Ver.ffentlichungs- version Anhang

7 Anhang

Anhang 1

7 Anhang

7.1 Sequenzalignments Die Alignments der Phosphattransportergene und der bakteriellen 16 S-rRNA-Gene, auf deren Grundlage die Berechnungen für die phylogenetischen Beziehungen durchgeführt wurden, finden sich im Rich-Text-Format (*.rtf) auf beiliegendem Datenträger.

7.2 Computergestützte Bildbearbeitung eingescannter Autoradiogramme 7.2.1 Grundlagen Prinzipiell hängt die Photoreaktion und damit verbundene Schwärzung eines Röntgenfilms von zwei Bedingungen ab:

a) der Strahlungsintensität und b) dem Abstand des Strahlers von der Filmoberfläche.

Zusätzlich kann das Ausmaß der Photoreaktion durch

c) die Nutzung von Verstärkungsfolien erhöht werden. In diesem Fall regt die Transmissionsstrahlung, die den Röntgenfilm bereits durchdrungen hat, die Beschichtung der Verstärkungsfolie an (früher CaCO3, heute meist Verbindungen der Übergangsmetalle). Die angeregten Moleküle geben die eingestrahlte Energie unter Fluoreszenz im Bereich des sichtbaren Lichts wieder ab (Abbildung 38). Im Idealfall können bis zu 95 % einer Schwärzung durch die Fluoreszenz der Verstärkungsfolie bedingt sein.

Abb. 1: Funktionsschema Wirkungsweise von Verstärkungsfolien

Verändert nach Kodak Scientific Imaging Systems (http://www.kodak.co.uk/US/en/health/scientific/)

In jedem Fall liegt der Schwärzung der Emulsionsbeschichtung eines Röntgenfilms eine Sättigungsfunktion zugrunde, die bei steigender Belichtung zu einer gesteigerten Schwärzung führt. Dies geht soweit, bis auf einer Fläche alle Farbstoffmoleküle reagiert haben, eine weitere Schwärzung dieser Fläche also nicht möglich ist. Bei Verwendung gleicher Strahlungsisotope, gleicher Filme und gleichen Verstärkungsfolien kann die

7 Anhang

Anhang 2

Sättigungsfunktion als konstant angenommen werden. Der Grad der Schwärzung als Produkt aus Größe des Flecks mit seiner Farbtiefe ist somit direkt von der Zahl der Zerfälle auf der entsprechenden dünnschichtchromatographischen Platte abhängig und lässt sich über folgende Proportionalitätsbeziehung beschreiben:

S ∼ A * M Formel 1: Proportionalitätsbeziehung für die Ermittlung der Filmschwärzung

S = Schwärzungsgrad, A = Fläche (Area) des Flecks, M = mittlere Schwärzung (Mean) des Flecks

7.3 Bildanalyse über direkte Graustufenzählung mittels BioPic Zur direkten Auszählung der Graustufen innerhalb eines eingescannten Autoradiogramms und damit Bestimmung von Fläche und Farbtiefe wurde ein Programm entwickelt, das die im Folgenden dargestellten wesentlichen Funktionen beinhaltete. 7.3.1 Beschreibung der Programmstruktur und -funktionen

1. Bestimmung der Hintergrundfärbung des Filmes Innerhalb des Hintergrundbereiches konnte durch subjektive Auswahl dreier Bildpunkte und Berechnung der Steigung zweier sich im ersten Bildpunkt kreuzenden Geraden die Lage der im Idealfall als Ebene im Raum angenommenen Hintergrundfärbung bestimmt werden. Außerdem war es möglich mittels der diesen Geraden zugrunde liegenden Funktionen den Hintergrundwert jedes einzelnen Bildpunktes innerhalb einer Auswahlfläche zu bestimmen. Innerhalb dieser Auswahlfläche konnte somit vom Grauwert jedes Bildpunkts der Hintergrundwert subtrahiert werden. In der dabei zugrunde liegenden Berechnung wurde zunächst die Steigung der beiden Geraden bestimmt:

steigung_in_x_richtung = (backgrey2 - backgrey1) / (backgrey2_x - backgrey1_x) steigung_in_y_richtung = (backgrey3 - backgrey1) / (backgrey3_y - backgrey1_y)

Formel 2: Berechnung der Hintergrundebene

Mittels der auf diese Weise bestimmten Gleichung wurde dann jeder gezählte Grauwert innerhalb eines Bildpunktes um seinen Hintergrundwert in x- und y-Richtung korrigiert:

corrx = (x - backgrey1_x) * steigung_in_x_richtung corry = (y - backgrey1_y) * steigung_in_y_richtung

Formel 3: Korrektur der Grauwerte

Der Korrekturwert wurde nun vom gezählten Grauwert abgezogen und als GREY-BACKGROUND im Ergebnisfeld ausgegeben:

greycorr = tmpcolgrey - (backgrey1 + corrx + corry) Formel 4: Ausgabefunktion des Korrekturwerts

7 Anhang

Anhang 3

2. Markierung eines Auswahlbereichs

Innerhalb dieser Auswahlfläche war es möglich, die Summe der Grauwerte über den Auswahlbereich abzüglich der wie oben angeführt berechneten Hintergrundwerte zu bestimmen.

3. Darstellung der Markierungsfläche als Oberflächendiagramm. 7.3.2 BioPic – Bedienung des Programms

Abb. 2: Screenshot BioPic-Programm

Nach dem Start durch Mausklick auf den Button „Datei öffnen“ eine Bilddatei öffnen. Zulässige Formate sind BMP (Windows-Bitmap), JPG (Joint Photographic Experts Group), GIF (Graphics Interchange Format) oder WMF (Windows Meta-File). Da weitere Grafikfilter nicht implementiert sind, müssen alle anderen Bildformate vorher mit einem Grafikprogramm in eines der o. a. Formate überführt werden.

7 Anhang

Anhang 4

Abb. 3: Screenshot BioPic-Programm mit geöffnetem Beispielbild, Hintergrundwerte bestimmt

Durch Mausklick auf den Button „Hintergrund bestimmen“ können innerhalb des Bildausschnitts drei Grauwerte gesetzt werden. Die Grauwerte des Hintergrundes werden in x-Richtung durch die Steigung einer Geraden durch die Punkte „Black-Grey1“ und „Black-Grey2“, in y-Richtung durch die Steigung einer Geraden durch die Punkte „Black-Grey1“ und „Black-Grey3“ und ihren Abstand von diesen drei Punkten definiert.

Abb. 4: Screenshot BioPic-Programm mit geöffnetem Beispielbild, Grauwerte ausgezählt

Durch Ziehen einer Markierungsmaske mit gehaltener linken Maustaste lässt sich eine Zählmaske (im Bild rot hinterlegt) definieren. Die Zählergebnisse werden automatisch im Ergebnisfenster dargestellt und sind als ASCII-Text markier- und kopierbar.

7 Anhang

Anhang 5

Ergebnisse sind: • Position der Zählmaske (Pixelabstand vom Bildrand links, rechts, oben und unten):

Left / Right / Top / Bottom • Summe der Rot-, Grün-, Blau- und Grauwerte:

Red / Green / Blue / Grey • Summe der vom Hintergrund befreiten Grauwerte:

Grey-Background • Arithmetisches Mittel des Hintergrundes:

Averagebackground

Abb. 5: Screenshot BioPic-Programm mit geöffnetem Beispielbild,

3D-Oberflächenplot der Zählfläche aus Abb. 48

Wird vor der Auswahl einer Zählmaske das Optionsfenster „Diagramm berechnen“ markiert, lassen sich die Grauwerte innerhalb der Zählmaske durch Mausklick auf den Button Diagramm/Bild in einem 3D-Oberflächenplot anschaulich darstellen. Diese 3D-Grafik lässt sich durch Klicken und Ziehen mit der Maus im Kipp- und Drehwinkel verändern.

7 Anhang

Anhang 6

7.3.3 Stärken und Schwächen des Programms 7.3.3.1 Prinzipieller Vorteil des Programms Besonderer Vorteil dieses sehr einfachen Programms war es, dass außer der Konvertierung des Ursprungsbilds in ein Standard-Windows-Format (z. B. Bitmap-Format [*.bmp]) und ggf. einer Invertierung des Grauspektrums keinerlei Operationen am Rohbild durchgeführt werden mussten. Insbesondere auf aufwendige und ggf. fehlerbehaftete Schärfungs- und ähnliche Retuschierarbeiten konnte prinzipiell verzichtet werden. 7.3.3.2 Prinzipielle Schwächen des Programms Bei der testweisen Anwendung stellte sich heraus, dass dieses Programm zwar prinzipiell funktionstüchtig ist, allerdings einige Schwächen ohne erhöhten Programmieraufwand und damit verbundene tiefere Einarbeitung in Spezialfunktionen der Programmiersprache Visual Basic 6.0 (Microsoft, Redmond, USA) nicht auszugleichen waren. Insbesondere waren folgende Probleme ohne weiteres nicht zu lösen:

1. Kreisförmige Markierung der auszuzählenden Fläche. Durch die rechteckige Standardmarkierung war es nur möglich, klar getrennte Färbungen auf dem Autoradiogramm auszuzählen. Ineinander übergehende Flecken waren nicht sinnvoll zu trennen, da dieses außerdem die Möglichkeit beinhalten musste, mehrere Markierungen aneinanderzulegen.

2. Unabhängigkeit des Zählergebnisses von der Größe der markierten Fläche. Durch die ungleichmäßige Hintergrundfärbung des Rohbildes war es mittels der eingesetzten Steigungsfunktionen in x- und y-Richtung nicht möglich, diese sicher und mathematisch korrekt aus den Markierungen auf dem gescannten Autoradiogramm herauszurechnen. Bei korrekter Umsetzung sollte sich eine Änderung der Größe der markierten Fläche nicht in der Summe der Graustufen innerhalb dieser Fläche bemerkbar machen, da der Hintergrund ja gleich Null gesetzt wird und somit nicht eingerechnet werden sollte. Dieses war nur in sehr engen Grenzen zutreffend.

Der Quelltext des Programms findet sich am Schluss des Anhangs.

7.4 Bestimmung der relativen Verbindungsanteile mittels PaintShopPro 7.0 und Scion Image Beta 4.0.2

7.4.1 Methode Neben der bereits wiedergegebenen Bildanalyse der eingescannten Röntgenfilme über Pixelzählung mit einem selbstgeschriebenen Visual-Basic®-Programm (Version 6.0, Microsoft, Redmond USA) wurde versucht, basierend auf in der Arbeitsgruppe vorhandenen (PaintShopPro 7.0) bzw. im Internet frei verfügbaren (Scion Image Beta 4.0.2) Bildbearbeitungsprogrammen eine Methode zur computergestützten Auswertung der Bilddaten entwickelt. Die Vorgehensweise und die einzelnen Schritte der Auswertung der

7 Anhang

Anhang 7

eingescannten Autoradiogramme sind im Folgenden näher beschrieben, die Bearbeitung der eingescannten Autoradiogramme sind ebenfalls als Bilder der einzelnen Teilschritte dargestellt. Wie für die Ergebnisse aus der Szintillationszählung war es möglich, die relativen Anteile der Verbindungen in Abhängigkeit von den jeweiligen Versuchsbedingungen darzustellen. Da sowohl die o. a. Szintillationszählungsergebnisse, als auch die zur Bildbearbeitung eingescannten Autoradiogramme auf denselben 2D-Dünnschichtchromatografischen Auftrennungen der löslichen Phosphatverbindungen beruhen, soll hier beispielhaft nur die Auswertung einer Verbindung aus einer Experimentreihe (Veränderung des relativen Anteils von anorganischem Phosphat im Pulse-Chase-Experiment) dargestellt werden. 7.4.2 Arbeitsschritte Zur computergestützten Auswertung der Autoradiogramme der 2-dimensionalen Dünnschichtchromatographie wurde wie folgt verfahren:

1. Einscannen des Autoradiogramms an Umax-Scanner 1200 mit Durchlichteinheit und Bedienungssoftware VistaScan 3.75 Einstellungen der Software:

• S/W-Foto • Transmissiv • 150 dpi • 100 % • „Magic Match“ und „Auto Jus.“ = off • Gamma-Korrekturwert = 0,5 • Hervorhebungswert = 255 • Schattenwert = 0 • Kontrastwert = 0 • Helligkeitswert = 0

Gescannte Bilder wurden im Tagged Image File Format (*.tif) auf der Festplatte gespeichert.

2. Bilddatei in PaintShopPro 7.0 aufrufen. 3. Spiegeln und Drehen des Bildes.

Durch Spiegeln bzw. Drehen des eingescannten Autoradiogrammes wurde der Startpunkt der Chromatographie nach oben links bei gleichzeitiger Anordnung der 1. Chromatographielaufrichtung von links nach rechts gelegt. Dabei war auf eine genaue Ausrichtung des Bildes zum Arbeitsgitter zu achten. Das so bearbeitete Bild wurde unter der Bezeichnung „RAW – ‚Objekt’ im Licht/Dunkel ‚Inkubationszeit’.tif“ abgespeichert, wobei ‚Objekt’ die Werte Geosiphon oder Nostoc, ‚Inkubationszeit’ die Werte 0 min bis 60 min annehmen konnte.

4. Beschneiden des Bildes auf eine Größe von 1000x1000 Pixel In der Vergrößerungsstufe 1:2 auf einem 19-Zoll Monitor wurde die Bilddatei auf 1000x1000 Bildpunkte zugeschnitten. Dabei war auf einen gleichen Randabstand des Startpunktes vom Bildrand zu achten.

7 Anhang

Anhang 8

Das so bearbeitete Bild wurde unter der Bezeichnung „‚Objekt’ im Licht/Dunkel ‚Inkubationszeit’ – CUT 1000x1000.tif“ abgespeichert.

5. Histogramm strecken. Das Histogramm stellt die Verteilung der Helligkeitswerte innerhalb einer Bilddatei dar. Durch die Streckungsfunktion sorgt dafür, dass ein Grossteil der zur Verfügung stehenden Helligkeitswerte verwendet wird, es wird dem Bild mehr Kontrast zugefügt.

6. Verwischen der Kanten (Gaussian Blur). Durch Verwendung einer auf einer Gauß’schen Normalverteilung beruhenden Verwischungsfilterfunktion mit dem Radius 5 Pixel wird dem Bild etwas Unschärfe zugefügt. Infolgedessen werden die durch das Scannen entstandenen Rasterpunkte verwischt.

7. Histogram strecken. Das so bearbeitete Bild wurde unter der Bezeichnung „‚Objekt’ im Licht/Dunkel ‚Inkubationszeit’ – CUT 1000x1000_histo_blur_histo.tif“ abgespeichert.

8. Kopie des Bildes verwischen (Gaussian Blur). Vom vorliegenden Bild unter Punkt 7 wurde nun eine Kopie angefertigt und mit der oben erwähnten Verwischungsfilterfunktion (in diesem Falle mit Radius 100 Pixel) großflächig verwischt. Auf diese Art entsteht ein Abbild der Hintergrundfärbung des Autoradiogramms.

9. Subtraktion des Bildhintergrunds. Mit Hilfe der Image-Arithmetic-Funktion kann das Hintergrundbild (vgl. 8.) nun vom Originalbild (vgl. 7.) abgezogen werden. Verwendete Einstellungen waren dabei:

• Image #1 = Originalbild, • Image #2 = verwischte Kopie, • Function = „Subtract“, • Channel = „All channels“ • Divisor = 1 • Clip color values = off

10. Bereinigung des Hintergrunds. Der aufgrund der Berechnung entstandene fleckige Bildhintergrund wurde von Hand mittelgrau (50 %) eingefärbt, nur echte Schwärzungen des Autoradiogrammes wurden stehen gelassen. Die mittelgraue Färbung ist insofern wichtig, dass sie beim späteren Strecken des Histogramms keinen Einfluß auf die Funktion hat.

11. Glättung der Bildränder. Mit Hilfe der „Despeckle“-Funktion, die einzelne weiße oder schwarze Pixel an Bildrändern entfernt und die zweimal angewendet wurde, konnte eine Glättung der Bildränder erreicht werden.

12. Histogramm strecken. 13. Einfärbung des Bildhintergrunds.

Der Bildhintergrund wurde mittels der Zauberstabmaske selektiert und schwarz eingefärbt und das so entstandene Bild, das nur noch die reine Information an den geschwärzten Stellen des Röntgenfilms enthielt, unter unter der Bezeichnung „‚Objekt’ im Licht/Dunkel ‚Inkubationszeit’ – cut_subtract_masked.tif“ abgespeichert.

7 Anhang

Anhang 9

14. Trennen der Markierungen. Durch Einziehen schwarzer Linien (Funktion Draw, Tool Options: Type = Single Line, Style = filled, Width = 3, „AntiAlias“) wurden die Markierungen von Hand getrennt und das Bild neu abgespeichert. Dabei waren kurze Datei- und Pfadnamen wichtig, da Scion Image nicht zu langen (Windows-) Datei- und Pfadnamen kompatibel ist.

15. Makro für Scion Image laden. Unter dem Menüpunkt „Special“ wurde der Eintrag „Load Macros“ ausgewählt und das Macro „Measure.txt“ im Ordner „Macros“ unter dem Installationsordner aktiviert.

16. Bilddatei öffnen. Die unter PaintShopPro erstellte Bilddatei wurde in Scion Image geöffnet.

17. Festlegung der Grenzwerte für die Zählung. Nach Laden des „Measure“-Makros war unter dem Menüpunkt „Special“ der Eintrag „Set Threshold“ zu finden. Dieser wurde ausgewählt und als Grenzwerte „0“ für „Lower“ und „255“ für „Upper“ angeben. Die entsprechenden Bildbereiche innerhalb dieser Grenzen wurden durch Scion Image rot hinterlegt.

18. Partikelauswertung. Unter dem Menüpunkt „Analyze“ wurde der Eintrag „Analyze Particles“ ausgewählt, zusätzlich zu den Standardoptionen wurde der Punkt „Outline Particles“ aktiviert.

19. Ergebnisse. Nach Ausführung der o. a. Rechenoperationen konnten die Fläche („Area“) und der arithmetische Mittelwert der Graufärbung der einzelnen Partikel („Mean“) im Ergebnisfenster abgelesen und in Microsoft Excel®, Version 10 (Microsoft, Redmond, USA) kopiert und weiterverarbeitet werden. Durch Anwendung der „Outline Particles“-Funktion wurden außerdem innerhalb des Bildes die Bereiche eingezeichnet, die zur Berechnung herangezogen wurden. Entsprechende Werte konnten somit manuell den Zählungsergebnissen aus der Szintillationszählung zugeordnet und mit diesen verglichen werden.

7 Anhang

Anhang 10

Abb. 6: Teilschritte der Bildbearbeitung und -analyse mit Paint Shop Pro 7.0 und Scion Image Beta 4.0.2

a) gescanntes Autoradiogramm; b) Bild auf 1000x1000 Pixel beschnitten und geradegerichtet; c) Histogramm gestreckt; d) Bild mit Radius „5“ mit Gauß’scher Unschärfe verwischt; e) Histogramm gestreckt;

f) und g) Teilbilder für Subtraktionsfunktion, g) wird von f) subtrahiert; h) Ergebnis der Bildsubtraktion; i) Hintergrund Mittelgrau eingefärbt; j) Bildränder 2x geglättet, Histogramm gestreckt; k) Hintergrund schwarz eingefärbt;

l) Markierungen durch Linien getrennt; m) Schwellenwert gesetzt („0“ bis „255“); n) Ergebnis der Makrofunktion „Analyze Particles“

Zur Bestimmung der relativen Anteile der verschiedenen Verbindungen und Verbindungsgruppen über Bildanalyse wurden die Bilder wie in Abbildung 43 dargestellt bearbeitet und analysiert. Die Bildbearbeitung [Teilbilder a) bis l)] erfolgte dabei in Paint Shop Pro 7.0, die Analyse der Partikel [Teilbilder m) und n)] in Scion Image Beta 4.0.2.

a) b) c) d)

e) f) g) h)

i) j) k) l)

m) n)

7 Anhang

Anhang 11

Zur Berechnung der relativen Anteile wurden die Ergebnisse der Partikelanalyse, die von Scion Image als Werte für die Fläche und mittleren Grauwert einer Markierung dargestellt werden, in Microsoft Excel® 10, 2002 (Microsoft, Redmond, USA) eingelesen und dort weiter verarbeitet. Für den tatsächlichen absoluten Wert einer Markierung wurde das Produkt aus Fläche und mittlerem Grauwert (Area x Mean) gebildet. Da Scion Image bei der Pixelanalyse unter Umständen weitere, sehr kleine oder schwache Partikel erkennt und getrennt analysiert, mussten in diesem Fall mehrere Markierungen von Hand wieder zusammengefasst und die absoluten Werte addiert werden. Mit Hilfe der Summe aller Absolutwerte konnte dann der relative Anteil der einzelnen Markierungen berechnet werden. 7.4.3 Vergleich der Ergebnisse aus Szintillationszählung und Bildauswertung 7.4.3.1 Quantifizierung der Markierungsverluste Zum Vergleich der Ergebnisse aus der Szintillationszählung und der Analyse der gescannten Autoradiogramme wurde zunächst der Anteil der Verbindungen bestimmt, der durch die Bildbearbeitungsschritte verloren ging. Dazu wurde von der Anzahl der Markierungen, die zur Zählung von der 2D-Dünnschichtchromatografieplatte ausgekratzt wurde, die Anzahl der Partikel subtrahiert, die durch die Analysefunktion von Scion Image Beta 4.0.2 erkannt wurde. Die erhaltene absolute Differenz wurde durch Division durch die gezählte Markierungsanzahl in einen prozentualen Anteil umgerechnet und ist in Abbildung 44 dargestellt. Die Standardabweichung wurde auf der Grundlage von 62 zur Bildanalyse und Szintillationszählung herangezogenen Autoradiogrammen berechnet.

Abb. 7: Anzahl [a)] und Verlust [b)] von Markierungen nach Bildanalyse gescannter Röntgenfilme

Es ist erkennbar, dass im Mittel knapp 20 % der Markierungen durch die Bildanalyse nicht erkannt wurden [vgl. Teilbild b)], d.h. bei einer mittleren Anzahl der zur Szintillationszählung ausgekratzen Markierungen von 20,0 (Standardabweichung 5,37 bei n=62) wurden 16,3 Markierungen erkannt (Standardabweichung 4,74 bei n=62) [vgl. Teilbild a)]. Insbesondere beim rechnerischen Entfernen des Bildhintergrundes [vgl. Abb. 43, f) bis h)], bei dem eine stark verwischte Kopie vom Originalbild abgezogen wurde, kam es zum Verlust von schwachen Schwärzungen des Röntgenbildes.

a) b)

7 Anhang

Anhang 12

7.4.3.2 Metabolisierung von 32Pi durch Blasen von Geosiphon pyriformis am Beispiel von anorganischem Phosphat

Abb. 8: Vergleich von Szintillationszählung [a)] und Bildanalyse [b)]:

Relativer Anteil des anorganischen Phosphats (Pi) bei Blasen von Geosiphon pyriformis im Pulse-Chase-Experiment

Einzelexperiment, Fütterungspuls = 1 min

Als ein Beispiel für die Bestimmung des relativen Anteils einer Verbindung in einer Experimentreihe ist in Abbildung 45 der Anteil des anorganischen Phosphats (Pi) aus Blasen von Geosiphon pyriformis im Pulse-Chase-Experiment dargestellt. Das Teilbild a) zeigt dabei das bereits bekannte Ergebnis aus Abschnitt 4.4.3.2.1 und wurde dort schon näher dargestellt. Im Teilbild b) wurde das Autoradiogramm desselben Experiments nun mittels Bildbearbeitung ausgewertet. Dabei zeigten sich zum Teil erhebliche Schwankungen des Anteils des markierten anorganischen Phosphats gegenüber den übrigen markierten Verbindungen. Diese Schwankungen sind größtenteils wohl auf die Übersättigung des Röntgenfilms durch die hohe Strahlungsintensität des großen Pi-Anteils zurückzuführen. 7.4.3.3 Vergleich der Anteile anderer markierter Verbindungen Die prominenteste Markierung (55,96 %, Standardabweichung 24,67 % bei n = 56) auf den 2D-Dünnschichtchromatogrammen war in der Regel wieder aus dem Blasen- bzw. Zellmaterial extrahiertes anorganisches Phosphat (Pi). Da der Anteil der nächsthäufigen Verbindung (Glutaminsäure-Phosphat) nur 8,81 % (Standardabweichung 11,16 % bei n=56) betrug, mussten die Röntgenfilme so lange auf den Chromatographieplatten aufliegen, dass bei den hohen Intensitäten, die als Pi aus dem Zellmaterial extrahiert werden konnten, der Sättigungsbereich der Schwärzung der Filmemulsion erreicht wurde. Aus diesem Grund war zu vermuten, dass in der Regel der relative Anteil von stark markierten Verbindungen, insbesondere dem genannten anorganischem Phosphat (Pi) in der Bildanalyse deutlich zu niedrig ausfallen würde. Deshalb wurde, wie bei der Auswertung der Experimente, durch Szintillationszählung der relative Anteil der markierten löslichen organischen Phosphatverbindungen, d.h. der extrahierbaren Verbindungen ohne Berücksichtigung des anorganischen Phosphats berechnet. Dies ist beispielhaft in Abbildung 46 dargestellt, in der die Anteile von 30 Verbindungen aus dem Pulse-Chase-Experiment mit Blasen von Geosiphon pyriformis, Nachinkubationszeit 60 min nach Fütterungspulse 1 min ohne Berücksichtigung von Pi bei der Berechnung der relativen Anteile gezeigt werden.

a) b)

7 Anhang

Anhang 13

Abb. 9: Vergleich Szintillationszählung und Bildanalyse

Darstellung der Fehlerschwankung Auswertung aller detektierbaren Markierungen eines einzelnen Autoradiogramms,

Pulse-Chase-Experiment mit Blasen von Geosiphon pyriformis, Fütterungspuls = 60sec, Nachinkubationszeit (chase) = 60 min

Neben dem Effekt, dass die relativen Anteile der Verbindungen mit geringer Markierungsintensität deutlicher dargestellt werden, war an diesem Beispiel erkennbar, dass sich auch die Abweichung der Bildanalyse von den Ergebnissen der Szintillationszählung deutlich verbessern könnte, da mit der Filmsättigung durch das stark markierte Pi eine große Fehlerquelle entfernt werden konnte. Trotzdem schwanken die Werte aus der Auswertung über Bildanalyse zum Teil erheblich um die aus Auswertung durch Szintillationszählung. 7.4.3.4 Zusammenfassung Aufgrund der doch erheblichen Abweichungen und vor allem des stark schwankenden Fehlers, der sich beim Vergleich anderer, hier nicht dargestellten Ergebnisse aus Szintillationszählung und Bildauswertung wiederholte, wurde die oben angeführte Methode nicht zur Auswertung herangezogen. Stattdessen wurden die o. a. Ergebnisse wie bereits angeführt durch Szintillationszählung bestimmt.

7 Anhang

Anhang 14

7.4.4 BioPic – Quelltext des Programms

VERSION 5.00

Object = "{65E121D4-0C60-11D2-A9FC-0000F8754DA1}#2.0#0"; "MSCHRT20.OCX"

Object = "{F9043C88-F6F2-101A-A3C9-08002B2F49FB}#1.2#0"; "COMDLG32.OCX"

Begin VB.Form main

Caption = "BioPic"

ClientHeight = 8835

ClientLeft = 60

ClientTop = 345

ClientWidth = 10875

Icon = "main.frx":0000

LinkTopic = "Form1"

ScaleHeight = 589

ScaleMode = 3 'Pixel

ScaleWidth = 725

StartUpPosition = 2 'Bildschirmmitte

Begin VB.PictureBox Picture2

Align = 3 'Links ausrichten

Height = 8835

Left = 0

ScaleHeight = 585


ScaleWidth = 173

TabIndex = 1

Top = 0

Width = 2655

Begin VB.CheckBox chk_diag

Caption = "Diagramm berechnen"

Height = 375

Left = 240

TabIndex = 15

Top = 8280

Width = 2055

End

Begin VB.CommandButton cmd_chart

Caption = "Diagramm / Bild"

Height = 375

Left = 240

TabIndex = 14

Top = 7800

Width = 2055

End

7 Anhang

Anhang 15

Begin VB.CommandButton cmd_setback

Caption = "Hintergrund bestimmen"

Height = 375

Left = 240

TabIndex = 9

Top = 6840

Width = 2055

End

Begin VB.CommandButton cmd_cancel

Caption = "Zählen abbrechen"

Height = 375

Left = 240

TabIndex = 8

Top = 7320

Visible = 0 'False

Width = 2055

End

Begin VB.CommandButton cmd_load_file

Caption = "Datei öffnen"

Height = 375

Left = 240

TabIndex = 7

Top = 6360

Width = 2055

End

Begin MSComDlg.CommonDialog CMDialog1

Left = 0

Top = 6720

_ExtentX = 847

_ExtentY = 847

_Version = 393216

End

Begin VB.TextBox Text1

BeginProperty Font

Name = "Courier New"

Size = 9.75

Charset = 0

Weight = 400

Underline = 0 'False

Italic = 0 'False

Strikethrough = 0 'False

EndProperty

Height = 4095

Left = 120

MultiLine = -1 'True

TabIndex = 6

Top = 120

7 Anhang

Anhang 16

Begin VB.CommandButton cmd_down

BackColor = &H00C0C0C0&

Height = 615

Left = 960

Picture = "main.frx":0442

Style = 1 'Grafisch

TabIndex = 5

Top = 5640

Width = 615

End

Begin VB.CommandButton cmd_right


Height = 615

Left = 1560


Style = 1 'Grafisch

TabIndex = 4

Top = 5040

Width = 615

End

Begin VB.CommandButton cmd_left


Height = 615

Left = 360

Picture = "main.frx":0CC6

Style = 1 'Grafisch

TabIndex = 3

Top = 5040

Width = 615

End

Begin VB.CommandButton cmd_up


Height = 615

Left = 960


Style = 1 'Grafisch

TabIndex = 2

Top = 4440

Width = 615

End

End

7 Anhang

Anhang 17

Begin VB.PictureBox Picture1

FillColor = &H0080FF80&

Height = 6420

Left = 2880

ScaleHeight = 424


ScaleWidth = 389

TabIndex = 0

Top = 240

Width = 5895

Begin MSChart20Lib.MSChart MSChart1

Height = 2655

Left = 120

OleObjectBlob = "main.frx":154A

TabIndex = 13

Top = 3600

Visible = 0 'False

Width = 2535

End

Begin VB.Label lbl_back3

BackColor = &H00E0E0E0&

BorderStyle = 1 'Fest Einfach

Caption = "Back-Grey3 ="

Height = 255

Left = 720

TabIndex = 12

Top = 1680

Visible = 0 'False

Width = 1695

End





Height = 255

Left = 720

TabIndex = 11

Top = 1320

Visible = 0 'False

Width = 1695

End

7 Anhang

Anhang 18





Height = 255

Left = 720

TabIndex = 10

Top = 960

Visible = 0 'False

Width = 1695

End

Begin VB.Shape shape_back3

BorderColor = &H0000FF00&

Height = 255

Left = 360

Shape = 3 'Kreis

Top = 1680

Visible = 0 'False

Width = 255

End



Height = 255

Left = 360

Shape = 3 'Kreis

Top = 1320

Visible = 0 'False

Width = 255

End



Height = 255

Left = 360

Shape = 3 'Kreis

Top = 960

Visible = 0 'False

Width = 255

End

Begin VB.Shape Shape1

BorderColor = &H000000FF&

Height = 555

Left = 240

Top = 240

Visible = 0 'False

Width = 555

End

End

7 Anhang

Anhang 19

Attribute VB_Name = "main"

Attribute VB_GlobalNameSpace = False

Attribute VB_Creatable = False

Attribute VB_PredeclaredId = True

Attribute VB_Exposed = False

Option Explicit

Public startx As Long

Public starty As Long

Public endx As Long

Public endy As Long

Public mousedownflag As Boolean

Public setbackflag As Long

Public exitcount As Boolean

Public backgrey1 As Long



Public backgrey1_x As Long



Public backgrey1_y As Long



Public diagcalculated As Boolean

Private Sub chk_diag_Click()

MSChart1.Visible = False

diagcalculated = False

End Sub

Private Sub cmd_left_Click()

Picture1.Left = Picture1.Left + main.ScaleWidth / 4

If Picture1.Left > Picture2.Width Then

Picture1.Left = Picture2.Width

End If

Picture1.Refresh

End Sub

Private Sub cmd_right_Click()

Picture1.Left = Picture1.Left - main.ScaleWidth / 4

If Picture1.Left + Picture1.Width < main.ScaleWidth Then

Picture1.Left = main.ScaleWidth - Picture1.Width

End If

Picture1.Refresh

End Sub

Private Sub cmd_up_Click()

Picture1.Top = Picture1.Top + main.ScaleHeight / 4

If Picture1.Top > 0 Then

Picture1.Top = 0

7 Anhang

Anhang 20

Private Sub cmd_down_Click()

Picture1.Top = Picture1.Top - main.ScaleHeight / 4

If Picture1.Top + Picture1.Height < main.ScaleHeight Then

Picture1.Top = main.ScaleHeight - Picture1.Height

End If

Picture1.Refresh

End Sub

Private Sub cmd_cancel_Click()

exitcount = True

enable_btns

Shape1.Visible = False

End Sub

Private Sub cmd_load_file_Click()

Dim str_datei As String

On Error GoTo endfunction

CMDialog1.DialogTitle = "BioPic Datei öffnen"

'CMDialog1.InitDir = str_Verzeichnis

CMDialog1.Filter = " " + "*.bmp|*.bmp|*.jpg|*.jpg|*.gif|*.gif|*.wmf|*.wmf"

CMDialog1.CancelError = True

CMDialog1.Flags = &H1000& Or &H4&

CMDialog1.FilterIndex = 1

CMDialog1.ShowOpen

str_datei = CMDialog1.FileName

Picture1.Picture = LoadPicture(str_datei)

Me.Caption = "BioPic - " & str_datei

cmd_setback_Click

endfunction:

End Sub

Private Sub cmd_setback_Click()

Text1.Text = ""


hidebackparams

cmd_load_file.Enabled = False

setbackflag = 4

End Sub

7 Anhang

Anhang 21

Private Sub count_pic()

Dim x As Long

Dim y As Long

Dim col As Long

Dim red As Long

Dim green As Long

Dim blue As Long

Dim grey As Long

Dim tmpcol1 As Long

Dim tmpcol2 As Long

Dim tmpcol3 As Long

Dim tmpcolgrey As Long

Dim greycorr As Long

Dim greycorr_count As Long

Dim corrx As Long

Dim corry As Long

Dim pixelcounter As Long

Dim averageback As Long

Dim steigung_in_x_richtung As Single

Dim steigung_in_y_richtung As Single

Dim diagrammwerte() As Long

Dim diagcountx As Long

Dim diagcounty As Long

Dim i As Long

'speicher anlegen

ReDim diagrammwerte(Shape1.Width, Shape1.Height)

exitcount = False

disable_btns

red = 0

green = 0

blue = 0

grey = 0

greycorr_count = 0

pixelcounter = 0

hidebackparams

Picture1.DrawMode = 9

steigung_in_x_richtung = (backgrey2 - backgrey1) / (backgrey2_x - backgrey1_x)

steigung_in_y_richtung = (backgrey3 - backgrey1) / (backgrey3_y - backgrey1_y)

DoEvents

7 Anhang

Anhang 22

diagcounty = 0

For y = (Shape1.Top + 1) To (Shape1.Top) + (Shape1.Height - 2)

diagcountx = 0

For x = (Shape1.Left + 1) To (Shape1.Left) + (Shape1.Width - 2)

pixelcounter = pixelcounter + 1

If (exitcount = True) Then

Exit Sub

End If

col = Picture1.Point(x, y)

tmpcol1 = col And &H1FF0000

tmpcol1 = tmpcol1 / &H10000

blue = blue + tmpcol1

tmpcol2 = col And &H100FF00

tmpcol2 = tmpcol2 / &H100

green = green + tmpcol2

tmpcol3 = col And &H10000FF

'red1 = tmpcol / &H1

red = red + tmpcol3

tmpcolgrey = ((tmpcol1 + tmpcol2 + tmpcol3) / 3)

grey = grey + tmpcolgrey

'jetzt von grey den hintergrundwert für diesen punkt abziehen

'es werden die steigungen pro pixel für die x und y richtung benötigt

'(von shape_back1 aus nach x richtung und y richtung)

corrx = (x - backgrey1_x) * steigung_in_x_richtung

corry = (y - backgrey1_y) * steigung_in_y_richtung

averageback = averageback + (backgrey1 + corrx + corry)

greycorr = tmpcolgrey - (backgrey1 + corrx + corry)

greycorr_count = greycorr_count + greycorr

diagrammwerte(diagcountx, Shape1.Height - diagcounty - 3) = greycorr

diagcountx = diagcountx + 1

Next x

Picture1.Line ((Shape1.Left + 1), y)-(((Shape1.Left) + (Shape1.Width - 1)), y), RGB(200, 0, 0)

DoEvents

diagcounty = diagcounty + 1

Next y

7 Anhang

Anhang 23

If chk_diag.Value = 1 Then

MSChart1.ChartData = diagrammwerte()

MSChart1.RowCount = Shape1.Width - 2

MSChart1.ColumnCount = Shape1.Height - 2

diagcalculated = True

End If

For i = 1 To MSChart1.ColumnCount

MSChart1.Plot.SeriesCollection(i).DataPoints(-1).Brush.FillColor.Set 255, 0, 0

'MSChart1.Plot.Light.AmbientIntensity = 0

'MSChart1.Plot.Light.EdgeIntensity = 1

'MSChart1.Plot.Light.LightSources(1) = 0

Next i

averageback = averageback / pixelcounter

showbackparams

Text1.Text = "Left : " & (Shape1.Left + 1) & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "Right : " & (Shape1.Left) + (Shape1.Width - 2) & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "Top : " & (Shape1.Top + 1) & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "Bottom: " & (Shape1.Top) + (Shape1.Height - 2) & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "RED : " & red & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "GREEN: " & green & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "BLUE : " & blue & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "---------------" & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "GREY : " & grey & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "GREY-BACKGROUND:" & Chr$(13) & Chr$(10) & greycorr_count & Chr$(13) & Chr$(10)

Text1.Text = Text1.Text + "AVERAGEBACKGROUND:" & Chr$(13) & Chr$(10) & averageback

'freigeben

ReDim diagrammwerte(0)

enable_btns

End Sub

7 Anhang

Anhang 24

Private Sub cmd_chart_Click()

MSChart1.Top = 0

MSChart1.Left = 0

MSChart1.Width = Me.ScaleWidth - Picture2.Width

MSChart1.Height = Me.ScaleHeight

If MSChart1.Visible = True Then

MSChart1.Visible = False

Else

If chk_diag.Value = 1 Then

If diagcalculated = True Then

MSChart1.Visible = True

End If

End If

End If

End Sub

Private Sub Form_Load()

Picture1.Height = 1000

Picture1.Width = 1000

Picture1.Top = 0


Shape1.Left = 5

Shape1.Top = 5

Shape1.Width = 5

Shape1.Height = 5

backgrey1_x = 0

backgrey1_y = 0

backgrey2_x = 10

backgrey2_y = 0

backgrey3_x = 0

backgrey3_y = 10

diagcalculated = False

End Sub

Private Sub Form_Resize()


Picture1.Top = 0

Picture1.Refresh

End Sub

7 Anhang

Anhang 25

Private Sub Picture1_MouseDown(Button As Integer, Shift As Integer, x As Single, y As Single)

endx = 0

endy = 0

If setbackflag = 4 Then

backgrey1 = (getgreyval(x, y) + getgreyval(x + 1, y) + getgreyval(x - 1, y) + getgreyval(x, y + 1) + getgreyval(x, y - 1)) / 5

shape_back1.Visible = True

shape_back1.Left = x - (shape_back1.Width / 2)

shape_back1.Top = y - (shape_back1.Height / 2)

backgrey1_x = x

backgrey1_y = y

lbl_back1.Top = shape_back1.Top

lbl_back1.Left = shape_back1.Left + (shape_back1.Width * 1.2)

lbl_back1.Caption = "Back-Grey1 = " & backgrey1

lbl_back1.Visible = True

setbackflag = 3

Exit Sub

End If


If x < backgrey1_x + lbl_back1.Width + (shape_back1.Width * 1.2) Then

Exit Sub

End If

y = backgrey1_y



shape_back2.Left = x - (shape_back2.Width / 2)

shape_back2.Top = shape_back1.Top

backgrey2_x = x

backgrey2_y = y





setbackflag = 2

Exit Sub

End If

7 Anhang

Anhang 26


If y < backgrey1_y + lbl_back1.Height + 2 Then

Exit Sub

End If

x = backgrey1_x



shape_back3.Left = shape_back1.Left

shape_back3.Top = y - (shape_back3.Height / 2)

backgrey3_x = x

backgrey3_y = y





setbackflag = 1

enable_btns

Exit Sub

End If

Text1.Text = ""

mousedownflag = True

startx = x

starty = y

End Sub

Private Sub Picture1_MouseMove(Button As Integer, Shift As Integer, x As Single, y As Single)

If (x > startx) And (y > starty) And (mousedownflag = True) Then

'die nächsten vier if abfragen werden benötigt um sicherzustellen

'dass das selektierte feld innerhalb des bildes liegt

If x > ((Me.ScaleWidth - Picture1.Left) - 5) Then

x = (Me.ScaleWidth - Picture1.Left) - 5

End If

If x > Picture1.Width Then

x = Picture1.Width - 5

End If

If y > ((Me.ScaleHeight - Picture1.Top) - 5) Then

y = (Me.ScaleHeight - Picture1.Top) - 5

End If

If y > Picture1.Height Then

y = Picture1.Height - 5

End If

7 Anhang

Anhang 27

endx = x

endy = y

Shape1.Left = startx

Shape1.Top = starty

Shape1.Width = x - startx

Shape1.Height = y - starty

Shape1.Visible = True

Shape1.Refresh

End If

End Sub

Private Sub Picture1_MouseUp(Button As Integer, Shift As Integer, x As Single, y As Single)

If setbackflag > 0 Then


setbackflag = 0

End If

Exit Sub

End If

mousedownflag = False

If (endx > startx + 3) And (endy > starty + 3) Then

Shape1.Left = startx

Shape1.Top = starty

Shape1.Width = endx - startx

Shape1.Height = endy - starty

count_pic

Else

endx = startx + 3

endy = starty + 3


End If

End Sub

Private Sub disable_btns()

cmd_up.Enabled = False

cmd_down.Enabled = False

cmd_left.Enabled = False

cmd_right.Enabled = False

cmd_load_file.Enabled = False

cmd_setback.Enabled = False

cmd_cancel.Visible = True

End Sub

7 Anhang

Anhang 28

Private Sub enable_btns()

cmd_up.Enabled = True

cmd_down.Enabled = True

cmd_left.Enabled = True

cmd_right.Enabled = True

cmd_load_file.Enabled = True

cmd_setback.Enabled = True

cmd_cancel.Visible = False

End Sub

Private Function getgreyval(x As Single, y As Single) As Long

Dim col1 As Long

Dim red1 As Long

Dim green1 As Long

Dim blue1 As Long

Dim tmpcol As Long

col1 = Picture1.Point(x, y)

tmpcol = col1 And &H1FF0000

tmpcol = tmpcol / &H10000

blue1 = blue1 + tmpcol

tmpcol = col1 And &H100FF00

tmpcol = tmpcol / &H100

green1 = green1 + tmpcol

tmpcol = col1 And &H10000FF

'red1 = tmpcol / &H1

red1 = red1 + tmpcol

getgreyval = (red1 + green1 + blue1) / 3

End Function

Private Sub showbackparams()







Documents

Ver.ffentlichungs- version Anhang