Untersuchungen zur

Transport- und Signalkompetenz

von schweren IgM-Ketten

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Kai-Uwe Herrmann

aus Konstanz

2007

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Universität Erlangen-Nürnberg.

Tag der mündlichen Prüfung: 31. Juli 2007

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. rer. nat. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Hans-Martin Jäck

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Winkler

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1 SUMMARY 1

2 ZUSAMMENFASSUNG 2

3 EINLEITUNG 3

3.1 Die Entwicklung von B-Lymphozyten 3

3.2 Die Entstehung der Antikörpervielfalt 5

3.3 Die Struktur des Prä-BZRs 8

3.4 Der Prä-BZR-Kontrollpunkt 11

3.5 Transport- und Signalkompetenz des Prä-BZRs 13

4 FRAGESTELLUNG 17

5 ERGEBNISSE 18

5.1 Etablierung einer VH-Bibliothek 19

5.2 Untersuchungen zur Transportkompetenz von µH-Ketten 21

5.2.1 Auswahl eines geeigneten Zellkultursystems 21

5.2.2 Expression von µH-Ketten nach retroviraler Transfektion 23

5.2.3 Oberflächentransport von µH-Ketten in An- und Abwesenheit einer SL- und L-Kette 24

5.3 Untersuchungen zur Signalkompetenz von µH-Ketten 32

5.3.1 Signalkompetenz transduzierter µH-Ketten in Anwesenheit der SL-Kette 34

5.3.2 Vergleichende Analyse der Signalkompetenz transduzierter µH-Ketten in An- und Abwesen-heit der SL-Kette 40

5.3.3 Analyse SL-abhängiger und SL-unabhängiger µH-Ketten in vivo 46

5.4 Analyse muriner VH-Regionen 49

5.4.1 Vergleichende Analyse der Verwendung von VH-, D- und JH-Gensegmenten in VH-Regionenvon WT- und λ5-defizienten Mäusen 51

5.4.2 Analyse der CDR-H3 53

5.5 Untersuchungen zur Affinität von VH-Idiotypen zu BiP 58

Inhaltsverzeichnis

II

6 DISKUSSION 61

6.1 Transportkompetenz von µH-Ketten in An- und Abwesenheit einer SL- bzw. L-Kette 62

6.2 Oberflächenexpression und induzierte Prä-BZR-Signale 65

6.3 SL-Ketten abhängige und unabhängige µH-Ketten 68

6.4 Die Affinität zu BiP entscheidet über die Selektion von µH- Ketten 76

6.5 Analyse muriner VH-Regionen 78

7 MATERIAL UND METHODEN 85

7.1 Material 85

7.1.1 Chemikalien und Enzyme 857.1.2 Versuchstiere 857.1.3 Zelllinien und Kulturbedingungen 867.1.4 Antikörper 877.1.5 Plasmide und Konstruktion retroviraler Expressionvektoren 887.1.6 Oligonukleotide 917.1.7 Bakterien 92

7.2 Methoden 92

7.2.1 Zellkulturverfahren 927.2.1.1 Kultivierung und Ernten der Zellen 927.2.1.2 Kryokonservierung von Zellen 937.2.1.3 Auftauen von Zellen 937.2.1.4 Bestimmung der Zelldichte 937.2.1.5 Subklonierung (limiting dilution) 93

7.2.2 Aufreinigung von primären B-Zellen aus dem Knochenmark und der Milz von Mäusen 947.2.2.1 Lyse der Erythrozyten 947.2.2.2 Aufreinigung von CD19+ Knochenmarks- und CD43- Milzzellen 94

7.2.3 Retrovirale Transduktion 957.2.3.1 Gewinnung retroviraler Partikel durch transiente Transfektion von Phoenix-Eco Zellen 957.2.3.2 Retrovirale Transduktion von Zelllinien 957.2.3.3 Retrovirale Transduktion von primären Pro-B-Zellen 96

7.2.4 Durchflusszytometrie 967.2.4.1 Zellsortierung mittels MoFloTM 967.2.4.2 Analyse von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen 967.2.4.3 Bestimmung der Zellzahl primärer B-Zellen mit Flow-Count Fluorespheres 977.2.4.4 Analyse des Kalzium-Einstroms nach Stimulierung B-lymphoider Zellen 97

Inhaltsverzeichnis

III

7.2.5 Molekularbiologische Methoden 987.2.5.1 Präparation von Plasmid-DNA und RNA 987.2.5.2 Isolation genomischer Mausschwanz-DNA 987.2.5.3 Synthese von cDNA 997.2.5.4 DNA/RNA-Konzentrationsbestimmung 997.2.5.5 Restriktionsverdau 997.2.5.6 Alkalische Phosphatase 997.2.5.7 Klenow-Reaktion 997.2.5.8 Ligation von DNA 997.2.5.9 Transformation in E. coli 1007.2.5.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 1007.2.5.11 Agarose-Gelelektrophorese 1017.2.5.12 Extraktion von DNA-Fragmenten 1017.2.5.13 DNA-Sequenzierung 101

7.2.6 Analyse von murinen VH-Regionen 1017.2.6.1 Amplifikation von murinen VH-Regionen 1017.2.6.2 Datenbank- und statistische Analysen 103

7.2.7 Proteinbiochemische Methoden 1047.2.7.1 Erstellung von Zelllysaten 1047.2.7.2 Ko-Immunpräzipitation 1047.2.7.3 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Page 1057.2.7.4 Western Blot-Analyse 106

8 ABKÜRZUNGEN 107

9 LITERATURVERZEICHNIS 110

10 EIGENE PUBLIKATIONEN 121

11 LEBENSLAUF 122

12 DANKSAGUNG 123

Summary

1

1 Summary

The induction of an efficient humoral immune response requires the generation of a highly

diverse repertoire of functional antibodies. During early B cell development, the immature

pre-B cell receptor (pre-BCR) is involved in the selection and clonal expansion of pre-B

cells that produce a functional µ heavy chain (µHC), that is, one capable to pair with an

immunoglobulin (Ig) light chain (LC). The membrane bound pre-BCR consists of two

µHCs associated with two IgLC-like surrogate light chains (SLC) and the signal trans-

duction unit Igα/Igβ. Nascent initially uncomplete folded µHCs are retained in the endop-

lasmatic reticulum (ER) by the heavy chain binding protein (BiP), and SLC was proposed

to be required for enabling the release of functional µHCs from BiP, which leads to the

transport of a pre-BCR to a signaling competent compartment on the surface of pre-B cells.

However, we evinced that, dependent on their unique variable (VH) region (idiotype) func-

tional µHCs isolated from splenic B cells can be divided in two subclasses: 40% could

reach the cell surface and signaling capability only in the presence of a SLC and are there-

fore lost from the antibody repertoire in a SLC-deficient mice; 60% of the µHCs were

transport and signaling competent even in the absence of SLC. While in the presence of

SLC the cell surface density of all functional µHCs was increased and therefore pre-BCR

signals were amplified, co-immunoprecipitation-assays revealed that the affinity of a µHC

to BiP is already determined by its VH idiotype. Hence, the intrinsic attributes of a VH re-

gion (1) determines whether a VH idiotype requires SLC for transport to the cell surface,

(2) and defines its abundance on the cell surface and thus, its representation in the final

antibody repertoire. In contrast, SLC is essential for µHCs that could not reach transport

competence without an interaction partner and amplifies the cell surface density of all

functional µHCs, and thus pre-BCR-mediated duplication of pre-B cells. However, the

intrinsic transport- and signaling competence of a µHC is determined by the affinity of a

VH-idiotype to BiP. Therefore BiP selects the VH-repertoire and determines simultaneously

the frequency of a unique VH idiotype in the IgH-repertoire, whereas SLC shapes the final

antibody repertoire by increasing the combinatorial diversity through the amplification of

pre-B cells with functional µHCs.

Zusammenfassung

2

2 Zusammenfassung

Voraussetzung für eine effiziente humorale Immunantwort ist die Etablierung einer großen

Antikörperdiversität. Während der frühen Entwicklung von B-Zellen nimmt dabei der so-

genannte Prä-B-Zellrezeptor (Prä-BZR) eine entscheidende Funktion bei der Selektion und

klonalen Expansion von Prä-B-Zellen ein, welche funktionelle, d.h. mit leichten (L)-Ketten

paarungsfähige schwere IgM (µH)-Ketten produzieren. Der membranständige Prä-BZR

besteht aus zwei µH-Ketten, zwei kovalent assoziierten surrogaten leichten (SL)-Ketten

sowie der Signaltransduktionseinheit Igα/Igβ. Bisher wurde angenommen, dass alle paa-

rungsfähigen, aber zunächst noch unvollständig gefalteten µH-Ketten im Endoplasmati-

schen Retikulum (ER) von dem Chaperon BiP (heavy chain binding protein) zurück gehal-

ten werden und erst nach der über eine SL-Kette vermittelten Dissoziation von BiP als Prä-

BZR in einem signalkompetenten Kompartiment auf der Zelloberfläche erscheinen. In die-

ser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass funktionelle µH-Ketten in Abhängigkeit von

ihrer variablen (VH) Region (Idiotyp) in zwei Subklassen unterteilt werden können: 40%

der aus Milz-B-Zellen klonierten µH-Ketten benötigten die SL-Kette, um die Zelloberflä-

che zu erreichen, und verhielten sich in Abwesenheit der SL-Kette wie dysfunktionelle

µH-Ketten. 60% der analysierten µH-Ketten waren hingegen sowohl in An- als auch in

Abwesenheit der SL-Kette transport- und auch signalkompetent. Während die SL-Kette die

Oberflächendichte aller funktionellen µH-Ketten erhöhte und dadurch Prä-BZR-Signale

verstärkte, zeigte sich in Immunpräzipitationsstudien, dass die Affinität einer µH-Kette zu

BiP bereits durch den jeweiligen VH-Idiotyp vorgegeben ist. Somit bestimmen die intrinsi-

schen Eigenschaften einer VH-Region, ob ein Idiotyp die SL-Kette zum Transport benötigt,

wie gut er im Vergleich zu anderen Idiotypen auf die Oberfläche transportiert wird und

letztendlich darüber, wie oft er im finalen Antikörper-Repertoire repräsentiert ist. Die SL-

Kette ist dagegen essentiell für µH-Ketten, die ohne Interaktionspartner keine Transport-

kompetenz erreichen können, verbessert aber auch die Transportrate aller funktionellen

µH-Ketten und erhöht dadurch die über den Prä-BZR vermittelte klonale Expansion von

Prä-B-Zellen. Die intrinsische Transport- und Signalkompetenz einer µH-Kette wird hin-

gegen durch die Affinität eines VH-Idiotyps zu BiP bestimmt. BiP selektioniert somit das

Repertoire für VH-Idiotypen und legt gleichzeitig fest, wie häufig bestimmte VH-Idiotypen

im späteren IgH-Repertoire vertreten sind, während die SL-Kette über die Verstärkung der

klonalen Expansion von Prä-B-Zellen mit funktionellen µH-Ketten das finale Antikörper-

Repertoire durch Erhöhung der kombinatorischen Diversität maximiert.

Einleitung

3

3 Einleitung

3.1 Die Entwicklung von B-Lymphozyten

Die Reifungsprozesse in der frühen Entwicklung von B-Zellen bilden die Grundlage für

die Entstehung einer enormen Antikörpervielfalt und sind daher für eine effiziente humora-

le Immunantwort gegen Pathogene und andere Noxen essentiell. Während der Reifung

durchlaufen B-lymphoide Zellen mehrere Entwicklungsstadien, die durch die schrittweisen

Umlagerungen von Immunglobulin (Ig)-Gensegmenten sowie durch die Expression von

Immunglobulinrezeptoren und unterschiedlichen Oberflächenmoleküle gekennzeichnet

sind (Abb. 1; Zusammenfassungen in Osmond et al., 1990; Bradl et al., 2005 und Vetter-

mann et al., 2006).

HSZ frühe späte große kleine unreife

Prä-BZR BZR

D JH VH DJH VDJH

VL JL

Pro-B-Zelle Prä-B-Zelle B Zelle

VDJH VDJH

Knochenmark

VLJL

CD19

c-kit CD25

Rag1/2 Rag1/2

Abb. 1: Die frühe B-Zellentwicklung im murinen Knochenmark. Aufgeführt sinddie einzelnen Differenzierungsstadien, die Umlagerungen der Ig-Gensegmente V, Dund J am Schwer(H)-Ketten- und der VL und JL-Segmente am Leicht(L)-Kettenlokus, die stadienspezifischen Oberflächenmarker, sowie die temporäre Ex-pression der VDJ-Rekombinationsenzyme Rag1 und Rag2. Abkürzungen: Pro, Pro-genitor; Prä, Precursor; BZR: B-Zellrezeptor; CD: Cluster of Differentiation; HSZ:Hämatopoietische Stammzelle

Im adulten Knochenmark entwickeln sich aus pluripotenten hämatopoietischen Stammzel-

len zunächst frühe Pro-B-Zellen (CD19+/c-kit+), deren Immunglobulingensegmente V (Va-

Einleitung

4

riable), D (Diverse) und J (Joining) sich noch in der Keimbahnkonfiguration befinden

(Abb. 1). Durch den temporär synthetisierten und für die weitere B-Zellentwicklung essen-

tiellen Enzymkomplex Rag1/Rag2 (Recombination Activating Gene) erfolgt im Pro-B-

Zellstadium zunächst die Umlagerung eines D- und JH-Segmentes auf beiden Allelen am

Schwer-(H)Ketten-Lokus (Mombaerts et al. 1992; Shinkai et al., 1992; Grawunder et al.,

1995). Das daraus resultierende DJH-Segment wird im Anschluss daran mit einem strom-

aufwärts gelegenen VH-Segment verknüpft, wodurch das Exon für die variable (V)-Region

einer Immunglobulin (Ig) H-Kette gebildet wird. Im Falle einer produktiven VHDJH-

Umlagerung synthetisieren späte Pro-B-Zellen eine H-Kette des Isotyps µ (µHC), welche

als Dimer zusammen mit der sogenannten Ersatz-Leicht-Kette, auch surrogate leichte Ket-

te (SL-Kette) genannt, sowie der Signaltransduktionseinheit Igα/Igβ an die Zelloberfläche

transportiert werden (Karasuyama et al., 1990; Tsubata et al., 1990; Brouns et al., 1993).

Dieser membranständige Komplex wird aufgrund seiner Homologie zum klassischen B-

Zellrezeptor (BZR) als sogenannter Prä-BZR bezeichnet und markiert das Erreichen des

großen Prä-B-Zellstadiums. Das Prä-B-Entwicklungsstadium ist zudem durch die Herun-

terregulierung von c-kit und der Induktion von CD25 charakterisiert. Pro-B-Zellen, die

aufgrund von unproduktiven Umlagerungen entweder keine oder aber eine mit der SL-

Kette nicht-paarungsfähige µH-Kette synthetisieren, können keinen Prä-BZR zusammen

bauen und werden über Apoptose eliminiert (zusammengefasst in Vettermann et al., 2006).

Prä-BZR-Signale dienen zum einen wahrscheinlich dem Aufrechterhalten des sogenannten

Allelausschlusses, der die Synthese eines BZR garantiert und dadurch für jede B-Zelle eine

einzige Antigenspezifität gewährleistet (Wabl et al., 1982; Nussenzweig et al., 1987). Zum

anderen induziert der Prä-BZR von der Zelloberfläche aus eine kurze klonale Expansion

von 4-6 Zellteilungen von sich entwickelnden Prä-B-Zellen (Decker et al., 1991; Rolink et

al., 1993; Kline et al., 1998; Hess et al., 2001). Diese differenzieren anschließend zu klei-

nen, ruhenden Prä-B-Zellen. In diesem Reifestadium wird der zuvor herunterregulierte

Rag1/Rag2-Komplex erneut exprimiert und die Rekombinationsmaschinerie an den L-

Ketten-Lokus verlagert (Grawunder et al., 1995). Hier werden zuerst die VL- und JL-

Segmente des Igκ-Lokus umgelagert. Bei unproduktiven Rekombinationen an beiden κ-

Loci wird der Igλ-Lokus verwendet (Moore et al., 1985; Reth et al., 1987). Eine erfolgrei-

che Umlagerung ermöglicht hingegen die Synthese einer L-Kette, die zusammen mit der

bereits vorhandenen µH-Kette als BZR an der Zelloberfläche exprimiert werden kann. Be-

vor die IgM-positiven unreifen B-Zellen das Knochenmark verlassen, werden sie auf die

Einleitung

5

Spezifität des von ihnen exprimierten BZR hinsichtlich Autoreaktivität negativ selektio-

niert. Selbstreaktive unreife B-Zellen werden eliminiert, anergetisiert oder können über die

Editierung des BZRs (Receptor Editing) die Spezifität ihrer Antigenbindestelle verändern

(Lu et al., 1997; Tiegs et al., 1993; zusammengefasst in Edry et al., 2004).

Positiv selektionierte unreife B-Zellen wandern über die Blutbahn in die peripheren lym-

phatischen Organe wie Lymphknoten und Milz und entwickeln sich bis zum Kontakt mit

ihrem spezifischen Antigen zu IgM+/IgD+ naiven B-Zellen (Bourgois et al., 1977). Nach

Antigenkontakt durchlaufen B-Zellen wieder eine klonale Expansionsphase, bevor sie je

nach Antigen und vorhandener T-Zellhilfe in Gedächtnis-B-Zellen oder Antikörper-

sezernierende Plasmazellen differenzieren.

3.2 Die Entstehung der Antikörpervielfalt

Sowohl die Maus als auch der Mensch sollten aufgrund ihrer enormen Antikörpervielfalt

von bis zu 1012 verschiedenen Kombinationen in der Lage sein, jedes Antigen zu erkennen

und eine humorale Immunantwort einzuleiten. Die Antikörpervielfalt wird durch mehrere

Prozesse innerhalb der frühen B-Zellentwicklung gewährleistet. Dabei bilden zufällig aus-

gewählte VH-, D- und JH-Segmente am IgH-Lokus sowie VL- und JL-Segmente am IgK-

Ketten-Lokus die Basis für die sogenannte rekombinatorische Diversität (Tab. 1; zusam-

mengefasst in Bassing et al., 2002).

Lokus Segment Maus Mensch

IgH VH 97 39-46

D 14 27

JH 4 6

IgLκ VLκ 94-96 40

JLκ 4 5

IgLλ VLλ 3 30-33

JLλ 3 4

Tab. 1: Vergleich der Anzahl bekannter V-, D- und J-Segmente zwischen Mausund Mensch.Quelle: http://imgt.cines.fr/textes/IMGTposters/IMGC_IG.html und http://imgt.cines.fr/textes/IMGTeducation/Tutorials/IGandBcells/_UK/Synthesis/

Einleitung

6

Dieses zufällige Rearrangement von Ig-Gensegmenten wird durch den temporär exprimier-

ten Enzymkomplex Rag1/Rag2 initiiert und führt im Fall einer produktiven Umlagerung,

d.h. ohne Auftreten eines vorzeitigen Translations-Stop-Kodons, zur Synthese einer H-

Kette vom µ-Isotyp (µH-Kette). Limitiert wird die spätere Antikörperdiversität jedoch

durch eine begrenzte Anzahl rearrangierbarer Gensegmente (Tab. 1). Das durch die Re-

kombination verschiedener Ig-Gensegmente generierte Repertoire wird zusätzlich durch

die Aktivität des Enzyms Terminale Desoxynucleotidyl Transferase (TdT) während des

Verknüpfungsprozesses der Ig-Gensegmente erhöht (Komori et al., 1993). Dabei können

durch TdT nicht-keimbahnkodierte Nukleotide (N-Nukleotide) vor dem Ligieren der Ig-

Gensegmente hinzugefügt oder während dieses Prozesses auch entfernt werden. Weiterhin

können die D-Segmente im Gegensatz zu den V- und J-Gensegmenten in allen drei Lese-

rastern verwendet werden. Schließlich wird durch die zufällige Prozessierung der am ko-

dierenden Ende durch Rag1/2 erzeugten Haarnadelschleife über die Bildung sogenannter

Palindrom-Nukleotide (P-Nukleotide) die spätere Variabilität weiter erhöht. Diese Prozes-

se werden zusammengefasst auch als Verknüpfungsdiversität bezeichnet (Abb. 2).

P N

tgtgcaaga tgggttactacggc...t cc ....ccttgactactgg

.......ctacggc... gt .........actactggtgtgcaaga tcgg

VHWTII.99

VHWTII.100

C A R L G Y Y G P L D Y W

C A R S A T A Y Y W

VH1 D1-2 JH2N

Position: 104 118

Position: 104 118

Abb. 2: Die CDR-H3 als Schlüsselfaktor hinsichtlich Variabilität und Antigen-spezifität. Dargestellt sind exemplarisch zwei Verknüpfungssequenzen (CDR-H3)am IgH-Lokus als Nukleotid- und Aminosäuresequenz mit gleicher Rekombinations-aber unterschiedlicher Verknüpfungsdiversität. Durch die Deletion von Keimbahn-nukleotiden (.), dem Einfügen von N-Nukleotiden (N) sowie der Generierung von P-Nukleotiden (P) wird die Antikörpervariabilität drastisch erhöht, die spätere Amino-säuresequenz der CDR-H3 maßgeblich verändert und dadurch die jeweilige Antigen-spezifität beeinflusst. Die Aminosäuresequenz der CDR-H3 ist nach der IMGT-Definition umrahmt. Aufgeführt sind die über eine Datenbankanalyse nachgewieseneZugehörigkeit des V-Gensegmentes zu einer VH-Familie sowie die verwendeten D-und JH-Segmente.

Einleitung

7

Dadurch kommt es zu einer drastischen Erhöhung der Antikörperdiversität, die sich am

deutlichsten in der sogenannten Complementarity Determining Region 3 der schweren Ket-

te (CDR-H3) widerspiegelt. Diese ist das direkte Produkt der rearrangierten VH-, D- und

JH-Segmente, einschließlich deletierter und hinzugefügter N- bzw. P-Nukleotide, und be-

sitzt aufgrund dessen die höchste Variabilität innerhalb des Antikörper-Repertoires. Die

CDR-H3 nimmt jedoch nicht nur eine zentrale Position innerhalb der späteren Antigenbin-

destelle ein und prägt somit die jeweilige Antigenspezifität und dadurch den Idiotyp eines

Antikörpers, sondern kann dessen Funktionalität hinsichtlich Faltbarkeit und Paarungsfä-

higkeit mit einer L-Kette negativ beeinflussen. (Kline et al., 1998; Xu et al., 2000; Martin

et al., 2003; Collis et al., 2003; Barrios et al., 2004).

Durch das zufällige und ungenaue Verknüpfen von V-, D- und J-Keimbahngensegmenten

kann zwar die rekombinatorische und die Verknüpfungsdiversität erhöht und somit eine

maximale Variabilität des Antikörper-Repertoires gewährleistet werden; gleichzeitig führt

dieser Prozess aber auch zu einem hohen Ausschuss von Pro-B-Zellen, die entweder gar

keine oder eine nicht-paarungsfähige µH-Kette produzieren. So kommt es bei 2/3 aller

Rearrangements zu einem zufallsbedingten Verschieben des Leserasters und einem damit

verbundenen Auftreten vorzeitiger Translations-Stop-Kodons. Das verbleibende Drittel an

Pro-B-Zellen kann zwar aufgrund eines produktiven Rearrangements eine µH-Kette ex-

primieren, etwa 50% dieser Ketten können aber weder mit einer SL-Kette noch mit einer

klassischen L-Kette paaren. Diese Zellen gehen daher ebenfalls verloren (Huetz et al.,

1993; Keyna et al., 1995; ten Boekel et al., 1997; Kline et al., 1998). Die klonale Expansi-

on großer Prä-B-Zellen, die eine mit L-Kette paarungsfähige µH-Kette produzieren, dient

somit zum einen zum Ausgleich des Verlustes von B-Zellen während der frühen Entwick-

lung (Decker et al., 1991; Rolink et al., 1993; Hess et al., 2001). Zum anderen wird jeder

der expandierten VH-Idiotyp-identischen Prä-B-Zell-Klone nach einer erfolgreichen Umla-

gerung des IgL-Lokus eine andere L-Kette und dadurch eine andere BZR-Spezifität erzeu-

gen. Somit ist die klonale Expansion funktioneller Prä-B-Zellen neben der kombinatori-

schen, rekombinatorischen und Verknüpfungsdiversität ein weiterer wichtiger Mechanis-

mus, um die Vielfalt des Antikörper-Repertoire zu erhöhen (Abb. 3).

Durch die klonale Expansion können somit bis zu 64 unreife B-Zellen mit zwar gleicher

IgH- aber unterschiedlichen L-Ketten entstehen. Da letztendlich die jeweilige Antigenspe-

zifität aus dem Zusammenwirken einer H- und L-Kette resultiert, vervielfältigt die klonale

Einleitung

8

Expansion und die damit verbundene Erhöhung der kombinatorischen Diversität das späte-

re Antikörper-Repertoire um ein Vielfaches.

Prä-BZR

BZR

VDJH

VL JL

VDJH VDJH

VLJL

große kleine unreife

Prä-B-Zelle B Zelle

Abb. 3: Schematische Darstellung der klonalen Expansionsphase und der dar-aus resultierenden Erhöhung der kombinatorischen Diversität. Große Prä-B-Zellen mit einem funktionalen Rearrangement des IgH-Lokus werden durch Prä-BZR-Signale klonal expandiert. Alle Zellen im daraus resultierenden Klon rearran-gieren im kleinen Prä-B-Zellstadium unabgängig voneinander den IgL-Lokus, wo-durch es zu einer drastischen Erhöhung der kombinatorischen Diversität und somitder Antikörpervielfalt kommt.

3.3 Die Struktur des Prä-BZRs

Ein Prä-BZR setzt sich aus einem Homodimer, bestehend aus zwei µH-Ketten, zusammen

(Abb. 4). Beide µH-Ketten sind dabei jeweils mit einer SL-Kette assoziiert (Pillai et al.,

1987; Tsubatha et al., 1990). Diese besteht aus den beiden nicht-kovalent miteinander ver-

bundenen Untereinheiten λ5 und VpreB (Kudo et al., 1987; Karasuyama et al., 1990;).

Zusätzlich verfügt der Prä-BZR über die Signaltransduktionseinheit Igα/Igβ, die Signale

über die Rekrutierung von Signalmolekülen an die sogenannten Immunoreceptor-tyrosine

based activation motifs (ITAM) im Igα/Igβ ins Zellinnere weiterleiten (Hombach et al.,

1988; Brouns et al., 1993; zusammengefasst in Clark et al., 2005).

Einleitung

9

μHC

Igα/β

5

VpreB

UTSLC

Cµ1

Cµ2

Cµ3

Cµ4

VH

ITAM

Abb. 4: Hypothetische Struktur des Prä-BZRs. Der Prä-BZR setzt sich aus einemµH-Ketten-Dimer zusammen, welches mit zwei SL-Ketten über Disulfidbrücken as-soziiert ist. Letztere bestehen jeweils aus den beiden nicht-kovalent assoziierten Un-tereinheiten VpreB und λ5, die beide sowohl Ig-ähnliche als auch nicht-Ig-ähnlicheDomänen, sogenannte unique tails (UT), besitzen. Die Transduktionseinheit Igα/Igβübermittelt über die ITAM-vermittelte Rekrutierung von Adaptoren und Enzymendie Signale des Prä-BZRs ins Zellinnere. Abkürzungen: Cµ1-4: konstante Regionen;VH: variable Region; ITAM: Immunoreceptor Tyrosin-based Activation Motif.

Die nur im Pro- und Prä-B-Zellstadium exprimierte, invariante SL-Kette weist eine hohe

strukturelle Ähnlichkeit zu der erst im weiteren Entwicklungsverlauf entstehenden konven-

tionellen L-Kette auf. So zeigten Computersimulationen, dass VpreB eine starke Ähnlich-

keit zur variablen Domäne einer L-Kette besitzt, während λ5 der konstanten Region einer

λL-Kette gleicht (Lanig et al., 2004; Bankvich et al., 2007) entspricht. λ5 ist über eine Di-

sulfidbrücke kovalent mit der Cµ1-Domäne der µH-Kette assoziiert und komplementiert

mit einem zusätzlichen β-Strang die Faltung von VpreB zu einer Ig-Domäne (Guelpa-

Fonlupt et al., 1994; Melchers, 1999; Lanig et al., 2004; zusammengefasst in Vettermann

et al., 2006; Bankvich et al., 2007). Im Gegensatz zu einer konventionellen L-Kette tragen

λ5 am C-terminalen und VpreB am N-terminalen Ende sogenannte unique tails, die keiner-

lei Homologie zu bekannten Ig-Domänen besitzen (Sakaguchi et al., 1986). Der 21 Ami-

nosäuren lange unique tail von VpreB weist dabei eine negative Ladung auf, der 50 Ami-

nosäuren lange unique tail von λ5 ist hingegen positiv geladen. Die Funktion dieser Re-

gionen wird kontrovers diskutiert. Obwohl sie für eine Assemblierung der SL-Kette nicht

Einleitung

10

von Bedeutung sind (Minegishi et al., 1999), scheinen sie jedoch für die effiziente Signal-

initiierung durch den Prä-BZR unerlässlich zu sein (Melchers, 2005; C. Vettermann et al.,

unveröffentliche Befunde). Unklar ist jedoch, ob diese Signalverstärkung durch Bindung

der unique tails an einen externen Liganden auf Knochenmark-Stromazellen (Bradl et al.,

2001 & 2003; Gauthier et al., 2002; Rossi et al., 2006) oder über Homoaggregation des

Prä-BZRs, also einem Prä-B-Zellen autonomen Mechanismus, geschieht (Ohnishi et al.,

2003; Bankovich et al., 2007).

Eine µH-Kette setzt sich aus einer variablen und einer konstanten Region zusammen. Die

konstante IgM-Domäne lässt sich in vier Domänen (Cµ1-4) unterteilen und bestimmt spä-

ter die Effektorfunktion des IgM-Antikörpers. Durch das Vorkommen einer zusätzlichen

Transmembrandomäne von ca. 25 Aminosäuren in der Cµ4-Region kann der Prä-BZR

ebenso wie der spätere BZR im Gegensatz zu sezernierten Antikörpern auf der Zellober-

fläche von B-Zellen exprimiert werden (Rogers et al., 1980). Die VH-Region ist hingegen

das Produkt der Verknüpfung von zufällig gewählten VH-, D- und JH-Gensegmenten wäh-

rend des Rekombinationsprozesses im Pro-B-Zellstadium. Im späteren BZR bildet sie zu-

sammen mit der VH-Region der im kleinen Prä-B-Zellstadium rearrangierten L-Kette die

spezifische Antigenbindestelle (Paratop) des Antikörpers aus. Sowohl die VH-Region einer

H- als auch einer L-Kette lassen sich in drei hoch variable Regionen (CDR1-3) (Kirkham

et al., 1994) und vier eher konservierte Gerüstregionen unterteilen. CDR1 und 2 werden

jedoch durch die Keimbahnsequenz des rearrangierten V-Segmentes festgelegt und zeigen

daher eine geringere Variabilität als die CDR3 (siehe dazu auch Kapitel 3.2). Die struktu-

relle Integrität der VH-Region wird durch vier Gerüstregionen (engl.: frame work regions)

gewährleistet. Sie dienen in erster Linie zur Ausbildung einer stabilen Struktur für die ei-

gentliche Antigenbindestelle, welche sich aus den CDR1-3 der H- und der L-Kette zu-

sammensetzt. Aufgrund ihrer hohen Variabilität sowie ihrer zentralen Position innerhalb

der Antigenbindestelle übernehmen die CDR3 der H- und L-Kette eine dominierende Be-

deutung für die jeweilige Antigenspezifität eines Ig-Rezeptors (Collis et al., 2003; Barrios

et al., 2004). Computerunterstützte Strukturanalysen des Prä-BZRs zeigten, dass die uni-

que tails der SL-Kette an der Stelle der späteren Position der CDR3 der L-Kette herausra-

gen und sich in direkter Nähe zur CDR-H3 befinden (Lanig et al., 2004; Bankovich et al.,

2007).

Einleitung

11

3.4 Der Prä-BZR-Kontrollpunkt

Zur Etablierung einer effizienten humoralen Immunantwort ist der Prä-BZR Teil eines

wichtigen Kontrollpunktes und fungiert dabei als „Ausweis“ für Prä-B-Zellen, die eine

funktionelle, d.h. mit einer L-Kette paarungsfähigen µH-Kette produzieren (Melchers et

al., 2000; zusammengefasst in Burrows et al., 2002 und Vettermann et al., 2006). Da die

Rekombination der Ig-Gensegmente ein gewollt zufälliger Prozess ist, können neben Prä-

B-Zellen mit funktionellen auch solche mit dysfunktionellen µH-Ketten entstehen (Huetz

et al., 1993; Keyna et al., 1995; ten Boekel et al., 1997). Den Prä-BZR-Kontrollpunkt kön-

nen jedoch ausschließlich späte Pro-B-Zellen passieren, die eine funktionelle µH-Kette

produzieren. Zellen mit einem unproduktiven oder dysfunktionellen Rearrangement der

VDJ-Gensegmente werden hingegen durch Apoptose eliminiert. Verschiedene Studien mit

Knockout (KO)- und transgenen (tg) Mäusen unterstreichen dabei die essentielle Bedeu-

tung der einzelnen Komponenten des Prä-BZR-Komplexes. So weisen Rag1-/-- und Rag2-/--

Mäuse, die also keine VDJ-Umlagerung durchführen können, eine vollständige Arretie-

rung der B-Zellentwicklung im Pro-B-Zellstadium auf (Mombaerts et al., 1992; Shinkai et

al., 1992). Transgene Mäuse, die ausschließlich eine dysfunktionelle µH-Kette exprimie-

ren, können ebenfalls den Prä-BZR-Kontrollpunkt nicht passieren und werden eliminiert

(Kline et al., 1998). Einen kompletten Block der weiteren B-Zellentwicklung zeigen auch

Mäuse mit einer deletierten IgM-Membrandomäne (Kitamura et al., 1991), Mäuse denen

die JH-Gensegmente fehlen (Chen et al., 1993) sowie Mäuse mit einer Mutation in den

ITAMs der Signaltransduktionseinheit Igα/β (Gong et al., 1996; Kraus et al., 2001; Reich-

lin et al., 2001).

Mäuse, die defizient für die SL-Ketten-Komponenten VpreB und λ5 sind, zeigen hingegen

einen unvollständigen Arrest, da sich hier trotzdem reife Milz-B-Zellen, wenn auch mit

deutlich verringerter Frequenz als in Wildtyp (WT) Mäusen, entwickeln können (Kitamura

et al., 1992; Martensson et al., 1999; Mundt et al., 2001; Shimizu et al., 2002). Diese Ent-

wicklungsstörung umfasst eine ca. zweifach erhöhte Zahl an Pro-B-Zellen, während sich

das periphere B-Zellkompartiment erst mit zunehmendem Alter der SL-Ketten-defizienten

Mäuse auf bis zu 50% dem einer WT-Maus annähert. Trotz dieser verminderten B-Zellzahl

zeigten Untersuchungen, dass reife B-Zellen in einer λ5-defizienten Maus prinzipiell so-

wohl zu einer T-Zell-abhängigen als auch T-Zell-unabhängigen Immunantwort in der Lage

sind (Harfst et al., 2005). Neuere Studien unter anderem aus unserem Labor zeigten, dass

Einleitung

12

die in SL-Ketten-defizienten Mäusen nachgewiesene deutliche Reduktion der peripheren

B-Zellzahl in erster Linie auf eine ausbleibende Proliferationsphase von Prä-B-Zellen zu-

rückzuführen ist. Wieso SL-Ketten-defiziente Mäuse überhaupt B-Zellen generieren kön-

nen, wurde unter anderem durch Arbeiten aus unserem Labor geklärt. Diese Untersuchun-

gen zeigten, dass Pro-B-Zellen, die eine transgene µH-Kette produzieren, auch in Abwe-

senheit einer L-Kette den Prä-BZR-Kontrollpunkt passieren können (Schuh et al., 2003;

Galler et al., 2004). Ob diese Eigenschaft auch auf andere funktionelle µH-Ketten über-

tragbar ist, war Gegenstand dieser Promotionsarbeit.

Die durch den Prä-BZR induzierte klonale Expansionsphase endet nach 4-6 Zellteilungen

(Rolink et al., 1994; Karasuyama et al., 1994). Aufgrund dieser klonalen Proliferations-

phase ist die Anzahl an Prä-B-Zellen in einer Maus 5-7mal höher als die Pro-B-Zellzahl

(Loffert et al., 1994), wodurch es letztlich zu einer drastischen Erhöhung der kombinatori-

schen Diversität von schweren und leichten Ketten kommt. Zusätzlich konnte gezeigt wer-

den, dass Signale des Prä-BZRs die Herunterregulierung der SL-Komponenten λ5 und

VpreB initiieren (Parker et al., 2005). Man vermutet daher eine Verbindung in Form eines

negativen Rückkopplungsmechanismus zwischen den von der Zelloberfläche kommenden

Prä-BZR-Signalen, dem Ausbleiben der Expression von λ5 und VpreB und der damit ver-

bundenen Beendigung der Präsentation des Prä-BZRs an der Zelloberfläche sowie dem

Abbruch der klonalen Expansionssignale. Neben Proliferationssignalen führt ein funktio-

nelles Rearrangement der VDJ-Segmente aber auch zur Initiierung von Signalen zur He-

runterregulierung der Expression von Rag1/Rag2 (Grawunder et al., 1995; Galler et al.,

2004). Dieser Sachverhalt steht in engem Zusammenhang mit dem sogenannten Allelaus-

schluss, durch den nur identische Ig-Rezeptoren mit gleicher Antigenspezifität auf der

Oberfläche einer reifen B-Zelle exprimiert werden. Ein möglicher Mechanismus dabei ist,

dass eine funktionelle µH-Kette Signale auslöst, durch die weitere Rearrangements am

IgH-Lokus unterbunden werden (Feedback-Modell nach Jung et al., 2006). Ob die µH-

Kette dazu auch die Zelloberfläche erreichen muss oder Signale bereits aus dem endo-

plasmatischen Retikulum (ER) auslöst, ist noch nicht geklärt. Zusätzlich scheinen Prä-

BZR-Signale auch bei der Umlagerung der Rekombinationsmaschinerie sowie bei der Ak-

tivierung des IgL-Lokus beteiligt zu sein (Reth et al., 1987; Tsubata et al., 1992; zusam-

mengefasst in Geier et al., 2006; Schuh et al., 2007, in press).

Einleitung

13

3.5 Transport- und Signalkompetenz des Prä-BZRs

Voraussetzung für eine effiziente Differenzierung von Pro- zu Prä-B-Zellen ist die produk-

tive Umlagerung der VH-, D- und JH-Gensegmente und die darauffolgende Expression ei-

ner funktionellen, d.h. mit L-Ketten paarungsfähigen µH-Kette. Neu translatierte µH-

Ketten werden zunächst von dem sogenannten heavy chain binding protein (BiP oder auch

GRP78) gebunden, einem Chaperon, welches unvollständig gefaltete Ig-Ketten im ER zu-

rückhält. Dabei hält BiP alle µH-Ketten über ihre noch unvollständig gefaltete Cµ1- und

VH-Regionen zurück (Haas et al., 1983; Hendershot et al., 1988; Lee et al., 1999;). Erst die

Paarung mit einer SL-Kette bzw. in späteren Reifestadien mit einer konventionellen L-

Kette löst diesen Rückhaltemechanismus und führt zu einer korrekten Faltung der Im-

munglobulindomänen, was den Zusammenbau eines Ig-Rezeptors und den Transport in ein

signalkompetentes Kompartiment auf der Zelloberfläche zur Folge hat (Hendershot, 1990;

Lee et al., 1999; Vanhove et al., 2001; Abb. 5).

Abb. 5: BiP-vermittelter Retentionsmechanismus von H-Ketten. Das ChaperonBiP (B) bindet an die ungefaltete Cµ1- und VH-Region von µH-Ketten und hält dieseim ER zurück. Der Oberflächentransport in ein signalkompetentes Kompartiment er-folgt erst nach Ablösung von BiP durch eine SL- bzw. L-Kette und der korrektenFaltung der Immunglobulindomänen. Allerdings wurde eine transgene µH-Kette be-schrieben, die auch ohne Anwesenheit einer kompletten SL- und L-Kette die Zell-oberfläche erreicht (Schuh et al., 2003; Galler et al., 2004). Ob diese Eigenschaft je-doch auch auf alle VH-Idiotypen zutrifft, ist bisher noch nicht bekannt.

Im Gegensatz dazu ist es dysfunktionellen µH-Ketten, die weder mit einer SL- noch mit

einer L-Kette paaren, nicht möglich, sich von BiP zu lösen und sie verbleiben daher im

ER. Da bis zu 60% der neu gebildeten µH-Ketten nicht mit einer L-Kette paaren können,

ist diese Selektion ein entscheidender Mechanismus zur Optimierung der Qualität des spä-

teren Antikörper-Repertoires (ten Boekel et al., 1997; zusammengefasst in Vettermann et

al., 2006). Sich entwickelnde B-Zellen, die eine dysfunktionelle µH-Kette exprimieren,

Einleitung

14

werden im weiteren Verlauf wahrscheinlich durch die Akkumulierung ungepaarter Protei-

ne im ER und die damit verbundene Induktion einer ER-Stressantwort, dem sogenannten

Unfolded Protein Response (UPR)-Weg, eliminiert (Kohler, 1980; Meister, 2004). Die

Paarungsfähigkeit einer µH-Kette mit einer SL- bzw. L-Kette wird dabei offensichtlich

von der VH-Region maßgeblich beeinflusst. So zeigen insbesondere µH-Ketten mit einem

VH81X-Segment, einem Mitglied der VH5-(VH7183) Familie, sehr häufig die Eigenschaft,

nicht paarungsfähig zu sein (Huetz et al., 1993; Keyna et al., 1995; Martin et al., 2003). In

diesem Zusammenhang konnte zusätzlich in einem transgenen Mausmodell gezeigt wer-

den, dass eine paarungsunfähige VH81X-µH-Kette keine Differenzierungssignale initiieren

und somit auch nicht die Entwicklung von B-Zellen voran treiben konnte (Kline et al.,

1998).

In klarem Widerspruch zum gängigen Paradigma des Rückhaltemechanismus von funktio-

nellen µH-Ketten durch BiP stehen jedoch die Erkenntnisse aus den bereits vorgestellten

SL-defizienten Mausmodellen (Kitamura et al., 1992; Martensson et al., 1999; Mundt et

al., 2001; Shimizu et al., 2002). Hier konnten µH-Ketten auch ohne Anwesenheit einer SL-

Kette den Prä-BZR-Kontrollpunkt passieren, wodurch in der Peripherie funktionelle B-

Zellen nachweisbar waren. Dies ist insofern eine Überraschung, da gezeigt werden konnte,

dass die Signalinitiation des Prä-BZRs über die Aktivierung von Igα nicht aus dem ER,

sondern von einem Kompartiment aus dem trans-Golgi-Apparat (Guloglu et al., 2006) oder

von der Zelloberfläche erfolgen muss (Mielenz et al., 2003). Die Untersuchungen an µMT-

Mäusen unterstützen dabei dieses Modell. Durch die Deletion der Transmembrandomäne

konnten die hier exprimierten µH-Ketten nicht in die Zelloberflächenmembran eingebun-

den werden, was zu einem vollständigen Arrest der B-Zellentwicklung im Pro-B-

Zellstadium führte (Kitamura et al., 1991). Zusätzlich zeigte die Assoziation der zytoplas-

matischen Domänen von Igα/β mit der inneren Zellmembranseite, dass dadurch eine weite-

re B-Zellentwicklung ermöglicht wird (Bannish et al., 2001). Durch diese Befunde und

dem Vorhandensein von B-Zellen in der Peripherie SL-defizienter Mäuse zeichnet sich

daher eine SL-unabhängige Vermittlung der Transportkompetenz von µH-Ketten ab. Ein

alternativer Mechanismus zur Rettung µH-Ketten-positiver Prä-B-Zellen in Abwesenheit

einer SL-Kette wäre beispielsweise durch eine vorzeitige Umlagerung der Gensegmente

des L-Kettenlokus erklärbar. Die daraus resultierende L-Kette kann daher auch in Abwe-

senheit einer SL-Kette als Bindungspartner die korrekte Faltung von µH-Ketten bewirken,

deren Oberflächentransport vermitteln und somit den Phänotyp SL-defizienter Mäuse er-

Einleitung

15

klären (Karasuyama et al., 1994; Pelanda et al., 1996). Dieses Modell konnte jedoch unter

anderem durch Befunde in unserem Labor in einer Rag2- und λ5-defizienten Maus, die

eine transgene µH-Kette exprimiert, widerlegt werden (Schuh et al., 2003; Galler et al.,

2004). Die hier exprimierte µH-Kette war ohne Faltungspartner nicht nur an der Zellober-

fläche nachweisbar, sondern konnte auch Differenzierungs- und Proliferationssignale so-

wie die Herunterregulierung der Rag-Expression induzieren. Unklar war jedoch, ob die

Eigenschaft eines autonomen Oberflächentransports der transgenen µH-Kette Sp6 auch auf

alle anderen paarungsfähigen µH-Ketten übertragbar ist. Diese Frage sollte deshalb in der

vorliegenden Arbeit beantwortet werden.

Unklar in diesem Zusammenhang ist jedoch, wie sich µH-Ketten in Abwesenheit einer SL-

bzw. L-Kette überhaupt von BiP lösen können. Denkbar wäre, dass ein nicht identifizierter

Interaktionspartner wie das von Melchers 2005 postulierte Protein-X diese Funktion über-

nimmt. Alternativ könnten auch Proteine mit einer oder mehreren Ig-Domänen wie

VpreB3 oder BILL-Cadherin Transportkompetenz ermöglichen (Ohnishi et al., 1994; Mel-

chers, 2005). VpreB3 besitzt eine Homologie von 37% zu VpreB1 und wird vorwiegend in

Prä-B-Zellen exprimiert (Rosnet et al., 1999), während BILL-Cadherin dagegen auf Pro-

und unreifen B-Zellen nachweisbar ist (Ohnishi et al., 2005). Letzteres wird in Assoziation

mit λ5, VpreB1 oder VpreB2 auf der Zelloberfläche exprimiert und wird auch als soge-

nannter Pro-BZR bezeichnet. Ebenfalls diskutiert werden vorzeitig translatierte Vκ- oder

JκCκ-Keimbahntranskripte, deren Vorkommen bisher jedoch nur in humanen B-Zellen

nachgewiesen wurde (McKeller et al., 2006). Eine andere mögliche Erklärung für eine SL-

unabhängige Transportkompetenz von µH-Ketten wäre, dass die VH-Region, vergleichbar

zu den Erkenntnissen bezüglich der dysfunktionellen µH-Ketten, die Affinität zu BiP ent-

scheidend beeinflusst. In diesem Fall sollten verschiedene funktionelle µH-Ketten unter-

schiedlich stark an der Oberfläche exprimiert werden. Dass VH-Regionen tatsächlich das

Ausmaß des Oberflächentransportes und die damit verbundene Stärke des Prä-BZR-

Signals und das Ausmaß der klonalen Expansion beeinflussen, konnte kürzlich gezeigt

werden (Kawano et al., 2006). Ob dieser Mechanismus jedoch auf die unterschiedliche

Interaktion einer funktionellen µH-Kette mit der SL-Kette zurückzuführen ist oder dabei

unterschiedliche Affinitäten einer VH-Region zu BiP eine ausschlaggebende Rolle spielen,

ist noch nicht geklärt. Daher sollte in der hier vorliegenden Arbeit die Transportkompetenz

verschiedener paarungsfähiger µH-Ketten sowohl in An- als auch in Abwesenheit von SL-

und L-Ketten durchflusszytometrisch in einem Zellkulturansatz untersucht werden. Über

Einleitung

16

Ko-Immunpräzipitationsstudien sollte zugleich die Affinität verschiedener µH-Ketten zu

BiP ebenfalls in einem SL- und L-Ketten-freien System untersucht werden.

Die verminderte Zahl von B-Zellen in der Peripherie SL-defizienter Mäuse wird in erster

Linie auf eine ausbleibende Proliferationsphase von Prä-B-Zellen zurückgeführt (Kitamura

et al., 1992; Martensson et al., 1999; Rolink et al., 2000; Mundt et al., 2001; Shimizu et

al., 2002). Dahingehend wird vermutet, dass funktionelle µH-Ketten alleine bereits in der

Lage sind, Differenzierungssignale für eine weitere B-Reifung zu induzieren, während die

Einleitung einer effizienten klonale Expansion von der Assemblierung eines vollständigen

Prä-BZRs abhängig ist (C. Vettermann et al., unpublizierte Beobachtung). Um zu überprü-

fen, ob µH-Ketten, die auch ohne SL-Ketten die Zelloberfläche erreichen (sogeannte SL-

Ketten-unabhängige µH-Ketten), tatsächlich funktionell und signalkompetent sind, wurde

neben der Analyse des Oberflächentransports auch deren Signalkapazität sowohl in An- als

auch in Abwesenheit von SL- und L-Ketten untersucht. Von besonderer Bedeutung war

dabei, inwieweit es eine Korrelation der induzierten Signalstärke mit der Menge der an der

Zelloberfläche exprimierten µH-Kette gibt und wie die SL-Kette dieses Verhältnis beein-

flusst.

Fragestellung

17

4 Fragestellung

Eine entscheidende Rolle in der frühen B-Zellentwicklung spielen Signale des nur in Prä-

B-Zellen exprimierten Prä-B-Zellrezeptors (Prä-BZR). Dieser membranständige Komplex

besteht aus zwei µH-Ketten, welche mit zwei SL-Ketten, bestehend aus den Untereinheiten

λ5 und VpreB, sowie der Signaltransduktionseinheit Igα/β verbunden sind. Voraussetzung

für den Transport des Prä-BZRs in ein signalkompetentes Kompartiment an der Zellober-

fläche ist die Ablösung der µH-Kette von dem sogenannten heavy chain binding protein

(BiP), einem Chaperon, welches unvollständig gefaltete Ig-Ketten im Endoplasmatischen

Retikulum (ER) zurückhält. Nachgewiesen wurde bereits, dass BiP an die erste konstante

Domäne von H-Ketten bindet und, damit Ig-Rezeptoren Transportkompetenz erreichen

können, wieder abgelöst werden muss. Im Prä-B-Zellstadium übernimmt diese Funktion

die SL-Kette. Überraschenderweise zeigten neuere Befunde, dass eine transgene µH-Kette

jedoch auch in Abwesenheit einer SL-Kette nicht nur die Zelloberfläche erreicht, sondern

darüber hinaus Proliferations- und Differenzierungssignale induziert. Unklar ist jedoch, ob

es sich hier um eine generelle Eigenschaft aller µH-Ketten handelt oder ob nur eine spe-

zielle, nur wenige µH-Ketten umschließende Subgruppe autonome Transportkompetenz

erreichen kann. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, die Frequenz transportautonomer

und signalkompetenter µH-Ketten zu bestimmen. Dazu sollte in einem Zellkultursystem

zunächst die Transportkompetenz verschiedener µH-Ketten mittels Durchflusszytometrie

in Abwesenheit von SL- und L-Ketten bestimmt werden. Im weiteren Verlauf sollte außer-

dem die Signalkapazität im Verhältnis zur Oberflächendichte von µH-Ketten in An- und

Abwesenheit von der SL-Kette sowohl in vitro als auch in vivo untersucht werden. Die

verwendeten µH-Ketten wurden dabei zufällig aus zwei zu Beginn dieser Arbeit aus der

Milz von WT- und λ5-defizienten Mäusen etablierten Bibliotheken variabler Regionen

(VH) gewählt. Eine vergleichende Sequenzanalyse der klonierten µH-Ketten sollte zusätz-

lich eine mögliche Korrelation zwischen einem SL-Ketten-autonomen Oberflächentrans-

port sowie der spezifischen Aminosäurezusammensetzung der VH-Region aufzeigen. Des-

weiteren sollten Ko-Immunpräzipitations-studien zeigen, ob die VH-Region die Affinität

einer µH-Kette zu BiP beeinflusst. Sollte dies zutreffen, würde die Stärke der Interaktion

zwischen einer VH-Region und BiP das Ausmaß der Oberflächenrepräsentation des Prä-

BZRs und somit den Beitrag eines VH-Idiotypen im späteren Antikörper-Repertoire be-

stimmen.

Ergebnisse

18

5 Ergebnisse

Der Prä-BZR dient als Ausweis für frühe funktionelle Prä-B-Zellen, den Prä-BZR-

Kontrollpunkt zwischen dem späten Pro- und dem frühen Prä-B-Zellstadium passieren zu

können. Neben Überlebens- und Differenzierungssignalen induziert der auf der Zellober-

fläche von Prä-B-Zellen exprimierte Rezeptorkomplex auch Signale, die zu einer kurzen

Proliferationsphase führen. Je nach Stärke des Prä-BZR-Signals führt dies zu einer 2-6-

fachen Vervielfältigung einer Prä-B-Zelle und zu einem Klon, in dem alle Zellen den glei-

chen VH-Idiotyp besitzen. Da jede dieser klonotypisch identischen Prä-B-Zellen nach einer

erfolgreichen Umlagerung am IgL-Lokus eine andere L-Kette produziert, entstehen IgM-

positive B-Zellen, die alle eine andere Antigenspezifität besitzen. Die über den Prä-BZR

eingeleitete klonale Expansion trägt also über die Erhöhung der kombinatorischen Diversi-

tät entscheidend zur Etablierung eines großen Antikörper-Repertoires bei (zusammenge-

fasst in Vettermann et al., 2006).

Der für die Initiierung dieser Signale notwendige Transport des Prä-BZRs an die Zellober-

fläche erfordert jedoch die vorherige komplette Assemblierung des Rezeptors aus einem

µH-Ketten-Dimer, zwei SL-Ketten und der Signaltransduktionseinheit Igα/β. Durch die

Bindung einer SL-Kette an eine noch nicht vollständig gefaltete µH-Kette wird dabei das

ER-ständige Chaperon BiP verdrängt und somit der Transport des Prä-BZRs vom ER an

die Zelloberfläche eingeleitet (Haas et al., 1983; Hendershot et al., 1988). Überraschen-

derweise konnten in SL-defizienten Mäusen trotz einer deutlichen Beeinträchtigung der B-

Zellentwicklung am Prä-BZR-Kontrollpunkt in der Peripherie IgM-positive B-Zellen,

wenn auch in geringeren Zahlen, nachgewiesen werden (Kitamura et al., 1992; Martensson

et al., 1999; Mundt et al., 2001; Shimizu et al., 2002). Diese Ergebnisse deuteten auf einen

SL-Ketten-unabhängigen alternativen Mechanismus zur Loslösung von µH-Ketten von

BiP hin. Neuere Studien unter anderen aus unserem Labor unterstützen diese Hypothese

(Schuh et al., 2003; Galler et al., 2004). So konnte eine transgene µH-Kette in einer SL-

und L-Ketten-defizienten Maus an der Zelloberfläche detektiert werden und darüberhinaus

Differenzierungssignale induzieren. Ob es sich hier um eine generelle Eigenschaft aller

µH-Ketten oder um ein spezielles, nur auf einige wenige µH-Ketten beschränktes Phäno-

men handelt und die Frage, welche Bedeutung die SL-Kette tatsächlich für die Initiierung

von Prä-BZR-Signalen übernimmt, sollten innerhalb dieser Arbeit untersucht werden. Falls

die Fähigkeit, Signale auch in Abwesenheit einer SL-Kette zu induzieren, auf wenige VH-

Ergebnisse

19

Idiotypen beschränkt ist, würden wir eine Änderung im VH-Repertoire reifer B-Zellen in

einer SL-Ketten-defizienten Maus nachweisen können. Zusätzlich sollten alle µH-

Idiotypen aus peripheren reifen B-Zellen einer SL-Ketten-defizienten Maus transport- und

signalkompetent in Abwesenheit einer SL- bzw. L-Kette sein. Um diese Vorhersagen zu

überprüfen, wurde über RT-PCR eine VH-Bibliothek aus Milz-B-Zellen von WT- und λ5-

defizienten Mäusen angelegt.

5.1 Etablierung einer VH-Bibliothek

Publizierte Daten zeigten bereits, dass die spezifischen Eigenschaften einer aus einem zu-

fälligen Rearrangement von VH-, D- und JH-Segmenten resultierenden VH-Region nicht nur

die spätere Antigenspezifität prägen, sondern auch die Paarungsfähigkeit einer µH-Kette

mit einer SL- bzw. L-Kette bestimmen (Huetz et al., 1993; Keyna et al., 1995; Martin et

al., 2003; Su et al., 2003). Während sich diese Untersuchungen hauptsächlich auf eine be-

stimmte VH-Familie (VH5, identisch mit der VH7183-Familie) und einem bestimmten Mit-

glied dieser Familie (VH81X-Segment) beschränkten (Huetz et al., 1993; Keyna et al.,

1995; Hayden et al., 2002; Martin et al., 2003; Kawano et al., 2006), kann durch die Etab-

lierung einer VH-Bibliothek aus Milz-B-Zellen und die damit mögliche zufällige Auswahl

beliebig vieler Plasmidklone zur weiteren Analyse ein möglichst breites Spektrum unter-

schiedlicher VH-Familien berücksichtigt werden. Durch die Verwendung von B-Zellen aus

der Milz konnte dabei garantiert werden, dass alle isolierten µH-Ketten die Qualitäts-

merkmale des Prä-BZR-Kontrollpunktes erfüllten und die weitere B-Zellreifung vorantrei-

ben konnten. Das ist insofern von großer Bedeutung, da alle isolierten VH-Regionen aus

der Milz einer λ5-defizienten Maus, wie die bereits erwähnte transgene Sp6-µH-Kette

(Schuh et al., 2003; Galler et al., 2004), Transport- und Signalkompetenz auch in Abwe-

senheit einer SL-Kette erreichen mussten. Unter der Annahme, dass generell alle funktio-

nellen µH-Ketten Signale für eine weitere B-Zellentwicklung auch in Abwesenheit einer

SL-Kette initiieren können, sollte eine vergleichende Sequenzanalyse von µH-Ketten aus

WT- und λ5-defizienten Mäusen keine Unterschiede im peripheren VH-Repertoire aufzei-

gen. Im gegenteiligen Fall, wenn also nur eine bestimmte Subgruppe von µH-Ketten unab-

hängig von der SL-Kette transport- und signalkompetent sein sollte, würde diese Eigen-

Ergebnisse

20

schaft von einem oder mehreren speziellen Attributen innerhalb der VH-Region abhängig

sein und über eine vergleichende Sequenzanalyse sichtbar werden.

Zur Isolierung von VH-Regionen wurde daher in einem ersten Ansatz ein degenerierter VH-

Primer und ein Gemisch von drei JH-Primern (amplifizieren alle vier murinen JH-Regionen)

verwendet, mit denen möglichst viele verschiedene VH-Regionen der insgesamt 15 be-

kannten Maus-VH-Familien über eine RT-PCR aus RNA amplifiziert werden konnten (ten

Boekel et al., 1997). Die aus Milz-RNA generierten VH-Amplifikate wurden in einen

Plasmidvektor einkloniert und anschließend über Transformation in E. coli eingebracht

(Abb. 6).

Isolation von CD43-

Zellen aus der Milz

RT-PCRmittels degenerierter VH-Primer

Klonierung & Sequenzierung

WT λ5-/-

Analyse der Sequenzen

Abb. 6: Übersichtsschema zur Etablierung einer VH-Bibliothek aus WT- undλ5-defizienten Mäusen. CD43- Zellen aus der Milz von WT- und λ5-/--Mäusen wur-den mittels magnetischer Zellsortierung angereichert. Die Amplifikation von VH-Regionen erfolgte über eine RT-PCR synthetisierter cDNA mit degenerierten VH-Primern und einem Mix aus JH-Primern. Nach Klonierung in den SequenziervektorpCR2.1 wurden alle Sequenzen auf Fehler wie vorzeitige Stop-Kodons überprüft.Fehlerfreie VH-Sequenzen dienten zur Etablierung einer VH-Bibliothek, dienten alsAusgangsmaterial für die Folgeversuche und wurden auf spezifische Attribute inner-halb der VH-Region untersucht, welche die Transport- und Signalkompetenz von µH-Ketten beeinflussen.

Ergebnisse

21

Die transformierten Plasmide wurden daraufhin aus zufällig ausgewählten Einzelkolonien

isoliert und die einklonierten VH-Region sequenziert. VH-Sequenzen mit einem durchge-

henden Leseraster wurden in silico analysiert und dienten zudem als Quelle für die Einklo-

nierung in den retroviralen Expressionsvektor pCHIG, um die µH-Ketten in einem geeig-

neten Zellkultursystem auf ihre Transport- und Signalkompetenz zu untersuchen.

Die Ergebnisse der vergleichenden Sequenzanalyse zwischen VH-Regionen aus WT- und

λ5-defizienten Mäusen werden unter Berücksichtigung ihrer getesteten Transport- und

Signalkompetenz im Kapitel 5.4 vorgestellt.

5.2 Untersuchungen zur Transportkompetenz von µH-Ketten

Das Ziel dieses Abschnittes war die Beantwortung der Frage, ob der autonome Oberflä-

chentransport von µH-Ketten eine spezielle, nur wenige µH-Ketten betreffende Eigen-

schaft ist oder ob es sich um eine allgemeine Fähigkeit aller funktionellen µH-Ketten han-

delt. Dazu sollte die Frequenz von µH-Ketten, die auch in Abwesenheit einer SL- und L-

Kette an die Zelloberfläche transportiert werden, in einem Zellkultursystem bestimmt wer-

den. Dabei sollte der Vergleich der Transportfähigkeit von µH-Ketten aus WT- und λ5-

defizienten Mäusen Rückschlüsse darauf ermöglichen, welche Bedeutung die SL-Kette bei

der Vermittlung der Transportkompetenz übernimmt.

5.2.1 Auswahl eines geeigneten Zellkultursystems

Zur Überprüfung eines autonomen Oberflächentransports von µH-Ketten war zunächst die

Auswahl eines geeigneten Zellkultursystems erforderlich. So konnte zwar durch die Ver-

wendung von Rag-/-/λ5-/--Mäusen die Ablösung schwerer Ketten von BiP in Abwesenheit

einer SL-Kette durch vorzeitig rearrangierte L-Ketten bereits ausgeschlossen werden

(Schuh et al., 2003; Galler et al., 2004). Allerdings könnte ein autonomer SL- und L-

Ketten unabhängiger Transport einer transgenen µH-Kette an die Zelloberfläche von Pro-B

oder Prä-B-Zellen in Rag-/-/λ5-/--Mäusen aber auch durch sterile Vκ- oder JκCκ-

Keimbahntranskripte oder durch Proteine mit einer oder mehreren Ig-Domäne(n) wie

Ergebnisse

22

VpreB3 oder BILL-Cadherin ermöglicht werden (Ohnishi et al., 1994; Melchers, 2005;

McKeller et al., 2006).

Um die Untersuchung eines autonomen Transports verschiedener µH-Ketten an die Zell-

oberfläche zu gewährleisten, wurde daher die Plasmozytomzelllinie Ag8.H ausgewählt

(Kearney et al., 1979). Diese Zellen sind sowohl aufgrund von Deletionen am IgH und κL-

Lokus als auch wegen ihres späten Differenzierungsstadiums innerhalb der B-

Zellentwicklung nicht in der Lage, selbst H-, κL- und SL-Ketten zu produzieren. Parallel

zu den hier durchgeführten Arbeiten wurde Ag8.H-Igα im Rahmen einer Diplomarbeit

mittels RT-PCR, Durchflusszytometrie und proteinbiochemischen Methoden analysiert

und weitergehend charakterisiert (Mortha, 2006). Dadurch konnte die Beeinflussung eines

autonomen Oberflächentransports von µH-Ketten durch die Expression einer SL- bzw. κL-

oder λL-Kette, VpreB3 und BILL-Cadherin ausgeschlossen werden. Schließlich konnten in

anti-µH-Ketten-Präzipitaten aus Lysaten eines µH-Ketten-transfizierten AgH-Klones keine

Polypeptide mit einer erwarteten Masse eines VH- bzw. eines CL-Polypeptides nachgewie-

sen werden (Ergebnisse nicht gezeigt). Aufgrund dessen scheint die Ag8.H-Linie ein opti-

males System zu sein, um die autonome Transportfähigkeit transduzierter bzw. transfizier-

ter µH-Ketten durchflusszytometrisch zu analysieren.

Da Ag8.H-Zellen nur Igβ, jedoch nicht das für den Transport von Ig-Rezeptoren ebenfalls

notwendige Igα produzieren (Hans-Martin Jäck, nicht publizierte Beobachtung), wurden

innerhalb einer Diplomarbeit zunächst stabile Igα-produzierende Ag8.H-Transfektanten

etabliert (Metzner, 2004). Diese wurden zu Beginn der vorliegenden Arbeit subkloniert

und der Klon mit der höchsten Igα-Expression (Ag8.H-Igα.17, im weiteren Verlauf der

Arbeit mit Ag8.H-Igα bezeichnet) für weiterführende Versuche verwendet. Von besonde-

rer Bedeutung waren dabei auch Studien mit zwei im Labor bereits etablierten µH-Ketten-

produzierenden stabilen Ag8.H Klonen. Die beiden von Mirjam Metzner (Metzner, 2004)

etablierten Zelllinien exprimierten zum einen eine funktionelle µH-Kette (VH17.2.25; Jäck

et al., 1992), zum anderen eine dysfunktionelle µH-Kette (VH81XF; Keyna et al., 1995).

Bezeichnenderweise konnte nur die funktionelle Kette im Ag8.H-System an der Zellober-

fläche nachgewiesen werden. Parallel durchgeführte Ko-Immunpräzipitationsstudien der

funktionellen und der dysfunktionellen µH-Kette zeigten zudem keine Unterschiede im

Proteinmuster der Präzipitate. Dadurch kann die Anwesenheit eines noch unbekannten

Interaktionspartners von µH-Ketten im Ag8.H-System zwar nicht vollständig ausgeschlos-

Ergebnisse

23

sen werden, ein autonomer Transport von µH-Ketten an die Zelloberfläche ist aber als

wahrscheinlich anzusehen (Mortha, 2006).

5.2.2 Expression von µH-Ketten nach retroviraler Transfektion

Für die Folgeversuche wurden sowohl bereits im Labor vorhandene als auch neue, aus den

frisch etablierten VH-Bibliotheken isolierte VH-Regionen verwendet. Die bekannten VH-

Regionen wurden dabei gezielt zur Etablierung des Testsystems ausgesucht, während die

VH-Regionen aus den Bibliotheken zufällig ausgewählt wurden. Alle verwendeten VH-

Regionen wurden in den retroviralen Expressionsvektor pCHIG einkloniert und als Teil

der membranständigen Form einer µH-Kette exprimiert. Die über eine IRES-Region ge-

währleistete Ko-Expression von GFP diente dabei als Nachweis einer erfolgreichen Infek-

tion der Zellen. Für alle Versuche wurde der retrovirale GFP-kodierende Vektor pCIG, der

zur Konstruktion des µH-Ketten-kodierenden Vektors diente, als Transfektions- und Fär-

bekontrolle mitgeführt. Die dysfunktionelle µH-Kette mit der VH81XF-Region diente als

Kontrolle für eine µH-Kette, die auch in Anwesenheit der SL-Kette weder Transport- noch

Signalkompetenz erreichen kann (Keyna et al., 1995; Metzner, 2004).

Um eine erfolgreiche Expression transduzierter µH-Ketten auf Proteinebene zu überprüfen,

wurden Ag8.H-Igα-Zellen mit retroviralen Überständen infiziert und nach 24 Stunden auf

die Expression von GFP durchflusszytometrisch untersucht. Anschließend wurden Protein-

lysate aus 3 x 106 GFP+ Zellen elektrophoretisch aufgetrennt und nach Transfer auf eine

Nitrozellulosemembran mit spezifischen Antikörpern auf die Anwesenheit von µH-Ketten

analysiert. Aktinsignale kontrollierten die Menge an geladenem Protein (Abb. 7).

Ergebnisse

24

µHC (WB)

TransduzierteAg8.H-Igα

VH8

1X

F

VHλ5

ko

II.8

2

VH1

7.2

.25

VH8

1X

BC

2

pC

IG

kDa

97

66

45

31

1 2 3 4 5

45Aktin (WB)

Abb. 7: Western Blot-Analyse µH-Ketten-transduzierter Ag8.H-Zellen. Ag8.H-Igα-Zellen wurden retroviral infiziert, 24 Stunden später lysiert und mittels SDS-Page und Western Blot-Analyse untersucht. Zur Kontrolle der Spezifität des anti-µH-Ketten-Serums wurden Ag8.H-Igα-Zellen mit dem nur für GFP kodierenden retrovi-ralen Vektor pCIG (Spur 1) infiziert. Vier verschiedene retrovirale Konstrukte ex-primierten µH-Ketten mit unterschiedlichen VH-Regionen (Spuren 2-5). Die Analyseder Proteinlysate erfolgte mit spezifischen Antikörpern gegen µH-Ketten (µHC) undAktin. Die Positionen des Molekularmassenstandards sind links, die der detektiertenProteine rechts angegeben. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für dreiunabhängige Experimente. Abk.: WB: Western Blot

Retroviral infizierte Ag8.H-Igα-Zellen zeigten 24 Stunden nach Infektion ein spezifisches

Signal mit der erwarteten molekularen Masse einer membranständigen µH-Kette (Abb. 7:

Spuren 2-5). Die µH-Ketten-Signale waren dabei unabhängig von der verwendeten VH-

Region vergleichbar, während die Vektorkontrolle kein spezifisches Signal zeigte (Abb. 7:

Spur 1). Die durchgeführte Aktinfärbung wies auf eine gleichmäßige Protein-Beladung

hin.

5.2.3 Oberflächentransport von µH-Ketten in An- und Abwesenheiteiner SL- und L-Kette

Zur Analyse der Transportkompetenz verschiedener µH-Idiotypen wurden zwei Zelllinien

verwendet. Die bereits vorgestellte Plasmozytomzelllinie Ag8.H-Igα repräsentierte eine

Ergebnisse

25

SL- und L-Kettenfreie Umgebung. Die Abelson-Maus-Leukämie-Virus (Abl-MuLV)-

transformierte Pro-B-Zelllinie 38.B9- hingegen erlaubte aufgrund der Anwesenheit der

kompletten SL-Kette, die Funktionalität einer µH-Kette in Anwesenheit eines BiP-

dissoziierenden „Liganden“ zu überprüfen (Alt et al., 1981). Zusätzlich konnte durch den

direkten Vergleich mit parallel transduzierten Ag8.H-Igα- und 38.B9-Zellen die Trans-

portkompetenz einer µH-Kette in An- und Abwesenheit der SL-Kette untersucht werden.

Zusätzlich wurde im Ag8.H-System die Transportkompetenz einiger VH-Idiotypen auch in

Anwesenheit einer simultan transduzierten κL-Kette untersucht.

Die Messung der Transportkompetenz von µH-Ketten mit unterschiedlichen VH-Regionen

erfolgte 24 Stunden nach retroviraler Infektion mittels Durchflusszytometrie. Dabei wur-

den innerhalb einer Versuchsreihe sowohl Ag8.H-Igα- als auch 38.B9-Zellen stets parallel

mit retroviralen Überständen der gleichen Charge infiziert. Anschließend wurde jeweils

die Hälfte eines Ansatzes intrazellulär und die andere an der Oberfläche mit spezifischen

Antikörpern gegen µH-Ketten gefärbt. Die Analyse der µH-Kettenexpression erfolgte

durch Setzen eines Auswahlbereichs auf lebende GFP+ Zellen. Abbildung 8 zeigt exempla-

risch für alle getesteten µH-Ketten ein typische durchflusszytometrische Analyse. Als

Kontrolle für die Spezifität des anti-µH-Kettenserums dienten Zellen, die mit pCIG retro-

viral transduziert wurden (graue Kurven). Die dysfunktionelle VH81XF-µH-Kette diente

aufgrund ihrer Unfähigkeit, weder mit SL- noch mit konventionellen L-Ketten paaren zu

können, als Negativkontrolle für die Oberflächenfärbungen, da sie ausschließlich in intra-

zellulären Färbungen nachweisbar war (Abb. 8: oberste Reihe). Funktionelle, mit SL- und

L-Ketten paarende µH-Ketten konnten aufgrund ihrer Fähigkeit, ohne SL- bzw. L-Kette

die Zelloberfläche zu erreichen, in zwei Gruppen unterteilt werden: Sogenannte SL-

Ketten-abhängige µH-Ketten, wie die VH81XBC2-µH-Kette, waren in Abwesenheit einer

SL-Kette nicht transportkompetent (Abb. 8: zweite Reihe), SL-Ketten-unabhängige µH-

Ketten waren hingegen auch ohne SL-Kette auf der Zelloberfläche von Ag8.H-Zellen

nachweisbar. Dabei reichte das Ausmaß der Oberflächendichte in transduzierten Ag8.H-

Igα-Zellen von einer sehr schwachen bis zu einer sehr starken Oberflächenfärbung (Abb.

8: linke Seite). Diese graduelle Verteilung war auf deutlich höherem Expressionsniveau

auch in den parallel transduzierten 38.B9-Zellen nachweisbar (Abb. 8: rechte Seite) und

bestätigte damit die Befunde, dass µH-Ketten abhängig von ihrer VH-Region unterschied-

lich an die Zelloberfläche transportiert werden (Kawano et al., 2006).

Ergebnisse

26

VH81XF

intra-zellulär

Zell-oberfläche

intra-zellulär

VH81XB

C2

Zell-oberfläche

Transduzierte Ag8.H-Igα (SLC-/LC-) Transduzierte 38.B9 (SLC+)

+ LC

Zell-oberfläche

FI: µHC

Zellz

ahl

VH

λ5koII.

82

VH

λ5koI.36

4

4

10

227

443

3054

7473

92100

32

34

40

106

VH17.2

.25

VH3-3

2 6

2538

5663

7065

32

34

256

252

4

226

260

Abb. 8: Durchflusszytometrische Überprüfung der Transportkompetenz vonµH-Ketten in transduzierten Ag8.H-Plamozytom- und 38.B9-Pro-B-Zellen.Ag8.H-Igα- und 38.B9-Zellen wurden retroviral infiziert und die Expression transdu-zierter µH-Ketten in An- und Abwesenheit von SL- bzw. einer ko-transduzierten κL-Kette 24 Stunden später durchflusszytometrisch bestimmt (offene Kurven). Die Ana-lyse lebender GFP+ Zellen auf intrazelluläre als auch auf der Zelloberfläche expri-mierte µH-Ketten erfolgte mittels spezifischen PE-markierten Antikörpern gegenµH-Ketten. Als Negativkontrolle für die Spezifität des anti-µH-Ketten-Serums wur-de der nur für GFP kodierende retrovirale Vektor pCIG verwendet (graue Kurve).Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität (MFI, mean fluorescence intensity) µH-Ketten-transduzierter Zellen ist in jedem Histogramm oben rechts angegeben. Linkssind die Namen der von den µH-Ketten verwendeten VH-Idiotypen aufgeführt. Diedargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Abk.:FI: Fluoreszenzintensität; µHC: µH-Kette; SLC: SL-Kette; κLC: κIgL-Kette.

Ergebnisse

27

Zur Überprüfung der Transportfähigkeit einer µH-Kette in Anwesenheit einer klassischen

L-Kette wurden Ag8.H-Igα-Zellen simultan mit µH-Ketten- und κL-Ketten-kodierenden

Retroviren in einem parallelen Ansatz infiziert (Abb. 8: Mitte). Während die dysfunktio-

nelle VH81XF-µH-Kette auch in Anwesenheit einer transduzierten κL-Kette nicht trans-

portkompetent war, konnten alle funktionellen µH-Ketten, inklusive der SL-Ketten-

abhängigen µH-Ketten, in etwa gleicher Intensität unabhängig vom VH-Idiotyp auf der

Zelloberfläche nachgewiesen werden.

In einem unabhängigen Ansatz wurde die Paarungsfähigkeit der hier gezeigten µH-Ketten

mit der SL-Kette in einer Immunpräzipitationsstudie zusätzlich überprüft. Neben der dys-

funktionellen VH81XF-µH-Kette wurden die funktionellen µH-Ketten VH81XBC2, VH3-

32, VH17.2.25, VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82 verwendet und retroviral in 38.B9-Zellen

transduziert. Als Negativkontrollen wurden nicht-infizierte sowie mit pCIG-transduzierte

38.B9-Zellen mitgeführt. Als Positivkontrolle wurde die stabil mit einer funktionellen µH-

Kette transduzierte 38.B9 TdT4.6-Zelllinie verwendet (Martin et al., 2003). Im Fall von

funktionellen µH-Ketten sollten in anti-µH-Ketten-Präzipitaten nach elektrophoretischer

Auftrennung mittels Western Blot-Analyse die SL-Ketten-Komponenten λ5 und VpreB

nachweisbar sein. Dabei müssten jeweils äquimolare Mengen von µH-Ketten und beiden

SL-Ketten-Komponenten nachweisbar sein. Um diese Vorhersagen zu überprüfen, wurden

3 x 106 GFP+-Zellen lysiert und µH-/SL-Ketten-Aggregate mit einem spezifisch gegen µH-

Ketten gerichteten Antikörper präzipitiert. Nach einer elektrophoretischen Auftrennung

wurden die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und mit spezifischen An-

tikörpern gegen die präzipitierte µH-Kette, λ5 und VpreB analysiert (Abb. 9). Obwohl die

präzipitierte µH-Ketten-Menge in allen Ansätzen vergleichbar war, unterschied sich die

Menge der ko-präzipitierten SL-Ketten-Komponenten deutlich. Die aufgetragene Reihen-

folge korrelierte dabei von links nach rechts mit der in Ag8.H-Igα- und 38.B9-Zellen

nachgewiesenen steigenden Oberflächendichte der verschiedenen µH-Ketten (Abb. 9: Spu-

ren 2-7 und 8). Bei allen präzipitierten µH-Ketten konnte ein spezifisches Signal mit der

erwarteten molekularen Masse von VpreB nachgewiesen werden (Abb. 9: Spuren 2-7). Ein

Signal für λ5 war hingegen ausschließlich bei funktionellen µH-Ketten detektierbar (Abb.

9: Spuren 3-7 und 8). Auffallenderweise war das Signal sowohl für λ5 als auch VpreB bei

den funktionellen µH-Ketten VH3-32 und VH17.2.25 im Verhältnis zu den anderen geteste-

ten funktionellen µH-Ketten sehr schwach (Abb. 9: Spuren 4 und 5). Die mitgeführten Ne-

Ergebnisse

28

gativkontrollen zeigten weder für eine µH-Kette noch für die beiden SL-Ketten-

Komponenten ein spezifisches Signal.

66

VH

λ5koI.36

VH17.2

.25

µHC (WB)

λ5 (WB)

VH3-3

2

VH

λ5koII.

82

VH81XF

VH81XB

C2

kDa

Transduzierte38.B9 (SLC+)

38.B

9

38.B

9TdT4.6

IP: anti-µHC

1 2 3 4 5 6 7 8 9

pC

IG

VpreB (WB)

97

21

21

14

Abb. 9: Analyse der Paarungsfähigkeit funktioneller µH-Ketten mit SL-Kette.38.B9-Zellen wurden mit den oben angegebenen µH-Ketten-Vektoren bzw. dem nurfür GFP kodierenden Vektor pCIG retroviral transduziert. Anschließend wurden 3 x106 GFP+ Zellen lysiert, µH-Ketten/SL-Ketten-Aggregate mit einem Antikörper ge-gen µH-Ketten präzipitiert und mittels SDS-Page und Western Blot-Analyse unter-sucht. Die Analyse der Proteinlysate erfolgte mit spezifischen Antikörpern gegenµH-Ketten (µHC), λ5 und VpreB. Die Positionen des Molekularmassenstandardssind links, die der detektierten Proteine rechts anggegeben. Die aufgetragene Reihen-folge der transduzierten µH-Ketten korreliert von links nach rechts mit einer steigen-den Zunahme der Oberflächendichte. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativfür drei unabhängige Experimente. Abk.: SLC: SL-Kette; WB: Western Blot.

Insgesamt wurde nach retroviraler Transduktion in Ag8.H-Igα- und 38.B9-Zellen die

Transportkompetenz von 59 klonierten µH-Ketten-Idiotypen bestimmt (Tab. 2). Neben den

klonierten VH-Regionen aus der Milz von WT- und λ5-defizienten Mäusen wurden zur

Etablierung des Testsystems auch µH-Ketten aus bereits vorhandenen Expressionsplasmi-

den verwendet. Diese wurden in Tab. 2 mit einem Stern (*) markiert. Die isolierten VH-

Regionen wurden aus jeweils zwei WT- bzw. λ5-defizienten Mäusen in unabhängigen An-

sätzen kloniert. Die römischen Ziffern I oder II im Namen der jeweiligen Sequenz be-

zeichnen dabei ihre jeweilige Ursprungsmaus, während die Zahl am Namensende für eine

zufällig ausgewählte E. coli Kolonie steht. Über eine Datenbankanalyse

(http://imgt.cines.fr) wurde die Zugehörigkeit zu einer VH-Familie sowie die verwendeten

D- und JH-Segmente nachgewiesen. Die detaillierte statistische Analyse der Zusammenset-

zung der isolierten VH-Sequenzen wird in Kapitel 5.4 vorgestellt.

Ergebnisse

29

λ5koII.

109

1--

2-

-λ5koII.

48

2D

FL16.1

1-

-

λ5koII.

20

10

DQ

52

4-

++

λ5koI.32

1D

FL16.1

3+

++

++

λ5koI.13

1--

4+

++

λ5koI.33

1D

Q52

2+

++

++

λ5koI.37

1D

FL16.1

4+

++

++

λ5koII.

68

1--

2+

++

++

λ5koII.

72

1D

SP

2.9

1+

++

λ5koII.

82

1D

Q52

2+

++

++

+λ5koII.

113

1D

FL16.1

2+

++

λ5koII.

125

1D

Q52

2+

++

λ5koII.

63

2D

Q52

3+

++

λ5koII.

115

5D

Q52

4+

++

λ5koI.5

14

DF

L16.1

2+

++

++

λ5koI.20

14

DF

L16.1

1+

+λ5koI.33

14

DS

P2.8

4+

++

λ5koI.4

14

--2

++

++

+λ5koII.

314

DS

P2.1

12

++

++

λ5koII.

39

14

DF

L16.1

2+

++

++

λ5koI.36

15

DS

P2.x

2+

++

++

wtI.3

01

DQ

52

2-

-81XF

*5

DS

P2.4

2-

-

wtII.67

1D

FL16.1

2-

++

wtII.110

2D

SP

2.4

4-

++

81XB

C2*

5D

FL16.1

1-

++

wtII.38

5D

FL16.2

2-

+w

tII.62

5--

2-

+w

tI.2

514

DF

L16.2

4-

++

SP

6*

1D

FL16.1

3+

++

++

wtI.1

11

DF

L16.1

2+

++

++

wtII.90

1D

SP

2.4

4+

++

wtI.1

27

1D

FL16.1

1+

++

3-3

2*

2D

SP

2.1

1+

++

wtII.71

3D

Q52

4+

++

wtII.102

5--

1+

++

+I7

.2.2

5*

14

DS

P2.1

04

++

++

+w

tI.3

614

DF

L16.1

2+

++

++

wtI.3

714

DF

L16.1

3+

++

wtI.3

15

DF

L16.1

3+

++

dysfu

nktional

SL-a

bhängig

SL-u

nabhängig

WT

VH-Idio

typ

Subkla

ssen

Nam

e-S

LC

+S

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VH

DJ H

VD

J-A

naly

se

Zell-

oberflä

che

Nam

e

λ5

-/-

-SLC

+S

LC

VH

DJ H

VD

J-A

naly

se

Zell-

oberflä

che

λ5ala

.21

DS

P2.2

4-

++

+λ5ala

.51

DS

P2.1

4-

++

+λ5ala

.35

DQ

52

4-

++

+λ5ala

.10

5D

FL16.1

1-

++

λ5ala

.61

DF

L16.1

2+

++

++

λ5ala

.81

DF

L16.1

3+

+λ5ala

.91

DS

P2.2

4+

++

+λ5ala

.14

1D

SP

2.2

3+

++

λ5ala

.16

1D

Q52

3+

++

+λ5ala

.12

14

DS

P2.x

2+

++

+

λ5dU

.21

DS

T4

2-

+λ5dU

.41

DS

P2.x

3-

+λ5dU

.81

--4

-+

++

λ5dU

.11

DQ

52

3+

++

λ5dU

.51

DS

P2.1

2+

++

+λ5dU

.61

DF

L16.1

2+

++

+λ5dU

.71

DQ

52

2+

++

+λ5dU

.10

1D

ST4

2+

++

++

λ5dU

.93

DS

P2.1

3+

++

Nam

e-S

LC

+S

LC

VH

DJ H

VD

J-A

naly

se

Zell-

oberflä

che

λ5ΔU

-SLC

+S

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VH

DJ H

VD

J-A

naly

se

Zell-

oberflä

che

λ5

ala

Ta

b.

2:

Üb

ers

ich

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get

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ten

µH

-Ket

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n-

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erS

L-K

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mar

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VH-R

egio

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All

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H-R

egio

nen

wur

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naus

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Mil

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λ5

-/- ,

λ5

ala

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erλ

5Δ

UM

äus

en

iso

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chre

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ng

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VH-R

egio

nen

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WT

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An

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latu

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H-R

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jew

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igen

Ver

suchs

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rein

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fällig

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gew

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VH-B

ibli

oth

eke

n.Z

usätz

lich

an

ge

gebe

nsi

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ieüb

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ine

Dat

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ank

ana

lyse

nac

hg

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sene

Zuge

höri

gkeit

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VH-

Fam

ilie

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VH

-Reg

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9

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LC

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fläch

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++

+ho

heO

ber

fläch

ene

xpre

ssio

n.A

bk.:

SL

C:

SL

-Ket

te.

Milz

Ergebnisse

30

Um einen objektiven Vergleich der Oberflächendichte über mehrere Versuchsreihen zu

ermöglichen, wurden die gemessenen Fluoreszenzintensitäten von µH-Ketten-

transduzierten Zellen jeweils durch die Fluoreszenzintensität der Vektorkontrolle dividiert.

Der daraus resultierende Quotient (Q) war daher ein relatives Maß für die jeweilige Stärke

der Oberflächenexpression einer µH-Kette. Dabei galt: - (keine Oberflächenexpression

nachweisbar, Q < 1.25), + (schwache Oberflächenexpression, Q > 1.25 und < 2.5), ++

(mittlere Oberflächenexpression, Q > 2.5 und < 7.5) und +++ (hohe Oberflächenexpressi-

on, Q > 7.5). Die Festlegung der jeweiligen Grenzwerte basierte dabei in Relation zur ge-

messenen Fluoreszenzintensität der nachgewiesenen dysfunktionellen µH-Ketten. Auf-

grund dieser relativen Einteilung der jeweiligen Transportkompetenz in An- und Abwe-

senheit eines Bindungspartners erfolgte eine Zuordnung der getesteten µH-Ketten in drei

Idiotypsubklassen: Dysfunktionelle µH-Ketten zeigten weder in An- noch in Abwesenheit

einer SL- oder einer L-Kette eine Oberflächendichte, SL-abhängige µH-Ketten waren aus-

schließlich in Anwesenheit einer SL- bzw. L-Kette auf der Zelloberfläche nachweisbar,

während SL-unabhängige µH-Ketten auch ohne Bindungspartner Transportkompetenz

erreichten, allerdings war diese höher, wenn eine SL- oder L-Lette vorhanden war (vgl.

Abb. 8).

Der wesentliche strukturelle Unterschied zwischen einer SL-Kette und einer konventionel-

len leichten Kette sind die sogenannten unique tails von λ5 und VpreB, die beide keine

Homologie zu bekannten Ig-Domänen aufweisen (Sagakuchi et al., 1986). Beide Regionen

sind zwar für eine Assemblierung der SL-Kette nicht von Bedeutung (Minegeshi et al.,

1999), scheinen jedoch für eine effiziente Initiierung der klonalen Expansion von Prä-B-

Zellen von essentieller Bedeutung zu sein (Melchers, 2005; zusammengefasst in Vetter-

mann et al., 2006). Aufgrund dessen sollte in Mäusen mit genetisch veränderten unique

tails der Transport aller funktionellen µH-Ketten an die Zelloberfläche weiterhin gewähr-

leistet bleiben. Die Proliferationsphase von Prä-B-Zellen sollte hingegen gestört sein und

sich dadurch eine verminderte B-Zellzahl in der Peripherie nachweisen lassen. Zur Unter-

suchung der Bedeutung des λ5 unique tails in der frühen B-Zellentwicklung wurden von

Christian Vettermann in unserer Abteilung im Rahmen seiner Disseration zwei transgene

Mausmodelle etabliert: In der λ5ala-transgenen Maus wurden alle basischen Aminosäuren

des stark positiv geladenen λ5 unique tails gegen neutrales Alanin ausgetauscht, während

der unique tail von λ5 in der λ5ΔU-transgenen Maus komplett deletiert wurde (noch nicht

publizierte Daten C. Vettermann). Beide Mausmodelle zeigten dabei im Vergleich zu einer

Ergebnisse

31

WT-Maus eine erhöhte Anzahl von Pro-B-Zellen sowie eine reduzierte Zellzahl von Prä-

B-Zellen und auch IgM+ B-Zellen in der Peripherie. Der nachgewiesene Phänotyp befand

sich jedoch hinsichtlich des Zahlenverhältnisses von Pro-B-Zellen und den darauffolgen-

den Reifestadien bei beiden transgenen Mäusen zwischen dem Phänotyp einer WT- und

einer λ5-defizienten Maus. Daraus wurde geschlussfolgert, dass der λ5 unique tail mit sei-

nen basischen Aminosäuren für eine effiziente Initiierung von Signalen zur klonalen Ex-

pansion großer Prä-B-Zellen unerlässlich ist (persönliche Mitteilung C. Vettermann). Die

Funktion der SL-Kette, als Bindungspartner die Transportkompetenz von µH-Ketten zu

ermöglichen, sollte davon jedoch unbeeinflusst bleiben. Falls dies der Fall ist, sollten sich

sowohl SL-abhängige als auch SL-unabhängige µH-Ketten mit gleicher Frequenz wie in

einer WT-Maus in peripheren B-Zellen nachweisen lassen. Neben den isolierten VH-

Regionen aus WT- und λ5-defizienten Mäusen wurden daher insgesamt 19 weitere µH-

Ketten aus den beiden λ5-transgenen Mäusen in gleicher Weise auf ihre Transportkompe-

tenz untersucht.

Zusammengefasst zeigt der Vergleich aller µH-Ketten aus der Milz einer WT-Maus, dass

ca. 40% der µH-Ketten SL-abhängig und ca. 60% SL-unabhängig die Zelloberfläche errei-

chen (Abb. 10).

SL-unabhängig:

WT λ5ala λ5dU

188

15SL-abhängig:

21dysfunktional:

2114n

*

6

4

-

10

6

3

-

9

WT λ5-/- λ5ala λ5dU

λ5-/

-

WT

λ5a

la

λ5Δ

U

20

80

60

40

100

Pro

zentgete

ste

ter

VH-R

egio

nen

[%]

λ5-/-

SL-abhängig

SL-unabhängig

Abb. 10: Übersicht über die Anzahl der getesteten µH-Ketten und ihre jeweiligeZuordnung in drei VH-Idiotyp-Subklassen. Im oberen Abschnitt ist die absoluteAnzahl aller aus den angegebenen Mäusen getesteten µH-Ketten sowie ihre Zuord-nung in die drei VH-Idiotyp-Subklassen in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Trans-portkompetenz dargestellt. Im unteren Abschnitt sind das prozentuale Verhältnis SL-abhängiger und SL-unabhängiger µH-Ketten sowie die jeweilige Herkunft darges-tellt. * = p < 0,03.

Ergebnisse

32

Isolierte µH-Ketten aus einer λ5-defizienten Maus zeigten hingegen eine signifikante Ver-

schiebung dieses Verhältnisses auf ca. 5% SL-abhängige zu ca. 95% SL-unabhängige µH-

Ketten. Tatsächlich entsprechen diese 5% jedoch nur einer der insgesamt 19 getesteten

funktionellen µH-Ketten aus einer λ5-defizienten Maus. Eine Prä-B-Zelle, die eine SL-

abhängige µH-Kette exprimiert, sollte den Prä-BZR- bzw. den µH-Ketten-Kontrollpunkt in

einer λ5-defizienten Maus eigentlich nicht passieren können. Es ist aber möglich, dass die-

se µH-Kette als „blinder Passagier“ in einer Prä-B-Zelle, die eine zweite SL-unabhängige

µH-Kette exprimierte, den peripheren B-Zellpool erreichen konnte. Zudem könnte die

Amplifikation dieser VH-Region aus RNA einer λ5-defizienten Maus auf eine Kontamina-

tion der isolierten RNA mit genomischer DNA zurückzuführen sein. Bei den isolierten

µH-Ketten aus der transgenen λ5ala- und λ5ΔU-Maus konnte, wie vorhergesagt, ein Ver-

hältnis von SL-abhängigen zu SL-unabhängigen µH-Ketten nahezu identisch zu einer WT-

Maus nachgewiesen werden. Das zeigt, dass für die „Rettung“ SL-abhängiger µH-Ketten

die SL-Kette ohne λ5 unique tail vollkommen ausreicht.

Mit den hier gezeigten Analysen konnte eine differentielle Oberflächendichte von µH-

Ketten in Abhängigkeit zu ihrem Idiotyp gezeigt werden. Dabei wird die Menge der an der

Zelloberfläche exprimierten µH-Ketten in erster Linie von der jeweiligen VH-Region be-

stimmt. In Anwesenheit der SL-Kette war der Oberflächentransport von µH-Ketten zwar

deutlich erhöht, die gemessenen Unterschiede in der jeweiligen Transportkompetenz waren

jedoch auch in Abwesenheit der SL-Kette nachweisbar. Weiterhin konnten funktionelle,

also mit L-Ketten paarende µH-Ketten in zwei Idiotyp-Subklassen eingeteilt werden: SL-

abhängige µH-Ketten waren ausschließlich in Anwesenheit der SL-Kette an der Zellober-

fläche nachweisbar, während SL-unabhängige µH-Ketten in vermindertem Maße auch in

Abwesenheit der SL-Kette Transportkompetenz erreichten.

5.3 Untersuchungen zur Signalkompetenz von µH-Ketten

Die durchflusszytometrischen Untersuchungen zur Transportkompetenz identifizierten

zwei Gruppen funktioneller µH-Ketten: (I) SL-abhängige µH-Ketten waren ausschließlich

in Anwesenheit einer SL- oder L-Kette auf der Zelloberfläche nachweisbar, (II) SL-

unabhängige µH-Ketten besaßen hingegen auch in Abwesenheit einer SL-Kette Transport-

Ergebnisse

33

kompetenz. Auffallend in diesem Zusammenhang war zum einen eine deutliche Zunahme

der Oberflächendichte von allen funktionellen µH-Ketten in Gegenwart einer SL-Kette.

Zum anderen blieben die relativen Unterschiede in der graduellen Oberflächenexpression

verschiedener µH-Ketten sowohl in An- als auch in Abwesenheit einer SL-Kette bestehen.

Ähnliche Befunde ergaben sich auch aus einer während dieser Promotion veröffentlichen

Arbeit aus dem Karasuyama-Labor (Kawano et al., 2006). Die Autoren zeigten, dass sich

µH-Ketten als Teil eines Prä-BZR in ihren jeweiligen Zelloberflächen-Mengen unterschei-

den und somit die induzierten Prä-BZR-Signale verschieden stark ausfallen. Der postulier-

te Mechanismus einer SL-Ketten-vermittelten Selektion von µH-Ketten konnte in diesen

Arbeiten jedoch nicht weiter untersucht werden, da die Transport-und Signalkompetenz

verschiedener µH-Ketten ausschließlich in Anwesenheit der SL-Kette untersucht wurden.

Da die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Unterschiede in der Oberflächendichte ver-

schiedener µH-Ketten-Idiotypen sowohl in An- als auch in Abwesenheit einer SL-Kette

bestehen blieben, weisen die hier erhaltenen Daten jedoch eher darauf hin, dass sowohl die

Fähigkeit zu einem SL-Ketten-unabhängigen Oberflächentransport als auch der Grad der

Oberflächendichte durch den VH-Idiotyp der jeweiligen µH-Kette bereits vorher festgelegt

sind. Die SL-Kette übernimmt in diesem Fall eine Verstärkerrolle auf zwei Ebenen: Ers-

tens ermöglicht sie durch das Verdrängen von BiP die Erhöhung der Prä-BZR-Dichte auf

der Zelloberfläche und zweitens erlaubt sie wahrscheinlich über die C- und N-terminalen

nicht-Ig-ähnlichen Regionen von λ5 und VpreB eine Liganden-abhängige oder unabhängi-

ge Kreuzvernetzung des Prä-BZRs. Beides würde zu einer Verstärkung des für die Erhö-

hung des Antikörper-Repertoires nötigen proliferativen Ex-pansionssignals führen. Die

Frequenz, mit der letztlich ein VH-Idiotyp im finalen Repertoire vertreten ist, würde in die-

sem Modell also sowohl von den intrinsischen Eigenschaften der VH-Region als auch von

einer SL-Kette abhängen.

Im folgenden Kapitel soll nun die Signalkompetenz von verschiedenen µH-Ketten, die sich

in ihrer Oberflächendichte unterscheiden, in An- und Abwesenheit der SL-Kette untersucht

werden. Von besonderer Bedeutung war dabei die Untersuchung der Signalkompetenz von

funktionellen µH-Ketten und insbesondere die Initiierung von Signalen SL-abhängiger

µH-Ketten in An- und Abwesenheit der SL-Kette. Des Weiteren sollte eine Korrelation

zwischen dem Ausmaß der Oberflächendichte von µH-Ketten und der induzierten Signal-

stärke überprüft werden. Für diese Experimente wurden verschiedene µH-Ketten verwen-

det, die zuvor in Ag8.H-Igα- und 38.B9-Zellen hinsichtlich ihrer Transportkompetenz un-

Ergebnisse

34

tersucht wurden (Abb. 8). Die dysfunktionelle VH81XF-µH-Kette diente dabei als Beispiel

für eine nicht-paarungsfähige (also dysfunktionelle) Kette, während die VH81XBC2-µH-

Kette stellvertretend für die Gruppe der SL-abhängigen µH-Ketten verwendet wurde. Zu-

sätzlich wurden vier weitere SL-unabhängige µH-Ketten, die sich im Grad ihrer Oberflä-

chendichte deutlich voneinander unterschieden, in die Analysen mit einbezogen. Das

Spektrum der Zelloberflächendichte ersteckte sich dabei in Abwesenheit einer SL-Kette

von einer schwachen (VH3-32) über eine mittlere (VH17.2.25 und VHλ5koI.36) bis hin zu

einer starken Expression (VHλ5koII.82). Als Transfektions- und Färbekontrolle wurde ein

retroviraler Vektor verwendet, der nur für GFP kodierte.

5.3.1 Signalkompetenz transduzierter µH-Ketten in Anwesenheit derSL-Kette

Da in Abl-MuLV-transformierten Zelllinien die meisten der intrazellulären Prä-BZR-

Signalketten aktiviert und über die Abl-Tyr-Kinase viele Proteine an Tyrosinresten bereits

phosphoryliert sind, ist die 38.B9-Pro-B-Zelllinie nicht gut zur Überprüfung der Signal-

kompetenz des Prä-BZRs geeignet. Daher wurde zur Überprüfung der Signalkompetenz

von retroviral tranduzierten µH-Ketten hinsichtlich der Aktivierung von Prä-BZR-

abhängigen intrazellulären Signalketten die IL7-abhängige Pro-B-Zelllinie R5B verwen-

det. In den nicht Abl-MuLV-transformierten R5B-Zellen sollten sich im Gegensatz zu der

bisher verwendeten Pro-B-Zellinie 38.B9 Prä-BZR-induzierte Signale ohne weitere Mani-

pulationen wie zum Beispiel durch Zugabe von GlivecTM, einem Abelson-Kinase-Inhibitor,

nachweisen lassen (Muljo et al., 2003; Kawano et al., 2006). Aufgrund der Expression der

SL-Kette in R5B-Zellen sollten alle funktionellen (d.h. paarungsfähigen) µH-Ketten nach

retroviraler Transduktion auf der Zelloberfläche nachweisbar sein, während die verwende-

te dysfunktionelle VH81XF-µH-Kette intrazellulär zurück gehalten werden und de-

mentsprechend nicht signalkompetent sein sollte. Basierend auf den Daten hinsichtlich der

Untersuchungen zur Transportkompetenz in Ag8.H-Igα- und 38.B9-Zellen, sollten sich

darüber hinaus funktionelle µH-Ketten in ihrer Zelloberflächendichte unterscheiden. Sollte

dabei die Dichte des an der Zelloberfläche exprimierten Prä-BZRs für die Stärke der ini-

tiierten Signale tatsächlich entscheidend sein, so sollte eine Kreuzvernetzung des Rezep-

tors eine gegebene Korrelation zwischen diesen Attributen zeigen. In diesem Fall würden

Ergebnisse

35

dysfunktionelle µH-Ketten keine Prä-BZR-Signale initiieren, während funktionelle µH-

Ketten mit zunehmender Oberflächendichte auch stärkere Signale induzieren (Abb. 11).

Kreuzvernetzung des Prä-BZRmit anti-IgM F(ab)2-Fragment

Prä-BZR

F(ab)2

µH-Kette

VpreBλ5

Abb. 11: Korrelation der Oberflächenmenge funktioneller µH-Ketten und derinduzierten Signalstärke. Schematische Darstellung von drei unterschiedlich starkan der Zelloberfläche exprimierten Prä-BZR-Komplexen. Die Menge des an derZelloberfläche präsentierten Prä-BZRs ist dabei von der Transportrate der jeweiligenµH-Kette und dadurch vom VH-Idiotyp abhängig. Mit steigender Oberflächenmengefunktioneller µH-Ketten sollte sich die induzierte Signalstärke nach einer Kreuzver-netzung des Prä-BZR-Komplexes erhöhen.

Für die Folgeversuche wurden zunächst R5B-Zellen mit verschiedenen µH-Ketten retrovi-

ral transduziert und 24 Stunden später durchflusszytometrisch analysiert (Abb. 12). Dabei

wurde die Menge an µH-Ketten sowohl intrazellulär als auch an der Zelloberfläche mit

einem Cy5-markierten anti-IgM Antikörper bestimmt. Analysiert wurden ausschließlich

lebende, transduzierte, d.h. GFP+ Zellen. Im Vergleich zur Vektorkontrolle als auch zur

dysfunktionellen VH81XF-µH-Kette unterschieden sich alle verwendeten VH-Idiotypen

hinsichtlich ihrer Oberflächendichte. Dadurch konnten zum einen in einem unabhängigen

Zellkultursystem die Daten aus den Ag8.H-Igα- und 38.B9-Zellen bestätigt werden. Zum

anderen waren so die experimentellen Voraussetzungen für die Bestimmung einer Korrela-

tion der Höhe der Oberflächenexpression und der induzierten Signalstärke gegeben.

Ergebnisse

36

FI: µHC

Zell-oberfläche

intra-zellulär

280

299

197

12

32

37

Zellz

ahl

VH81XB

C2

VH81XF

VH3-3

2

153

273

249

44

63

193

VH

λ5koII.

82

VH

λ5koI.36

VH17.2

.25

TransduzierteR5B (SLC+)

Abb. 12: Durchflusszytometrische Analyse von µH-Ketten-transduzierten, IL7-abhängigen R5B-Pro-B-Zellen. R5B-Zellen wurden retroviral infiziert und die Ex-pression der transduzierten µH-Ketten 24 Stunden später durchflusszytometrisch be-stimmt (offene Kurven). Die Analyse lebender GFP+ Zellen auf intrazelluläre alsauch auf der Zelloberfläche exprimierte µH-Ketten erfolgte mittels spezifischen Cy5-markierten Antikörpern gegen µH-Ketten. Als Negativkontrolle für die Spezifität desanti-µH-Ketten-Serums wurde der nur für GFP kodierende retrovirale Vektor pCIGverwendet (graue Kurve). Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität (MFI, meanfluorescence intensity) µH-Ketten-transduzierter Zellen ist in jedem Histogrammoben rechts angegeben. Links sind die Namen der von den µH-Ketten verwendetenVH-Idiotypen aufgeführt. Die dargestellten Analysen wurden in Zusammenarbeit mitC. Vettermann durchgeführt und sind repräsentativ für drei unabhängige Experimen-te. Abk.: FI: Fluoreszenzintensität; µHC: µH-Kette; SLC: SL-Kette.

Ergebnisse

37

Die Gruppe um Chris Paige zeigte, dass die gleichzeitige Aktivierung des Prä-BZRs und

des IL7-Rezeptors zu einer synergistischen Phosphorylierung der MAP-Kinasen (mitogen

activated protein kinases) Erk1 und Erk2 (extracellular signal regulated kinases) führt

(Fleming et al., 2001). Beide Erk-Serinkinasen sind Rezeptor-distale Komponenten sowohl

der Prä-BZR- als auch der BZR-Signalkaskade, werden nach Kreuzvernetzung des jeweili-

gen Oberflächenrezeptors an Serin phosphoryliert und sind an der Regulation des Zell-

wachstums sowie der Differenzierung von B-Zellen beteiligt (zusammengefasst in Jumaa

et al., 2005). Der Phosphorylierungsstatus von Erk1/2 wurde daher in µH-Ketten-

transduzierten R5B-Zellen vor und nach Kreuzvernetzung des Prä-BZRs mit einem anti-

IgM F(ab)2-Fragment untersucht. Dazu wurden zunächst mit einem MoFloTM-

Durchflusszytometer transduzierte GFP+-R5B-Zellen auf einen Reinheitsgrad > 98% ange-

reichert. Anschließend wurden mit und ohne anti-IgM F(ab)2-Fragment stimulierte R5B-

Zellen lysiert. Als Negativkontrolle wurden mit dem GFP-kodierenden Vektor pCIG trans-

duzierte R5B-Zellen verwendet. Die Proteinlysate wurden elektrophoretisch aufgetrennt

und mittels Western Blot und spezifischen Antikörpern gegen die µH-Kette sowie gegen

phosphoryliertes Erk1/2 und unphosphoryliertes Erk1 analysiert (Abb. 13).

Die Analyse der µH-Ketten- (Abb. 13, oberer Blot) und Erk1-Signale (Abb. 13, unterer

Blot) dienten dabei zur Überprüfung einer vergleichbaren Beladung an Proteinlysat und

zeigten, wie erwartet, vergleichbare Signalstärken zwischen den verschiedenen Trans-

fektanten, was darauf hindeutet, dass ähnliche Zelläquivalente in allen Ansätzen geladen

wurden. Im Vergleich zu den unstimulierten Ansätzen (Abb. 13: Spuren 1-7) konnte nach

Prä-BZR-Kreuzvernetzung in den stimulierten und mit einer funktionellen µH-Kette trans-

duzierten R5B-Zellen (Abb. 13, mittlerer Blot, Spuren 8-14) ein deutlicher Anstieg im

Signal von phosphoryliertem Erk1/2 nachgewiesen werden. Dabei nahm die Stärke des

Phosphorylierungssignals von Erk1/2 korrelierend zu einer höheren Oberflächendichte des

Prä-BZRs zu (vgl. Abb. 12). Die Zunahme der Stärke des pErk-Signals nach Prä-BZR-

Kreuzvernetzung kann hierbei auf einen spezifischen Effekt der Oberflächen-µH-Kette

zurückgeführt werden, da weder in anti-IgM F(ab)2-Fragment behandelten pCIG- noch in

VH81XF-µH-Ketten-transduzierten Zellen ein Signal für pErk nachgewiesen werden konn-

te (Spuren 8 und 9).

Ergebnisse

38

µHC (WB)

pErk1/2 (WB)

kDa VH17.2

.25

VH17.2

.25

pC

IG

VH81XF

VH3-3

2

VH

λ5koII.

82

VH

λ5koI.36

VH81XB

C2

pC

IGV

H81XF

VH3-3

2

VH

λ5koII.

82

VH

λ5koI.36

VH81XB

C2

45

66

- anti-IgM F(ab)2 + anti-IgM F(ab)2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Erk1 (WB)45

Transduzierte R5B (SLC+)

Abb. 13: Analyse des Phosphorylierungsstatus von Erk1/2 nach Prä-BZR-Kreuzvernetzung in µH-Ketten-transduzierten R5B-Pro-B-Zellen. 5 x 106 trans-duzierte und GFP+-sortierte R5B-Zellen wurden für 2 min mit anti-IgM F(ab)2-Fragment stimuliert, lysiert und mittels SDS-Page und Western Blot-Analyse unter-sucht (Spuren 8-14). Parallel behandelte, aber unstimulierte R5B-Zellen dienten alsVergleichskontrolle (Spuren 1-7). R5B-Zellen, infiziert mit einem retroviralen, nurfür GFP-kodierenden Vektor (pCIG) wurden als Negativkontrolle mitgeführt (Spuren1 und 8). Die verwendeten µH-Ketten wurden mit steigender Oberflächenexpressionvon rechts nach links aufgetragen (Spuren 2-7 bzw. 9-14). Die Analyse der Protein-Lysate erfolgte mit spezifischen Antikörpern gegen µH-Ketten (µHC), phosphory-liertem Erk1/2 und unphosphoryliertem Erk1. Die Positionen des Molekularmassen-standards sind links, die der detektierten Proteine rechts anggegeben. Die dargestell-ten Analysen wurden in Zusammenarbeit mit C. Vettermann durchgeführt und sindrepräsentativ für drei unabhängige Experimente. Abk.: SLC: SL-Kette; WB: WesternBlot.

Ein weiterer sehr interessanter Befund war, dass phosphorylierte Formen von Erk1/2 erst

nach Kreuzvernetzung des Prä-BZRs nachgewiesen werden konnten. Die schwachen, in

einigen µH-Ketten-transduzierten Ansätzen nachweisbaren Banden auf Höhe der unteren

pErk-Bande sind nicht auf eine µH-Ketten-spezifische Signaltransduktion zurückführbar,

da sie auch in GFP-transduzierten, µH-Ketten-negativen R5B-Zellen (Spur 1) nachweisbar

waren und die Intensität nach Prä-BZR-Kreuzvernetzung nicht erhöht wurde (Spur 8). Die-

se Befunde scheinen daher das von Melchers aufgestellte Signalinitierungsmodell, in dem

die ligandenunabhängige Selbstvernetzung des Prä-BZRs bereits autonome Signale aus-

löst, zu widerlegen (Ohnishi et al., 2003). Allerdings muss hier angemerkt werden, dass in

dem von Ohnishi et al. durchgeführten Experiment eine Abl-MuLV-transformierte Prä-B-

Ergebnisse

39

Zelllinie verwendet wurde. Trotzdem weisen die in der hier vorliegenden Arbeit gezeigten

Daten stark darauf hin, dass zumindest abhängig vom experimentellen Zellsystem eine

Kreuzvernetzung simuliert durch anti-IgM F(ab)2-Fragment nötig ist, um überhaupt nach-

weisbare Signale auszulösen.

Die Kreuzvernetzung des Prä-BZRs führt neben der Phosphorylierung von Erk1/2 aber

auch zu einer Aktivierung der Phospholipase-Cγ2 und zum Einstrom von Kalzium in das

Zytoplasma (Hendriks et al., 2004). Die damit verbundene Erhöhung der intrazellulären

Kalzium-Konzentration kann durchflusszytometrisch über die Fluoreszenzänderungen ei-

nes Kalzium-sensitiven Farbstoffes nachgewiesen werden und dadurch als Methode für die

Quantifizierung der über den Prä-BZR induzierten Signalstärke dienen. Dazu wurden 5 x

106 R5B-Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Indo-1 beladen und anschließend mit anti-

IgM F(ab)2-Fragment stimuliert. Eine ebenfalls durchgeführte Stimulation mit Ionomycin

diente zur Überprüfung der erfolgreichen Beladung von Zellen mit Indo-1. Anschließend

wurde die Änderung der Indo-1-Fluoreszenz, ausgelöst durch den Einstrom von Kalzium,

in lebenden GFP+ Zellen über einen Zeitraum von drei Minuten gemessen und als kineti-

scher Verlauf in einem Diagram analysiert. Die jeweiligen Kinetiken der Indo-1-

Fluoreszenz (proportional zur Änderung des intrazellulären Kalziumsgehaltes) in den mit

unterschiedlichen µH-Ketten transduzierten R5B-Zellen wurden zum besseren Vergleich

als Overlay dargestellt (Abb. 14).

Übereinstimmend mit den vorherigen Ergebnissen zeigten die kinetischen Verläufe der

Änderung der Indo-1-Fluoreszenz, dass in Zellen mit transduzierten funktionellen µH-

Ketten nach Kreuzvernetzung des Prä-BZRs tatsächlich auch der Kalzium-Signalweg in-

duziert wurde. Dabei korrelierten die maximale Stärke und die Schnelligkeit, mit der das

Maximum erreicht wurde, mit der jeweiligen Dichte an Prä-BZR auf der Zelloberfläche.

So konnte bei Zellen mit geringer Prä-BZR-Dichte (VH81XBC2- und VH3-32-Idiotypen)

ein deutlich schwächerer und auch verzögerter Anstieg im Kalziumsignal beobachtet wer-

den als bei Zellen mit einer mittleren (VH17.2.25, VHλ5koI.36) bzw. einer hohen Prä-BZR-

Oberflächendichte (VHλ5koII.82). Die Abhängigkeit der Prä-BZR-Signalstärke von der

Oberflächendichte zeigte sich auch klar durch eine im zeitlichen Verlauf früh detektierba-

ren Änderung des Kalziumgehaltes in den Zellen mit den höchsten, aber dennoch unter-

schiedlichen Oberflächendichten (vgl. Kintetik von VHλ5koI.36- und von VHλ5koII.82-

Idiotyp-transduzierten Zellen) und einer verzögerten Antwort in Zellen mit einer mittleren

Ergebnisse

40

Prä-BZR-Dichte (VH17.2.25). Die Zunahme des Kalziumsignals war abhängig von der

Anwesenheit der µH-Kette auf der Zelloberfläche, da eine Stimulation mit anti-IgM

F(ab)2-Fragment weder in Zellen mit der dysfunktionellen µH-Kette noch mit GFP alleine

eine Änderung im Kalziumsignal auslöste.

pCIG

VHλ5koII.82

VH81XFVHBC2

VH17.2.25

VH3-32VHλ5koI.36

30

40

50

60

70

FII

ndo-1

400

nm

/510

nm

Zeit [s]

50 100 150 200

Abb. 14: Analyse der Änderung des intrazellulären Kalziumgehaltes nach Prä-BZR-Kreuzvernetzung. 5 x 106 transduzierte R5B-Zellen wurden mit dem Fluores-zenzfarbstoff Indo-1 beladen, das Hintergrundsignal der Zellen für eine Minute ge-messen und mit anti-IgM F(ab)2-Fragment stimuliert (). Die Messung des Kal-zium-Einstroms erfolgte nach Stimulierung über einen Zeitraum von 3 Minuten. DerKalzium-Einstrom wurde als das Verhältnis der Fluoreszenz von Indo-1 bei 400 nmund 510 nm in lebenden GFP+ R5B-Zellen in einem kinetischen Verlauf dargestellt.Als Negativkontrolle wurden R5B-Zellen infiziert mit dem nur für GFP-kodierendenretroviralen Vektor pCIG mitgeführt. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativfür drei unabhängige Experimente. Abk.: FI: Fluoreszenzintensität.

5.3.2 Vergleichende Analyse der Signalkompetenz transduzierter µH-Ketten in An- und Abwesenheit der SL-Kette

Die zuvor in der Pro-B-Zelllinie R5B durchgeführten Versuche zeigten eine Korrelation

zwischen der Oberflächendichte eines Prä-BZR (bzw. µH-Kette) und dem Grad des über

den Prä-BZR induzierten Signals. Dabei war die dysfunktionelle und nicht an der Zellober-

fläche exprimierte VH81XF-µH-Kette nicht in der Lage, Signale zu initiieren, während alle

funktionellen (also paarenden) µH-Ketten nach Kreuzvernetzung Signale induzierten.

Aufgrund der Expression der SL-Kette in R5B-Zellen war eine Unterscheidung zwischen

der Signalstärke von SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten jedoch nicht mög-

lich. Letztere sollten auch in Abwesenheit der SL-Kette immer noch in der Lage sein, Sig-

nale zu induzieren, die eine weitere Differenzierung von B-Zellen ermöglichen. SL-

Ergebnisse

41

abhängige µH-Ketten sollten hingegen aufgrund ihrer fehlenden autonomen Transport-

kompetenz in Abwesenheit einer SL-Kette, vergleichbar zu dysfunktionellen µH-Ketten,

keine Signale initiieren können.

Mit primären Knochenmarks-B-Zellkulturen sollten diese Vorhersagen durch einen direk-

ten Vergleich der Signalkompetenz verschiedener µH-Ketten in An- und Abwesenheit der

SL-Ketten-Komponente λ5 überprüft werden (Abb. 15). Daneben sollte überprüft werden,

ob die in Ag8.H-Igα-, 38.B9- und R5B-Zellen gewonnenen Erkenntnisse bzgl. der diffe-

rentiellen Oberflächenexpression von µH-Ketten auch in Abwesenheit einer SL-Kette rep-

roduziert werden können. Falls dies zutrifft, kann man schlussfolgern, dass die Transport-

kompetenz einer µH-Kette durch die intrinsischen Eigenschaften der jeweiligen VH-

Region vorgegeben ist. Schließlich sollte untersucht werden, ob SL-Ketten-unabhängige

µH-Ketten in Anwesenheit einer SL-Kette besser auf die Oberfläche gelangen und, wenn

ja, ob sich die Erhöhung der Prä-BZR-Dichte auf der Zelloberfläche auf die induzierte

Signalstärke auswirkt.

Dazu wurden CD19+ Zellen aus dem Knochenmark von λ5-positiven WT- und λ5-

defizienten Mäusen zunächst magnetisch aufgereinigt. Um den Einfluss durch endogene

µH-Ketten auszuschließen, waren bei beiden Mauslinien zusätzlich beide Rag2-Gene dele-

tiert. Direkt im Anschluss daran erfolgte die retrovirale Transduktion der isolierten B-

Zellen mit verschiedenen µH-Ketten-Expressionsvektoren. Hier wurden der bereits vor-

gestellte dysfunktionelle VH81XF-Idiotyp und der als SL-abhängig klassifizierte

VH81XBC2-Idiotyp sowie die SL-unabhängigen Idiotypen VH3-32, VH17.2.25,

VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82 verwendet. Als Kontrolle wurde ein retroviraler Vektor mit-

geführt, der nur für GFP, aber nicht für eine µH-Kette kodierte (pCIG). Nach der Infektion

wurden die transduzierten CD19+ Zellen in dreifacher Ausführung auf der Stromazelllinie

ST2 kultiviert. 24 und 72 Stunden nach Infektion wurden die Zellen geerntet, mit Flow-

Count Fluorespheres vermischt und die Zellzahl durchflusszytometrisch bestimmt.

Ergebnisse

42

Isolation von CD19+ Zellenaus dem Knochenmark

SLC-SLC+

Retrovirale

Infektion

Bestimmung derZellwachstumsrate

Rag2-/-

λ5+/+

Rag2-/-

λ5-/-

ST2-Zellen

Abb. 15: Analyse der Signalkompetenz einer µH-Kette in An- und Abwesenheitder SL-Kette. Schematisch dargestellt ist der Versuchsablauf zur Messung desZellwachstums von SL-Ketten-positiven und –defizienten CD19+ Zellen, die mit ver-schiedenen µH-Ketten-Konstrukten retroviral transduziert und anschließend auf ST2-Zellen kultiviert wurden. Das Potential und Ausmaß verschiedener µH-Ketten Zell-wachstum induzieren zu können, wurde durch die Bestimmung der Zellzahl 24 und72 Stunden nach Beginn der Stromazellkulturen durchflusszytometrisch bestimmt.

Parallel zur Bestimmung der jeweiligen Zellzahl wurde die Oberflächenexpression der µH-

Ketten in den transduzierten primären CD19+ Zellen bestimmt. Dazu wurden die Zellen

sowohl intrazellulär als auch an der Zelloberfläche mit einem PE-markierten spezifischen

Antikörper gegen µH-Ketten gefärbt und durchflusszytometrisch nach dem Ausblenden

GFP-negativer Zellen analysiert (Abb. 16). Dabei konnten die in den Ag8.H-Igα-, 38.B9-

und R5B-Zellsystemen gemachten Beobachtungen einer differentiellen Oberflächenex-

pression von µH-Ketten weitestgehend reproduziert werden. Lediglich die vorher unter-

schiedliche Oberflächenexpression der Idiotypen VH17.2.25 und VHλ5koI.36 zeigten in

den transduzierten primären Pro-B-Zellen keinen nachweisbaren Unterschied bzgl. der

Dichte ihrer Oberflächenexpression.

Ergebnisse

43

FI: µHC

Zell-oberfläche

intra-zellulär

37

46

41

4

4

6

Zellz

ahl

VH81XB

C2

VH81XF

VH3-3

2

42

54

72

8

8

35

VH

λ5koII.

82

VH

λ5koI.36

VH17.2

.25

Transduzierte primäre CD19+ B-Zellenaus dem Knochenmark

Zell-oberfläche

intra-zellulär

Rag2-/-/λ5-/- Rag2-/-/ λ5+/+

49

35

42

5

10

16

32

29

44

26

27

53

Abb. 16: Durchflusszytometrische Analyse der µH-Ketten-Synthese in transdu-zierten primären CD19-positiven Knochenmarkszellen. Primäre CD19+ Zellenaus dem Knochenmark von Rag2-/-/λ5+/+- und Rag2-/-/λ5-/--Mäusen wurden magne-tisch angereichert, retroviral mit den angegebenen µH-Ketten-Vektoren transduziert(offene Kurven) und anschließend auf ST2-Zellen kultiviert. 72 Stunden später er-folgte die Analyse der intrazellulären und Zelloberflächenexpression der µH-Ketten(µHC) nach Färbung mit spezifischen PE-markierten Antikörpern gegen µH-Kettenin lebenden GFP+ Zellen. Als Negativkontrolle wurde der GFP-kodierende retrovira-le pCIG-Vektor verwendet (graue Kurve). Die durchschnittliche Fluoreszenzintensi-tät (MFI, mean fluorescence intensity) µH-Ketten-transduzierter Zellen ist in jedemHistogramm oben rechts angegeben. Abk.: FI: Fluoreszenzintensität.

Ergebnisse

44

Während die dysfunktionelle VH81XF-µH-Kette im Vergleich zur Vektorkontrolle wie

erwartet weder in An- noch Abwesenheit einer SL-Kette an der Oberfläche nachweisbar

war (Abb. 16: obere Reihe), zeigten die funktionellen µH-Ketten unabhängig von ihrer

intrazellulären Expression Unterschiede in der Dichte ihrer jeweiligen Oberflächenexpres-

sion. Dabei war der Oberflächentransport von allen funktionellen µH-Ketten in Anwesen-

heit der SL-Kette (Abb. 16: rechte Histogramme) im Vergleich zur Abwesenheit der SL-

Kette (Abb. 16: linke Histogramme) deutlich erhöht. Schließlich konnten, wie erwartet, die

zuvor im Ag8.H-System als SL-unabhängig bestimmten µH-Ketten (Abb. 8) auf der Zell-

oberfläche von Prä-B-Zellen auch in Abwesenheit einer SL-Kette nachgewiesen werden.

Der als SL-abhängig klassifizierte VH81XBC2-Idiotyp konnte in primären Pro-B-Zellen in

Übereinstimmung mit den vorherigen Ergebnissen ebenfalls ausschließlich in Anwesenheit

der SL-Kette Transportkompetenz erreichen.

Neben der Analyse des Oberflächentransports wurde 24 und 72 Stunden nach Transdukti-

on der verschiedenen µH-Ketten in primäre CD19+ Knochenmarkszellen die jeweilige

Zellzahl pro Ansatz bestimmt, das Verhältnis von GFP-positiven zu GFP-negativen Zellen

in den einzelnen Kulturen berechnet und anschließend auf das Verhältnis von GFP-

positiven und -negativen Zellen der Vektorkontrolle pCIG (ohne µH-Kette) standardisiert

(Abb. 17). In Anwesenheit der SL-Kette zeigten alle mit funktionellen µH-Ketten transdu-

zierte Kulturen gegenüber der pCIG-transduzierten Kultur einen relativen Anstieg des

Verhältnisses von GFP+ zu GFP- Zellen (Abb. 17, schwarze Balken). Dabei korrelierte der

Grad der Induktion des Zellwachstums mit der zuvor beobachteten differentiellen µH-

Ketten-Dichte auf der Zelloberfläche (Abb. 16). In Abwesenheit der SL-Kette war der po-

sitive Einfluss von SL-Ketten-unabhängigen µH-Ketten auf das Zellwachstum signifikant

geringer. Die dysfunktionelle VH81XF-µH-Kette, die auch in Anwesenheit einer SL-Kette

nicht an der Zelloberfläche nachgewiesen werden konnte, hatte im Vergleich mit der Vek-

torkontrolle keinen messbaren Einfluss auf das Zellwachstum. In der Abwesenheit einer

SL-Kette unterstützten ausschließlich die zuvor als SL-unabhängig klassifizierten Idioty-

pen VH3-32, VH17.2.25, VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82 das Zellwachstum (Abb. 17, weiße

Balken). Auffallend war, dass sowohl der dysfunktionelle VH81XF- als auch der SL-

abhängige VH81XBC2-Idiotyp in Abwesenheit einer kompletten SL-Kette das Wachstum

reduzierte.

Ergebnisse

45

Rela

tive

Zunahm

eG

FP

+Zelle

nnach

72h

Kultur

0

1

2

Rag2-/-/λ5+/+

Rag2-/-/λ5-/-

*

* **

**

Abb. 17: Relative Zunahme transduzierter GFP/CD19-positiver Knochen-markszellen. Primäre CD19+ Zellen aus Rag2-/-/λ5+/+- (schwarze Balken) und Rag2-/-

/λ5-/- (weiße Balken)-Mäusen wurden magnetisch aufgereinigt, retroviral mit den an-gegebenen µH-Ketten-Idiotypen transduziert und anschließend in Dreifachansätzenauf ST2-Zellen kultiviert. Als Kontrolle wurden Zellen mit dem nur für GFP-kodierenden retroviralen Vektor pCIG transduziert. 24 und 72 Stunden später erfolg-te die Bestimmung der Zellzahl lebender Zellen mittels Durchflusszytometrie. Fürdie Auswertung wurde das Verhältnis von GFP-positiven zu GFP-negativen Zellenin µH-Ketten-transduzierten Kulturen zu beiden Zeitpunkten berechnet und auf denauf 1 gesetzten GFP+/GFP--Quotienten von pCIG-transduzierten Kulturen (gestri-chelte Linie) standardisiert. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für dreiunabhängige und in Dreifachansätzen durchgeführte Experimente. * = p < 0,05.

Diese Ergebnisse konnten auch durch Auftragen der absoluten Zahl GFP-positiver Zellen

über die Zeit verifiziert werden (Abb. 18). So unterstützten in Anwesenheit einer SL-Kette

alle funktionellen VH-Idiotypen das Zellwachstum transduzierter Pro-B-Zellen (Abb. 18:

linke Kurven). In Abwesenheit einer SL-Kette konnten jedoch, wie erwartet, nur die bei-

den funktionellen und SL-unabhängigen µH-Ketten VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82 das

Wachstum GFP+ Zellen unterstützen (Abb. 18: rechte Kurven). Die dysfunktionelle µH-

Kette VH81XF, die SL-abhängige µH-Kette VH81XBC2 ebenso wie die Vektorkontrolle

hatten hingegen einen negativen Effekt auf das innerhalb des Messzeitraums von drei Ta-

gen bestimmte Wachstum von GFP-positiven Zellen.

Ergebnisse

46

20 30 40 50 60 70 8000

20 30 40 50 60 700

2

4

6

8

10

800

Rag2-/-/λ5+/+ Rag2-/-/λ5-/-

Zellz

ahlx

1.0

00

Zeit [h]

pCIG

VHλ5koII.82

VH81XFVH81XBC2VHλkoII.36

Abb. 18: Zunahme der absoluten Zahl GFP-positiver Zellen. Primäre CD19+ Zel-len aus Rag2-/-/λ5+/+- (schwarze Balken) und Rag2-/-/λ5-/- (weiße Balken) -Mäusenwurden magnetisch aufgereinigt, retroviral mit den angegebenen µH-Ketten-Idiotypen transduziert und anschließend in Dreifachansätzen auf ST2-Zellen kulti-viert. Als Kontrolle wurden Zellen mit dem nur für GFP-kodierenden retroviralenVektor pCIG transduziert. 24 und 72 Stunden später erfolgte die Bestimmung derZellzahl lebender GFP+ Zellen mittels Durchflusszytometrie. Die dargestellten Er-gebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige und in Dreifachansätzen durchge-führte Experimente.

5.3.3 Analyse SL-abhängiger und SL-unabhängiger µH-Ketten invivo

Die bisherigen Untersuchungen beschränkten sich auf die Bestimmung der Transport- und

Signalkompetenz von µH-Ketten in immortalisierten B-lymphoiden Linien und isolierten

primären Pro-B-Zellen. Die aufgrund der durchgeführten Experimente mögliche Unter-

scheidung funktioneller µH-Ketten in SL-abhängige und SL-unabhängige µH-Ketten im-

pliziert, dass nur Prä-B-Zellen mit SL-unabhängigen µH-Ketten in der Lage sind, den Prä-

BZR-Kontrollpunkt in Abwesenheit einer SL-Kette zu passieren und eine weitere B-

Zellreifung in vivo einzuleiten, wie dies für die Sp6-µH-Kette bereits gezeigt wurde

(Schuh et al., 2003). SL-abhängige µH-Ketten sollten hingegen aufgrund der vorliegenden

Daten in Abwesenheit einer SL-Kette keine Transportkompetenz erreichen und keine Dif-

ferenzierung von Pro-B-Zellen in vivo einleiten. Vielmehr sollten SL-abhängige µH-Ketten

ohne Bindungspartner intrazellulär akkumulieren und vergleichbar zu einer dysfunktionel-

len µH-Kette, die ein signalkompetentes Kompartiment auf der Zelloberfläche sich entwi-

ckelnder B-Lymphozyten nicht erreichen kann, die weitere B-Zellreifung nicht mehr un-

terstützen.

Ergebnisse

47

Zur Überprüfung dieser Hypothese und zur Bestätigung, dass die in einem Zellkulturmo-

dell identifizierten SL-abhängigen µH-Ketten auch in vivo eine SL-Kette zur Signaliniti-

ierung benötigen, wurden verschiedene µH-Ketten-transgene Mauslinien verwendet. Dabei

exprimierten zwei dieser Linien jeweils eine in der hier vorliegenden Arbeit als SL-

unabhängig klassifizierte µH-Kette (VH3-32 bzw. VH17.2.25), während eine weitere trans-

gene Maus die SL-abhängige VH81XBC2-µH-Kette exprimierte (Martin et al., 1997). In

allen drei transgenen Mauslinien wurden durch Rückkreuzungen homozygote Deletionen

des λ5-Gens und teilweise auch des Rag2-Gens eingebracht. Das erlaubte, den Effekt der

jeweiligen transgenen µH-Kette in Abwesenheit einer SL-Kette und ohne störenden Ein-

fluss endogener µH-Ketten auf die Differenzierung c-kit+ Pro-B-Zellen durch den Prä-

BZR-Kontrollpunkt zu untersuchen. Zur Überprüfung des Übergangs zwischen Pro- und

Prä-B-Zellkompartiment wurde in Zusammenarbeit mit C. Vettermann (AG Jäck) und T.

Carvalho (AG Kearney, Birmingham, USA) Gesamtknochenmark aus den jeweiligen 7-8

Wochen alten Mäusen isoliert und lebende Lymphozyten entweder auf Pro-B-Zellen nach

Anfärben mit Alexa488-markierten CD19- und PE-markierten c-kit-Antikörpern oder auf

Prä-B-Zellen nach Anfärben mit Alexa488-markierten CD19- und PE-markierten CD25-

Antikörpern durchflusszytometrisch analysiert (Abb. 19).

Die beiden als SL-unabhängig klassifizierten Idiotypen VH3-32 und VH17.2.25 waren so-

wohl in An- als auch in Abwesenheit von λ5 und Rag2 in der Lage, die Differenzierung

von Pro- zu Prä-B-Zellen zu gewährleisten. In Gegenwart von λ5 war die Frequenz von

CD25-positiven Prä-B-Zellen im Vergleich zur λ5-/- Situation wie erwartet deutlich erhöht.

In der transgenen Maus, welche die SL-abhängige µH-Kette VH81XBC2 exprimierte,

konnten c-kit-positive Pro-B-Zellen den Prä-BZR-Kontrollpunkt hingegen nur in Anwe-

senheit von λ5 passieren. In Abwesenheit von λ5 wurde ein nahezu vollständiger Block der

B-Zellentwicklung am Übergang vom Pro- zum Prä-B-Stadium (d.h. dem Prä-BZR-

Kontrollpunkt) nachgewiesen. Das war auf den ersten Blick überraschend, da in Anwesen-

heit eines Rag1/2-Komplexes bei fehlenden µH-Kettensignalen nach dem Feedback-

Modell von Fred Alt eine Umlagerung endogener IgH-Gene stattfinden sollte. Das war

jedoch in der transgenen BC2-Maus nicht der Fall, da in Abwesenheit einer SL-Kette auch

in einer Rag-WT-Umgebung keine CD25-positiven Prä-B-Zellen nachweisbar waren (Abb.

19: 2. Reihe, 5. Histogramm). Das lässt die Spekulation zu, dass eine µH-Kette bereits von

einem intrazellulären Kompartiment eventuell über den sogenannten unfolded protein res-

ponse (UPR)-Weg Signale in den Zellkern sendet, die Umlagerungen am endogenen IgH-

Ergebnisse

48

Lokus verhindern. Alternativ könnte eine Überaktivierung des UPR eventuell eine termi-

nale pro-apoptotische Antwort auslösen (Meister et al., 2007). Dagegen spricht allerdings,

dass Pro-B-Zellen in diesen Mäusen noch vorhanden waren. Schließlich könnte auch die

µH-Ketten-mRNA unabhängig vom Proteinsignal einen negativen Einfluss auf die Umla-

gerung am IgH-Lokus haben (Lutz et al., 2006).

Abb. 19: Effekt SL-abhängiger und SL-unabhängiger µH-Ketten auf dieB-Zellreifung in transgenen Mäusen. Knochenmark aus 7-8 Wochen alten transge-nen Mäusen wurde isoliert und lebende Zellen im Lymphozytenfenster auf Pro-B-Zellen (Alexa488-CD19- und PE-c-kit-Antikörper) und auf Prä-B-Zellen (Alexa488-CD19- und PE-CD25-Antikörper) durchflusszytometrisch analysiert. Der prozentualeAnteil der markierten Populationen ist jeweils rechts oben angegeben. Die dargestell-ten Analysen wurden in Zusammenarbeit mit C. Vettermann und T. Carvalho durchge-führt und sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Abkürzungen: FI:Fluoreszenzintensität.

Die vor allem durch die Primärstruktur der CDR3-H bestimmten intrinsischen Eigenschaf-

ten einer VH-Region beeinflussen also maßgeblich den Transport von µH-Ketten an die

Zelloberfläche, wie hier in der Pro-B-Zelllinie R5B und in primären Pro-B-Zellen nachge-

wiesen werden konnte. Zudem zeigte sich eine klare Korrelation zwischen der Menge ei-

Ergebnisse

49

ner an der Zelloberfläche exprimierten µH-Kette und dem Ausmaß der induzierten Signal-

stärke nach einer Kreuzvernetzung des Prä-BZRs. Diese Korrelation konnte in unabhängi-

gen Ansätzen durch die Messung des Phosporylierungsstatus des in der Prä-BZR-

Signalkaskade eingebundenen Erk1/2, des Kalzium-Einstroms sowie der Zellwachstumsra-

te bestimmt werden. Durch den Vergleich der Signalkompetenz verschiedener µH-Ketten

in primären Pro-B-Zellen konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die zuvor als SL-

abhängig charakterisierte VH81XBC2-µH-Kette tatsächlich nicht in der Lage war, Signale

in Abwesenheit einer SL-Kette zu induzieren. In Anwesenheit einer SL-Kette zeigte die

VH81XBC2 µH-Kette hingegen nicht nur Transport-, sondern auch Signalkompetenz. Die

Eigenschaften von als SL-abhängig und -unabhängig charakterisierten µH-Ketten konnten

darüber hinaus in transgenen Mausmodellen in vivo verifiziert werden. Dabei konnten zwei

SL-unabhängige µH-Ketten eine weitere B-Zellentwicklung auch ohne SL-Kette vor-

antreiben, während die VH81XBC2-µH-Kette ausschließlich in Anwesenheit der SL-Kette

die weitere B-Zellentwicklung über das Pro-B-Zellstadium hinaus gewährleisten konnte.

5.4 Analyse muriner VH-Regionen

Die intrinsische Eigenschaft einer aus einem zufälligen Rearrangement der VH-, D- und JH-

Segmente resultierenden VH-Region prägt nicht nur die spätere Antigenspezifität, sondern

bestimmt auch die Paarungsfähigkeit einer µH-Kette mit einer SL- bzw. L-Kette (Huetz et

al., 1993; Keyna et al., 1995; Martin et al., 2003). Die in dieser Arbeit etablierten VH-

Bibliotheken dienten somit zum einen als Quelle für klonierbare VH-Regionen zur Unter-

suchung der autonomen Transport- und Signalkompetenz verschiedener VH-Idiotypen.

Zum anderen könnte die Sequenzierung von Klonen aus der VH-Bibliothek auch dazu die-

nen, mittels bioinformatischer Studien Strukturen bzw. Konsensusmotive in einer VH-

Region zu ermitteln, die die Paarung mit einer L-Kette sowie die Fähigkeit, auch ohne SL-

Kette die Zelloberfläche zu erreichen, bestimmen.

Neben jeweils zwei unabhängig voneinander etablierten VH-Bibliotheken aus der Milz von

WT- und λ5-defizienten Mäusen wurden für diese Analyse zusätzlich auch VH-Regionen

aus CD19+/c-kit+ Pro-B- und CD19+/CD25+ Prä-B-Zellen isoliert. In diesem Fall standen

insbesondere mögliche Veränderungen des VH-Repertoires vor und nach Passieren des

Prä-BZR-Kontrollpunktes im Vordergrund der Analyse. Gleichermaßen wurden die zuvor

Ergebnisse

50

auf Transport- und Signalkompetenz untersuchten µH-Ketten mit in die Analyse einbezo-

gen. Die Sequenzen der insgesamt 55 funktionellen µH-Ketten sollten aufgrund ihrer vor-

herigen Klassifizierung in SL-abhängige und SL-unabhängige µH-Ketten zusätzlichen

Aufschluss über die eine autonome Transportkompetenz vermittelnden Eigenschaften einer

VH-Region ermöglichen. Insbesondere gegebenenfalls vorhandene Übereinstimmungen in

den Unterschieden zwischen isolierten VH-Regionen aus der Milz von WT- und λ5-

defizienten Mäusen sowie den VH-Regionen der beiden Idiotyp-Subklassen sollten diese

speziellen Attribute hervorheben.

Die Analyse der VH-Regionen erfolgte dabei unter Verwendung der IMGT-Datenbank mit

Hilfe der hier verfügbaren Online-Werkzeuge (http://imgt.cines.fr) und unter Berücksichti-

gung der IMGT-Nomenklatur für Ig-Gensegmente und Definition der CDR3-H-Region

(siehe dazu auch Abb. 2 und Tab. 11). In Tabelle 3 ist die Anzahl aller für die Analyse

verwendeten VH-Regionen und ihre jeweilige Herkunft aufgelistet. Um einen Vergleich

der jeweiligen Mäuse und B-Zellkompartimente zu ermöglichen, wurden für die spätere

Auswertung und Darstellung in Diagrammen die prozentualen Anteile der jeweiligen µH-

Ketten berechnet.

Kompartiment WT λ5-/-

Pro-B n = 85 n = 69

Prä-B n = 35 n = 52

Milz n = 142 n = 146

VH-Idiotyp Subklassenfunktioneller µH-Ketten

SL-abhängig n = 14

SL-unabhängig n = 41

Tab. 3: Gesamtzahl (n) der analysierten VH-Regionen und ihre Herkunft.

Ergebnisse

51

5.4.1 Vergleichende Analyse der Verwendung von VH-, D- und JH-Gensegmenten in VH-Regionen von WT- und λ5-defizientenMäusen

Das Exon für die VH-Region wird während der Rekombination aus zufällig ausgewählten

VH-, D- und JH-Gensegmenten zusammengesetzt. Jedes dieser Gensegmente entstammt

dabei einem Pool mehrerer verfügbarer Segmente (vgl. Tab. 1) und besitzt aufgrund von

Unterschieden in der jeweiligen Nukleotidsequenz individuelle Eigenschaften, die zur Ent-

stehung der Antikörpervielfalt beitragen. Gleichzeitig beeinflussen diese Merkmale jedoch

auch die strukturelle Integrität und Faltung der H-Kette. Aufgrund dessen könnten die At-

tribute, die einen autonomen Oberflächentransport von µH-Ketten begünstigen, in der

Verwendung bevorzugter VH-, D- und JH-Gensegmente begündet sein. Falls dies der Fall

ist, sollte in µH-Ketten, die in einer λ5-defizienten Maus die Passage von Prä-B-Zellen

durch den Prä-BZR-Kontrollpunkt erlauben, präferentiell und gehäuft eine bestimmte

Kombination von VH-, D- und/oder JH-Segmenten vorkommen. Die gleiche Überlegung

gilt auch für SL-unabhängige VH-Idiotypen. Dazu wurden über eine vergleichende Daten-

bankanalyse die in den µH-Ketten vorkommenden VH, D- und JH-Gensegmente bestimmt

(Abb. 20).

Die Verwendung eines degenerierten VH-Primers führte zu einem Auftreten von VH-

Segmenten aus 13 der insgesamt 15 bekannten VH-Familien (Abb. 20: linke Diagrammrei-

he). Die VH1-Familie mit der höchsten Anzahl vorkommender Keimbahnsegmente war in

der hier gezeigten Studie unter allen analysierten µH-Ketten, egal aus welcher Maus oder

welchem B-Zellkompartiment sie isoliert wurden, die anteilsmäßig größte Fraktion. Die

statistisch signifikante unterschiedliche Verteilung der VH-Familien 1, 2, 3 und 14 in den

isolierten VH-Regionen aus der Milz von WT- und λ5-defizienten Mäusen konnte im Ver-

gleich von SL-abhängigen zu SL-unabhängigen µH-Ketten jedoch nicht reproduziert wer-

den. Die hier gefundenen Unterschiede waren mit Ausnahme des gehäuften Vorkommens

von Mitgliedern der VH5-Familie in SL-abhängigen µH-Ketten nicht signifikant.

Ergebnisse

52

0

20

40

60

80

WT

l5-/

-

0

20

40

60

80

WT

l5-/

-

0

20

40

60

80

WT

l5-/

-

*

**

*

0

20

40

60

80

SL

C-

de

pe

nd

ent

*

Pro-B Prä-B MilzVH-

Idiotypen

AnalysierteVH-Regionen[%]

0

10

20

30

40

SL

C-d

ep

end

ent

SL

C-i

nd

ep

end

ent

0

10

20

30

40

WT

l5-/

- *

0

20

40

WT

l5-/

-

*

0

20

40

WT

l5-/

-

0

20

40

60

80

JH

1JH

2JH

3JH

4

WT

l5-/

-

0

20

40

60

80

JH

1JH

2JH

3JH

4

WT

l5-/

-

0

20

40

60

80

JH

1JH

2JH

3JH

4

WT

l5-/

-

*

0

20

40

60

80

JH

1JH

2JH

3JH

4

SL

C-d

ep

end

ent

SL

C-i

nd

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*

VH-F

am

ilie

D-S

eg

me

nt

JH-S

eg

me

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WT

λ5-/

-

SL-a

bhängig

SL-u

nabhängig

WT

λ5-/

-

WT

λ5-/

-

Ab

b.

20.

An

aly

sed

er

vo

rko

mm

en

de

nV

H-,

D-

un

dJ

H-G

en

segm

ente

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VH

-Reg

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erg

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Date

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ana

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unte

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dar

gest

ellt.

Abk

.:nd

=k

eine

Zuo

rdnu

ng

mö

glic

h;*

=p

<0,0

5.

Ergebnisse

53

In allen analysierten Kompartimenten konnten Mitglieder der bekannten D-Segmente

nachgewiesen werden (Abb. 20: mittlere Diagrammreihe). Da jedoch während der VDJ-

Rekombination das D-Segment durch Deletionen bzw. das Hinzukommen nicht-

keimbahnkodierter Nukleotide im Vergleich zu den V- und J-Segmenten am stärksten ver-

ändert wird, war der Anteil nicht mehr zuordnungsfähiger (nd) D-Segmente erwartungs-

gemäß hoch. Im Vergleich isolierter µH-Ketten aus Prä-B-Zellen von WT- und λ5-

defizienten Mäusen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen, nicht zu einer Keim-

bahnsequenz zuordnungsfähigen D-Segmenten nachgewiesen werden. Insgesamt waren

die gefundenen Unterschiede in allen analysierten Kompartimenten trotz zum Teil großer

prozentualer Abweichungen jedoch nicht signifikant und sind insbesondere bei der ver-

gleichenden Analyse von SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten auf die in man-

chen Fällen zu geringe Anzahl analysierter VH-Regionen zurückzuführen.

Die vier murinen JH-Segmente konnten bei allen analysierten VH-Regionen fehlerfrei zu-

geordnet werden (Abb. 20: rechte Diagrammereihe). Hier zeigte sich ein statistisch gehäuf-

tes Auftreten von JH4-Segmenten sowohl in µH-Ketten aus der Milz λ5-defizienter Mäuse

als auch in SL-unabhängigen µH-Ketten.

5.4.2 Analyse der CDR-H3

Als das direkte Produkt der VDJ-Rekombination stellt die CDR-H3 innerhalb des Antikör-

per-Repertoires die Struktur mit der höchsten Variabilität dar. Sie ist daher der Schlüssel-

faktor für die Antigenspezifität und befindet sich in zentraler Position der späteren Anti-

genbindestelle (Collis et al., 2003; Barrios et al., 2004). Zusätzlich scheint die Verknüp-

fungssequenz von entscheidender Bedeutung für das Passieren des Prä-BZR-

Kontrollpunktes während der frühen B-Zellentwicklung zu sein. So beeinflusst die jeweils

einzigartige CDR-H3 die Paarungsfähigkeit einer µH-Kette mit einer SL- bzw. L-Kette

und bestimmt dadurch die weitere Entwicklung der davon betroffenen B-Zelle (Keyna et

al., 1995; Martin et al., 2003). Eine mögliche Selektion funktioneller µH-Ketten anhand

der Qualitätsmerkmale ihrer CDR-H3 wird dabei durch computerbasierte Strukturanalysen

des Prä-BZRs unterstützt. Diese zeigten, dass die unique tails der SL-Kette sich in direkter

Nähe zur CDR-H3 befinden (Lanig et al., 2004; Bankovich et al., 2007). Dadurch könnten

spezifische Attribute, die beispielsweise die strukturellen Eigenschaften einer Verknüp-

fungssequenz festlegen, entscheidend die Bindung einer µH-Kette an eine SL-Kette be-

Ergebnisse

54

einflussen. Sollte dies der Fall sein, müsste der Vergleich von CDR-H3s aus WT- und λ5-

defizienten Mäusen bzw. von SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten diese Un-

terschiede widerspiegeln. Daher wurden parallel zu der bereits vorgestellten Analyse der

VH-Region insbesondere die spezifischen Merkmale der CDR-H3 sowohl auf genetischer

als auch auf proteomischer Ebene untersucht. Dazu gehörten das verwendete Leseraster

des D-Segmentes, die Länge der CDR-H3, die Frequenz der vorkommenden Aminosäuren,

die spezifische molekulare Masse sowie der isoelektrische Punkt (Abb. 21 und 22). Zur

Bestimmung der Lage der CDR-H3 innerhalb einer VH-Region wurde die Definition nach

IMGT verwendet. Dabei befindet sich die Verknüpfungssequenz, flankiert von den inva-

rianten Aminosäuren Cystein und Tryptophan, zwischen den Aminosäurepositionen 104

und 118 einer VH-Region (Lefranc et al., 2003, vgl. Abb. 2). Für die Bestimmung der Fre-

quenz der in der CDR3-H vorkommenden Aminosäuren wurde der internationale Ein-

Buchstaben-Code verwendet (Tab. 12). Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit

einem Stern (*) markiert. Zum Teil war die Anzahl der zur Verfügung stehenden CDR-H3

sehr gering, so dass der hier verwendete Fisher’s Exact Test zwar einen p-Wert < 0,05

ergab, aufgrund der in diesen Fällen zu geringen Vergleichsmenge (n < 5) jedoch keine

statistisch gesicherte Aussage möglich war. Die davon betroffenen Vergleiche wurden mit

einer Raute (#) gekennzeichnet.

Die Längen der analysierten Verknüpfungssequenzen in µH-Ketten aus einer WT-Maus

bewegten sich über die drei B-Zellkompartimente innerhalb einer Gauß`schen Normalver-

teilung um einen Mittelwert von 11,5 Aminosäuren (Abb. 21, linke Diagrammreihe). Da-

bei stimmte die Längenverteilung mit bereits publizierten Daten überein (Zemlin et al.,

2003). Signifikante Unterschiede zwischen WT- und λ5-defizienten Mäusen konnten in der

Länge einer CDR-H3 mit 10 Aminosäuren bzw. von CDR-H3s mit 5 und 13 Aminosäuren

in Prä-B-Zellen bzw. Milz-B-Zellen nachgewiesen werden. Insbesondere der Anteil auffal-

lend kurzer CDR-H3s mit einer Länge von 5 Aminosäuren war in der λ5-defizienten Maus

um das Vierfache höher als in einer WT-Maus. Die Analyse von CDR3-Längen in SL-

abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten zeigte hingegen keine signifikanten Unter-

schiede.

Ergebnisse

55

0

10

20

30

23

45

67

89

10

11

12

13

14

15

16

17

18

WT

l5-/

-

#

0

10

20

30

23

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17

18

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0

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17

18

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17

18

SLC

-dep

ende

nt

SLC

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ep

end

ent

Pro-B Prä-B MilzVH-

Idiotypen

AnalysierteVH-Regionen[%]

CD

R-H

3:

Lä

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WT

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-

WT

λ5-/

-

WT

λ5-/

-

CD

R-H

3:

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SL

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bhängig

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CD

R-H

3:

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sch

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=p

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,05.

Ergebnisse

56

Mehrere signifikante Unterschiede konnten in der Frequenz der vorkommenden Amino-

säuren nachgewiesen werden (Abb. 21: mittlere Diagrammreihe). So waren die Aminosäu-

ren Arginin (R), Histidin (H), Serin (S) und Leucin (L) in CDRH-3s aus dem Pro-B-

Zellkompartiment von WT- und λ5-defizienten Mäusen unterschiedlich vertreten, während

in Prä-B-Zellen beider Mäuse sehr ähnliche Aminosäurefrequenzen nachweisbar waren.

Der Vergleich der Verknüpfungssequenzen von isolierten µH-Ketten aus der Milz zeigte

signifikante Unterschiede zwischen WT- und λ5-defizienten Mäusen bei den Aminosäuren

Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Histidin (H), Serin (S), Threonin (T), Phenylala-

nin (F) sowie Isoleucin (I). Diese Unterschiede konnten zumindest im Fall von Asparagin-

säure (D) sowie Threonin (T) auch zwischen SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-

Ketten bestätigt werden. Zusätzlich zeigte sich hier eine signifikante Anreicherung der

Aminosäure Glycin in SL-unabhängigen µH-Ketten.

Signifikante Unterschiede zwischen WT- und λ5-defizienten Mäusen konnten im verwen-

deten Leseraster (reading frame, RF) des jeweiligen D-Segmentes im Pro-B-Zellstadium

nachgewiesen werden (Abb. 21: rechte Diagrammreihe). Während RF2 häufiger in CDR-

H3s aus λ5-defizienten Mäusen vorkam, zeigten WT-Mäuse eine Präferenz für RF3. Diese

Tendenz war auch in Prä-B- sowie in isolierten B-Zellen aus der Milz einer WT-Maus

nachweisbar. In SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten zeigten sich hingegen

keine signifikanten Unterschiede in der Verwendung eines bestimmten RF im D-Segment.

Bei einigen Verknüpfungssequenzen war es jedoch nicht mehr möglich, das Leseraster der

Keimbahnsequenz eines D-Segmentes zuzuordnen (nd).

Die Analyse der jeweiligen Molekularmasse der nachgewiesenen CDR-H3 ergab weder in

Pro- noch in Prä-B-Zellen einen signifikanten Unterschied zwischen WT- und λ5-

defizienten Mäusen (Abb. 22: linke Diagrammreihe). In isolierten µH-Ketten aus der Milz

λ5-defizienter Mäuse traten Verknüpfungssequenzen mit einer geringeren molekularen

Masse von 900 und 1000 gehäuft auf, während CDR-H3s mit einer Masse von 1500 und

1800 signifikant häufiger bei µH-Ketten aus WT-Mäusen nachweisbar waren. Bei der

Analyse von SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten trat die Anreicherung von

CDR-H3s in SL-abhängigen Ketten mit einem Molekulargewicht von 1500 noch deutli-

cher hervor, während die anderen Unterschiede nicht mehr statistisch signifikant waren.

Ergebnisse

57

0

20

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

*

* *

0

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40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

WT

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40 SLC-dependent

SLC-independent

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VH-

Idio

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VH-R

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n[%

]CDR-H3:

Molekulare MasseCDR-H3:

Isoelektrischer Punkt

WTλ5-/-

SL-abhängigSL-unabhängig

WTλ5-/-

WTλ5-/-

Abb. 22: Analyse der molekularen Masse und des isoelektrischen Punktes derCDR-H3. Alle aus den angegeben Kompartimenten isolierten VH-Regionen wurdeneiner vergleichenden Datenbankanalyse unterzogen und die prozentualen Anteile ander jeweiligen Gesamtmenge dargestellt. Abk.: # = zu geringe Anzahl für eine statis-tisch gesicherte Aussage; * = p < 0,05.

Mehrere signifikante Unterschiede hinsichtlich des isoelektrischen Punktes der analysier-

ten CDR-H3s konnten zwischen WT- und λ5-defizienten Mäusen im Pro-B-Zellstadium

nachgewiesen werden (Abb. 22: rechte Diagrammreihe). So zeigten die Verknüpfungsse-

quenzen aus WT-Mäusen eine Tendenz zu CDR-H3s mit einem isoelektrischen Punkt

kleiner als 9. Dabei waren die pHi-Werte von 6 und 8 statistisch signifikant. Ein isoelektri-

scher Punkt von 12 konnte signifikant häufiger bei CDR-H3s aus λ5-defizienten Mäusen

Ergebnisse

58

gezeigt werden. Diese im Pro-B-Zellkompartiment gemachten Beobachtungen waren je-

doch in Prä-B-Zellen nicht mehr nachweisbar. Die analysierten Verknüpfungssequenzen

aus der Milz zeigten im Vergleich zu λ5-defizienten Mäusen hingegen erneut eine Ver-

schiebung des isoelektrischen Punktes zu niedrigeren pH-Werten bei WT-Mäusen. In die-

sem Fall waren die pHi-Werte von 4 und 6 statistisch signifikant, während CDR-H3s aus

λ5-defizienten Mäusen überwiegend einen pHi-Wert von 9 und 13 zeigten. Tendenziell,

jedoch nicht statistisch signifikant, waren diese Unterschiede auch beim Vergleich von SL-

abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten nachweisbar. Niedrigere pHi-Werte traten

besonders häufig in CDR-H3s von SL-abhängigen µH-Ketten auf, während SL-

unabhängige µH-Ketten häufiger CDR-H3s mit einem höheren isoelektrischen Punkt auf-

wiesen.

5.5 Untersuchungen zur Affinität von VH-Idiotypen zu BiP

Innerhalb der vorliegenden Arbeit konnten hinsichtlich ihrer Transportkompetenz in Ab-

wesenheit von SL-Ketten zwei Gruppen funktioneller µH-Ketten nachgewiesen werden:

SL-abhängige µH-Ketten waren ausschließlich in Anwesenheit einer SL- oder L-Kette auf

der Zelloberfläche detektierbar, SL-unabhängige µH-Ketten besaßen hingegen auch in

Abwesenheit einer SL-Kette Transportkompetenz. Dabei war die Menge der an der Zell-

oberfläche exprimierten µH-Ketten der Schlüsselfaktor, welcher in erster Linie über die

Stärke des initiierten Signals entschied. Obwohl das Vorhandensein der SL-Kette die Höhe

der Oberflächenexpression maßgeblich verstärkte, blieben differenzielle Unterschiede in

der Transportkompetenz unterschiedlicher µH-Ketten auch in Abwesenheit einer SL-Kette

bestehen. Diese Befunde zeigen zum einen, dass die meisten VH-Idiotypen auch autonom

an die Oberfläche gelangen und daher lediglich hinsichtlich der Verstärkung ihrer Signal-

kapazität auf die SL-Kette angewiesen sind. Zum anderen trägt die SL-Kette entscheidend

zur Ablösung von SL-abhängigen µH-Ketten von BiP bei. Die zugrunde liegenden Mecha-

nismen, warum manche µH-Ketten autonom und andere nur SL-abhängig transportkompe-

tent sind, sowie die differentielle Oberflächenexpression von unterschiedlichen VH-

Idiotypen scheinen jedoch in erster Linie von den intrinsischen Eigenschaften einer VH-

Region selbst und ihrer spezifischen Affinität zu BiP abhängig zu sein, wodurch der Grad

der Oberflächendichte eines VH-Idiotyps und seine Repräsentation im späteren Antikörper-

Repertoire entscheidend bestimmt werden.

Ergebnisse

59

Frühere Publikationen zeigten, dass die Struktur der VL-Region maßgeblich die Affinität

einer L-Kette zu BiP bestimmt (Leitzgen et al., 1997; Whitcomb et al., 2003). Um dies

auch für VH-Idiotypen zu verifizieren, wurden verschiedene µH-Ketten-Idiotypen aus

transduzierten Ag8.H-Zellen präzipitiert und mittels Westernblot-Analyse die Menge von

ko-präzipitiertem BiP ermittelt. Für diese Versuche wurde die originale Ag8.H-Linie und

keine Ag8.H-Igα-Zellen verwendet. Da Igα für den Oberflächentransport einer µH-Kette

essentiell ist (Hombach et al., 1988), wurden somit alle transduzierten µH-Ketten aufgrund

des Fehlens von Igα unabhängig von ihrer vorher gezeigten autonomen Transportfähigkeit

intrazellulär im ER zurückgehalten. Dadurch wurden die Voraussetzungen für einen direk-

ten Vergleich der Affinität SL-abhängiger und SL-unabhängiger µH-Ketten zu BiP ge-

schaffen. Für die Durchführung der Immunpräzipitationen wurde das bereits vorgestellte

µH-Ketten-Set bestehend aus dem dysfunktionellen VH81XF- und dem SL-abhängigen

VH81XBC2-Idiotyp sowie den SL-unabhängigen µH-Ketten-Idiotypen VH3-32, VH17.2.25,

VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82 verwendet und retroviral in Ag8.H-Zellen transduziert. An-

schließend wurden 3 x 106 GFP+ Zellen lysiert und BiP/µHC-Aggregate mit einem spezifi-

schen gegen µH-Ketten gerichteten Antikörper präzipitiert. Nach einer elektrophoretischen

Auftrennung wurden die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und mit spe-

zifischen Antikörpern gegen die präzipitierten µH-Ketten und ko-präzipitiertes BiP analy-

siert (Abb. 23). Lysepuffer allein und das Präzipitat aus Ag8.H-Zellen transduziert mit dem

nur für GFP-kodierenden Vektor pCIG dienten dabei als Negativkontrollen (Abb. 23: Spu-

ren 1 und 2). Im Anschluss an die Antikörperfärbungen wurde die Membran densitomet-

risch ausgewertet und das daraus resultierende Verhältnis der Menge von ko-präzipitiertem

BiP zu präzipitierter µH-Kette als Diagramm dargestellt (Abb. 23: unten).

Obwohl die Menge der verschiedenen µH-Ketten in den anti-µH-Ketten-Präzipitaten nahe-

zu identisch war, unterschieden sich die Signale des ko-präzipitierten BiP deutlich. Die

aufgetragene Reihenfolge entsprach dabei von links nach rechts der in den Zellkultursys-

temen nachgewiesenen steigenden Oberflächenexpressionen der verschiedenen µH-Ketten

(Abb. 23: Spuren 3-8). Dabei konnte in Präzipitaten mit der dysfunktionalen VH81XF-µH-

Kette mit einer nicht nachweisbaren Expression an der Zelloberfläche die höchste Menge

(Abb. 23: Spur 3) und in Präzipitaten mit der SL-unabhängigen VHλ5koII.82-µH-Kette mit

der höchsten Dichte auf der Zelloberfläche das geringste Signal an BiP detektiert werden

(Abb. 23: Spur 8). Die Menge an BiP-Signalen in den anti-µH-Ketten-Präzipitaten korre-

Ergebnisse

60

lierte also umgekehrt proportional zum Ausmaß der Oberflächenexpression der jeweiligen

funktionellen µH-Ketten (Abb. 23: Spuren 2-8).

VH17.2

.25

VH

λ5koI.36

µHC (WB)

BiP (WB)

VH3-3

2

VH

λ5koII.

82

kDa VH81XF

VH81XB

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IP: anti-µHC

TransduzierteAg8.H

Verh

ältnis

BiP

:µH

C

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96

66

1 2 3 4 5 6 7 8

0

0,2

0,4

0,6

0,8

96

66

Abb. 23: Untersuchungen zur Affinität unterschiedlicher µH-Ketten-Idiotypenzu BiP. Ag8.H-Zellen wurden mit den angegebenen µH-Ketten-Idiotypen retroviraltransduziert. Anschließend wurden 3 x 106 GFP+ Ag8.H-Zellen lysiert und µH-Ketten/BiP-Aggregate mit einem Antikörper gegen µH-Ketten präzipitiert. Nachelektrophoretischer Auftrennung und Transfer wurden die präzipitierten Proteine mitden angegebenen Antikörpern analysiert. Die Reihenfolge der aufgetragenen Probenentspricht von links nach rechts einer steigenden Oberflächenexpression von µH-Ketten. Die Positionen des Molekularmassenstandards sind links, die von µH-Kette(µHC) und BiP rechts gekennzeichnet. Im unteren Abschnitt ist das mittels Densito-metrie bestimmte Verhältnis der Signale von ko-präzipitiertem BiP und präzipitierterµH-Kette dargestellt. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für eines vondrei unabhängig durchgeführten Experimenten.

Mit den hier durchgeführten Immunpräzipitationsstudien konnte gezeigt werden, dass die

Bindungsaffinität einer µH-Kette zu BiP maßgeblich von ihrem VH-Idiotyp beeinflusst

wird. So zeigte die dysfunktionelle µH-Kette eine vergleichsweise hohe, während bei

funktionellen µH-Ketten eine schwächere Affinität zu BiP nachweisbar war. Diese Unter-

schiede standen dabei in klarem Zusammenhang mit der zuvor nachgewiesenen differen-

tiellen Oberflächenexpression der getesteten µH-Ketten und zeigen, dass BiP tatsächlich

maßgeblich die Oberflächendichte eines VH-Idiotypen und damit seine finale Repräsentati-

on im peripheren Antikörper-Repertoire bestimmt.

Diskussion

61

6 Diskussion

Die Expression des Prä-BZRs stellt einen entscheidenden Kontrollpunkt innerhalb der frü-

hen Entwicklung von B-Zellen dar. Dieser membranständige Rezeptorkomplex besteht aus

einem µH-Dimer, welches mit zwei SL-Ketten, bestehend aus den Untereinheiten λ5 und

VpreB, sowie der Signaltransduktionseinheit Igα/β assoziiert ist (zusammengefasst in Vet-

termann et al., 2006). Voraussetzung für den Transport in ein signalkompetentes Kompar-

timent an der Zelloberfläche ist die Ablösung von BiP, einem Chaperon, welches unvoll-

ständig gefaltete Immunglobulinketten im ER zurückhält. BiP bindet dabei an die Cµ1-

Domäne von µH-Ketten und wird nach dem gängigen Modell im Prä-B-Zellstadium durch

die Paarung einer SL-Kette mit einer µH-Kette verdrängt (Haas et al., 1983; Hendershot et

al., 1988; Lee et al., 1999). Überraschenderweise zeigten neuere Befunde, dass die trans-

gene µH-Kette-Sp6 auch in Abwesenheit der SL-Kette nicht nur die Zelloberfläche er-

reicht, sondern darüber hinaus Proliferations- und Differenzierungssignale induziert

(Schuh et al., 2003; Galler et al., 2004). Unklar ist jedoch, ob es sich hier um eine generel-

le Eigenschaft aller µH-Ketten handelt oder nur eine spezielle, nur wenige µH-Ketten um-

schließende Subgruppe diese Fähigkeit besitzt. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es die

Frequenz dieser transportautonomen µH-Ketten zu bestimmen. Neben der Transportkom-

petenz verschiedener µH-Ketten wurde außerdem die Signalkapazität im Verhältnis zur

Oberflächenexpression von µH-Ketten in An- und Abwesenheit der SL-Kette sowohl in

vitro als auch in vivo untersucht. Dazu wurden zufällig ausgewählte µH-Ketten aus zwei zu

Beginn dieser Arbeit aus der Milz von WT- und λ5-defizienten Mäusen etablierten VH-

Bibliotheken verwendet. Die vergleichende Sequenzanalyse der klonierten µH-Ketten soll-

te zusätzlich eine mögliche Korrelation zwischen einem autonomen Oberflächentransport

sowie der spezifischen Aminosäurezusammensetzung der VH-Region aufzeigen. Desweite-

ren sollten Ko-Immunpräzipitationsstudien zeigen, inwieweit die VH-Region die Affinität

einer µH-Kette zu BiP beeinflusst.

Auf den folgenden Seiten sollen die Ergebnisse dieser Arbeit nochmals zusammengefasst

und deren biologische Relevanz diskutiert werden.

Diskussion

62

6.1 Transportkompetenz von µH-Ketten in An- und Abwesen-heit einer SL- bzw. L-Kette

Die nachgewiesene Oberflächenexpression der zufällig ausgewählten µH-Kette-Sp6 in

Abwesenheit einer SL- bzw. L-Kette deutete bereits an, dass zumindest ein Teil aller funk-

tionellen µH-Ketten zu einem autonomen Oberflächentransport befähigt sein sollte (Schuh

et al., 2003; Galler et al., 2004). Zur Bestimmung der Frequenz von µH-Ketten mit einer

SL-unabhängigen Oberflächenexpression wurde daher die Plasmozytomlinie Ag8.H-Igα

als experimentelles Zellkultursystem etabliert (Metzner, 2004). Parallel zu den hier durch-

geführten Arbeiten wurde Ag8.H-Igα im Rahmen einer Diplomarbeit mittels RT-PCR,

Durchflusszytometrie und proteinbiochemischen Methoden weitergehend analysiert (Mor-

tha, 2006). Aufgrund dieser Studien konnte eine Verfälschung der Ergebnisse durch das

Vorhandensein von SL- und L-Ketten und vor allem auch alternativen Paarungspartnern in

Ag8.H-Igα nahezu ausgeschlossen werden. Postuliert werden in diesem Zusammenhang

neben vorzeitig rearrangierten L-Ketten bzw. deren translatierten Keimbahntranskripte

auch Proteine mit Ig-Domänen wie VpreB oder BILL-Cadherin (Ohnishi et al., 1994; Mel-

chers, 2005; McKeller et al., 2006). Das Vorhandensein eines noch unbekannten Bin-

dungspartners konnte in Ag8.H-Igα durch vergleichende Ko-Immunpräzipitationsstudien

einer dysfunktionellen und einer funktionellen µH-Kette unter verschiedenen Lysebedin-

gungen ebenfalls nicht nachgewiesen werden (Mortha, 2006). Dennoch kann aufgrund des

nicht vollständig möglichen Ausschlusses eines bisher noch unbekannten Interaktionspart-

ners ein autonomer Oberflächentransport von µH-Ketten in Ag8.H-Igα nie eindeutig nach-

gewiesen werden, ist aber zum jetzigen Kenntnisstand als sehr wahrscheinlich anzusehen.

Publizierte Daten aus den Arbeitsgruppen Jäck und Wu zeigten bereits eine enge Korrela-

tion der spezifischen Eigenschaften der VH-Region und der Funktionalität einer µH-Kette

(Keyna et al., 1995; Martin et al., 2003). Die Paarungsfähigkeit einer µH-Kette mit einer

SL- bzw. L-Kette wird dabei maßgeblich von den verwendeten VH-, D- und JH-Gen-

segmenten beeinflusst, wodurch ausschließlich Prä-B-Zellen mit einer funktionellen µH-

Kette klonal expandiert werden können. Die negative Selektion dysfunktioneller µH-

Ketten durch die SL-Kette ist daher innerhalb der frühen B-Zellentwicklung ein kritischer

Schritt zur effizienten Etablierung der späteren Antikörpervielfalt. Der zu Grunde liegende

Mechanismus dabei ist, dass µH-Ketten anhand ihrer spezifischen VH-Region durch die

SL-Kette auf ihre Paarungseigenschaft geprüft, durch diese Interaktion von BiP abgelöst

Diskussion

63

werden und nach Transport an die Zelloberfläche Signale für eine weitere B-

Zellentwicklung initiieren (zusammengefasst in Vettermann et al., 2006). Da die VH-

Region offensichtlich der entscheidende Faktor hinsichtlich der Funktionalität ist, wurde

zur Bestimmung der Frequenz von µH-Ketten mit einer SL-Ketten-unabhängigen Trans-

portkompetenz eine ausreichend große Menge klonierbarer VH-Regionen bereitgestellt und

die transduzierten µH-Ketten mittels durchflusszytometrischen Analysen auf die intrazel-

luläre Expression sowie die jeweilige Oberflächendichte in An- und Abwesenheit der SL-

Kette bestimmt (Abb. 8). Dabei konnte der frühere Nachweis einer differentiellen Oberflä-

chenexpression verschiedener Prä-BZRen in SL-Ketten-exprimierenden 38.B9-Zellen klar

bestätigt werden (Kawano et al., 2006). Neu hingegen ist, dass diese Unterschiede auch in

Abwesenheit der SL-Kette nachweisbar waren. Besonders auffällig war dabei die graduelle

Verschiebung in der Höhe der Oberflächenexpression von µH-Ketten in An- und Abwe-

senheit der SL-Kette. So waren µH-Ketten mit einer geringen Oberflächendichte wie die

VH81XBC2 sowohl in An- als auch in Abwesenheit der SL-Kette im Verhältnis schwächer

transportkompetent als andere µH-Ketten. Die differentiellen sowie die graduellen Unter-

schiede in der Oberflächenexpression konnten sowohl in der SL-Ketten-exprimierenden

Zelllinie R5B als auch in primären Pro-B-Zellen aus λ5+/+- und λ5-/--Mäusen reproduziert

werden. Diese Daten stehen damit im Widerspruch zu Kawano et al. (2006), da der hier

postulierte SL-Ketten-vermittelte Selektionsmechanismus über unterschiedliche Oberflä-

chenexpressionen nicht gegeben ist. Vielmehr deuten die gewonnenen Erkenntnisse eine

SL-unabhängige, BiP-vermittelte Selektion von µH-Ketten an. Zum einen konnte die diffe-

rentielle Oberflächenexpression von funktionellen VH-Idiotypen sowohl in An- als auch in

Abwesenheit der SL-Kette nachgewiesen werden. Zum anderen war die Retention von

dysfunktionellen µH-Ketten auch in Anwesenheit einer SL-Kette funktionsfähig. Dadurch

kommt der SL-Kette in erster Linie eine Rolle zur Erhöhung der Transportrate des Prä-

BZRs an die Zelloberfläche und dadurch zur Verstärkung von Prä-BZR-Signalen zu. Die

Selektion funktioneller µH-Ketten sowie die differentielle Oberflächenexpression von µH-

Ketten und dem damit verbundenen unterschiedlichen Beitrag zum späteren Antikörper-

Repertoire werden jedoch maßgeblich von den spezifischen Eigenschaften einer VH-

Region und ihrer Affinität zu BiP bestimmt.

Durch die stets parallel durchgeführten durchflusszytometrischen Analysen konnte zusätz-

lich ein direkter Vergleich der Menge von µH-Ketten in der Zelle und auf der Zelloberflä-

che durchgeführt werden. In diesem Zusammenhang ist anzunehmen, dass Zellen mit einer

Diskussion

64

hohen intrazellulären Expression gleichzeitig auch eine hohe Oberflächenmenge der trans-

duzierten µH-Kette aufweisen. Diese Korrelation war zum Teil gegeben. So zeigten die

exemplarisch in Abb. 8 dargestellten Daten, dass µH-Ketten sowohl in Ag8.H-Igα- als

auch in 38.B9-Zellen einen unterschiedlich stark ausgeprägten Zusammenhang zwischen

intrazellulärer Expressionsrate und Oberflächentransport aufweisen. In R5B-Zellen konnte

jedoch eine Entkopplung dieses Mechanismus nachgewiesen werden. Hier zeigten die µH-

Ketten VH81XF und VH81XBC2 die höchsten intrazellulären Expressionsraten (Abb. 12).

Gleichzeitig war der dysfunktionelle VH81XF-Idiotyp überhaupt nicht und der funktionelle

VH81XBC2-Idiotyp im Verhältnis zu den anderen getesteten VH-Idiotypen in geringeren

Mengen an der Zelloberfläche nachweisbar. Während durch die Verwendung des retrovira-

len Expressionsvektors pCHIG zwischen den verschiedenen Transfektanten meist sehr gut

vergleichbare intrazelluläre Mengen an µH-Ketten erzielt werden konnten, zeigte die funk-

tionelle µH-Kette VHλ5koII.82 jedoch stets die höchste intrazelluläre Expression intrazel-

lulär und auch die stärksten Oberflächensignale auf Ag8.H-Igα-, 38.B9- und primären Pro-

B-Zellen. In diesem speziellen Fall wäre denkbar, dass andere exprimierte VH-Idiotypen

zunächst unvollständig gefaltet im ER weitestgehend zurückgehalten und zumindest zum

Teil abgebaut werden. Der VHλ5koII.82-Idiotyp könnte hingegen aufgrund der individuel-

len Eigenschaften seiner VH-Region autonom seine Cµ1-Domäne falten, dadurch einem

vorzeitigen Abbau entgehen und intrazellulär stärker exprimiert vorliegen. Diese Hypothe-

se wird zum einen von dem im Vergleich zu anderen µH-Ketten sehr hohen autonomen

Oberflächentransport in Abwesenheit der SL-Kette unterstützt. Zum anderen zeigten die

durchgeführten Immunpräzipitationsstudien dieser µH-Kette eine auffallend verringerte

Menge der ko-präzipitierten SL-Ketten-Komponenten λ5 und VpreB (Abb. 9: Spur 7).

Inwieweit die hohe intrazelluläre Expressionsrate von VHλ5koII.82 den tatsächlichen

Oberflächentransport beeinflusst, wurde jedoch nicht weiter untersucht.

Während die Zelloberflächendichten der getesteten µH-Ketten sowohl in An- als auch

Abwesenheit der SL-Kette deutliche Unterschiede zeigten, erreichten funktionelle µH-

Ketten in Kombination mit einer κL-Kette Transportkompetenz auf nahezu gleichem Ni-

veau (Abb. 8: Mitte). Die hier nachgewiesene hohe Oberflächendichte des BZRs könnte

darin begründet sein, dass leichte Ketten eine relativ hohe Affinität zu schweren Ketten bei

einer gleichzeitig geringen Affinität zu BiP besitzen (Leitzgen et al., 1997). Der Verdrän-

gungsmechanismus von BiP könnte daher sehr viel effizienter als bei einer SL-Kette sein

und dadurch den Oberflächentransport von µH-Ketten maximieren. Die im Vergleich zum

Diskussion

65

Prä-BZR höhere Transportrate des BZRs erscheint auch physiologisch sinnvoll: Durch die

höhere Anzahl verfügbarer Antigenbindestellen auf der Zelloberfläche würde eine entspre-

chende Kreuzvernetzung des BZRs stärkere Signale für die Einleitung einer effizienten

humoralen Immunantwort induzieren. Gleichzeitig wären geringere Antigenmengen not-

wendig, um eine effiziente Kreuzvernetzung durchzuführen.

Die Versuche hinsichtlich der Transportkompetenz zeigten, dass ca. 60% der getesteten

µH-Ketten aus einer WT-Maus auch in Abwesenheit der SL-Kette an die Zelloberfläche

transportiert werden. Das Paradigma einer BiP-vermittelten absoluten Retention aller

schweren Ketten über die Cµ1-Domäne und einer notwendigen Ablösung von BiP durch

die SL-Kette ist durch unsere Arbeiten somit endgültig widerlegt.

6.2 Oberflächenexpression und induzierte Prä-BZR-Signale

Ein weiteres wichtiges Teilziel der vorliegenden Arbeit war die Überprüfung der Signal-

kompetenz verschiedener µH-Ketten-Idiotypen. Zum einen sollte damit die Funktionalität

der verwendeten µH-Ketten in Abhängigkeit ihres Idiotyps überprüft werden. Zum ande-

ren dienten die Experimente zur Überprüfung einer Korrelation der Höhe der Oberflächen-

expression sowie der induzierten Signalstärke in An- und Abwesenheit einer SL-Kette.

Da in Abl-MuLV-transformierten Zelllinien bereits viele Proteine des Prä-BZR-

Signalweges phosphoryliert sind, wurde die IL7-abhängige Pro-B-Zelllinie R5B verwen-

det. Dies erlaubte die Bestimmung der induzierten Prä-BZR-Signalstärke ohne weitere

Beein-flussung der Zellen wie zum Beispiel durch Zugabe von GlivecTM, einem Abelson-

Kinase-Inhibitor (Muljo et al., 2003; Kawano et al., 2006). Dabei konnte in Abhängigkeit

zur nachgewiesenen Oberflächendichte eine klare Korrelation zur induzierten Prä-BZR-

Signalstärke mit zwei unabhängigen methodischen Ansätzen nachgewiesen werden (Abb.

13 und Abb. 14). Die beiden VH-Idiotypen VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82 zeigten hier über-

einstimmend zu ihrer verhältnismäßig hohen Oberflächenexpression einen starken Phos-

phorylierungsgrad von Erk1/2 sowie einen schnellen und starken Kalzium-Einstrom nach

Kreuzvernetzung. Dieser kombinierte Nachweis der Signalstärke war bei der dysfunktio-

nellen µH-Kette VH81XF vollständig und bei den funktionellen µH-Ketten VH81XBC2

und VH3-32 mit ihrer niedrigeren Oberflächenexpression deutlich verringert. Ein abwei-

Diskussion

66

chendes Verhalten von dieser Korrelation zeigte hingegen die funktionelle µH-Kette

VH17.2.25. Die Transportkompetenz dieser µH-Kette in den verwendeten R5B-Zellen lag

zwischen den schwächer exprimierten VH-Idiotypen VH81XBC2 und VH3-32 sowie den

höher exprimierten VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82. Damit übereinstimmend konnte ein

intermediärer Verlauf der Kinetik des Kalzium-Einstroms sowohl in der Stärke als auch im

zeitlichen Verlauf nachgewiesen werden. Abweichend bei der µH-Kette VH17.2.25 war

hier jedoch eine auffallend schwache Phosphorylierung von Erk1/2. Dieser Unterschied

könnte darauf zurückzuführen sein, dass innerhalb dieser Versuchsreihe zwei verschiedene

Signalwege des Prä-BZRs gemessen wurden. Während die Induktion eines Kalzium-

Signals über das als Adapterprotein fungierende B cell linker protein (BLNK oder SLP-65)

und die Aktivierung der Phospholipase-Cγ verläuft, findet die Phosphorylierung von

Erk1/2 über den GTP-abhängigen Ras-Signalweg statt (Hendriks et al., 2004; zusammen-

gefasst in Jumaa et al., 2005). In Abhängigkeit zur Oberflächendichte des Prä-BZRs könn-

te nun jeweils nur einer der beiden Signalwege aktiviert werden. Schwächer auf der Zell-

oberfläche vorhandene µH-Ketten würden nach Kreuzvernetzung somit ein basales Signal,

ausreichend für das Überleben der B-Zelle und eine weitere Differenzierung innerhalb der

B-Zellentwicklung, ermöglichen. Ab einem gewissen Schwellenwert der Oberflächendich-

te führt eine Kreuzvernetzung des Prä-BZRs jedoch zu einer Antwort, die beide Signalwe-

ge umschließt. Durch die induzierten stärkeren Signale würde daher nicht nur Überleben

und Differenzierung der B-Zelle gewährleistet sein, sondern auch die klonale Expansion

funktioneller Prä-B-Zellen ermöglicht und verstärkt werden. Daten aus der Promotionsar-

beit von Christian Vettermann unterstützen dieses zweistufige Modell der Signalinitiierung

des Prä-BZRs. Dabei könnte neben der absoluten Menge an µH-Ketten auf der Zellober-

fläche auch deren Grad an Einwanderung in sogenannte Lipid-Mikrodomänen (lipid rafts)

wie für den BZR bereits gezeigt ausschlaggebend sein (Cheng et al., 2001; persönliche

Diskussion mit D. Mielenz). In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass nach

Kreuzvernetzung auch der Prä-BZR in diese Mikrodomänen auf der Zelloberfläche ein-

wandert und von dort Signale initiiert (Guo et al., 2001). Diese Einwanderung könnte je-

doch bei schwach auf der Zelloberfläche exprimierten µH-Ketten nicht stattfinden oder

nicht ausreichend sein. Durch eine Isolierung von Lipid-Mikrodomänen vor und nach

Kreuzvernetzung aus mit verschiedenen µH-Ketten-transduzierten R5B-Zellen könnte die-

se Hypothese überprüft werden.

Diskussion

67

Das Modell der zweistufigen Signalinitiierung durch den Prä-BZR konnte auch in primä-

ren mit µH-Ketten-transduzierten Pro-B-Zellen nachgewiesen werden. In Übereinstim-

mung mit dem nachgewiesenen Phosphorylierungsstatus von Erk1/2 zeigten die mit den

VHλ5koI.36- und VHλ5koII.82-Idiotypen transduzierten λ5+/+-Pro-B-Zellen über die Zeit

einen sprunghaften Anstieg im Wachstum GFP-positiver Zellen im Vergleich zu den ande-

ren getesteten µH-Ketten (Abb. 17). Auffallend war jedoch die in etwa gleiche Dichte der

VH17.2.25- und VHλ5koI.36-Idiotypen auf der Zelloberfläche transduzierter Pro-B-Zellen.

Dieser Widerspruch zu der zuvor aufgestellten Hypothese kann jedoch mit einer unter-

schiedlich stark ausgeprägten Affinität einer µH-Kette zur SL-Kette erklärt werden. Wie

die durchgeführten Ko-Immunpräzipitationsstudien zeigten, binden verschiedene µH-

Ketten die SL-Ketten-Komponenten λ5 und VpreB unterschiedlich stark. Insbesondere die

µH-Kette VH17.2.25 zeigte dabei im Vergleich zu den VHλ5koI.36- und VHλ5koII.82-

Idiotypen eine deutlich schwächere Affinität sowohl zu λ5 als auch zu VpreB. Da die SL-

Kette für eine effiziente Signalinitiierung des Prä-BZRs jedoch unerlässlich ist (zusam-

mengefasst in Vettermann et al., 2006), würde bei einer identischen Oberflächendichte

verschiedener µH-Ketten die Menge vorhandener SL-Ketten die initiierte Signalstärke

bestimmen. Diese mögliche Erklärung wird unterstützt durch den direkten Vergleich des

induzierten Zellwachstums in An- bzw. Abwesenheit von λ5. Während die Oberflächenex-

pressionen der µH-Ketten VH17.2.25 und VHλ5koI.36 auch ohne λ5 identisch waren, redu-

ziert sich das Wachstum von GFP-positiven Zellen in der Abwesenheit von λ5 bei

VHλ5koI.36 drastisch und befindet sich nun auf gleichem Niveau mit VH17.2.25. Dieser

Unterschied hebt somit die individuelle Bedeutung des Wechselspiels zwischen VH-Idiotyp

und SL-Kette für verschiedene µH-Ketten hervor.

Der direkte Vergleich der parallel durchgeführten Experimente zeigt weiterhin, dass die

aufgrund ihres autonomen Oberflächentransports als SL-unabhängig klassifizierten µH-

Ketten VH3-32, VH17.2.25, VHλ5koI.36 und VHλ5koII.82 tatsächlich in Abwesenheit von

λ5 Signale, die das Zellwachstum begünstigen, initiieren (Abb. 17). Neben der Korrelation

der jeweiligen Expressionshöhe an der Zelloberfläche und der induzierten Signalstärke war

in allen Fällen die Zellwachstumsrate mit λ5 signifikant höher. Die von Kawano et al.

(2006) postulierte Selektion von µH-Ketten aufgrund unterschiedlicher Oberflächenex-

pressionen und der damit verbundenen Signalstärke lässt sich jedoch nicht beweisen. In

diesem Zusammenhang ist davon auszugehen, dass Prä-B-Zellen, die eine µH-Kette mit

hoher Oberflächendichte und starker Signalinduktion exprimieren, generell auch stärker

Diskussion

68

klonal expandiert werden. Dieser in Übereinstimmung mit Kawano et al. (2006) stehende

Wirkmechanismus wird jedoch nicht, wie postuliert, über die Selektion durch die SL-Kette

vermittelt. Vielmehr bestimmt in den meisten Fällen die jeweilige VH-Region bereits allein

über die jeweilige Transport- und Signalkompetenz der µH-Kette und damit über ihren

späteren Beitrag zum Antikörper-Repertoire. Die SL-Kette übernimmt daher keine selekti-

ve, sondern für die Gruppe der SL-unabhängigen µH-Ketten in erster Linie eine signalver-

stärkende Funktion. Diese Verstärkungsfunktion spiegelte sich in den hier gezeigten Daten

wider in der graduellen Erhöhung der Oberflächendichte und in der Höhe des induzierten

Zellwachstums in Anwesenheit der SL-Kette. Die für das entstehende Antikörper-

Repertoire relevante selektive Funktion beispielsweise auf die Paarungsfähigkeit von µH-

Ketten war hingegen ein SL-Ketten-unabhängiger Prozess, der auch in Abwesenheit von

λ5 nachweisbar war. Eine selektive Funktion hat die SL-Kette hingegen für VH-Idiotypen,

die für den Transport an die Zelloberfläche auf eine Paarung mit der SL-Kette angewiesen

sind. Dieser Punkt wird im nächsten Abschnitt diskutiert.

6.3 SL-Ketten abhängige und unabhängige µH-Ketten

Die Analyse der Signalkompetenz verschiedener µH-Ketten in An- und Abwesenheit von

λ5 zeigte neben den bereits diskutierten Ergebnissen zum ersten Mal eine bisher unbekann-

te Subgruppe von funktionellen µH-Ketten. Während die, in der hier vorliegenden Arbeit

verwendete, dysfunktionelle µH-Kette VH81XF erwartungsgemäß weder in An- noch in

Abwesenheit von λ5 an der Zelloberfläche exprimiert war und aufgrund dessen keine Prä-

BZR-spezifischen Signale induzieren konnte, konnten die in den Analysen verwendeten

funktionellen VH-Idiotypen in zwei Subgruppen unterteilt werden (Abb. 16 und Abb. 17).

Die Mitglieder der Gruppe der hier als SL-unabhängig klassifizierten µH-Ketten waren

sowohl in An- als auch Abwesenheit von λ5 transport- und signalkompetent. Neben Idio-

typ-abhängigen Unterschieden war die jeweilige Transport- und Signalkompetenz jedoch

bei allen µH-Ketten in Anwesenheit einer kompletten SL-Kette höher. Insofern bezieht

sich die Namensgebung „SL-unabhängig“ lediglich auf die grundlegende Eigenschaft einer

µH-Kette, auch ohne SL-Kette, wenn auch in geringerem Maße, die Zelloberfläche zu er-

reichen und Prä-BZR-typische Signale induzieren zu können. Die Mitglieder der Gruppe

der SL-abhängigen µH-Ketten waren hingegen ausschließlich in Anwesenheit einer SL-

Kette transport- und signalkompetent. Aufgrund dessen zeigte die SL-abhängige, funktio-

Diskussion

69

nelle µH-Kette VH81XBC2 in Abwesenheit von λ5 ein identisches Verhalten zu einer dys-

funktionellen µH-Kette, während in Anwesenheit von λ5 die µH-Kette VH81XBC2 in der

Lage war, Signale für das Zellwachstum von transduzierten primären Pro-B-Zellen zu in-

duzieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die gemessenen absoluten Zellzahlen in

Abwesenheit von λ5 sowohl bei den mit einer dysfunktionellen als auch mit einer SL-

abhängigen µH-Kette transduzierten GFP-positive Zellen rückläufig waren (Abb. 18). Die-

se auffällige Reduktion ist wahrscheinlich auf die intrazelluläre Akkumulation dieser µH-

Ketten und der damit verbundenen Induktion einer finalen Stressantwort durch unvollstän-

dig gefaltete Proteine (UPR, unfolded proteine response) zurückzuführen. Da die extensive

Induktion des UPR-Signalweges in einer Zelle zur Apoptose führt (Meister et al., 2007),

könnte somit die Abnahme der Zellzahl von λ5-defizienten Pro-B-Zellen transduziert mit

den VH-Idiotypen VH81XF und VH81XBC2 erklärt werden. Das Phänomen, dass Hybri-

domzellen mit einer ungepaarten µH-Kette einen Wachstumsnachteil haben, wurde bereits

in den 70er Jahren von Köhler entdeckt und als H-Ketten-Toxizität (heavy chain toxicity)

beschrieben (Kohler, 1980; Meister, 2004). Interessanterweise war dieses Verhalten in der

Gegenwart von λ5 nicht mehr nachweisbar. Während der SL-abhängige VH81XBC2-

Idiotyp nun mit der SL-Kette paaren konnte, dadurch Transport- und Signalkompetenz

erreichte und Zellwachstum induzierte, zeigte der dysfunktionelle VH81XF-Idiotyp über

den gemessenen Zeitraum eine gleich bleibende Zellzahl. Dieser Unterschied zur Situation

ohne λ5 könnte eventuell auf Überlebenssignale, die über den sogenannten Pro-B-

Zellrezeptor induziert wurden, zurückzuführen sein (Ohnishi et al., 2005). Dabei wird

vermutet, dass dieser Signalkomplex Pro-B-Zellen bis zu einer produktiven Umlagerung

der H-Kettengensegmente das Überleben zumindest für eine gewisse Zeit sichert. Im Fall

eines nicht produktiven bzw. dysfunktionellen Rearrangements auf beiden H-Ketten-Loci

enden diese Überlebenssignale und die Pro-B-Zelle geht in Apoptose.

Zusätzlich zu den durchgeführten Experimenten mit isolierten primären Pro-B-Zellen

konnte durch die Verwendung transgener Mausmodelle der Nachweis der SL-abhängigen

Idiotypsubklasse auch in vivo reproduziert werden (Abb. 19). Der in unserem Zellkultur-

system klassifizierte SL-abhängige VH81XBC2-Idiotyp war dabei ausschließlich in Anwe-

senheit von λ5 in der Lage, die Differenzierung vom Pro- zum Prä-B-Zellstadium zu er-

möglichen. In Abwesenheit von λ5 kam es hier zu einem nahezu vollständigen Block in-

nerhalb der B-Zellentwicklung. Die wenigen CD19+/CD25+ Prä-B-Zellen, die in diesem

Fall noch nachweisbar waren, könnten darauf zurückzuführen sein, dass einige Pro-B-

Diskussion

70

Zellen das BC2-Transgen verloren haben oder die Rückkopplungssignale der BC2-µH-

Kette zum Beenden der VDJ-Rekombination nicht komplett sind. Eine interessante Frage

wäre daher, wie die in Abwesenheit der SL-Kette im ER zurückgehaltene transgene BC2-

µH-Kette den Allelausschluss am endogenen Lokus induziert. Die SL-Kette selbst scheint

zumindest für die Initiierung des Allelausschlusses im Gegensatz zur Induktion von Diffe-

renzierung und Proliferation nicht notwendig zu sein (Shimizu et al., 2002). Daher konnte

bereits gezeigt werden, dass µH-Ketten auch in Abwesenheit von SL-Ketten weitere Um-

lagerungen am Genlocus unterdrücken können (Nussenzweig et al., 1987; Galler et al.,

2004). Allerdings handelte es sich bei diesen Studien um SL-Ketten-unabhängige µH-

Ketten, die auch in Abwesenheit einer SL-Kette die Oberfläche erreichen. Ob für die In-

duktion des Allelausschlusses die Expression des Prä-BZRs an der Zelloberfläche über-

haupt notwendig ist, ist somit noch ungeklärt. Es wäre daher denkbar, dass eine Signalini-

tiierung für den Allelausschluss bereits auch schon aus dem Trans-Golgi-Apparat stattfin-

den kann (Guloglu et al., 2006). Diese Hypothese könnte durch Verwendung der µH-Kette

VH81XBC2 oder einer anderen SL-abhängigen µH-Kette in An- und Abwesenheit der SL-

Kette überprüft werden.

Insgesamt wurden in der hier vorliegenden Arbeit 55 funktionelle VH-Idiotypen getestet

und anhand ihrer autonomen Transportkompetenz den beiden Idiotyp-Subklassen zugeord-

net (Tab. 2). Durch den Vergleich von VH-Regionen, isoliert aus WT- und λ5-defizienten

Mäusen, konnte zusätzlich der Anteil SL-unabhängiger bzw. SL-abhängiger µH-Ketten am

Gesamtrepertoire bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass ca. 40% aller getesteten µH-

Ketten aus einer WT-Maus in ihrer Transportkompetenz strikt abhängig von der Paarung

mit einer SL-Kette waren. Dieser überraschend hohe Anteil würde somit, wie für die µH-

Kette VH81XBC2 gezeigt, in einer Situation ohne SL-Kette dem Gesamtrepertoire verloren

gehen und die humorale Immunantwort in ihrer Diversität empfindlich einschränken. Auf-

fallend war hingegen das Vorkommen einer SL-abhängigen µH-Kette aus der λ5-

defizienten Maus. Dieses unerwartete Auftreten kann jedoch auf die Paarung dieser µH-

Kette mit einer vorzeitig rearrangierten leichten Kette zurückgeführt werden. Alternativ

hätte diese µH-Kette auch als „blinder Passagier“ in einer Prä-B-Zelle, die eine zweite SL-

unabhängige µH-Kette exprimierte, den peripheren B-Zellpool erreichen können. Eine

weitere Erklärung wäre aber auch, dass durch eine Kontamination mit genomischer DNA

nicht wie beabsichtigt nur funktionelle µH-Ketten von der isolierten cDNA amplifiziert

wurden, sondern auch dysfunktionell bzw. SL-abhängig rearrangierte VDJ-Segmente. Mit

Diskussion

71

den verwendeten Primern, welche vom 5`-Ende des V- bis zum 3`-Ende des J-Segmentes

ein komplettes VDJ-Exon amplifizieren, konnte eine Unterscheidung zwischen dysfunk-

tionellen und funktionellen Rearrangements nicht getroffen werden. Dies spiegelt sich

auch wider im Vorkommen einer bzw. zweier dysfunktioneller µH-Ketten in der cDNA

der WT- bzw. der λ5-defizienten Maus. Dieses Problem kann jedoch zukünftig durch die

Verwendung eines reversen Primers innerhalb des Cµ1-Exons einfach umgangen werden.

Neben den VH-Bibliotheken aus WT- und λ5-defizienten Mäusen wurden zusätzlich aus

zwei weiteren transgenen Mäusen VH-Regionen amplifiziert. Dazu wurden die beiden von

Christian Vettermann während seiner Promotion etablierten λ5ala- und λ5ΔU-Mauslinien

zur Untersuchung der Bedeutung des λ5 unique tails für die Signalinitiierung durch den

Prä-BZR verwendet (noch nicht publizierte Daten C. Vettermann). Beide Mausmodelle

zeigten dabei im Vergleich zu einer WT-Maus eine erhöhte Anzahl von Pro-B-Zellen so-

wie eine reduzierte Zellzahl von Prä-B-Zellen und auch IgM+ B-Zellen in der Peripherie.

Der nachgewiesene Phänotyp befand sich jedoch hinsichtlich des Zahlenverhältnisses von

Pro-B-Zellen und den darauffolgenden Reifestadien bei beiden transgenen Mäusen zwi-

schen dem Phänotyp einer WT- und einer λ5-defizienten Maus. Daraus wurde geschluss-

folgert, dass der λ5 unique tail mit seinen basischen Aminosäuren für eine effiziente Ini-

tiierung von Signalen zur klonalen Expansion großer Prä-B-Zellen unerlässlich ist (persön-

liche Mitteilung C. Vettermann). Trotz des in beiden Mausmodellen mutierten bzw. dele-

tierten λ5 unique tails blieb die Funktion der SL-Kette, als Bindungspartner den Transport

von allen funktionellen µH-Ketten an die Zelloberfläche zu ermöglichen, weiterhin erhal-

ten. Dabei zeigte sich im Vergleich zu einer WT-Maus eine nahezu identische Verteilung

von ca. 40% SL-abhängigen zu ca. 60% SL-unabhängigen µH-Ketten sowohl in der λ5ala-

als auch in der λ5ΔU-Maus (Abb. 10). Dieser Befund spiegelt somit die essentielle Funkti-

on der SL-Kette für das spätere Antikörper-Repertoire durch die Rettung von SL-

abhängigen µH-Ketten wider.

In Kombination mit dem bereits vorgestellten zweistufigen Modell der Prä-BZR-

Signalinitiierung und den Erkenntnissen aus den λ5ala- und λ5ΔU-Mäusen lässt sich daher

folgendes Modell zur Erklärung des Phänotyps einer λ5-defizienten Maus postulieren

(Abb. 24; persönliche Diskussion mit C. Vettermann): Das spätere Gesamtrepertoire von

VH-Idiotypen setzt sich sowohl aus SL-abhängigen als auch SL-unabhängigen µH-Ketten

zusammen. Hierbei ermöglicht die SL-Kette nicht nur den Transport aller funktionellen

Diskussion

72

µH-Ketten in ein Signalkompartiment an die Zelloberfläche, sondern induziert zusätzlich

eine effiziente klonale Expansion.

Pro-B

Prä-B

λ5alaWT λ5ΔUλ5-/-

SL-abhängig

Proliferation

SL-unabhängig +

+

+++

+

-

-

+

+

+

+

+

+SL-abhängig

SL-unabhängig +++ - + +

Differenzierung

Abb. 24: Effekt von SL-abhängigen und SL-unabhängigen VH-Idiotypen auf dieInitiierung von Prä-BZR-Signalen für Differenzierung und Proliferation. Sche-matisch dargestellt sind neben der WT-Situation die Bedingungen in einer λ5-defizienten Maus sowie in zwei transgenen Mausmodellen. In der λ5ala-Maus wur-den alle basischen Aminosäuren des λ5 unique tails gegen neutrales Alanin ausge-tauscht, während in der λ5ΔU-Maus der komplette λ5 unique tail deletiert wurde.Das Modell beruht darauf, dass alle funktionellen µH-Ketten, sobald sie sich in ei-nem signalkompetenten Kompartiment auf der Zelloberfläche befinden, mindestensbasale Signale für eine weitere B-Zelldifferenzierung initiieren können. SL-unabhängige VH-Idiotypen können jedoch auch in Abwesenheit der SL-Kette eineweitere Differenzierung ermöglichen. SL-abhängige VH-Idiotypen hingegen benöti-gen die SL-Kette als Paarungspartner, um Transportkompetenz überhaupt zu errei-chen. Dieser Mechanismus wird dabei unabhängig von den λ5 unique tails vermit-telt, so dass auch bei einer mutierten SL-Kette die Differenzierung von B-Zellen mitfunktionellen µH-Ketten gegeben ist. Ohne vollständige SL-Kette ist jedoch eineklonale Expansion, induziert durch die Kreuzvernetzung des Prä-BZRs über die uni-que tails von λ5 und VpreB, nicht möglich, so dass die B-Zellzahl in der Peripherieund somit auch das Antikörper-Repertoire von beiden transgenen Mäusen gegenübereiner WT-Maus stark reduziert ist.

Diskussion

73

Dadurch werden nicht nur ca. 40% des Gesamtrepertoires überhaupt erst bereit gestellt,

sondern durch die klonale Expansion wird die kombinatorische Diversität und damit das

finale primäre Antikörper-Repertoire zusätzlich erhöht. In einer λ5-defizienten Maus kön-

nen zum einen ca. 40% der funktionellen, aber SL-abhängigen µH-Ketten keine Trans-

portkompetenz erreichen und die davon betroffenen B-Zellen werden eliminiert. Zum an-

deren können die verbleibenden SL-unabhängigen µH-Ketten zwar basale Signale für eine

weitere B-Zelldifferenzierung einleiten, eine effiziente klonale Expansion bleibt jedoch

aufgrund der fehlenden SL-Kette aus. In den beiden transgenen λ5ala- bzw. λ5ΔU-

Mausmodellen konnte ein intermediärer Phänotyp zwischen WT- und λ5-defizienter Maus

nachgewiesen werden (noch nicht publizierte Daten C. Vettermann). Dabei kann die mu-

tierte SL-Kette ohne funktionellen λ5 unique tail immer noch die Transportkompetenz

aller funktionellen µH-Ketten ermöglichen, wodurch sich die periphere B-Zellzahl erhöht.

Eine effiziente klonale Expansion ist jedoch nur in Gegenwart des λ5 unique tails möglich,

so dass sich hier im Vergleich zur WT-Maus weniger B-Zellen in der Peripherie und da-

durch auch ein reduziertes Antikörper-Repertoire nachweisen lassen. Aufgrund dieses Mo-

dells könnte der Phänotyp einer SL-defizienten Maus erklärbar sein. Entgegen den Erwar-

tungen wurde in SL-defizienten Mäusen kein vollständiger Block in der Entwicklung von

B-Zellen nachgewiesen, sondern lediglich eine deutliche Reduktion der absoluten B-

Zellzahl in der Peripherie. Dieser Mangel wurde bisher in erster Linie auf die fehlende

klonale Expansion heranreifender Prä-B-Zellen zurückgeführt, konnte letztlich aber den

starken Rückgang der peripheren B-Zellzahl nie vollständig erklären (Kitamura et al.,

1992; Martensson et al., 1999; Mundt et al., 2001; Shimizu et al., 2002). Unter Berück-

sichtigung der hier neu gewonnenen Erkenntnisse und des postulierten Modells zeigt sich

aber, dass in Abwesenheit der SL-Kette neben dem Ausbleiben einer effizienten klonalen

Expansionsphase lediglich ca. 60% der B-Zellen überhaupt eine weitere Differenzierung

durchlaufen können und sich dadurch die periphere B-Zellzahl drastisch reduziert.

Die SL-Kette übernimmt daher in der B-Zellentwicklung eine duale Funktion: Zum einen

ermöglicht sie Transportkompetenz von SL-abhängigen funktionellen µH-Ketten und er-

höht die Transportrate für alle funktionellen VH-Idiotypen. Durch den Transport SL-

abhängiger µH-Ketten werden dabei ca. 40% des Gesamtrepertoires überhaupt bereit ge-

stellt. Zum anderen induziert die SL-Kette über eine Liganden-unabhängige oder

-abhängige Kreuzvernetzung der unique tails von λ5 und VpreB eine effiziente klonale

Expansion von Prä-B-Zellen. Im Anschluss daran können diese Klone mit identischen µH-

Diskussion

74

Ketten unabhängig voneinander die leichten Kettengensegmente rearrangieren und es

kommt durch die kombinatorische Diversität zu einer weiteren Erhöhung der Antikörper-

vielfalt. Ob das Vorkommen SL-unabhängiger µH-Ketten biologisch relevant ist, bleibt

unbekannt. Eine potentielle Funktion könnte jedoch die Initiierung von Überlebenssignalen

während der Genumlagerung am leichten Kettenlokus sein. Dabei wird vermutet, dass

während der frühen B-Zellentwicklung zunächst der bereits erwähnte Pro-BZR bis zur

Ausbildung des Prä-BZRs das Überleben sich entwickelnder B-Zellen gewährleistet (Oh-

nishi et al., 2005; Hess et al., 2001). Nach Einleitung der klonalen Expansionsphase durch

Prä-BZR-Signale wird jedoch auch die Expression der SL-Ketten-Komponenten λ5 und

VpreB herunterreguliert (Parker et al., 2005). Dabei wird diskutiert, ob durch diesen Me-

chanismus und die damit verbundene Beendigung der Oberflächenexpression des Prä-

BZRs die Proliferationsphase gestoppt wird. Diese Herunterregulierung könnte somit zur

Terminierung der über den λ5 unique tail vermittelteten klonalen Expansion dienen, führt

aber auch gleichzeitig dazu, dass essentielle Überlebenssignale bis zu einer erfolgreichen

Umlagerung des L-Kettenlokus und der Expression des BZRs an der Zelloberfläche unter-

bunden werden. Das Rearrangement der L-Kettengensegmente VL und JL ist ebenfalls ein

zufälliger Prozess, wodurch auch unproduktive Umlagerungen stattfinden können. Da im

Gegensatz zum schweren Kettenlokus keine zusätzlichen D-Segmente verwendet werden,

können jedoch beim Auftreten von unproduktiven Rearrangements sowohl am κ- als auch

am λ-Lokus durch das sogenannte Receptor editing noch weitere Umlagerungen erfolgen

(Lu et al., 1997; Tiegs et al., 1993; zusammengefasst in Edry et al., 2004). Aufgrund des-

sen ist die Wahrscheinlichkeit eines produktiven Rearrangements einer L-Kette deutlich

höher als bei einer schweren Kette. Dieser Prozess ist jedoch beim zufälligen Auftreten

mehrerer unproduktiver Umlagerungen in erster Linie zeitabhängig. Zur Überbrückung

dieser Zeitspanne könnten SL-unabhängige µH-Ketten auch im späten Prä-B-Zellstadium

noch immer Überlebenssignale von der Zelloberfläche senden und das Überleben bis zu

einer produktiven Umlagerung gewährleisten. Dieser Entwicklungsvorteil SL-

unabhängiger µH-Ketten könnte durch Sequenzanalysen der leichten Kettenloci peripherer

B-Zellen zumindest indirekt nachgewiesen werden. Ein alternativer Mechanismus zur Be-

reitstellung von Überlebenssignalen während des Rearrangements der L-Kettengen-

segmente wird auch hinsichtlich translatierter Vκ- oder JκCκ-Keimbahntranskripte disku-

tiert (McKeller et al., 2006). Die hieraus resultierenden Polypeptide könnten im späten

Prä-B-Zellstadium nach Terminierung der SL-Ketten-Expression den Transport von so-

Diskussion

75

wohl SL-abhängigen als auch SL-unabhängigen µH-Ketten-Idiotypen an die Zelloberflä-

che gewährleisten.

Eine weitere interessante Frage ist auch, inwieweit die Herunterregulierung der SL-Kette

und die Beendigung der klonalen Expansionsphase korrelieren. Während in Prä-BZR-

defizienten Mäusen eine Verzögerung der Herunterregulierung von λ5 nachgewiesen wur-

de, konnte durch Prä-BZR-Signale zunächst eine Beendigung der Expression von sowohl

λ5 als auch VpreB zunächst auf einem und anschließend auf dem zweiten Allel nachge-

wiesen werden (Parker et al., 2005). Aufgrund dessen würden SL-abhängige µH-Ketten

gar nicht und SL-unabhängige µH-Ketten deutlich schwächer an die Zelloberfläche gelan-

gen und eine weitere Proliferation sich entwickelnder B-Zellen gestoppt werden. Eine SL-

unabhängige µH-Kette, wie die hier gezeigte VHλ5koII.82, könnte möglicherweise jedoch

auch in Abwesenheit der SL-Kette diesen Kontrollmechanismus allein aufgrund ihrer ho-

hen autonomen Transportkompetenz auf der Zelloberfläche und durch eine damit korrelie-

renden andauernden Signalinitiierung umgehen. Die dadurch unkontrollierte Proliferation

würde somit für einen Organismus eine potentielle Gefährdung darstellen. Unter Verwen-

dung von zuvor hinsichtlich ihrer autonomen Transport- und Signalkompetenz klassifizier-

ten µH-Ketten könnten daher weitere Erkenntnisse über den Abbruch der Proliferations-

phase in der frühen B-Zellentwicklung gewonnen werden. Inwieweit die µH-Kette

VHλ5koII.82 in biologischer Hinsicht tatsächlich von Bedeutung ist, bleibt hingegen noch

unbeantwortet. Schließlich wurde diese µH-Kette aus einer λ5-defizienten Maus isoliert

und entstammt somit aus einer Umgebung, die spezifisch auf SL-unabhängige µH-Ketten

selektionierte. Über die Frequenz von solchen µH-Ketten mit einer nahezu autonomen

Transportkompetenz in einer WT-Maus können somit derzeit jedoch keine gesicherten

Aussagen getroffen werden. Da von 21 getesteten µH-Ketten aus λ5-defizienten Mäusen

die µH-Kette VHλ5koII.82 als einzige diese auffällige Eigenschaft besaß, ist das Vorkom-

men solcher µH-Ketten in einer WT-Maus aller Wahrscheinlichkeit nach eher selten.

Unabhängig von den hier vorgestellten Ergebnissen konnte eine andere µH-Kette, die, ob-

wohl sie nur schlecht mit der SL-Kette assoziiert, aber dennoch ständig Proliferationssig-

nale initiiert, in der fötalen Leber identifiziert werden (Wasserman et al., 1998). Die Funk-

tion einer µH-Kette mit solchen Eigenschaften ist zwar noch unbekannt, diskutiert wird

von den Autoren in diesem Fall aber, dass es sich möglicherweise um einen Mechanismus

handelt, durch den nützliche VH-Gene durch kontinuierlich, wenn auch schwach proliferie-

rende B-Zellen aus dem fötalen in das adulte Repertoire gezogen werden.

Diskussion

76

6.4 Die Affinität zu BiP entscheidet über die Selektion von µH-Ketten

Wie frühere Daten bereits zeigten und die hier in der vorliegenden Arbeit durchgeführten

Ergebnisse bestätigen, werden µH-Ketten als Teil eines vollständig assemblierten Prä-

BZRs auf der Oberfläche unterschiedlich stark exprimiert (Kawano et al., 2006; Abb. 8,

Abb. 12 und Abb. 16). Die damit korrelierende Signalstärke führt zu einer unterschiedlich

starken klonalen Expansion, wodurch letztlich die Frequenz eines bestimmten VH-

Idiotypen im finalen Antikörper-Repertoire bestimmt wird. Die Selektion funktioneller

µH-Ketten und die unterschiedliche Signalinitiierung durch verschiedene µH-Ketten wur-

den bisher stets auf die spezifische Interaktion der SL-Kette mit einer µH-Kette zurückge-

führt. Der hier durchgeführte Vergleich dieses postulierten Selektionsmechanismus von

µH-Ketten in An- bzw. Abwesenheit der SL-Kette zeigte jedoch, entgegen der früheren

Annahme, dass auch ohne SL-Kette dysfunktionelle µH-Ketten intrazellulär zurückgehal-

ten und funktionelle µH-Ketten differentiell an die Zelloberfläche transportiert werden.

Die hier durchgeführten Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass in Abhängigkeit zum

jeweiligen Idiotyp die Affinität einer µH-Kette zu BiP unterschiedlich ist (Abb. 23). Dabei

korrelierte die Affinität zwischen BiP und einem bestimmten VH-Idiotyp umgekehrt pro-

portional zur gemessenen Oberflächenexpression der µH-Kette. Auffälligerweise spiegel-

ten die Unterschiede in der nachgewiesenen Affinität und der Transportkompetenz die Si-

tuation sowohl in An- als auch in Abwesenheit der SL-Kette wider. So war die Affinität

der verwendeten dysfunktionellen µH-Kette VH81XF und der SL-abhängigen µH-Kette

VH81XBC2, die in Abwesenheit der SL-Kette beide nicht transportkompetent waren, je-

weils am höchsten. Die SL-unabhängigen µH-Ketten zeigten hingegen in Übereinstim-

mung zu ihrer jeweiligen autonomen Transportkompetenz eine stetige Abnahme der Men-

ge an ko-präzipitiertem BiP. Aufgrund dessen scheint daher die VH-Region selbst über ihre

individuelle Aminosäuresequenz die Affinität zu BiP zu bestimmen und legt dadurch die

grundlegende Transportkompetenz einer µH-Kette fest. Die SL-Kette übernimmt in diesem

Fall keine selektive Funktion mehr, sondern verstärkt lediglich die Oberflächendichte eines

Prä-BZRs. Die Tatsache, dass in Anwesenheit der SL-Kette verschiedene µH-Ketten diffe-

rentiell auf der Zelloberfläche exprimiert werden, könnte dabei auf eine verhältnismäßig

schwache Affinität der SL- zu einer µH-Kette zurück zu führen sein. Aufgrund dieser ge-

Diskussion

77

ringen Interaktion kann die SL-Kette bei µH-Ketten mit einer hohen Affinität zu BiP nur

wenige µH-Ketten ablösen, während dieser Prozess bei µH-Ketten mit einer ohnehin ge-

ringen Affinität zu BiP sehr viel effizienter abläuft. Dies könnte auch der Grund sein, wes-

halb alle getesteten µH-Ketten in der Gegenwart einer konventionellen κ-leichten Kette,

die eine hohe Affinität zu einer µH-Kette besitzt (Leitzgen et al., 1997), sehr stark und auf

nahezu identischem Niveau an die Zelloberfläche transportiert wurden.

Zum Nachweis der jeweiligen Transportkompetenz einer µH-Kette wurde die Plasmozy-

tomlinie Ag8.H-Igα verwendet. In dieser Zelllinie konnten in einer parallel durchgeführten

Diplomarbeit weder mögliche bekannte noch unbekannte Interaktionspartner, die eine Ab-

lösung einer µH-Kette von BiP vermitteln könnten, gefunden (Mortha, 2006). Insbesonde-

re konnte die Anwesenheit der SL-Kette und konventionellen κL- und λL-Ketten sowie

postulierte alternative Interaktionspartner wie translatierte Keimbahntranskripte des κ-

Lokus, VpreB3 und BILL-Cadherin ausgeschlossen werden (Ohnishi et al., 1994; Mel-

chers, 2005; McKeller et al., 2006). Aufgrund dessen ist ein autonomer Transport von µH-

Ketten-Dimeren an die Zelloberfläche denkbar. Ein vergleichbarer Mechanismus konnte

bereits für L-Ketten gezeigt werden (Leitzgen et al., 1997). Obwohl ungefaltete L-Ketten

ähnlich wie schwere H-Ketten während ihrer Biosynthese zunächst von BiP intrazellulär

zurückgehalten werden, wird diese Interaktion maßgeblich von der VL-Region beeinflusst

und kann ohne zusätzlichen Bindungspartner zur Ablösung von BiP führen (Skowronek et

al., 1998; Davis et al., 1999). Damit übereinstimmend wurden bereits computerberechnete

potentielle BiP-Bindestellen auch in der VH-Region nachgewiesen (Knarr et al., 1995).

Darüber hinaus zeigten Expressionsstudien mit einem monoklonalen IgG-Antikörper, dass

auch in Abwesenheit einer L-Kette die Sezernierung eines IgG-Dimers in Drosophila-

Zellen nachgewiesen werden konnte und diese dennoch über einen BiP-abhängigen Weg

verlief (Kirkpatrick et al., 1995). Ebenfalls in Abwesenheit einer L-Kette konnte eine

membranständige µH-Kette die Oberfläche von Drosophila-Zellen erreichen (Wossning et

al., 2004). Des Weiteren konnten in Kameliden Homodimere bestehend aus zwei IgG-

Ketten nachgewiesen werden, die ohne L-Kette ins Blut sezerniert wurden (Hamers-

Casterman et al., 1993). Dadurch scheint eine autonome oder zumindest partielle Faltung

der Cµ1-Domäne beeinflusst durch die spezifischen Eigenschaften einer VH-Region auch

für µH-Ketten möglich. Über diesen Mechanismus wären sowohl die unterschiedlichen

Affinitäten verschiedener µH-Ketten zu BiP, die daraus folgende differentielle Oberflä-

Diskussion

78

chenexpression von µH-Ketten als auch die Transportkompetenz SL-unabhängiger µH-

Ketten in Abwesenheit eines Bindungspartners erklärbar.

6.5 Analyse muriner VH-Regionen

Die etablierten VH-Bibliotheken dienten in erster Linie als Ausgangsmaterial klonierbarer

VH-Regionen und somit zur Bestimmung der Frequenz von µH-Ketten, die zu einem auto-

nomen Oberflächentransport in der Lage sind. Die Eigenschaft einer SL-unabhängigen

Oberflächenexpression war dabei von der jeweiligen VH-Region abhängig, worüber die

Affinität einer µH-Kette zu BiP reguliert wurde. Durch eine vergleichende Sequenzanalyse

sollten daher die spezifischen Attribute innerhalb einer VH-Region gefunden werden, die

eventuell die Affinität eines VH-Idiotypen zu BiP bestimmen. Dazu wurden VH-Regionen

aus der Milz von WT- und λ5-defizienten Mäusen analysiert. Während in der WT-

Situation sowohl SL-abhängige als auch SL-unabhängige µH-Ketten im peripheren Reper-

toire nachgewiesen wurden, waren SL-unabhängige µH-Ketten in der Milz einer λ5-

defizienten Maus stark angereichert bzw. unter Berücksichtigung des bereits diskutierten

Nachteils der verwendeten VH-Primer ausschließlich vorhanden. Letzteres stand dabei in

Übereinstimmung mit der Erwartung, dass nur SL-unabhängige µH-Ketten den Prä-BZR-

Kontrollpunkt passieren können und somit in der Peripherie einer λ5-defizienten Maus

nachweisbar sein sollten. Dysfunktionelle und in der Abwesenheit von λ5 auch SL-

abhängige µH-Ketten sollten hingegen negativ selektioniert werden. Die Eigenschaften,

die einen autonomen Oberflächentransport bzw. eine geringere Affinität zu BiP ermögli-

chen, sollten somit durch den Vergleich der beiden peripheren VH-Repertoires nachweisbar

sein. Neben den isolierten VH-Regionen aus der Milz wurden zusätzlich noch zwei weitere

Bibliotheken aus dem Pro- und dem Prä-B-Zellkompartiment von WT- und λ5-defizienten

Mäusen als Kontrolle etabliert. Hier sollte die Selektion für SL-unabhängige µH-Ketten in

der λ5-defizienten Maus beim Übergang von Pro- in das Prä-B-Zellstadium zum ersten

Mal innerhalb der B-Zellreifung nachweisbar sein. Die spezifischen Eigenschaften einer

VH-Region, die eine autonome Oberflächenexpression ermöglichen, sollten dabei sowohl

in VH-Regionen aus dem Prä-B- als auch aus dem peripheren B-Zellkompartiment auftre-

ten. Zusätzlich müssten die gefundenen Unterschiede durch den Vergleich von zuvor als

SL-abhängig bzw. SL-unabhängig klassifizierten µH-Ketten signifikant nachweisbar sein.

Diskussion

79

Zur Bestimmung, welche Faktoren dabei die Affinität zu BiP beeinflussen könnten, wur-

den mehrere Eigenschaften einer VH-Region analysiert. Zum einen war bekannt, dass dys-

funktionelle µH-Ketten häufig ein VH81X Segment der VH5-Familie beinhalten (Keyna et

al., 1995; Kline et al., 1998). Zum anderen wurde bereits gezeigt, dass insbesondere die

CDR-H3 die Paarungsfähigkeit von µH- und SL-Ketten beeinflusst (Martin et al., 2003).

Zusätzlich konnten computergestützte Analysen von zwei verschiedenen µH-Ketten poten-

tielle BiP-Bindestellen in der direkten Nähe zur CDR-H3 nachweisen (Knarr et al., 1995).

Aufgrund dessen wurden sowohl die vorkommenden VH-, D- und JH-Segmente bestimmt,

aber auch insbesondere die spezifischen Eigenschaften der CDR-H3 analysiert.

Auffällig war das Auftreten von mehreren signifikanten Unterschieden in den VH-Familien

1, 2, 3 und 14 in den VH-Bibliotheken aus der Milz von WT- und λ5-defizienten Mäusen.

Diese Unterschiede konnten durch den Vergleich SL-abhängiger und SL-unabhängiger

µH-Ketten nicht reproduziert werden (Abb. 20). Interessanterweise wurde hier jedoch eine

signifikante Anreicherung von Mitgliedern der VH5-Familie in SL-abhängigen µH-Ketten

nachgewiesen. Das bereits erwähnte gehäufte Auftreten von dysfunktionellen µH-Ketten

innerhalb dieser Familie deutet daher in Zusammenhang mit dem verstärkten Auftreten

von SL-abhängigen µH-Ketten eine im Vergleich zu anderen µH-Ketten höhere Affinität

zu BiP an. Diese höhere Bindungsstärke führt möglicherweise dazu, dass die SL-Kette im

Fall von dysfunktionellen µH-Ketten BiP gar nicht und bei funktionellen µH-Ketten nur

schwach ablösen kann. Diese hier über die SL-Kette notwendige Verdrängung von BiP

führt zu einem gehäuften Vorkommen SL-abhängiger µH-Ketten bei gleichzeitiger Reduk-

tion SL-unabhängiger µH-Ketten. Daraus ergibt sich zumindest im Fall der VH5-Familie

eine direkte Beeinflussung der Affinität einer µH-Kette zu BiP durch das verwendete VH-

Segment.

Obwohl das D-Segment eine zentrale Rolle für die spezifischen Eigenschaften der CDR-

H3 übernimmt, konnten bei der hier durchgeführten Analyse keine signifikanten Unter-

schiede zwischen den analysierten B-Zellkompartimenten ermittelt werden. Damit in

Übereinstimmung zeigten publizierte Daten aus der Gruppe von Harry Schroeder ebenfalls

keine signifikanten Veränderungen der verwendeten D-Segmente über die gesamte B-

Zellentwicklung hinweg (Ivanov et al., 2005). Die zum Teil ausgeprägteren Unterschiede

beim Vergleich SL-abhängiger und SL-unabhängiger µH-Ketten deuten zwar eine mögli-

che Funktion des verwendeten D-Segmentes bei der Beeinflussung der Affinität einer µH-

Diskussion

80

Kette zu BiP an, konnten jedoch nicht als signifikant bestätigt werden. Die Analyse des

verwendeten Leserasters zeigte in Übereinstimmung zur Literatur einen deutlich geringe-

ren Anteil von D-Segmenten im Leseraster 2 (Ichihara et al., 1996). Während in WT-

Mäusen gewöhnlich eine negative Selektion von µH-Ketten mit D-Segmenten im Leseras-

ter 2 und 3 zugunsten des Leserasters 1 nachgewiesen wurde (Loffert et al., 1996), konnte

dieser Prozess in der hier vorliegenden Analyse nicht deutlich gezeigt werden (Abb. 21).

Bei isolierten B-Zellen aus der Milz einer WT-Maus konnte jedoch eine Anreicherung von

D-Segmenten im Lese-raster 1 bei einer gleichzeitigen Abnahme von D-Segmenten im

Leseraster 2 bestimmt werden. Der Anteil an D-Segmenten im Leseraster 3 blieb hier je-

doch nahezu gleich. Interessanterweise war der Anteil von D-Segmenten im Leseraster 1

deutlich, wenn auch nicht statistisch signifikant, höher bei SL-unabhängigen als bei SL-

abhängigen µH-Ketten. Das Leseraster 1 ist dabei das am häufigsten vorkommende Leser-

aster in funktionellen µH-Ketten im peripheren Repertoire einer WT-Maus (Loffert et al.,

1996; Ivanov et al., 2005). Ein ähnlicher Sachverhalt konnte bei der Analyse der vorkom-

menden JH-Segmente nachgewiesen werden. Hier zeigte sich ähnlich zur Literatur ein

verminderter Anteil an µH-Ketten mit einem JH1-Segment (Ivanov et al., 2005), während

das am häufigsten vorkommende JH4-Segment sowohl im peripheren Repertoire der Milz

als auch in SL-unabhängigen µH-Ketten signifikant gehäuft vorkam. Die Anreicherung

von µH-Ketten mit einem D-Segment im Leseraster 1 und einem JH4-Segment könnte da-

her in Abhängigkeit zur daraus resultierenden Aminosäureabfolge mit einer generell gerin-

geren Affinität zu BiP und einer damit verbundenen höheren Transport- und Signalkompe-

tenz verbunden sein.

Die Verlängerung der CDR-H3 mit einer zufällig ausgewählten Aminosäure aus einem

Pool von 20 proteinogenen Aminosäuren bewirkt rein rechnerisch eine Verzwanzigfa-

chung des potentiellen Antikörper-Repertoires. Aufgrund dessen ist die Verlängerung der

CDR-H3 durch N- und P-Nukleotide ein wesentlicher Faktor zur Erhöhung der Antikör-

perdiversität. Der maximalen Länge einer CDR-H3 sind aber in erster Linie durch die reine

Keimbahnlänge der D-Segmente sowie durch die darin kodierten Aminosäuren, insbeson-

dere Prolin und Cystein, Grenzen gesetzt, da diese wahrscheinlich die spätere Schleifen-

struktur bei längeren CDR-H3 zusätzlich stabilisieren (Zemlin et al., 2003). Diese Schlei-

fenbildung prägt dabei nicht nur die jeweilige Spezifität eines Antikörpers, sondern auch

die strukturelle Ausformung der Antigenbindestelle beispielsweise als Tasche oder Aus-

stülpung (Morea et al., 1998). Obwohl mittlerweile auch in Mäusen, ähnlich wie beim

Diskussion

81

Menschen, CDR-H3 mit einer Länge über 20 Aminosäuren in einem artifiziellen System

nachgewiesen werden konnten (Lutz et al., 2006), scheint für die Optimierung des Anti-

körper-Repertoires eine Selektion von µH-Ketten aufgrund der CDR-H3-Länge unerläss-

lich. Damit in Zusammenhang konnte eine Verschiebung der durchschnittlichen Länge

durch den Wegfall sehr kurzer und auch sehr langer CDR-H3 während der B-

Zellentwicklung nachgewiesen werden (Ivanov et al., 2005). Dieser für µH-Ketten der

VH5-Familie gezeigte Mechanismus konnte für das hier analysierte Repertoire reproduziert

werden. Dabei wurde ausgehend vom Pro-B-Zellstadium über die Folgestadien eine komp-

lette Reduktion von µH-Ketten mit einer CDR-H3 kürzer als 5 Aminosäuren detektiert.

Durch das gleichzeitig seltene Auftreten von µH-Ketten mit einer CDR-H3-Länge über 16

Aminosäuren entstand eine annähernd Gauß´sche Normalverteilung der CDR-H3-Länge in

der WT-Maus. Diese Selektion konnte zumindest beim Übergang von Pro- zu Prä-B-

Zellen auch in λ5-defizienten Mäusen nachgewiesen werden. Davon jedoch abweichend

zeigte sich eine starke Anreicherung von kurzen CDR-H3 in der Milz von λ5-defizienten

Mäusen im Vergleich zur WT-Situation. Dieser Sachverhalt sprach somit zunächst für ei-

nen Entwicklungsvorteil von µH-Ketten mit einer kurzen CDR-H3 in der Abwesenheit von

λ5. Entgegen dieser Hypothese konnte jedoch keine Korrelation zwischen der CDR-H3-

Länge und einer bevorzugten Transport- und Signalkompetenz nachgewiesen werden. Das

Auftreten der verkürzten CDR-H3 ist daher unter Umständen auf eine an die B-

Zellentwicklung anschließende Selektion bzw. Anreicherung zurückzuführen. So könnte

eine Infektion der Versuchstiere zum Zeitpunkt der Isolation eine solche Verschiebung

innerhalb des peripheren Antikörper-Repertoires zur Folge haben. Frühere Experimente

zeigten, dass speziell die CDR-H3-Länge über die jeweilige Antigenspezifität und auch

Antigenpräferenz entscheidet (Collis et al., 2003). In diesem Fall wäre denkbar, dass, ob-

wohl die nachgewiesenen verkürzten CDR-H3 in ihrer Aminosäureabfolge einzigartig

waren, sie dennoch das gleiche Antigen detektiert und eine humorale Immunantwort mit

einer damit verbundenen Anreicherung der Antikörper in der Peripherie ausgelöst haben.

Ob diese Vermutung richtig ist, könnte beispielsweise durch die Bestimmung der jeweili-

gen Antigenspezifität der isolierten VH-Regionen nachträglich überprüft werden.

Frühere Versuche zeigten, dass sich die CDR-H3 überwiegend aus neutralen oder hydro-

phoben Aminosäuren zusammensetzt (Ivanov et al., 2002). Geladene Aminosäuren, insbe-

sondere Arginin und Lysin, treten hingegen oft in autoreaktiven Antikörpern auf (Radic et

al., 1993). Dabei wird vermutet, dass positiv geladene Aminosäuren DNA erkennen, wäh-

Diskussion

82

rend negativ geladene Aminosäuren bevorzugt Histone binden könnten (Krishnan et al.,

1996; Monestier et al., 2000). Die hier durchgeführte Analyse der Aminosäurefrequenz der

CDR-H3 zeigte sowohl im Vergleich von µH-Ketten aus dem Pro- als auch aus dem peri-

pheren B-Zellkompartiment zahlreiche signifikante Unterschiede zwischen WT- und λ5-

defizienten Mäusen. Diese konnten jedoch nicht in Prä-B-Zellen nachgewiesen werden.

Zusätzlich konnten als übereinstimmende Unterschiede zwischen den untersuchten CDR-

H3 aus der Milz und den SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten lediglich das

Vorkommen der negativ geladenen Asparaginsäure und dem neutralen Threonin als signi-

fikant bestätigt werden. Neben Threonin konnte zusätzlich das ebenfalls neutrale Glycin

ausschließlich in SL-unabhängigen µH-Ketten nachgewiesen werden, während diese bei-

den Aminosäuren in SL-abhängigen µH-Ketten vollständig fehlten. Ob diese Unterschiede

in der Aminosäurefrequenz jedoch tatsächlich die Transportkompetenz von µH-Ketten

beeinflussen oder auf temporäre Unterschiede zwischen den Versuchstieren zurückzufüh-

ren sind, lässt sich aufgrund der insgesamt zu geringen Menge an untersuchten µH-Ketten

mit analysierter Transportkompetenz nicht mit Sicherheit bestimmen (vgl. Tab. 3). Die

Analyse weiterer als SL-abhängig bzw. SL-unabhängig klassifizierten µH-Ketten könnte

hier jedoch weitere Rückschlüsse ermöglichen. Nicht aussagekräftige Ergebnisse finden

sich auch bei der Bestimmung der jeweiligen molekularen Masse der CDR-H3 wieder.

Von mehreren als signifikant nachgewiesenen Unterschieden analysierter CDR-H3 aus der

Milz von WT- und λ5-defizienten Mäusen konnte nur eine molekulare Masse von 1500 als

signifikanter Unterschied zwischen SL-abhängigen und SL-unabhängigen µH-Ketten be-

stätigt werden. Inwieweit diese spezifische molekulare Masse tatsächlich eine Rolle bei

einer möglichen Beeinflussung der Affinität einer µH-Kette zu BiP spielt, lässt sich auf-

grund der vorliegenden Ergebnisse jedoch zur Zeit nicht abschätzen. Auffallend waren

hingegen die signifikanten Unterschiede des isolelektrischen Punktes zwischen WT- und

λ5-defizienten Mäusen. Hier zeigten bevorzugt CDR-H3 aus WT-Mäusen bei einem nied-

rigen pHi-Wert und CDR-H3 aus λ5-defizienten Mäusen bei einem hohen pHi-Wert ihren

jeweiligen isoelektrischen Punkt. Diese ungleiche Verteilung konnte tendenziell, wenn

auch nicht signifikant, durch den Vergleich SL-abhängiger und SL-unabhängiger µH-

Ketten bestätigt werden. Interessant in diesem Zusammenhang ist dabei die Ladungsvertei-

lung der unique tails von λ5 und VpreB, die sich beide in einem vollständig assemblierten

Prä-BZR in direkter Nähe zur CDR-H3 befinden (Bankovich et al., 2007). Während der

unique tail von λ5 stark basisch ist (pHi 12,13) und in einem neutralen Millieu somit posi-

tiv geladen ist, handelt es sich bei VpreB um einen leicht sauren (pHi 5,11) und dadurch

Diskussion

83

negativ geladenen Abschnitt (Bradl et al., 2003). SL-abhängige µH-Ketten, deren CDR-H3

bei einem neutralen pH-Wert tendenziell ebenfalls negativ geladen wäre, würden daher

unter Umständen eine schwächere Wechselwirkung zu VpreB eingehen und dadurch eine

Ablösung von BiP erschweren, während die positiv geladenen SL-unabhängigen µH-

Ketten sich möglicherweise leichter von BiP lösen können. Auch in diesem Fall würde

eine Erhöhung der Anzahl an getesteten µH-Ketten zuverlässigere Aussagen ermöglichen.

Eine weitere interessante Option zur Überprüfung einer Korrelation der Affinität einer µH-

Kette zu BiP und den spezifischen Eigenschaften der VH-Region wäre das gezielte Austau-

schen der CDR-H3. Dadurch könnte die Bedeutung der CDR-H3 hinsichtlich des BiP-

vermittelten Selektionsprozesses von µH-Ketten weitergehend charakterisiert werden.

Durch zusätzlich eingebrachte Punktmutationen innerhalb der VH-Region bzw. CDR-H3

könnten darüber hinaus detailliertere Aussagen getroffen werden. Der bereits erfolgte

Nachweis, dass die Sezernierung einer humanen IgG3-Kette durch eine Punktmutation in

der Cγ3-Domäne blockiert werden konnte, zeigt dabei, wie empfindlich die Interaktion

zwischen einer H-Kette und BiP ist (McLean et al., 2005). Ein ähnlicher Einfluss könnte

somit auch auf die VH-Region übertragbar sein.

Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigten, dass die funktionellen

µH-Ketten des Antikörper-Repertoires in zwei Idiotyp-Subklassen unterteilt werden konn-

ten. Die mit einem Anteil von ca. 40% als SL-abhängig klassifizierten µH-Ketten waren

ohne SL-Kette nicht auf der Zelloberfläche nachweisbar und konnten keine Prä-BZR typi-

sche Signale induzieren. Die mit einem Anteil von ca. 60% größere Gruppe der SL-

unabhängigen µH-Ketten waren hingegen sowohl in An- als auch in Abwesenheit der SL-

Kette transport- und signalkompetent. Neben dem Nachweis eines SL-unabhängigen Ober-

flächentransports konnte auch die differentielle Expression von µH-Ketten auf der Zell-

oberfläche nachgewiesen werden. Durch die parallel durchgeführten Analysen der jeweili-

gen Transport- und der damit korrelierenden Signalkompetenz von verschiedenen µH-

Ketten in An- und Abwesenheit der SL-Kette zeigte sich, dass sowohl die autonome

Transportkompetenz als auch die differentielle Oberflächendichte in erster Linie von den

spezifischen Eigenschaften der VH-Region maßgeblich beeinflusst wird. Die bisherige ver-

gleichende Sequenzanalyse der VH-Regionen deutet an, dass die Interaktion eines VH-

Idiotypes und BiP von einer Kombination mehrerer Eigenschaften der VH-Region abhän-

gig zu sein scheint. Während Mitglieder der VH5-Familie verstärkt in der SL-abhängigen

Idiotyp-Subklasse vorkamen, zeichneten sich SL-unabhängige µH-Ketten durch ein ge-

Diskussion

84

häuftes Auftreten eines JH4-Segmentes aus. Inwieweit die spezifischen Eigenschaften der

CDR-H3 die Bindungsaffinität zu BiP beeinflussen, konnte aufgrund der zu geringen

Menge klassifizierter VH-Idiotypen nicht endgültig bestimmt werden. Auffällig in diesem

Zusammenhang war jedoch eine Tendenz bei SL-abhängigen µH-Ketten zu einer negativ

geladenen CDR-H3, SL-unabhängige µH-Ketten zeigten hingegen häufiger eine positiv

geladene CDR-H3. Während die SL-Kette zu einer grundlegenden Erhöhung der Oberflä-

chenexpression aller funktionellen µH-Ketten führt und dadurch Prä-BZR-Signale ver-

stärkt werden, entscheidet die durch den VH-Idiotyp bestimmte Affinität einer µH-Kette zu

BiP nicht nur über die Funktionalität, sondern auch über die Fähigkeit zu einem autono-

men Oberflächentransport und die jeweilige Höhe der Oberflächenexpression einer µH-

Kette. Somit ist die SL-Kette essentiell für µH-Ketten, die ohne Interaktionspartner keine

Transportkompetenz erreichen können. Darüber hinaus leitet die SL-Kette eine effiziente

klonale Expansionsphase aller Prä-B-Zellen mit einer funktionellen µH-Kette ein und er-

höht dadurch die spätere Antikörpervielfalt maßgeblich. BiP hingegen selektioniert das

Repertoire für VH-Idiotypen und legt gleichzeitig fest, wie häufig bestimmte VH-Idiotypen

im späteren IgH-Repertoire vertreten sind.

Material und Methoden

85

7 Material und Methoden

7.1 Material

7.1.1 Chemikalien und Enzyme

Soweit nicht anders angegeben wurden alle allgemeinen Reagenzien und Materialien für die

Zellkultur sowie die verwendeten Chemikalien und Enzyme von den Firmen Amersham-

Pharmacia (Freiburg), Eppendorf (Hamburg), Invitrogen (Karlsruhe), Merck (Darmstadt),

NEB (Frankfurt/M.), Qiagen (Hilden), BD-Pharmingen (Heidelberg), Roth (Karlsruhe) und

Sigma-Aldrich (Taufkirchen) bezogen. Für die Herstellung von Lösungen, Puffern und Ver-

dünnungen wurde ausschließlich Reinstwasser aus einer PureLab Deionisierungsanlage der

Firma USF (Ramsbach-Baumbach) oder HPLC-Wasser der Firma Merck verwendet.

7.1.2 Versuchstiere

Alle verwendeten Versuchstiere wurden unter sterilen Bedingungen in einzeln belüfteten Kä-

figen (IVC) im Tierstall des Nikolaus-Fiebiger-Zentrums in Erlangen gehalten. Die Genotypi-

sierung etablierter transgener Mäuse erfolgte mittels DNA-Isolierung aus Schwanzbiopsien

und anschließender PCR. Für die Versuche wurden sowohl männliche als auch weibliche Tie-

re verwendet.

Genotyp Referenz

λ5-/- Kitamura et al., 1992

µHC 3-32tg Wellmann et al., 2001

Rag2-/-/λ5-/-/µHC 3-32tgRag2-/-/λ5+/-/µHC 3-32tgλ5-/-/µHC 3-32tg

C. Vettermann, AG Jäck

λ5alatg1 und λ5ΔUtg1 Vettermann et al., 2007, in Vorbereitung

µHC 17.2.25tg (QM allele) Cascalho et al., 1996

Rag2-/-/λ5-/-/µHC 17.2.25tgRag2-/-/λ5+/-/µHC 17.2.25tg

C. Vettermann, AG Jäck

Rag2-/-/dTg/λ5+/+ und Rag2-/-/dTg/λ5+/+ Hess et al., 2001

C57Bl/6 Charles River (Sulzfeld)

Tab. 4: Zusammenstellung der verwendeten Mauslinien.

Material und Methoden

86

7.1.3 Zelllinien und Kulturbedingungen

Alle Suspensionszelllinien sowie ST2-Zellen wurden in RPMI 1640, 5% (R5) bzw. 10%

(R10) fötalem Kälberserum, 50 U/ml Penicillin, 50 µg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin,

1 mM Pyruvat und 50 µM β-Mercaptoethanol bei 37°C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit

kultiviert.

Die für die Produktion ecotroper Retroviren verwendete, adhärent wachsende Verpackerzell-

linie Phoenix-Eco wurde in Dulbecco´s Mod Eagle Medium (DMEM), 10% (D10) hitzeinak-

tiviertem fötalem Kälberserum, 50 U/ml Penicillin, 50 µg/ml Streptomycin, 2 mM L-

Glutamin, 1 mM Pyruvat und 50 µM β-Mercaptoethanol bei 37°C, 7,5% CO2 und 100% Luft-

feuchtigkeit kultiviert (Pear et al., 1993). Der für die Kultivierung von R5B-Zellen notwendi-

ge IL7 Überstand wurde mit Jm-IL7.6-Kulturen produziert. Diese Zelllinie wurde im Labor

von Fritz Melchers (Basel Institute for Immunology) durch stabile Transfektion der Plasmozy-

tomlinie J558 mit dem offenen Leseraster von murinem IL7 etabliert. Alternativ dazu wurde

auch rekombinantes IL7 (Becton Dickinson) mit einer Konzentration von 5 ng/ml eingesetzt.

Weitere Zelllinien mit Angabe der Referenz und den entsprechenden Kulturbedingungen sind

in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Zelllinie Referenz Kulturmedium Zusätze

38B9 Alt et al., 1981 R10

38B9 TdT4.6 Martin et al., 2003 R10 5 µg/ml Puromycin

Ag8.H Kearney et al., 1979 R10

Ag8.H-Igα Metzner, 2004 R10 1 mg/ml G418

Ag8.H-Igα-Fµ7dys Metzner, 2004 50% RPMI164050% DMEM

1 mg/ml G4181,25 µg/ml Mycophe-

nolsäure250 µg/ml Xanthin100 μM Hypoxanthin16 μM Thymidin

Ag8.H-Igα-17.2.25fct Metzner, 2004 R10

R5B C. Millne/C. Paige R10 5 ng/ml IL7 oder4% IL7 Überstand

ST2 Ogawa et al., 1988 R5

Tab. 5: Zusammenstellung der verwendeten Zelllinien in alphabetischer Reihenfolge.

Material und Methoden

87

7.1.4 Antikörper

Alle verwendeten Antikörper wurden gemäß den Herstellerangaben gelagert. Selbst aufgerei-

nigte Antikörper wurden in PBS mit 0.1% NaN3 bei 4°C aufbewahrt.

Antigen Antikörper Verdünnung Herkunft

Aktin Ziege IgG-anti-Maus Aktin WB 1:1.000 Sigma-Aldrich

BiP/GRP78 Maus IgG-anti-Maus BiP/GRP78 WB 1:1.000 BD-Pharmingen

c-kit PE-Ratte IgG-anti-Maus c-kit FACS 1:100 Becton Dickinson

CD19 A488-Ratte IgG-anti-Maus CD19Klon 1D3

FACS 1:200 Becton DickinsonAlexa488-Konjugation nachHerstellerangaben(Molecular Probes)

CD25 PE-Ratte IgG-anti-Maus CD25 FACS 1:200 Becton Dickinson

ERK1 Maus IgG-anti-Maus Erk1 WB 1:2.000 Becton Dickinson

Igα Maus IgG-anti-Maus Igα(24C2.5)

WB 1:500FACS 1:100

Mielenz et al., 2003

IgκLC PE-Ziege IgG-anti-Maus κLC FACS 1:200 Southern Biotech

IgM Ziege IgG-anti-Maus IgM IP Southern Biotech

IgM HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgM WB 1:6.000 Keyna et al., 1995

IgM Cy5-Ziege IgG-anti-Maus IgM FACS 1:400 Southern BiotechCy5-Konjugationnach Herstelleranga-ben (AmershamBiosciences)

IgM PE-Ziege IgG-anti-Maus IgM FACS 1:500 Southern Biotech

λ5 Syrian Hamster IgG-anti-Maus λ5 WB 1:500 Keyna et al., 1995

pERK1/2 Kaninchen IgG-anti-Maus pErk1/2 WB 1:2.000 Cell Signaling Tech-nology

VPreB Ratte IgG-anti-Maus VPreB (R5) WB 1:500 Stephan et al., 2001

Tab. 6: Zusammenstellung der verwendeten Primär-Antikörper in alphabetischerReihenfolge. Abkürzungen: A488: Alexa Fluor 488; FACS: Fluorescence Activated CellSorting; IP: Immunpräzipitation; WB: Western Blot.

Material und Methoden

88

Antigen Antikörper Verdünnung Herkunft

Kaninchen IgG HRP-Ziege IgG-anti-KaninchenIgG

WB 1:10.000 Jackson Lab

Maus IgG FITC-Ziege IgG-anti-Maus IgG FACS 1:100 Jackson Lab

Maus IgG HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgG WB 1:10.000 Jackson Lab

Ratten IgG HRP-Kaninchen IgG-anti-ZiegeIgG

WB 1:10.000 Jackson Lab

Hamster IgG HRP-Ziege IgG-anti-Syrian Hams-ter IgG

WB 1:10.000 Jackson Lab

Ziegen IgG HRP-Kaninchen IgG-anti-ZiegeIgG

WB 1:10.000 Jackson Lab

Tab. 7: Zusammenstellung der verwendeten Sekundär-Antikörper in alphabeti-scher Reihenfolge. Abkürzungen: A488: Alexa Fluor 488; HRP: Meerrettich-Peroxidase; FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting; WB: Western Blot.

7.1.5 Plasmide und Konstruktion retroviraler Expressionvektoren

Folgende Plasmide und retrovirale Vektoren wurden verwendet:

Name Insert Resistenzgen(e) Herkunft/Referenz

LXSPstar-81XBC2cµm

membranständigeVH81X(BC2)-µHC

AmpicillinPuromycin

Konstruiert im Labor JäckMartin et al., 1997

pCHIG µHC-IRES-GFP Ampicillin Vorliegende Arbeit

pCLIR κLC-IRES-dsRedII Ampicillin Vorliegende Arbeit

pCR2.1 TA-Klonierungs-stelle

AmpicillinKanamycin

Invitrogen

pCIG eGFP-IRES-Puro AmpicillinPuromycin

M. Wabl und F. SpillmanLorens et al., 2000

Tab. 8: Zusammenstellung der verwendeten Plasmide und retroviralen Vektoren.

RT-PCR amplifizierte VH-Regionen wurden über eine TA-Schnittstelle in das kommerziell

erhältliche Plasmid pCR2.1 einkloniert und anschließend sequenziert. Der GFP-

exprimierende retrovirale Vektor pCIG wurde als Negativkontrolle für µH-Kettenfärbungen

in allen Experimenten mitgeführt, während pCLIR (CMV Promotor-κL-Kette-IRES-dsRed2-

N1) zur Überprüfung der Paarungsfähigkeit transduzierter µH-Ketten mit einer κL-Kette

diente.

Material und Methoden

89

Zur Konstruktion eines µH-Ketten-kodierenden retroviralen Vektors pCHIG (E1187; Abb. 25

A) wurden VH-Fragmente aus pCR2.1 isoliert und zunächst in das mit SalI/HindIII linearisier-

te Plasmid LXSPstar-81XBC2cµm (E237) ligiert und anschließend über die Restriktions-

schnittstellen SalI und BsaBI in pCHIG (CMV Promotor-µH-Kette-IRES-GFP) einkloniert.

pCHIG wurde wie folgt konstruiert: Die einklonierte µH-Kette wurde dem Plasmid

LXSPstar-81XBC2cµm entnommen und beinhaltete das vollständige durchgehende Leseras-

ter für den VH-Leader, die VH-Region sowie alle vier Regionen und beide Membrandomänen

der konstanten Region der µH-Kette. Zum Einklonieren in den mit XhoI/NheI linearisierten

pCIG-Ausgangsvektor (urspüngliche Bezeichnung: pCru5; E1082) wurde über eine PCR-

Reaktion zunächst am 5`-Ende des VH-Leader-Segmentes eine XhoI-Schnittstelle eingefügt

und ein 181 bp langes Fragment einschließlich einer EcoRI-Schnittstelle in der VH-Region

amplifiziert. Der noch fehlende Rest der schweren Kette wurde über einen Restriktionsverdau

mit EcoRI/NotI aus LXSPstar-81XBC2cµm isoliert. Parallel dazu wurde aus dem Plasmid

pMSCV Neo-IRES-GFP (Pear et al., 1996 und J. Wittmann, AG Jäck; E672) mit NotI/NheI

die IRES-GFP Kassette herausgeschnitten. Im Anschluss daran wurden alle vier Teilstücke in

einer Ligierung in den linearisierten pCIG-Vektor einkloniert und über einen Kontrollverdau

mit HindIII (Fragmentlängen: 5345bp, 1668 bp, 1116 bp) überpüft.

Zur Konstruktion des κL-Ketten-kodierenden Vektors pCLIR (Abb. 25 B) wurde der offene

Leseraster einer κL-Kette zunächst aus dem Plasmid pCR2-991κ (C363) über einen Verdau

mit EcoRI isoliert und im Anschluss daran in den gleichen Ursprungsvektor pCR2 zurück

ligiert. Anschließend wurde die einklonierte κL-Ketten-Sequenz mit einem KpnI-Verdau auf

die gewünschte (-) Orientierung überprüft und mit XhoI/BamHI erneut isoliert. Die vollstän-

dige Gensequenz für den Fluoreszenzfarbstoff dsRed2-N1 wurde aufgrund einer im Leseras-

ter von dsRed2-zweimal vorkommenden NcoI-Schnittstelle über einen partiellen Verdau mit

NcoI/NotI aus dem Plasmid pdsRed2-N1 (Clontech, Mountain View, USA; E867) geschnit-

ten. Parallel dazu wurde eine IRES-Sequenz über BamHI/NcoI aus dem Plasmid pMSCV

Neo-IRES-GFP (E672). Abschließend wurden alle Teilsegmente gleichzeitig in den mit

XhoI/NotI linearisierten Vektor pCIG ligiert. Eine putative alternative Spleissstelle im nicht-

codierenden Bereich zwischen der einklonierten κL-Kettensequenz und der IRES-Sequenz

wurde durch einen Restriktionsverdau mit BamHI/SacII entfernt. Die Überhänge an beiden

Schnittstellen wurden durch eine Klenow-Reaktion aufgefüllt und der Vektor anschließend

ligiert. Die Überprüfung des vollständigen Einbaus der Segmente in pCLIR (E1335) erfolgte

über einen Kontrollverdau mit XhoI/HindIII (Fragmentlängen: 5958 bp, 967 bp). Zusätzlich

Material und Methoden

90

wurden die beiden Expressionskassetten von pCHIG und pCLIR nach Abschluss der Klonie-

rungsschritte vollständig sequenziert.

A

B

Abb. 25: Restriktionskarten der verwendeten retroviralen Vektoren. Beschreibungsiehe Text. A, pCHIG steht für CMV Promotor-µH-Kette-IRES-GFP. B, pCLIR stehtfür CMV Promotor-κL-Kette-IRES-dsRed2-N1. Abkürzungen: bla: Ampicillinresistenzdurch β-Laktamase; Cµ1-4m: konstante Domänen 1-4 inkl. Membrandomäne derschweren µ-Kette; GFP: Green Fluorescence Protein; IRES: Internal Ribosomal EntrySite; LC: leichte Kette; LTR: long terminal repeats; ori: Origin of Replication; pCMV:Promotor Cytomegalievirus; Psi: retrovirales Verpackungssignal; VH: variable Regionder schweren Kette.

Material und Methoden

91

7.1.6 Oligonukleotide

Folgende Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen im 50 nmol-Maßstab syntheti-

siert:

Material und Methoden

92

7.1.7 Bakterien

Alle Klonierungen wurden mit dem Bakterienstamm E. coli GeneHogs: mcr A, Δ(mrr-hsd

RMS-mcr BC), Φ80 Lac Z ΔM15, ΔLacX74, rec A1, ara Δ139, (ara-leu) 7697, galU galK

rpsL (strR), end A1, nup G (Invitrogen) durchgeführt.

Die Kultivierung von Bakteriensuspensionen erfolgte in LB-Medium (10 g Bacto Trypton, 5

g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid, ad 1l dH2O) über Nacht bei 37°C auf einem Schüttler oder

bei ausplattierten Bakterienkolonien auf LB-Platten (10 g Bacto Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g

Natriumchlorid, 12 g Agar-Agar, ad 1l dH2O) in einem Brutschrank. Zur Selektion wurden

jeweils 10 mg/ml Ampicillin zugegeben.

7.2 Methoden

7.2.1 Zellkulturverfahren

7.2.1.1 Kultivierung und Ernten der Zellen

Suspensionszelllinien wurden regelmäßig alle 2-3 Tage und in Abhängigkeit zur Zelldichte

im Verhältnis 1:5 bzw. 1:10 gesplittet. Bei den adhärent wachsenden Zelllinien Phoenix-Eco

und ST2 wurde zunächst das alte Medium abgezogen, die Zellen in vorgewärmtem sterilem

PBS gewaschen und anschließend mit sterilem Trypsin-EDTA (0,05%) überschichtet. Die

Ablösung der Zellen erfolgte für maximal 5 Minuten bei 37°C. Abgebrochen wurde die Reak-

tion durch Zugabe des vierfachen Volumens des entsprechenden Zellkulturmediums sowie

einer Zentrifugation für 5 min bei 1.400 rpm und 4°C (Heraeus Megafuge). Für die weitere

Kultivierung wurde das Zellpellet vorsichtig in geeignetem Zellkulturmedium resuspendiert,

im Verhältnis 1:5 gesplittet und in Zellkulturflaschen überführt.

Für Versuche entnommene Zellen wurden zunächst in kaltem PBS gewaschen und bis zur

weiteren Verwendung stets auf Eis gehalten.

Material und Methoden

93

7.2.1.2 Kryokonservierung von Zellen

Zur langfristigen Aufbewahrung von Zellen wurden 5 x 106 Zellen bei 1.400 rpm für 5 min

bei 4°C abzentrifugiert (Heraeus Megafuge) und in 1 ml Einfriermedium (90% FKS, 10%

DMSO) resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen zunächst in Einfrierröhrchen über-

führt und in einem mit Isopropanol gefüllten Behälter bei -70°C langsam eingefroren. Die

endgültige Lagerung der Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff.

7.2.1.3 Auftauen von Zellen

Das Einfriermedium wurde nach Auftauen der Zellen bei RT durch Zugabe von 35 ml geeig-

netem Zellkulturmedium verdünnt und bei 1.400 rpm und 4°C für 5 min abzentrifugiert (He-

raeus Megafuge). Anschließend wurde der Überstand entfernt und das Zellpellet vorsichtig in

entsprechendem Zellkulturmedium resuspendiert.

7.2.1.4 Bestimmung der Zelldichte

Zur Bestimmung der Zellzahl pro ml Volumen wurden die Zellen resuspendiert, 50 µl Zell-

suspension entnommen und mit 50 µl Trypanblau in PBS (4 %) gemischt. Die Auszählung

ungefärbter lebender Zellen erfolgte mittels einer Neubauer-Zählkammer. Dabei wurde die

Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop in 4 Großquadraten bestimmt, der Durchschnitt mit

dem Verdünnungsfaktor und mit 104 multipliziert.

7.2.1.5 Subklonierung (limiting dilution)

Um aus heterogenen Zellpopulationen Einzelklone zu erhalten wurde die Zellzahl bestimmt

und mit geeignetem Zellkulturmedium auf 150 Zellen/100 ml verdünnt. Anschließend wurden

mit einer Multikanalpipette auf fünf 96-well Mikrotiterplatten 200 µl/well der Zellsuspension

ausgesät. Nach frühestens sieben Tagen konnten herangewachsene Klone isoliert und im wei-

teren Verlauf durchflusszytometrisch analysiert werden.

Material und Methoden

94

7.2.2 Aufreinigung von primären B-Zellen aus dem Knochenmark undder Milz von Mäusen

Zur Entnahme der Zellen wurden die Versuchstiere mittels CO2 eingeschläfert und durch cra-

niale Dislokation getötet. Die Femora und die Tibia jeden Tieres wurden jeweils an beiden

Enden geöffnet und mehrmals mit kaltem R10-Zellkulturmedium und einer 23G-Kanüle

durchgespült. Die Milz wurde nach Öffnen der Bauchhaut entnommen und mit Hilfe eines

Zellsiebes (70 µm, BD Falcon) in eine Einzelzellsuspension überführt. Anschließend wurden

beide Zellsuspensionen einmal in 15 ml R10-Zellkulturmedium gewaschen.

7.2.2.1 Lyse der Erythrozyten

Zur Einengung der Zellzahl wurden die Zellsupsensionen aus dem Knochenmark bzw. der

Milz zunächst bei 4°C und 1.400 rpm für 8 min pelletiert und anschließend in 5 ml Erythrozy-

tenlysepuffer (0,15M NH4Cl, 20 mM HEPES) für exakt 5 min bei RT inkubiert. Die Reaktion

wurde durch Zugabe von 9 ml kaltem R10-Zellkulturmedium abgestoppt, die Zellen erneut

pelletiert und in 15 ml R10-Zellkulturmedium aufgenommen.

7.2.2.2 Aufreinigung von CD19+ Knochenmarks- und CD43- Milzzellen

Für die magnetische Zellsortierung wurden jeweils 1 x 107 Zellen mit 10 µl Magnetic Beads

(CD19 oder CD43, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) und 90 µl MACS-Puffer (PBS, 2 %

FKS) vermischt. Nach Inkubation der Ansätze für 20 min bei 4°C wurden die Zellen mit 4 ml

MACS-Puffer gewaschen. Die Zellsortierung erfolgte mit einem Auto-MACS-Gerät (Milte-

nyi Biotec) direkt im Anschluss. CD19-gefärbte Knochenmarkszellen wurden positiv, CD43-

gefärbte Milzzellen negativ selektioniert, anschließend in R10-Zellkulturmedium aufgenom-

men und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert.

Material und Methoden

95

7.2.3 Retrovirale Transduktion

7.2.3.1 Gewinnung retroviraler Partikel durch transiente Transfektion von Phoenix-Eco Zellen

24 Stunden vor der Transfektion wurden 3,5 x 106 Phoenix-Eco Zellen in einer 9 cm Petri-

Schale ausgesät. Unmittelbar vor der Transfektion wurde das alte D10-Kulturmedium mit

frischem, vorgewärmtem Medium inklusive 25 µM Chloroquin ersetzt. Die Transfektion

wurde mittels Kalzium-Phosphat Methode durchgeführt (Pear et al., 1993). Dazu wurden 1 ml

einer DNA-Lösung (20 µg retrovirale Plasmid DNA, 2 mM CaCl2) tröpfchenweise und unter

Erzeugung von Luftblasen mittels einer Handpipette mit 1 ml 2x HBS (50 mM HEPES pH

7,05, 10 mM KCl, 12 mM Glucose, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4,) vermischt und lang-

sam auf die ausplattierten Phoenix-Eco Zellen gegeben. Der Transfektionsansatz wurde für 9

bis max. 10 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das alte Medium mit

10 ml frischem vorgewärmtem D10-Kulturmedium ersetzt und der Ansatz über Nacht im

Brutschrank erneut inkubiert. Zur Konzentrierung des retroviralen Überstandes wurde am

nächsten Morgen das Medium abgezogen und durch 6 ml vorgewärmtes D10 Zellkulturme-

dium ersetzt. Weitere 24 Stunden später, also 48 Stunden nach Beginn der eigentlichen Trans-

fektion wurde der erste Virenüberstand abgenommen. Bei Bedarf wurde auch der retrovirale

Überstand 72 Stunden nach der Transfektion gesammelt. Alle gesammelten retroviralen

Überstände wurden zunächst mit 2.000 rpm bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert und anschlie-

ßend durch einen Filter (0,45 µm; Peske, Aindling-Arnhofen) steril filtriert. Die Lagerung

erfolgte bis zur weiteren Verwendung bei -70°C.

Durch die Verwendung GFP-exprimierender Konstrukte konnte die Transfektionseffizienz

mittels Durchflusszytomtrie bestimmt werden. Dazu wurden die adhärent wachsenden Phoe-

nix-Eco Zellen durch Pipettieren von den Petrischalen abgelöst und gut resuspendiert. An-

schließend wurde 1/10 des Volumens für die durchflusszytometrische Analyse verwendet.

7.2.3.2 Retrovirale Transduktion von Zelllinien

Alle Zelllinien wurden in 24-well Zellkulturplatten mit retroviralen Partikeln aus den gesam-

melten Überständen infiziert. Dazu wurden 5 x 105 Zellen in 100 µl entsprechendem Zellkul-

turmedium resuspendiert, mit 1 ml Virusüberstand und 10 µg/ml Polybren (Sigma) vermischt

Material und Methoden

96

und in einer 24-well Zellkulturplatte für 3 Stunden bei 3.000 rpm und 33°C zentrifiguiert (He-

raeus Megafuge). Anschließend wurde das gesamte Volumen eines wells in 15 ml Falcon-

Röhrchen überführt, bei 1.500 rpm und 4°C für 5 Minuten pelletiert und in 4 ml frischem

Zellkulturmedium aufgenommen und weiterkultiviert. Die Expression der retroviral transdu-

zierten Gene wurde frühestens 24 Stunden nach der Infektion durchflusszytometrisch über-

prüft.

7.2.3.3 Retrovirale Transduktion von primären Pro-B-Zellen

Die Infektion von 1 x 105 primären Pro-B-Zellen erfolgte identisch zu der unter 7.2.3.2 be-

schriebenen Vorgehensweise, aufgrund der geringeren Zellzahl und Zellgröße jedoch in 15 ml

Falcon-Röhrchen und nicht in 24-well Zellkulturplatten. Nach Abschluss der Zentrifugation

wurden die Zellpellets direkt in frischem R10-Zellkulturmedium aufgenommen und im weite-

ren Verlauf auf ST2-Zellen kultiviert.

7.2.4 Durchflusszytometrie

7.2.4.1 Zellsortierung mittels MoFloTM

1-2 x 107 GFP+ Zellen wurden in entsprechendem Zellkulturmedium bei 1.500 rpm, 4°C für 5

Minuten gewaschen, in PBS/5% FKS resuspendiert und auf Eis gelagert. Gegebenenfalls vor-

handene Zellverklumpungen wurden mit Hilfe eines Pre-Separation-Filters (Miltenyi Biotec)

entfernt. Die Zellsortierung erfolgte an einem MoFloTM-Durchflusszytometer (Dako Cytoma-

tion, Hamburg). Nach der Sortierung wurden die Zellen in entsprechendem Zellkulturmedium

gewaschen und anschließend für weitere Versuche kultiviert.

7.2.4.2 Analyse von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen

2-5 x 105 Zellen wurden bei 1.500 rpm und 4°C für 5 Minuten pelletiert und einmal in 1 ml

FACS-Puffer (1x PBS; 2% FKS, 0,05% Natrium Azid) gewaschen. Oberflächenmoleküle

wurden durch Zugabe von 50 µl der jeweiligen Antikörperverdünnung in FACS-Puffer für

30 min auf Eis markiert. Intrazelluläre Proteine wurden gemäß den Herstellerangaben des Fix

& Perm Kits (An der Grub, Kaumberg, Österreich) zunächst fixiert und anschließend per-

Material und Methoden

97

meabilisiert und mit 50 µl der jeweiligen Antikörperverdünnung in FACS-Puffer für 15 min

bei RT inkubiert. Anschließend bzw. zwischen der Zugabe von Primär- und Sekundärantikör-

per wurden die Zellen zweimal in jeweils 1 ml FACS-Puffer gewaschen. Vor der Messung in

einem FACSCalibur Durchflusszytometer (Becton Dickinson) wurden die Zellen in 400 µl

FACS-Puffer aufgenommen und auf Eis gehalten. Die Auswertung der Messdaten erfolgte

mit Hilfe der CellQuestTM Software v4.0.2 (Becton Dickinson).

7.2.4.3 Bestimmung der Zellzahl primärer B-Zellen mit Flow-Count Fluorespheres

Murine CD19+ gesortete Zellen aus dem Knochenmark wurden retroviral infiziert und in ei-

nem Volumen von 100 µl R5-Zellkulturmedium sowie in einer Konzentration von 104 Zel-

len/well in einer 96-well Zellkulturplatte auf ST2-Zellen in Triplikaten ausgesät. Diese wur-

den 18-24 Stunden zuvor mit 10 µg/ml Mitomycin C (Stammlösung in serumfreien RPMI, 0,2

mg/ml) für maximal 2 Stunden bei 37°C inkubiert, 3x in vorgewärmten PBS gewaschen und

ebenfalls in einem Volumen von 100 µl R5-Zellkulturmedium sowie einer Konzentration von

104 Zellen/well auf der gleichen Zellkulturplatte ausgebracht. Die Zellen wurden bei 37°C,

5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert und das gesamte Volumen eines wells (200 µl)

jeweils 24 und 72 Stunden nach der Transfektion in FACS-Röhrchen überführt. Anschließend

folgte eine Zugabe von 200 µl Flow-Count Fluorespheres-Lösung (1:100 in 1x PBS; Beck-

man Coulter, Fullerton, USA) und die Bestimmung der Zellzahl an einem FACSCalibur

Durchflusszytometer (Becton Dickinson) (Hess et al., 2001). Dazu wurden pro Messprobe

jeweils 200 Flow-Count Fluorespheres als interner Standard gemessen und der dadurch er-

mittelte Wert zur Bestimmung der Gesamtzellzahl anschließend mit dem Faktor 10 multipli-

ziert. Die Auswertung der Messdaten erfolgte mit Hilfe der CellQuestTM Software v4.0.2

(Becton Dickinson).

7.2.4.4 Analyse des Kalzium-Einstroms nach Stimulierung B-lymphoider Zellen

5 x 106 Zellen wurden in 700 µl R5-Zellkulturmedium aufgenommen und mit 7 µl Indo-Mix

(50 µg Indo-1-AM, 37 µl 0,015% Pluronic F-127 (beides Molecular Probes), 458 µl DMSO)

für 25 min bei 30°C inkubiert. Nach Zugabe von zusätzlichen 700 µl R5-Zellkulturmedium

erfolgte eine weitere Inkubation für 10 min bei 37°C. Anschließend wurden die Zellen 2x mit

jeweils 1 ml Krebs-Ringer Lösung (10 mM HEPES pH 7,0, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM

Material und Methoden

98

MgCl2, 1mM CaCl2, 10 mM Glucose) gewaschen, zuletzt in 500 µl Krebs-Ringer Lösung

aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert.

Zur Messung des Kalzium-Einstroms wurden 60 µl der jeweiligen Zellsuspension mit 540 µl

Krebs-Ringer Lösung vermischt und mit 10 µg anti-IgM F(ab)2-Fragment (Jackson) oder 5 µg

Ionomycin (Sigma) stimuliert. Die Analyse erfolgte an einem LSRII Zytometer (Becton Di-

ckinson) über einen Zeitraum von 4 Minuten. Zur Auswertung der Messdaten wurde die

Software FlowJo v5.7.2 (Treestar, Ashland, USA) verwendet.

7.2.5 Molekularbiologische Methoden

7.2.5.1 Präparation von Plasmid-DNA und RNA

Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte mit kommerziell erhältlichen Mini-, Midi- und

Maxi-Kits nach den Herstellerangaben (Qiagen).

Zur Aufreinigung von Gesamt-RNA aus Zelllinien und Primärzellen wurde das RNeasy-Kit

(Qiagen) gemäß den Herstellerangaben verwendet.

7.2.5.2 Isolation genomischer Mausschwanz-DNA

Schwanzbiopsien wurden in 400 µl PBND-Puffer (50 KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM

MgCl2-6H2O, 0,1 mg/ml Gelatine, 0,45% NP40, 0,45% Tween20) aufgenommen und mit

10 µl Proteinase K (Peqlab 20 mg/ml) vermischt. Die Ansätze wurden über Nacht bei 56°C

auf einem Thermo-Schüttler inkubiert. Anschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung der

Proteinase K bei 95°C für 10 min. Nicht-lysierte Bestandteile wurden durch Zentrifugation

für 10 min bei 13.000 rpm (Heraeus Biofuge fresco) und Überführung der Überstände in fri-

sche 1,5 ml Reaktionsröhrchen entfernt. Zur daran anschließenden Genotypisierung mittels

PCR wurden jeweils 3 µl des Überstandes verwendet.

Material und Methoden

99

7.2.5.3 Synthese von cDNA

Als Ausgangsmenge wurde 1 µg Gesamt-RNA verwendet. Die RT (Reverse Transkriptase)-

PCR wurde mit Hilfe des SuperScript II bzw. III Polymerase Kit unter Verwendung von Oli-

go-dT12-18 bzw. 20-Primern gemäß den Herstellerangaben durchgeführt (Invitrogen).

7.2.5.4 DNA/RNA-Konzentrationsbestimmung

Die Konzentration von DNA- oder RNA-Lösungen wurde durch Messung der Absorption bei

260 nm und 280 nm mit einem NanoDrop (Peqlab) bestimmt.

7.2.5.5 Restriktionsverdau

Alle durchgeführten Restriktionsverdaus wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt

und durch Zugabe von 1/5 Volumen Ladepuffer (5x, 100 mM EDTA, pH 8,0, 15 % Ficoll

400, 0,25 % Bromphenolblau) beendet.

7.2.5.6 Alkalische Phosphatase

Um ein Schließen linearisierter Vektor-DNA während der Ligation zu vermeiden, wurden die

5´-Phosphatreste mit alkalischer Phosphatase (CIP, 10 U/µl) gemäß den Herstellerangaben

(NEB) hydrolysiert.

7.2.5.7 Klenow-Reaktion

Vorhandene 5‘-Überhänge nach Restriktionsverdaus wurden mittels Klenow-Reaktion zu

glatten Enden aufgefüllt. Dazu wurde die DNA-Suspension auf ein Volumen von 16 µl aufge-

füllt und mit 2 µl NEB-Puffer 2 (10x), 1 µl dNTP (0,5 mM, Genaxxon) und 1 µl Klenow

(0,5 U/µl, NEB) versetzt. Die Inkubation erfolgte zunächst für 15 min bei 25°C und anschlie-

ßend für 20 min bei 75°C.

7.2.5.8 Ligation von DNA

Die jeweiligen DNA-Fragmente wurden auf ein Volumen von 8 µl mit dH2O aufgefüllt und

mit 1 µl Ligationspuffer (10x) sowie 1 µl T4 DNA Ligase (400 U/µl, NEB) versetzt. Die In-

Material und Methoden

100

kubation erfolgte entweder für mindestens 1 Stunde bei RT oder über Nacht bei 4°C. Für die

Transformation in E. coli wurden die Ansätze anschließend im Verhältnis 1:2 mit dH2O ver-

mischt.

7.2.5.9 Transformation in E. coli

Zur Transformation von Plasmiden wurden 50 µl elektrokompetente E. coli auf Eis aufgetaut

mit 1 µl Ligationsansatz vermischt, für 5 Minuten inkubiert und anschließend in vorgekühlte

Küvetten (1 mm, Peqlab) überführt. Die Elektroporation wurde bei einer Spannung von 1,66

kV, einer Kapazität von 25 µF und einem Widerstand von 200 Ω durchgeführt. Direkt im An-

schluss daran wurde die Bakterienlösung mit 1 ml LB-Medium vermischt und für 30 Minuten

bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 150 µl des Reaktionsansatzes auf einer LB-Agar

Platte mit entsprechendem Selektionszusatz ausgestrichen und im Brutschrank bei 37°C über

Nacht inkubiert.

7.2.5.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Alle Reaktionen erfolgten in einem Volumen von 20 µl und wurden in einer Primus 96 PCR-

Maschine von Peqlab durchgeführt. Die Anzahl der durchlaufenen Zyklen betrug 35, die De-

naturierung der DNA erfolgte für 30 sec bei 94°C. Die weiteren spezifischen Reaktionsbedin-

gungen wurden den verwendeten Oligonukleotidprimern angepasst und sind in Tab. 9 zu-

sammengefasst.

Ein PCR-Reaktionsansatz enthielt:

Komponente Volumen

DNA (10-100 ng) x µl

Primer_fwd (5-20 µM) 1 µl

Primer_bwd (5-20 µM) 1 µl

dNTP-Mix (10 mM, Genaxxon) 0,5 µl

TAQ-Puffer (10x, Genaxxon) 2 µl

TAQ-Polymerase (5 U/µl, Genaxxon) 0,2 µl

dH2O ad 20 µl

Tab. 10: Übersicht der verwendeten Einzelkomponenten eines PCR-Ansatzes. Abkür-zungen: bwd: backward, fwd: forward, x: verwendetes Volumen an DNA in Abhängigkeitzur DNA-Konzentration.

Material und Methoden

101

7.2.5.11 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Auftrennung und Größenbestimmung von DNA-Fragmenten wurden Agarose-Gele (1%)

mit 5 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) je 100 ml 1x TAE (50x: 2M Tris-HCl pH 8,5, 1 M Nat-

riumacetat, 50 mM EDTA) verwendet. Eine parallel aufgetragene 100 bp oder 1 kb DNA-

Leiter diente dabei als Größenstandard (NEB). Die Gele wurden nach der Elektrophorese un-

ter UV-Licht (312 nm) dokumentiert.

7.2.5.12 Extraktion von DNA-Fragmenten

DNA-Fragmente wurden nach Ausschneiden mit einem Skalpell aus dem Agarose-Gel mit

dem Gel-Extraktionskit QiaEx II von Qiagen aufgereinigt. Dabei entsprach die Vorgehens-

weise den Herstellerangaben.

7.2.5.13 DNA-Sequenzierung

Alle Sequenzierreaktionen wurden mit dem Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

(Applied Biosystems, Darmstadt) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Analyse erfolgte

mit dem Kapillarsequenziergerät ABIPrism (Applied Biosystems). Anschließend erfolgte die

Auswertung der Sequenzdaten mit der Software SeqMan v5.06 (DNAStar, Madison, USA)

und VectorNTI v10.3 (Invitrogen).

7.2.6 Analyse von murinen VH-Regionen

7.2.6.1 Amplifikation von murinen VH-Regionen

In einer ersten PCR wurde mit einem am 5´-Ende der VH-Region direkt im Anschluss an die

VH-Leader Sequenz hybridisierenden degenerierten Primer und einem Mix von drei verschie-

denen Primern am 3´-Ende des JH-Segmentes die VH-Region amplifiziert (ten Boekel et al.,

1997; Abb. 25 A). Das daraus resultierende Fragment wurde in den Vektor pCR2.1 ligiert und

sequenziert. VH-Regionen ohne Sequenzierfehler wurden anschließend über eine zweite PCR

am 5`-Ende der VH-Region mit einer SalI-Schnittstelle versehen, in einem Zwischenschritt in

das mit SalI/HindIII linearisierte Plasmid LXSPstar-81XBC2cµm einkloniert und über eine

Transformation in E. coli vervielfältigt. Die Einklonierung der VH-Regionen in den retrovira-

Material und Methoden

102

len Zielvektor pCHIG erfolgte über die Restriktionsschnittstellen SalI und BsaBI. Zum Ab-

schluss wurden die Identitäten der einklonierten VH-Regionen mittels Sequenzierung verifi-

ziert.

Um im weiteren Verlauf den Zwischenschritt über die Einklonierung in LXSPstar-

81XBC2cµm zu umgehen, wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit anstelle der JH-Primer ein

in der konstanten Region der µH-Kette hybridisierender Primer verwendet (Abb. 25 B). Da-

durch konnte nach der zweiten Amplifikation der VH-Regionen über SalI und BsaBI direkt in

pCHIG einkloniert werden.

BsaBI

A

1. VHdeg_fwd JH1-4Mix HindIII_bwd

CµmL VDJ

2. VHdeg SalI_fwd

BsaBI

B

1. VHdeg_fwd Cµ1_bwd

CµmL VDJ

2. VHdeg SalI_fwd

Abb. 25: Strategie zur Klonierung von murinen VH-Sequenzen. Dargestellt ist dieStruktur des offenen Leserasters einer murinen membranständigen µH-Kette beste-hend aus der Leader-Peptid-Sequenz (L), der VDJ-Region sowie allen vier C- undden zwei Membrandomänen. Die Position der verwendeten Primer und ihre internenRestriktionsschnittstellen sind angegeben. Für eine erste Amplifikation wurde einVH-Primer ohne Schnittstelle verwendet. Zur weiteren Klonierung wurde über einezweite PCR eine SalI-Schnittstelle am 5`-Ende der VH-Region eingebracht. A, DieAmplifikation muriner VH-Regionen erfolgte zunächst unter Verwendung eines am3`-Ende des JH-Segmentes hybridisierendes Primer-Mixes. B, Durch Verwendungdes unterhalb der Restriktionsschnittstelle BsaBI hybridisierenden Cµ1_bwd Primerskonnte direkt in den Zielvektor pCHIG einkloniert werden. Abkürzungen: bwd:backward; fwd: forward; JH1-4Mix: Mix aus JH1/4, JH2 und JH3-Primern; VHdeg: de-generierter VH-Primer.

Material und Methoden

103

7.2.6.2 Datenbank- und statistische Analysen

Die Zuordnung der amplifizierten murinen VH-, D- und JH-Segmente sowie die Analyse der

vorkommenden CDR-H3 Regionen erfolgte über eine vergleichende Sequenzanalyse mit der

ImMunoGeneTics (IMGT)-Datenbank (http://imgt.cines.fr). Dabei wurde auch die hier ver-

wendete Nomenklatur der VDJ-Gensegmente übernommen (Tab. 11; Lefranc et al., 2003).

VH-Familien D-Segmente

IMGT AlternativeBezeichnung

IMGT AlternativeBezeichnung

IMGT AlternativeBezeichnung

VH1 J558 D1-1 DFL16.1 D2-14 DSP2.10

VH2 Q52 D1-2 DFL16.2 D3-1 DST4.2

VH3 36-60 D2-1 DSP2.1 D3-2 DST4

VH4 X-24 D2-2 DSP2.4 D4-1 DQ52

VH5 7183 D2-3 DSP2.9

VH6 J606 D2-4 DSP2.2

VH7 S107 (T15) D2-5 DSP2.x

VH8 3609 D2-6 DSP2.x

VH9 VGAM3-8 D2-7 DSP2.3

VH10 VH10 D2-8 DSP2.5

VH11 CP3 D2-9 DSP2.6

VH12 CH27 D2-10 DSP2.7

VH13 3609N D2-11 DSP2.8

VH14 SM7 D2-12 DSP2.12

VH15 VH15A D2-13 DSP2.13

Tab. 11. IMGT-Nomenklatur und alternative Bezeichnungen muriner funk-tioneller VH-Familien und D-Segmente.Quelle: http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/index.php?repertoire=nomenclatures&species=mouse&group=IGHV#notes und http://imgt.cines.fr/IMGT_GENE-DB/GENElect?query=4.2+&species=Mus+musculus

Die Überprüfung auf statistische Signifikanz erfolgte in Abhängigkeit zur vorliegenden Da-

tenmenge mittels T-Test, χ2-Test oder einem Vierfeldertest. Bei letzterem wurde der abge-

wandelte Fisher’s Exact Test für kleine Gesamtmengen verwendet. Bei allen statistischen

Berechnungen galten Werte p ≤ 0,05 als signifikant.

Material und Methoden

104

Die 20 proteinogenen Aminosäuren wurden im Ein-Buchstaben-Code verwendet:

Aminosäure Code Aminosäure Code

Alanin A Leucin L

Arginin R Lysin K

Asparagin N Methionin M

Asparaginsäure D Phenylalanin F

Cystein C Prolin P

Glutamin Q Serin S

Glutaminsäure E Threonin T

Glycin G Tryptophan W

Histidin H Tyrosin Y

Isoleucin I Valin V

Tab. 12. Einbuchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren.

7.2.7 Proteinbiochemische Methoden

7.2.7.1 Erstellung von Zelllysaten

Die zu lysierenden Zellen wurden einmal in kaltem PBS gewaschen und anschließend pro

1 x 106 Zellen in 50 µl Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA,

1% Triton-X-100, 10µg/ml Aprotinin, 1 mM PMSF, 10 mM Natriumfluorid) resuspendiert.

Die Zelllyse erfolgte für 30 min auf Eis. Anschließend wurden unlösliche Bestandteile für 10

min bei 4°C und 13.000 rpm (Heraeus Biofuge fresco) abzentrifugiert und die Überstände in

frische 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Die Lagerung erfolgte bis zur weiteren Verwen-

dung kurzzeitig auf Eis oder längerfristig bei -70°C.

7.2.7.2 Ko-Immunpräzipitation

Für einen Immunaffinitätspräzipitationsansatz wurden zunächst 5 µg des verwendeten Anti-

körpers mit 30 µl immobilisierter Protein-G-Sepharose-Matrix (Pierce, Bonn) für 1 Stunde

bei 4°C auf einem Rotator inkubiert. Nach einem Waschschritt in PBS mit 2% BSA wurde

das Zelllysat aus 3-5 x 106 Zellen zugegeben und der Ansatz für 2 Stunden bei 4°C auf einem

Rotator inkubiert. Anschließend wurde das Sepharose-Pellet dreimal mit jeweils 1 ml Hoch-

salzpuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 5 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,1% SDS, 0,5% Natrium

Deoxychelat, 0,5% Triton-X-100) und einmal mit 1 ml Niedrigsalzpuffer (50 mM Tris-HCl

Material und Methoden

105

pH 8,5) bei 2.000 rpm und 4°C für 2 Minuten (Heraeus Biofuge fresco) gewaschen. Nach

dem letzten Waschschritt wurde das Sepharose-Pellet in 70 µl 1x SDS-Ladepuffer (50 mM

Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 1% Bromphenolblau, 0,1 mM β-Mercaptoethanol)

aufgenommen, für 10 Minuten bei 95°C gekocht und anschließend auf Eis abgekühlt. Die

präzipitierten Proteine im Überstand wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelektrophorese ana-

lysiert.

7.2.7.3 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Page

Proteinsuspensionen wurden nach Molekularmasse in einem Polyacrylamidgel elektrophore-

tisch aufgetrennt (Laemmli 1970). Die Elektrophorese wurde in einer Trennkammer mit einer

Größe von 16 x 18 cm der Firma Hoefer (San Francisco, USA) durchgeführt.

Komponente Trenngel (10 %) Sammelgel

Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) 10 ml 1,7 ml

3 M Tris-HCl pH 8,8 3,75 ml

0,5 M Tris-HCl pH 6,8 2,5 ml

dH2O 15,65 ml 5,55 ml

SDS (10 %) 300 µl 100 µl

Ammoniumpersulfat (10 %) 300 µl 100 µl

TEMED 12 µl 12 µl

Tab. 13: Übersicht der verwendeten Einzelkomponenten zur elektrophoretischenAuftrennung von Proteinen mittels SDS-Page.

Vor der Elektrophorese mit einer Stromstärke von 35 mA pro Gel für ca. 4 Stunden wurden

die Proben mit einem entsprechenden Volumen 5x SDS-Ladepuffer (250 mM Tris-HCl

pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 5% Bromphenolblau, 0,5 mM β-Mercaptoethanol) ver-

mischt, für 10 Minuten bei 95°C gekocht und anschließend auf Eis abgekühlt. Zur späteren

Größenbestimmung der Proteine wurde der Broad Range Molekulargewichtsstandard der

Firma Bio-Rad (München) geladen.

Material und Methoden

106

7.2.7.4 Western Blot-Analyse

Elektrophoretisch aufgetrennte Proteine wurden von einem SDS-Polyacrylamidgel auf eine

Nitrozellulosemembran (Schleicher & Schuell, Dassel) mittels semi-dry Methode und dem

PerfectBlueTM-System (Peqlab, Erlangen) transferiert. Die Vorgehensweise entsprach dabei

den Herstellerangaben.

Zur Bestimmung der Laufweiten des Molekulargewichtsstandards wurden die Proteine auf

der Nitrozellulosemembran mit Ponceau-S (0,2% Ponceau S, 3% Trichloressigsäure, 3% Sul-

foalicylsäure) unspezifisch angefärbt und die entsprechenden Banden markiert. Die Membran

wurde durch mehrmaliges Waschen mit TBS/0,1% Tween 20 entfärbt. Die Blockierung un-

spezifischer Antikörperbindestellen wurde durch eine Inkubation für 60 min in TBS/0,1%

Tween 20 mit 5% Magermilchpulver erreicht. Der spezifische Nachweis von Proteinen er-

folgte mit den entsprechenden Primär- und Sekundärantikörperkombinationen in TBS/0,1%

Tween 20 mit 5% Magermilchpulver. Zwischen den beiden Antikörperfärbungen wurde die

Membran 3x für 10 min in TBS/0,1% Tween 20 gewaschen. Die Nachweisreaktion erfolgte

mit Hilfe des ECL-Systems (Amersham Pharmacia) und Röntgenfilmen. Die Belichtungszeit

wurde je nach Proteinvorkommen variiert.

Für weitere Analysen wurde die Aktivität der Peroxidase mit 0,1% NaN3 inhibiert und an-

schließend die Membran 3x für 10 Minuten in TBS/0,1% Tween 20 gewaschen. Oder gebun-

dene Antikörper für 2x 5 Minuten mit Stripping-Puffer (0,1 M Glycin pH 2,5, 0,5 M NaCl,

0,1% Tween 20, 0,1% NaN3) entfernt. Im Anschluss daran wurde die Membran 4x 10 Minu-

ten in TBS/0,1% Tween 20 gewaschen.

Abkürzungen

107

8 Abkürzungen

α alpha

β beta

κ kappa

λ lambda

µ mikro

µHC schwere Kette vom µ-Isotyp

A Ampère

AA Acrylamid

aa Aminosäure

Abb. Abbildung

Abl-MuLV Abelson murine leukemia virus

Ak Antikörper

Amp Ampicillinresistenz

APS Ammoniumpersulfat

BiP immunoglobulin heavy chain binding protein (schwere Ketten Bindeprotein)

BIS Bisacrylamid

Bla Ampicillinresistenz durch β-Laktamase

BLNK B cell linker protein

BSA Rinderserumalbumin

bp Basenpaar

BZR B-Zellrezeptor

°C Grad Celsius

CH/CL konstante Domäne der schweren bzw. leichten Immunglobulinkette

CD Cluster of Differentiation

cDNA Komplementäre DNA

Da Dalton

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

ds doppelsträngig

ECL Enhanced Chemiluminescence

Abkürzungen

108

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ER Endoplasmatisches Retikulum

ERK Extracellular Signal-Regulated Protein Kinase

EtBr Ethidiumbromid

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FI Fluoreszenzintensität

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

FKS Fötales Kälberserum

g Gramm

GFP Green Fluorescene Protein

GTP Guanosin Triphosphat

h Stunde

H-Kette Ig-Schwer (heavy)-Kette

HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase

HRP Meerrettich-Peroxidase

Ig Immunglobulin

IP Immunpräzipitation

IRES Internal Ribosomal Entry Site

ITAM Immunoreceptor Tyrosin-based Activation Motif

IVC Individual Ventilated Cages

k Kilo

kb Kilobasenpaare

kDa Kilo Dalton

KM Knochemark

l Liter

L-Kette Ig-Leicht (light)-Kette

LB Luria Broth

LC leichte Immunglobulinkette

M molar

MACS Magnetic Cell Sorting

MFI Mean Fluorescence Intensity

min Minute

mol Einheit der Stoffmenge Mol

Abkürzungen

109

Mol Stoffmenge in mol

n nano

NET NaCl-EDTA-Tris

OD optische Dichte

ori origin of replication

p Piko

PAA Polyacrylamid

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Kettenreaktion

PE Phycoerythrin

PI Propidiumiodid

Prä-BZR Prä-B-Zellrezeptor

RAG Recombination Activating Gene

RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute

RPMI Rosewell Park Memorial Institute

RT Raumtemperatur

RT Reverse Transkriptase

s Sekunde

SDS Natriumdodecylsulfat

SL-Kette Surrogate leichte Kette

Tab. Tabelle

TBS Tris Buffered Saline

TdT Terminale Deoxynukleotidyltransferase

TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin

Tris Trishydroxymethiaminomethan

Tween20 Poly(oxyethylen)n-Sorbitan-Monolaurat

U Einheit (Unit)

UPR unfolded proteine response

UV Ultraviolettes Licht

V Volt

VH/VL Variable Domäne der Immunglobulin-H- bzw. L-Kette

WB Western Blot

WT Wildtyp

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#In Klammern [] ist der jeweilige Impact Factor (IF) des Journals angegeben (Stand: 2006;Quelle: http://www.isiknowledge.com).

*Geteilte Erstautorenschaft

Lebenslauf

122

11 Lebenslauf

Persönliche Daten: Kai-Uwe Herrmann

Diplom-Biologe

geboren am 06. Juni 1974 in Konstanz

Hochschulstudium:

2003 – 2007 Dissertation in der Abteilung für Molekulare Immunologie ander Medizinischen Klinik III in Erlangen unter Anleitung vonProf. Dr. Hans-Martin Jäck zum Thema: Transport- und Signal-kompetenz von schweren IgM-Ketten

2003 – 2006 Stipendiat des Erlanger Graduiertenkollegs 592: Lymphozyten:Differenzierung, Aktivierung und Deviation

2002 – 2003 Diplomarbeit am Institut für Tropenmedizin der Universität Tü-bingen zum Thema: Immunmodulatorische Substanzen aus Fila-rien: Etablierung eines Testsystems

1998 – 2002 Diplomstudiengang der Biologie an der Eberhardt-Karls-Universität in Tübingen

1996 – 1998 Studiengang für das Lehramt an Realschulen in Freiburg i.Brsg.

Zivildienst:

1994 – 1995 Mobiler Sozialer Dienst bei der Arbeiterwohlfahrt in Bruchsal

Schulausbildung:

1986 – 1994 Bertha-von-Suttner-Gymnasium in Ettlingen

1985 – 1986 Realschule in Linkenheim-Hochstetten

1984 – 1985 Hauptschule in Linkenheim-Hochstetten

1980 – 1984 Grundschule in Linkenheim-Hochstetten

Danksagung

123

12 Danksagung

Herrn Professor Dr. Hans-Martin Jäck danke ich für die Überlassung des interessanten Themasmeiner Dissertation, für die intensive Betreuung, seine erstklassigen wissenschaftlichen Anre-gungen, sowie für die kritische Durchsicht dieser Arbeit und für seine verständnisvolle Unters-tützung.

Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler danke ich für die hervorragenden wissenschaftlichen Anre-gungen und für die Übernahme des Zweitgutachtens.

Herrn Christian Vettermann danke ich für seine große Diskussionsbereitschaft und für seinewertvollen durchflusszytometrischen Daten.

Herrn Dr. Dirk Mielenz und Herrn Dr. Wolfgang Schuh danke ich für die ausgezeichneten undimmer aus reiner Begeisterung für die Forschung erteilten wissenschaftlichen Anregungen.

Herrn Arthur Mortha für seine unstillbare wissenschaftliche Neugierde und seinen beispiello-sen Enthusiasmus.

Frau Susanne Duncker und Herrn Dr. Wolfgang Schuh danke ich für hilfreichen Korrektur-und Verbesserungsvorschläge beim Schreiben dieser Arbeit.

Herrn Dr. Michael Zemlin von der Universitätsklinik Marburg danke ich für die stete Unters-tützung bei allen Fragen und Problemen bezüglich statistischer Analysen.

Frau Dr. Astrid Elter und Herrn Professor Dr. Lars Nitschke danke ich für die Einweisung undihre Hilfe bei der Durchführung der Kalzium-Messungen.

Herrn Dr. Thiago Carvalho und Prof. Dr. John Kearney von der Universität Birmingham/USAdanke ich für die großzügige Bereitstellung der Daten aus der VH81XBC2-Maus.

Den Mitgliedern meiner Betreuungskommission, Herrn Prof. Dr. Dr. Andrè Gessner und HerrnPD Dr. Robert Slany danke ich für ihre große Diskussionsbereitschaft und ihre wertvollen Bei-träge bei meinen Kommissionssitzungen.

Allen Kollegiaten des GK592 danke ich für die unvergessliche Zeit.

Mein besonderer Dank gilt allen hier nicht einzeln aufgeführten MolIms für deren unglaublicheHilfsbereitschaft und nie endende Unterstützung.

Und von ganzem Herzen danke ich:

meiner zukünftigen Frau Sandra Hille für ihre unglaubliche Geduld, ihr großzügiges Ver-ständnis und für das unermüdliche Korrekturlesen dieser Arbeit!

meinen Eltern, ohne die alles gar nicht möglich gewesen wäre!