

2.1.1 Quick Change Mutagenese von pST3GAL3wt zu pST3GAL3A320P

Für eine Überexpression der Sialylmotiv-S-Mutationsvariante musste zunächst ein

Expressionsvektor mit einem ST3GAL3A320P-c-Myc-Fusionsprotein erstellt werden. Als

Ausgangsvektor wurde hierfür der pST3GAL3wt-c-Myc-Vektor verwendet (freundlicherweise

von Prof. Dr. Gerardy-Schahn zur Verfügung gestellt; Vektorkarte: siehe Anhang Abbildung

31-35 und Tabelle 8). Das Rückgrat dieses Vektors bildete der pcDNA3.1/myc-hisA-Vektor

von Invitrogen, in den die Volllängen-cDNA der Isoform B1 (accession no. NM_006279.2)

über XbaI/NotI eingefügt wurde. Für die Einführung der Basensubstitution an der Position

c.958 von G zu C wurde eine ortsspezifische Mutagenese mit dem unter 4.2.7

beschriebenen Kit der Firma Agilent Technologies durchgeführt. Das hierfür entworfene

Primerpaar (siehe 4.1.3) band an derselben Stelle im Vektor auf dem jeweils

komplementären Strang. Die einzelnen Primer waren 31 Basen lang, hatten eine

Schmelztemperatur von 80.2 °C, einen GC-Gehalt von 58 % und trugen mittig die

einzuführende Basensubstitution (rot markiert) GACGAGGTGGCAGTCCCAGGATTTGGCTATG

/CATAGCCAAATCCTGGGACTGCCACCTCGTC. Es wurden mehrere Proben mit einer

Verdünnungsreihe des Ausgangsplasmides von 50, 20, und 10 ng/50 µl angesetzt. Zu jedem

Ansatz wurden jeweils 125 ng der Primer (12.2 µl) gegeben. Jeweils eine Kolonie von jeder

Plasmidverdünnung wurde anschließend selektiert und angezogen. Jeweils von 2,5 ml der

Kultur wurde eine Plasmid Mini Isolation nach 4.2.5 durchgeführt, die anderen 2,5 ml

wurden als Glycerinkulturen nach 4.2.4 bei -80 °C konserviert. Anhand einer Sanger-

Sequenzierung des zu mutierenden Bereiches (siehe 4.1.9) von jedem isolierten Plasmid und

20 Ergebnisse

dem Ausgangsplasmid konnte eine erfolgreiche Basensubstitution innerhalb des

Fusionsproteins für die Plasmide der Plasmidverdünnung von 10 und 20 ng/50 µl

nachgewiesen werden. Das isolierte Plasmid der 50 ng/50 µl Plasmidverdünnung zeigte den

gleichen Genotyp wie das Wildtyp Plasmid (Abb. 2.1). Die dafür verwendeten Primer sind

unter 4.1.3 aufgeführt.

Abbildung 2.1: Mutationsvalidierung. Sequenzchromatogramme der ausgewählten Quick-Change-Mutageneseklone. Jeweils einmal des Wildtyps und der Ansätze mit 10, 20 und 50 ng Plasmid. Der zu mutierende Bereich ist mit einem Pfeil markiert.

2.1.2 Subzellulare Lokalisierung der exogen exprimierten ST3GAL3-Varianten

Die subzellulare Lokalisierung der ST3GAL3-Sialylmotiv-S-Mutationsvariante wurde anhand

einer Überexpression in LMTK--Zellen untersucht. LMTK--Zellen sind immortalisierte Maus

Fibroblasten und besonders für die Überexpression von Proteinen geeignet, da sie 5-Bromo-

2‘-deoxyuridine-resistent, Thymidinkinase-mangelhaft und Histonacetyltransferase-sensitiv

sind. Die Transfektion und Überexpression aller Mutationsvarianten und des Wildtypenzyms

erfolgte wie unter 4.4.7.2 mit Hilfe von Lipofectamin. Es wurden von allen

Mutationsvarianten und vom Wildtypplasmid ein Gemisch aus 500 ng Plasmid und 500 ng

Leervektor verwendet. Die verwendeten Plasmidmengen wurden vorher austitriert, um eine

zu starke Expression der Fusionsproteine zu vermeiden. Hierbei wurden Mengen zwischen

100 ng Plasmid bis zu 1 µg Plasmid verwendet. Die transfizierten Zellen wurden für 72 h

Ergebnisse 21

inkubiert und anschließend fixiert. Die so erhaltenen fixierten Zellen wurden genutzt, um die

subzellulare Lokalisierung der Fusionsproteine zu ermitteln. Anhand einer

Immunfluoreszenzfärbung des c-MYC-Epitopes bei gleichzeitiger Färbung des Golgimarkers

Giantin konnten sowohl die bisherigen Ergebnisse für das Wildtyp Enzym als auch für die

TMD- und die CD-Mutationsvarianten bestätigt werden (Durchführung siehe 4.7.7 und

4.7.1) [3]. Das c-Myc-Signal für das Wildtypfusionsprotein überlappte vollständig mit dem

Giantin-Signal und zeigte so die natürliche Golgi-Lokalisierung des Enzyms. Die Signale der c-

Myc-Färbungen der TMD- und CD-Mutationsvarianten zeigten keine spezifische

Überlappung mit dem Giantin-Signal. Das Signal der TMD-Variante zeigte Ähnlichkeiten zu

einem ER-Signalmuster, wohingegen das Signal der CD-Variante im ganzen Zytoplasma

verteilt zu sein schien. Das c-MYC-Signal der Sialylmotiv-S-Mutationsvariante zeigte

ebenfalls keine spezifische Überlappung mit dem des Golgimarkers (Abb. 2.2). Eine gestörte

subzellulare Lokalisierung des ST3GAL3-Enzyms konnte somit auch für die Sialylmotiv-S-

Mutationsvariante nachgewiesen werden.

Abbildung 2.2: ST3GAL3-Lokalisierung. Immunfluoreszenzbilder der exogenen Expression verschiedenener ST3GAL3-Mutationsvarianten in LMTK

--Zellen. Analysiert wurde das ST3GAL3-Myc-Fusionsprotein mit einem c-Myc-tag-Antikörper

(ac-MYC, Sigma-Aldrich, M4439, 1:1000) und der Golgi Apparat mit einem Giantin-Antikörper (aGia, Covance, PRB-114C, 1:1000).

2.1.3 Endogene ST3GAL3-Lokalisierung

Um die endogene Expression und die Lokalisierung der ST3GAL3 in den Patientenzellen zu

untersuchen, wurden drei verschiedene Antikörper gegen verschiedene ST3GAL3-Epitope

22 Ergebnisse

getestet. Die Färbungen wurden mit den Referenz iPS-Zelllinien HD2 und ASC23, HEK und

Myoblasten nach dem unter 4.7.7 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Es wurden zwei

polyklonale Antikörper (ST3 und ST3S) und ein monoklonaler Antikörper (ST3M) getestet.

Alle drei Antikörper hatten den Isotyp IgG und stammten aus dem Kaninchen. Das Epitop

des Antikörpers ST3 liegt am c-terminalen Ende des Enzyms und umfasste die Sialylmotive 3

und VS. Das Epitop des Antikörpers ST3M liegt mittig im Enzym und umfasste das Sialylmotiv

L. Das Epitop des Antikörpers ST3 umfasste das gleiche Epitop wie der Antikörper ST3M,

außer dem Sialylmotiv L (Abb. 2.3).

Abbildung 2.3: Bindungsepitope der ST3GAL3-Antikörper. Schematische Darstellung des ST3GAL3-Proteins und der Epitope (ST3, ST3S und ST3M). Grün: Transmembrandomäne, gelb: Sialylmotive von links nach rechts large (L), small (S) und Domäne 3.

Für alle Antikörper wurden verschiedene Verdünnungen ausgetestet. Für keinen der

Antikörper konnte ein spezifisches Signal detektiert werden.

2.2 Etablierung patientenspezifischer iPS

Für die Erforschung von entwicklungsneurobiologischen Erkrankungen gibt es bisher wenige

Modelle, die eine realitätsnahe Untersuchung ermöglichen. Um diese Engpässe etwas zu

erweitern, kann man durch die exogene Expression von einem Set an Transkriptionsfaktoren

Patientenzellen zu induzierten pluripotente Stammzellen (iPS) reprogrammieren [63] [61].

Erfolgreich reprogrammierte iPS können dann in späteren Experimenten sowohl zu

neuronalen Stammzellen als auch adulten Neuronen differenziert werden und so als

patienten-spezifisches in-vitro-Modell genutzt werden, welches auch die Untersuchung von

Entwicklungsstörungen zulässt. Um die Vorteile dieses Modells nutzen zu können, wurden

deshalb patientenspezifische iPS etabliert. Zur besseren Übersichtlichkeit wurde der

schematische Ablauf dieser Methode zusammengefasst (Abb. 2.4).

Für die Etablierung der iPS dienten Fibroblasten der Patientin (4695) und des gesunden

Geschwisterkindes (4696) als Ausgangsmaterial (Abb. 2.6). Für die Reprogrammierung der

Zellen wurde ein lentivirales Vektorsystem genutzt, das die persistente Integration der vier

H2N COOH

ST3S

ST3M

ST3

p.Ala320Pro

Ergebnisse 23

Yamanaka Faktoren erlaubt. Die erfolgreiche Expression der Transkriptionsfaktoren konnte

anhand der Expression eines Reporterfarbstoffes (dTomato) überprüft werden. Ab Tag 20

nach der Transduktion waren stammzellähnliche Kolonien erkennbar und konnten manuell

selektiert werden.

Abbildung 2.4: Schematischer Ablauf einer Reprogrammierung. Transfektion von HEK-293-Zellen mit dem lentiviralen Transfervektor (p4in1), der für die vier Reprogrammierungsfaktoren und einen Reporterfarbstoff codiert sowie drei Hilfsvektoren (pg_p.4xCTE, pMD2.G, pRSV-Rev), die für die Verpackungsproteine, die reverse Polymerase und einen Transkriptionsfaktor codieren. Nach der Viruspartikelisolation wurden Primärfibroblasten (30.000/cm

2) mit diesen

transduziert (MOI 0.25). Nach 8 Tagen Inkubationszeit Passage auf Feederzellen (MEF). Um Tag 21 manuelle Selektion und Expansion der ersten stammzellähnlichen Kolonien.

Um eine geeignete Referenzzelllinie zu der Patientenlinie ΔSt3Gal3 nutzen zu können,

wurden Hautfibroblasten des weiblichen Geschwisterkindes 4696, im weiteren AS genannt,

für eine Reprogrammierung verwendet. Dieses Geschwisterkind ist homozygot für den

Wildtyp des ST3GAL3-Gens [3]. Kernstück des hierbei verwendeten Protokolls bildete das

unter 4.5 beschriebene multicistronische lentivirale Vektorsystem. Für die

Viruspartikelproduktion wurden zunächst HEK-293-Zellen mit den unter 4.5 beschriebenen

Vektoren (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Axel Schambach) mit Hilfe

der unter 4.5.1 beschriebenen Calcium-Chlorid Methode transfiziert. Die

viruspartikelhaltigen Überstände wurden nach 36 h und 48 h entnommen und bei - 80 °C

kryokonserviert. Die Konzentration der Viruspartikel wurde anhand der unter 4.5.2

beschriebenen Virustiterbestimmung ermittelt. Es wurden hierfür HT1080-Zellen

verwendet. Diese humane fibroblastische Zelllinie stammt aus einem Fibrosarcoma und

wurde gewählt, da sie sich ähnlich zu den in der Reprogrammierung verwendeten primären

24 Ergebnisse

Hautfibroblasten verhält. Für die Titration wurden Verdünnungsreihen von 0, 0.3, 1, 3, 9 und

27 µl Viruspartikelkonzentrat in Dubletten verwendet. Die Menge der transfizierten Zellen

konnte anschließend über eine FACS-Analyse der dTomato-Reporterfarbstoff-

exprimierenden Zellen bestimmt werden.

Es wurden zwei Gefäße einer Mikrotiterplatte mit 6 Kavitäten mit je 30.000 AS-

Fibroblasten/cm2 der Passage 3 wie unter 4.5.3 reprogrammiert. Für die Transduktion der

AS-Zellen wurden Viruspartikel mit 470.000 IU/ml und einer MOI von 0,25 verwendet. Dies

ergab ein Volumen von 28 µl Viruspartikelkonzentrat pro 30.000 Zellen. Es wurde eine

„Spininoculation“ durchgeführt. Nach der Transduktion waren die Auswirkungen der

Expression der vier Transkriptionsfaktoren anhand von morphologischen Veränderungen bei

etlichen Zellen beobachtbar. Um Tag 13 der Reprogrammierung veränderten sich etliche

Zellen weg von der typischen, spindelförmigen Morphologie der Ausgangsfibroblasten. Viele

Zellen wiesen einen vergrößerten Zellkern und eine runde, stammzellähnliche Form auf.

Zellen, die die Transfektionskassette mit den vier Transkriptionsfaktoren integriert hatten,

konnten unter dem Fluoreszenzmikroskop im roten Kanal (Extinktion 530 - 560 nm) anhand

der Expression des Reporterfarbstoffes dTomato identifiziert werden. Viele dieser ersten

morphologisch veränderten Zellen proliferierten weiter und fingen an, kleine Kolonien zu

bilden, die sich im weiteren Verlauf zu größeren stammzellähnlichen Kolonien entwickelten.

Wichtige Charakteristika hierbei waren ein großer Zellkern, koloniales Wachstum in

Wabenstruktur und ein runder Zellkörper. Die stark proliferierenden Kolonien waren hierbei

von einer Vielzahl toter Zellen bedeckt. Ab einer Größe von ca. 150 µm, beziehungsweise

zwischen Tag 20 und Tag 25 der Reprogrammierung, wurden insgesamt 42 Klone manuell

selektiert. Es wurden einzelne Klone unterschiedlicher Größe und

Wachstumsgeschwindigkeit selektiert. Von diesen 42 Klonen konnten insgesamt 12 Klone

(3, 4, 11, 13, 20, 23, 24, 28, 31, 33, 39, 40) vereinzelt expandiert werden, bis genügend

Zellmasse vorhanden war, um, wie unter 4.4.6 beschrieben, mindestens vier

kryokonservierte Aliquote von jedem Klon anzulegen. Nach dem 25. Tag der

Reprogrammierung konnte das Signal des Reporterfarbstoffes dTomato in den Zellen nicht

mehr detektiert werden. Dies deutet auf ein episomales Silencing der Transkriptionskassette

hin (Abb. 2.5).

Ergebnisse 25

Abbildung 2.5: Morphologische Veränderungen während einer Reprogrammierung nach der persistenten Transduktion eines multicistronsichen lentiviralen Vektors. Dieser trägt die vier für die Reprogrammierung notwendigen Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC sowie einen Reporterfarbstoff (dTomato). Dargestellt sind Durchlichtbilder von Hautfibroblasten eines gesunden Geschwisterkindes zur ΔSt3Gal-3-Patientin, vor und 13, 18 und 25 Tage nach der Transduktion, kombiniert mit dem dTomato-Signal. Deutlich erkennbar war die Veränderung von einzeln wachsenden, spindelförmigen Zellen mit kleinem Zellkern hin zu runden Zellkörpern, großen Zellkernen sowie hin zu einem Wachstum in Kolonien. Auffällig ist der Rückgang des Reporterfarbstoffsignal und somit das Umschalten von exogener zu endogener Expression der Transkriptionsfaktoren.

2.2.1 Mutationsvalidierung der Patienten-iPS-Zelllinie ΔSt3Gal-3

Primäre Fibroblasten der Patientin 4695 wurden, durch das oben beschriebenes Protokoll

von unserem Kooperationspartner Dr. Dirk Hoffman vom Institut für experimentelle

Hämatologie der Medizinischen Hochschule Hannover, reprogrammiert. Für diese Arbeiten

wurden Fibroblasten einer Hautbiopsie der Patientin 4695 verwendet, die die Mutation

c958G>C im ST3GAL3-Gen homozygot tragen soll. Um die Identität dieser neu entstandenen

iPS-Linie (im weiteren ΔSt3Gal-3 genannt) zu überprüfen, wurde aus ihr, wie unter 4.1.4.1

beschrieben, genomische DNA isoliert. Anschließend wurde diese DNA für eine Sanger-

Sequenzierung des Exon 12 des ST3GAL3-Gens, der den mutierten Bereich umfassen soll,

aufbereitet. Die hierfür verwendeten Primer und Anweisungen wurden unter 4.1.3 und

4.1.9 beschrieben. Als Referenz wurde genomische DNA eines gesunden Blutspenders

verwendet. Mit Hilfe der MutationSurveyor-V3.23-Software (GATC BioTech AG, Konstanz)

konnten die Chromatogramme der Patienten-DNA mit der des gesunden Blutspenders

verglichen werden und so die homozygote Mutation im ST3GAL3-Gen für die ΔSt3Gal-3-

Linie bestätigt werden (Abb. 2.6).

26 Ergebnisse

Abbildung 2.6: (A) Vereinfachter Stammbaum der Familie der Patientin, gefüllte Symbole kennzeichnen Patienten. Chromatogramme eines Teils des Exon 12 von ST3GAL3 (B) eines Blutspenders und (C) des Patienten 4695. Das mutierte Basenpaar ist rot eingerahmt.

2.2.2 Validierung der Pluripotenz von drei verschiedenen iPS-Linien

Neben den angestrebten Veränderungen auf episomaler, translationaler und

morphologischer Ebene durch die persistente Integration der Transkriptionskassette in das

Wirtsgenom, können durch diesen gravierenden Eingriff auch anomale Veränderungen, wie

genomische Aberrationen und Insertionen oder Deletionen, auftreten. Um die Eignung der

gewonnenen iPS-Linien als komparables in-vitro-Modell zu überprüfen, wurden je ein Klon

der ΔSt3Gal-3, AS (ASC23) sowie einer weiteren Referenzzelllinie HD2 näher charakterisiert.

Die Pluripotenz der verwendeten Zelllinien wurde über q-RT-PCR einer Auswahl an

Pluripotenzmarkern sowie Immunfluoreszenzfärbungen nachgewiesen. Es wurden Array-

CGH sowie geschachtelte integrative PCRs mit Fusionsprimern durchgeführt, um die

genomische Integrität und den genauen Integrationsort der Kassette zu verifizieren.

Darüber hinaus wurde eine Sequenzierung der Gesamt-RNA aus den Stammzellen aller drei

Klone über die SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform sowie eine anschließende

Hauptkomponentenanalyse durchgeführt.

Ergebnisse 27

2.2.2.1 Quantitative PCR

Die Quantifizierung der mRNA-Expressionsintensität der Pluripotenzmarker wurde über die

quantitative Echtzeit-PCR, kurz q-RT-PCR nach 4.1.8.1 ermittelt. Als Plattform wurde ein

Light Cycler 480 und der Roche SYBR Green I Mastermix, beides von der Firma Roche (Basel,

Schweiz) genutzt. Es wurden die Pluripotenzmarker OCT3/4 (POU5F1), NANOG, SOX2, LIN28,

REX1 und PODXL für die Quantifizierung ausgewählt. Die hierfür verwendeten Primer, siehe

4.1.3, wurden Exon-Exon überspannend entworfen, um die Amplifikation genomischer

Bereiche auszuschließen. Als Referenzgene wurden für jede Probe die Gene ACTB und

GAPDH mitgemessen. Die RNA für diese Experimente wurde entweder über das TriZOL-

(4.1.4.4) oder das TriSpin-Protokoll (4.1.4.5) isoliert. Für die cDNA-Synthese wurden je

Ansatz 250 ng Gesamt-RNA eingesetzt. Geht man von einer vollständigen, reversen

Transkription aus, so wurden in der q-RT-PCR je Reaktion 12,5 ng cDNA eingesetzt. Jede

Probe und jedes Gen wurde in Dubletten oder Triplikaten gemessen. Die Auswertung

erfolgte anhand der ΔΔCt-Methode. Hierbei wurden die für jedes Gen erhaltenen Ct-Werte

zunächst gegen die interne Kontrolle, also die Referenzgene, verglichen:

. Danach wurde der FoldChange, also das Ausmaß der

Expressionsveränderung, dieser Gene von iPS im Vergleich zu den dazugehörigen

Fibroblasten als berechnet. In allen iPS-Linien konnte ein deutlicher Anstieg der

Expression der Pluripotenzmarker, variierend von einem 75-fachen Anstieg (NANOG in HD2)

bis zu einem 14.400-fachen Anstieg (OCT3/4 in ΔSt3Gal-3), nachgewiesen werden (Abb. 2.7).

28 Ergebnisse

A

B

Abbildung 2.7: Expressionsänderung der Pluripotenzmarker. (A) q-RT-PCR-Daten zur Expression von sechs Pluripotenzmarkern (LIN28a, NANOG, OCT3/4, PODXL, REX1 und SOX2), jeweils von der Referenzlinie (HD2), der gesunden Geschwisterkind- (ASC23) und der Patienten- (ΔSt3Gal-3) Zelllinie. Dargestellt ist der Anstieg der Expression der Marker in iPS, wobei die Expression in den korrespondierenden Fibroblasten als Bezugsgröße gewählt wurde. Die Stichprobenvarianz der einzelnen Marker wird als Fehlerbalken dargestellt. (B) RNA-Sequenzierungsdaten in „reads per kilobase per million“ wichtiger Pluripotenzmarker (PODXL, LIN28a, DNMT3B, SOX2, OCT4, MYC, NANOG) und Marker der Linien Mesoderm (T), Endoderm (SOX17) und Ectoderm (PAX6), jeweils von embryonalen Stammzellen (hES), zwei iPS-Referenzlinien (HD2, ASC23) und der Patientenlinie ΔSt3Gal-3.

Auffällig hierbei war, dass die Expression der Markergene in den Linien ΔSt3Gal-3 und ASC23

vergleichbar hohe Werte erreichte. Im Vergleich dazu lagen die insgesamt erreichten

Expressionswerte der Markergene bei der Linie HD2 deutlich darunter (Abb. 2.7). Diese

Ergebnisse scheinen mit der Passagenzahl sowohl zum Zeitpunkt der RNA-Isolation als auch

ihrer klonalen Einzigartigkeit zu korrelieren. Während die Linien ΔSt3Gal-3 und ASC23 mit

einer Passagenzahl von 36 und 16 relativ jung waren, waren die der Linie HD2 hingegen mit

einer Passagenzahl von 50 deutlich älter. Vergleiche von Ergebnissen der RNA-

Ergebnisse 29

Sequenzierung (siehe 4.1.11) der beiden Referenzlinien (HD2, ASC23) und der Patientenlinie

(ΔSt3Gal-3) mit embryonalen Stammzellen zeigen, dass sich die Expressionsintensität der

Pluripotenzmarker der iPS in der gleichen Größenordnung bewegt wie die der embryonalen

Stammzellen (Abb. 2.7B) (Detaillierte Betrachtung der RNA-Sequenzierungsergebnisse unter

2.4.2).

2.2.2.2 Immunfluoreszenzfärbung

Die Pluripotenzmarker OCT3/4 und SSEA4 wurden über eine Immunfluoreszenzfärbung in

den iPS-Linien nachgewiesen. OCT3/4 ist ein Transkriptionsfaktor, das Signal aus der IFF

hierfür wurde deshalb im Zellkern erwartet. SSEA4 hingegen ist ein Zuckerepitop auf

Glycolipiden, das Signal wurde deshalb auf der Oberfläche der Zellen erwartet. Zellen von

allen drei Linien wurden auf Mausfibroblasten und Deckgläschen kultiviert und anschließend

mit einer 4 % Paraformaldehydlösung fixiert (siehe 4.7.6). Die Zellen konnten dann mit

spezifischen Antikörpern markiert werden und diese dann mit fluoreszenzmarkierten

Sekundärantikörpern detektiert werden (4.7.7). Es wurden Primärantikörper gegen Epitope

des Transkriptionsfaktors OCT3/4 und das Oberflächenglycosid SSEA4 verwendet. Als

Sekundärantikörper konnte der Alexa-444-markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet

werden (siehe 4.7.1). Das Einbettmedium enthielt den in die DNA interkalierenden Farbstoff

DAPI. Der Farbstoff gibt Signale innerhalb der Zellkerne, weshalb die Lokalisierung der

markierten Epitope näher eingegrenzt werden konnte. Die Färbungen zeigten für alle drei

Zelllinien deutliche Signale. Sowohl für die OCT3/4-Färbung, als auch die SSEA4-Färbung.

Das Signal des Transkriptionsfaktors überlappte vollständig mit dem DAPI-Signal im Zellkern

und das Signal der SSEA3/4-Färbung zeigte detailliert die Oberflächenstruktur der Zellen

(Abb. 2.8).

30 Ergebnisse

Abbildung 2.8: Immunfluoreszenzfärbung der Pluripotenzmarker. Immunfluoreszenzfärbungen gegen zwei Pluripotenzmarker (grün) und den Zellkern (blau) jeweils bei der Referenz iPS-Linie (HD2), der gesunden Geschwister- (ASC23) und der Patienten- (ΔSt3Gal-3) iPS-Linie. SSEA4 (aSSEA4, Biozol, BLD-330402, 1:100) ist ein Glycosphingolipid und Teil der Zelloberfläche, OCT4 (aOCT4, SCB, SC-5279, 1:50) ist ein Transkriptionsfaktor und im Zellkern lokalisiert. Maßstabsbalken 100 µm

2.2.3 Array-CGH

Um die genomische Integrität der iPS-Linien zu überprüfen, wurde von unserer

Kooperationspartnerin Prof. Dr. rer. nat. Doris Steinemann, TEAM funktionelle Genomik der

medizinischen Hochschule Hannover, eine hochauflösende Array-basierende, vergleichende

Genomhybridisierung (Array-CGH) durchgeführt. Bei der Array-CGH handelt es sich um eine

molekulare Analyse des gesamten Genoms mit der Mikrodeletionen und

Mikroduplikationen, allerdings keine balancierten Chromosomenaberrationen,

nachgewiesen werden können. Es wurde genomische DNA der Fibroblasten der Patientin

(ΔSt3Gal-3) und des gesunden Geschwisterkindes (AS) sowie der daraus reprogrammierten

iPS-Linien untersucht. Nach der Hybridisierung mit den DNA-Sonden und der Detektion der

Fluoreszenzsignale konnte bei keiner Probe eine Anomalie gegenüber der Referenz-DNA

(Fibroblasten) detektiert werden. Die iPS-Linie ASC23 zeigte zwei kleinere Deletionen auf

dem Chromosom 16, welche aber auch in den Fibroblasten (AS) gefunden wurden (Anhang

Abbildung 36).

Ergebnisse 31

2.2.4 Integrationsort der Viruskassette

Um den genauen Integrationsort der Transkriptionskassette innerhalb des Wirtsgenoms zu

bestimmen, wurde eine geschachtelte, integrative PCR mit Fusionsprimern (FPNI-PCR)

etabliert. Für die Amplifikation wurden Primer mit einer definierten Sequenz verwendet, die

am 5‘ Ende der Transkriptionskassette, also innerhalb der trunkierten „long terminal

repeats“ (LTRs), binden und eine Amplifikation aus der Kassette heraus in den unbekannten

genomischen Bereich hinein ermöglichen. Die weitere Amplifikation dieses ersten Stranges

wurde durch den Einsatz eines Pools an degenerierten Fusionsprimern ermöglicht. Die

hierfür verwendeten Primer und Protokolle sind unter 4.1.3 und 4.1.10 genauer

beschrieben. Die so gewonnenen Amplifikate wurden für eine Sanger-Sequenzierung

eingesetzt und die erhaltenen Sequenzen anschließend auf das humane Genom aligniert.

Die FPNI-PCR wurde für die Patienten-iPS-Linie ΔSt3Gal-3 und des gesunden

Geschwisterkindes ASC23 durchgeführt. Für die Zellen des gesunden Geschwisterkindes

(ASC23) konnte ein Integrationsereignis an der Position 158904392 (hg19, Feb. 2009) auf

dem langen Arm des Chromosoms 4 festgestellt werden. An dieser Stelle liegt kein offener

Leserahmen vor. 189326 bp davor befindet sich das Gen FAM198B, wahrscheinlich ein

Membranprotein, dass während der Entwicklung in Nerven und Epithelzellen exprimiert

wird. 762656 bp danach befindet sich das Gen GRIA2, ein Glutamat-Rezeptor, der in

Neuronen des ZNS exprimiert wird. Für die Patientenzellen der iPS-Linie ΔSt3Gal-3 wurden

zwei Integrationsereignisse an Position 6.956.876 (hg19, Feb. 2009) auf dem kurzen Arm des

X-Chromosoms und an Position 25.663.792 auf dem langen Arm des Chromosoms 17

gefunden. Der Integrationsort auf dem X-Chromosom liegt ebenfalls in keinem offenen

Leserahmen. Er liegt 10.085 bp oberhalb des Gens HDHD1, einer Haloacid-Dehalogenase-

ähnlichen Hydrolase ohne bekannte Funktion und 423219 bp unterhalb des Gens VCX3A,

einem Protein, das in der Spermatogenese eine Rolle zu spielen scheint, und mit X-

gebundener geistiger Behinderung in Verbindung gebracht wird [109]. Der Integrationsort

auf dem Chromosom 17 liegt 42686 bp unterhalb des Gens WSB1, der

Substraterkennungsuntereinheit eines Ubiquitinasekomplexes, und 81146 bp oberhalb des

Pseudogens TBC1D3P5.

32 Ergebnisse

2.2.5 Hauptkomponentenanalyse

Von den drei iPS-Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 wurde eine RNA-Sequenzierung

mittels der SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform (Applied Biosystems, Waltham,

Massachusetts, USA) durchgeführt. Für die RNA-Isolation wurden TriZOL-Proben aller drei

Zelllinien als iPS auf Matrigel kultiviert und nach 50 und 90 Tagen kortikaler Differenzierung

geerntet. Von den Zelllinien HD2 sowie ΔSt3Gal-3 wurden darüber hinaus Proben nach 12

Tagen kortikaler Differenzierung sequenziert. Von jedem Zustand jeder Zelllinie wurden

zwei biologische Replikate verwendet. Die RNA wurde anschließend, wie unter 4.1.4.4

beschrieben, isoliert und für eine RNA-Sequenzierung auf der SOLiD-5500-XL-

Sequenzierplattform eingesetzt. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit einem Barcode

versehen und 75 bp vorwärts sowie 35 bp rückwärts sequenziert. Die Rohdaten wurden

anschließend mit der Lifescope-Software auf das humane Genom (hg19) aligniert und

anschließend über das R-Paket DESeq normalisiert [110]. Die Hauptkomponentenanalyse

wurde ebenfalls unter Verwendung des R-Pakets DESeq durchgeführt.

Abbildung 2.9: Hauptkomponentenanalyse. Hauptkomponentenanalyse mittels des R-Pakets DESeq aus den RNA-Sequenzierungsdaten der drei Zelllinien ASC23, HD2 sowie ΔSt3Gal3 und den vier Zuständen iPS sowie nach 12, 50 und 90 Tagen (d12, d50 und d90) kortikaler Differenzierung.

Die Hauptkomponentenanalyse ergab drei verschiedene Hauptgruppen. Die erste Gruppe

bestand aus den sechs iPS-Proben, die zweite aus den vier Proben nach 12 Tagen kortikaler

Ergebnisse 33

Differenzierung und die dritte aus den acht Proben nach 50 bzw. 90 Tagen Differenzierung.

Die Gruppe der iPS-Proben zeigt, dass sich die biologischen Replikate der drei Zelllinien

relativ ähnlich sind. Die Zelllinien untereinander hingegen sind klar voneinander abgegrenzt.

Die Gruppe der Proben nach 12 Tagen Differenzierung zeigt die größte Heterogenität

zwischen den verschiedenen Zelllinien. Die Proben der beiden Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal-

3 nach 50 bzw. 90 Tagen Differenzierung konnten zu einer Gruppe zusammengefasst

werden und zeigten die geringste Heterogenität. Interessanterweise zeigten die

Patientenzellen nach 50 Tagen Differenzierung deutlich größere Unterschiede zur restlichen

Gruppe als nach 90 Tagen (Abb. 2.9). Während bei dem Vergleich zwischen den iPS-Linien

HD2 und ΔSt3Gal-3 89 Gene signifikant (p-Wert < 0.05) differentiell exprimiert waren,

wurden für den Vergleich zwischen den Linien ASC23 und ΔSt3Gal-3 nur 13 Gene signifikant

differentiell exprimiert (Abb. 2.10). Da die ST3GAL3-Expression in iPS nur basal vorhanden

ist und die Mutation in Übereinstimmung mit dem Krankheitsbild die Entwicklung auf

Stammzellebene nicht beeinflusst, kann man folgern, dass die Unterschiede zwischen den

drei iPS-Linien krankheitsunabhängig sind. Es ist somit wahrscheinlich, dass der genetische

Hintergrund der Zellen sowie die klonale Prägung während der Reprogrammierung zu

diesen Unterschieden geführt haben. Für die weiteren Analysen wurde deshalb die Zelllinien

ASC23 des gesunden Geschwisterkindes als Hauptreferenz zu den Patientenzellen gewählt.

Abbildung 2.10: Mengendiagramm differentiell exprimierter Gene. Verglichen werden DE-Gene der iPS-Vergleiche zwischen HD2 gegen ΔSt3Gal-3 (blau) sowie ASC23 gegen ΔSt3Gal-3 (grün). Die Gruppe der Gene, die in beiden Vergleichen signifikant differentiell exprimiert wurden, ist rot hinterlegt. Die Gene sind G0S2, PEG3, ZIM2, ZNF208 und SLC30A8, wobei die Pfeile die Richtung der Expressionsveränderung angeben.

34 Ergebnisse

2.3 Differenzierung zu Kortexneuronen

West-Syndrom-Patienten leiden an frühinfantilen epileptischen Anfällen und einer starken

geistigen Behinderung [3]. Um die molekularen Ursachen dieser Erkrankung des zentralen

Nervensystems untersuchen zu können, sollten die etablierten patientenspezifischen iPS-

Linien ΔSt3Gal-3 und ASC23 zu Neuronen differenziert werden. Für die Differenzierung von

iPS zu Neuronen wurden bisher etliche Methoden in der Literatur beschrieben. Mit diesen

Methoden können iPS zu unterschiedlichen Zelltypen differenziert (z.B. GABAerge Neuronen

oder Oligodendrocyten), aber auch die regionale Identität dieser Zellen (z. B. frontaler

Kortex, Mittelhirn oder dem Rhombencephalon) bestimmt werden. Für die Entscheidung,

welches Differenzierungsprotokoll etabliert werden sollte, wurde die ST3GAL3-

Expressionsintensität in verschiedenen Bereichen des adulten Gehirns untersucht. Darüber

hinaus wurde der Phänotyp und das Ansprechen der Patienten auf antiepileptische

Medikamente berücksichtigt (siehe 2.3.1).

2.3.1 ST3GAL3-Expressionsintensität in verschiedenen Bereichen des Gehirns

Wir haben Genexpressionsprofile verschiedener adulter Gehirnareale mittels Sequenzierung

der gesamt RNA über die SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform (Life Technologies Carlsbad,

USA) erstellt. Es wurden RNA-Proben von 11 verschiedenen Gehirnbereichen adulter

humaner Spender untersucht. Die ribosomale RNA wurde mittels des Ribo-ZeroTM-Kits

(Epicenter, Madison, WI) entfernt. Anschließend wurde die RNA mit den Materialien und

Anleitungen des SOLiD®-Gesamt-RNA-Seq-Kits (Life Technologies, Carlsbad, USA)

aufbereitet, für jede Probe wurde hierbei ein eigener Barcode verwendet. Je die Hälfte der

Bibliothek wurde mit der „exact call chemistry“ gemischt und 75 bp vorwärts sequenziert.

Die andere Hälfte wurde als „paired end“ 75 bp vorwärts und 35 bp rückwärts sequenziert.

Die resultierenden Einzelsequenzen werden im weiteren „Reads“ genannt und die

Expressionslevel der einzelnen Gene werden als Reads per kilobase per million (RPKM)

angegeben. Anhand dieser Daten konnte das Ausmaß der Expression der 6 ST3GAL-Gene in

verschiedenen Bereichen des Gehirns ermittelt werden. Im Durchschnitt aller sequenzierten

Bereiche zeigt das ST3GAL1-Gen mit 4.6 RPKM die niedrigste Expression und das ST3GAL5-

Gen mit 26.6 RPKM die höchste. Das ST3GAL3-Gen zeigt mit 10 RPKM im Durchschnitt aller

sequenzierten Bereiche die zweithöchste Expression. In den einzelnen Bereichen hatte das

ST3GAL3-Gen mit 15.56 RPKM seine höchste Expression aller untersuchten Areale im

Ergebnisse 35

zerebralen Kortex (siehe Tabelle 2.1). Mit Blick auf die Daten der Expressionsprofile und

dem Phänotyp der Patientin wurde daher ein Differenzierungsprotokoll für kortikale Zellen

etabliert.

Tabelle 2.1: Sialyltransferaseexpression in verschiedenen Gehirnarealen. Ausmaß der Expression der verschiedenen α-2,3-Sialyltransferasen als reads per kilobase per million [RPKM] für verschiedeneAreale im adulten humanen Gehirn.

ST3GAL1 ST3GAL2 ST3GAL3 ST3GAL4 ST3GAL5 ST3GAL6

Durchschnitt [RPKM] 4.62 6.89 10.06 9.40 26.64 7.96

Zerebraler Kortex 6.00 6.18 15.56 5.96 28.15 6.92

Corpus Callosum 2.99 3.18 7.21 17.98 18.23 4.33

Diencephalon 2.29 7.19 8.82 12.23 31.95 5.77

Thalamus 4.61 7.29 9.39 10.89 32.03 8.54

Cerebellum 2.38 14.05 11.24 4.79 16.01 16.62

Medulla oblongata 5.75 5.17 8.51 11.54 24.4 11.15

2.3.2 Modifiziertes Differenzierungsprotokoll nach Yichen Shi et al.

Der Beginn eines epileptischen Anfalles ist durch das zeitgleiche Auftreten zweier Ereignisse

gekennzeichnet: 1. das Auftreten eines Hochfrequenzaktionspotentials und 2. der

Hypersynchronisierung einer neuronalen Population im Kortex. Die pathophysiologischen

Ursachen dieser beiden Ereignisse sind bisher noch nicht vollständig geklärt, im Allgemeinen

geht man aber von einem Ungleichgewicht zwischen exzitatorischen Signalen durch

Projektionsneuronen und inhibierenden Signalen durch Interneuronen aus [111]. Die

Patientin 4695 sprach auf keine getestete Medikation an. Es wurden Arzneistoffe mit

verschiedenen Wirkmechanismen getestet. Hierzu gehörten das Mittel Vigabratin, ein

GABA-Transaminase-Suizid-Inhibitor, sowie Topiramat, ein AMPA-Rezeptor-Inhibitor [3].

Vigabratin erhöht die Halbwertzeit von GABA im Kortex der Patientin, welches von

GABAergen Interneuronen freigesetzt wird. Der AMPA-Rezeptor ist ein ionotroper

Glutamatrezeptor und ist somit an der Weiterleitung von Aktionspotentialen zwischen

Projektionsneuronen beteiligt. Da es keine eindeutigen Hinweise auf die molekularen

Ursachen und die hauptsächlich beteiligten Zelltypen der epileptischen Anfälle gab, wurde

die Etablierung eines Differenzierungsprotokolls bevorzugt, mit dem möglichst viele

Zelltypen des Kortexes abgebildet werden konnten. Die Entscheidung viel deshalb auf das

Differenzierungsprotokoll für kortikale Neuronen und neuronale Netzwerke nach Yichen Shi

36 Ergebnisse

et al. [112]. Der schematische Ablauf dieses Differenzierungsprotokolls wird in Abbildung

2.11 verdeutlicht.

Abbildung 2.11: Schematischer Ablauf des neuronalen Differenzierungsprotokolls nach Yichen Shi et al Modifiziertes Protokoll nach Yichen Shi et al., 2012, Nature Protocols: Zu iPS aus „Feeder“-freier Kultur in Konfluenz wird ein Induktionsmedium gegeben, welches zwei SMAD-Inhibitoren und Retinolsäure enthält (d 1). Nach ca. 10 Tagen bildet sich aus den Stammzellen ein Neuroectoderm (d 10). Nach einer Passage auf Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichtete Kulturgefäße fangen die neuronalen Vorläuferzellen an, sich in Rosetten zu formieren (~d 15). Nach einer weiteren Passage, in der die Zellen vereinzelt werden, wachsen die ersten Neuronen aus den Rosetten heraus (ab d 20).

Methodisch basiert dieses Protokoll auf der dualen Inhibition zweier SMAD-Proteine in

konfluent adhärenten iPS [77] bei gleichzeitiger Retinolsäurezugabe. Die Kultur im

konfluenten Monolayer bietet, im Gegensatz zu der häufig verwendeten Kultur von

„Embroyid Bodies“ (z.B. [75]), den Vorteil, dass die Zellen gleichmäßiger von den Reagenzien

erreicht werden und eine Entwicklung Richtung frontalem Kortex frühzeitig beeinflusst

werden kann. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll den Vorteil, dass die Zellen die

wichtigsten Schritte der embryonalen Neurogenese des Kortexes nachbilden. Hierbei

werden alle Entwicklungsstadien durchlaufen und alle kortikalen Zelltypen, bis auf

Interneurone, gebildet. Diese Differenzierung wurde mit den drei iPS-Linien HD2, ΔSt3Gal3

und ASC23 durchgeführt. Das Differenzierungsprotokoll wurde wie unter 4.6.1 beschrieben

durchgeführt. Direkt nachdem die iPS im Monolayer Konfluenz erreichten, wurde das

Medium für 8 - 10 Tage zu neuronalem Induktionsmedium (NIM) gewechselt. Der erste Tag

in NIM markierte den ersten Tag der neuronalen Differenzierung (Tag 1). Die folgenden

Ergebnisse 37

Tagesbezeichnungen der Differenzierung beziehen sich immer auf diesen Startpunkt. Die

wichtigsten darauf folgenden Stadien während der neuronalen Differenzierung waren die

Bildung des Neuroectoderms (Tag 9 - 12), dass sich nach der 1. Passage zu neuronalen

Stammzellen (Tag 12 - 20) entwickelte, welche in charakteristischen Rosettenstrukturen

wuchsen. Hieraus entwickelten sich neuronale Progenitorzellen, aus denen sich über

asymmetrische Zellteilung die ersten Neuronen entwickelten (ab Tag 20) (Abb. 2.11). Die

neuronalen Stammzellen wurden auf Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten Kulturgefäßen

bis maximal Tag 27 durch die Zugabe von 10 ng/ml bFGF expandiert und anschließend

kryokonserviert. Das Originalprotokoll wurde in mehreren Punkten in der Handhabung

leicht variiert. Während der 1. Passage des Neuroectoderms wurde vor der Dispase-II-

Behandlung zweimal mit 1x DPBS gewaschen und anschließend mit einer abgerundeten

Glaspasteurpipette 16 Quadrate erzeugt, um die reaktive Oberfläche zu vergrößern. Zudem

wurde auf die Verwendung von mTeSR-Medium vollständig verzichtet, da eine

Differenzierung in diesem Medium nicht möglich war. Die iPS wurden in konditioniertem

Stammzellmedium mit einer möglichst geringen bFGF-Konzentration bis zur gewünschten

Zellmenge kultiviert.

Abbildung 2.12: Wichtige Entwicklungsstadien während der Differenzierung zu kortikalen Neuronen. Von links nach rechts Durchlichtbilder von iPS auf Matrigel, konfluenten neuroectodermalen Zellen (Tag 8-12), neuronalen Stammzellen in Rosetten (ab Tag 13) und kortikalen Neuronen (ab Tag 20), Maßstabsbalken 50 µm.

Die morphologischen Veränderungen der konfluenten iPS hin zu einem konfluenten

Neuroectoderm waren sehr subtil und zeichneten sich hauptsächlich durch die

Verkleinerung der Zellen und Zellkerne aus. Zudem zeigten die neuroectodermalen Zellen

häufig eine erkennbare Wachstumsrichtung. Nach der 1. Passage organisierten sich die

neuronalen Stammzellen in polarisierten Rosettenstrukturen, welche Ähnlichkeiten zu

kortikalem Neuroepithelium aufwiesen. Deutlich erkennbar waren hierbei das apikale

Lumen und die basale Außenseite der Rosetten. Ab Tag 20 der Differenzierung traten erste

kortikale Neuronen auf, erkennbar an den typischen dreieckigen Zellkörpern und für den

Kortex typischen langen Axonen (Abb. 2.12). Für längere Inkubationszeiten wurden die

Zellen meistens in einer Zelldichte von ca. 50.000 Zellen/cm2 in poly-L-Ornithin/Laminin-

38 Ergebnisse

beschichtete Kulturgefäße inkubiert. Nach 30 Tagen Inkubation waren bereits eine

substantielle Neurogenese und erste neuronale Netzwerke erkennbar. Bis Tag 50 der

Differenzierung hatten sich aus diesen kleinen Netzwerken bereits dichte Neuronenteppiche

entwickelt, die aus den deutlich vergrößerten, rosettenförmigen Strukturen herauswuchsen.

Den Verlauf einzelner Axone nachzuvollziehen war kaum mehr möglich. Vereinzelt traten

Zellen unbestimmter Morphologie auf. Nach 90 Tagen Kultur hatten sich aus den Rosetten

große 3D-Strukturen gebildet, die über sehr dicke Neuronenbündel miteinander verbunden

waren. Bis zu diesem Zeitpunkt waren etliche Zellen unbestimmter Morphologie erkennbar.

Einzelne Zellen waren nur noch in Randgebieten, oder Bereichen, an denen der Zellteppich

aufgerissen und neu besiedelt war, erkennbar. Da Proben, die länger als 50 Tage in Kultur

wuchsen, Untersuchungen von einzelnen Zellen kaum mehr ermöglichten, wurden die

folgenden funktionellen Analysen auf die Zeitpunkte Tag 12, 30, 35 und 50 beschränkt (Abb.

2.13).

Abbildung 2.13: Durchlichtbilder kortikaler Zellen in der Langzeitkultur. Durchlichtbilder der beiden Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal-3 nach 30, 50 und 90 Tagen kortikaler Differenzierung in verschiedenen Vergrößerungen. Maßstabsbalken 50 µm.

Ergebnisse 39

2.3.3 Validierung der kortikalen Identität der differenzierten Zellen

Für die weiteren funktionellen Charakterisierungen der Zellen sollte die kortikale Identität

der Neuronen validiert werden. Wie bei der Pluripotenzvalidierung der iPS wurden hierbei

verschiedene kortexassoziierte Marker untersucht. Es wurden sowohl die in der Literatur

[112] empfohlenen Marker FOXG1, EMX1, SOX1, OTX1/2 und PAX6 als auch der

Pluripotenzmarker OCT4 mit q-RT-PCR und teilweise mit Immunfluoreszenzfärbung

untersucht.

2.3.3.1 Quantitative PCR

Die Quantifizierung der mRNA-Level der Kortexmarker wurde über die q-RT-PCR nach

4.1.8.1 in kortikalen Zellen nach 12 Tagen Differenzierung ermittelt. Es wurden die oben

genannten Kortexmarker neben dem Pluripotenzmarker OCT3/4 (POU5F1) für die

Quantifizierung ausgewählt. Die hierfür verwendeten Primer, siehe auch 4.1.3, wurden aus

der Literatur übernommen [112]. Als Referenzgene wurden für jede Probe die Gene ACTB

und GAPDH gemessen. Die RNA für diese Experimente wurde über das TriZOL-Protokoll

(4.1.4.4) isoliert. Für die cDNA-Synthese wurden je Ansatz 250 ng Gesamt RNA eingesetzt,

bei einer vollständigen reversen Transkription wurden je Reaktion 12.5 ng cDNA eingesetzt.

Jede Probe und jedes Gen wurde in Dubletten oder Triplikaten gemessen. Die Auswertung

erfolgte anhand der ΔΔCt-Methode. Der relative „FoldChange“, also das Ausmaß der

Expressionsveränderung, wurde aus den ΔCt-Werten der kortikalen Neuronen zu den

dazugehörigen iPS als berechnet. Für jedes Gen wurde die Stichprobenvarianz

berechnet. Für alle Kortexmarker konnte ein deutlicher Anstieg in den kortikalen Zellen

gegenüber den iPS ermittelt werden. Dieser variierte von einem 1.75-fachen Anstieg von

OTX1/2 in den ΔSt3Gal-3-d12-Zellen, bis zu einem 29.000 fachen Anstieg von PAX6 in den

ΔSt3Gal-3-d12-Zellen. Für den Pluripotenzmarker OCT4 konnte ein 9.500-facher für die

ΔSt3Gal-3-d12-Zellen, bzw. für die ASC23-d12-Zellen ein 6030-facher Rückgang der

Expression gegenüber den iPS ermittelt werden. (Abb. 2.14).

40 Ergebnisse

Abbildung 2.14: Expression Kortex assoziierter Marker. Relative q-RT-PCR-Daten der Expression von fünf Kortexmarkern (FOXG1, EMX1, SOX1, OTX1/2 und PAX6) und einem Pluripotenzmarker (OCT4) jeweils von Zellen d12 der Patientin (ΔSt3Gal-3) und des gesunden Geschwisterkindes (ASC23). Die Expression der Marker in den korrespondierenden iPS wurde Bezugsgröße gewählt. Der Fehlerbalken stellt die Stichprobenvarianz der einzelnen Marker dar, wobei n = 3 bzw. 6.

2.3.3.2 Immunfluoreszenzfärbung

Die kortexassoziierten Marker PAX6 und OTX1/2 wurden über eine

Immunfluoreszenzfärbung von kortikalen Zellen der Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 an

Tag 20 der Differenzierung untersucht. PAX6 ist ein Marker für neuronale Stammzellen, z.B.

radiale Gliazellen. OTX1 ist ein Transkriptionsfaktor, der in frühen kortikalen Stammzellen

exprimiert wird [113]. Alle drei Zelllinien wurden auf poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten

Deckgläschen kultiviert und an Tag 20 mit einer 4 % Paraformaldehydlösung für 30 Minuten

fixiert und anschließend permeabilisiert. Die Epitope wurde mit spezifischen

Primärantikörpern (aPAX6, SCB, SC81649, 1:300; aOTX1/2, Millipore, ab9566, 1:300)

markiert und konnten mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern detektiert werden

(4.7.7). PAX6 sowie OTX1/2 sind Transkriptionsfaktoren, die Signale wurden somit im

Zellkern der Zellen erwartet und konnten mit dem Signal der DAPI-Färbungen (blauer Kanal)

verglichen werden. Für alle drei Zelllinien konnten die kortexassoziierten Marker PAX6 und

OTX1/2 nachgewiesen werden. Die Signale lagen räumlich im Bereich der DAPI-Signale und

somit der Zellkerne der Zellen (Abb. 2.15).

Ergebnisse 41

Abbildung 2.15: Immunfluoreszenzfärbung kortexassoziierter Marker. Immunfluoreszenzfärbung gegen zwei Kortexmarker (grün und rot) und den Zellkern (blau) von der Referenz iPS-Linie (HD2), der gesunden Geschwister (ASC23) und der Patienten (ΔSt3Gal-3) iPS-Linie, jeweils nach 20 Tagen neuronaler Differenzierung. Pax6 (aPax6, SCB, SC-81649, 1:300) als auch Otx1/2 (aOtx1/2, Millipore, ab9566, 1:300) sind Transkriptionsfaktoren, die Signale wurde innerhalb des Zellkerns erwartet.

2.4 Funktionelle Analysen

Die molekularen Ursachen des West-Syndroms, verursacht durch die fehlende enzymatische

Aktivität der CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-sialyltransferase

(ST3GAL3), sollten sowohl anhand der etablierten iPS-Linien, als auch bei den

differenzierten kortikalen Zellen von Patientin und gesundem Geschwisterkind näher

charakterisiert werden. An welche Galaktoseepitope die ST3GAL3 Sialinsäuren transferiert

und ob sie spezifisch für die daran gebundenen Protein- oder Lipidstrukturen ist, ist bisher

nicht bekannt. Da bisher keine konkreten Informationen zu den Zielstrukturen und somit

den Auswirkungen der Mutation vorliegen, wurden die Zellen hypothesenfrei auf

verschiedenen Ebenen (morphologischer, physikalischer, entwicklungsbiologischer und

Expressionsebene) untersucht.

42 Ergebnisse

2.4.1 Messung der ST3GAL3-Expression mittels digitaler PCR

Das Ausmaß der Expression des ST3GAL3-Gens sollte in den verschiedenen

Differenzierungsstadien der Patientin und des gesunden Geschwisterkindes untersucht

werden. Hierfür wurden zunächst intronüberspannende Primer für die Hauptisoform B1

konstruiert und anschließend mittels q-RT-PCR analysiert. Für die relative Quantifizierung

wurden die beiden Referenzgene ACTB und GAPDH gemessen. Es wurden iPS- und kortikale

Zellen nach 50 und nach 90 Tagen der Differenzierung von den Zelllinien ΔSt3Gal-3 und

ASC23 wie unter 4.1.8.1 beschrieben untersucht. Für qPCR-Messungen werden interne

Referenzgene gemessen, deren Expression in allen Proben auf einem vergleichbaren Niveau

liegen sollte. Da die Expressionswerte der Referenzgene, entgegen der Grundannahme

gleichbleibender Expression, zwischen den verschiedenen Differenzierungsstadien nicht

vergleichbar waren, erfolgte ein methodischer Wechsel zur digitalen PCR. Die digitale PCR

ermöglicht es, absolute mRNA-Mengen, ohne den Einsatz von Referenzgenen, zu

bestimmen. Für diese Untersuchungen wurde der FAM-markierte Taq-Man-Assay

Hs00544035_m1 von Life Technologies über die Exon-Exon-Grenze 7 und 8 der Isoform B1

des ST3GAL3-Gens genutzt. Die digitale PCR wurde wie unter 4.1.8.2 beschrieben

durchgeführt. Für jede Reaktion wurden 12.5 oder 22.5 ng Gesamt-cDNA eingesetzt. Dies

entsprach einer Konzentration von 1.25 oder 2.5 ng/µl. Das Auslesen der Chips erfolgte über

das Quant Studio 3D (Thermofisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) System in

Kopien pro µl und wurde anschließend in Kopien pro ng RNA umgerechnet.

Die einzelnen biologischen Replikate zeigten zum Teil eine relativ hohe Stichprobenvarianz.

Die technischen Replikate hingegen zeigten eine deutlich geringere Varianz, wie bei der

Messung der kortikalen Zellen nach 90 Tagen erkennbar. Bei den iPS lag der Durchschnitt

bei 129.8 Kopien/ng RNA in den ΔSt3Gal-3 und 125 Kopien/ng RNA in den ASC23 Zellen.

Nach 50 Tagen Differenzierung lag der Durchschnitt bei 647.7, bzw. 637.2 Kopien/ng RNA

und nach 90 Tagen bei 617.7, bzw. 523.6 Kopien/ng RNA. Es war in allen Proben ein

deutlicher Anstieg der ST3GAL3-Expression bei differenzierten Zellen im Vergleich zu

undifferenzierten iPS zu erkennen.

Der deutlich erkennbare Rückgang der ST3GAL3-Expression von 113 Kopien/ng RNA

zwischen den Tagen 50 zu 90 der Differenzierung in den ASC23 Zellen war in den

Patientenzellen nicht messbar. Hier betrug die Differenz lediglich 30 Kopien/ng RNA. Da die

Stichprobenvarianz zwischen den einzelnen biologischen Replikaten von Tag 50 aber mit ca.

Ergebnisse 43

168 Kopien/ng RNA sehr hoch war, und für die Messung der Zellen nach 90 Tagen

Differenzierung keine biologischen Replikate vorhanden waren, können wir keine

eindeutigen Schlüsse aus den vorliegenden Ergebnissen ziehen (Abb. 2.16 und Tabelle 9 des

Anhangs).

Abbildung 2.16: Mittlere ST3GAL3-Expression mittels dPCR. Dargestellt sind die mittleren ST3GAL3-Expressionslevel in Kopien/ng RNA als Balkendiagramm. Untersucht wurden jeweils Patientenzellen (ΔSt3Gal-3, rot) und Zellen des gesunden Geschwisterkindes (ASC23, grün) als iPS bzw. nach 50 und 90 Tagen kortikaler Differenzierung. Die Fehlerbalken stellen die Stichprobenvarianz (wobei n = 4)

2.4.2 Vergleichende RNA-Seq-Analysen

Von den drei Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 wurde jeweils eine RNA-Sequenzierung

mittels der SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform unternommen. Für die RNA-Isolation

dienten TriZOL-Proben aller drei Zelllinien als iPS auf Matrigel und nach 12, 50 und 90 Tagen

kortikaler Differenzierung. Die RNA wurde anschließend wie unter 4.1.4.4 beschrieben

isoliert und für eine RNA-Sequenzierung auf der SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform

eingesetzt. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit einem Barcode versehen und 75 bp vorwärts

sowie 35 bp rückwärts sequenziert. Abhängig von den verschiedenen biologisch relevanten

Fragestellungen wurden Vergleiche zwischen den verschiedenen Zelllinien und Zuständen

durchgeführt und so für jedes Gen ein FoldChange-Wert berechnet. Die Listen der

differentiell exprimierten Gene (DE-Gene) wurden anschließend gefiltert. Hierbei wurden

alle Vergleiche ausgeschlossen, deren p-Wert größer als 0.05 war. Als Konsequenz der

Ergebnisse der Hauptkomponentenanalyse (siehe Abb. 2.9) wurden nur Vergleiche zwischen

den beiden Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal-3 näher analysiert. Die Genlisten der drei

Hauptvergleiche jeweils von Patientenzellen gegen Zellen des gesunden Geschwisterkindes

44 Ergebnisse

als iPS, nach 50 und nach 90 Tagen kortikaler Differenzierung wurden genauer untersucht (1

ASC23 iPSC vs ΔSt3Gal-3 iPSC; 2 ASC23 d50 vs ΔSt3Gal-3 d50; 3 ASC23 d90 vs ΔSt3Gal-3 d90;

im Folgenden Vergleich 1,2 oder 3 genannt). Darüber hinaus wurden jeweils die Vergleiche

von kortikalen Zellen nach 50 Tagen Differenzierung gegen die jeweils korrespondierenden

iPS (jeweils von Patientin und gesundem Geschwisterkind) genauer ausgewertet(4 ASC23

iPSC vs ASC23 d50; 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50 im Folgenden Vergleich 4 und 5

genannt). Der Vergleich 1 der RNA-Sequenzierungsdaten der beiden iPS Zelllinien ergab 13

DE-Gene, beim Vergleich 2 der Patientenzellen und der Zellen des gesunden

Geschwisterkindes nach 50 Tagen kortikaler Differenzierung wurden 23 DE-Gene gefunden

und beim Vergleich 3 nach 90 Tagen Differenzierung 38 signifikante DE-Gene (Abb. 2.17).

Die Annotation der einzelnen Gene innerhalb der Listen sowie eine „Gen Ontologie

Enrichment Analyse“ (GO-Terme) der gesamten Liste wurde über die DAVID Software

erstellt [114]. Eine erweiterte Funktionsanalyse der einzelnen Gene wurde mittels manueller

Datenbankrecherche (Genecards, NCBI, Uniprot) durchgeführt.

Abbildung 2.17: Differentielle Genexpression zwischen Patientin und gesundem Geschwisterkind. (A) Anzahl der differentiell exprimierten (DE) Gene aus den Vergleichen zwischen Patienten und gesunden Geschwisterkind iPS, neuronal differenzierten Zellen nach 50 und 90 Tagen. (B) Mengendiagramm der DE-Genlisten der drei Zustandsvergleiche.

Innerhalb der Genlisten der drei Vergleiche (1-3) tauchten fünf Gene in allen Vergleichen

auf. Drei der Gene die in allen Vergleichen auftraten (PEG3, ZIM2 und MEG3) waren

paternal oder maternal geprägte Gene. CTFS codiert für die Thiol-Protease Cathepsin F, die

an der intrazellulären Degradation und dem Proteinumsatz beteiligt sein soll. TCERG1L

codiert für ein Transkriptionselongator-ähnliches Protein. Alle Gene bis auf MEG3 waren in

den Patientenzellen hochreguliert.

Unter den DE-Genen des iPS-Vergleichs 1 waren bis auf zwei Ausnahmen hauptsächlich

paternal oder maternal geprägte Gene. Darüber hinaus fiel nur das Gen G0S2 auf, es kodiert

Ergebnisse 45

ein Protein, das am G0-G1-Switch beteiligt ist. Die DAVID-Analyse dieser DE-Genliste ergab

keine interessanten angereicherten Gen-Onthologien.

Die DAVID-Analyse der Liste der DE-Gene des Vergleichs 2 (Zellen nach 50 Tagen

Differenzierung) zeigte, dass Gene mit dem GO-term „neural crest cell development“

(GO:0014032, Enrichment score 2.58, p-value 5.6 x 10-4; CYP26C1, GBX2, CYP26A1) vermehrt

vorkamen. Anhand der erweiterten Funktionsanalyse (siehe oben) der Gene konnten drei

weitere Gene einer Entwicklung in Richtung „hindbrain“ zugeordnet werden (POU4F1,

TFAP2B, IRX3). Darüber hinaus konnten damit 6 Gene den Auswirkungen und Vorgängen

einer erhöhten Zellzyklusrate zugeordnet werden (TCERG1L, RASAL1, CARTPT, CTSF,

HIST1H3C und VGLL3).

Die DAVID-Analyse der Liste der signifikanten DE-Gene des Vergleichs 3 (Zellen nach 90

Tagen Differenzierung) zeigte, dass Gene mit dem GO-term “regulation of transcription,

DNA-dependent“ (GO:0006355, Enrichment score 6.2, p-value 3.8 x 10-11; IRX3, IRX6, IRX5,

LMX1B, ZNF717, TFAP2B, ZNF667, POU4F2, SIX2, POU4F1, PAX3, FOXB1, TLX3, OTP), „eye

development“ (GO:0001654, Enrichment score 2.74, p-value 1.3 x 10-3; IRX5, LMX1B,

POU4F2, MAB21L2) sowie “cell motion“ (GO:0006928, Enrichment score 2.36, p-value 7.82 x

10-3; LMX1B, POU4F2, POU4F1, PAX3, TLX3) vermehrt vorkamen. Insgesamt konnten über

die erweiterte Funktionsanalyse 13 Gene einer Entwicklung in Richtung Auge via Zellen der

Neuralleiste zugeordnet werden (SPARCL1, MAB21L2, IRX5, TFAP2B, ESPN, IRX3, LMX1B,

C1QL4, PI15, SIX2, POU4F1, POU4F2, IRX6).

Unabhängig von der Enrichment Analyse fielen die drei Gene NTS, TAC1 und ADCYAP1 auf

bezüglich ihrer Funktion besonders auf. Das Gen NTS codiert für den Neurotransmitter

Neurotensin, TAC1 für Protachykinin-1 und ADCYAP1 (PACAP) für das Adenylatcylase

aktivierende Protein 1. Das NTS-Gen war in den Patientenzellen deutlich herunterreguliert

(fold change 0.00246), die Gene TAC1 und ADCYAP1 hingegen waren deutlich hochreguliert

(fold change 21.6, 24.6). Neurotensin ist ein 13 Aminosäuren langer Neurotransmitter, der

an der Modulation dopaminerger Neuronen beteiligt ist und eine Rolle bei vielen

neuropsychiatrischen Erkrankungen, wie z. B. Schizophrenie [115], beteiligt ist.

Protachykinin-1 ist die Vorstufe der beiden Neurotransmitter „Substanz P“ und „Neurokinin

A“ [116, 117]. Das Adenylatcyclase aktivierende Protein 1 erhöht die endogenen cAMP-Level

im zentralen Nervensystem [118].

46 Ergebnisse

Abbildung 2.18: Mengendiagramm der Vergleiche von neuronal differenzierten iPS nach 50 Tagen mit den korrespondierenden iPS jeweils von Patientin und Zellen des gesunden Geschwisterkindes (Darstellung nicht maßstabsgetreu)

Tabelle 2.2 DAVID-Gen-Onthologie-Anreicherungsanalyse P-Werte berechnen sich als modifizierter exakter Test nach Fisher und verdeutlichen die Signifikanz der Anreicherung dieser Gen-Onthologien.

Kategorie Name Anzahl p-Wert

ASC23 ΔSt3Gal-3 ASC23 ΔSt3Gal-3

SP_PIR_KEYWORDS glycoprotein 528 494 4.92E-19 4.43E-24

GOTERM_BP_FAT neuron differentiation

99 102 1.41E-17 9.97E-23

GOTERM_BP_FAT cell motion 97 98 4.25E-14 5.50E-18

GOTERM_BP_FAT forebrain development

42 45 1.32E-10 3.60E-14

Bei den Vergleichen 4 und 5 (4 ASC23 iPSC vs ASC23 d50; 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50)

konnten für die Patientin 1671 DE-Gene gefunden werden, für denselben Vergleich beim

gesunden Geschwisterkind wurden 1948 DE-Gene gefunden. 1237 dieser Gene tauchten in

beiden Vergleichen auf (Abb. 2.18). Die DAVID-Analysen der beiden Vergleiche zeigte eine

Anreicherung für etliche Gen-Onthologien. In beiden Vergleichen kamen unter anderem die

GO-Terme für „glycoprotein“, „neuron differentiation“, „cell motion“ und „forebrain

development“ vermehrt vor (Tabelle 2.2). Die Clustering-Analyse für die DE-Gene beider

Vergleiche ergaben ebenfalls insgesamt sehr ähnliche Gen-Onthologien. Die interessanten

Cluster hierbei sind das Annotations-Cluster 12 bzw. 8 der GO-Terme zur Entwicklung des

„forebrain“ , „telencephalon“, „pallium“, „hippocampus“, „limbic“ und „dentate gyrus“-

System, wobei der GO-Term zur „forebrain“ Entwicklung mit einem p-Wert von 5.36*10^-8

und 1.35*10^-11 und 42 beziehungsweise 45 Genen eindeutig der dominierende Term ist

(Anhang Tabelle 1-13).

Ergebnisse 47

In beiden Vergleichen taucht ein Cluster auf, das die GO-Terme der organspezifischen

Entwicklung umfasst. Für den Vergleich 4 (4 ASC23 iPSC vs ASC23) enthält dies die GO-

Terme „sensory organ development“, „embryonic organ morphogenesis“, „embryonic organ

morphogenesis“, „embryonic organ development“, „ear morphogenesis“, „inner ear

morphogenesis“, „ear development“ und „inner ear development“. Dieses Cluster enthält für

den Vergleich der Patientenzellen ( 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50)nur GO-Terme zur

Entwicklung des Auges. Dies sind die Terme „sensory organ development“, „eye

development“, „camera-type eye development”, “eye morphogenesis” und “camera-type

eye morphogenesis”. Dieses Annotations-Cluster ist beim gesunden Geschwisterkind das

Cluster 21 und erhielt die interne Anreicherungsbewertung von 3.26. Dahingegen rangierte

das gleiche Cluster bei der Patientin an Stufe 12 mit einer deutlich höheren

Anreicherungsbewertung von 5.99 (Anhang Tabelle 11-13).

2.4.3 Adhäsionsassay

Glycosylierungen von Oberflächenproteinen, Lipiden und Proteoglykanen können unter

anderem die richtige Faltung dieser Strukturen und die Interaktion mit anderen

Zielmolekülen beeinflussen. Unter anderem werden Signalmoleküle, wie Rezeptoren (Notch,

Insulin), oder Adhäsionsmoleküle, wie NCAM, glycosyliert. Um die Auswirkungen der

ST3GAL3-Mutation auf die adhäsiven Eigenschaften der Zellen zu untersuchen wurde ein

Adhäsionsassay entwickelt, der die Adhäsionsgeschwindigkeit auf einem definierten

Untergrund misst. Für diese Untersuchungen wurden die Zellen geerntet, gezählt und in

einer definierten Zellmenge wieder ausgesät. Da die Zellen für die Zellzahlbestimmung

vereinzelt werden mussten, wurden die Experimente nur mit neuronal differenzierten Zellen

nach 30 Tagen und Fibroblasten der beiden Zelllinien ΔSt3Gal-3 und ASC23, nicht aber mit

iPS, durchgeführt. Es wurde kein späterer Zeitpunkt der Differenzierung gewählt, da nach

diesem Zeitpunkt zu viele Neuronen gebildet worden waren, die für dieses Experiment zu

sensitiv sind. Die Fibroblasten wurden in einer Mikrotiterplatte mit 12 Kavitäten ohne

Beschichtung und die neuronal differenzierten Zellen nach 30 Tagen auf poly-L-

Ornithin/Laminin-beschichtete Mikrotiterplatten ausgesät. Nach definierten Zeitintervallen

wurde der Überstand abgenommen und die darin verbliebenen Zellen gezählt (4.7.9).

Diese Daten konnten als relative Mengen anhaftender Zellen über die Zeit aufgetragen

werden. Es wurden jeweils zwei technische Replikate und mindestens drei biologische

48 Ergebnisse

Replikate gemessen. Während für die Fibroblasten kein Unterschied im Adhärenzverhalten

nachgewiesen werden konnte, zeigten die neuronal differenzierten Zellen nach 30 Tagen

einen deutlichen Unterschied. Bereits nach 2 Minuten waren knapp 40 % aller

Patientenzellen angesiedelt, wohingegen erst 16 % aller Zellen des gesunden

Geschwisterkindes adhäriert waren. Von den Patientenzellen waren 85 % aller Zellen zum

letzten Zeitpunkt der Messung angesiedelt, bei den Zellen des gesunden Geschwisterkindes

nur 77.5 % (Abb. 2.19).

Abbildung 2.19: Zelladhärenz. Dargestellt sind die relativen Mengen adhärierter Zellen über die Zeit. Analysiert wurden jeweils die Patientenzellen (ΔSt3Gal3, rot) und die Zellen des gesunden Geschwisterkindes (ASC23, grün) als Fibroblasten und nach 30 Tagen kortikaler Differenzierung (NI d30). Die Fehlerbalken stellen die Stichprobenvarianz dar.

2.4.4 NCAM und PSA Nachweis in kortikalen Neuronen

Das neuronale Zelladhäsionmolekül, kurz NCAM, ist ein in der neurobiologischen

Entwicklung wichtiges Transmembranprotein Es soll unter anderem an der Zell-Zell-

Adhäsion, den Neurit-Auswüchsen und der neuronalen Plastizität beteiligt sein [119]. In

seiner nativen Form liegt es poly-sialyliert (PSA) vor. In seiner un-sialylierten Form ist es

homophil und kann an andere NCAMs auf der Oberfläche anderer Zellen binden. Die

Polysialylierung erfolgt α-2,8 an einem α-2,3-gebundenen Sialinsäurerest durch eine

Polysialyltransferase. Inwiefern die fehlende enzymatische Aktivität der ST3GAL3 die

Polysialylierung von NCAM, und somit seine Adhärenzeigenschaften, beeinflusst, sollte

mittels einer Immunfluoreszenzfärbung von NCAM und polysialyliertem NCAM (PSA)

überprüft werden. Die Antikörper 123C3 gegen NCAM und 735 gegen PSA wurden

freundlicherweise von Prof. Büttner, Zelluläre Chemie, Medizinische Hochschule Hannover,

zur Verfügung gestellt. Die Färbung wurde nach einer 4 % Paraformaldehyd-Fixierung, wie

unter 4.7.7 beschrieben, durchgeführt. Da beide Epitope Oberflächenstrukturen sind,

Ergebnisse 49

erfolgte keine Permeabilisierung Da beide Antikörper den Isotyp IgG1 hatten und aus der

Maus stammen, konnte keine Ko-Färbung erstellt werden. Von den drei Zelllinien HD2,

ASC23 und ΔSt3Gal-3 wurden kortikale Zellen nach 70 Tagen der Differenzierung markiert.

Bei allen drei Zelllinien und bei beiden Färbungen konnten NCAM und PSA-NCAM

nachgewiesen werden. Die Belichtungszeit und die Verstärkung waren in allen Aufnahmen

gleich, trotzdem können anhand dieser Färbungen keine definitiven quantitativen Aussagen

getroffen werden. (Abb. 2.20 und 2.21).

Abbildung 2.20: Neuronales Zell-Adhäsions-Molekül auf kortikalen Zellen. Anti-NCAM-immunfluoreszenzmarkierte kortikale Zellen nach 70 Tagen der Differenzierung jeweils von den Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 (aNCAM, 123C3, 1:642, Prof. Büttner; aMaus IgG Alexa 488, life Technologies, A-11029, 1:200) Maßstab = 50 µm.

50 Ergebnisse

Abbildung 2.21: Polysialylierung von kortikalen Neuronen. Anti-PSA-immunfluoreszenzmarkierte kortikale Zellen nach 70 Tagen der Differenzierung jeweils von den Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3. (aPSA, 735, 1:800, Prof. Büttner, aMaus IgG Alexa 488, life Technologies, A-11029, 1:200) Maßstab = 50 µm.

2.4.5 Glycosylierungsmuster

Für die Analyse der direkten Auswirkungen der ST3GAL3-Mutation auf die

Glycosylierungsmuster der Zellen wurden Proteinlysate von den Zelllinien ΔSt3Gal-3 und

ASC23 jeweils als iPS nach 50 und nach 90 Tagen kortikalen Differenzierung von unserem

Kooperationspartner Prof. Dr. Büttner untersucht. Die Proben wurden zunächst durch

Ultraschallbehandlung in Lysepuffer aufgeschlossen und anschließend mittels einer SDS-

Gelelectrophorese getrennt und auf Nitrocellulose übertragen. Diese wurden mit

verschiedenen Lektinen gefärbt. Es wurden hierfür drei Lektine aus Maackia amurensis

(MAA), Sambucus Nigra (SNA) und Datura stramonium (DSA) verwendet. Das MAA-Lektin

bindet bevorzugt an α-2,3-gebundenen Sialinsäureresten, SNA an α-2,6-gebundenen

Sialinsäureresten und DSA an β-1,4-gebundener Galaktose. In allen Blots wurden 5 oder 10

µg Proteinlysat eingesetzt und mit einer Ko-Färbung auf die Ladungskontrolle GAPDH

überprüft.

Ergebnisse 51

Abbildung 2.22: Lektinblots der Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal3. Lektinblots der Proteinlysate der beiden Zelllinien als iPS und nach 50 (d 50) und 90 (d 90) Tagen Differenzierung. Jeweils 5 bzw. 10 µg Probe wurden aufgetragen. Färbung mit MAA-, SNA- oder DAS-Lektinen, Ladungskontrolle GAPDH. PR: Page Ruler (Marker), pos.: positiv Kontrolle Fetuin 1 µg, neg.: negativ Kontrolle BSA/Asialofetuin 1 µg.

Die Markierung der α-2,3-gebundenen Sialinsäurereste zeigte weder bei den iPS noch bei

den differenzierten Zellen ein verändertes Bandenmuster, lediglich die Bandenintensität

schien bei den Patientenzellen in jedem Zustand etwas stärker zu sein. Die Signale der α-2,6-

Sialinsäure-Färbung zeigten weder im Bandenmuster noch in der Bandenintensität einen

Unterschied. Die Markierung der β-1,4-gebundener Galaktose durch das Lektin DSA zeigte

ebenfalls eine leicht erhöhte Bandenintensität bei den Patientenzellen. Knapp oberhalb der

70-kDa-Bande des Markers war bei dieser Färbung der Patientenzellen eine zusätzliche

Bande erkennbar (Abb. 2.22 weißer Pfeil).

2.4.6 Projektionsneuronen im sich entwickelnden Kortex

Während der neuronalen Differenzierung zu kortikalen Zellen bilden sich aus dem

Neuroectoderm die ersten neuronalen Stammzellen. Diese bestehen zunächst aus apikalen

radialen Gliazellen (RG, PAX6+) und äußeren radialen Gliazellen (oRG, PAX6+), aus denen

später, wie auch in vivo, basale intermediäre Progenitorzellen (ISC, TBR2+) hervorgehen. Alle

drei Arten von neuronalen Stammzellen bilden über asymmetrische Zellteilung den

Ausgangspool für die Neurogenese der kortikalen Neuronen. Die nachfolgende

Neurogenese läuft nach einem stereotypen zeitlichen Muster ab. Hierbei werden die

Projektionsneuronen der verschiedenen Schichten des Kortexes innerhalb von 70 Tagen

nach FGF-Entzug von innen nach außen gebildet. Zunächst werden Neuronen der Lamina VI,

(TBR1+), gefolgt von Lamina V/VI (CTIP2+) und Lamina II-IV (SATB2+), gebildet [88]. Um die

gebildeten Projektionsneuronen und deren relativen Anteil an allen Zellen zu untersuchen,

52 Ergebnisse

wurden neuronal differenzierte Zellen nach 50 Tagen der Patientenzelllinie (ΔSt3Gal-3) und

der Zelllinie des gesunden Geschwisterkindes (ASC23) auf die Marker TBR1 (Kaninchen IgG,

Abcam, ab 31940) und SATB2 (Maus IgG, Abcam, ab51502) gefärbt und anschließend über

eine Messung mit einem BioAnalyzer (Agilent Technologies Inc. Santa Clara, USA)

quantifiziert. Zunächst wurde eine qualitative Immunfluoreszenzfärbung der Zellen mit dem

TBR1-Antikörper (1:200) nach den beschriebenen Protokollen (4.7.6 und 4.7.7)

durchgeführt. Als Sekundärantikörper wurde ein Alexa-Fluor-555-markierter Antikörper

gegen Kaninchen-IgG (1:600) verwendet. Für die Fluoreszenzaufnahmen wurde das Nikon

Eclipse T2000-U und die „Spot advanced“ Software (Spot Imaging Solutions, Sterling

Heights, USA) genutzt. Es wurden von beiden Zelllinien Fluoreszenzaufnahmen des roten

Kanals (TBR1 Signal) und des blauen Kanals (Dapi Signal) erstellt. Bei beiden Zelllinien waren

TBR1-positive Neuronen detektierbar (Abb. 2.23). Da das augenscheinliche Verhältnis von

allen Zellkernen (Dapi, blau) zu den TBR1-positiven Zellen (rot) im Vergleich zwischen

Patientenzellen und gesundem Geschwisterkind unterschiedlich zu sein schien, wurde eine

Quantifizierung der TBR1- und SATB2-Subpopulationen durchgeführt.

Abbildung 2.23: Projektionsneuronen im sich entwickelnden Kortex. Immunfluoreszenzfärbung gegen einen Marker der Kortexschicht VI (Tbr1, Abcam, ab31940, 1:300; aKaninchen IgG-Alexa Fluor 555, Life Technologies, 1:500) jeweils von Kortexneuronen an Tag 50 von gesundem Geschwisterkind (ASC23) und Patientin (ΔSt3Gal3). Maßstabsbalken 50 µm.

Für die Quantifizierung der TBR1- uns SATB2-positiven kortikalen Neuronen wurden die

„Agilent BioAnalyzer Plattform“ und das „Agilent Cell Kit“ sowie die dazugehörigen Chips

verwendet (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA). Die Färbung und Messung der

Zellen erfolgte an das vom Hersteller angelehnte, unter 4.7.10 beschriebene Protokoll. Von

jeder Zelllinie wurden mindestens drei biologische Replikate in jeweils drei technischen

Replikaten gemessen. Bei jeder Messung wurden ungefärbte Zellen als Negativkontrolle und

Ergebnisse 53

Zellen, die nur mit SYTO-16- oder APC-markierten Sekundärantikörpern gefärbt waren,

mitgemessen. Die Auswertung der Messungen erfolgte mittels der „Agilent 2100 Expert

Software“. Die Schwellenwerte für die Farbstoffe wurden anhand der mitgemessenen

Negativkontrolle und Sekundärantikörperkontrolle für jeden Chip individuell ermittelt und

auf die gemessenen Proben angewendet. Zunächst wurde die Population aller Zellen

anhand der SYTO-16-Kontrolle definiert. Hierfür wurde der Schwellenwert für den blauen

Kanal so definiert, dass der Hauptteil der SYTO-16-positiven Population eingeschlossen

wurde. Danach wurden von diesen Zellen die falsch-positiven Signale anhand der

Sekundärantikörperkontrolle ausgeschlossen, indem der Schwellenwert für den roten Kanal

so gelegt wurde, dass der Hauptteil der APC-positiven Population ausgeschlossen wurde.

Blieben trotzdem einzelne positive Ausreißersignale innerhalb der Auswahl der

Sekundärantikörperkontrolle, wurden diese von den Ergebnissen subtrahiert.

Abbildung 2.24: Quantifizierung der Projektionsneuronen. Geschwisterkind- (ASC23) und Patientenzellen (ΔSt3Gal-3) nach 50 Tagen kortikaler Differenzierung mit Tbr1- (Abcam, ab31940, 1:100) oder SATB2- (Abcam, ab51502, 1:50) Antikörpern markiert und mit APC-markierten Sekundärantikörpern (Life Technologies, A-10931, 1:350, A-865, 1:100, Ex/Em 650/660) im roten Kanal (Ex/Em 630/680) sichtbar gemacht. Die Gesamtmenge der Zellen wurde über eine Anfärbung aller Zellkerne mit SYTO 16 (Life Technologies, S7578, 1nM, Ex/Em 488⁄518) im blauen Kanal (Ex/Em 470/525) bestimmt. (A) Exemplarische Punktdiagramme der Tbr1- und SATB2-Färbung jeweils von gesundem Geschwisterkind (ASC23) und Patientin (ΔSt3Gal3). (B) Relative Mengen aller Tbr1- bzw. SATB2-positiven Zellen jeweils von gesundem Geschwisterkind (ASC23, grün, 54.51 % (Tbr1) , 5.65 % (SATB2)) und Patientin (ΔSt3Gal3, rot, 23.88 % (Tbr1), 4.54 %(SATB2)). Grafik und Statistik erstellt mit Graphpad Prism 6. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler zum arithmetischen Mittel, wobei n = 9.

Im Mittel ergaben sich aus den Punktdiagrammen für die Zellen des gesunden

Geschwisterkindes 54.51 % TBR1-positive Zellen und 5.65 % SATB2-positive Zellen. Für die

Zellen der Patientin ergaben sich 23.88 % TBR1-positive Zellen und 4.54 % SATB2-positive

Zellen (Abb. 2.24). Die Student‘s t-Tests zeigten für alle Ergebnisse eine deutliche Signifikanz

(ASC23: <0.0001 (TBR1), 0.0029 (SATB2); ΔSt3Gal3: <0.0001 (TBR1), <0.0001 (SATB2)). Die

Subpopulation an kortikalen TBR1-positiven Projektionsneuronen ist beim gesunden

54 Ergebnisse

Geschwisterkind mehr als doppelt so hoch (2.28) wie bei der Patientin, wohingegen der

Unterschied in der Population der SATB2-positiven Neuronen nicht signifikant ist. Die

Rohdaten der einzelnen Replikate können in Tabelle 14 im Anhang eingesehen werden.

Ergebnisse 55

2.4.7 Neuronale Stammzellen

Projektionsneuronen entstehen durch asymmetrische Zellteilung aus neuronalen

Stammzellen, wie z.B. radialen Gliazellen (RG) und intermediären neuronalen Stammzellen

(ISC) (siehe auch 2.4.6). Um diese beiden Ursprungspopulationen der Neuronen näher zu

charakterisieren, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen zwei Marker für diese

Zelltypen durchgeführt. Radiale Gliazellen exprimieren den Transkriptionsfaktor PAX6, sie

bilden den Hauptteil der Zellen innerhalb der Rosettenstrukturen. Durch asymmetrische

Zellteilung können aus den radialen Gliazellen intermediäre neuronale Stammzellen

entstehen. Die ISC haben einen größeren Zellkörper und im Gegensatz zur bipolaren

Morphologie der radialen Gliazellen keine Fortsätze, sie befinden sich gehäuft in

Randgebieten der Rosetten. Die Expression des ISC-spezifischen Transkriptionsfaktors TBR2

verdrängt dabei vollständig die Expression von PAX6 [108]. Untersucht wurden Zellen nach

35 Tagen kortikaler Differenzierung jeweils von der Patientin (ΔSt3Gal-3) und vom gesunden

Geschwisterkind. Fixierungen und Ko-Färbungen wurden wie unter 4.7.6 und 4.7.7

beschrieben durchgeführt. Für beide Zelllinien konnten sowohl Signale für die radialen

Gliazellen (grün) als auch für die intermediären neuronalen Stammzellen (rot) nachgewiesen

werden. In beiden Proben bildeten die RGs den Hauptteil der Rosettenstrukturen. Die ISCs

waren hauptsächlich in den Randgebieten der Rosetten zu finden. In keiner Probe wurden

Zellen detektiert, in denen beide Transkriptionsfaktoren gleichzeitig exprimiert wurden

(Abb. 2.25).

Abbildung 2.25: Neuronale Stammzellen. Immunfluoreszenzbilder von gefärbten kortikalen Zellen nach 35 Tagen Differenzierung jeweils von Patient (ΔSt3Gal-3) und gesundem Geschwisterkind (ASC23). Radiale Gliazellen PAX6

+ (aPax6,

SCB, SC-81649, 1:300, grün) und intermediäre Stammzellen TBR2+ (aTbr2, Abcam, ab23345, 1:100, rot) Maßstabsbalken 50

µm. Die Aufnahmen der verschiedenen Zelllinien wurden im selben Fluoreszenzkanal mit denselben Belichtungszeiten und Verstärkungen aufgenommen.

56 Diskussion

3. Diskussion

3.1 Etablierung und Validierung eines patientenspezifischen iPS-Modells

Bisher verwendete artifizielle in-vitro-Modelle für komplexe kognitive Erkrankungen

konnten zwar gegebenenfalls den Zelltyp von Interesse abbilden, Untersuchungen an

komplexen dreidimensionalen Zusammenhängen aber nicht darstellen. In-vivo-Modelle, wie

die Maus, können diese Zusammenhänge hingegen abbilden, zeigen jedoch eine deutlich

niedrigere zerebrale Komplexität im Vergleich zum humanen Gewebe [54]. Da es

normalerweise nicht möglich ist, Gewebematerial vom betroffenen lebenden Patienten zu

erhalten, bieten patientenspezifische iPS die momentan beste Möglichkeit, dieses Gewebe

in vitro abzubilden. Für die vorliegende Arbeit konnte ein patientenspezifisches iPS-Modell

genutzt werden. Hierfür wurden Fibroblasten einer Patientin mit der homozygoten

Punktmutation c.958G>C im ST3GAL3-Gen, ursächlich für eine schwere Form des West-

Syndroms, und einem weiblichen gesunden Geschwisterkind homozygot für das Wildtypallel

reprogrammiert [3]. Für die Reprogrammierung wurde ein lentivirales Vektorsystem

genutzt. Die morphologischen und epigenetischen Veränderungen wurden durch die

persistente Integration der vier Yamanaka-Faktoren [63, 71] in das Genom und deren

exogene Expression angestoßen.

Um die Vergleichbarkeit der beiden erhaltenen Linien zu gewährleisten, wurden die

Auswirkungen der Reprogrammierung genau untersucht. Von jeweils einem iPS-Klon der

Patientin und des gesunden Geschwisterkindes, die die morphologischen Kriterien für

Stammzellen erfüllten, wurden sowohl die genetischen und epigenetischen Veränderungen

als auch ihre Pluripotenz genauer untersucht. Die Pluripotenz der Linien konnte mittels

Immunfluoreszenzfärbungen und quantitativer PCR ausgewählter pluripotenzassoziierter

Faktoren bestätigt werden [62]. Darüber hinaus belegte die erfolgreiche Differenzierung zu

kortikalen Neuronen die Fähigkeit zur Pluripotenz für mindestens eine der drei

Keimblattrichtungen.

Auf den Einsatz von Teratoma zum Nachweis der Pluripotenz beider Linien wurde innerhalb

dieser Arbeit aus ethischen und zeitlichen Gründen komplett verzichtet. Für einen Teratom-

Assay werden immundefizienten Mäusen iPS injiziert und beobachtet, ob diese einen nicht-

malignen Tumor entwickeln, der eine Mixtur aus Zellen aller drei Keimblätter enthält [68]. Er

Diskussion 57

galt lange Zeit als Standardmethode, um Pluripotenz der iPS zu validieren. Problematisch

hierbei ist allerdings, dass dieser die tatsächliche Bildung aller humanen Zelltypen, ebenso

wie die Beteiligung an allen Keimblättern, nicht eindeutig nachweisen kann [120]. Darüber

hinaus ist der Erfolg eines Teratom-Assays von der Injektionsstelle abhängig und weder

diese noch das Alter der Mäuse oder die Zahl der Zellen, die injiziert werden, sind bei diesen

Assays standardisiert [121]. Wir hoffen, dass die erfolgreiche Differenzierung zu kortikalen

Neuronen, neben der Expression der ausgewählten pluripotenzassoziierten Faktoren,

ausreichend belegt, dass die Zellen pluripotent sind. Für zukünftige Arbeiten wäre es

angebracht, auch das Potenzial für Differenzierungen in die beiden anderen Keimblätter,

Endoderm und Mesoderm, beispielsweise über die Differenzierung zu Cardiomyocyten und

hepatische Zellen nachzuweisen.

Allgemein unterliegen iPS-Linien eines gemeinsamen Donors einer hohen genetischen und

epigenetischen Varianz, die ihren Einsatz als Modell für genetisch bedingte Erkrankungen,

aber auch regenerative Methoden in Frage stellen. Die Varianz der Linien kann neben den

Auswirkungen auf die Pluripotenz auch das Differenzierungspotential der Linien

beeinflussen [122] und wird deshalb im Vorfeld funktionaler Untersuchungen stringent

untersucht. All diese Unterschiede können dazu führen, dass die Vergleichbarkeit der Linien

für komparative Studien wie unsere nicht mehr gewährleistet ist. Die Ursachen dieser

Varianz können einerseits im gewählten somatischen Ausgangsmaterial, im

Reprogrammierungsprozess oder auch am Selektionsdruck während der Langzeitkultur

liegen [123].

Im Folgenden soll untersucht werden, welche verschiedenen Faktoren zu einer erhöhten iPS

Varianz führen können und wie wir versucht haben, diese Fehlerquellen zu überprüfen.

– Genetische Ursachen – Die genetischen Variationen in iPS können von Aneuploidien, über

subchromosomale „copy number variations“ (CNV) bis hin zu „single nucleotide variations“

(SNVs) reichen. Aneuploidien treten in ca. 13 % aller iPS- und hES-Linien auf [124], wobei

Trisomie 12 am häufigsten vorliegen. Sie korrelieren meist mit einer höheren Passagenzahl

und beruhen auf einer positiven Selektion während der Kultur. Das Chromosom 12 enthält

unter anderem die Pluripotenzgene NANOG und GDF3, wodurch sich ein Selektionsvorteil

bei einer Trisomie 12 erklären lässt [125]. CNVs treten ebenfalls vermehrt vor

Pluripotenzgenen wie DNMT3B auf und deuten auf eine Selektion während der

58 Diskussion

Langzeitkultur hin [126]. Einen zusätzlichen Ursprung soll der Prozess der

Reprogrammierung darstellen, wobei aber viele der Deletionen wahrscheinlich durch den

Selektionsdruck während der Langzeitkultur wieder verloren gehen [127]. In einer Deep-

Sequencing-Studie zu CNVs in iPS konnten die Ergebnisse der bisherigen arraybasierten

Studien (Laurent, Hussein) hingegen nicht bestätigt werden. Im Durchschnitt konnten nur

zwei CNVs pro Linie gefunden werden, die nicht schon im somatischen Ausgangsmaterial zu

finden waren [128]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die meisten CNVs ihren

Ursprung nicht im Reprogrammierungsprozess haben, sondern im geringgradigen CNV-

Mosaizismus des somatischen Ausgangsgsmaterials. In iPS-Linien konnten durchschnittlich

zwölf SNVs gefunden werden, wobei mehr als die Hälfte schon im Ausgangsmaterial

vorhanden war und keine Zusammenhänge zwischen der Art des Ausgangsmaterials oder

des Reprogrammierungsprozesses gefunden werden konnten [129-131].

Als Methode für die Reprogrammierung unserer Fibroblasten wurde ein integrierendes

lentivirales Vektorsystem genutzt. Die persistente Integration der Viruskassette in das

Wirtsgenom kann je nach Integrationsort unvorhergesehene Auswirkungen für die isolierte

Linie haben. Neben den integrierenden Methoden gibt es mittlerweile etliche nicht-

integrierende Systeme, die mRNA, Sendai-Viren [67] oder episomale mRNA [132] nutzen.

Der Hauptvorteil dieser Methoden besteht darin, dass das Genom nicht durch die

Integration verändert wird. Da unsere Zellen nicht für den Einsatz in regenerativen

Methoden vorgesehen waren, spielte für die Auswahl hauptsächlich die Anwendbarkeit der

Methoden eine Rolle. Mit einer Effizienz von 0,27 %, einem Erfolg von 95 - 100 %, und einer

Aneuploidierate von 4.5 % ist die lentivirale Methode immer eine der besten im Vergleich zu

den nicht-integrierenden Methoden [133]. Da alle anderen Methoden einen

kostenintensiven, kommerziellen Erwerb der Reagenzien voraussetzen, ist die lentivirale

Methode die günstigste Alternative.

In den meisten bisherigen Arbeiten wurde die genetische Integrität nur mittels

Karyotypisierungen, oder „Fluorescence in situ hybridization“ (FISH)-Analysen überprüft.

Wir konnten die genetische Integrität beider Linien anhand der unauffälligen Ergebnisse der

Array-CGH wie der FPNI-PCR validieren. Mittels der Array-CGH-Ergebnisse konnten wir

zeigen, dass keine chromosomalen Aneuploidien und darüber hinaus, im Gegensatz zur

FISH-Analyse, das keine CNVs in den Linien vorliegen. Das Auftreten von SNVs kann diese

Methode ebenfalls nicht untersuchen. Mittels der FPNI-PCR konnten wir erstmals den

Diskussion 59

genauen Integrationsort der Viruskassetten zeigen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen

zeigen, dass durch die Verwendung eines integrierenden Reprogrammierungssystems keine

offenen Leserahmen gestört wurden und somit die genetische Integrität erhalten blieb.

– Epigenetische Ursachen – Epigenetische Veränderungen reichen von variabler X-

Chromosom-Aktivierung über veränderte Histon-Acetylierungs bis hin zu DNA-

Methylierungsmustern, die in einer differentiellen Expression resultieren können.

Während der Reprogrammierung kann es zu einer Veränderung der X-Chromosom-

Inaktivierung kommen. In seltenen Fällen kann nach der Reprogrammierung eine

Aktivierung beider Chromosomen auftreten, häufiger aber kommt es zu einem Wechsel

zwischen aktivem und inaktivem Chromosom [134]. Der Wechsel zwischen den

Chromosomen stellt hauptsächlich ein Problem für Untersuchungen von X-chromosomal

rezessiven Erkrankungen dar. Im Fall einer Studie zum Rett-Syndrom konnte dieser Umstand

sogar zum Vorteil genutzt werden, um zwei isogene iPS-Linien zu isolieren [58].

Die Ursachen für Variationen im DNA-Methylierungs- und Histon-Deacethylierungsmuster

und damit einhergehender Veränderungen des Expressionsprofils von iPS können sowohl

das variierende Ausgangsmaterial aus verschiedenen somatischen Quellen als auch der

Reprogrammierungsprozess an sich sein [131]. Je länger diese Zellen kultiviert werden,

desto geringer wurden die Unterschiede [135]. In den meisten Fällen wurden die DNA-Hypo-

und

-Hypermethylierungsmuster des Ausgangsmaterials in den iPS-Linien beibehalten. Dies

spricht für eine nicht vollständige Reprogrammierung [136, 137].

Epigenetische Veränderungen drücken sich häufig in einem differentiellen Expressionsprofil

aus. Die beiden von uns validierten Klone ΔSt3Gal-3 und ASC23 zeigten in der

vergleichenden RNA-Sequenzierung kaum Unterschiede im Expressionsprofil, was auch

durch die Hauptkomponentenanalyse der iPS, hES und gingivalen Fibroblasten bestätigt

werden konnte. Diese Ergebnisse geben uns einen Hinweis darauf, dass sich auch die DNA-

Methylierungsmuster beider Linien nicht bedeutend voneinander unterscheiden. Die

auffälligsten signifikant differentiell exprimierten Gene der Vergleiche zwischen iPS von der

Patientin und gesundem Geschwisterkind waren maternal oder paternal geprägte Gene. Ob

die Expression der verschiedenen Allele durch den Reprogrammierungsprozess eingeführt

wurde [135], oder ob diese Allele schon im Ausgansmaterial exprimiert wurden, können wir

60 Diskussion

anhand unserer Ergebnisse leider nicht beantworten. Es ist möglich, dass sich das

Expressionsprofil der Patientenzellen in vivo, also während der Entwicklung der Patientin

deutlicher von dem des gesunden Geschwisterkindes unterscheiden würde und hier nur

eine artifizielle Ähnlichkeit vorliegt. Da unsere Patientin neben den kognitiven

Einschränkungen und der schweren Epilepsie aber keine Beteiligung anderer Gewebe zeigt,

scheint ein großer Unterschied im Genexpressionsprofil auf Stammzellebene

unwahrscheinlich. Um diese Bedenken gänzlich ausräumen zu können, wäre es notwendig,

weitere Klone der Patientin und des gesunden Geschwisterkindes für die funktionalen

Analysen einzusetzen.

– Klonale Varianz – Für die Untersuchungen von monogenen, erblich bedingten

Erkrankungen streben viele Gruppen einerseits die Verwendung von isogenen Kontrollen,

andererseits die Analyse von mehreren Klonen dieser Linien an [57, 94]. Als Vorteil erhofft

man sich einerseits einen identischen genetischen Hintergrund und andererseits eine

Streuung der Varianz in CNVs, SNVs und epigenetischen Mustern. Nach der

Reprogrammierung können die schon genannten epigenetischen Veränderungen dazu

führen, dass es zu einer hohen Varianz zwischen den einzelnen isolierten und expandierten

Klonen kommen kann [135, 138]. Besonderen Einfluss hat hierbei das sich ändernde DNA-

Methylierungs- und Histon-Acetylierungsmuster. Dieses kann zur Folge haben, dass sich

auch das Genexpressionsprofil umformt. Solche Änderungen können einerseits die

Vergleichbarkeit der Patientenzellen mit denen der Kontrolle beeinträchtigen, darüber

hinaus kann sich aber auch die Tendenz, in welche Richtung des Keimblattes diese Zelllinien

besser differenzierbar sind, ändern.

Um isogene Kontrollen zu erhalten, werden mittlerweile häufig Zinkfingernukleasen oder

das antivirale Abwehrsystem CRISPR aus Bakterien [139] verwendet. Hierbei wird gezielt das

Genom an einer bestimmten Stelle verändert, so dass ein Gendefekt eingeführt oder

korrigiert werden kann. Dies konnte bisher auf Pflanzen, Mäuse und humane permanente

und Primärzellen angewendet werden [140-142]. Die Einführung dieser genetischen

Veränderung ist sehr effizient und einfach in der Handhabung. Da die Selektion und

Expansion der erfolgreich editierten Zellen aber vor allem bei humanen Stammzellen sehr

aufwendig sein kann und zum Startzeitpunkt meiner Arbeiten (2012) noch nicht vollständig

erforscht war, wurde auf die Verwendung isogener Kontrollen innerhalb dieser Arbeit

verzichtet. Auch trotz der Nutzung von isogenen Kontrollen, können nicht alle

Diskussion 61

Veränderungen verhindert werden. Dies sind vor allem die Einflüsse einer extensiven

Langzeitkultur sowie der geringfügige Mosaizismus im Ausgangsmaterial.

Für die Erstellung unseres iPS-Modells wurde darauf geachtet, möglichst viele Fehlerquellen

von Anfang an zu umgehen. Veränderungen, die auf das somatische Ausgangsmaterial

zurückzuführen sind, wurden durch die Auswahl an gleichem Ausgangsmaterial

(Fibroblasten) vermieden. Um Veränderungen, die durch den Reprogrammierungsprozess

auftreten können, zu minimieren, wurde einerseits ein multicistronisches, lentivirales

Vektorsystem genutzt, welches nur eine Integrationsstelle pro Transkriptionskassette

erfordert [143] und so die Stöchiometrie verbessert, Zum anderen wurden der Histon-

Deacetylase-Inhibitor Valproinsäure [72] und Ascorbinsäure [73] direkt nach der

Transduktion eingesetzt, um Veränderungen der Genprägung, wie zum Beispiel beim Dlk-

Dio3-Lokus, zu verhindern. Darüber hinaus haben wir Fibroblasten einer direkten

Verwandten mit gleichem Geschlecht für die Reprogrammierung der Referenzlinie

ausgewählt. Wir erhofften uns, dass der genetische Hintergrund beider Geschwister einer

isogenen Kontrolle möglichst nah kommt. Nicht zuletzt zeigt uns die vergleichende RNA-

Sequenzierung, dass unser Modell die gleichen Anforderungen erfüllt, die auch an ein

isogenes Modell gestellt werden

Die Erfüllung aller von uns überprüften Qualitätskriterien an eine iPS Linie durch das

vorliegende patientenspezifische iPS-Modell schafft die Voraussetzung für die folgenden

komparativen Studien zur Charakterisierung des monogen erblich bedingten West-

Syndroms. Die unauffälligen Array-CGH- sowie RNASeq-Ergebnisse zeigen uns, dass das von

uns etablierte Modell nicht nur die Qualitätskriterien einer iPS-Linie erfüllt, sondern sich

darüber hinaus gut als Alternative zu einem isogenen Modell eignet.

3.2 Kortikale Differenzierung nach Yichen Shi et al.

Die komparativen Untersuchungen der Linien der Patientin und des gesunden

Geschwisterkindes zeigten keine signifikanten Unterschiede auf iPS-Ebene. Diese Ergebnisse

überraschten nicht, da die Patientin einen ausschließlich kognitiv beeinträchtigten Phänotyp

zeigt, ohne Beteiligung anderer körperlicher Systeme. Neben der starken geistigen

Behinderung zeigt unsere Patientin auch epileptische Anfälle. Da der Anfang solcher Anfälle

vorrangig im kortikalen Gewebe des Gehirns zu finden sein soll [111] und die ST3GAL3-

Expression hier auch im adulten Gewebe mit die höchsten Level zeigte, wurde eine

62 Diskussion

Differenzierung zu kortikalen Neuronen und neuronalen Netzwerken etabliert. Jeweils

Patienten-iPS und iPS des gesunden Geschwisterkindes konnten in mehreren Ansätzen zu

kortikalen Neuronen differenziert werden. Ihre kortikale Identität wurde mittels qPCR und

Immunfluoreszenzfärbungen kortexassoziierter Marker bestätigt [112].

Für die Auswahl des passenden Differenzierungsprotokolls von iPS zu neuronalen Zellen gibt

es bisher etliche gut etablierte Protokolle. Die meisten dieser Protokolle wurden zwar

anfänglich für embryonale Stammzellen etabliert, konnten aber erfolgreich auf die

Anwendung mit induzierten Stammzellen übertragen werden [144, 145]. Diese

unterscheiden sich nicht nur im methodischen Weg und der Effizienz, sondern vor allem

auch in der Prägung auf verschiedene subzerebrale Identitäten entlang der rostro-caudalen

und anterior-posterioren Achsen des Gehirns. Eine der ersten Methoden zur Differenzierung

von Stammzellen zu Neuronen nutzt den Übergangszustand der embryonalen Körperchen

(embroyid bodies; EB). Hierbei werden die Stammzellkolonien als Sphären in Suspension für

mehrere Tage kultiviert. Nach anschließender erneuter Kultur im Monolayer bilden sich aus

den Kolonien Zellen aller drei Keimblätter [75]. Diese Technik konnte durch die Einführung

definierter Medien [146], hängender Tropfenkultur [147] oder Aggrewell-Platten für eine

definiertere Größe der embryonalen Körperchen [148] zwar verbessert werden, ihre

Nachteile aber nicht überwiegen. Zum einen ist die Effizienz der Differenzierung relativ

niedrig und die neuronalen Stammzellen müssen manuell oder enzymatisch isoliert werden.

Des Weiteren ist die Durchführung der Methode anspruchsvoll und langwierig. Der größte

Nachteil ist, dass kaum Einfluss auf die Entwicklung im frühen Stadium der neuronalen

Stammzellen innerhalb der embryonale Körperchen genommen werden kann, [77], um sie

so für eine bestimmte zerebrale Identität zu prägen. Eine andere Methode ist die Kokultur

von Stammzellen mit ausgereiften Zellen. So können unter anderem durch die Kokultur mit

stromalen Mauszellen (PA6) dopaminergen Neuronen [149] oder mit Maus-Myoblasten

(C2C12) Motorneuronen [84] erhalten werden. Nachteil sind die undefinierten

Bedingungen, die eine zweite, zudem artfremde Zelllinie mit sich bringt und die Fähigkeit,

diese zu kultivieren.

Das von uns verwendete Protokoll basiert auf der Methode der dualen SMAD-Inhibition

[77]. Hierbei werden die iPS im konfluenten Monolayer kultiviert und eine Differenzierung

zu neuroektodermalen Zellen durch die Zugabe der beiden SMAD-Inhibitoren SB431542 und

Noggin induziert. Diese Agenzien inhibieren die TGFβ/Activin/Nodal und BMP-Signalwege

Diskussion 63

und unterdrücken so eine Differenzierung der iPS zu Mesoderm und Endoderm [77, 150].

Nach einer ersten Passage kann man mittels dieser Methode eine fast 100 % Konversion zu

neuronalen Stammzellen erhalten. Durch die Exposition der neuronalen Stammzellen mit

verschiedenen Faktoren und Inhibitoren kann die weitere Differenzierung zu verschiedenen

neuronalen Subtypen wie Motorneuronen, dopaminergen Neuronen oder Zellen der

Neuralleiste angeregt werden [77, 151]. Einer der größten Vorteile dieses Protokolls ist die

Möglichkeit, die Zellen frühzeitig mit Agenzien zu beeinflussen, um die Prägung auf eine

bestimmte subzerebrale Identität zu begünstigen. Das von uns verwendete Protokoll für die

Differenzierung von kortikalen Neuronen basiert auf dem Originalprotokoll zur dualen

SMAD Inhibition und vereint etliche Verbesserungen mit der frühzeitigen Exposition der

Zellen mit Retinolsäure [112]. Interessanterweise konnte nur durch die frühzeitige Addition

von Retinolsäure zum neuronalen Induktionsmedium eine Prägung auf die frontale kortikale

Identität der Zellen begünstigen. Dies Ergebnisse widersprechen der allgemein vertretenen

Meinung, dass Retinolsäure aufgrund seines Konzentrationsgradienten hauptsächlich für die

Entwicklung posteriorer/dorsaler Gebiete notwendig ist [152]. Das relativ teure,

rekombinante Protein Noggin wurde hierbei durch den BMP-Inhibitor Dorsomorphin

ausgetauscht [78, 153]. Die Handhabung der Methode hingegen gestaltete sich schwieriger

als vermutet, gerade die korrekte Passage des Neuroectoderms in adäquater

Fragmentgröße musste mehrfach optimiert werden. Einen deutlichen Vorteil hingegen bot

die Möglichkeit, die kortikalen neuronalen Stammzellen zu kryopräservieren. So konnte

dieselbe erfolgreich differenzierte Charge an Zellen mehrfach für verschiedene Experimente

eingesetzt werden, ohne die gesamte Differenzierung und Validierung wiederholen zu

müssen.

Nach der neuronalen Induktion der iPS zu kortikalen Stammzellen können sich aus diesen

Zellen fast alle kortikalen Zelltypen, wie Projektionsneuronen und Astrocyten entwickeln.

Die Differenzierung zu Interneuronen kann dieses Protokoll hingegen nicht abbilden, da

Interneuronen in der subpalliativen, proliferativen Zone des Telencephalons gebildet

werden, bevor sie in den Neokortex migrieren [154]. Eine Besonderheit des Protokolls ist,

dass die Neurogenese der Projektionsneuronen in vitro nach dem gleichen zeitlichen und

strukturellen Muster abläuft, wie während der Embryogenese in vivo [88]. Dies ermöglicht

es uns nicht nur, Veränderungen in einem bestimmten voll entwickelten neuronalen Subtyp

zu untersuchen, sondern auch Veränderungen, die nur in einem zeitlich begrenzten Rahmen

64 Diskussion

während der Neurogenese auftreten, näher zu erforschen. Gerade gegenüber den bisher

verwendeten Mausmodellen eröffnet uns diese Eigenschaft mögliche Störungen im

Zusammenspiel der verschiedenen neuronalen Stammzellen, wie äußeren radialen

Gliazellen oder intermedialen neuronalen Stammzellen (IPC), welche kaum in der Maus

vorhanden sind, zu beobachten [54, 155]. Der gesamte Ablauf der zerebralen Entwicklung

von Mensch und Nager unterscheidet sich deutlich voneinander; 20 % aller Gene werden

während dieser Entwicklung differentiell exprimiert [156]. Um das in-vitro-Modell der

patientenspezifischen iPS noch mehr an die tatsächliche Situation in vivo anzunähern,

könnten sie zu dreidimensionalen zerebralen Organoiden differenziert werden. Anhand

dieser zerebralen Organoide kann ein semi-organisiertes, humanes Gehirngewebe in vitro

untersucht werden. Besondere Merkmale hierbei sind, dass sich dorsale prosencephalische

Bereiche mit Progenitorzellen und primitiven kortikalen Schichten beobachten lassen (bis

Lamina V/VI). Darüber hinaus können auch Bereiche nachgewiesen werden, die auf den

Hippocampus und den ventralen Prosencephalon spezialisiert sind [157].

Für die Validierung der kortikalen Identität mittels qPCR wurden Zellen nach 20 Tagen

Differenzierung gegen die korrespondierenden iPS verglichen. Hierbei konnte für jede

untersuchte Differenzierung ein Anstieg in der Expression von fünf kortexassoziierten

Markern und der drastische Rückgang eines pluripotenzassoziierten Gens und somit eine

erfolgreiche Differenzierung nachgewiesen werden.

Im Gegensatz zum Originalprotokoll haben wir darüber hinaus für eine noch detailliertere

komparative Untersuchung des Genexpressionsprofils beider Linien vergleichende gesamt

RNA-Sequenzierungen von Patientin und gesundem Geschwisterkind jeweils von zwei

Proben nach 50 Tagen sowie zwei Proben nach 90 Tagen Differenzierung auf der SOLiD

5500XL-Plattform durchgeführt. Anschließend wurden dann die einzelnen Ergebnisse mit

einander verglichen. Im Detail waren hier die Vergleiche der beiden Linien im

differenzierten Zustand (2 ASC23 d50 vs ΔSt3Gal-3 d50 und 3 ASC23 d90 vs ΔSt3Gal-3 d90)

und der iPSC mit ihren jeweiligen differenzierten Zustände (4 ASC23 iPSC vs ASC23 d50; 5

ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50) interessant. Die Replikate beider Linien stammten jeweils

von derselben Differenzierung. Von allen Vergleichen wurde berechnet ob verschiedene

GO-Terme der DE-Gene vermehrt vorkommen und durch ihre Verwandtschaft ein Cluster

mit ähnlicher Funktion bilden.Die DAVID-Analysen der signifikant differentiell exprimierten

Gene der Vergleiche 4 und 5 (4 ASC23 iPSC vs ASC23 d50; 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50)

Diskussion 65

unterstützen die qPCR-Analysen und zeigen eindeutig, dass vermehrt Gene annotiert zur

Genothologie (GO-Term) „neuronal differentiation“- und „forebrain“-Entwicklung exprimiert

wurden (Tabelle 2.2).

Bei den Vergleichen 4 und 5 fielen neben den zu erwartenden GO-Termen „glycoprotein“,

„neuron differentiation“, „cell motion“ und „forebrain development“ auch GO-Terme zur

Entwicklung anderer Gehirnbereich wie dem „hindbrain“ oder „neural crest cell“/“eye

development“ auf. Für den Vergleich 4 (gesundes Geschwisterkind) ist dies das Cluster 12,

für den Vergleich 5 (Patientin) sogar das Cluster 8. Noch deutlicher wird dies, wenn man sich

die Enrichment Analyse der Vergleiche der differenzierten Zellen direkt gegeneinander

betrachtet (2 ASC23 d50 vs ΔSt3Gal-3 und 3 ASC23 d90 vs ΔSt3Gal-3 d90) Für den Vergleich

2 ist es das erste Cluster mit einem Enrichment score von 2,57 und für den Vergleich 3 das

zweite Cluster mit einem Enrichment score von 3,99. Beide Cluster verdeutlichen, dass in

den kortikal differenzierten Zellen viele Gene exprimiert werden, die während einer

Differenzierung anderer zerebraler Bereiche, wie dem Rhombencephalon („hindbrain“) oder

dem Auge, eine Rolle spielen. Interessanterweise sind die Gene mit den GO-Termen zur

Entwicklung von Augenzellen nur bei der Patientin erhöht exprimiert. Die verschiedenen

Teile des menschlichen Auges entwickeln sich aus allen drei Keimblättern, mesoderm,

endoderm und ectoderm. Hierbei sind die Zellen der Neuralleiste, die sich ebenfalls wie die

Kortexneuronen aus dem Neuroectoderm entwickeln, unter anderem für die Bildung der

Linse verantwortlich [158]. Das wir bei der Differenzierung der Patientenzellen vermehrt

Gene mit den GO-Termen „sensory organ development“ und „neural crest“ finden, könnte

daran liegen, dass sich aus dem Neuroectoderm während der Differenzierung neben den

kortikalen Stammzellen auch Zellen der Neuralleiste gebildet haben.

Betrachtet man diese Ergebnisse im größeren Zusammenhang zeigt die RNA-Sequenzierung

der kortikal differenzierten Zellen, dass es sich hierbei nicht um einen klar abgegrenzten

Prozess handelt, sondern eine Differenzierung in viele andere Bereiche unterschwellig

stattfindet. Da bisher noch keine anderen Arbeiten über RNA-Sequenzierungen zur

kortikalen Differenzierung veröffentlicht wurden, auch nicht in der Originalarbeit von Shi

und Kollegen, können wir anhand unserer Ergebnisse nicht eindeutig beantworten, ob sich

hierbei tatsächlich eine eigenständige neuronale Subpopulation gebildet hat oder ob es sich

um die differentielle Expression in allen Zellen handelt. Schaut man sich allerdings, ohne

einen Vergleich, die in beiden Linien am häufgsten exprimierten Gene an, so ist die reine

66 Diskussion

Expressionshöhe der Gene der „forebrain“-Entwicklung gegenüber denen, die an der

Differenzierung der anderen Bereiche beteiligt sind, so deutlich viel höher (RPKM), dass wir

davon ausgehen, dass die Zellen trotzdem hauptsächlich dem frontalen Kortex zuzuordnen

sind (Anhang Tabelle 11-13).Dies wird ebenfalls dadurch unterstrichen, dass die Ergebnisse

der qPCR und der Immunfluoreszenzfärbung im Vergleich zu den Arbeiten von Shi und

Kollegen die gleichen Erwartungen erfüllen, weshalb wir davon ausgehen, dass ihr Einsatz in

den funktionellen Analysen hierdurch nicht beeinträchtigt ist. Um diese Unsicherheit aber

gänzlich ausräumen zu können, hätte während der Differenzierung anhand einer FACS-

Analyse mit passenden Markern gegen kortikale Zellen und Zellen der Neuralleiste eine

Quantifizierung der Zellen vorgenommen werden müssen. Da nicht mehr von allen

Differenzierungsansätzen Zellen vorhanden sind, kann dies nicht nachgeholt werden. Für

folgende Experimente sollten die bereits bestehenden Qualitätskontrollen durch qPCR und

Immunfluoreszenzfärbung auch auf Marker anderer zerebraler Bereiche, wie dem

Rhombencephalon, Mesencephalon und der Neuralleiste, ausgeweitet werden, um die

Effizienz der kortikalen Differenzierung zu überprüfen.

3.3 Glycosylierung und zelluläre Adhäsion

In vorherigen Studien konnte schon gezeigt werden, dass die Sekretion der von uns

untersuchten Mutation im Sialylmotiv-S (p.Ala320Pro) der ST3GAL3 gestört ist sowie ein

vollständiger enzymatischer Aktivitätsverlust vorliegt [5]. Darüber hinaus zeigten unsere

Untersuchungen mit LMTK- Zellen, dass bei Überexpression unserer Mutationsvariante eine

gestörte Lokalisierung außerhalb des Golgi-Apparates vorliegt.

Daraus resultierend zeigten die Patientenzellen nach 50 und 90 Tagen Differenzierung eine

zusätzliche Bande in der DAS-Lektinfärbung bei 70 kDa. Das Lektin DAS bindet an

endständigen β-1,3-gebundenen Galactoseresten, welche auch eines der Hauptedukte der

ST3GAL3 sind. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die ST3GAL3, entgegen der bisherigen

Annahme, eine erhöhte Target Spezifikation besitzt und dieses Target beim Wegfall ihrer

enzymatischen Aktivität als zusätzliche Bande in der DAS Färbung sichtbar wird.

Zudem zeigen die Ergebnisse des Zelladhäsions Assays, dass Patientenzellen nach kortikaler

Differenzierung deutlich schneller an den Untergrund adhärieren, als gleich lang

differenzierte Zellen des gesunden Geschwisterkindes.

Für die weitere Untersuchung der Ursachen der erhöhten Zelladhäsion bei Patientenzellen

Diskussion 67

wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt. Die erste Hypothese postulierte, dass durch die

fehlende ST3GAL3-Aktivität ein oder mehrere Glycoepitope in allen Zellen nicht sialyliert

wurden und so die Adhärenzeigenschaften aller Zellen beeinflusst wurden. Die zweite

Hypothese postuliert, dass es durch die fehlende ST3GAL3-Aktivität zu einer funktionalen

Störung kam, die sich in einer Verschiebung im Mengenanteil der verschiedenen neuronalen

Subtypen ausdrückt. Die verschiedenen vorhandenen kortikalen Zelltypen, z.B. RG, IPC, oRG

oder PN können an sich unterschiedliche adhäsive Eigenschaften besitzen, so dass sich das

gesamte adhäsive Verhalten ändert, wenn die eine oder andere Populationsanzahl erhöht

oder erniedrigt wäre.

Strukturen, die für die Überprüfung der ersten Hypothese in Betracht kommen, wären

sialyliert und direkt oder indirekt an der Zelladhäsion beteiligt. Da eine drastische

Verminderung von Sialoglycoproteinen in der St3Gal3 Knock-out Maus [26] nachweisbar

war, sollen Glycoproteine im Vordergrund dieser Betrachtungen stehen.

Die Ergebnisse unseres Zelladhäsionsassays deuten vor dem Hintergrund der Ergebnisse der

Lektinfärbungen an, dass die fehlende Sialylierung durch die ST3GAL3 (70 kDa Bande)

ausschließlich in kortikal differenzierten Patientenzellen, aber nicht in den Fibroblasten zu

den differentiellen adhäsiven Eigenschaften führt. Deshalb beschränken wir uns im

Folgenden auf die Betrachtung der möglichen ST3GAL3 Substrate speziell im zentralen

Nervensystem (ZNS).

Im ZNS gibt es verschiedene spezifische Zelladhäsionsmoleküle, die eine wichtige Rolle

während der Entwicklung des Gehirns und im reifen adulten Zustand spielen. Die Zell-Zell-

Adhäsion im adulten zerebralen Gewebe kann hierbei in die Bildung der Synapsen [159], die

Adhäsion zwischen Axonen und anderen Zellen und die Axon-Axon-Adhäsion untergliedert

werden.. Die hieran beteiligten Zelltypen, Abläufe, Makro- und Mikrostrukturen sowie deren

möglichen Targets der ST3GAL3, die bei einer gestörten Sialylierung zu einem Phänotyp

führen können, sollen im Folgenden näher beleuchtet werden.

– Bildung der Synapsen – Im Aufbau neuronaler Synapsen können zwei verschiedene

Adhäsionsstrukturen unterschieden werden, die synaptischen Junctions (SJ) und die puncta

adharentia junctions (PAJ). Während die SJ an der Neurotransmission beteiligt sind, stellen

die PAJ die mechanische Adhäsion der beiden Zellen dar. In der aktiven Zone der Synapse

sind etliche Ca2+-Kanäle und Vesikel mit Neurotransmittern vorhanden. Die mechanische

Adhäsion wird innerhalb der PAJ über verschiedene Adhäsionsmoleküle vermittelt. N-

68 Diskussion

Cadherine und Catenine liegen symmetrisch verteilt vor und stellen die Verbindung zum

Actin-Skelett her. Nectin-1/3 sowie Afadin liegen unregelmäßig verteilt innerhalb der PAJ

vor [160]. Mutationen im Nectin-1-Gen können unter anderem das Zlotogora-Ogür-Syndrom

hervorrufen, dass sich durch geistige Behinderung, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, Syndaktylie

und ektodermale Dysplasie auszeichnet [161]. An der Schlüssel-Schloss-Funktion der

Synapsen sind die Adhäsionsmoleküle SYG-1/2 und Sidekick [162] beteiligt. Die Spezifität der

Synapsen könnte über die Protocadherindiversität vermittelt werden [163]. Die Bildung

einer Synapse wird über die Bindung von Neuroligin an β-Neurexin vermittelt [164].

– Die Axon-Zelladhäsion – besteht hauptsächlich zwischen Axonen und Astrozyten,

Oligodendrocyten oder anderen Axonen. Die mechanische Adhäsion von Astrozyten an

Axonen wird durch einen Komplex aus Necl-1, TSLL1 und SynCAM3 hergestellt [165].

Astrozyten regulieren die neuronale Transmission durch Glutamataufnahme [166],

Koaktivierung von NMDA-Rezeptoren oder sogar direkter Regulierung mittels

Thrombospondin [167].

– Die paranodale Adhäsion –, also die Adhäsion zwischen Axonen und Oligodendrocyten,

spielt eine wichtige Rolle für die Myelinierung von Axonen und somit der korrekten

Reizweiterleitung. Direkt um einen Ranvierschen Schnürring herum liegen drei verschiedene

Domänen vor, der Na+-Kanal-reiche Schnürring selbst, die angrenzenden paranodalen

„Septate Junctions“ und die juxtaparanodale Region mit ihren repolarisierenden K+-Kanälen.

Die „Septate Junctions“ vermitteln ihre mechanische Adhäsion hauptsächlich auf der

axonalen Seite durch das Transmembranprotein Caspr in Verbindung mit dem GPI-

verankerten Adhäsionsmolekül Contactin [168]. Mutationen im Caspr Gen CNTNP1 führen

zu Athrogryposis multiplex congenita. Bei dieser im frühkindlichen Alter letalen Krankheit

liegt unter anderem eine starke Vergrößerung der Ranvierschen Schnürringe und ein

deutlich verringerte Myelinierung des Ischiasnervs vor [169]. Dieser Komplex bindet an das

oligodendrocytische Adhäsionsmolekül Neurofascin 155 [170]. Unterstützt wird die Bildung

dieser Bindung durch die ECM-Glycoproteine Tensacin-R und –C [171].

– Axonale Faszikulation – Während der frühen neuronalen Entwicklung werden die Axone

longitudinal oder faszikulär durch anziehende und abstoßende Faktoren zu ihrem

Bestimmungsort geleitet. Die beiden wichtigsten Adhäsionsmoleküle der axonalen

Faszikulation sind L1 und NCAM [172]. Mutationen im humanen L1-Gen führen zu

verschiedenen Syndromen, die sich häufig durch zerebrale Agnesie, Hydrozephalus,

Diskussion 69

geistiger Behinderung sowie epileptischen Anfällen auszeichnen können [173]. Auf das

Neuronale Zell-Adhäsions-Molekül (NCAM) möchte ich später noch genauer eingehen.

– Zelltypen der Neurogenese – Während der Entwicklung des Gehirns spielen

unterschiedliche neuronale Stammzellen eine wichtige Rolle bei der Neurogenese. Ihre

Entstehung, symmetrische und asymetrische Zellteilung sowie die Interaktion untereinander

ist ebenfalls stark durch sialylierte Adhäsions Moleküle beeinflusst.

Zunächst kommt es zur Bildung der neuroektodermalen Zellen in der Neuralröhre. Diese

sind entlang ihrer apikal-basalen Achse stark polarisiert und enthalten an ihrem apikalen

Ende „Tight und Adherens Junctions“ [174]. Aus den neuroektodermalen Zellen entstehen

die neuronalen Stammzellen – zunächst die Radialen Gliazellen (RG), die die ventrikuläre

Zone des Gehirns bilden. Für den Übergang aus neuroektodermalen Zellen zu RG werden

vor allem Gene zur Bildung der „Tight Junctions“ herunterreguliert, nicht aber der

„Adherens Junctions“, so dass die Zellen ihren epithelialen Charakter verlieren und mehr

Eigenschaften von Astroglia übernehmen [175]. Die apikal-basale Polarität der RG befähigt

sie zur asymmetrische Zellteilung zu äußeren radialen Gliazellen (oRG), intermedialen

neuronale Stammzellen (IPC) oder Projektionsneuronen (PN) [101, 176]. Für die Migration

der intermedialen Stammzellen in den subventrikulären Raum verlieren diese ihre

„Adherens Junctions“ und die letzten epithelialen Eigenschaften [100, 177].

Die ECM bildet während der zerebralen Entwicklung eine Basallamina (BL), in der sich die

neuronalen Stammzellen aufhalten. Sie moduliert deren Erhaltung und Differenzierung

sowie Migration ihrer Nachkommen [178-180]. Besonders fallen hier die RG auf, die über

ihre Endfüße direkt an der Basallamina adhärieren. Die Entfernung der BL beeinflusst die

Überlebenschancen der RG sowie die kortikale Laminierung [181]. Die wichtigsten

Bestandteile der BL sind zu diesem Zeitpunkt, Laminin, Tenascin-C, Reelin und Notch-1.

Laminine fördern die Migration, Expansion und Differenzierung der neuronalen

Stammzellen [182, 183]. Mutationen in den Genen ihrer Dystroglycan- oder

Integrinrezeptoren haben große Auswirkungen auf das NSC-Verhalten. So führen

Mutationen im Dystroglycan oder seiner Glycosyltransferase zu kortikaler neuronaler

Ektopie [184, 185]. Inaktivierungen des β1-Integrins führen zu abnormaler Entwicklung der

neokortikalen Laminierung und Windung [186, 187]. Tenascin-C fördert die Neurogenese in

dem es den Wechsel von neuroektodermalen Zellen zu RG fördert [188-190]. Reelin wird im

Neokortex sekretiert und bindet an die ApoE2- und VLDL-Rezeptoren, die von migrierenden

70 Diskussion

Neuronen und RG exprimiert werden [191, 192]. Reelin wurde mehrfach als ein

Chemoattraktant vorgeschlagen, das die neuronale Migration steuert. Eine vorgeschlagene

Hypothese zum Wirkmechanismus ist, dass Reelin die Ablösung der Neuronen von den RG

und die Glia-unabhängige Migration fördert [192, 193]. Mutationen der beteiligten Faktoren

der Reelin-Signalwege führen beim Menschen zu Lissencephalie und zerebraler Hypoplasie

[194].

– Molekulare Strukturen – Obwohl die ST3GAL3 vermutlich hauptsächlich Glycoproteine

sialyliert, kann sie trotzdem direkt oder indirekt an der Sialylierung und Regulation anderer

Adhäsionsmoleküle beteiligt sein. Die wichtigsten molekularen Bausteine der ZNS-Adhäsion

sollen deshalb hier noch einmal gesondert diskutiert werden.

Veränderungen des Expressionsmusters von Glycolipiden, wie auch Ganglioside, korrelieren

häufig mit neurologischen Entwicklungspunkten [195] und beeinflussen so die Neurito-,

Axono- und Synaptogenese. Alle Ganglioside werden im Golgi-Apparat durch verschiedene

sequentielle Glycosyltransferasen modifiziert [38]. Die α-2,3-Sialylierungen von GA1 und

GD3 werden durch die ST3GAL2 und ST3GAL5 (GM3 Synthase) katalysiert. Die GM3-

Synthase ist ein kritisches Enzym für die Bildung aller komplexen Ganglioside und eine

Mutation in ihrem Gen ist assoziiert mit dem „Amish Infantile Epilepsy“ Syndrom [42]. Da

auch eine Beteiligung der ST3GAL3 indirekt an der Sialylierung von GA1 diskutiert wird,

sollte die Sialylierung dieses Gangliosids in zukünftigen Arbeiten beachtet werden [26].

Während der sehr frühen Phase der Neuralrohrbildung fördern Glycosaminoglycane und

hochmolekulare, unverzweigte Polysaccharide wie Hyaluronsäure ihre Struktur und

Spannkraft [196].

Proteoglycane zeigen im Gehirn eine sehr prominente Rolle, trotzdem sind kaum Störungen

durch Proteoglycandefekte bekannt. Gründe hierfür könnten einerseits ihre funktionale

Redundanz, aber auch ihre embryonale Letalität sein. Einzige Ausnahmen bildet Perlecan,

dessen Mutation bei Mäusen zu Exencephalie oder neuronaler Ektopie und schweren

Basallaminadefekten führt [197, 198].

Während der zerebralen Entwicklung nehmen zwei Glycoproteine eine besonders wichtige

Rolle ein, das Zell-Adhäsions-Moleküle NCAM und der Notch-1-Rezeptor.

Das NCAM liegt hauptsächlich im polysialylierten (PSA) Zustand vor. PSA ist ein lineares

Homopolymer, das bis zu 200 α-2,8-gebundene Sialinsäurereste trägt und ausschließlich auf

dem NCAM vorkommt. Die Reaktion wird von den Polysialyltransferasen ST8Sia-II und -IV

Diskussion 71

katalysiert [199], wobei eine α-2,3-gebundene Sialinsäure als Ausgangszucker vorhanden

sein muss. PSA ist ein stark negatives Molekül mit einer starken Hydratisierung und

Kationbindungsaffinität, das den PSA-NCAM-Komplex befähigt, sich an der Regulation der

Myelinierung, Axonleitung, Synapsenbildung und neuronaler funktionaler Plastizität zu

beteiligen [199-203]. Polysialyltransferase defiziente Mäuse zeigen Verhaltens- und

Entwicklungsdefizite, eine Reduktion der Langzeit-Potenzierung und -Depression sowie

gestörte Synapsenbildung im Hippocampus [204, 205]. Da die Polysialylierung von NCAM bei

unserer Patientin in kortikalen Zellen nicht gestört ist, schließe ich allerdings eine

Beteiligung der ST3GAL3 am Aufbau der PSA aus.

Der Notch-Rezeptor (NOTCH-1) spielt eine essentielle Rolle während der zerebralen

Entwicklung und beeinflusst unter anderem die Differenzierung von Oligodendrocyten und

Astrocyten, inhibiert die Neurogenese und stabilisiert den RG-Pool während der

embryonalen Neurogenese [206, 207]. Die Aktivität des Notch-Rezeptors kann durch die

Bindung von DLL1 (Delta-like 1) oder JAG1 (Jagged 1) reguliert werden. DLL1 wird von

neuronalen, intermediären Stammzellen exprimiert und kann in Verbindung mit LFMG

(Lunatic-Fringe-Protein) Notch in RG aktivieren [208, 209]. Für die korrekte Faltung,

Ligandenerkennung und Endocytose ist die O-Glycosylierung des Notch-Rezeptors essentiell

[210, 211]. An seinen dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnlichen Domänen werden die

Serine- oder Threoninreste mit einer Fucose O-glycosidisch modifiziert. Dieser Schritt wird

durch die Fucosyltransferase OFUT1 katalysiert [212]. Der Notch-Rezeptor wird im

Folgenden noch durch eine unbekannte β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase, β-1,4-

Galactosyltransferase und einer α-2,3-Sialyltransferase modifiziert [213]. Mutationen im

OFUT1-Gen führen bei Drosophila zu einem Notch-ähnlichen Phänotyp [214]. Die CDG IIc,

charakterisiert durch langsames Wachstum, geistige Behinderung und schwere

Immundefizite, wird durch Mutationen im GDP-Fucose-Transporter (SLC35C1) verursacht

[215]. Obwohl die ST3GAL3 hauptsächlich am Aufbau des Sialyl-Lewis-A-Epitops beteiligt

sein soll, können wir aufgrund seiner geringen Aktivität gegen β-1,4-Galactose und seiner

allgemein breiten Substratspezifität eine Beteiligung an der Bildung der Notch-

Glycosylierung momentan nicht ausschließen [5].

Da fast alle hier genannten Makro- und Mikrostrukturen der interzellulären Adhäsion im

ZNS durch die fehlende ST3GAL3-Aktivität verändert sein können, wäre es sehr interessant

in weiteren Arbeiten zu untersuchen welche Zielstrukturen genau von der ST3GAL3 sialyliert

72 Diskussion

werden, um die Auswirkungen auf das Adhäsivverhalten näher beleuchten zu können. Ein

Ansatzpunkt für die Suche dieser Strukturen liefert die zusätzliche Bande in der DAS

Lektinfärbung der kortikalen Patientenzellen. Da unsere Ergebnisse bisher noch keinen

Hinweis auf den konkreten Reaktionspartner angeboten haben, wäre es sinnvoll, zunächst

eine Gesamt-Sialom-Untersuchung durchzuführen, um das Glycosylierungmuster genauer zu

charakterisieren.

3.4 Die Neurogenese kortikaler Projektionsneuronen

Als nächstes sollte die zweite Hypothese, dass eine Verschiebung im Mengenanteil der

verschiedenen neuronalen Zellsubtypen zu dem differentiellen adhäsiven Verhalten der

kortikalen Patientenzellen führt, überprüft werden.. Hierfür wurde die Menge

verschiedener Projektionsneuronen an definierten Zeitpunkten der Differenzierung

kontrolliert. Im Vergleich zu den Zellen des gesunden Geschwisterkindes können wir bei den

Patientenzellen nach 50 Tagen kortikaler Differenzierung 2,28-mal weniger TBR1-positive

Neuronen detektieren. Interessanterweise können wir trotzdem in beiden Proben nach 50

Tagen kortikaler Differenzierung schon um die 5 % SATB2-positive Neuronen detektieren.

Da wir nur bei den TBR1-positiven Neuronen eine Reduktion messen, können wir davon

ausgehen, dass es sich hierbei nicht um einen totalen Entwicklungsrückstand handelt,

sondern um eine selektive Reduktion der TBR1-positiven corticothalamischen

Projektionsneuronen. Anscheinend liegt tatsächlich eine veränderte

Subpopulationszusammensetzung innerhalb der kortikalen Patientenzellen vor.

Während der Differenzierung der iPS zu kortikalen Zellen nach Shi et al. [112] werden alle

Klassen von Projektionsneuronen (PN) in einer in-vivo-ähnlichen temporalen Folge gebildet

[88]. Hierbei entstehen zuerst die Neuronen der Kortexschichten V und VI und danach der

Schichten II und III. Eine Einteilung der PN wurde hauptsächlich anhand ihrer Hodologie

erstellt, also in welche zerebrale Region ihre Axone projizieren. In der VI. Schicht befinden

sich corticothalamische Projektionsneuronen (CThPN; TBR1+)[216], in der V. subkortikale

Projektionsneuronen (SCPN; CTIP2+) [217] und in der II. - IV. Schicht callosale

Projektionsneuronen (CPN; SATB2+) [218]. In vitro sollen bis Tag 50 der kortikalen

Differenzierung fast alle TBR1-positiven Neuronen gebildet worden sein (Abbildung 3.1 (B)).

SATB2-positive Neuronen sollen hauptsächlich zwischen Tag 65 und 90 gebildet werden

Diskussion 73

[88]. Dieser zeitliche Ablauf entspricht in den Hauptpunkten dem Ablauf der humanen

kortikalen Neurogenese in vivo [219].

Abbildung 3.1: Projektionsneuronen des Kortexes (A) Bildung der TBR1-positiven CThPN (Projection neurons lamina VI) aus PAX6-positiven radialen Gliazellen (radial glia cells) und TBR2-positiven intermediären neuronalen Stammzellen (intermediate progenitors). (B) Schematischer Aufbau der kortikalen Schichten des adulten humanen Kortexes.

Um die Ursachen der Reduktion TBR1-positiver Projektionsneuronen genauer verstehen zu

können, sollen im Folgenden die molekularen Abläufe zur Bildung dieser Neuronen näher

beleuchtet werden.

Während des Schließeung des Neuralrohrs entwickeln sich aus den neuroektodermalen

Zellen die ersten neuronalen Stammzellen, die RG. RG sind durch eine apikal-dorsale

Polarität charakterisiert und führen über symmetrische Zellteilung zur Expansion des RG-

Pools. Über asymmetrische Zellteilung entstehen aus ihnen oRG, intermediäre Stammzellen

(IPC) oder direkt die ersten Projektionsneuronen [101, 176]. Die oRG sind ebenfalls unipolar,

im Gegensatz zu den RG fehlt es ihnen jedoch am apikalen Fortsatz. Sie kommen

hauptsächlich in der äußeren subventrikulären Zone (OSVZ) des Kortex vor und können sich

ebenfalls über asymmetrische Teilung selbst reproduzieren und Projektionsneuronen bilden

[220]. Im Mauskortex kommen sie zwar in der subventrikulären Zone (SVZ) vor, aber in

dramatisch geringerer Menge [54]. Die IPC haben eine multipolare Morphologie und liegen

ungebunden vor. Sie stellen eine Durchgangsstufe von RG zu Projektionsneuronen dar,

proliferieren nur wenig und teilen sich häufig über symmetrische Zellteilung zu zwei

Projektionsneuronen [102]. Sie amplifizieren so die Zahl aller möglichen

Projektionsneuronensubtypen aus dem RG-Pool deutlich.

In der Gesamtheit bilden diese Stammzellen die verschiedenen

Projektionsneuronensubtypen in aufeinanderfolgenden Wellen. Es wird diskutiert, dass man

74 Diskussion

diese neuronalen Stammzellen in verschiedene Linien unterscheiden kann, die eine

Beschränkung für einen bestimmten Subtyp, wie den der TBR1-positiven PN,

haben.Experimente mit retroviral markierten neuronalen Stammzelllinien in der Maus

zeigen, dass sich aus frühen Stammzellen noch PN aller Schichten bilden können, aus später

geborenen Stammzellen jedoch nur noch PN der oberen Schichten [221, 222]. Es käme

somit zu einer Verringerung der Multipotenz einer jeden Stammzelllinie im Verlauf der

Entwicklung. Eine weitere Hypothese besagt, dass es von Anfang an PN-Subtyp-beschränkte

Stammzelllinien gibt. Gestützt wird diese Hypothese von einem Experiment, das zeigt, dass

CUX2-positive neuronale Stammzellen, nur PN der oberen Schichten bilden, obwohl sie

schon zu einem frühen Zeitpunkt geboren wurden [223]. Es scheint demnach zwei

verschiedene Stammzelllinien zu geben (CUX2+ und CUX2-), die entweder

Projektionsneuronen der unteren (Cux2-) oder der oberen Schicht (Cux2+) liefern können.

Inwiefern ein Fehler, verursacht durch die Mutation im ST3GAL3-Gen, in der Cux2- Linie

vorliegen könnte und ob dieser sich auf die Produktion der TBR1-positiven PN auswirkt, ist

allerdings beim momentanen Forschungsstand nicht zu beantworten.

Es gibt Hinweise darauf, das sich TBR1-positive CThPN durch eine Entwicklungskaskade über

radiale Gliazellen (PAX6) aus intermediären Stammzellen (TBR2) entwickeln [108] (siehe

Abbildung 24 (A)). Der Übergang von RG zu IPC wird durch die verringerte Expression

adhäsiver Strukturen wie den „Adherens Junctions“ charakterisiert [89, 100]. Sie sollten

somit ein deutlich niedrigeres adhäsives Verhalten haben. Die Entwicklung einer RG zu einer

IPC wird durch die Aktivierung von TBR2 mittels NEUROG2 in einer der beiden Tochterzellen

angestoßen. TBR2 ist ein direktes Zielgen von NEUROG2. Wie genau die Aktivierung des

NEUROG2-Gens in nur einer der Tochterzellen reguliert ist, ist nicht bekannt.

Interessanterweise gibt es Hinweise darauf, dass Notch-Inhibierung zwischen der

entstehenden Tochterzelle und der Ausgangszelle die Expression von NEUROG2 inhibiert

[224]. Wie schon beschrieben ist für die Funktion des Notch-Rezeptors eine korrekte

Glycosylierung, unter anderem auch Sialylierung, wichtig.

Eine Reduktion der IPC-Population aufgrund fehlender ST3GAL3 Funktion könnte die

erhöhten adhäsiven Eigenschaften der kortikalen Patientenzellen und die verringerte

Population an TBR1-positiven Neuronen erklären.

Inwiefern die fehlende ST3GAL3-Funktion dieses Zusammenspiel beeinflusst, könnte anhand

einer Immunopräzipitation des Notch-Rezeptors und anschließender Lectinfärbung auf α-

Diskussion 75

2,3-Sialinsäure- und β-1,3-Galactoseepitope überprüft werden. Die Reduktion der IPC-

Population wurde mittels einer Immunfluoreszenzfärbung auf RG- und IPC-Marker (PAX6,

TBR2) von Patientenzellen und Zellen des gesunden Geschwisterkindes nach 35 Tagen

Differenzierung untersucht. Diese qualitative Methode zeigt, dass beide Subpopulationen in

beiden Proben vorhanden sind. Darüber hinaus wäre eine Quantifizierung mittels einer

FACS-Analyse notwendig, um zu untersuchen, ob die Menge an TBR2-positiven IPC reduziert

ist.

3.4 Zusammenfassung/Ausblick

Geistige Behinderung ist mit einer Prävalenz von 2-3 % in der Weltbevölkerung, eine relativ

häufige Erkrankung, wobei 30 -50 % dieser Fälle nicht-syndromal und/oder idiopatisch

verlaufen. In 25 % aller Fälle kann eine erblich bedingte Ursache gefunden werden [9].

Obwohl die genetische Ursache in vielen Fällen bekannt ist, konnte bisher nur in wenigen

Fällen eine molekulare Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp gezogen werden. In

vorangegangenen Studien konnten 3 verschiedene Mutationen im Gen der im Golgi-Apparat

lokalisierten β-Galactosidase-α-2,3-sialinsäuretransferase 3 (ST3GAL3) als ursächlich für

schwere Formen nicht-syndromaler geistiger Behinderung (c.38C>A und c.1108G>T) und

West Syndrom (c.958G>C), einer epileptischen Enzephalopathie, identifiziert werden [3, 5]

Vorangegangene und eigene funktionale Untersuchungen zeigten, dass zwei der

Mutationsvarianten (c.958G>C und c.1108G>T) keine enzymatische Aktivität mehr besitzen

und alle eine gestörte subzellulare Lokalisation außerhalb des Golgi-Apparates aufweisen

[5]. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Ursachen die zum erblich bedingtem

West Syndrom infolge einer Punktmutation im ST3GAL3 Gen (c.958G>C; p.320A>P) führen.

Die untersuchte Patientin, leidet neben ihrer starken geistigen Behinderung an

epileptischen Anfällen, hauptsächlich des Flexortyps, die schon im frühkindlichen Alter

auftraten [3]. Da häufig verwendete Modellsysteme, wie z.B. die Maus, nur bedingt geeignet

sind die komplexen kognitiven Defekte abzubilden die zu geistiger Behinderung oder

Epilepsie führen [54], konnten bisher selten die Funktionszusammenhänge die den

Erkrankungen zu Grunde näher untersucht werden. Um die in vivo-Bedingungen in vitro

bestmöglich wiederspiegeln zu können wurde deshalb für diese Forschungsarbeiten ein

neues Modellsystem auf Basis patientenspezifischer induzierter pluripotenter Stammzellen

76 Diskussion

(iPS) generiert.

Fibroblasten der Patientin und einer gesunden Schwester konnten durch persistente

Integration und Expression einer Transkriptionskassette, die die vier Yamanaka

Reprogrammierungsfaktoren, OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC, und einen Reporterfarbstoff

enthielt, zu iPS reprogrammiert werden. Die Auswirkung der morphologischen, genetischen

und epigenetischen Veränderungen während der Reprogrammierung wurden mitttels

Immunfluoreszenzfärbungen (IFF), qPCR, Differenzierung, RNA-Sequenzierung, FPNI-PCR

und Array-CGH untersucht. Die Pluripotenz, also das Vermögen sich in alle drei Keimblätter

zu differenzieren, wurde durch den Expressionsnachweis der Pluripotenz assoziierten

Faktoren OCT3/4 und SSEA4 in der IFF bzw. zusätzlich LIN28a, NANOG, c-MYC und REX1

durch qPCR nachgewiesen. Darüber hinaus konnten beide Zelllinien zu kortikalen Neuronen

differenziert werden. Um die Fähigkeit der iPS zur Bildung von Zellen aller drei Kiemblätter,

ähnlich wie bei Teratoma Versuchen in Mäusen, nachzuweisen, wäre eine Differenzierung

zu Vertretern der anderen beiden Keimblätter, wie Cardiomyozyten und Leberzellen

sinnvoll. Genetische und epigenetische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien können

durch unterschiedliches Ausgangsmaterial, den Reprogrammierungsprozess als auch der

Selektion während der Langzeitkultur entstehen. Für unsere anschließenden komparativen

Studien wurde deshalb die Vergleichbarkeit der beiden Zelllinien durch FPNI-PCR, Array-CGH

und RNA-Sequenzierungen untersucht. Mittels der FPNI-PCR konnten wir zeigen, dass durch

die Integration der Transkriptionskassetten kein offener Leserahmen betroffen war. Die

geringen Unterschiede im RNA-Expressionsprofil und die beinahe identischen Array-CGH

Ergebnisse zeigten uns, dass die Auswirkungen des Reprogrammierungsprozesses relativ

gering waren. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass es nur geringe Unterschiede zwischen

den beiden Zelllinien gibt und sie deshalb als Alternative zu isogenen Kontrollen geeignet

sind. Darüber hinaus wäre eine Wiederholung der bisherigen Experimente mit zusätzlichen

Klonen der Zelllinien sinnvoll.

Da epileptische Anfälle häufig ihren Ursprung im kortikalen Bereich des Zerebrums finden

und auch das adulte humane Gehirn dort mit die höchste ST3GAL3 Expression zeigt, wurden

beide iPS Linien für weitere Experimente mehrfach zu kortikalen Zellen differenziert. Der

Vorteil des verwendeten Protokolls besteht darin, dass hierbei die Neurogenese in vivo auch

in vitro nach vollzogen wird. Die kortikale Identität der differenzierten Zellen, sowie eine

Erhöhung der ST3GAL3 Expression im Vergleich zu den iPS konnte mittels qPCR und IFF

Diskussion 77

Kortex assoziierter Marker validiert werden. Des weiteren zeigten tiefergehende RNA-

Sequenzierungen dieser Zellen, dass die Patientenzellen signifikant mehr Gene exprimieren,

die normalerweise während der Entwicklung von Zellen der Neuralleiste Richtung

Augenzellen exprimiert werden. Inwiefern diese Ergebnisse Folge der Mutation oder der

Differenzierungseffizienz sind, kann auf Grund fehlender Analysetiefe in der

Vergleichsliteratur nicht beurteilt werden. Da die Ergebnisse der IFF und qPCR, welche in der

Literatur verwendet wurden, ähnlich sind, gehen wir davon aus, dass die Linien für

vergleichende Untersuchungen geeignet sind. Für zukünftige Differenzierungen sollte man

trotzdem über die im verwendeten Protokoll empfohlene qPCR der Expression kortikaler

Gene hinaus auch die Expression der Gene anderer zerebraler Bereiche überprüfen und die

Ergebnisse ggf. mittels FACS Analysen bestätigen.

Funktionale Untersuchungen zeigten, dass Patientenzellen, nach 30 Tagen kortikaler

Differenzierung, ein deutlich verstärktes Adhäsionssverhalten im Vergleich zu den Zellen des

gesunden Geschwisterkindes aufweisen. Dieses Unterschied zeigten die Fibroblasten beider

Linien nicht.

Zur Erklärung dieser Beobachtung wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt: Der

Unterschied im adhäsiven Verhalten der kortikal differenzierten Zellen könnte (I) von einer

Verschiebung im Sialylierungsmuster aller Zellen ausgehen und/oder (II) durch eine

Verschiebung im Mengenanteil neuronaler Subpopulationen mit unterschiedlich adhäsiven

Verhalten entspringen.

Zur Überprüfung der ersten Hypothese wurden die Glycosylierungsepitope von

Ganzzellysaten kortikal differenzierter Zellen (nach 50 und 90 Tagen beider Linien) mittels

Lektinfärbungen untersucht. Hierbei konnten für die α-2,3-gebundenen Sialinsäurereste

(Produkt der ST3GAL3) keine Unterschiede festgestellt werden. Die Markierung der β-1,4

gebundenen Galactose, dem hauptsächlichen Reaktionspartner der ST3GAL3, zeigte jedoch

eine zusätzliche Bande um 70 kDa bei kortikalen Patientenzellen nach 50 und 90 Tagen

Differenzierung. Diese Bande deutet darauf hin, dass durch die fehlende ST3GAL3-Aktivität

ein konkretes Epitop unsialyliert verbleibt und das Enzym entgegen der bisherigen Meinung

eine Subtratspezifität aufweisen könnte.

Da es unzählige glycosylierte Adhäsionsmoleküle während der neuronale Entwicklung gibt

wurde zunächst der prominenteste Vertreter, das neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM),

auf korrekte Sialylierung in Patientenzellen und Zellen des gesunden Geschwisterkindes

78 Diskussion

nach 70 Tagen kortikaler Differenzierung überprüft. Die IFF des NCAM und seiner

polysialylierten Form zeigte jedoch keine Unterschiede. Um das Substrat der ST3GAL3,

welches die zusätzliche Bande hervorrufen könnte, näher eingrenzen zu können, wäre eine

Untersuchung des kompletten Sialoms mittels Massenspektrometrie beider Zelllinien

sinnvoll.

Zur Überprüfung der zweiten Hypothese wurde eine quantitative Bestimmung der

neuronalen Subpopulationen während der Neurogenese verfolgt. Während der kortikalen

Differenzierung in vivo und in vitro entstehen aus neuronalen Stammzellen die

verschiedenen kortikalen Projektionsneuronen von innen nach außen in einem stereotypen

zeitlichen Muster. Tatsächlich zeigten qualitative Immunfluoreszenz-basierte

Untersuchungen, dass die Menge der bis Tag 50 differenzierten TBR1-positiven CThPN der

untersten kortikalen Schicht bei der Patientin deutlich reduziert (2,28 fach) ist.

Veränderungen bei den TBR1-positiven CThPNs konnten bisher mit etlichen neuronalen

Entwicklungsstörungen, wie Autismus, und Epilepsie in Verbindung gebracht werden [225-

227]. In verschiedenen TBR1-defizienten Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass die

kortikale Laminierung deutlich gestört war. Fokale kortikale Dysplasie I (FCD I) ist eine

häufige Ursache von generalisierter Epilepsie. Sie ist selten im MRT erkennbar und meistens

durch lokale Dyslaminierung charakterisiert [228-230]. Eine erneute Untersuchung der

Patientin mit einem hochauflösenden MRT könnte zeigen, ob hier eine unerkannte FCD I

vorliegt.

Darüber hinaus zeigten TBR1-defiziente Mäuse eine Erhöhung der Autismus2 und eine

Verringerung der Neurotensin Expression. Eine ähnliche Verringerung der Neurotensin

Expression konnte auch in vitro bei unserer Patientin beobachtet werden. Neurotensin zeigt

eine erhöhte Expression in autistischen Patienten [231] und während sowie nach einem

epileptischen Anfall in Ratten [232]. Interessanterweise zeigt eine glycosylierte Form des

Neurotransmitters eine antikonvulsive Wirkung im Rattenmodell. Um die Signifikanz der

Neurotensin Expression und anderer Gene beurteilen zu können, müsste von weiteren

biologischen Replikaten eine RNA-Sequenzierung gemacht werden.

TBR1-positive CThPN sollen sich aus intermediären Stammzellen (IPC; TBR2-positiv)

entwickeln [108], die durch die verringerte Expression adhäsiver Strukturen wie den

„Adherens Junctions“ charakterisiert sind [89, 100]. Es konnten allerdings keine qualitativen

Unterschiede zwischen Patienten-IPC und IPC des gesunden Geschwisterkindes

Diskussion 79

nachgewiesen werden. Dennoch könnte eine qualitative Reduktion des IPC-Pools das

unterschiedlich adhäsive Verhalten, als auch die verringerte Menge TBR1-positiver

Neuronen erklären und könnte anhand einer FACS Analyse überprüft werden. Ein weiterer

interessanter Ansatzpunkt ist die Bildung der IPC. Diese wird wahrscheinlich durch einen

sialylierten Notch-abhängigen Mechanismus gesteuert [208]. Die korrekte Sialylierung des

Notch-Rezeptors könnte mittels Immunopräzipitation und anschließender selektiver

Markierung der α-2,3-Sialinsäureepitope überprüft werden. Um die Dyslaminierung und die

verschiedenen Subpopulationen neuronaler Stammzellen in vitro besser untersuchen zu

können, wäre eine Differenzierung beider Zelllinien zu zerebralen Organoiden möglich.

In dieser Arbeit konnte erfolgreich ein neues patientenspezifisches iPSC Model für genetisch

bedingtes West Syndrom etabliert werden. Dieses Modell zeigte, dass kortikale

Patientenzellen durch den Verlust der ST3GAL3 Aktivität während der Neurogenes in vitro

eine signifikante Reduktion an TBR1-positiven chorticothalamischen Projektionsneuronen

aufweisen. Des Weiteren zeigte sich, dass die ST3GAL3 anscheinend eine noch unbekannte

Substratspezifität besitzt die bei ihrem Aktivitätsverlust eine Struktur von ca. 70 kDa

unsialyliert hinterlässt. Obwohl der Zusammenhang zwischen diesen beiden Ergebnissen

noch nicht geklärt ist, lässt sich vermuten, dass dies zu dem beobachteten erhöhten

Adhäsivverhalten der kortikalen Neuronen führt.

80 Material und Methoden

4. Material und Methoden

4.1 Nukleinsäurearbeiten

4.1.1 Die Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (PCR: Polymerase Chain Reaction) dient zur gezielten

Amplifikation von Oligo-Nukleotidsequenzen. Die Grundlage für eine solche Amplifikation

stellt zunächst chromosomale oder Plasmid-DNA dar, des weiteren werden noch

Oligonukleotidstarter (Primer) benötigt, welche den Sequenzen beider Enden des zu

amplifizierenden Bereichs entsprechen [233]. Zu diesem Ansatz kommen anschließend noch

die desoxy-Nukleosidtriphosphate (dNTPs) eine hitzestabile DNA-Polymerase und der

Reaktionspuffer hinzu. Die wichtigsten Schritte einer jeden PCR sind zunächst die

Denaturierung der beiden Doppelstränge (94 – 95 °C), gefolgt von der Anlagerung

(Annealing, 51 -65 °C) der Primer und der anschließenden Elongation dieser durch die

entsprechende DNA-Polymerase. Die weiteren Zyklen von Denaturierung – Annealing –

Elongation dienen der exponentiellen Amplifikation dieser Nukleotidsequenzen. Um die

Bedingungen für die jeweilige Reaktion zu optimieren, können noch Dimethylsulfoxid

(DMSO) oder Magnesium-Chlorid in unterschiedlicher Konzentration beigefügt werden

[234].

Die Reaktion wurde in zugeschnittenen PCR 96-Well Platten (0.2 ml Kavitäten), mit extra

dünnen Wänden für eine optimale Hitzeverteilung pipettiert und anschließend in einem der

folgenden Thermocyclern mit 96 Well Block nach folgendem Programm durchgeführt.

Benötigte Materialien

AmpliTaq Gold® DNA-Polymerase mit Puffer I Life Technologies N8080240

GoTaq® Hot Start Polymerase Promega M5001

SureCycler Agilent Biometra

Material und Methoden 81

Arbeitsanweisung

Reaktionsmix

H2O 7 µl

Fw Primer (10 µM) 1 µl

Rev Primer (10 µM) 1 µl

GOTaq Mix 10 µl

DNA 1 µl

Programm des Thermocyclers

94/95 °C 5 min

94/95 °C 30 sec

51-65 °C 30 sec 30x

72/73 °C 1 min

72/73 °C 5 min

15 °C ∞

4.1.2 Primerdesign

Oligonukleotidstarter, auch Primer genannt, sind kurze DNA Einzelstränge, die innerhalb

einer PCR für verschiedene Anforderungen eingesetzt werden. Die am häufigsten

verwendeten Primer binden an einer spezifischen Stelle komplementär zur Matrize und an

ihrer freien 3‘ OH Gruppe kann die DNA Polymerase mit der Synthese beginnen. Sie

definieren so den Start und das Ende eines Amplifikats. Sie sollten im Schnitt ca. 20

Basenpaare (bp) lang sein, der GC Gehalt sollte nicht über 50 % liegen und die

Schmelztemperatur um die 60 °C [235].

Für das Primerdesign wurde die Primer3 Software [236] oder die Primer-BLAST Software von

NCBI verwendet. Hierbei wurde der zu amplifizierende Bereich entweder als FASTA Sequenz

oder über die RefSeq ID geladen und definiert.

Für die Amplifikation von cDNA Sequenzen bei der quantitativen PCR wurde darauf

geachtet, nur Intron überspannende Primer auszuwählen und die Größe der Amplifikate

zwischen 50 und 90 bp zu halten. Primer für eine sog. „Quick Change“ Mutagenese (siehe

4.2.7) wurden manuell ausgesucht und anschließend in einem der beiden Software


Werkzeuge (s.o.) auf GC-Gehalt, Schmelztemperatur und Sekundärstrukturen überprüft. Um

trotz des Missprimings eine stabile Anlagerung zu gewährleisten, sind diese Primer ca. 30 bp

lang.

4.1.3 Verwendete Primer

Tabelle 4.1 Primerliste

Target Oligo Name Sequenz Län

ge

Verwendung

ST3GAL3 g_St3gal3_fw CTCTAGGGAGCTTGGCTGAAG 21 Sanger Sequenzierung

ST3GAL3 g_St3gal3_rev GAGGGCACGTAGGATGCTTG 20 Sanger Sequenzierung

ST3GAL3 ST3GAL3_fw CAGTACGAGCGCGATTCTCT 20 qPCR

ST3GAL3 ST3GAL3_rev AATGAGGCTGAGTGCTGGTC 20 qPCR

ST3GAL3 St3 Insert Rev AGTGATGACGCGAGCTTTCA 20 Sanger Sequenzierung

ST3GAL3 QCc958G>CFw GACGAGGTGGCAGTCCCAGGATT

TGGCTATG

31 Quick Change

ST3GAL3 QCc958G>Crev CATAGCCAAATCCTGGGACTGCC

ACCTCGTC

31 Quick Change

GAPDH GAPDH_QRT2_

u

GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA 20 qPCR/Standard

GAPDH GAPDH_QRT2_

l

AACCATGTAGTTGAGGTCAATGA

A

24 qPCR/Standard

ACTB ACTB_QRT2_u CCCAGCACAATGAAGATCAA 20 qPCR/Standard

ACTB ACTB_QRT2_l ATCTGCTGGAAGGTGGACAG 20 qPCR/Standard

POU5F1 OCT4_fw AGAAGGAGAAGCUGGAGCAA 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

POU5F1 OCT4_rev CTTCCCAAATAGAACCCCCA 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

NANOG SOX2_fw GGACACTGGCTGAATCCTTCC 21 qPCR/Pluripotenzmark

er

NANOG SOX2_rev CTCGCTGATTAGGCTCCAACC 21 qPCR/Pluripotenzmark


er

SOX2 LIN28_fw ATGGAGAAAACCCGGTACGC 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

SOX2 LIN28_rev TTTTGCGTGAGTGTGGATGG 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

LIN28 NANOG_fw TTGAGGAGCAGGCAGAGTGG 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

LIN28 NANOG_rev TGCATTTGGACAGAGCATGG 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

REX1 REX1_fw AATAGCTGACCACCAGCACA 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

REX1 REX1_rev AAACACCTGCTGGACTGTGA 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

PODXL PODXL_fw ACAGCAGCATCAACTACCCA 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

PODXL PODXL_rev CTTCTCACTCTGTGTCTGTG 20 qPCR/Pluripotenzmark

er

EMX1 Emx1-Fw CTCTCCGAGACGCAGGTGAA 20 qPCR/Kortex Marker

EMX1 Emx1-Rev GTTGATGTGATGGGAGCCCT 20 qPCR/Kortex Marker

PAX6 Pax6-Fw GTGTCCAACGGATGTGTGAG 20 qPCR/Kortex Marker

PAX6 Pax6-Rev CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC 20 qPCR/Kortex Marker

FOXG1 Foxg1-Fw AGGAGGGCGAGAAGAAGAAC 20 qPCR/Kortex Marker

FOXG1 Foxg1-Rev TCACGAAGCACTTGTTGAGG 20 qPCR/Kortex Marker

SOX1 Sox1-Fw TACAGCCCCATCTCCAACTC 20 qPCR/Kortex Marker

SOX1 Sox1-Rev GCTCCGACTTCACCAGAGAG 20 qPCR/Kortex Marker

OTX1 Otx1-Fw AGCCACTCCGACAAGGTTGG 20 qPCR/Kortex Marker

OTX1 Otx1-Rev ATGCCGTATGGGGGTTGTTT 20 qPCR/Kortex Marker


4.1.4 Nukleinsäureisolation

In dieser Arbeit wurden verschiedenen Analysemethoden angewendet, für die hochreine

und intakte DNA und RNA benötigt wurden. Prinzipiell erfolgt die Isolation von

Nukleinsäuren immer in diesen vier Schritten: Zelllyse – Trennung – Präzipitation –

Reinigung. In den nachfolgenden Protokollen wurden diese Schritte mit verschiedene

Agenzien und Techniken durchgeführt. Die Zelllyse wird je nach Zelllinien und Anwendung

mit einem Lysepuffer, der Detergenzien oder Phenol enthält, durchgeführt. Die Abfolge von

Präzipitation und Trennung der Komponenten kann dabei ebenfalls variieren. So werden bei

der Kieselgel-Säulen Isolation die Nukleinsäuren zunächst voneinander getrennt und erst

später gefällt, bei der Phenol Chloroform Isolation werden die Komponenten zunächst in

verschiedenen Phasen voneinander getrennt und anschließend gefällt. Die Präzipitation und

Reinigung erfolgt immer über die Zugabe von Ethanol oder Isopropanol, unter Gegenwart

von Salzen.

4.1.4.1 Isolation genomischer DNA über Adsorption an Kieselgel

Der wichtigste Schritt dieser Isolationsmethode ist die selektive Bindung von DNA an eine

Kieselgel Festphase. Kieselgel ist ein stark hygroskopisches, amorphes Siliciumdioxid. Die

Bindung der DNA erfolgt über Wassestoffbrückenbindungen, wenn die Salzkonzentration

und der pH Wert optimal eingestellt wurden.

Abbildung 4.1: DNA Adsorption an einer Kieselgel Festphase

Hierfür werden die Zellen zunächst unter Zugabe von Detergenzien und Proteinase K lysiert.

Anschließend wird der Salzgehalt und der pH-Wert, durch die Zugabe von chaotropen Salzen

sowie Ethanol oder Isopropanol, für die Bindung von DNA optimiert. Nach der selektiven

Bindung von DNA an der Festphase können alle anderen Komponenten von der Phase

abgewaschen werden, so dass abschließend reine DNA von der Phase eluiert werden kann.



Nucleo Spin Tissue Marcherey-Nagel # 740952

Ethanol 100 %

Thermoschüttler (70 °C)

Bis zu 107 Zellen können pro Ansatz verarbeitet werden; jede Kieselgelsäule kann bis zu 60

µg DNA binden.

Arbeitsanweisung

+200 µl Puffer T1 + 25 µl Proteinase K + 200 µl Puffer B3 -> 15‘ 70 °C

Thermoschüttler

+ 210 µl EtOH 100 % -> vortexen

Je Probe eine Kieselgelsäule in ein Röhrchen setzen

Gesamte Probe auf die Säule geben -> 1‘ 11.000 g

Durchfluss verwerfen

+ 500 µl Waschpuffer BW -> 1‘ 11.000 g


+ 600 µl Waschpuffer B5 -> 1‘ 11.000 g

Durchfluss verwerfen -> 1‘ 11.000 g

Kieselgelsäule in ein beschriftetes 1.5 ml Eppendorf Gefäß setzen

+ 50 µl vorgewärmten Puffer BE (70 °C) -> 1‘ RT -> 1‘ 11.000

g

4.1.4.2 Präparation genomischer DNA mittels TriZOL

Diese Präparationsmethode wurde gewählt, wenn aus derselben Probe gleichzeitig RNA und

Protein isoliert werden sollte. Bei dieser Technik werden die Zellen mit TriZOL, einer

käuflichen Mischung aus Guanidinumthiocyanat Salzen und Phenol (Invitrogen, # 15596-

018)), lysiert und anschließend nach Zugabe von Chloroform eine Phasentrennung erzeugt.

In der oberen, wässrigen Phase (blau) befindet sich dann die gesamt RNA, in der milchigen

Interphase (weiß) die DNA und in der unteren, organischen Phase (rot) die Proteine [237].


Über eine sequentielle Trennung und Fällung dieser drei Komponenten können sie so

simultan aus einer Probe gewonnen werden.

Abbildung 4.2 Phasentrennung TriZOL Aufreinigung


TriZol Invitrogen # 15596-018

EtOH 100 % und 75 %

Chloroform

0,1 M NaCitrat/10 % EtOH

8 mM NaOH

Arbeitsanweisung

1ml TriZOL pro 10 cm2 oder 5-10 x 106 Säuger Zellen

Überstand (ÜS) absaugen; 1x mit 1x PBS waschen

+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben, mit Zellschaber abkratzen, durch mehrmaliges auf-

und abpipettieren homogenisieren (je nach Zelldichte Menge anpassen)

Hier Einfrierschritt bei -20 °C möglich

TriZol Pellet auf Eis auftauen lassen -> 15’ bei RT

+ 0,2 ml Chloroform pro 1ml TriZol -> 15“ schütteln

Falls notw. in 2 ml Gefäß überführen -> 3’ bei RT -> 15’ 12.000 G

Abbildung 4.3 DNA Phase der TriZOL Aufreinigung

Obere wässrige Phase in neues Gefäß überführen -> RNA Isolierung

+ 0,3 ml 100 % EtOH pro ml TriZol invertieren -> 3‘ RT -> 5‘ 2000 g 4°C


Organische Phase oberhalb des DNA Pellets

abnehmen und in neues 1,5 ml Gefäß überführen -> Protein Isolation

+ 1 ml 0.1 M NaCitrat/10 % EtOH pro ml TriZoL -> 30’RT -> 5‘ 2000g 4 °C

+ 1 ml 0.1 M NaCitrat/10 % EtOH pro ml TriZoL -> 30‘RT -> 5‘ 2000g 4 °C

Jeweils Überstand verwerfen

+ 1.5 – 2 ml 75 % EtOH pro ml TriZol -> 20‘RT -> 5‘ 2000g 4°C

Überstand verwerfen Pellet Lufttrocknen -> 5 – 15‘

In 8 mM NaOH resuspendieren

Lagerung bei -5 bis -20 °C

4.1.4.3 Gesamt-RNA

Während der Isolation von Gesamt-RNA aus Säugerzellen kommt es häufig zur Degradation

der RNA durch in der Zelle und/oder der Umwelt vorhandene RNAsen. Um möglichst intakte

RNA zu isolieren wurde deshalb eine Phenol-Chloroform basierte Exktraktionsmethode

gewählt. Die dabei verwendeten Salze inhibieren die RNAsen und durch die anschließende

Phasentrennung mittels Chloroform Zugabe können diese dann nahezu vollständig von der

RNA separiert werden [237].

Gesamt-RNA Präparation mittels TriZOL



Ethanol 100 % und 75 %

Chloroform

0.1 M NaCitrat/10% EtOH

8 mM NaOH

1ml TriZOL pro 10 cm2 oder 5-10 x 106 Säuger Zellen


Arbeitsanweisung

ÜS absaugen; 1x mit 1xPBS waschen

+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben -> 15’ bei RT

Lysierte Zellen durch mehrmaliges auf- und abpipettieren homogenisieren (je nach

Zelldichte Menge anpassen) und in 2 ml Gefäß überführen




Falls notw. in 2 ml Gefäß überführen -> 3’ bei RT -> 15’ 12.000 g

4°C

Abbildung 4.4: RNA Phase TriZOL Aufreinigung

Obere, wässrige Phase in neues Gefäß überführen

+ 0,5 ml Isopropanol / ml TriZOL invertieren -> 10‘ RT -> 10‘ 12.000 g 4 °C

Überstand vorsichtig abnehmen (RNA pelletiert)

+ 1ml 75 % EtOH / ml TriZOL vortexen -> 5‘ 5000 g

Überstand komplett abnehmen

Pellet lufttrocknen

RNA in RNAse freiem Wasser resuspendieren

TriSpin RNA Präparation

Um gesamt RNA aus kleinen Proben möglichst verlustfrei und rein zu isolieren, wurde eine

kombinierte Methode aus TriZOL und Kieselgel-Säulen angewendet [238].



Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent # 400800

Chloroform


Ethanol 70 %

Arbeitsanweisung

ÜS absaugen; 1x mit 1x PBS waschen

+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben -> 15’ bei RT

Lysierte Zellen durch mehrmaliges auf- und abpipettieren homogenisieren (je nach

Zelldichte Menge anpassen) und in 2 ml Gefäß überführen





Abbildung 4.5: RNA Phase TriZOL Aufreinigung

Obere, wässrige Phase in neues Gefäß überführen

Organische Phase für die Isolierung von DNA und Protein verwendbar

+ 1:1 70 % EtOH -> 2x 5“ vortexen

≤ 700 µl auf Säule geben -> 30-60“ 12.000 G


(Bei Proben >700 µl Schritt 9 und 10 wiederholen)

DNAse Behandlung für RT-PCR Anwendungen:

o + 600 µl Low-Salt Waschpuffer -> 30-60“ 12.000 G

o Durchfluss verwerfen -> 2’ 12.000 G

o DNAse Mix vorbereiten: 50 µl DNAse Puffer + 5 µl RNAse freier DNAse

o DNAse Mix direkt auf die Membran geben -> 15’ 37 °C

+ 600 µl High-Salt Waschpuffer > 30-60“ 12.000 G


+ 600 µl Low-Salt Waschpuffer -> 30-60“ 12.000 G



+ 300 µl Low-Salt Waschpuffer -> 2’ 12.000 G

Säule in neues RNAse freies 1,5 ml Gefäß

+ 30-100 µl Elutionspuffer (60°C) -> 2‘ RT -> 1‘ 12.000 G

Lagerung bei -20 °C für bis zu 1 Monat

Langzeitlagerung -80 °C

4.1.5 Gelelektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren

In der Gelektrophorese macht man sich die unterschiedliche Ionenbeweglichkeit von

Nukleinsäuremolekülen in einem elektrischen Feld zunutze, um diese nach ihrer Größe und

Ladung aufzutrennen. Als Matrix wird oft ein Agarosegel verwendet. Agarose ist ein

Polysaccharid aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose, welches hauptsächlich aus

Rotalgen gewonnen wird. In TBE gelöst bildet es ein gelartiges, negativ geladenes Polymer.

Je höher die Agarosekonzentration ist, desto kleiner sind die Poren des Gels. Die

Wanderungsgeschwindigkeit der unterschiedlichen Nukleinsäuremoleküle ist somit von der

Länge, der Ladung und der Sekundärstruktur des Moleküls abhängig. Um die Nukleinsäuren

nach der Gelelektrophorese im Gel sichtbar machen zu können, werden ihnen der

interkalierende Farbstoff Ethidiumbromid zugesetzt. Ethidiumbromid verändert durch die

Bindung an Nukleinsäuren sein Absorptionsspektrum und wird so unter UV-Licht sichtbar.

Als Größenstandard wird eine 1 kb oder 100 bp Leiter verwendet.

Agarosekonzentration Auftrennungsbereich

0,8 800 – 12.000

1,5 200 – 4000

2,0 50 – 2000


Agarose Biozym 850094

1x TBE-Puffer

Ethidiumbromid Roth HP47.1


Ladepuffer Fermentas R0611

Leiter 100 bp ThermoFisher SM0241

1kb DNA Ladder NEB N3232S

Gelektrophoresekammer

Gelkammer

Kamm

10x TBE Puffer

TRIS 121.1 g 1 M

Borsäure 61.8 g 1 M

EDTA (Dinatrium Salz) 7.4 g 0.02 M

Mit RNase freiem Wasser zubereiten. Für 1x TBE 100 ml auf 1 L verdünnen. Bis zu 6 Monate

bei RT lagerbar.

Arbeitsanweisung

Benötigte Menge Agarose einwiegen und in entsprechendem Volumen TBE-Puffer in

der Mikrowelle aufkochen, bis vollständig gelöst

Mehrmals zwischendurch schwenken, um Klumpen und Siedeverzug zu verhindern.

1 Tropfen Ethidiumbromid pro 100 ml Gellösung zugeben

Kurz abkühlen lassen und in vorbereitete Gelkammer mit Kamm eingießen

Nach ca. 30 Minuten sollte das Gel fest geworden sein; Kamm entfernen

Proben 6:1 mit Ladepuffer mischen und in die einzelnen Taschen pipettieren

In der ersten Spur 3 µl einer passenden Leiter pipettieren

In der Regel verwendet man eine Spannung von 5 Volt/cm Gellänge; diese sollte aber

an die jeweilige Anwendung angepasst werden

Detektion unter UV-Licht

4.1.6 Nukleinsäure Quantifizierung

Für nachfolgende Anwendungen war es meist notwendig, sowohl die Menge die Reinheit als

auch Unversehrtheit der isolierten Nukleinsäuren zu bestimmen. In dieser Arbeit wurden


dafür fluorometrische Messungen genutzt. Hierbei wurden zur Probe jeweils für DNA oder

RNA spezifische, interkalierende, fluoreszierende Farbstoffe zugegeben und anschließend

entweder im Qubit Fluorometer oder auf einem BioAnalyzer Chip gemessen. Die Menge

wurde dann anhand einer Standardreihe berechnet. Die Messung im Qubit wurde vor allem

für die Untersuchung von genomischer DNA bevorzugt. Der Vorteil ist, dass man die

Nukleinsäuren relativ störungsfrei auch bei niedrigen Konzentrationen messen kann, Der

Nachteil ist, dass man keine Aussage über den Reinheitsgrad der Probe erhält. Für die

Messung von DNA Fragmenten aus PCRs und RNAs bietet eine elektrophoretische Analyse

mit einem BioAnalyzer Kit mehr Vorteile. Bei dieser Lab-On-a-Chip Methode werden

mikrokapillare Chips verwendet, über die mehrere, vorher mit fluoreszierenden Farbstoffen

gefärbte Proben eine Gelelektrophorese durchlaufen können. Innerhalb des Gerätes können

dann die nach Ladung und Größe aufgetrennten Nukleinsäurefraktionen über eine

laserinduzierte Fluoreszenz gemessen werden. Die 2100 expert Software rechnet

anschließend die Fluoreszenzintensität gegen die Migrationszeit auf und erstellt so ein

Elektropherogramm. Über die Peakflächen der internen Standards und die Peakflächen der

gemessenen Nukleinsäuren wurde anschließend deren Menge berechnet. Für RNA bietet

die Messung mit dem BioAnalyzer den Vorteil, dass die „RNA integrity number“ berechnet

werden kann. Hierbei wird die gesamt Peakfläche der RNA über ein logarithmisches

Regressionsmodel mit den zu erwartenden Peakflächen der intakten 28S und 18S

ribosomalen RNA verglichen. Die Werte können zwischen 10 für vollkommen intakte RNA

und 1 für vollkommen degradierte RNA liegen [239].

4.1.6.1 Qubit Analysen


Qubit® dsDNA BR Assay Kit Life Technologies Q32850

Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851

Qubit® RNA HS Assay Kit Life Technoligies Q32852

Qubit® Protein Assay Kit Life Technoligies Q33211

Qubit® assay Gefäß Life Technologies Q32856


Arbeitsanweisung

Mastermix vorbereiten: n x 199 µl Qubit Puffer + n x 1 µl Qubit reagent

n x Assay Gefäß beschriften 1 – 10 µl Probe vorlegen

auf 200 µl mit Mastermix auffüllen

kurz vortexen und mit der Tischzentrifuge abzentrifugieren -> 2-20‘ RT

Im Qubit messen

4.1.6.2 BioAnalyzer Messungen


RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067- 1511

RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067- 1513

Small RNA Kit Agilent 5067- 1548

Chip priming station Agilent 5065- 4401

IKA vortex mixer

RNaseZAP® Ambion, Inc. 9780

RNase-Free Water Ambion, Inc. AM9938

Microzentrifuge

Heizblock oder Wasserbad

Arbeitsanweisung

Beispielhaft für RNA 6000 Nano Kit

Die Anweisungen für die anderen Kits variieren hauptsächlich in den Komponenten.

Chip Priming Station vorbereiten

Spritze austauschen:

o Alte Spritze aus dem Deckel heraus schrauben

o Alte Spritze aus dem Clip entlassen und verwerfen

o Plastickkappe der neuen Spritze entfernen und in den Clip einsetzen

o In das Loch des "Luer lock" einführen und festschrauben

Basisplatte einstellen

o Verriegelung öffnen.


o Mit Schraubenzieher Schraube auf Unterseite lösen.

o Platte anheben und an Position C wieder einsetzen; Schraube erneut

festziehen

Spritzenclip einstellen:

o den Cliphebel öffnen und bis zur obersten Position laufen lassen

RNA Leiter vorbereiten

o Leiter abzentrifugieren und in RNase freies Gefäß geben

o Temperaturdenaturierung für 2 min bei 70 °C.

o Sofort auf Eis kühlen

o Leiter aliquotieren in 0.5 mL RNase- freien Gefäß

o Aliquots bei - 70 °C lagern

o Wiederholte Temperaturdenaturierung

o Vor der Benutzung Leiter auf Eis auftauen

Gel vorbereiten

o 550 μL RNA gel matrix (red) in einen Spinfilter

o 1500 g ± 20 % für 10 min bei RT

o 65 μL gefilterte Gelaliquots in 0.5 mL RNase- freie Microzentrifugengefäß.

Filtriertes Gel in 4 Wochen aufbrauchen. Lagerung bei 4 °C.

Gel-Dye Mix vorbereiten

o RNA Farbkonzentrat (blau) auf RT für 30 min.

o RNA Farbkonzentrat (blau) für 10 s vortexen, abzentrifugieren und 1 μL des

Farbstoffes zu 65 μL filtriertes Gelaliquot.

o Lösung gut vortexen, bei 13000 g für 10 min RT zentrifugieren; Vorbereiteten

Gel-Farb-Mix innerhalb eines Tages verbrauchen.

Gel-Dye Mix beladen

o Neuen RNA chip in die Chip priming Station legen.

o 9 μL des gel- Gel-Dye Mix in das markierte Well.

o Kolben bei 1 mL schließen der Chippriming Station.


o Kolben runter drücken bis er vom Clip gehalten wird.

o 30 s warten, dann den Chip entlassen.

o 5 s warten. Langsam den Kolben auf 1 mL Position zurück führen.

o Öffnen der Chippriming Station + 9 μL des Gel-Dye Mix in das markierte Well.

o Restlichen Gel-Dye Mix verwerfen

Marker laden

o 5 μL des RNA Marker (grün) in alle 12 Proben Wells und in das markierte Well

Laden der Leiter und der Proben

o 1 μL der präparierten Leiter in das markierte Well.

o 1 μL der Probe in jedes der 12 Proben Wells. 1 μL des RNA Markers (grün) in

jedes unbenutzte Proben Well.

o Chip horizontal in den IKA-Vortexer und für 1 min bei 2400 rpm vortexen.

o Chip auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument innerhalb 5 min laufen

lassen

4.1.7 cDNA Synthese

Für quantitative RNA Messungen muss die vorhandene RNA in doppelsträngige cDNA

(„complementary DNA“) umgeschrieben werden. Hierfür wurde eine reverse Transkriptase

genutzt. Die reverse Transkription von Gesamt-mRNA läuft ähnlich einer herkömmlichen

PCR ab. Anstatt der spezifischen Primer können hier Oligo(dT)18Primer oder sog. Random-

Hexamer-Primer verwendet werden. Oligo(dT)18Primer binden spezifisch an den Poly-A

Schwanz von mRNA und bilden mit ihrem freien 3‘ OH Ende den Anfangspunkt für die

reverse Transkription. Random-Hexamer-Primer liegen in einer Mischung aus Nukleotid-

Hexameren mit jeweils zufälliger Sequenzzusammensetzung vor. Sie bilden ebenfalls mit

ihrem freien 3‘ OH Ende den Start einer cDNA Synthese, binden aber im Gegensatz zu den

Oligo(dt) 18 Primern zufällig überall. Der Vorteil ist, dass man so auch Poly-A-Schwanz-freie

RNAs, wie teilweise degradierte RNA, microRNA oder ribosomale RNA amplifizieren kann.



Random Hexamer Primer Promega C118A

10 mM dNTPs

DEPC Wasser Ambion, Inc. AM9938

5x RT-Puffer Invitrogen Y02331

25 mM MgCl2 Promega A351B

0,1 M DTT Invitrogen Y00147

RNAse out NEB M0314L

Superscript III Invitrogen 56575

Arbeitsanweisung

Reaktions Mix Synthese Mix

≤5 µg RNA (max. 8 µl)

1 µl Random Primer

1 µl 10 mM dNTPs

Auf 8 µl mit DEPC Wasser auffüllen

5x RT Puffer 4 µl

25 mM MgCl2 4 µl

0,1 M DTT 2 µl

RNAse out 1 µl

SS III 1 µl

Reaktionsmix 5‘ 65 °C → 1‘ Eis

+ 10 µl Synthese Mix

10’ 25 °C

50’ 50 °C

5’ 75°C

Bei -20 °C lagern

250 ng RNA eingesetzt -> 12.5 ng/µl (Proben < 32 ng/µl RNA nicht für q/dPCR sinnvoll)

4.1.8 Quantitative PCR Methoden

Für die Quantifizierung von spezifischen mRNAs kann man verschiedene Methoden nutzen.

Für diese Arbeiten wurde einerseits die quantitative Echtzeit-PCR (RT-PCR), andererseits die

digitale PCR genutzt. Beide Techniken beruhen auf einer herkömmlichen PCR und können


nur mit cDNAs durchgeführt werden, weshalb eine cDNA-Synthese vorausgehen muss.

Während bei der quantitativen Echtzeit-PCR über einen bestimmten Zeitraum eine

fluorometrische Messung der gebildeten DNA-Amplifikate abläuft, wird bei der digital PCR

eine Endzeitpunktsmessung vorgenommen.

4.1.8.1 Light Cycler 480 SYBR Green Roche

Die Quantitative Echtzeit-PCR misst die Zunahme der Fluoreszenz über die Zeit. An den

daraus aufgetragenen sygmoidalen Kurven kann der Zeitpunkt ermittelt werden, zu dem die

Kurve eine definierte Fluoreszenzintensität überschreitet. Diese Punkte werden auch

Crossing Points/time, kurz Cp oder Ct Werte, genannt.

Abbildung 4.6: Typische Fluoreszenzkurven einer quantitativen PCR

Für eine relative Quantifizierung werden bei jeder Probe zusätzlich zur Expression der

Zielgene die Expression von Referenzgenen gemessen. Diese Referenzgene werden für die

interne Standardisierung der Proben genutzt, wobei man davon ausgeht, dass sie in jeder

Probe ungefähr gleich stark exprimiert werden. Aus den Ct Werten des Zielgens und dem

Durchschnitts Ct aller Ct Werte der Referenzgene kann so der ΔCt Wert gebildet werden.

Der relative Expressionsunterschied (Ratio) zwischen Probe und Kontrolle berechnet sich als

, wobei sich der delta-delta-Ct Wert aus der Subtraktion der ∆Ct Werte von Probe und

Kontrolle ergibt [240].



Ligth Cycler® 480 DNA SYBR Green I Master Roche 04707516001

Target Primer Fw und Rev

Referenz Primer Fw und Rev

Ligth Cycler® 480 Roche

Light Cycler Platten

PCR Klebefolien Thermo Fisher AB-0558


Arbeitsanweisung

10 µl Roche SYBR Green I Master

0,4 µl Forward Primer (10 µM → 200 nM Endkonzentration)

0,4 µl Reverse Primer (10 µM → 200 nM Endkonzentration)

≤ 20 ng/20 µl Reaktion cDNA


Mit Folie abkleben; Bis zur Reaktion auf Eis inkubieren

Programm

Program Name Cycles Analysis Mode

Pre-Incubation 1 None

Amplification 45 Quantification

Melting Curve 1 Melting Curves

Cooling 1 None

Program Name Target [°C] Acquisition mode Hold [mm:ss] Ramp Rate [°C/sec]

Pre Incubation 95 None 03:00 4.8

Amplification

95 None 00:10 4.8

55 None 00:20 2.5

72 SINGLE 00:01 4.8

Melting Curve

95 None 00:05 -

65 None 01:00 -

98 Continous 5-10 Acq. /°C -

Cooling 40 None 0:10 2.0

4.1.8.2 Quant Studio 3D

Bei der digitalen PCR läuft wie bei der q-RT-PCR eine herkömmliche PCR ab. Der Unterschied

ist, dass der gesamte Reaktionsansatz auf einem Chip verteilt wird, der ca. 10.000 Kavitäten

umfasst. Durch eine vorherige Grenzverdünnung des Ausgangsmaterials sollen pro Kavität

ca. 0,8 Reaktionen ablaufen. Am Ende der PCR wird aus jeder Kavität entweder ein positives


oder ein negatives Signal detektiert. Durch die Annahme, dass die Matrizen einer Poisson-

Verteilung folgend, verteilt wurden, kann direkt von der Anzahl der positiven Kavitäten auf

die Anzahl der Ausgangsmatrizen geschlossen werden.


QuantStudio™ 3D Digital PCR Chips Life Technologies 4485507

QuantStudio™ 3D Digital PCR Master Mix Life Technologies 4482710

QuantStudio™ 3D Digital PCR UV Sealing Kit Life Technologies 4488475

UPL Sonden

Taq-Man Assays

GeneAmp®PCR System 9700

Chip Loader Life Technologies

Quant Studio 3D Life Technologies

Arbeitsanweisung

1. PCR-Ansatz für 1 Probe und 1 Chip

(UPL-Sonden)

Material Volumen Stock Endkonzentration

Digital PCR MasterMix 2x 9,0 2x 1x

Vorwärtsprimer 1,8 10 pM 1 pM

Rückwärtsprimer 1,8 10 pM 1 pM

UPL (Sonde) 1,8 2,5 pM 0,2 pM

DNA 1,8 10 ng/μl 1 ng/μl

Aqua dest. 1,8 - -

Gesamtvolumen

(für einen Chip)

18 - -

(TaqMan Assay)


Material Volumen Stock Endkonzentration

Digital PCR MasterMix (2x) 9 2x 1x

TaqMan Assay (20x) 0,9 20x 1x

(c)DNA 1,8 10 ng/μl 1 ng/μl

Aqua dest. 6,3 - -

Gesamtvolumen

(für einen Chip)

18 - -

Vortexen (low-speed) oder auf- und abpipettieren, kurz abzentrifugieren

2. Chip beladen

PCR-Ansatz bei Raumtemperatur inkubieren (~5-10 Minuten)

ChipLoader starten (ChipLoader-Arm muss in Ausgangsstellung sein!)

ChipLoader-Arm in

Ausgangsstellung

(180°-Winkel)

Bereitstellung folgender Materialien:

Chip Chip-Deckel Loading-Blade

ImmersionFluid-Spritze* ** ChipSealant-Spritze** UV-Pen/ -Station

Abbildung 4.7 „Quant Studio TM

3D Digital PCR System“ Betriebsanleitung, life Technologies, Carlsbad, CA, USA entlehnt

* Wird eine neue Spritze verwendet, muss der Kolben kurz um ein oder zwei mm

zurückgezogen werden, um mögliche Blockaden zu lösen.


** Verpackung aufbewahren! Die Spritzen werden bei Nichtgebrauch darin bei

Raumtemperatur gelagert.

Wenn der ChipLoader betriebsbereit ist (grünes Dauer-

leuchten), den Chip in die Chiphalterung und die

Loading-Blade einspannen; den roten Schutzfilm vom

Chip-Deckel entfernen und den Deckel in die Halterung

am ChipLoader-Arm einspannen; dazu den Knopf nach

vorne drücken und wieder loslassen, sobald der Chip

eingelegt ist.

Den vorbereiteten PCR-Ansatz kurz vortexen und ab-

zentrifugieren; 14,5 μl PCR-Ansatz in den Sample-

LoadingPort der LoadingBlade pipettieren. Leichter,

wenn man die Blade in der Hand hält. Aufpassen! Nicht

gegen die Rückwand drücken. Versatzfrei in den ChipLoader einspannen und anschließend

den schwarzen Button des ChipLoaders betätigen, um den Beladungsvorgang zu starten

(Lampe blinkt dann grün).

Sofort nachdem der Beladungsvorgang abgeschlossen ist, den Chip mit ausreichend Tropfen

ImmersionFluid bedecken. Die gesamte schwarze Fläche sollte bedeckt sein! (ggf.

danebenge-gangenes mit einem mit Isopropanol-getränkten Tuch abwischen)

Den ChipLoader Arm um 180 ° rotieren und ca. 15s auf den Chip pressen. Danach mit

gedrücktem Release-Button den Arm wieder in die Ausgangsstellung bringen.

Alle Seiten des Chipdeckels kräftig und gleichmäßig mit der Hand andrücken, um

nachfolgende Verdunstung zu vermeiden.


Den Chip an den Seitenkanten fassen, aus der

Chiphalterung entnehmen und (mit der Öffnung nach

oben) im 45° Winkel halten. Dann den Chip mit

ImmersionFluid auffüllen, bis nur noch eine 2-3mm große

Luftblase im Chip ist.

Die Chip-Öffnung mit dem ChipSealant versiegeln.

Dazu ChipSealant mit der Spritze auf die Öffnung geben.

Den Chip anschließend in die UV-Curing Station des

ChipLoaders schieben und den Chip solange

hineindrücken, bis das UV-Licht aufleuchtet und wieder

erlischt (~15 Sek). Der Chip darf dabei das Dach der UV-

Curing Station nicht berühren.

Dann wird der Chip so in die „UV-Station“ eingelegt, dass

die Öffnung unter dem UV-Pen liegt. Den Chip 30 Sek.

mit UV-Licht bestrahlen.

Bei diesem Schritt unbedingt eine UV-Schutzbrille

tragen!!!

Den Chip auf einer sauberen und trockenen Arbeitsfläche zwischenlagern. Die PCR sollte in

den ersten 2h nach Beladung erfolgen.

3. PCR-Cycling

GeneAmp®PCR System 9700 starten.

dPCR-Chips gleichmäßig auf die Chip-Halter verteilen (die Chip-Öffnung muss nach

vorne zeigen), die Halter mit den ThermalPads bedecken und in den Cycler stellen.

Diesen schließen (Wird nur ein Halter verwendet, muss dieser immer auf die rechte

Heizplatte des Cyclers gestellt werden).

Folgende PCR-Reaktion starten:

Stage Step Temp (°C) Time (mm:ss) Ramp rate


Run speed: Standard

Volumen: 20 μL

Hold DNA polymerase activation 96.0 10:00

Default

Cycling

(39 cycles)

Anneal/extend 60.0 2:00

Denature 98.0 0:30

Hold Final extension 60.0 2:00

Hold Storage 10.0 ∞


4. Chip-Analyse durch QuantStudio3D

Chips aus dem PCR-Cycler entnehmen und ggf. Kondenswasser mit einem fusselfreien Tuch

abwischen.

Quant Studio 3D starten

Im Menü „USB“ als Speicherort auswählen und einen USB-Stick in den USB-Port einführen.

Schubfach des QuantStudios öffnen

und den Chip mit der Oberseite nach

oben auf den Schlitten legen.

Schubfach schließen.

Auf dem Touchpad des QuantStudios

„Start Run“ auswählen, um die Analyse zu starten.

Nachdem die Schritte „Processing Chip“ und „Analysing Chip“ abgeschlossen sind, werden

die vorläufigen Ergebnisse angezeigt

VIC und FAM stehen für die detektierbaren

Farbstoffe. Die Fähnchen können in den Farben grün,

gelb oder rot erscheinen und zeigen die Qualität der

Auswertung an. Bei „rot“ sollte die Messung (nach

Inspektion des Chips auf Verunreinigungen, etc.)

wiederholt werden.

Bei Verwendung von Negativkontrollen ohne Target oder DNA-Sample werden keine

Flaggen angezeigt. Diese müssen mit der AnalysisSuite-Software auf Amplifikationen

untersucht werden.


Die Probenauswertung kann mit Auswahl des Buttons „Done“ beendet und ein neuer Chip

analysiert werden.

Die Daten Analyse erfolgt in der Quant Studio 3D AnalysisSuite, einer Cloud Software.

4.1.9 Sangersequenzierung

Für die Sequenzierung von einzelnen DNA Fragmenten einer Größe bis ca. 1000 bp wurde

die Didesoximethode nach Sanger verwendet. Hierbei wird ein vorhandenes DNA-Fragment

in einer PCR erneut amplifiziert. Das Besondere ist der verwendete Mix aus Desoxy und

Didesoxynukleotiden. Durch den Einbau eines fluoreszenzmarkierten ddNTPs werden so

verschiedenlange Kettenabbruchprodukte gebildet. Die PCR Bedingungen werden so

gewählt, dass statistisch gesehen an jeder Position der Matrize mehrmals ein Abbruch

stattfindet. Die so gebildeten, unterschiedlich langen Kettenabbruchprodukte können

anschließend über eine Kapillargelelektrophorese aufgetrennt und analysiert werden.

Anhand der daraus gebildeten Sequenzchromatogramme kann die vorhandene

Basenabfolge mit einer Referenz verglichen werden.

Abbildung 4.8 Typisches Sequenzchromatogramm einer Sangersequenzierung


PCR Produkt


Primer Fw/Rev

DMSO Roth A994.2

3 M Natrium Acetat Ambion AM9740

Ethanol 100 bzw 70 %

100 mM dNTPs Life Technologies 10297-018 (wird von uns auf 10mM

verdünnt)

Light Cycler Platten Roche 05102413001

ExoSAP-IT Affymetrix 78205 10 ML

Big Dye Life Technologies 4337456

5x Puffer Life Technologies 4336699

HiDi-Formamide Life Technologies 4311320

Arbeitsanweisung

Aufreinigung PCR-Produkt mit ExoSAP-IT:

Ansatz je Sample:

PCR-Produkt: 0,5 - 2 µl

ExoSAP-IT: 0,75 µl

Aqua bidest: 2,25 – 3,75 µl

Mastermix (ExoSAP-IT + Aqua bidest) vorbereiten, in Platte vorlegen, PCR-Produkt

pipettieren; je nach Bandenstärke 0,5 bis 2 µl PCR-Produkt einsetzen (mit Menge an H2O

ausgleichen) (bei ganz schwachen Banden kann das Wasser auch ganz weggelassen werden,

dann 4,25 µl PCR-Produkt verwenden).

(Mastermix + DNA: pro Well 5 µl)

Inkubation:

Thermocycler Programm EXOSAP

37°C 20 min.

80°C 15 min.

Markierung für Sequenzierung mit ABI (BigDye® Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit):


Ansatz je Sample:

gereinigtes PCR-Produkt: 5 µl

Primer (5 pmol): 1 µl

Aqua bidest: 1 µl

Sequenzmix (Big Dye): 1 µl

5x Puffer: 1,5 µl

DMSO: 0,5 µl

Mastermix (5 µl) zu gereinigtem PCR-Produkt (5 µl) geben, Gesamtvolumen 10 µl.

Markierungsreaktion:

Thermocycler Programm ABI-Mark

1’ 96°

10’’ 96°

5’’ 50° 30 Cyclen* *bis zu 40 Cyclen mgl.

1’** 60° **bis 4 min

∞ 15°

Hinweis: Die Fluoreszenzmarkierung ist lichtempfindlich; Proben bei der weiteren

Bearbeitung (trocknen, lösen, aufbewahren) vor Licht schützen!

Fällung und Reinigung der Proben zur Sequenzierung:

Fällung der Proben:

Ansatz je Sample:

Natrium-Acetat (3M): 1 µl

Ethanol 100%: 25 µl


Zum Markierungsprodukt geben, kurz vortexen, 20 min zentrifugieren (max. rpm, ca. 3700,

4°C).

Flüssigkeit ausklopfen.

Waschen der Proben:

Ansatz je Sample:

Ethanol 70%: 100 µl

Zum Markierungsprodukt geben, kurz vortexen, 20 min zentrifugieren, Flüssigkeit

ausklopfen, Pellet 15 bis 30 min. auf 39 °C Heizplatte trocknen (Ethanol sollte vollständig

verdunstet sein, kann nach 15 min kontrolliert werden).

Lösen der Proben:

Ansatz je Sample:

HiDi : 20 µl

15 min bei Raumtemperatur stehen lassen, dann vortexen und runterzentrifugieren,

anschließend sequenzieren (oder bis zur Sequenzierung im Kühlschrank lagern oder

einfrieren).


4.1.10 FPNI-PCR

Um den genauen Integrationsort der

Transkriptionskasette innerhalb des

Wirtsgenoms zu bestimmen wurde eine

geschachtelte integrative PCR mit

Fusionsprimern (FPNI-PCR) etabliert.

Kernstück dieser Methode ist die

Verwendung von Fusionsprimern. Für die

Amplifizierung wurden einerseits Primer mit

einer definierten Sequenz verwendet, die

am 5‘ Ende der Transkriptionskassette, also

innerhalb der trunkierten LTRs binden und

eine Amplifizierung aus der Kassette heraus

ermöglichen. Die weitere Amplifikation

dieses ersten Stranges wird durch den

Einsatz eines Pools an degenerierten

Fusionsprimern ermöglicht. Diese Primer

haben einen zufällig degenerierten Teil und

eine bekannte Adaptersequenz. Die

verschieden langen Amplifikate konnten nun über eine Gelextraktion vereinzelt werden und

über anschließende nested PCR und die Verwendung von aufeinanderfolgenden

spezifischen Primern reine Amplifikate der die Kassette flankierenden DNA Bereiche

gewonnen werden. Die so gewonnenen Amplifikate wurden anschließend für eine Sanger

Sequenzierung eingesetzt. Die hierfür verwendeten Primer und Protokolle sind unter 4.1.3

gelistet [241].


Gen spezifische Primer 0,2 uM

Fusionsprimer Pool 1 uM

10 uM pool of each FP1-9, and use 0,555 ul.

Abbildung 4.9: Ablauf der FPNI PCR


FSP1 and FSP2 0,2 uM

GOTaq Mastermix

Arbeitsanweisung

1st PCR: (Primer: SIN_LTR_5For_0 + FP and RU5_LTR_5rev_0 + FP1-9 pool)

1 Zyklus 95 °C, 2 min

2 Zyklen 95 °C, 10 Sec; 55 °C, 30 sec, 72 °C, 2 min (ssDNA production)

1 Zyklus 95 °C, 10 Sec, 25 °C, 2 min, ramp +0,2 °C/Sec; 72 °C, 2 min (degenerate

oligo)

2 Zyklen 95 °C, 10 Sec; 55 °C, 30 sec, 72 °C, 2 min

1 Zyklus 95 °C, 10 Sec, 44 °C, 2 min; 72 °C, 2 min

2nd PCR: (Primer: SIN_LTR_5For_1 + FSP1 and RU5_LTR_5rev_1 + FSP1)

Verdünne 1st PCR 1:20: 1 µl 1st PCR für einen 20 µl Reaction

1 Zyklus 72 °C, 5 min (add 2nd PCR Mastermix, GoTaq + neue Primer, 20 ul)


30 Zyklen 95 °C, 10 sec; 55 °C, 30 sec; 72 °C, 2 min


3rd PCR: (Primers: SIN_LTR_5For_2 + FSP2 and RU5_LTR_5rev_2 + FSP2)

Verdünne 2nd PCR 1:50: 0.4 µl 2nd PCR auf 20 µl Reaktion


12 Zyklen 95 °C, 10 Sec; 55 °C, 30 sec, 72 °C, 2 min


Mastermixe

1st PCR mix: x µl DNA (~20 ng genomische DNA)

1 µl Gen spezifische Primer (10 µM, SIN_1 oder RU5_1)

0,55 µl FP Primer Pool (10 µM von jedem FP1-9 Primer, aus Stammlösung)

y µl Wasser (Ambion oder Sigma) auf 20 µl Endvolumen

10 µl 2 x GoTaq Mastermix


2nd PCR 1 µl 1st PCR Produkt


1 µl FSP1 Primer (10 µM)

Wasser auf 20 µl


3rd PCR Verdünne 2nd PCR Produkt 1:50 und nutze 1 µl als Templat für die 3rd PCR

(1:1000 Verdünnung)


1 µl FSP2 primer (10 µM)

Wasser auf 20 µl


5-10 µl auf einer Agarosegelelectrophorese laufen lassen

Genomische DNA ohne Viruskassette als Negativkontrolle verwenden

Anschließend Sangersequenzierung mit den letzten verwendeten Primern möglich.

4.1.11 Vergleichende RNA Expressionsanalysen

Für die vergleichenden RNA Expressionsanalysen wurde RNA aus TriZOL Proben nach 4.1.4.4

isoliert. Anschließend wurde die rRNA mittels des Ribo-ZeroTM Kits (Epicenter, Madison,

WI) entfernt. Die RNA wurde mit den Materialien und Anleitungen des SOLiD® Total RNA-

Seq Kit (Invitrogen) aufbereitet. Für jede Probe wurde hierbei ein eigener Barcode

verwendet. Einige der Bibliotheken wurde mit der „exact call chemistry“ gemischt und 75 bp

vorwärts sequenziert. Andere wurden als „paired end“ 75 bp vorwärts und 35 bp rückwärts

sequenziert. Nach dem Export der Daten wurden diese mittels des Lifescope software

analysis tools (Invitrogen) auf das humane Referenzgenome GRCh37/hg19 gemappt. Die

statistische Interpretation wurde mittels R durchgeführt. Die einzeln gemappten Fragmente

werden im weiteren „Reads“ genannt und die Expressionslevel der einzelnen Gene werden

als Reads per kilobase per million, kurz RPKM angegeben. Für die weiteren Analysen wurden

die Expressionslevel mittels des „R“ Pakets DESeq (Quelle) ausgewertet. Die Normalisierung

umfasst im DESeq Paket eine Berücksichtigung der Genlänge und des GC Gehaltes eines

Gens (-> In-lane normalization) sowie eine Umrechnung der Reads in Reads per kilobase of

exon per million mapped reads RPKM (->between-lane normalization). Abhängig von den


verschiedenen biologisch relevanten Fragestellungen wurden Vergleiche zwischen den

verschiedenen Zelllinien und Zustände durchgeführt. Die Genlisten wurden anschließend

gefiltert. Hierbei wurden alle Vergleiche, die einen FoldChange von kleiner 2 ergaben,

ausgeschlossen. Die verbliebenen Gene wurden anhand ihres P-Wertes gefiltert. Hierbei

wurden alle Vergleiche ausgeschlossen, deren p-Wert größer 0.05 war. Der p-Wert ist das

Ergebnis eines Likelihood-Ratio Testes (LRT) basierend auf der negativen binominal

Verteilung der normalisierten Genreads. Der hiervon gebildete padj ergibt sich durch eine

Bonferroni-Korrektur des p-Wertes. Hierbei wirkt man dem Auftreten von falsch-posi ven

Fehlern durch die erhöhte Menge an Wiederholungen der Anwendung des LRTs entgegen

(LRT wird pro Vergleich für 2x 17.000 Gene durchgeführt). Das R Paket DESeq wurde

ebenfalls genutzt um eine Hauptkomponentenanalyse durchzuführen. Die

Hauptkomponentenanalyse ist eine variablenorientierte Methode, die versucht, die

Originalvariablen durch eine kleinere Anzahl ,,dahinterliegender” Variablen zu ersetzen.

Hierbei wird eine orthogonale Transformation der ursprünglichen Variablen in eine neue

Menge unkorrelierter Variablen, den Hauptvariablen, vollzogen. Die Hauptkomponenten

werden nacheinander in absteigender Bedeutung konstruiert und stellen eine

Linearkombination der ursprünglichen Variablen dar. In unserem Fall wurde dies bis auf

zwei Hauptkomponenten vollzogen, so dass die Datensätze zweidimensional dargestellt

werden konnten.

4.2 Vektorarbeiten

Für die gezielte endogene Expression von Genen werden in der Gentechnik meistens

doppelsträngige DNA Vektoren eingesetzt. Die in dieser Arbeit verwendeten Vektoren

beruhen auf der Basis bakterieller Plasmide oder lentiviralen Ursprungs. Alle Vektoren

enthielten ein Resistenzgen, um sie in E.coli gezielt vermehren zu können, sowie einen

starken Säuger Promotor vor dem Zielgen, um eine Expression im Zielorganismus zu

gewährleisten. Die Plasmide wurden verwendet, um eine transiente Expression des Wildtyp

ST3GAL3 Proteins und seiner Mutationsvarianten in LMTK- Zellen zu erreichen. Der

multicistronische, lentivirale Vektor wurde genutzt, um vier Transkriptionsfaktoren

persistent in das Genom von primär Fibroblasten der Patientin zu integrieren.


4.2.1 Vektoren

Tabelle 4.2: Verwendete Vektoren

Name Vektor Resist

enz Stamm Beschreibung

pcDNA3.1/myc-his

A pcDNA3.1/myc-his A Amp XL1-blue

Euk. Expression vector for C-term

myc-His tag.

pST3GAL3wt-myc pcDNA3.1-

myc/His A Amp XL-1 blue

ST3GAL3 wt full length aus cDNA

(splice variant B1, accession no.

NM_006279.2) von Origene

(RC208261) in pcDNA3.1-myc/His A

über XbaI/BotI

pST3GAL3A13D-myc pcDNA3.1-


ST3GalIIIA13D (MutN), Umklonierung

über XbaI/NotI

pST3GAL3D370Y-myc pcDNA3.1-


ST3GalIIID370Y (MutC), Umklonierung

über XbaI/NotI

pST3GAL3A320D-myc pcDNA3.1-


ST3GalIIIA320D, Quick Change

Mutagenese aus pST3GAL3wt-myc

pMD2.G pMD2.G Amp DH5α Viruspartikel Produktion

VSV-G

pRSV-Rev pRSV-Rev Amp DH5α Viruspartikel Produktion HIV-1 Rev

pcDNA3.gp4xCTE pcDNA3 Amp Viruspartikel Produktion HIV-1 gag

und pol

pRRL.PPT.SF.hOKSMco-

idTom.pre.FRT

lentiviraler

Vektor 3.

Generation

Amp

hOct3/4, hKlf4, hSox2, hc-Myc;

Multicistronischer, lentiviraler

Transfervektor

4.2.2 Stämme und Medien

Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden zur Vervielfältigung von

Plasmiden genutzt. Die in vitro konstruierten Plasmide wurden in den Stamm DH5α

transformiert und dann nach entsprechender Anzucht reisoliert.


Tabelle 4.3: Verwendete Bakterienstämme

Stamm Genotyp Herkunft/Refrenz

DH5α supE44 hsdR17 (rk-mk+) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 ΔlacU169 (Φ80 ΔlacZ::M15)

Hanahan, 1985

Die Sterilisation der Medien erfolgte im Autoklaven für 20 min bei 120°C und 1 bar

Überdruck. Festmedien enthielten 2% Agar.

LB-Medium 1 % Trypton

0,5 % NaCl

0,7 % Hefeextrakt pH = 7,5

Zur Selektion Ampicillin-resistenter Klone wurde dem Medium Ampicillin in einer

Endkonzentration von 100 mg/l zugesetzt.

4.2.3 E.coli Transformation

Für die Transformation des E. coli-Stammes DH5α wurde die Calciumchlorid-Methode

verwendet [242].


MgCl2 100 mM

CaCl2 100 mM

CaCl2 in 15 %igem Glycerin 100 mM

LB-Medium

Plasmid/Virus-DNA

Arbeitsanweisung:

A) Herstellung und Lagerung transformationskompetenter Zellen

50 ml LB-Medium + 1 ml frische Stationärkultur des E. coli-Stammes DH5α

37 °C Orbitalschüttler -> Extinktion von 0,6 (600 nm)

jeweils in ein steriles Sarstedtröhrchen -> 15‘ Eis -> 10‘ 4000 Upm 4°C


in 15 ml eiskalter 0,1 M MgCl2-Lösung -> 10‘ 4000 Upm 4°C

15 ml eiskalter 0,1 M CaCl2-Lösung -> 20‘ Eis -> 10‘ 4000 Upm 4°C

+ 2,5 ml eiskalte 0,1 M CaCl2/Glycerin-Lösung resuspendiert

100 μl-Aliquots auf vorgekühlte 1,5 ml Eppendorf-Gefäße

Lagerung bei -80°C

B) Transformation der kompetenten Zellen

Auftauen auf Eis -> +DNA -> 30‘ Eis

2‘ 42 °C -> 5‘ Eis

+ 2 ml LB-Medium -> 30 – 60‘ 37 °C -> 1‘ 11.000 g

+100 µl LB-Medium -> LB-Amp Platten ausplattiert

37 °C ÜN

Bei Transformation von Ligationsansätzen wurde eine repräsentative Anzahl der

gewachsenen Einzelklone nach der „Mini-Screen“-Methode (4.2.5) untersucht.

4.2.4 E.coli Glycerinkultur

Für die Langzeitlagerung von transformierten E.coli Stämmen, wurden diese in einer 16 %

Glycerinlösung bei -80 °C kryokonserviert.


Wachsende E-coli Kultur (mid log phase)

80% Glycerin steril

Kryogefäß mit Innengewinde 2ml

Arbeitsanweisung


5 ml LB Medium mit einzelner Kolonie animpfen -> 37 °C Wasserbad bis mid log

phase

Nicht überwachsen lassen!!

800 µl der E-coli. Kultur in Kryogefäß vorlegen -> +200 µl 80% steriles Glycerin.

Vortexen

Lagerung bei -80 C

Zellen aus Glycerinkultur anziehen:

Mit sterilem 100 µl Tip die Oberfläche ankratzen -> zu 5 ml LB-Amp Medium geben

37 °C Wasserbad Schüttler

Stock NICHT auftauen lassen!!

4.2.5 Plasmidpräparation

Plasmidpräparationen wurden zur Validierung einzelner Klone nach einer Transformation im

Mini Ansatz (5 ml) oder im Maxi Ansatz (100 ml) für die quantitative Plasmidpräparation

durchgeführt. Beide Kits sind eine modifizierte Variante der alkalischen Lyse. Bei der

Alkalischen Lyse werden die Zellen durch die Zugabe eines alkalischen Detergenzien

enthaltenden Puffers (NaOH, SDS) lysiert. Die freiwerdende DNA kann dann anschließend,

wie bei der DNA Präparation, über eine Kieselgel-Festphase spezifisch isoliert werden [243].

Plasmid Mini Präparation


Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymogen Research D4036

Arbeitsanweisung

600 µl einer E.coli Kultur in 1,5 ml Gefäß

+100 µl 7x Lysis Puffer (blau)

o 4-6x invertieren 2‘ RT


+ 350 µl kalten Neutralisationspuffer (gelb) gut mischen

o 12.000 g 3‘

Überstand auf Zymo-Spin IIN Säule geben

o 12.000 g 15‘‘

o Durchfluss verwerfen

+ 200 µl Endo-Wasch Puffer auf Säule

o 12.000 g 30‘‘

+ 400 µl Zyppy Wasch Puffer auf Säule

o 12.000 g 1‘

Säule in sauberes, beschriftetes 1,5 ml Gefäß überführen

+ 30 µl Zyppy Elutionspuffer

o 1‘ RT

o 12.000 g 30‘‘

Plasmid Maxi Präparation


Endotoxin-free Plasmid Purification Kit JetStar 70-15014

Ethanol 100 %

LB-Medium

Isopropanol

Amp-Tabs Agilent 300021-61

Arbeitsanweisung

5 ml LB-Amp-Medium als Vorkultur mit E.coli animpfen.

o 37 °C Orbitalschüttler im Wasserbad ÜN

5 ml Übernachtkultur zu 100 ml LB-Amp-Medium geben.

o 37 °C Orbitalschüttler im Wasserbad ÜN


Säulen senkrecht über Behälter so platzieren, dass der Durchfluss aufgefangen werden

kann. Am besten eignen sich ein Eisbehälter und ein Falconständer.

+ 30 ml Equilibrierungspuffer pro Säule -> durch Schwerkraft durchlaufen lassen

Zellen in 50 ml Falcon sammeln -> 3‘ 12.000 g

Ggf. wiederholen

+ 10 ml Resuspensionspuffer mit RNase A -> resuspendieren bis homogen -> 5‘ RT

+ 10 ml Präzipitationspuffer -> sofort invertieren (nicht vortexen)

10‘ > 12.000 g RT -> + 1/10 des Volumen Endo-1 Puffer

Komplettes Volumen auf Säule laden -> durch Schwerkraft durchlaufen

lassen

+ 30 ml Endo-2 Puffer -> durch Schwerkraft durchlaufen

lassen

30 ml Waschpuffer E5 -> durch Schwerkraft durchlaufen

lassen

+ 15 ml Elutionspuffer -> 50 ml Falcon sammeln (Eluat

enthält DNA)

+ 10.5 ml Isopropanol -> gut mischen -> 30‘

>12.000 g 4 °C

Überstand verwerfen -> + 5 ml EtOH 70 % -> 5‘ > 12.000 g

Überstand verwerfen -> 10‘ lufttrocknen

Pellet in TE Puffer oder DEPC Wasser resuspendieren

Lagerung bei -20 °C

4.2.6 Enzymatische Restriktionsanalysen

In der Molekularbiologie werden oft Restriktionsenzyme vom Typ II verwendet, die eine

hexamere Palindromsequenz erkennen und spalten. Dabei entstehen definierte DNA-

Fragmente mit spezifischen Enden. Restriktionsspaltungen dienten hier entweder der

Überprüfung von Plasmidpräparationen oder wurden für Klonierungsreaktionen eingesetzt.

Die entsprechenden Enzyme wurden von der Firma New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)

bezogen, wobei die nötigen Reaktionspuffer mitgeliefert wurden. In welchem Puffer die


gewählten Enzyme am effektivsten schneiden können, kann über den NEB Double Digest

Finder ermittelt werden.


Restriktionsendonuklease NEB

10x NEB Puffer

DNA

DEPC Wasser

Arbeitsanweisung

1 Einheit des Restriktionsenzyms kann in der Regel 1 µg DNA in einem 50 µl

Reaktionsvolumen innerhalb 1 Stunde komplett verdauen. Enzyme sollten generell auf Eis

aufbewahrt werden und als letztes zum Ansatz pipettiert werden.

1 µg DNA in 1.5 ml Gefäß

+ 5 µl 10x NEB Puffer


+ 1µl Enzym

1h 37 °C

Ggf. auf einem Agarosegel überprüfen


4.2.7 Quick Change Mutagenese

Bei der Quick Change Mutagenese können ortsspezifisch Mutationen, wie

Basensubstitutionen, Deletionen oder Insertionen, über die verwendeten Primer in einen

Vektor eingeführt werden. Hierfür wird eine herkömmliche PCR mit der in diesem Kit

enthaltenen PfuTurbo Polymerase durchgeführt. Die verwendeten Primer wurden nach

folgenden Kriterien entworfen. Nach der PCR wird der parentale Mutterstrang durch die

Dpn I Endonuclease verdaut, welche spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA

schneidet (5´-Gm6ATC-3´) [244].

Primer Anforderung

Länge 25 – 45 bp

Schmelztemperatur ≥ 78 °C

Bindungsstelle Gleiche Stelle, unterschiedlicher Strang

Mutation In der Mitte des Primers

GC Gehalt ≥ 40 %

Wobei h



QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent 200518

LB-Amp-Agarplatten

Arbeitsanweisung

Die einzusetzende Konzentration Primer für 125 ng berechnet sich wie folgt:

Kontrollreaktion:

5 µl 10x Reaktionspuffer

2 µl (10 ng) pWhitescript Kontrollplasmid

125 ng Kontrollprimer #1 und #2

1 µl dNTP Mix

DEPC Wasser auf 50 µl

Proben-Reaktion:

Ansatz mehrerer Proben mit einer Plasmid DNA Verdünnungsreihe 5 – 50 ng

5 µl 10x Reaktionspuffer

X µl (5-50 ng) Plasmid

X µl 125 ng Kontrollprimer #1 und #2

1 µl dNTP Mix

DEPC Wasser auf 50 µl

Zu beiden Reaktionsansätzen am Schluss 1 µl PfuTurbo Polymerase (2.5 U/µl) hinzufügen.


Thermozykler-Programm:

Zyklus Temperatur Zeit

1 95 °C 30‘‘

12 - 18 95 °C 30‘‘

55 °C 1‘

68 °C 1‘/kb Plasmidlänge

Für Punktmutationen werden 12 Zyklen Amplifikation benötigt.

2‘ Eis

+ 1 µl Dpn I zu jeder Reaktion gut mischen -> 1 h 37 °C

Transformation von je 1 µl Mutagenese Ansatz zu 50 µl XL1-Blue superkompetenten Zellen

Normale E.coli Transformation

Kontroll Mutagenese auf LB-Amp Platten mit 80 µg/ml X-gal und 20 mM IPTG

Mutagenesen auf LB-Amp Platten

37 °C > 16 h

Nach erfolgreicher Transformation Anzucht einzelner Kolonien; Kolonie PCR und

anschließende Sangersequenzierung, um die korrekte Mutation zu bestätigen.

4.3 Stammlösungen

Gelatine (Porcine) Fisher G/0150/53

SOLL 1,1 % 550 mg in 50 ml 1x PBS autoklavieren

Aufbewahrung 4 °C

Arbeitsverdünnung 1:10 0,1 % 50 ml zu 500 ml 1x PBS geben

bFGF lifeTech PHG0026

SOLL 100 ng/µl 50 µg in 500 µl MilliQ lösen

12 Aliquots à 40 µl


Aufbewahrung -20 °C

Arbeitsverdünnung je nach Linie zwischen 10 – 100 ng/ml SCM

bFGF RnD 4114-TC-01M

SOLL 200 µg/ml 1 mg in 5 ml 1x PBS lösen

Aliquots à 100 µl


Arbeitsverdünnung je nach Linie zwischen 10 – 100 ng/ml SCM

Dispase II Roche 4942078001

SOLL 10 mg/ml 200 mg abwiegen in 20 ml DMEM/F12 lösen, 22 µm filtersterilisieren

20 Aliquots à 1 ml


Arbeitsverdünnung 1:10 1 mg/ml 200 µl zu 2 ml (1 6W)

ROCK Inhibitor Sigma-Aldrich Y0503-1MG

MW 320,26

SOLL 10 mM 1 mg in 312 µl MiliQ lösen

Alliquots à 20 µl


Arbeitsverdünnung 1:1000 10 µM

Mitomycin (MMC) Sigma-Aldrich M4287-5x2MG

SOLL 0,5 mg/ml Komplettes Fläschchen (2 mg) in 4 ml MiliQ lösen, evtl, bei 37°C

Wasserbad

erwärmen

Arbeitsverdünnung 1:50 10 µg/ml (5 ml DMEM +100 µl MMC)

Aufbewahrung lichtgeschützt 4 °C

Vitamin C Sigma-Aldrich A4544-25G (Transduktion)


SOLL 10 mg/ml 100 mg in 10 ml DMEM lösen zu je 50 und 500 µl Aliquots in Alufolie

RT

Arbeitsverdünnung 1:200 50 µg/ml

Aufbewahrung -20 °C und lichtgeschützt

Chloroquine Sigma-Aldrich C6628-25G (Transfektion)

MW 515,9 g/mol

SOLL 25 mM 50 mg in 4 ml 1xPBS oder Wasser

Arbeitsverdünnung 1:1000 25 µM pro 6Well (a 2,5 ml) 2,5 µl

Aufbewahrung 4 °C und lichtgeschützt

Na Butyrat Sigma-Aldrich B5887 (Transfektion)

MW 110 g/mol

SOLL 0,5 M 250 µg in 4,5 ml Sigma Wasser lösen

Arbeitsverdünnung 1:100 5 mM pro 10 cm Schale (a 7 ml) 70 µl

Aufbewahrung 4 °C

VPA Sigma-Aldrich P4543-10G (Transduktion)

SOLL 400 mM 50 mg/ml in DMEM lösen zu je 50 µl und 500 µl Aliquots in Alufonie

bei -20°C Arbeitsverdünnung 1:200 2 mM


Protamin Sigma-Aldrich P4020 (Transduktion)

SOLL 4 µg/ml 4 mg in 1 ml H2O lösen 1:1000 Verdünnung machen

Arbeitsverdünnung 1:1000 4 ng/ml

Aufbewahrung Aliquots bei 4 °C

Insulin SigmaAldrich 91077C (Dual SMAD)

SOLL 5 mg/ml 100 mg in 10 ml sterilem Wasser lösen + 1-2 Tropfen HCl bis sich alles gelöst

hat. Auf 20 ml auffüllen.

Arbeitsverdünnung 1:1000 5 µg/ml pro 50 ml N2-Medium 50 µl

Aufbewahrung Aliquots bei -20 °C


SB431542 Millipore 616464 (Dual SMAD)

5 mg in 119 µl DMSO gelöst

IST 100 Mm

Arbeitsverdünnung 1:10.000 10 µM pro 50 ml Medium 5 µl


Dorsomorphin RnD Systems (Tocris) 3093/10 (Dual SMAD)

MW 472,1 g/mol

SOLL 10 mM 10 mg in 2,117 ml sterilem Wasser lösen 4 Aliquots à 500 µl

Verdünnung 1 mM 80 µl Stammlösung + 720 µl MiliQ 16 Aliquots à 50 µl

Arbeitsverdünnung 1:1000 1 µM pro 50 ml Medium 50 µl


Laminin Sigma 1ml L2020 (Kortexneuronen)

SOLL 1 mg/ml Gefäß langsam bei 4 °C auftauen lassen;

in 8 Aliquots à 125 µl in vorgekühlte 1,5 ml Gefäß füllen

Arbeitsverdünnung 1:50 20 µg/ml (6 ml 1x PBS zu jedem Aliquot)

Aufbewahrung Aliquots -20 °C / Arbeitsverdünnung 4 °C

Digitonin Sigma D141-100MG (Kortexneuronen)

SOLL 1 mg/ml 100 mg in 2 ml Sigma-Wasser lösen (auf 95 °C im Schüttler aufheizen

und anschließend auf RT abkühlen lassen)

auf 20 ml à 1 ml Aliquots einfrieren

Arbeitsverdünnung 1:5

Aufbewahrung Aliquots -20 °C / Arbeitsverdünnung 4 °C

Torin-1 RnD 4247-10mg (Array-CGH)

SOLL 1 mM 10 mg (alles) in 16,45 ml DMSO lösen (1 h 37 °C)

2 Aliquots à 8 ml

SOLL 100 µM 200 µl 1 mM Stammlösung in 1800 µl DMSO verdünnen

2 Aliquots à 1 ml


Arbeitsverdünnung 1:1000 100 nM


4.4 Säuger-Zellkultur Einführung

Die Kultur von Säugerzellen unter definierten Wachstumsbedingungen bietet die

Möglichkeit, Zellen in vitro, also außerhalb ihres Ursprungsorganismus, zu expandieren, zu

beobachten und zu analysieren. Die Zellen werden dabei unter spezifischen Temperatur und

Gasbedingungen (37 °C, 5 % CO2) in Plastikgefäßen unter der Zuführung spezifischer

Nährmedien in Inkubatoren angezogen. Bei der Bearbeitung dieser Zellen wurde ein

erhöhtes Augenmerk auf die Vermeidung von Kontaminationen gelegt. Um dies zu

gewährleisten, wurde immer äußerst genau auf die Einhaltung der guten Laborpraxis

Reinheitsgebote geachtet.

Alle Arbeiten mit lebenden Zellen sollten unter einer Sterilwerkbank ausgeführt

werden.

Die Sterilwerkbänke und Filter sollten regelmäßig gewartet werden.

Die Sterilwerkbänke sollten vor und nach einer jeden Benutzung mit 70 % Ethanol

desinfiziert werden.

Es sollten nur so viele Gegenstände wie notwendig unter einer Bank stehen.

Alle Gegenstände, die unter die Bank gebracht werden, sollten steril sein (Hände,

Pipetten, Tips, Medien, usw.).

Pipettierarbeiten sollten mit sterilen Einwegtips und einzeln verpackten, sterilen

sero-logischen Pipetten ausgeführt werden.

Der Experimentator sollte Handschuhe tragen, diese regelmäßig wechseln und vor

dem Kontakt mit den Zellen mit 70 % Ethanol desinfizieren.

Der Experimentator sollte einen Kittel, der nur für die Zellkultur benutzt wird, tragen.

Die Abfälle sollten in den dafür vorgesehenen Behältern gesammelt und vor der

Entsorgung steril autoklaviert werden.

Die Inkubatoren sollten regelmäßig sterilisiert werden (Heißluft oder chemisch).

Das Wasser in den Wasserbädern sollte regelmäßig gewechselt und vorsorglich mit

Kupfersulfat versetzt werden (Lösung).


Sollte es dennoch zu einer Kontamination kommen (Bakterien, Hefen, Pilze, andere

Zelllinien), sollten diese Kulturen sofort entsorgt werden.

4.4.1 Zellmaterial und Medien

Für die Verwendung des Patientenmaterials liegt eine Einverständniserklärung vor.

Material

Tabelle 4.4 Verwendete Zelllinien und Patientenmaterial

Genotyp Zellart Medien Herkunft Sex Anwendung

HeLa Aneuploid

n = 70 - 164

Immortalisiert

e

Zervixkarzino

m-Zellen

Basal

Medium

Human ♀ Transformation

en

HEK Hypotriploid

n = 64

embryonale

Nierenzellen

Basal

Medium

Human ♀? Transformation

en

HT1080 Pseudodiploi

d

n = 44 - 48

Fibroblasten

Fibrosarcom

Basal

Medium

Human ♂ Virustiter-

bestimmung

LMTK- Hyperdiploid

n = 42 - 48

Fibroblasten Basal

Medium

Maus ♂ Überexpression

ΔBUDR, ΔTK,

HAT sensitiv

CF1 Fibroblasten Basal

Medium

Maus „Feeder“ Zellen

AS Wt

n = 42

Primär

Fibroblasten

gesundes

Geschwister

Basal

Medium

Human ♀ Funktionelle

Analysen

/Re-

programmierun

g

ΔSt3Gal

3-HF

St3Gal3

A320D

n = 42

Primär

Fibroblasten

Patientin

Basal

Medium


Analysen

ASC23 ihOKSMco- Induziert SCM/ Human ♀ Funktionelle


idTom

n = 42

pluripotente

Stammzellen

mTeSR/

kond.SCM

Analysen

/Differenzierung

ΔSt3Gal

3

ihOKSMco-

idTom

ΔST3GAL3

n = 42

Induziert

pluripotente

Stammzellen

SCM/

mTeSR/

kond.SCM


Analysen

/Differenzierung

HD2 ihOKSMco-

idTom

n = 42

Induziert

pluripotente

Stammzellen

SCM/

mTeSR/

kond.SCM

Human ♂ Funktionelle

Analysen

/Differenzierung

Tabelle 4.5: Normales Gehirn Probenmaterial

Probe Lot. No. Kat. No. Geschlecht Alter

[Jahre]

Pool

von

Human Adult Normal Tissue

Total RNA- Brain: Cerebellum A508112 R1234039-50-BC ♂ 26 1


Total RNA- Brain-

Diencephalon

A902009 R1234049-10-BC ♂ 26 1


Total RNA- Brain-

Hippocampus

B308094 R1234052-10-BC ♂ 27 1


Total RNA- Brain- Corpus

Callosum

A601516 R1234045-10-BC ♂ 26 1


Total RNA- Brain- Cerebral

Kortex

B403060 R1234042-10-BC ♂ 24 1


Total RNA- Brain- Frontal Lobe A505174 R1234051-50-BC ♂ 27 1


Total RNA- Brain- Medulla

oblongata

A906047 R1234057-50-BC ♀ 60 1

Human Adult Normal Tissue A505663 R1234062-50-BC ♂ 27 1


Total RNA- Brain- Occipital

Lobe


Total RNA- Brain- Parietal

Lobe

A611008 R1234066-50-BC ♂ 26 1


Total RNA- Brain- Temporal

Lobe

A811245 R1234078-50-BC ♂ 22 1


Total RNA- Brain- Thalamus A404119 R1234079-50-BC ♂ 23 1


Total RNA- Brain- Occipital

Lobe

A505663 R1234062-50-BC ♂ 27 1


Medien

Grundsätzlich zu beachten: Stammzellmedien nie aus der 500 ml Flasche verwenden. Immer

in sterilen 250 ml Glasflaschen oder 50 ml Flacons als Aliquots ansetzen und bei 4 /-20 °C

lagern. Vor Verwendung nur benötigte Menge im Wasserbad (37 °C) erwärmen.

Feeder-Medium (teilungsinaktiviert)

MEF

DMEM Gibco 10313-039 4 °C

10 % FCS Life Technologies 10270-098

1 % P/S Gibco 15140-122

Bsp: 500 ml DMEM F12

50 ml FCS

5 ml P/S

Normales iPS Medium (SCM Kultivierung auf

Feederzellen)

In 250 ml sterilen Glasflaschen ansetzen.

Rest 192 ml DMEM/F12 Gibco 31331-028

20 % 50 ml KO Serum Replacement Gibco 10828010

1 % 2,5 ml Glutamax Gibco 35050038

1 % 2,5 ml MEM-NEAA Gibco 11140-050

1 % 2,5 ml P/S Gibco 15140-122

5 nM 500 µl β-Mercaptoethanol Gibco 31350-010

xxx xx µl bFGF (Konz. zw. 10 – 100 ng/ml) RnD 4114-TC-

01M

TIPP

!!! Maximal 7 Tage verwenden!!!

Wirklich wichtig! Zellen sehen mit älterem Medium deutlich schlechter aus und

differenzieren viel häufiger!


Konditioniertes iPS Medium (MEF-cm Zellkultur auf Matrigel ohne Feeder)

Benötigte Medien

Normales iPS Medium SCM

60.000 Zellen/cm² teilungsinaktivierte MEFs in mittelgroßen bis großen

gelatinebeschichtete Zellkulturflaschen aussäen

o In Feeder Medium 1 d bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren

Feeder Medium absaugen, 1x mit 1xPBS waschen

+ 0,5 ml/cm2 MEF-cm (vorher) auf die Zellen geben

o 22 – 26 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren

Medium abnehmen steril filtrieren und aliquotieren

o Bei -20 °C einfrieren, besser sofort verwenden

Konditionierung ist an 7 aufeinanderfolgenden Tagen wiederholbar

TIPP: Medium nicht bei 4 °C lagern, nach Benutzung maximal 1x wieder einfrieren.

Vor Benutzung benötigte Menge bFGF zugeben.

Neural maintenance medium (NMM)

1:1 Mix aus N2 und B27 Medium

N2: DMEM/F12 Gibco 31331-028

1x N-2 Gibco 17502-048

5 µg/ml Insulin Sigma Aldrich 91077C

1 mM Glutamin Gibco 35050038

100 µM NEAA Gibco 11140-050

100 µM β-ME Gibco 31350-010

1x P/S Gibco 15140-122

B27: Neurobasal Gibco 21103-049


1x B-27 mit Vit.A Gibco 17504-044

200 mM Glutamax Gibco 35050038

1x P/S Gibco 15140-122

Für die direkt Mischung von 100 ml NMM:

1 ml B27

500 µl N2

100 µl Insulin

1 ml Glutamin

1 ml P/S

500 µl NEAA

48,5 ml Neurobasal

47,5 ml DMEM/F12

Neural induction medium (NIM)

Neural maintenance medium +

500 ng/ml Noggin RnD 719-NG

10 µM SB431542 Millipore 616464-5MG

oder

1 µM Dorsomorphin RnD 3093

10 µM SB431542 Millipore 616464-5MG

Kryo-Medium

40 % frisches SCM

30 % konditioniertes SCM

30 % DMSO Gibco 10828010 -20 °C

→ alles zusammengeben und steril filtrieren

1x PBS für 1 L


800 ml MilliQ

8 g NaCl 137 mM

0,2 g KCl 2.7 mM

1,44 g Na2HPO4 8 mM

0,2 g KH2PO4 1.46 mM

pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 7,4 einstellen auf 1 L auffüllen,

Heißautoklavieren (20 min, 121 °C)

Bei RT lagern

Basal-Medium

DMEM Gibco 10313-039 4 °C

20 % FCS

1 % P/S; GlutaMax; NEAA

Dieses Medium wurde für teilungsaktive MEF, primär Fibroblasten, HeLa, HEK, HT1080 und

LMTK- Zellen verwendet.

4.4.2 Oberflächenbeschichtung

Für die Kultur etlicher Zellen war es notwendig die zu verwendenden Plastikgefäße

zusätzlich mit unterschiedlichen Bestandteilen der Extrazellulären Matrix, wie z.B. Laminin

oder einer Mischung aller Bestandteile wie z.B Gelatine oder Matrigel zu beschichten.

Gelatinebeschichtung (iPS Zellkultur auf Feeder)


0,1 % Gelatine in 1x DPBS

Pro 25 cm2 Flasche 3 ml

6Well 2 ml

Arbeitsanweisung


Für 15-30 Minuten bei RT inkubieren.

Gelatine absaugen und entweder direkt verwenden, oder für 1 h bei RT eintrocknen lassen

und anschließend direkt verwenden.


Matrigel Beschichtung (iPS Zellkultur ohne Feeder)


Matrigel BD 356234 400 µl Aliquots -20 °C

DMEM/F12 Biochrom 500 ml Flasche 4 °C

Gemisch 24 ml 4 °C

Arbeitsanweisung

Matrigel über Nacht auf Eis im Kühlschrank auftauen. Kurz schwenken, um sicher zu stellen,

dass es vollständig aufgetaut ist. Mit vorgekühlten Einmalpipetten unter der Sterilwerkbank

zu je 400 µl in 1,5 ml Gefäß aliquotieren. Alle Arbeiten auf Eis durchführen.

Bei -20 °C lagern.

Matrigel wird 1:60 mit DMEM/F12 verdünnt und kann dann bis zu 3x verwendet werden.

Hierzu 24 ml DMEM/F12 abnehmen und 5 ml zu dem gefrorenen, aliquotierten Matrigel

geben. Unter ständigem auf- und abpipettieren auftauen und anschließend mit den

verbliebenen 19 ml DMEM mischen.

Pro 25 cm2 Flasche 2 ml

6Well 1 ml Matrigel mit Einmalpipette aufgeben und gut verteilen

1 h bei 37 °C inkubieren.

Matrigel mit Einmalpipette herausnehmen (nicht absaugen) und in Falcon zum wieder

verwenden sammeln. Immer Anzahl der Nutzungsrunden auf dem Deckel dokumentieren.

Bei 4 °C lagern. (2x mit 1x PBS waschen)

Beschichtete Kulturgefäße nicht trocken lagern, maximal mit 1x PBS überschichtet bis zu 1h

im Kühlschrank lagerbar. Vor Verwendung Mediumanteil vorlegen und bei RT bis zur

Nutzung unter der Werkbank lagern.


Poly-L-Ornithine/Laminin Beschichtung (neuronal differenzierte Zellen)


Laminin Sigma Aldrich L2020

Poly-L-Ornithine Sigma Aldrich P4957

Arbeitsanweisung

1ml pro 6Well Poly-L-Ornithin

4 h 37 °C

Überstand abnehmen und verwerfen

Aliquotiertes Laminin in 6 ml kaltem 1x PBS lösen

1ml pro 6Well

4 h 37 °C oder ÜN

Überstand abnehmen und verwerfen

4.4.3 Teilungsinaktivierung

Sowohl humane Stammzellen als auch iPS werden auf sogenannten Feederzellen kultiviert.

Für diese Arbeiten wurden murine embryonale Fibroblasten in Kokultur gehalten, um das

Medium für die Stammzellen zu konditionieren. Um zu verhindern, dass die Stammzellen

von den „Feederzellen“ überwachsen wurden, wurden diese durch eine

Mitomycinbehandlung teilungsinaktiviert.


Mitomycin (MMC) Sigma-Aldrich M4287-5x2MG

Teilungsaktive MEF

Basal Medium

0,25 % Trypsin/EDTA Life Technologies 25200-056

1x DPBS Life Technologies 14190-094


Arbeitsanweisung

Fibroblasten in Feeder Medium auf möglichst große Zellzahl anziehen

+ 10 µg je ml MMC → 2,5 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren

Medium absaugen

1x mit 1x DPBS waschen

+ adäquate Menge 0,25 % Trypsin/EDTA hinzufügen

5 – 10 min bei 37 °C inkubieren

Verdau mit 2 – 3 x Menge Medium stoppen

Bei 500 g für 5 min abzentrifugieren

Zellen zählen

Ca. 30.000 Zellen pro 1 cm2 → Für 1x 6Well Pl. 1,73 x 106

Zellen/ml

Für 2x 6Well Pl. 3,5 x 106 Zellen/ml

Kryo Stocks für 1x 6Well Pl und für 2x 6Well Pl anlegen (genaueres siehe Anleitung)

TIPP

Zellsupension auf die Konzentration von 2x 6Well Pl. 2,3 x 106 Zellen/ml verdünnen und für

1x 6Well Pl. 500 µl Kryomedium in Gefäß vorlegen (1:1 verdünnen).

4.4.3 Erhaltungskultur

Grundsätzlich zu beachten: ALLE Pipettierarbeiten werden mit serologischen

Einmalpipetten unternommen. Falls man nicht sicher ist, ob die Sterilität noch gewährleistet

ist, lieber einmal mehr wegschmeißen. Benutzte Pipetten werden in einer Plastiktüte neben

dem Autoklaviermüll gesammelt und bei der Verwendung eines neuen Sackes unten hinein

gelegt. Medien maximal 1 Woche verwenden, vorher auf Trübung untersuchen, immer für

jede Zelllinie einzeln aliquotieren und Zelllinien nacheinander bearbeiten. NIEMALS mit

benutzter Pipette in sterile Gefäße gehen.

Kulturgefäße

6Well Platten 9,6 cm2 Cellstar 657-160 2 – 4 ml maximal

Kleine Flaschen 25 cm2 Greiner 690160 3 – 5 ml maximal



Erhaltungskultur iPS:


Basalmedium

SCM

5-50 ng bFGF

0,1 % Gelatine in 1x PBS

Matrigel BD 356234 400 µl Aliquots -20

°C


6Well-Platte

Arbeitsanweisung

Feederzellen aussäen -1 d

Kulturgefäße mit 0,1 % Gelatine beschichten → 15 min RT inkubieren

Benötigte Menge DMEM Medium aliquotieren und im Wasserbad erwärmen

Feeder sind in Kryobehälter: schwarzer Deckel, Hänger: Aufschrift Feeder

Kryogefäß im Wasserbad (37 °C) auftauen. Nur bis sie eben aufgetaut sind, NICHT

länger

10 – 12 ml DMEM/F12-Medium in 15 ml Falcon abnehmen, Zellen in 1 ml Medium

resuspendieren und in Falcon übertragen. Mehrmals auf- und abpipettieren um

DMSO zu depletieren.

Bei 500 g und für 5 min pelletieren

Währenddessen Gelatine absaugen und

pro 6Well 1 ml oder

pro 25 cm2 Flasche 2 ml MEF Medium vorlegen.

Medium von pelettierten Zellen vorsichtig absaugen und Pellet in 0,5 ml MEF

Medium pro 6Well oder 1 ml pro 25 cm2 Flasche resuspendieren.

0,5 ml Zellsuspension pro 6Well, bzw. 1 ml pro 25 cm2 Flasche aussäen

Kreuzweise verteilen


Für 1 d (min 8 h) bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren

TIPP: Feeder sollten für die iPS Kultur bei einer Zellzahl von min. 15.000 Zellen/cm2

ausgesät werden. Verwendungshinweis auf dem Kryogefäß beachten.

Stammzellen aussäen 0 d

Kulturgefäße mit Matrigel beschichten oder vorbereitete Feederzellen verwenden

Benötigte Menge SCM (MG → MEF-cm oder mTeSR) aliquotieren

Kryogefäß im Wasserbad (37 °C) auftauen. Nur bis sie eben aufgetaut sind, NICHT

länger.

10 – 12 ml DMEM/F12 Medium in 15 ml Falcon abnehmen, Zellen in 1 ml Medium

resuspendieren und in Falcon übertragen. Mehrmals auf- und abpipettieren um

DMSO zu depletieren.

Bei 250 g und SOFT Einstellung für 5 min pelletieren

Währenddessen Matrigel bzw. Feeder Medium absaugen

2x mit 1x PBS waschen und

pro 6Well 1 ml oder

pro 25 cm2 Flasche 2 ml SCM vorlegen.

Medium von pelettierten Zellen vorsichtig absaugen und Pellet in 0,5 ml SCM pro

6Well oder 1 ml pro 25 cm2 Flasche resuspendieren.

Zellen dabei möglichst wenig vereinzeln

0,5 ml Zellsuspension pro 6Well, bzw. 1 ml pro 25 cm2 Flasche aussäen

+ ROCK Inhibitor in der Verdünnung 1:1000 (3 µl pro Well) direkt zum Well

dazugeben

Kreuzweise verteilen

bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren

Mediumwechsel

Für die Erhaltungskultur von einer jeden Zelllinie ist es wichtig, dass die Zellen von einem für

sie spezifischen Medium mit genügend Nährstoffen und optimalem pH Wert umgeben sind.

Deshalb sollte es je nach Stoffwechselaktivität regelmäßig ausgetauscht werden.


Die meisten Medien enthalten den Farbstoff Phenol Rot. Dieser verfärbt sich bei sinkendem

pH-Wert von Pink über Rot zu Gelb. Er zeigt somit an, wie aktiv die Zellen die enthaltene

Glucose zu Calciumdioxid verstoffwechseln. Die meisten Zelllinien vertragen Medienwechsel

jeden zweiten Tag, bei einer Passage am Freitag.

Arbeitsanweisung

Vakuumpumpe + VacuumHand verwenden. Füllstand der Abfallflasche kontrollieren, evtl.

neue mit Desinfektionsmittel in angestrebter Verdünnung (aufs Endvolumen bezogen)

vorbereiten und austauschen. Autoklavierte Pasteurpipetten auf VacuumHand aufstecken

und für jeden neuen Arbeitsschritt wechseln. Gebrauchte Pipetten in Metallbehälter

außerhalb der Werkbank sammeln autoklavieren und abschließend im Glasmüll entsorgen.

VacuumHand am Ende einer jeden Benutzung mit 70 % EtOH und mit A.dest nacheinander

spülen.

Medienwechsel wurden bei WT und Mutanten iPS jeden Tag vorgenommen. Erscheint die

Kultur sehr robust, kann man versuchen, auf weniger Medienwechsel pro Woche zu

reduzieren.

z.B.: Bei Mo – Mi – Fr (Split) muss das Medium am Wochenende nicht

gewechselt werden.

Direkt nach der Passage können viele Linien zwei Tage ohne Medium auskommen,

da die Kolonien noch sehr klein sind.

ÜS absaugen

+ 1,5(2)/3 ml frisches Medium

Um einen vorzeitigen Abbau des bFGFs zu verhindern, immer nur benötigte Menge Medium

im Wasserbad erwärmen und Mediumvorrat bei +4 °C lagern oder bFGF immer direkt

vorher dazu geben.

Medienwechsel bei allen anderen Zelllinien müssen immer an die jeweiligen Teilungsraten

und Stoffwechselaktivitäten angeglichen werden. Im Allgemeinen können diese Zelllinien

aber auch in den oben genannte Rhythmus, Mo – Mi – Fr (Split), gebracht werden.

TIPP: Um Medium zu sparen, kann bei täglichem Mediumwechsel ein Volumen von 1,5

ml/6Well verwendet werden, bei Medienwechsel jeden zweiten Tag 2 ml

verwenden.


4.4.4 Passagieren

Neben der regelmäßigen Versorgung mit Nährstoffen ist es ebenfalls wichtig, die Zellen in

einem teilungsaktiven Zustand zu halten. Um dies zu gewährleisten, sollte den Zellen immer

genügend Raum für die Expansion gegeben werden. Hierfür wurden die Zellen geerntet und

in einer der Zelllinien angepassten Teilungsrate verdünnt und neu ausgesät.

4.4.4.1 EDTA/Trypsin Split

Die meisten Zelllinien können mit einer einfachen enzymatischen Methode passagiert

werden. Hierzu zählen HeLa, HEK, MEF, HT1080, LMTK- sowie primär Fibroblasten. Sie

beruht auf einem partiellen Verdau der Oberflächenproteine durch Trypsin und dem

zusätzlichen Entzug von Calcium- und Magnesiumionen durch das chelatierende Molekül

EDTA.


Basal Medium

0,25 % Trypsin/EDTA Life Technologies 25200-056


Arbeitsanweisung

Medium absaugen

1x mit 1x DPBS waschen

o Überstand verwerfen

+ adäquate Menge Trypsin/EDTA hinzufügen (6Well = 1 ml)

5 – 10 Min bei 37 °C inkubieren

o Sichtkontrolle unter dem Mikroskop, ob alle Zellen gelöst

o Ggf Zellgefäß einen kräftigen „Klapps“ geben

Verdau mit 2 – 3x Menge Medium stoppen

Zellsuspension in Falcon sammeln

Bei 500 g für 5 min abzentrifugieren

Überstand verwerfen

Zellen in adäquatem Volumen Basal Medium resuspendieren


In geeignetem Splitverhältnis in neue Kulturgefäße aussäen

4.4.4.2 Dispase II Split

iPS auf Feeder und auf Matrigel


DMEM/F12 Gibco 31331-028

Dispase Roche 4942078001

SCM

Arbeitsanweisung

Enzymatische und mechanische Passage

+ 200 µl Dispase Stammlösung direkt zum Medium (Verdünnung 1:1000)

5 min bei 37 °C inkubieren, nicht anstoßen

ÜS absaugen

15 – 45 min ohne ÜS bei 37 °C inkubieren

Unter Lichtmikroskop beobachten

Ränder der Kolonien sollten sich leicht aufwellen

Ansonsten: Inkubationszeit auf maximal 45 min verlängern

Kolonien mit 2 ml DMEM/F12 w/o KOSR abspülen

Alt. bei zu hoher Adhäsion mit steriler 1000 µl Spitze mit Druck die gesamte

Oberfläche einmal abspülen oder mit 10 ml Pipette abkratzen

Zellen in Falcon mit 10 ml DMEM/F12 sammeln

Zellen durch Gravitation oder für 3 min bei 250 g sedimentieren lassen

ÜS absaugen

Waschvorgang 1x wiederholen (Zellen reagieren empfindlich auf Dispase Reste)

+1 ml Medium; Kolonien durch auf- und abpipettieren zerkleinern, dabei bei Bedarf

von 5 ml über 1000 µl zu 200 µl kleiner werden. Kolonien sollten frei schwimmen,

nur langsam absinken (Schneekugel). Zell-Mediumsuspension in angemessener

Verdünnung auf vorbereitete Feederzellen verteilen

ggf. ROCK Inhibitor in der Verdünnung 1:1000 (3 µl pro Well) direkt zum Well

dazugeben


Kreuzweise verteilen → bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren

TIPP

Stammzellen NIE vereinzeln!! Vorsichtig pipettieren, Blasen vermeiden! Sind

Differenzierungs-anzeichen bzw. „Autofeeder“ zu sehen, Zellen länger mit Enzym inkubieren

und so depletieren. Zeitpunkt genau abpassen, um Stammzellkolonien nicht zu vereinzeln.

Differenzierte Zellen manuell vor der Passage lösen und entfernen. Splitraten können von

1:1 bis 1:20 variieren.

4.4.4.3 Manuelle Passage

iPS auf Feederzellen und auf Matrigel

Manuelle Passage

Kolonie unter dem Mikroskop beobachten

Mit steriler rundgezogener Pasteurpipette oder mit 200 µl Spitze kreuzweise in

kleinere Rechtecke schneiden (Schachbrettmuster)

Mit steriler 200 µl Pipettenspitze vorsichtig abschaben und einsaugen.

Vorsichtig zerkleinern und direkt auf vorbereitete Wells aussäen

In etwa können 2 – 3 große Kolonien pro 6Well reichen

4.4.4.4 Accutase Passage

Die enzymatische Passage mit dem Accutase Mix ist für neuronal differenzierte Zellen ab

Tag 25 des Differenzierungsprotokolls vorgesehen.



StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A11105-01


NMM

Arbeitsanweisung

ÜS abnehmen

1x mit 1x DPBS spülen

+ 500 µl Accutase

3‘ , 37 °C

+2 ml DMEM w/o mit 1000 µl Pipette alles gut abspülen und in 15 ml Falcon

sammeln; 1 – 2 x wdh.

3‘ 350 G

ÜS abnehmen

+2 ml NMM resuspendieren

1:10 Verdünnung mit „Neubauer Improved“ auszählen

Zellen 50.000 Zellen/cm2 auf Laminin/Ornithin beschichtete Wells aussäen

+1 d Mediumwechsel; nachfolgend jeden 2. Tag Medium wechseln

4.4.5 Kryokonservierung


Kryomedium 30 % DMSO

Kryogefäß mit Innengewinde

DMEM/F12 Gibco 31331-028

Arbeitsanweisung

ÜS absaugen

1x mit 1x PBS waschen


+ 200 µl Dispase II

5 min bei 37 °C inkubieren nicht anstoßen

ÜS absaugen

15 - 45 min ohne ÜS bei 37°C inkubieren

Unter Lichtmikroskop beobachten

Ränder der Kolonien sollten sich leicht aufwellen

Ansonsten: Inkubationszeit auf maximal 45 min verlängern

Kolonien mit 2 ml DMEM/F12 abspülen

Zellen in Falcon mit 10 ml DMEM/F12 sammeln

Zellen durch Gravitation oder für 3 min bei 250 g sedimentieren lassen

ÜS absaugen

Waschvorgang 1x wiederholen (Zellen reagieren empfindlich auf Dispase Reste)

Kulturen sollten „flockig“ im Medium schwimmen

NICHT zerkleinern!

+ [Anzahl Kryos] x 1ml SCM

+ [Anzahl Kryos] x 0,5 ml SCM w 30 % DMSO tropfenweise zugeben (!!)

10 % DMSO Endkonzentration

ZÜGIG 1,5 ml Zellsuspension pro Kryogefäß austeilen und in Kryocell bei -80 °C

wegfrieren

+ 1 d Kryogefäß in Flüssig-N2 übertragen

Dauerhaft lagerbar

Gefäße IMMER nach folgendem Muster korrekt beschriften:

Zelllinie – ggf. Mutation – Passage – Datum – Verwendungszweck – Initialen

iPS – ΔG6PC3 – #15 – 040512 – 1x6Well – Falk

TIPP: DMSO ist ein starkes Zellgift, nach Zufügen zügig arbeiten!

4.4.6 Transfektion

Für die gezielte Expression von Genen innerhalb eines eukaryotischen Systems wird die

genetische Information meistens in Form von Vektoren transient oder persistent in die


Wirtszelle eingeschleust. Die Aufnahme von Fremd-DNA in die Zellen kommt normalerweise

nur bei infektiösen Angriffen von Bakterien oder Viren vor. Mit Hilfe der entwickelten

Transfektionsmethoden wurde es aber dennoch möglich, die Membran der Zellen für die

DNA durchlässig zu machen.

4.4.6.1 Calcium-Chlorid-Präzipitation

Bei der Calcium-Phosphat-Präzipitation wird einer Calcium-Chlorid Lösung die zu

transfizierende DNA hinzugefügt. Mischt man diese Lösung anschließend mit einem HBS

Puffer, fallen feine Calcium-Phosphat Kristalle, an deren Oberfläche die DNA gebunden ist,

aus. Über einen noch nicht vollständig verstandenen Vorgang werden diese Kristalle dann

von den Zellen aufgenommen [245].


Calcium-Phosphat Transfektions Kit Clontech #631312

Medium DMEM w Glu

10 % FCS

1 % Natriumpyruvat Sigma-Aldrich B5887

1 % P/S

10 mM HEPES

25 mM Chloroquine Sigma-Aldrich C6628-25G

HEK Zellen

10 cm Schalen Cellbind Corning 3296

Arbeitsanweisung

Tag 1

5x106 Zellen pro 10 cm Schale in Basalmedium (zwei Schalen pro UC Ladung)

Tag 2

Plasmide und Komponenten auftauen, TF Medium aufwärmen

Plasmide mit Wasser auf 450 µl verdünnen

+ 50 µl CaCl2-Lsg in 1,5 ml Gefäß

+ 500 µl 2x HBS in 15 ml Falcon


DNA/CaCl2 durch “air-bubbling” mit den 500 µl 2x HBS mischen oder vortexen

o 20‘ RT

Altes Medium von HEK 293 Zellen absaugen

+ 10 ml TF Medium incl. 25 µM Chloroquine

+ DNA Calciumphosphate Mix

o 6 – 12’, 37 °C, 5 % CO2

Medium wechseln (7 ml TF Medium)

4.4.6.2 Lipofektion

Bei der Lipofektion werden kationische Lipide, wie z.B. Lipofectamine, für die Transfektion

genutzt. Sie bilden in wässriger Lösung Liposome, die mit der zu transfizierenden DNA

Komplexe bilden. Diese Komplexe werden dann über Endocytose in die Zellen

aufgenommen. Da die kationischen Lipide toxisch für die Zellen sind, muss das optimale

Verhältnis aus DNA, kationischen Lipiden und der Transfektionsdauer für jede Zelllinie neu

bestimmt werden [246].


Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent Life Technologies 11668027

OptiMEM Life Technologies 31985-070

Basalmedium

Plasmide

Arbeitsanweisung (Transfektion von LMTK- Zellen)

am Vortag im 6Well LMTK- à 3,0 – 3,5x 105 Zellen/Well auf Deckgläschen aussäen

Transfektion (70 – 80% Konfluenz; alle Angaben für ein Well einer 6Well Platte)

DNA-Menge austitrieren, um Überexpression zu vermeiden:

a) 500 ng pInteresse + 500 ng pcDNA3-Leervektor

b) 100 ng pInteresse + 900 ng pcDNA3-Leervektor

• 100 µl OptiMEM + 1 µg DNA mischen


• 100 µl OptiMEM + 6 µl Lipofectamine mischen

• beide Verdünnungen vereinigen, mischen und 15 - 45 min bei RT inkubieren

• nach der Inkubationszeit auf 1 ml mit OptiMEM auffüllen und mischen

• in der Zwischenzeit Zellen 2x mit 1-2 ml PBS waschen, 1x mit 1 ml OptiMEM

(Zellen können mit OptiMEM im Brutschrank stehen, bis das Transfektionsgemisch fertig ist)

Zellen trocken saugen und Transfektionsgemisch mit der Pipette gleichmäßig

auftropfen (nie mit Glaspipetten!!)

Zellen für 7 h bei 37 °C inkubieren

Transfektion abstoppen durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium mit 15 % FCS

Am nächsten Tag Medium absaugen und durch normales Kulturmedium ersetzen

Proteinnachweis möglich ab 24 h nach Transfektionsbeginn (z.B. IF-Färbung)

Lipofectamin nicht mit Glaspipetten pipettieren

4.5 Reprogrammierung humaner primärer Fibroblasten

Für die Erforschung von entwicklungsneurologischen Erkrankungen gibt es bisher wenige

Modelle, die eine realitätsnahe Untersuchung ermöglichen. Um diese Engpässe etwas zu

erweitern, kann man durch die exogene Expression von einem Set an Transkriptionsfaktoren

Patientenzellen zu induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) reprogrammieren [63] [61].

Erfolgreich reprogrammierte iPS können dann in späteren Experimenten sowohl zu

neuronalen Stammzellen als auch adulten Neuronen differenziert werden und so als

patienten-spezifisches in vitro Model genutzt werden, welches auch die Untersuchung von

Entwicklungsstörungen zulässt.

Durch die persistente Integration von vier humanen Transkriptionsfaktoren in das Genom

und deren exogenen Expression wurden diese Zellen in einen stammzellähnlichen Zustand

zurückversetzt. Dieser Vorgang wird im folgenden Reprogrammierung genannt. In dieser

Arbeit wurden hierfür die vier Yamanaka Faktoren, OCT4, KLF4, SOX2 und c-MYC, unter

Kontrolle des spleen focus-forming Virus Promoters, über einen integrativen,

multicistronischen, lentiviralen Vektor der dritten Generation genutzt [71]. Vektoren dieser

Art fehlen alle viralen proteincodierenden Gene. Die Transkriptionskasette einfassenden

long terminal repeats (LTRs) sind stark verändert und ermöglichen so nur noch die Insertion


in das Wirtsgenom, aber keine erneute Exzision. Die 3‘LTR ist in diesem System stark

deletiert und die 5‘LTR ist darüber hinaus an einen RSV Promoter fusioniert [247]. Für die

Produktion der Viruspartikel wurden HEK 293 Zellen mit drei Hilfsvektoren ko-transfiziert.

Auf dem Vektor pcDNA3.gp4xCTE sind die Informationen für die RNA abhängige DNA

Polymerase (pol) und der Strukturproteine (gag) codiert. Auf dem Vektor pRSV-Rev ein

lentiviraler Transkriptionsfaktor (Rev) und auf dem Vektor pMD2.G das Verpackungsprotein

des Vesikular stomatitis Virus (Abb. 25).

Abbildung 4.10: Evolution der lentiviralen Vektorsysteme. Oben der lentivirale Ursprungsvektor, darunter der lentivirale Transfervektor der 3. Generation und die dazugehörigen Verpackungsvektoren. LTR: long terminal repeats, GAG: Strukturprotein, POL: Polymerase, REV: Transkriptionsfaktor, SFFV: Promotor des Spleen focus forming Virus, IRES: Interne ribosomale Eintrittsstelle, CMV: Promotor des Cytomegalie Virus, VSV-G: Strukturprotein des Vesikular stomatitis Virus.

Während der Transkription werden die vier Transkriptionsfaktoren als eine prä-mRNA

gebildet, die sich anschließend über selbstschneidende Endohydrolase Schnittstelle

voneinander separieren und einzeln translatiert werden. Der Reporterfarbstoff wird über

eine eigene interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) exprimiert. Die darauf folgenden

Veränderung sind noch nicht umfassend verstanden, wahrscheinlich ändert sich aber die

Epigenetik weniger Zellen derart, dass sie sich zu einem morphologisch wie auch

transkriptionell stammzell-ähnlichen Zustand zurückentwickeln. Um die Effizienz der

Reprogrammierung noch zu steigern, wurde dem Ansatz Valproinsäure beigefügt [72].

GAG PRO POL

VIF

VPR

VPU

NEF

TAT REV LTRLTR ENV

3' LTR

POLGAG

RR

E

CMVREVCMV

Poly-AVSV-GCMV

RSV-5'LTR SFFV KFL4 SOX2 c-MYC dTomOCT4 P2A

T2A

E2A IRES


4.5.1 Viruspartikel Produktion


Siehe benötigte Materialien 4.4.7.1

HEK 293 Zellen

Plasmide pMD2.G

pRSV_Rev

pcDNA3.gp4xCTE

pRRL.PPT.SF.hOKSMco-idTom.pre.FRT

10 cm Schalen

Ultrazentrifuge (~112.000 g)

Arbeitsanweisung

Tag 1

5x106 Zellen pro 10 cm Schale in Basalmedium (zwei Schalen pro UC Ladung)

Tag 2

Plasmide und Komponenten auftauen, TF Medium aufwärmen

Plasmide mit Wasser auf 450 µl verdünnen

+ 50 µl CaCl2-Lsg in 1,5 ml Gefäß

+ 500 µl 2x HBS in 15 ml Falcon

DNA/CaCl2 durch “air-bubbling” mit den 500 µl 2x HBS mischen oder vortexen

o 20‘ RT

Altes Medium von HEK 293 Zellen absaugen

+ 10 ml TF Medium incl. 25 µM Chloroquin

+ DNA Calciumphosphate Mix

o 6 – 12’, 37 °C, 5 % CO2

Medium wechseln (7ml TF Medium)

Tag 3

Überstand vorsichtig mit einer Einmalspritze abnehmen


Durch 22 µm Filter sterilisieren

+ 7 ml TF-Medium

Überstand bei 4 °C in Falcons bis zur Ultrazentrifugation lagerbar

Erntezeiten

0 h Transfektion

12 h nach Transfektion Überstand verwerfen + 7 ml TF-Media

36 h nach Transfektion Ernte 7 ml + 7 ml TF media

48 h nach Transfektion Ernte 7 ml Zellen verwerfen oder mit 4 % PFA 15´ RT fixieren

Überstände vereinigen und bei 33.000 rpm (112.000 g) für 2 h und 4 °C

zentrifugieren

Viruspartikel in 1/100 Basalmedium des Ausgangsvolumens resusp. (28 ml > 280 µl)

Lagerung bei – 80°C oder Flüssigstickstoff

Plasmids: Transfer Vector 10 µg / 10 cm Schale

Gagpol 12 µg / 10 cm Schale

Rev 5 µg / 10 cm Schale

Env 1,5 µg / 10 cm Schale

Zeitschema:

Tag 1 Zellen aussäen 20:00 Uhr

Tag 2 Transfektion 8:00 Uhr 1. Mediumwechsel 16:00 - 20:00

Uhr

Tag 3 1. Viruspartikel Überstand Abnahme 20:00 Uhr

Tag 4 2. Viruspartikel Überstand Abnahme 08:00 Uhr Ultrazentrifugation 2 h, 4 °C,

33,000 rpm

Sofortige Titrierung

Tag 3 HT1080 aussäen

Tag 4 Transduktion


Tag 5 Mediumwechsel

Tag 6 Fixierung + FACS Messung innerhalb einer Woche

4.5.2 Virustiterbestimmung


Siehe Benötigte Materialien 4.5.2

HT1080 Zellen anstatt Primärfibroblasten

Arbeitsanweisung

HT1080 Zellen auftauen

Tag 0

HT1080 Zellen mit Trypsin/EDTA passagieren

30,000 Zellen pro Well einer 6Well-Platte aussäen

Tag 1

Transduktion

Verdünnungsreihe in Dubletten erstellen

o z.B.: Negativkontrolle, 1 µl, 3 µl, 9 µl und 27 µl des Viruspartikelkonzentrats

Medium absaugen

+ 4 ml Basalmedium + 4 ng/ml Protaminsulfat

o Mindestens 4 ml verwenden, andernfalls können die Zellen bei der

„Spininoculation“ trocken fallen und sterben

+ ausgerechnetes Volumen Viruspartikel

o Platten mit Parafilm versiegeln

1 h „Spininoculation“ bei 711 g und 37 °C mit einem Plattenrotor

37 °C, 5 % CO2 ÜN

Tag 3

Überstand absaugen


Vorsichtig 2x mit 1x PBS waschen

+ 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA

o 3 – 5’ 37 °C, 5 % CO2

Reaktion mit fünffachem Volumen Basalmedium abstoppen

o Zellen ernten

o 5’ 500 G

Überstand absaugen und in 1 ml frischer warmer 4 % PFA 1x PBS ordentlich

resuspendieren

o 15’ RT

o 5’ 500 G

Überstand absaugen

Vorsichtig 2x mit 1x PBS waschen

in 200 µl FACS-Flow Puffer resuspendieren (2 % FCS, 0,02 % NaN3 und 2 mM EDTA)

Zellen können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden bis zur Messung

FACS Analyse

Negativkontrolle messen

Parameter für vorwärts und seitwärts Scatter so definieren, dass Zellen lebend und

dTOmato positive

Verdünnungsreihe nacheinander messen; 10.000 Zellen min. bei jeder Messung

% lebende dTomato positive Zellen (von allen lebenden Zellen)

Titerberechnung

z.B.

HT1080 Fibrosarcoma: 18.2 h Verdopplungszeit → 2,6 Verdopplungen in 48 h


4.5.3 Transduktion, Selektion, Expansion


Basalmedium

SCM

Ascorbinsäure Sigma-Aldrich A4544-25G

Valproinsäure Sigma-Aldrich P4543-10G


Viruspartikel

Beheizbare Zentrifuge mit Plattenrotor

Arbeitsanweisung

Primär Fibroblasten auftauen und für min. 1 Woche kultivieren

Tag 0

Fibroblasten mit Trypsin/EDTA passagieren

30,000 Zellen pro Well einer 6Well-Platte aussäen

Tag 1

Transduktion

MOI 0,25 der Viruspartikel

Medium absaugen

+ 4 ml Basalmedium + 4 ng/ml Protaminsulfat

o Mindestens 4 ml verwenden, andernfalls können die Zellen bei der

„Spininoculation“ trocken fallen und sterben

+ ausgerechnetes Volumen Viruspartikel

o Platten mit Parafilm versiegeln

1 h „Spininoculation“ bei 711 g und 37 °C mit einem Plattenrotor

37 °C, 5 % CO2 ÜN

Tag 2 und 4


Überstand absaugen

+ Basalmedium + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure

Tag 6

Überstand absaugen

+ Basalmedium 1:1 SCM + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure

Tag 7

MMC behandelte MEF Feeder Zellen auf Gelatine beschichtete 6Well-Platten

aussäen (75.000 - 150.000 Zellen/Well)

Tag 8

Primär Fibroblasten passagieren Trypsin/EDTA Split

In SCM + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure + 10 µM ROCK Inhibitor

resuspendieren

Auf vorbereitete Feeder aussäen (1:5 – 1:50, je nach Wachstumsstärke)

Tag 10

Überstand absaugen

SCM + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure

Tag 12

Überstand absaugen

SCM + 50 µg/ml Vitamin C

Ab Tag 13 täglich, bis Kolonien groß genug zum picken sind

Überstand absaugen

SCM + 50 µg/ml Vitamin C

Tag 18 – 25

Manuelle Selektion der Kolonien (siehe auch 4.4.5.3)


Jeden Klon einzeln weiter expandieren, bis er 1 – 3 6Wells füllt (wie unter 4.4.4 und

4.4.5.2 beschrieben)

Kryokonservierung (4.4.6)

TIPP

Beim Selektieren der Klone sollte darauf geachtet werden, dass man Klone jeder Größe

wählt. Ebenfalls sollte man Klone jeder Replikationsgeschwindigkeit wählen. An

verschiedenen Tagen selektieren!

Abbildung 4.11: Zeitlicher Ablauf einer Reprogrammierung

4.6 Kortikale Differenzierung

Die erste Differenzierungsstufe während der Embryogenese ist die Entwicklung der drei

Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und Ectoderm aus der Blastula. Sie bilden die Grundlage

für alle weiteren reifen Gewebe, wie den Verdauungstrakt, die Muskulatur oder das Gehirn.

Die meisten bisher etablierten Differenzierungsprotokolle für iPS beinhalten die Bildung von

sog. „Embryoid bodies“ und einer terminierten Zugabe von „small molecules“. Die

Grundlage des in dieser Arbeit optimierten Differenzierungsprotokolls bildete hingegen ein

Ansatz in adhärenter Kultur. Hierbei wurden die Stammzellen in Konfluenz unter Zugabe von

zwei SMAD Inhibitoren und Retinolsäure kultiviert. Das sich daraus entwickelnde

Neuroectoderm durchlief anschließend unter weiterer Zugabe von Retinolsäure die

embryonale Neurogenese des humanen Kortexes [112].


4.6.1 Modifiziertes Protokoll nach Yichen Shi et al.



Poly-L-Ornithin Sigma Aldrich P4957

Matrigel BD 356234 400 µl Aliquots -20

°C


bFGF RnD 4114-TC-01M

Dispase II Roche 4942078001

Accutase Gibco A1110501

SCM

MEF-cm

NMM

NIM

Glaspasteurpipetten

Bunsenbrenner

6- und 12Well-Platten

45 µm Zellsieb

Arbeitsanweisung

Voraussetzung: Gesunde iPS Kultur auf MG/MEF-cm in 6Wells ~70 % konfluent

WICHTIG: bFGF Konzentration sollte so gering wie möglich sein!!! Hohe bFGF

Konzentrationen reduzieren die Effektivität der Differenzierung drastisch!

Herstellung einer konfluenten iPS Kultur auf Matrigel

Vorweg: 12Well Platte mit Matrigel beschichten

+ 1:10 Dispase II (10 mg/ml) direkt zum Medium

5‘ ,37 °C 5 % CO2

ÜS abnehmen

10 – 15‘ ohne ÜS 37 °C, 5 % CO2


Mit genügend Basalmedium ohne KOSR abspülen

Mit 1 G für 5‘ oder 250 G 3‘ abzentrifugieren

Waschvorgang 1x wiederholen

Zellen in MEF-cm + evtl. 10 µM ROCK Inhibitor resuspendieren, dabei Zellen

möglichst vereinzeln

Ggf. mit 45 µm Zellsieb Zellklumpen entfernen

In MG beschichtete 12Wells aussäen

Zellen sollen nächsten Tag konfluent sein, meist reicht ein Splitverhältnis von 6:1 aus

(ca. 3x 6Well auf 1x 12 Well; wenn die Kultur vorher recht dicht war ~70 %)

37 °C, 5 % CO2, ÜN

Neuronale Induktion (Tag 1 – Tag 8-12)

Kontrolle der Zellen unter dem Mikroskop: konfluent?

o Nein

In MEF-cm weiter kultivieren, bis konfluent

o Ja


+ 1ml NIM

37 °C, 5 % CO2, täglich Medium wechseln

Ca. um Tag 8 – 12 sollten sich alle großen Stammzellen zu einem gleichmäßigen, dicht

gepackten Neuroectoderm entwickelt haben und können/müssen dann passagiert werden.

o Kleinere Zellen mit deutlich kleinerem Zellkern zeigen oft Wachstumsrichtung

Passage

Vorweg

o 6Well mit Poly-L-Ornithin/Laminin beschichten (jeweils 4 h, 37 °C)

o Sterile Glaspasteurpipetten über dem Bunsenbrenner zu runden (!!) Spitzen

ziehen


Zellrasen mit vorbereiteten Pasteurpipetten in ca. 16 kleine Quadrate teilen

+ 100 µl Dispase II (Stlsg.: 10 mg/ml) direkt zum Medium

o 3-10‘ ,37 °C, 5 % CO2

Zeit muss jedes Mal neu bestimmt werden, unter dem Lichtmikroskop

beobachten

ÜS vorsichtig absaugen (!!!!)

Mit genügend Basalmedium ohne KOSR/FCS vorsichtig abspülen

o Möglichst große Klumpen behalten

Mit 1 G für 5‘ absinken lassen


In NIM sehr vorsichtig resuspendieren

o Durch auf- und abpipettieren mit einer 1000 µl Pipette in Aggregate von 300

– 500 Zellen brechen. Nicht kleiner!

Auf Poly-L-Ornithin/Laminin beschichtete 6Wells aussäen

o Splitrate 1:2 (1x12Well in 1x 6Well aussäen)

37 °C, 5 % CO2 ÜN

Wechsel zu NMM am nächsten Tag, tägliche Mediumwechsel

NSC Expansion (- 20 – 30 d)

Tägliche Kontrolle auf erste neuronale Rosetten (12 -17 d); falls ja

o + 20 ng/ml bFGF für 2 - 4 Tage, um Rosettenwachstum zu fördern

Dispase Passage

Vorweg: 6Well-Kulturgefäß mit Laminin beschichten

+ 200 µl Dispase II (Stlsg.: 10 mg/ml) direkt zum Medium

o 5‘ ,37 °C, 5 % CO2

Mit genügend Basalmedium ohne KOSR/FCS abspülen

Durch auf- und abpipettieren mit einer 1000 µl Pipette in Aggregate von 300 – 500

Zellen brechen.

Mit 1 G für 5‘ oder 350 G 3‘ abzentrifugieren



In NMM resuspendieren

Auf Poly-L-Ornithin/Laminin beschichtete 6Wells aussäen

o Splitrate 1:2-3 (1 6Well in 2-3 6Wells aussäen)

37 °C, 5 % CO2

Mediumwechsel jeden 2. Tag

Accutase Passage (25-30 d)

ÜS abnehmen

1x mit 1x PBS spülen

+ 500 µl Accutase

3‘, 37 °C

+2 ml DMEM w/o mit 1000 µl Pipette alles gut abspülen und in 15 ml Falcon

sammeln; 1 – 2x wdh.

3‘ 350 G

ÜS abnehmen

+2 ml NMM resuspendieren

1:10 Verdünnung mit „Neubauer improved“ auszählen

Zellen 50.000 Zellen/cm2 auf Poly-L-Ornithin/Laminin beschichtete Wells aussäen

+1 d Mediumwechsel; nachfolgend jeden 2. Tag Medium wechseln

Oder

Kryokonservierung (siehe 4.4.6)

Ab hier keine weiteren Splits mehr, da nun starke Neurogenese!!


4.7 Funktionelle Analysen

4.7.1 Antikörper

Tabelle 4.6 Primärantikörper Abkürzungserklärung: Intra: Intrazelluläres Epitop, Extra: extrazelluläres Epitop, ER: Endoplasmatisches Reticulum, NCAM: Neurales Zell Adhäsionsprotein, PSA: Polysialinsäure, pAb: polyklonaler Antikörper, Mab: monoklonaler Antikörper

Antikörper Antigen Spezies Firma Best.Nr Konz. WB IF/FC FACS Beschreibung Bemerkung Lagerung

Giantin Giantin human (Golgi)

Kaninchen Covance PRB-114C

- 1:5000 1:1000 -

polyclonal, Antiserum. Golgi

Marker; also works in IF with murine cell

line

Western transfer in presence of

0,1%SDS, after Transfer, rinse blot with 50%MeOH to

remove any residual SDS Intra

-20 °C

IRE1 IRE1 (ER)

Kaninchen Abcam ab37073 1

mg/ml 1:1000-1:2000

1: (1µg/ml)

- ER Marker alte Bestellnummer:

ab48189 Intra -20 °C

Calnexin Calnexin

(ER) Maus Millipore MAB3126

1 mg/ml

1:200 - 1:2000

1:500 - monoclonal, IgG1,

ER Marker

nicht sicher, ob der so gut funktioniert!

Intra -20 °C

NCAM 123C3

human NCAM IgG1

Maus (MHH) - 6,42

mg/ml

1 µg/ml (bis 5 µg/ml)

1:642 (10

µg/ml)

-

IgG1,subspez.2.AK IgG1 1:10000,

besser H+L 2.AK IgG 1:20000

in Magermilch/PBST OHNEAzid (bei

anschl. ECL Entwicklung) Extra

-20 °C

735 PSA Maus (MHH) - 2

mg/ml 1:800 1:800 - IgG2a Extra -20 °C

St3 St3Gal3 Kaninchen Abcam ab103837 - - 1:100 - PAb IgG Intra -20 °C

ST3S St3Gal3 Kaninchen Sigma AV46706-

50UG 50 µg/ - 1:500 - PAb IgG

Hu et al Paper Intra

-20 °C


Oct3/4 Oct3/4 Maus Santa Cruz

Biotechnoligies SC-5279

200 µg/ml

- 1:50 - MAb IgG2B Intra 4°C

SSEA4 SSEA4 Maus Biozol BLD-

330402 100 µg - 1:100 - Mab IgG3 Extra 4°C

Pax6 Pax6 Maus Santa Cruz

Biotechnoligies SC81649

200 µg/ml

- 1:300 - MAb IgG1 Intra 4°C

Otx1/2 Otx1/2 Kaninchen Millipore ab9566 100 µl - 1:300 - Serum Intra -20°C

Tbr1 Tbr1 Kaninchen Abcam ab31940 1

mg/ml - 1:200 1:200 PAb Intra -20°C

Satb2 Satb2 Maus Abcam ab51502 0,1

mg/ml - 1:200 1:200 MAb Intra -20°C

Tbr2 Tbr2 Kaninchen Abcam ab23345 0,5 – 1 mg/ml

- 1:100 PAb Intra -20°C

c-Myc c-MYC-

tag Maus Sigma Aldrich M4439

2 mg/ml

1:5000 1:1000 - MAb - 4 °C

Tabelle 4.7 Sekundärantikörper Abkürzungserklärung: APC: Alophycocyanin

Antikörper Antigen Spezies Firma Best.Nr Konz. WB IF/FC FACS Lagerung

Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488 Maus IgG Ziege LifeTechnologies A-11029 2 mg/ml - 1:300 - -20 °C

dunkel

Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 555 Kaninchen IgG Ziege LifeTechnologies A-21429 2 mg/ml - 1:600 - -20 °C

dunkel

Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488 Kaninchen IgG Ziege LifeTechnologies A-11008 2 mg/ml - - - -20 °C

dunkel


Anti-Maus IgG APC Kaninchen IgG Ziege LifeTechnologies A-10931 1 mg/ml - - 1-10

µg/ml

-20 °C

dunkel

Anti-KaninchenIgG APC Maus IgG Ziege LifeTechnologies A-865 1mg/ml - - 1-10

µg/ml

-20 °C

dunkel


4.7.2 Proteinisolation

4.7.2.1 Proteinisolation aus TriZOL Proben



EtOH 100 %

Chloroform

Isopropanol

Lösung A 0.3 M Guanidine hydrochloride in 95% Ethanol

Probenpuffer 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff

Arbeitsanweisung

1ml TriZoL pro 10 cm2 oder 5-10 x 106 Säugerzellen

ÜS absaugen; 1x mit 1x PBS waschen

+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben, mit Zellschaber abkratzen, durch mehrmaliges auf-

und abpipettieren homogenisieren (je nach Zelldichte Menge anpassen)





Phasentrennung

Abbildung 4.12: Proteinphase TriZOL Aufreinigung

Obere wässrige Phase in neues Gefäß überführen -> RNA Isolierung

+ 0,3 ml 100 % EtOH pro ml TriZol invertieren -> 3‘ RT -> 5‘ 2000 g, 4 °C

Organische Phase oberhalb des DNA Pellets abnehmen und in neues 1,5 ml Gefäß

überführen


+ 1,5 ml Isopropanol pro ml TriZol -> 10‘RT -> 10‘ 12000g, 4 °C


+ 2 ml Lösung A pro ml TriZol -> 20‘RT -> 5‘ 7500 g, 4 °C


Waschvorgang mit Lösung A zweimal wiederholen

+ 2ml 100 % EtOH -> 30‘ RT -> 5‘ 7500 g, 4 °C

Überstand verwerfen -> Vakuumzentrifuge 5-10‘

+ Probenpuffer -> ÜN RT

Lagerung bei -5 bis -20 °C

4.7.2.2 Lysepufferkit


ProteoJet Mammalian Cell Lysis Kit Fermentas K0301

Protease Inhibitor Cocktail

DPBS

Arbeitsanweisung

Protease Inhibitor zu benötigter Menge Lysepuffer zufügen

Überstand von den Zellen abnehmen

1x mit DPBS waschen


+ Lysepuffer (400 µl 6Well, 1 ml 10 cm Schale)

o 10‘ RT Schüttler

Lysierte Zellen in 1.5 ml Gefäß sammeln (ggf. Zellschaber nutzen)

o 15‘ 16.000 – 20.000 g

Überstand in neues Gefäß überführen

Sofort verwenden, ansonsten Lagerung bei -80 °C


4.7.3 SDS-Gelelektrophorese

Bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach einer Methode von Laemmli

(1970) erfolgt die Auftrennung von denaturierten Proteinen unter Zugabe eines Detergens

(Natriumdodecylsulfat, SDS) und somit nur anhand der Molekülgröße. Das negativ geladene

anionische Tensid SDS denaturiert die Proteine, der resultierende Komplex erhält durch die

angelagerten Sulfatgruppen eine gleichmäßig verteilte negative Ladung. Dementsprechend

wandern bei dieser Methode alle Proteine im elektrischen Feld zum Pluspol. Dabei werden

die Proteine zunächst in einem relativ großporigen Sammelgel fokussiert und anschließend

in einem feinporigen Trenngel deutlich voneinander separiert. Die nötige Trennschärfe wird

durch einen pH-Sprung von 6,8 auf 8,8 an der Grenze zwischen Sammel- und Trenngel

erreicht.

Das hier verwendete Sammelgel enthielt standardmäßig 3% des Polymers. Die

Acrylamidkonzentration des Trenngels wurde in Abhängigkeit von der Größe der

aufzutrennenden Proteine gewählt (10 – 12 %)


Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels 10 % BioRad 456-1031

Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels 12 % BioRad 456-1041

Laemmli Proben Puffer BioRad 161-0737EDU

10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer BioRad 161-0772EDU

Bio-Safe Coomassie Stain BioRad 161-0786

Beta-ME

Mini-PROTEAN Tetra Cell

Netzteil

Pre-stained Page Ruler Plus LifeTechnologies 26619

Arbeitsanweisung

2 Gele in Kammer einspannen (ggf. Leergel verwenden)

o Klebestreifen unten abziehen

In Mini-PROTEAN Kammer einsetzen

Mit 1x TGS-Puffer Zwischenraum und Kammer bis Markierung auffüllen

20 – 30 µg Gesamtprotein 1:1 mit Laemmli-Puffer mischen


o 10‘ 98 °C

Kamm aus dem Gel entfernen

o Taschen spülen

Proben in Taschen auftragen

Konstant 200 V max. 40 mA

Um Proteinmenge zu überprüfen, kann anschließend mit Bio-Safe Coomassie gefärbt

werden

Gel in Schale mit A.dest waschen

o 3x 5‘

+ 50 ml Bio-Safe Coomassie

o 1 h Schüttler

Coomassie verwerfen

+ A.dest waschen bis nur noch Banden sichtbar

4.7.4 Western Blot

In der SDS-PAGE aufgetrennte Proteine können mit dieser Methode auf eine Nitrocellulose

oder PVDF Membran übertragen werden. Es wurde hierbei das sog. „Semi-dry“ Verfahren

verwendet.


Nitrocellulose Whatman 10401196

PVDF Membran Roche 03010040001

Whatman Paper Whatman 3030672

Transferpuffer BioRad 1610771

Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell

Arbeitsanweisung

Gel, Filterpapier und Membran in Transferpuffer einlegen

o 5‘ RT

Blotting-Sandwich zusammen bauen


Abbildung 4.13 Schematischer Aufbau eines Western Blots

o Mit leerem 15 ml Falcon vorsichtig evtl. Blasen aus dem Sandwich

herausrollen (mit wenig Druck immer nur in eine Richtung arbeiten)

Nochmals mit wenig Transferpuffer befeuchten

15 – 30‘ 10 – 15 Volt

Mit einer Ponceau S Färbung kann die Bloteffizienz überprüft werden

4.7.5 Detektionsmethoden

Für den Nachweis von einzelnen Proteinen wurden die Epitope zunächst mit spezifischen

Primärantikörpern markiert. Diese werden spezifisch gegen ein Epitop, wie etwa ein c-Myc-

Tag, z.B. in Kaninchen oder Mäusen, gebildet.

Bei der Auswahl der Antigene für Western Blot Antikörper wurde in dieser Arbeit darauf

geachtet, dass diese im denaturierten Zustand markierbar waren. Die daran bindenden

Sekundärantikörper waren jeweils für den Fc-Teil des Antikörpers des jeweiligen Wirtes

spezifisch. (Primär = IgG aus der Maus -> sekundär gegen Fc-Teil des IgG aus der Maus). Sie

waren entweder mit einer Peroxidase aus dem Meerrettich (HRP), mit dem Infrarot

Farbstoff 800CW oder mit den Alexa Fluor Farbstoffen 488 oder 555 konjugiert.

Abbildung 4.14 Schematischer Ablauf einer Immunfärbung. Bindung der Primärantikörper an distinkte Epitope, Bindung mehrerer markierter Sekundärantikörper an den Fc-Teil der Primärantikörper.

4.7.5.1 Chemielumineszenz

Bei der Detektion mit HRP-konjugierten Antikörpern gibt man zu den mit Primär und

Sekundär-antikörpern markierten Proteinen eine Luminol enthaltende Lösung. Die

Oxidation von Luminol wird nun folgend von der Peroxidase katalysiert. Die hierbei

freiwerdende Lumineszenz kann dabei auf einem photosensitiven Film detektiert werden.



Pierce™ ECL Western Blotting Substrate Life Technologies 32106

Primärantikörper

Sekundärantikörper αRb-HRP GE NA9340V

Amersham Hyperfilm ECL GE 28-9068-36

1x TBS

Blockierlösung 5 % FBS in 1x TBS

Entwickler Fixierer

Arbeitsanweisung

Membran in 1x TBS waschen



+ 10 – 50 ml Blockierlösung

o 1 h RT Schüttler


Primärantikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken

o 4 °C ÜN

o 1 h RT Schüttler

3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler

Sekundär Antikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken

o 1 h RT Schüttler

o 3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler

Membran in Folie einschlagen und in Kassette in Dunkelkammer bringen

Detektionsreagenz 1und 2 1:1 mischen und auf Blot geben

o 1‘ RT

o Überstand verwerfen

Blot in Folie in Kassette legen, Hyperfilm auflegen

o Film 1‘ – 1 h belichten

Film entwickeln


4.7.5.2 Fluoreszenz

Für die fluorogene Detektion der Proteine wurden diese mit von Infrarot-Farbstoffen

konjugierten Sekundärantikörpern markiert.


Primärantikörper

Sekundärantikörper αRbIgG-IR Dye 800CW LI-COR 925-32213

1x TBS

Blockierlösung 5 % FBS in 1x TBS

Entwickler Fixierer

Arbeitsanweisung

Membran in 1x TBS waschen



+ 10 – 50 ml Blockierlösung

o 1 h RT Schüttler


Primär Antikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken

o 4 °C ÜN

o 1 h RT Schüttler

3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler

Sekundärantikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken

Alle weiteren Arbeiten abgedeckt, dunkel ausführen!!!

o 1 h RT Schüttler

o 3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler

Membran in Folie einschlagen und in Kassette zur Detektion bringen

4.7.6 Fixierung von Säugerzellen

Die Fixierung von Säugerzellen wurde in dieser Arbeit mit Formaldehyd durchgeführt.

Hierfür wird eine 8 % Paraformaldehydlösung hergestellt. Paraformaldehyd zerfällt in


Wasser zu Formaldehyd, welches mit den Proteinen in den Zellen reagiert und sie

miteinander vernetzt.


8 % PFA Lösung

1x DPBS

Arbeitsanweisung

ÜS absaugen

o 2x mit 1x PBS waschen

Mit 1,5 ml 4 % PFA in 1x PBS überschichten

o 15 – 30 min bei RT auf Schüttler inkubieren

Oder:

+ 1:1 8 % PFA in 1x PBS direkt zum Medium

15 – 30 min bei RT auf Schüttler inkubieren

3 x mit 1x DPBS waschen

Letztes DPBS Volumen darauf belassen

Platte mit Parafilm versiegeln

Lagerung bei 4 °C bis zu 1 Monat

4.7.7 Immunfluoreszenzfärbung

Die Immunfluoreszenzfärbung von fixierten Zellen beruht auf den gleichen Prinzipien wie

die Markierung von Epitopen in der Western Blot Detektion.

Bei der Auswahl der Antikörper wurde in dieser Arbeit darauf geachtet, dass die Antigene

für die Antikörperproduktion Epitope aus der nativen Form des Proteins waren. Die

Sekundärantikörper waren entweder mit Alexa Fluor 488 oder 555 markiert.


Name Absorptionsmaximum Emmissionsmaximum Filter

Alexa Fluor-488 490 525 FITC

Alexa Fluor 555 555 580 TRITC

Abbildung 4.15 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved.


Blockierlösung (5 % FBS oder Ziegenserum in DPBS)

Permeabilisierungslösung (0.1 % Triton X-100 in 1x DPBS)

1x DPBS

MiliQ

Primärantikörper

Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 oder 555

ProLong® Gold Antifade Mountant with DAPI Life Technologies P36941

Arbeitsanweisung (für 1x 6Well)

Alle Inkubationszeiten nach Zugabe des Sekundärantikörpers abgedunkelt ausführen

(dunkle Schale auflegen), Zellen vorher mit PFA fixieren

Optional: Permeabilisierung bei Markierung von intrazellularen Epitopen

Mit 1,5 ml 0,1 % Triton X-100 in 1x PBS überschichten

o 15 min bei RT auf dem Schüttler inkubieren

+ 1,5 ml Blockierlösung 2 % NGS in 1x PBS

o 30 – 60 min bei RT auf dem Schüttler inkubieren

Primärantikörper in vorgeschriebener Verdünnung in Blockierlösung mischen


50 µl Antikörper aufgeben und Verdunstung durch Auflegen eines

Parafilmplättchens verhindern

o 1 h bei RT auf dem Schüttler inkubieren

o Alternativ bei 4 °C ÜN

o Nächsten Tag 1 h bei RT inkubieren

Parafilm entfernen


o 5 min bei RT auf dem Schüttler inkubieren

Sekundärantikörper in vorgeschriebener Verdünnung in Blockierlösung mischen

50 µl Sekundärantikörper auf die markierte Stelle pipettieren und ebenfalls vor

Verdunstung durch Auflegen eines Parafilmplättchen schützen

o 1 h bei RT auf dem Schüttler inkubieren

3x mit 1x PBS waschen, jeweils

o 5 Min bei RT auf dem Schüttler inkubieren

2x mit MiliQ waschen, jeweils

o 5 Min bei RT auf dem Schüttler inkubieren

Kurz unter dem Abzug antrocknen lassen

10 – 20 µl DAPI II mounting solution auf Objektträger geben, trockenes Deckgläschen

über einen Rand vorsichtig, blasenfrei auflegen

o 24 h bei RT im Dunkeln trocknen lassen

Die Ränder mit Nagellack verschließen

Bei 4 °C bis zu 1 Jahr lagerbar

TIPP

Parafilm lässt sich am einfachsten entfernen, indem direkt 1,5 ml 1x PBS des ersten

Waschschrittes aufgegeben wird und das aufschwimmende Parafilmplättchen mit einer

Pinzette entfernt wird.

4.7.8 DiI Färbung

DiI, genauer 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate, ist ein

lipophiler kationischer Indocarbocyanid Farbstoff. Er wurde in dieser Arbeit genutzt, um die


Zellmembranen von Neuronen zu färben. Die so gefärbten Zellen sollten anschließend unter

dem Fluoreszenz-mikroskop morphologisch charakterisiert werden.

Name Absorptionsmaximum Emmissionsmaximum Filter

DiI 549 565 TRITC

Abbildung 4.16 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved.


8 % PFA Lösung

1x DPBS

DiI Kristalle Life Technologies D3911

ProLong® Gold Antifade Mountant with DAPI Life Technologies P36941

Arbeitsanweisung

Fixierung

2 % frisch aufgetautes PFA (Endkonz.) -> 15 min RT (zu 2 ml Medium kommen 666 µl 8 % PFA)

ÜS ab, 1x mit PBS gewaschen

DiI Färbung

ÜS ab + DiI Kristalle

10 min RT

2x mit PBS waschen, trocknen lassen, anschl. in DAPI eindeckeln

Analyse nach 72 h möglich


4.7.9 Adhärenz Assay

Die Adhärenz von Zellen sowohl an ihren Untergrund als auch an andere Zellen wird

hauptsächlich über die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix bestimmt.

Veränderungen in der ECM, aber auch in intrazellulären Signalwegen und dem Cytoskelett,

können so auch das Adhärenzverhalten dieser Zellen ändern. In diesem Assay wurde die

Adhärenzgeschwindigkeit einer Zellsuspension auf einen spezifischen Untergrund

gemessen. Hierfür wurden neuronale Vorläuferzellen (NI d30) geerntet, gezählt und auf

einen Poly-L-Ornithin/Laminin beschichteten Untergrund wieder ausgesät. Nach definierten

Zeitpunkten wurden die noch nicht adhärierten Zellen abgenommen und gezählt. Aus

diesen Daten konnte anschließend eine Anheftungskurve über die Zeit bestimmt werden.


0.5 µM sterile EDTA Lösung



Poly-L-Ornithin Sigma Aldrich P4957

NMM

„Neubauer improved“ Kammer

Arbeitsanweisung

Voraussetzung: lebende Zellkultur, die als einzelne Zellen wachsen können, hier als Beispiel

für neuronale Kortexzellen dargestellt.

12Wells mit Poly-L-Orinthin/Laminin beschichten

1-2 6Wells mit NI d30 Zellen

ÜS absaugen

+ 1,5 ml 1x PBS kreuzweise waschen

ÜS absaugen

+ 1,5 ml 1x PBS kreuzweise waschen

ÜS absaugen

+ 1 ml EDTA-Lsg (0,5 µM) 7‘ 37 °C


Mit insgesamt min 6 ml DMEM w/o abspülen

5‘ 250 g

ÜS absaugen

+ 12 ml NMM

o Zellen zählen und Zellzahl pro ml notieren

1 ml Zellsuspension pro 12Well aussäen

o 2‘ – 1 h bei 37 °C inkubieren

Nach Ablauf der Zeit jeweils den kompletten Überstand abnehmen

o Zellen erneut zählen

o Mittelwert aus allen drei Replikaten bilden

Je größer desto schneller der Adhäsionsprozess!

Mögliches Layout:

Tabelle 4.8: Layout Vorschlag für einen Adhärenzassay

2 min 5 min 10 min 30 min

ASC23

ASC23

ASC23

4.7.10 Bio Analyzer Cell Assay

Für die quantitative Bestimmung fluoreszenzmarkierter Zellen wurde die Zwei-Farben-

Durchflusszytometrie-Methode des BioAnalyzer Systems (Agilent Technoligies, Santa Clara,

USA) genutzt. Hierbei wurden alle Zellen mit SYTO16 (grün) gefärbt und die spezifischen

Primärantikörper mit einem APC (rot) markierten Sekundär-antikörper sichtbar gemacht.

Die Probenansätze konnten anschließend auf Chips geladen und einzeln vom BioAnalyzer


ausgewertet werden. Das BioAnalyzer System kann Farbstoffe über einen roten (Ex/Em

630/680) und einen blauen (Ex/Em 470/525) Kanal detektieren. So wird die Anzahl aller

Zellen (SYTO16), und davon die Anzahl der Untergruppe, die ebenfalls für das gesuchte

Epitop positiven Zellen (SYTO16 + APC), bestimmt.


Agilent Cell Kit Agilent Technologies 5067-1519

SYTO16 Life Technologies S7578

Blockierlösung (5 % FBS in DPBS)

Permeabilisierungslösung (0,1 % Triton X-100 in 1x DPBS)


MiliQ

Primärantikörper

Sekundärantikörper, APC konjugiert

SYTO16 Life Technologies S7578

Arbeitsanweisung (Optimiert für die Färbung von Kortex Neuronen NI d50)

Vorweg: Cell Assay Kit auf RT stellen.

Zellen ernten und in Blockierlösung resuspendieren

Zählen und Zellzahl auf 2 x 106 Zellen/ml einstellen (min. 4 x 106 Zellen)

o 500 µl für die Negativkontrolle wegstellen (1 x 106 Zellen)

Restliche Zellen + 1 µl/ml SYTO16 (1 µM) gut durchmischen → 30 min 37 °C dunkel

5‘ 500 g in 1.5 ml Blockierlösung resuspendieren

+ 500 µl 8 % PFA sofort vortexen

o 10 min. dunkel Eis(2 % Endkonzentration)

+ 330 µl 0,06 % Triton X-100 Lösung

o 10 min. dunkel Eis (0.014 % Endkonzentration)

5‘ 500 g

ÜS ab

+ Blockierlösung auf 1 x 106 Zellen/100 µl

o 100 µl für die nur SYTO16 Kontrolle wegstellen (1 x 106 Zellen)


o 100 µl für nur 2. Ab wegstellen (1 x 106 Zellen)

o Je 100 µl + 1. Ab

30 min. RT dunkel

5‘ 500 g

ÜS ab

+ je 100 µl Blockierlösung

o + Korrespondierende 2. Ab

30 min RT dunkel

Nur markierte 5‘ 500 g

o ÜS ab + 1.5 ml Blockierlösung

Alle Proben 5‘ 500 g

o ÜS ab + ABI „cell buffer“ auf 2 x 106 Zellen/ml

8 x 106 Zellen in 3 ml BL lösen

→ 4x 2 x 106 Zellen/ml →500 µl für Negativ (1 x 106 Zellen)

→ 3.5x 2 x 106 Zellen/ml →SYTO16, PFA, Triton

→ 7x 1x 106 Zellen/100 µl → 100 µl nur SYTO16, 100 µl je 2. Ab

→ 4x 1x 106 Zellen/100 µl → 200 µl je 1. Ab

→ 6x 1x 106 Zellen/100 µl → 2. Ab

Alle Proben in 500 µl ABI Zellpuffer resuspendieren.

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244. Nelson M., M.C.M., Use of DNA methyltransferase/endonuclease enzyme combinations for megabase mapping of chromosomes. Methods Enzymologies, 1992. 216: p. 279-303.

245. Graham F. L., v.d.E.A.J., A New Technique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA. Virology, 1973. 52: p. 456-467.

246. PHILIP L. FELGNER, T.R.G., MARILYN HOLM, RICHARD ROMAN, HARDY W. CHAN, MICHAEL WENZ, JEFFREY P. NORTHROP¶, GORDON M. RINGOLD, AND MARK DANIELSEN, Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Biochemistry, 1987. 84: p. 7413-7417.

247. Dull, T., et al., A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol, 1998. 72(11): p. 8463-71.

Eigenständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch

einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion

eingereicht wurde.

Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen

als die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte

eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.

Laura van Diepen

Danke…

Meinem Doktorvater, Prof. Dr. rer nat Kuss für die Vergabe dieses spannenden

Themas, das Vertrauen und die wissenschaftliche Anleitung und Anregung.

Herrn Dr. Jensen dafür mir immer neue Denkanstöße und Perspektivenwechsel zu

geben.

Herrn Weißmann für die unermüdlichen Diskussionen und Frau Jensen und Herrn

Sperling für die Hilfe im Labor.

Allen Kollegen herzlichst für die vielen freundschaftlich gemeinsam verbrachten

Stunden in und außerhalb des Labors.

All meinen Freunden und Verwandten, ohne euren Beistand hätte mir wohl manches

Mal der Mut und die Ausdauer gefehlt. Und meinem geliebten Mann Hannes. Mein

ewiger Optimist der mir die Liebe und Geborgenheit schenkt die mich stark macht.

Für meine Großmutter und mich

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Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen ...Untersuchungen+erblich...Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen erblich bedingter Erkrankungen des zentralen