Zeitsehrift fiir Krebsforschung, ]~d. 62, S. 140--162 (1957)

Aus dem Ins~itu~ de t~echerches sur le Cancer, Villejuif (Seine) (Direktor: Prof. OH. Ol3E~LrtCG)

Vergleiehende elektronenmikroskopisclae Untersuehung yon Ehrlieh- und u

Von W. WENSEL und W. BERNHARD

Mit 12 Textabbildungen

(Eingegrtngen am 17. Juni 1957)

Vcrschiedene elektronenmikroskopische Arbeiten haben sieh bereits mit der l~einstruktur "con Ascitestumoren befal3t. Den Ehrlich-Ascites- tumor haben besonders seit 1953 SELRY U. Mitarb. untersueht. Nach eiuer Studie fiber die M_itosen a5 und der elektronenmikroskopisehen Darstellung virus~hnlieher Gebilde im Cytoplasms 3" hat diese Ax'beits- gruppe eine erste zusammeniassende Darstellung der Ehrlieh-Aseites- tumorzelle gegeben aT.

Ober das Yoshida-Sarkom liegt unseres Wissens bisher keine der- artige Untersuehung vor.

Der Zweek der vorliegenden Arbeit ist, unter anderem ultrastruk- turelle Untersehiede dieser beiden Aseiteszell-Typen zu linden. Der Ehrlieh-Aseitestumor ist bekanntlieh el0ithelialen Ursprungs, wghrend der Yoshida-Tumor als I~undzellen-Sarkom bzw. l~etieulo-Endothetiom angesproehen wird (YosuIDA4~). Imvieweit kann man diese beiden Tumoren noeh submikrosk0piseh ihrer Herkunft n~eh eharakterisieren ? Entsprieht der liehtmikroskopiseh siehtbaren auffallenden Entdiffe- renzierung such ein submikroskopiseh erkennbarer vollstgndiger Verlust an Spezifitg~ ? Unterseheidet sieh ~erner die Ultrastruktur der Aseites- zellen yon den im soliden Verband waehsenden gleiehartigen Zellen ? Lassen sieh weiter die Aseiteszellen in das eharakteristisehe Elektronen- bild anderer Krebszellen einordnen ? Neben diesen allgemeinen Pro- blemen ist eine spezifisehe ~'ragestellung zu beantworten. Sie betrifft das mSgliehe Vorhandensein eines Virus im Ehrlich- mad Yoshida-Tumor.

Bekanntlieh wurde der Ehrlich-Tumor hie Ms Gesehwulst betraehtet, die yon Viren induziert werden kann. Die zahlreiehen Versuehe, ein hypothetisehes Agens zellfrei zu iibertragen, blieben erfolglos. Nun haben einerseits S~r~BY u. Mitarb.a6 schon 1954 zuf~llig in einigen Krebszellen Kolonien yon kleinen P~rgikeln elek- tronenmikroskopiseh dargestellt, welehe nach unseren heutigen Kenntnissen mor- phologiseh Ms Viren anzuspreehen sind. Diese Befnnde werden yon u u. Mig~rb. 4~ bests Aueh t~P~EI)L~E~D]~g U. 5Iit~rb. I1 f~nden vereinzelt virus- verd~ehtige Gebilde in einem anderen Stature des ]~hrlieh-Ascigestumors. Aller- dings untersehieden sieh diese Partikel deutlieh yon denen, die SELBu U. Mit~rb.

Untersuchung yon Ehrlich- und Yoshida-Ascitestumorzellen 141

beobachteten. Welter sind die biologischen Versuche yon GlCAFF113 U. Mitarb. yon Wichtigkeit, die unter anderem durch Injektion yon Ultrafiltraten des Ehrlich- Ascitestumors die Leukgmierate yon jungen AK-M~usen betri~chtlich erhShen konnten. GnAFFI kam zu dem Schlul~, da~ der Ehrlich-Tumor ein ultrafiltrierbares Agens enthMten miisse. Neuerdings ist es ~RIEND 12 gelungen, aus einem Ultra- filtrat einer hypertrophierten Milz yon einer Maus bei anderen Tieren eine filtrier- bare myeloische Leukgmie zu erzeugen. Die Splenomegalie des ersten Versuchs- tieres wurde nach Injektion eines zellfreien Filtrates des Ehrlichschen Adeno- carcinoms beobachtet. So h~ufen slch also in jiingster Zeit die Anzeichen fiir die Gegenwart yon Viren in diesen Tumoren. Es ist ebenfa]ls zu erwghnen, da~ auch das Yoshida-Sarkom schon Ms filtrierbarer Tumor betrachtet wurde is. Indessen fand diese Beobachtung bisher keine Best~tigung.

Es ist demnach eine weitere Aufg~be der vorl iegenden Untersuchung,

auf das Vorhandensein yon Viren in den beiden Asci testumoren zu achten und die eigenen Befunde mit den Ergebnissen der erwghnten

Autoren zu vergleichen.

~laterial und Methode

Zu unseren Versuchen benutzten wir insgesamt 32 weil~e Inzuchtm~tuse yore Stature I. C des Institut du Cancer und 22 Wistar-l~atten, auf die der Ehrlich- bzw. Yoshida-Ascitestumor durch intraperitoneale Injektion yon tumorha.ltiger Ascitesfliissigkeit iibertragen worden war. Der Ascites wurde am 4.--8. Tag nach der Transplantation durch Punktion gewonnen; fiir die elcktronenmikroskopischen Untersuchungen wurde das Punktat etwa 3 min bei 800 Umdrehungen je )/linute (etwa 100 g) zentrifugiert und das Zentrifugat anschlie~end in gepufferte l%ige Osmiums~ure (p~ 7,4) getropft, wobei kleine Kugeln yon etw~ 1 mm Durchmesser und relativ fester Konsistenz entstanden. N~ch einstiindiger Fixierung in 1 bis 2%iger, nach PALADE bei p~ 7,4 gepnfferter Osmiumsi~ure wurde in Alkohol ent- ws und in Butyl-Methacrylat nach der allgemein iiblichen Methode ein- gebettet. Die Schnitte wurden mit dem Ultra-Mikrotom ,,Porter-Blum" an- gefertigt und mit dem R.C.A.-Elektronenmikroskop EMU 2 untersucht. Die licht- mikroskopischen Vergleichsuntersuchungen wurden an Ausstrichen oder, bei den soliden Metastasen, an Paraffinschnitten durchgefiihrt.

Ergebnisse h n Gegensatz zu den in einem soliden Gewebe waehsenden Zellen

besitzen die im Ascites suspendier ten Tumorzel len eine runde bis ovMe Form, die aus dem Uberwiegen der Oberf l~chenspannung sowie der Elast izi t~t der Ze l lmembran gegenfiber deformierenden Einflfissen yon aui~en resultiert . D~ im Ascites alle induk t iven Einflfisse yon seiten der Naehbarzellen, Bluteapi l laren usw. fehlen, ordnen sich die Cyto- plasma~nteile oft in eigenartiger Weise an, die h~ufig an einen d re i - sehichtigen Aufbau erinnert . Dies gilt vor allen Dingen ffir junge Zellen, die meist e inen runden bis ovalen Kern besitzen, dem eine erste Zone, vorwiegend bestehend aus E lementen des Golgi-Apparates, anliegt. Dieser folgt welter nach aul~en eine zweite Region, in welcher m a n Mitochondrien und geringe Ergas top lasmas t ruk turen vorfindet. Zwischen dieser Region und der Ze l lmembran erstreekt sich eine dri t te Zone, die

Z. Krebsforsch. Bd. 62 10

142 W . WESSEL u n d W . B E ~ A ~ D :

Abb . 1. Ehr l ieh-Asei tes tumorze l le . Typ i sehe r ~ l b l i e k bei k le iner VergrS~erung . K e r n (K) m i t zwei d i ch t en Nucleolen (nu); C:~toplaslna m i t r e l a t iv sp~rHeh en twieke l t en Mitoehon- 6 r ien (m) ; Fe t te inschl f i ssen (F) ; k l e inem Go]g i -Appa ra t (G); sehr wenig fhd igem E r g a s t o - p]asme, (er). Der Pfei] (-~) zeigt au f eine sonde rba re S t r u k t u r , die b in u n d wieder in Krebsze l l en u n d no rma len , vo r a l lem embryon~ len , Ze]len gesehen werde~ ( , ,Membrunae

f e n e s t r a t a e " , s. Text) . Organel le~freie A_u2enzone der Zel lgwundsubstanz m i t vielen Zel lforts~tzen, den , ,Mierovil l i" . Vergr . 9800

im sllgemeinen yon Zellorg~nellen frei ist und aus scheinbsr strukturloser cytopl~sm~tischer Grundsubst~nz (Hy~lopl~sma) mit eingelagerten diffus verteilten t~ibonucleoproteid-Grsnul~ yon PALADE ~9 besteht (Abb. 1).

Untersuchung yon Ehrlich- und Yoshida-Ascitestumorzellen 143

In spgteren Stadien dellt sieh dann oft der Kern ein und der Golgi- Apparat konzentriert sieh in dieser Kernbucht. Bei alten Aseites- Tumorzellen finder man h~ufig mehrkernige Zellen, die wohl zum Teil dutch amitotisehe Kernteilungen entstehen, wobei man mitnnter eine Teilung der Nueleolensubstanz beobaehten kann. Bei diesen mehr- kernigen Zellen liegt der Golgi-Apparat stets zwisehen den Kernen und bleibt so in engem Kontakt mit beiden. Die alternden Zellen zeigen, wie sehon S~LBY 37 erw~hnte, stark ausgepr~gte degenerative Ersehei- nungen wie Fetteinschliisse, Cytoplasma-Vaeuolen und stark fort- gesehrittene Sehwellung oder gar Zerst6rung des Chondrioms.

W/~hrend das oben Gesagte allgemein sowohl ftir den Ehrlieh- als aueh fiir den Yoshida-Aseitestumor gilt, sollen nun im folgenden zu- ni%ehst die Feinstrukturen der Ehrlieh-Aseiteszellen, dann diejenigen der Yoshida-Zellen besehrieben und miteinander vergliehen werden.

1. Ehrlich-Ascitestumorzellen a) Der Ruhekern. Er ist im allgemeinen yon betriiehtlicher GrSl3e,

rundlich bei jiingeren, gelappt mit verschiedenen Einbuehtungen bei i l teren Zellen. Sind diese Einbuchtungen besonders rein, so erseheinen sie in Form eytoplasmatiseher Kans welehe den Kern durchziehen und verschiedentlich vesieul/ires Golgi-Material enthalten. Auf Quer- schnitten t/iuschen sie oft rundliehe Kerneinsehliisse vor (Abb. 2), die yon einer Doppelmembran begrenzt werden. Auffallend ist die Be- ziehung soleher Cytoplasma-Einstiilpunger~ zu den Nueleolen, deren granul/~re Substanz h~ufig an ihrer Wandung angereiehert ist. Dieses Ph/~nomen wurde schon liehtoptiseh ffir dasselbe Material yon I-IOMANN is besehrieben. Da man in den Kan/ilen ebenfalls derartige Granula findet, darf man wohl annehmen, dab an solchen Stellen ein Durehtrit t yon Kernmaterial dureh die Membran hindurch stattfindet (Abb. 2). Es seheint ein gewisser Zusammenhang zwischen der Kerngr6ge und dem Auftreten dieser tiefen Cytoplasma-Einstiilpungen zu bestehen, da sie bei kleinen Kernen selten auftreten. Die Oberfliichenvergr613erung, die ein Kern dutch Bildung soleher Kan/~le erf/ihrt, mug sehr betr/ichtlich sein und wird sich wohl aueh funktionell bemerkbar maehen. Im Gegensatz zu den liehtoptischen Beobaehtungen is, 2a, wonach sieh die Kan~tle yon Nucleolus oder den Chromosomen zu bilden seheinen, stellt das Elektronenmikroskop in jedem Fall eine Einstiilpung yon au[den her fest, was durch die Besehaffenheit der erw/ihnten Doppel- membran leicht festgestellt werden kann.

b) Nucleolen. Die Nucleolen sind hypertrophisch und werden, wie schon friiher bemerkt wurde '5, yon diehterem, vorwiegend diffus ver- teiltem, teils kSrnigem, teils fibrill~rem Material gebildet (Abb. 1). Nut sehr selten erkennt man Kernk6rperchen yon reticul/~rem oder f~digem

10"

144 W. W]~SS~L und W. BEI~Nt tARD :

Bau, wie sie ffir die meis ten normalen Zellen typ i sch sind. Das Chromatin h a t die Tendenz, sich in unregelm~Big ver te i l ten Haufen an die Kern- wandung anzulagern. Hierbe i hande l t es sich n icht e twa u m einen Fixierungseffekt , da eine solche Chromat inver te i lung in lebenden Zellen im Phasenkon t ra s t -Mikroskop ebenfalls s ich tbar ist.

Abb. 2. Ehrlich-Ascitestumorzelle. Ausschnitt aus eiuem Zellkern (K). Um den Nucleolus herum mehrere ruudliche ,,Einschlfisse" (~), die in Wirklichkeit quer getroffene Xan~le darstellen, welche sich durah Eiustiilpung der E:ernmembran yore CytoDl~Snm her bilden.

Km ]~ernmembr~n; G Golgi. Vergr. 34000

C) Die Chromosomen. Die Unte rsuchung der F e i n s t r u k t u r yon Chromosomen in Ul t r a -Di innschn i t t en is t bisher der schw~tchste P u n k t in der e lek t ronenmikroskopischen Ze]l~orschung geblieben. Einersei ts e r laubt die p rak t i sch zweidimensional ~rbei tende Methode nicht , die im R~um ver te i l ten Chromosomen in ihrer ganzen L~nge s ichtb~r zu machen, sondern m a n sieht nur Teflstficke. Andererse i t s is t es fraglich, ob mi t der j e tz t a l lgemein fiblichen Osmiumfixierung, die ja fiir das Cy top lasma ausgezeichnete Resu l t a t e liefert, auch eine gute Chromat in-

Untersuchung yon Ehrlich- und Yoshid~-Ascitestumorzellen 145

Abb. 3~ u . b . a Mitose eitler Ehrl ich-Asci tes tumorzel le . Typische aus diffus ver te i t t en k le inen Granula bes tehende Chromosomens t ruk tu r . Vergr . 8500. b Aussehn i t t yon 3a. Die h6here VergTSi3erung (66 000) l~Ll3t bei der bier a n g e w a n d t e n Technik keine organis ier te

I n n e n s t r u k t m ' tier Chromosomen e rkennen

fixierung erreicht wird. Die Ergebnisse sind bisher sehr entt~uschend. An Stelle einer hochorganisierten Struktur findet man Haufen von diffus verteiltem, kSrnigem M~terial (Abb. 3). Es lassen sich demn~ch,

146 W. WESSEL u n d W. BEI~NttAI~D :

wenigstens mit der hier angewandten Methode, keine Anzeichen einer Verinderung finden, die eventuell fiir einen eareinomat6sen Prozeg typiseh sein k6nnte.

d) Die Mitochondrien. Die Mitochondrien sind meist langgestreekt und differieren stark in ihrer Gr6ge. Degenerationserseheinungen wie Sehwellung, Unregelmagigkeit oder gar Fehlen der ,,Cristae" k6nnen oft beobaehtet werden (Abb. 1). t tervorznheben ist das seltene Auftreten yon Riesenmitoehondrien, welehe einen Dm'ehmesser yon fiber 4 # besitzen k/3nnen (Abb. 4). ttierbei zeigt der normale Kontrast des Mitoehondrienk6rpers und die gute Erhaltung der Innenstruktnr mit normalen ,,Cristae", daft es sieh nieht etwa um eine Schwellung handelt, sondern um ein fibermil~iges Waehstum. Solehe hypertrophisehen Mitoehondrien wnrden bisher in keinem normalen Gewebe beobaehtet. In einem einzelnen Falle eines Ovarialtumors der Maus traten ghnliehe Gebilde auf (eigene Beobaehtung, unver6ffentlieht). Die Anzahl der Mitoehondrien in den Ehrlieh-Aseitestumorzellen kann in weiten Grenzen variieren. Im allgemeinen ist sie jedoeh gegeniiber normalen Zellen ver- ringert.

e) Der Golgi-Apparat. Der Golgi-Apparat ist ebenfalls versehieden stark entwiekelt, erreieht aber meist eine geringe Ansdehnung. Seine Ultra-Strnktur kann in der Verteilung von Lamellen, Vaenolen und kleinen Bl~sehen normal sein. Hinfig fiberwiegt jedoch die mikro- vesicnlg~re Komponente.

f) Das Ergastoplasma. Das Ergastoplasma ist fiberall dentlieh ver- mindert oder fehlt vollstgndig, wenigstens, wenn n/an un~er diesem Begriff nur die fi~digen oder lamell~tren basophilen Strukturen verstehen will, deren Membranen mit den von PALADS~ 29 besehriebenen Ribo- nueleoproteid-K6rnehen besetzt sind. Diese K6rnehen k6nnen abet aueh ohne Membranen auftreten und erseheinen dann diffus verteilt oder in einzelnen Zonen angereiehert in der Grundsubstanz des Cyto- plasmas. Ihre Gegenwart erklgrt ohne Zweifel die verst~rkte Basophilie dieser Zellen (Abb. 5). Es handelt sich dabei, wie I-IowATso~ und HA~ TM

bemerkt haben, nm einen embryonMen dedifferenzierten Typus der eytoplasmatisehen Basophilie. Mit dem Ergastoplasma wahrseheinlieh in Znsammenhang stehend, morphologiseh jedoeh dentlieh versehieden yon diesem, erseheinen die yon PALAD~ 3~ als ,,Ciste~ae fenestratae" nnd yon SWlST 8s Ms ,,annulated membranes" bezeiehneten Lamellen- systeme, welehe in 3--5% aller Ehrlieh-Aseiteszellen gesehen wurden (Abb. 5). Es handelt sieh dabei um Biinde] yon geschliingelten, spiralig verlaufenden oder geraden tubuliren Strukturen, die als verdiehtete Zonen yon etwa 1---2 # Liinge und 1 # Breite irgendwo im Cytoplasma anftreten k6nnen. Diese sehlauehartigen Gebilde werden yon einer un- gefS~hr 50 A dieken Membran begrenzt, welehe zahlreiehe kleine, auf

Untersuchung yon Ehrlich- und Yoshida-Ascitestumorzellen 147

Abb. 4. Drei Riesenmitochondrien (M) in einer Ehrlieh-AsciteszeUe. Daneben gewShnliche Mitoehondrien ~on normaler Grb/3e (m); Kern (g). Vcrgr. 11700

Tangentialschnitten sichtbare ,,Poren" yon 30--50 m# aufweisen (Abb. ll). Die Zahl der Tubuli schwankt zwischen 3 und 20. Man kann

148 W . WESSEL u n d W . BERNtIAtCD:

Abb . 5. A u s s c h n i t t aus elmer Ehr l ich-Asc i tes tumorze l le . K e r n (K) u n 4 C y t o p l a s m a m i t wen igen kleinen, n o r m a l aus sehen4en Mi toehondr ien . W e n i g f~diges E r g a s t o p l a s m a (er), abe r viele diffus ver tef l te r i bonuc leopro te idha l t i ge K S r n c h e n y o n Pa lade . Gu t en twicke l t e

typ i sche , ,Membranae f e n e s t r a t a e " (Mr), Yergr . 31000

Untersuehung yon Ehrlieh- und Yoshida-Ascitestumorzellen 149

annehmen, dab aueh ihre Form in den verschiedensten Varianten auf- treten kann; sind die Tubuli beispielsweise stark abgeplattet, so mSgen sie als ,,Lamellen" erscheinen, haben sie hingegen eine runde Form, als ,,Zisternen". Z~-isehen diesen Lamellen finder man oft Palade- Granula. Das Aussehen soleher Strukturen erinnert stark an Bilder yon tangential gesehni~tenen Kernmembranen 2' 14. Sie wurden neben den sehon erwghnten Autoren aueh yon AFZELIUS in Seeigel-Eiern ge- sehen2. Sc}~uLzaa land solehe ,,membrane fenestratae" in einem Mam- maeareinom der Ratte and ist in einer Arbeit, die gleiehzeitig in unserem Laboratorium durehgefiihrt wurde, ngher auf diese Lamellensysteme eingegangen.

g) Cytoplasmaeinschliisse. An Cytoplasmaeinschltissen findet man hgufig in Kernn~he Fetttrop/en (Abb. 1), und zwar in alternden Zellen 5fter als in jungen. Ihre unregelmgBige Form im Elektronenbild is$ wahrscheinlieh der Tatsache zuzusehreiben, dal3 dureh die Osmium- fixierung nicht alle Lipoide gleieh gut fixiert werden und spgter dureh die Entwgsserung mit Alkohol noeh etwas Material herausge]Sst wird.

An weiteren Cytoplasmaeinsehl/issen sind vor allem virusartige Partikel zu nennen. Die beobachteten Formen kSnnen in zwei Kate- gorien eingeteilt werden. Einerseits wurden in einem Fall yon den 32 untersuehten Aseitestumoren Bilder gefunden, die denjenigen yon S~LBu u. Mitarb. a6 sehr ghnlieh sind. Hierbei handelt es sich um zahlreiehe ungeordnet zusammenliegende runde KSrperehen mit einem diehten ,,Kern" yon etwa 30--35 m/~ Durchmesser. Der ,,Kern" wird yon einer diinnen Membran konzentrisch umgeben. Der Gesamt- durehmesser betrggt ungef~hr 60 m#. In versehiedenen Zellen traten morphologisehe Varianten dieser Teilehen auf (Abb. 6a--e , 7a) und ihr , ,Kern" kann mehr oder weniger kontrastiert erseheinen. In einigen Fgllen sind die Teilehenhaufen yon einer Membran umgeben. Ist diese doppelt, wie in Abb. 6a, so darf angenommen werden, dab die virus- artigen Gebilde in einem transformierten Mitoehondrium liegen. Hierbei diirfte es sieh um friihe Entwicklungsstadien handeln. Tubulgre Ele- mente, wie sie beispielsweise yon SELBY U. Mitarb. zwischen den Par- tikeln gesehen wurden, konl~ten wir nieht beobaehten. Neben den bier besehriebenen virusghnliehen Teilchen sind noeh ~ndere, in unserem Untersuehtmgsmaterial relativ selten anftretende Gebilde zu erwghnen, die ihrer Feinstruktur naeh mit den yon FRI~DLAE~DE~ U. Mitarb. ~ gefundenen virusartigen Teilehen identiseh sind. Die genannten Autoren sahen im Cytoplasma yon Ehrlieh-Aseitestumorzellen etwa 60 m# groge, yon einer Doppelmembran umgebene, ,,kernlose" Gebilde, welehe jeweils in einem Cytoplasmablgsehen zu liegen seheinen, das als ,,endoplas- misehes Retieulum" (membranSser Tell des Ergastoplasmas) identi- fiziert wnrde. Hgufig sind die Partikel exzentriseh an einer Stelle der Innenseite des Blgsehens befestigt (Abb. 7 b). 3_hnliehe Befnnde werden

150 ~icV. WESSEL u n d W . B E R t R A n D :

Abb. 6 ~ - - c

Untersuchuug von Ehrlich- und goshida-Ascitestumorzellen ][51

von ADAMS und PaI~C~ t bei Ehrlieh-Aseitestumoren sowie von DALTOn" und FELIX 1~ beim Melanom S 91 berichtet. Aueh in unserem Falle t ra ten solehe K6rperehen auf, jedoeh nut sporadisch und in geringer Zahl. Eine systemat.isehe Untersuehung fiber den Prozentsatz der positiven F~il]e in bezug auf das gesamte Material wurde deshalb nieht ausgeffihrt.

W~hrend im vorhergehenden die Feinstruktur der im Aseites frei sehwimmenden Tumorze]le abgehandelt worden ist, sei erggnzend noch

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# Abb. 7a--b'. Schematisehe Darstellung yon virusartigen Partikeln, die bisher in Ehrlich- Aseitestumor-St~mmen g'efunden wurden, a Teilchenstruktur wie sie yon SELBY II. Mitarb., YASUZt~I n. Mitarb. sowie in unserem Ehrlieh-Stamm beobachtet wurde. b Teilchem y o n r i n g f 6 r m i g e r S t ruk tm" in den Ze l l en der A s c i t e s t u m o r - S t ~ i m m e y o n FRIED- LAENDER ll]Id PRIh~CE 11. Mitarb. b' Das gleiche Teilchen wie 7b in seiner oft beobachteteu

t t u f e i s e n f o r m m i t n m g e b e n d e r c y t o p l a s m a t i s c h e r ~ I e m b r a n

auf Unterschiede zu den auf dem Peritonaeum haftenden, in soliden Implantationsmetastasen wachsenden Zellen hingewiesen. Diese zeichnen sieh im Mlgemeinen dureh ein h6her entwickeltes Ergastoplasma und eine grSBere Zahl yon Mitochondrien aus. Diese hShere Differenzierung weist darauf hin, dab es sieh wahrseheinlich bei dem augergew5hnlich spgrliehen Vorhandensein yon Ergastoplasma und verminderter Mito- chondrienzahl bei den Ascitestumorzellen nicht allein um eine echte Zelleigensehaft handelt, sondern zum Tell um einen milieubedingten Effekt, denn zweifellos leben die auf dem Peri~onaeum waehsenden Zellen, die yon einsprossenden Blutcapillaren mit Sauerstoff und Nghr- stoffen versorgt werden, unter wesentlieh gfinstigeren Bedingungen als die im Aseites suspendierten Zellen. Das Verhalten der Asciteszellen erinnert an die Verminderung yon Ergastoplasma und Mitochondrien in l~attenleberzellen im ttungerzustand, wie es bereits beschrieben wurde ~. Es ist durehaus mSglich, alas die Differenz zwischen den ira

Abb. 6a c. Virus~ihnliche Partikel im Cytoplasma yon drei Ehrlich-Asciteszellen. a Ein- schliisse eventuell mitochondrialen Ursprungs mit beginnender Entwicklung solcher Ge- bilde. Vergr. 48000. b Vollstfindig entwickelte PartikeL Vergr. 46500. c Sehr zahlreiche

solcher Elemente in Fo~iKn eines dichten Haufens. Vergr. 51000

152 W. WESSEL und W. BERNHARD:

soliden Verband und den im Ascites lebenden Zellen ihre Ursache teil- weise in der untersehiedliehen Ern~Lhrung hat. Eine weitere Erklgrungs- mSglichkeit fiir diese morphologischen Unterschiede ist durch die Stammzelltheorie yon MAKINO 27 gegeben. Danaeh w~re es denkbar, dal~ nur bestimmte Zellmutanten innerhalb des Ascitestumors zu Metastasenbildung und solidem Waehstum geeignet sind. Wenn diese zu solidem Wachstum neigenden Zellmutanten an sieh sehon ein besser entwiekeltes Cytoplasma besitzen, so miiI~ten aueh deren Tochterzellen, die in den soliden Metastasen wachsen, hSher differenziert sein. Es wiirde sieh also in diesem Falle um einen Auslesevorgang handeln und die Differenz zwisehen den Aseites- und den im Verband wachsenden Zellen kSnnte nieht auf milieubedingte, sondern anf genetische Faktoren beruhen (KL]~I~ und KLEI~I 2~ SOH~MMELF~DElZ34). Welche dieser beiden M5glichkeiten zutrifft, lgl3t sich aus unseren Befunden nieht entscheiden.

2. Die Yoshida-Ascitestumorzellen im Vergleich zum Ehrlichschen Ascitescarcinom

Die Zellen sind im Durchschnitt kleiner und meistens, im Gegensatz zu den Ehrlich-Zellen, yon einer glatten Zellmembran begrenzt. Man finder zwar auch hier vereinzelt Cytoplasmaforts~tze (,,Microvilli"), aber sie sind wesentlich seltener als bei den Zellen des Ehrlieh-Ascites- tumors (Abb. 8). Die einzelnen Zellbestandteile verhalten sich wie folgt:

a) Der Kern ist relativ klein. Seine Oberfl~che ist wenig eingebuchtet. Tiefe cytoplasmatische Kaniile, die wie beim Ehrlich-Tumor den Kern durchziehen, wurden hier nicht beobachtet. Auf Tangentialschnitten weist die Kernmembran zahlreiche kleine Poren auf, wie sie bei allen normalen und malignen Zellen gefunden werden 14. Ffir die Mitosen und die Chromosomenstruktur gilt dasselbe wie bei den Ehrlich-Zellen.

b) Die Nucleolen zeigen im Vergleich zu denen der Ehrlich-Aseites- tumorzellen deutliche Unterschiede. Sie sind im allgemeinen reticular aufgebaut und bestehen nicht aus einer regellos aufgehi~uften, diffus- granul~ren Substanz. Somit entsprechen sie in diesem Punkte mehr den Nucleolenstrukturen normaler Zellen 5. Sie sind allerdings vielfach hypertrophisch. Die Differenz in dem Nucleolenaufbau stellt wohl den deutlichsten Unterschied beim Vergleich beider Tumoren dar.

e) Die Mitochondrien sind rund oder oval, nie langgestreckt, und auffallend klein. So sieht man oft kleinste, sehr dichte Partikel, die wohl als Ultramitochondrien ~s oder ,Microbodies" 3 anzusprechen und als Ausdruck eines regenerierenden Prozesses zu betrachten sind (Abb. 9). Andererseits sind aueh degenerative Erscheinungen im Chondriom hi~ufig. Viele Mitochondrien sind geschwollen, andere weisen in ihrem Inneren nnregelm~Bige Verdichtungen nnbekannter Natur auf (Abb. 10 a).

Untersuchung yon Ehrhch- und Yoshida-Ascitestumorzellen 153

Mitunter finder man sogar Zellen, in derem auf dem Schnitt sichtbaren Anteil keine Mitochondrien vorhanden sind (Abb. 10b).

Abb. 8. u Ubers ichtsaufn~hme. Zellen mi t gu t ~bgegrenzten Nuc- leolen, kleinen rundlichen, z. T. geschwollenen Mitochondrien; fast ohne jede En twick lung yon Erg~s top l~smamembranen . Geringe oder keine Ausbi ldung yon Protoplasm~for ts~tzen.

Vergr. 4500

d) DaB Ergastoplasma ist, wie bei den Ehrlich-Zellen, selten in Form yon c~nalicul~ren oder lame]l~ren Strukturen zu sehen. Die --- im

I5Z~ V~, WESSEL und W. BERNHARD:

Vergleich mit dem Ehrlich-Tumor geringere --Basophil ie des Cytoplasmas ist wohl auch hier grogentefls an die diffus im ttyaloplasma verteilten

A b b . 9. YosMda-Ascitestumorzelle . Sta.rk gela.ppter K e r n mit t iefer Einbuchtung' , in welcher sich die Golgi-Zone und z~hlreiche ~,Microbodies" befin~en. I~leine gesehwoliene 2r mi t unregelm~13igen , ,Cristae". Die Pfeile (-+) kennzeiehnen eln Blind.el e igenart iger fibrillhrer, parallel ver laufender Elemente yon etw~ 30 .~ Dicke. Sehr geringe

Entwickhm=~ von Ergas top l~smamembr~nen . Yergr. 8000

Paladegranula gebunden (Abb. lOb). Ebenso wie die Zellen des Ehrlich- Carcinoms bitden auch die Yoshida-Zellen ,,Cisternae" oder ,,Membranae fenestra~ae", allerdings seltener und weniger ausdifferenzier~ (Abb. 11 b, c).

Abb. 10g u. b. Yoshida-Ascitestumorzelle. a Ausschni t t aus chler Tumorzel le mi t K e r n (K), Golgi-Bl~schen (G) nnd eiaige~ z. T. degener ierenden Mitochondrierr (m). K e i a f&diges Ergas top lasma, abe t viele diffus ver te i l te PaladekSrnchen. Vergr. 25500. b Beispiel einer e x t r e m for tgeschr i t t enea Entdi f ferenzierung des Cytop lasma einer anderen Yoshida-Tumor- zelle, t tyMopl~sma (by) mit diffus ver te i l ten Pa ladekSrnchen und einigei1 blasig aufgetrie- bene~ Ergas toplasmasackchen . Keine anderen ZelIorganenen m e h r s ichtbar . Vergr. 25500

156 W. WESS~L u n d W. BEt{:NIIARD:

Abb. 11a - - c . Fe ins t ruk tu r tier , , ) I embranae fenes t ra t~e" . ~ Bfindel parallel geordneter Eleme~lte in einer Ehrlich~Tumo~'zelle. Transvers~lschnit t . DoppeLmembr~nen mi t regeL m~l~igen In te rva l len , ii~ welchen beide iVIembranen wie zus~mmengekleb t erscheinen. Vergr. 47500. b Yoshida-Tumorzel le . Kurzes Bfindel solcher Membr~ne~ tangent ia l ge- schnit ten. Vergr. 5~ 000. c Yoshid~-Tnmorzelle. Biindel yon gefenster ten Membrahen in der Ebene tier r ingf6nnjgen St rukturen oder Poren geschnit ten. G]eiches Aussehen wie

K e r n m e m b r a n im TanR)entialschni?~t. Vergr. 71000

Untersuchung von Ehrlich- und Yoshida-Asci~estumorzellen 157

e) Die Golgi-Zone ist nicht sehr entwickel~. Sie engspricht mehr dem vaeuoliiren Golgi-Typ und besitzt wenig Doppehnembranen oder mikro- vesieuliire Elemente.

Erw~hnt sei ferner das Aaftreten yon Bfindeln feiner, sehleierartiger Strukturen, die aus zahlreichen, etwa 30--40 A dicken Fibrillen be- stehen (Abb. 9). Sie liegen oft in der Nachbarschaft des Golgi-Apparates und werden yon BEssis und BRETON-GOIgIUS 9 sowie I~OUILLER II.

Mitarb. ~2 in Leuk/imie- und Tumorzellen niiher besehrieben. Die Be-

deutung soleher Zonen ist noeh unbekannt.

f) An Zelleinschliisse~ sind einerseits vereinze]~e Fetttrop]en zu nennen, znm anderen vor allem phagoeytierte Erythrocyten, die sich in den verschiedensten Abbaustadien befinden. Die Eigenschaft d e r Phagocytose is~ beim Yoshida-Tumor sehr viel starker ausgeprEgt als bei den Ehrlich-Asciteszellen.

Z u m Vergleich w u r d e n in v i t ro zu 3 cm 3 ze l lha l t igem Asci tes y o n je 5 T u m o r e n 3 Tropfen einer w/~Brigen LSsung chinesischer Tusche gegeben and die Zahl der Zellen, die Tuschepartikel phagocytiert haben, sowie die je Zelle aufgenommenen Teilchea alIe 10 rain bestimmt. Es zeigte sich hierbei, dal3 die u die Tuscheteilchen rascher und in gr6Berer Menge aufn~rhmen.

g) Was endlieh die Gegenwart virus~hnlicher Teilehen anbetrifft, so wurden bisher trotz intensiven Suehens weder im Kern noch im Cyto- plasma der Yoshida-Zellen Elemente gefunden, die als virusverd~eh~ige Strukturen zu interpretieren w~iren.

Diskussion :Die ultrastrukturelle Analyse der beiden Ascitestumoren er]aubt zu-

n/ichst den Vergleich mit den lichtoptisch erworbenen Erkenn~nissen. Es f~llt dabei sofort auf, daft sich aus teehnisehen Griinden das Studium dieser Zellen im Elektronenmikroskop fast ausschlieBlich auf das Cyto- plasma beschr/inkt, w/~hrend die verschiedenen lichtoptischen Studien, die nnter anderem besonders von LEVAN 23, 2a, HAUSC~[KA~7 nnd BAY- ~UT~ 3 ffir den Ehrlieh- und yon MA~I~o ~5, 2~, ~7 ffir den Yoshida- Ascitestumor durchgef/ihrt wurden, ausschliel31ieh den I(ern und die Chromosomen betreffen. Als Ansnahme seien hier nur die Arbeiten yon L~WT~ u. Mitarb. erwghnt ~2 In diesem Punkte ist das Elek- tronenmikroskop der klassisehen eytologischen Methode zweifellos unterlegen. W/~hrend die Probleme der Kerrrforschung dreidimensionaler Natur sind, bewegt sich die Ultra.-Feinschnib~-Cytologie in zwei Dimen- sionen. Augerdem ist es nngewil3, ob die angewandte Fixierungzur Darstellung der Kernstrukturen ebenso gut ist wie zur Dars~eltung des Cytoplasmas.

Die hier erhobenen Befunde fiir den Ehrlich-Tumor stimmen im wesenglichen mit denen yon S]~L]3y u. Mitarb. 37 fiberein. Es ist allerdings

Z. Krebsforsch. tM. 62 11

158 W. WESSEL und W. BE~NHAm) :

nnbekann~, ob der yon uns verwandte wahrseheinlieh hypodiploide Aseitestumor-Stamm mit dem yon S~LBY untersuehten genetiseh identiseh oder i~hnlich ist. Es w~re sieherlieh sehr interessant, die Feinstruk~ur des Cytoplasmas versehiedener Tumoren e]ektronenmikro- skopiseh zu vergleichen, die in ihrem Chromosomenbestand stark von- einander abweichen.

Die geringe Entwieklung des Ergastoplasmas ist an den beiden yon uns untersuchten Aseitestumoren wohl am auffallendsten. Dies wird besonders deutlich, wenn man die mit einem hoehorganisierten lamel- l~ren Ergastoplasma ausgesta~teten urspriingliehen ~utterzellen des Ehrlich-Aseitestumors, die Driisenzellen der 3~amma, zum Vergleieh heranzieht G.

Die Mitochondrien weisen meist nm" zaMenm~Bige Unterschiede bei einer Gegenfiberstellung der Zellen auf. Ge]egentlieh finde~ man jedoeh aueh Differenzen in der Form. Das Vorhandensein yon l~iesen- mitochondrien wurde unserer Kenntnis naeh bisher nieht beobachtet. Sie seheinen zwar sehr selten zu sein, deuten aber darauf hin, dab die sehr viel haufigeren degenerativen Veranderungen des Chondrioms nicht Mle sekund~rer Natur sind, wie S~L~Y 37, und DALTO,X und F~LIX 1~ annehmen. Zwar mug die Frage immer wieder erwogen werden, ob veto eigentlichen KrebsprozeB unabh~ngige Faktoren wie sehnelle Alterung der malignen Zellen, Ern~hrung, Nekrobiose und die damit verbundene J~nderung des pH-Wertes, usw. an tier Mitochondriensehwellung' nieht Mlein sehuld sind. Dieses Problem ist sehwierig zu entseheiden. Wir mSchten aber glauben, dab auch ein endogener Mitoehondriensehaden in der Krebszelle auftritt. Die Beobachtungen yon schlecht erhMtenen Mitoehondrien in den versehiedenen Tumoren h~ufen sich s, 29, obsehon man zugeben mug, dag auch 6fters vbllig intakte Elemente in mMignen Geschwfilsten gesehen werden. Dies alles gilt in gleieher Weise auch ffir den Yoshida-Tumor, in welehem Mlerdings niemMs l~iesenmito- ehondrien gefunden wurden.

Beide Aseitestumoren sind sieh in ihrer Feinstruktur sehr i/hnlich, so dag es, wenigstens in unserem Falle, umnSglich ist, mit Sieherheit hoehgradig entdifferenzierte Aseitestumorzellen zu unterseheiden, die ihrem Ursprung naeh einerseits epithelial, andererseits mesenehymM sind (Abb. 12). Ffir die epitheliMe Herkunft sprechen im FMle des Ehrlieh-Tumors die reichlicher vorhandenen ,,Mierovilli" der Zell- oberflgehe, die fiir normMe Epithelzellen typiseh sind und sieh in groBer Zahl auch bei soliden Mammatumoren der Maus a und der I~atte aa finden. Fiir die mesenehymMe Abkunft der Yoshida-Zellen spreehen vielMeht die feinen, intraeytoplasmatisehen Fibrillenbiindel, welehe bis- her nur in Sarkomen a2, Leuk~mie-Zellen 9 und normalem Endothe115 beobaehtet wurden.

Untersuchung yon Ehrlich- und Yoshid~.Ascitestumorzellen 159

Zusammenfassend kann gesagt werden, daft es bei beiden Aseites- zellarten nieht m6glieh war, im Elektronenmikroskop ein typisches, an der Einzelzelle stets wiederkehrendes Merkmal herauszustellen, welches uns erlaubt, die vorliegenden Zellen eindeutig als Krebszellen zu er- kennen. Eine ausgesproehene Tendenz zum Verlust organisierter Struk- turen und damit zur Entdifferenzierung ist zwei%llos vorhanden. Abet

Abb. 12. Schematische Darstellun~ tier Feinsgrukturen einer Ehrllch- (links) und einer Yoshida-Aseitestumorzelle (rechts). Nuleleolus (ntO, Golg[ (G), MiboehondMen (m), Ergasto-

plasma (er), Fett (F), Membranae fenestratae (m]), phag'ozytier~er Erythroeyt (/~),

wie in der Lichtmikroskopie, so stellt auch in der Elektronenmikroskopie dis Diagnose I~'ebszelle oder Normalzelle ein statist.isehes Urteil dar, welches man dutch Betraehttmg einer gT6Seren Zahl von Zellen sowie dutch ihre Anordnung zueinander erhglt.

Zur Gegenwart yon Viren oder virus~hnlichen Gebilden im Ehrlich- Aseitestumor ist zu sagen, dab unsere ]3eobachtungen die in anderen Instituten durehgeffihrten Untersuehungen best~tigen und erg~nzen. Es kSnnen jedoeh naeh wie vor keine SeMtisse fiber die Bedeutung dieser X6rperehen in den Krebszellen gezogen werden. Die aufterordentliehe Seltenheit von Partikeln yore Selbysehen Typus sprgehe nicht gegen die Annahme, dab es sieh hier um ein eancerogenes Agens handeln kSnnte.

11"

160 W. WESSEL und W. ]3EI~NIIAI~D :

In typischen, durch Viren hervorgerufenen Tumoren wie beispielsweise dem Rous-Sarkom sind die Viren morphologisch auch oft nieht nach- zuweisen 7. Es kann sich aber ebenso gut um ein nicht spezifisches, nicht pathogenes Virus handeln, dal3 sich zuf~llig in den Aseitestumor- zellen aufh~lt.

Die y o n I~RIEDLAE1NDEI~ 11 beschriebenen KSrperchen scheinen nicht bloI3 an das Ehrlich-Careinom gebunden zu sein. Sie wurden, wie erw~hnt, yon DALTO~ und FELIX n in einem Melanom der Maus ge- funden. Ihre Bedeutung ist demnaeh vSllig unklar, es soil aber auf eine gewisse Xhnlichkeit hingewiesen werden, die sie hinsichtlich ihrer GrSl3e und Struktur mit der intracellul~ren Form des Milchfaktors yon BITTS~I~ 6 aufweisen. Weitere Studien fiber die wahre Natur solcher Gebilde werden yon grol3em Interesse sein.

Summary A description and comparison of the fine structure as revealed by

the electron microscope, is given of the Ehrlieh and Yoshida ascites tumor cells of 32 mice and 22 rats respectively.

Ehrlich aseites tumor cells have multi-lobed nuclei, frequently crossed by several cytoplasmic channels, and large, very diffuse nucleoli. The Golgi complex, developed to a varyng extent is mostly micro~vesicular. Mitochondria are relatively scarce, some elongated, and some swollen and in a condition of degeneration. Ergastoplasmic membranes arc nearly entirely lacking. Palade granules, on the other hand, are numerous and diffusely distributed throughout the cytoplasm. The cell surface is characterized by many protrusions (microvilli).

Viruslike particles, similar to those described by Selby were found in one case, in the form of rather smaller groups in the cytoplasm. Their significance, and that of other formations suspected to be of viral origin is discussed.

The Yoshida tumor is characterized by a smaller nucleus with smoother surface, and with well defined nucleoli of reticular structure;

relatively small Golgi complex, frequently of a vacuolar type, small, often swollen mitochondria with irregularly arranged ,,cristae", few ergastoplasmic structures and diffusely distributed Palade granules, and

smooth cell surface with few, if any, protoplasmic protrusions. Phago- cytized erythrocytes or other inclusions are frequently found in the cytoplasm. There are no morphological indications to imply presence of virus in these cells.

Both tumors show rather poorly preserved mitochondria, and some loss of organized structure in the cytoplasm, a tendency which illustrates the far reaching dedifferentiation of cellular ultrastructure. Definite discrimination between aseites carcinoma and ascites sarcoma cells by means of the :electron microscope is not possible.

Untersuehung yon Ehrlieh- und Yoshida-Ascitestumorzellen 161

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Dr. W. WESSEL, Pathologisches Ins t i tu t der Univers i ta t Bonn a. Rhein, Venusberg

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