Original papers

Vergleichende Untersuchungen fiber partielle Aminosiiuresequenzen von Prolaminen und Glutelinen verschiedener Getreidearten

VII. Aminosiiuresequenzen von Prolaminpeptiden*

Herbert Wieser, Werner Seilmeier und Hans-Dieter Belitz Deutsche Forschungsanstalt fiir Lebensmittelchemie, Institut fiir Lebensmittelchemie der Technischen Universit~it Miinchen und Kurt-Hess-Institut fiir Mehl- und EiweiBforschung LichtenbergstraBe 4, D-8046 Garching, Bundesrepublik Deutschland

Comparative investigations of partial amino acid sequences of prolamines and glutelins from cereals VII. Amino acid sequences of prolamine peptides

Summary. The peptide fractions isolated from chymo- tryptic hydrolysates of wheat, rye and barley prol- amines [this journal (1984) 178:173] were separated into pure peptides by high-performance liquid chro- matography on octadecyl silica gel. The peptides which were most abundant were analyzed for amino acid composition and in part for amino acid sequence. Besides peptides which are typical for only one of the cereals investigated, peptides of similar composition were found in all three prolamines. These contain re- peating sequences and are built up of mainly Gin (Q), Pro (P) and hydrophobic amino acids (X) such as Phe, Tyr, Ile, Val and Leu. One of the most frequent partial sequences is QQPQQPXP.

Zusammenfassung. Die aus chymotryptischen Partial- hydrolysaten der Prolamine von Weizen, Roggen und Gerste gewonnenen Peptidfraktionen [6. Mitteilung; diese Zeitschrift (1984) 178:173] wurden durch Hoch- druckfliissigchromatographie an Octadecylkieselgel zu einheitlichen Peptiden aufgetrennt. Die mengenm~i- Big dominierenden Peptide wurden auf Aminosfiure- zusammensetzung und teilweise auf Aminosfiurese- quenz untersucht.

Neben Peptiden, die nur ffir eine der untersuchten Getreidearten typisch sind, wurden Peptide mit sich wiederholenden Sequenzabschnitten gefunden, die bei allen drei Prolaminen ~ihnlich aufgebaut sind und iiberwiegend aus GIn(Q), Pro(P) und hydrophoben

* Gef6rdert vonder AIF fiber den Forschungskreis der Ern~ihrungs- industrie e. V. Frau Redler und Frau Schiitzler danken wir fiir ausgezeichnete tech- nische Assistenz

Offprint requests to: H. Wieser

Z Lebensm Unters Forsch (1987) 184:366-373 © Springer-Verlag 1987

Aminosfiuren (X) wie Phe, Tyr, Ile, Val und Leu beste- hen. Eine der hfiufigsten Partialsequenzen ist QQPQQPXP.

Einleitung

In friJheren Arbeiten wurden Prolamine und Gluteline von Weizen, Roggen, Gerste und Mais mit e-Chymo- trypsin hydrolysiert. Die resultierenden Peptidgemi- sche wurden stufenweise durch Gelchromatographie, Kationenaustauschchromatographie und Anionen- austauschchromatographie aufgetrennt [1-4]. Die Untersuchung der erhaltenen Peptidfraktionen ergab bei den Prolaminen von Weizen, Roggen und Gerste eine ~ihnliche Verteilung der Aminos~iuren. Typische Peptidfraktionen aus allen Prolaminen enthalten viel Glx (>44mol-%), Pro (>28mo1-%) und Phe (> 7 mol-%). Maisprolamin weicht von den fibrigen Prolaminen deutlich ab; ffir die Peptidfraktionen sind Werte von Glx>20, Leu>20, Ala>12 und Pro > 10 mol-% charakteristisch. Die weitere Auftren- nung typischer, in der Ausbeute dominierender und damit besonders repr/isentativer Peptidfraktionen er- folgte durch Hochdruckflfissigchromatographie (HPLC) an Octadecylkieselgel (ODS). Die erhaltenen reinen Peptide wurden auf ihre Aminosfiurezusam- mensetzung, zum Tell auch auf ihre Aminosgurese- quenz analysiert. Uber einige Ergebnisse wurde be- reits kurz berichtet [5].

Material und Methoden Peptidfraktionen

Folgende durch Gelchromatographie, Kationenaustausch- und Anionenaustauschchromatographie erhaltenen Peptidfraktionen aus den chymotryptischen Hydrolysaten der Prolamine von Weizen, Roggen und Gerste [4] wurden zur weiteren Auftrennung einge- setzt:

PWI: 100, 200, 202, 212, 222, 23a4a, 304a, 305, 306a, 33b4, 34a4, 34a5, 34b4, 34b5;

PR: 100b, 102a, 102b, 200a, 200b, 204, 210a, 210b, 213,214, 220, 322a, 323;

PG: 100b, 102a, 110, 114, 203, 210, 212a, 222d, 23a2b, 34b4, 394.

Hochdruckfliissigchromatographie (nach [10, 11])

Vorsiiule: ODS-VYDAC 201 (30-44 p~m, Machery und Nagel); 4.6 × 30 mm - Trennsfiule: ODS-Hypersil (5 p.m, Shandon); 4.6 × 240 mm - Temperatur: 60 °C - Aufgabe: 1 mg Peptidfraktion, gel6st in 250 p.l H20 - Elutionssystem:

A: Triethylammoniumformiat (0.01 moll1, pH 6.0)/Acetonitril (95+5, v+v);

B: Wie A (60+40, v+v) - Gradient: linearer Anstieg von 0.3- 0.5% Acetonitril/min - Durchflul3:2.5 ml/min - Detektion: Absorp- tion bei 220 nm im DurchfluBphotometer.

Aminosdureanalyse

Nach [6] durchfiihren und die Werte ffir Ser, Thr, Val und Ile nach [7] mit den Faktoren 1.09, 1.05, 1.08 bzw. 1.07 korrigieren.

Bestirnmung der Aminosduresequenz

Manuellen EDMAN-Abbau und Analyse der PTH-Aminosfiuren nach [8] durchfiihren. Peptide mit N-terminaler Pyroglutamins~iure nach [9] mit 100 ~tl NaOH (1 moll1) 15 h bei 4 °C umsetzen, mit 100 Lal HC1 (1 mol/l) und 100 ~tl Natriumacetat-Puffer (0.4 moll1, pH 5,5) neutralisieren. Salze durch HPLC an ODS abtrennen (Eluti- onsfolge: 12,5 ml H20, 12,5 ml 2-Propanol/H20 (2+ 3, v/v) abtren- nen, Propanoleluat durch N2-Strom trocknen und zum Edman- Abbau einsetzen.

Ergebnisse und Diskussion

Hochdruckfliissigchromatographie

Die weitere Auftrennung der durch Anionenaus- tauschchromatographie [4] erhaltenen, in der Ausbeu- te dominierenden Peptidfraktionen aus den Prolami- nen von Weizen (PW), Roggen (PR) und Gerste (PG) erfolgte durch Hochdruckfliissigchromatographie an C18-Kieselgel. Ein von Rivier [10, 11] beschriebenes Elutionssystem (Triethylammoniumformiat/Acetoni- tril) erwies sich ffir die Fraktionierung als besonders geeignet. Als Beispiel einer Trennung ist in Abb. 1 das Chromatogramm der Fraktion PW 200 wiedergege- ben. Die iibrigen Trennungen sind in Form von Strichchromatogrammen dargestellt (Abb. 2). Sie zei- gen, dab die durch Anionenaustauschchromatogra- phie gewonnenen Peptidfraktionen durchweg aus mehreren Hauptkomponenten bestehen, die mit 5- 30% Acetonitril eluiert werden. Im allgemeinen nimmt die Hydrophobit~t mit steigendem Molekular- gewicht zu.

Fraktionsbezeichnungen: P Prolamin; WWeizen, R Roggen, G Ger- ste; die Ziffern 1-3 bezeichnen jeweils die Fraktion aus der Gel-, Ka- tionen- bzw. Anionenaustauschehromatographie. In einigen Fiillen wurden die Fraktionen in a und b unterteilt

A220

0.96

0.64-

0.32-

2~0 2's °/oCH3CN

Abb. 1. Chromatographie der Peptidfraktion PW 200 an Octadecyl- kieselgel

Aminosgiurezusammensetzung

Die durch Hochdruckflfissigchromatographie erhalte- nen Peptide wurden auf Aminosfiurezusammenset- zung analysiert. Zur Berechnung von Bruttoformeln wurden alle Aminosfiurewerte <2.0 mol-% (bei den hochmolekularen Peptiden) bzw. <4.0 mol-% (bei den iibrigen Peptiden) vernachl~issigt. Ein Teil der Er- gebnisse, und zwar ffir die in der Ausbeute dominie- renden und sequenzierten Peptide, ist in den Tabellen 1 a-1 c wiedergegeben.

Die Peptide aus Weizenprolamin enthalten fast durchweg sehr viel Glx (Z) und Pro (P), wobei deren molares Verh~iltnis stark variiert. Phe (F) ist die dritt- haufigste Aminosfiure; es kommen maximal 3 Reste pro Peptid vor. Einige Peptide bestehen nur aus diesen drei Aminos~iuren; bei anderen kommen eine oder zwei weitere Aminos~iuren hinzu. Es ffillt auf, dab die meisten Peptide ohne Phe andere hydrophobe Amino- sfiuren wie Leu (L), lie (I) oder Val (V) enthalten. Die Aminosfiuren Cys, His, Lys, Met und Arg sind in den untersuchten Peptiden nicht enthalten.

Bei den Peptiden aus Roggenprolamin schwankt das molare Verhfiltnis der ebenfalls stark dominieren- den Aminosfiuren Glx und Pro nur wenig. AuBerdem scheint das hfiufigere Vorkommen von Asx (B) und Met (M) typisch zu sein. Davon abgesehen sind die aus Weizen- und Roggenprolamin isolierten Peptide sehr fihnlich zusammengesetzt.

Bei den Peptiden aus Gerstenprolamin f~illt auf, dab Glx und Pro hfiufig im molaren Verh/iltnis 1 : 1 vor- kommen. Phe als dritthfiufigste Aminos~iure ist maxi- mal nur zweimal pro Peptid enthalten. Aufffillig ist auch das Vorkommen von Ile.

367

Origiaat papers

A22O

0.2-

0.1-

PWIO0 4 J 9 PW305

' ~ 'g ~+~ ~

P+00,01 liiJ+i '~iiiii :i ~: '8 , , I I , ,

PW212 tJl~'3 t, PW3/,o4

r , ,

2 4 3 6

, , , , , , , + , 47 !6 PW30/+o / ~ PW34b5

' 1 0 20 3'0 */. CH3CN

..o, ~,,oo~o.~to., '~,~ ]i' +li ,.~,oo, ~'ii i ~ ~.Oo~o.,_ ,o,oo~ ,,i+ + li~:o.

L , ,

il + , , ,

PR2 0a s :6 i7

23

~ll i i t i

23 5

I[ +1 ~ I I

, i

10 20 30 */. CH3CN

I i i P02,2o 2 ] ~ 17 1112 1314 15

t PG222d s

',~ 1+

+

t li~ PG34o4b 32 7

2

l ,ili+! +° ~ ° - -

3

J PG39/, 12 3! i~

I 1'0 20 30

% CH3CN

Abb.2. C h r o m a t o g r a p h i e verschiedener Pep t id f rak t ionen aus den P ro l aminen yon Weizen (PW), Roggen (PR) und Gers te (PG) an Octade- cylkieselgel (S t r i chch roma tog ramme)

Tabelle 1. Ausbeute% Aminos f iu rezusammense tzung b und Aminosf iu resequenz =von Pept iden aus

P ro l aminen

Fraktion PW Ausbeute Aminosfiurezusammensetzung Aminosfiuresequenz

a) Peptide aus Weizenprolamin (PW) 2121/2222 4,64 F2P6TZlo 33b46b 2,25 FPsSYZ 5 2224 1,77 F2LP6Z9 2003 1,65 F3PtoTZ15 33b45b/34a44b 1,65 AILPZ 3 1004 1 , 4 7 F3LPIISYZ16 2005 1,39 AF3LPgZI3 34a51 1,36 FP2SZ+ 3059a 1,25 FP2Z3 304a6 1,21 AF2P4Z7 34b46 1,08 ILPSZ 2 23a4a4 1,02 AGILP2Z 5 3057 1,01 FLPzSZ + 1003 0,92 FaLPIzSTYZ16 2225 0,84 F2GPTVYZIo 34a43 0,84 P2V2 Z 33b43 0,83 GLPZ 7 34a53 0,80 FPzTZ,~ 2023 0,78 F2P6Z 9 2009a 0,77 F3LPloSTZt3 33b44/34a42b 0,76 IPzSZ 3

34b45a 0,76 FLP+Z 3

2027 0,71 F2L2PgYZ8 304a4 0,70 FP¢VZ 7 306a3b 0,66 ABFGP2S2Z6 2022 0,62 F2PsZ 9 33b45c 0,60 G2IPVZ4 2008 0 , 5 8 F3LPgSTZIa 2007 0,54 FzLP6STZ 9 33b49 0,54 FLaP+Z+

TQQPQQPFPQQPQQPFPQ PQPQPFPSQQPY- LQPQQPFPQQPQQPFPQ TQQPQQPFPQQPQQPFPQQPQQPFPQ- AQIPQQL d OQFPQPQQPQQPFPQ... OAQLPFPQQPQQPFPQ... SQQQQPPF d OQPFPQPQQPF d OAFPQQPQQPFPQ IQPSLQ~ GIIQPQQPAQQL a OFPQQQQP(SL) d OTFPQQPQQPFPQ... VQQQQFPGQQQPFPPQQPYPQPQ VPVPQ- GQQPQQQQL d TQQPQQPF d OQFPQPQ... OTFPQQPQLPFP... SQPQQPP PQPQP... LQQPQ... OLQPFPQPQPFPPQLPYP... OQVPQPQQPQQPF d OPQAQGQ... OQFPQPQQPQQPFPQ VQGQGIIQPQ OTFPQQPQQPFP... OTFPQQPQQPFP... LQLQPFPQPQLP-

368

Tabel le 1 ( F o r t s e t z u n g )

Fraktion PW Ausbeute Aminos~urezusammensetzung Aminos~iuresequenz

304a1 0,53 LP4Zs OQLPQPQQP... 304a5 0,51 FLzP6VZ~o OQLVPQPQQPFP... 304a2 0,49 FP3Z6 OQFPQPQQP- 2221 0,48 FP4SZ 7 SQQPQQPFPQPQQP 23a4a2 0,48 AG2IP2VZ6 VQGQGIIQPQQPA 33b45a 0,44 FGPVZ-7 VQQQQFPGQQ 33b47b 0,43 FP3Z 5 XQQPQQPFPQ-- 34b47 0,43 BLPV2 VNVPL a 23a4a3a 0,42 FGLP4Z s LQQPQQPFPQPoo

GQGIIQPQQPA . . . . . 2122 0,37 FzHPTTVZI 1 TQQPQQXF... 34b42b 0,37 P4YZ,, PQPQPQY 34b41 0,36 LPZ 3 LQPQQ 3052 0,34 LPZ 6 OQQQQPL d 306a2 0,34 LPZ6 OQPQQQL d 33b42 0,34 AGPSVZ 3 AQGSVQPQ- 23a4al 0,31 FPgS2TZ 8 SQQPQQQFPQPQ... 2021 0,30 F2P6Z H OQQPQQPFPQQPFPQ... 34b44 0,29 FP2SZ 3 SQQQPPF a 2004 0,28 F2P9VZ13 OPQPFP... 2223 0,28 F2PTSZ13 SQQPQQPQPQQP... 33b41 0,28 GPSVZ z GSVQPQ 2026 0,27 FP4Z 4 OPQQPFPQQP...

b) Peptide aus Roggenprolamin (PR)

102a3 3,56 F2PgS2ZI4 SQPQQPFP... 3233 0,73 BG2LMPvSV3YZ~ t NMQVGPQGQVEXPQQQPLPQPQ... 3236 0,59 BGzLMP6SV3YZ~o NMQVGPXGQVEXPQQQPLPQP... 2142 0 , 4 1 F31P9S3VZ15 XIPQPQQPFP... 3232 0,24 FGLP6V2YZI2 GQVEXPQQQPLP... 322a3a 0,22 FLPsSVZ 8 OFPQQPQQPVPQQP... 3235b 0,20 GzLP6SVzYZ 9 VGPSGQVEXPQQQP... 2207 0,20 FP6SVZ s SQQPQQPQQPFPQQP... 210a3 0,18 F2PgSTZIs SQQPQQPFPQPQQPQQPFP... 322a4 0,18 F2LP6Zt o QQFPQQPQQPFPQQP... 3231 0,17 GLPsSVzYZ1o SGQVEXPQQQPL... 3238 0,15 AF2ILPsSVZ~ ~ AQQPEQII... 322al 0,12 FPsTZ 9 TQQPQQPFPQPQQP... 322a2 0,12 FIP6SVZ 9 OQFPQQPQQPVPQ... 210a6b 0,11 F 3 L 2 P ~ o S 2 T Z 1 7 SFPQTQQPQQPFPQP... 210a4 0,09 F2P~SZt2 SQQPQQPFPQPQQPQQPFPQP... 210a5 0,09 FzLPsSVZI 5 QQFPQQPQQXFPQ... 210a6a 0,08 FzGILPsSZ14 EQPQQPFPQQXG...

c) Peptide aus Gerstenprolamin (PG)

34a4b4 1,75 FP3Z 3 PQQPQPF 1102 1,08 F2IPloYZIo PQQPQPFPQQPIPQQPQpypQQpF a 34a4b6 1,08 AFLPVZ4 VLPQQQAQF a 222d5 1,07 FIPvVYZ 7 PQQPQPFPQQPIPQQP... 2104 1,04 FzlPI tYZx ~ PQQPQPFPQQPIPQQPQPYPQQP... 212a8a 0,48 FIPTYZ 9 PQQPQPFPQQPIPQQP... 212a7b 0,47 IzPaSYZ 9 SQQPIPQQPQPYPQQPIPQQP 34b45b 0,45 BLVP z VNVPL a 212a7a 0,41 FIP6YZ ~ PQQPIPQQPQPYPQQPF a 23a2b6 0,36 FILP4Z 4 IIPQQPQQP... 212a9a 0,34 FIPIoVYZt i PQQPQPFPQQPIPQQPQPYP... 212al 0,33 GP3VZ7 QQPQPQQGQQQQVP 34b46a 0,31 FLP2Z 2 LPQQPF d 222d2a 0,31 FGP3SV4Z 9 QQPQPQQGQQQQVPQ... 34b43b 0,30 G4TV3 GVGTGVGV d 23a2b4 0,27 ILzP4Z 4 IIPQQPQQP... 34a4b3a 0,24 FP2SZ 5 SQQPQQP... 34a4b5b 0,24 FLP2Zs FQQPQPQQL d 34a4bl 0,20 LPSZ4 SQPQQQL d 34a4b7b 0,19 FGLP3VZ3 LPQQP... 34a4b5a 0,18 G3PSV 3 GVGPSVGV d 34b45a 0,17 BLP3Y2Z3 LQQPYPQNPY 34b41 b 0,14 P3YZ4 PQQPQpy 34b44b 0,14 GILPZ z GLQQPI 34a4b2 0,12 FP2Z 5 FQQPQPQQ d 34a4b8 0,10 FILP3Z z IIPQQP... 34a4b3b 0,06 G3LPzYZ 6 LQPGQGQQGP...

a In % , b e z o g e n a u f e ingesetz tes P r o l a m i n

b Einbuchstaben-Code: N Asn; B Asx; T Thr ; S Ser; Q Gin ; E Glu ; Z Glx; P Pro ; G Gly ; A Ala; V Val; M Met ; I lie; L Leu; Y Tyr ; F Phe; H His; K Lys; R Arg ; O Pyrog lu tamins~ iure ; X u n b e k a n n t

c _ Sequenz beende t ; .. . Sequenz n i ch t be e nde t

d C - t e r m i n a l e Aminos~iure aus de r A m i n o s ~ u r e z u s a m m e n s e t z u n g abgele i te t

369

Original papers

Aminosduresequenz

Die Bestimmung der Aminosfiuresequenz der durch HPLC isolierten und in der Ausbeute dominierenden Prolaminpeptide erfolgte durch manuellen Edman- Abbau. Die freigesetzten PTH-Aminos~iuren wurden durch HPLC an ODS identifiziert. Ein Teil der Pepti- de, die am N-Terminus Pyroglutaminsfiure (O) auf- weisen, wurde durch Umsetzung mit NaOH dem Ed- man-Abbau zug~inglich gemacht und zumindest teil- weise sequenziert; allerdings wurden die Analysen fiber den 10. Schritt hinaus durch Oberlappungen sehr erschwert.

Bei den vollst~indig sequenzierten Peptiden stim- men Sequenzanalyse und Aminosfiureanalyse hin- sichtlich der Anzahl der Aminosfiurereste meist fiber- ein. In einigen Ffillen sind aber Abweichungen zu be- obachten. Bei Vorliegen der Sequenz Ile-Ile ergab die Aminosfiureanalyse z.B. zu wenig Ile und bei lfinge- ren, glutaminreichen Peptiden zu viel Glx. C-termina- le Aminosfiuren mit stark hydrophoben Seitenketten wie Phe, Leu und Ile wurden beim vorletzten Abbau- schritt mitextrahiert und somit nicht erfal3t; sie wur- den anhand der Aminosfiurezusammensetzung zuge- ordnet.

In Tabelle 1 a sind die Aminosfiuresequenzen von 54 Peptiden aus Weizenprolamin (PW) zusammenge- stellt. Die Summe ihrer Ausbeuten betrfigt 4,2%, be- zogen auf eingesetztes Protein. Berfcksichtigt man die Verluste bei den einzelnen chromatographischen Trennverfahren, so kann man davon ausgehen, dab diese Peptide mindestens 10% des Prolamins reprfi- sentieren. Von 32 Peptiden wurde die Gesamtsequenz ermittelt, wobei die Kettenl~inge zwischen 5 und 26 Aminosfiureresten liegt. 22 Peptide haben Pyroglut- amins~iure am N-Terminus; die l~ingste analysierte Teilsequenz aus dieser Peptidgruppe besteht aus 18 Aminos~iureresten (PW 2027). Zwei Peptide (PW 34b45a, PW 23a4a3a) erwiesen sich als nicht ein- heitlich; die Sequenzen konnten jedoch aufgrund der unterschiedlichen Ausbeuten an PTH-Aminosiiuren zumindest in Teilbereichen trotzdem eindeutig ermit- telt werden. Drei Peptidpaare (PW 2121/PW 2222; PW 33b45b/PW 34a44b; PW 33b44/PW 34a42b) ha- ben eine identische Sequenz. Die Sequenzen einiger kfrzerer Peptide sind in lfingeren enthalten (z.B. PW 34a53 in PW 2121/2222 und PW 2003; PW 33b45c in PW 23a4a2; PW 33b45a in PW 2225; PW 33b41 in PW 33b42).

Ein Vergleich der hier erhaltenen Prolaminpartial- sequenzen mit der Gesamtsequenz von A-Gliadin [12] und mit den aus Nucleinsfiuren abgeleiteten Sequen- zen yon Gliadin-Typ [12-19] zeigt, dab 8 der vollstfin- dig sequenzierten Peptide (PW 33b46b; 34a43; 33b44/ 34a42b; 33b49; 33b45a; 34b42b; 33b42; 33b41) im ~-

Typ [12-16], 5 Peptide (PW 33b45b/34a44b; 34b46; 33b43; 304a2; 34b47) im 7-Typ [17-19] und PW 34b41 in beiden Typen enthalten sind. Vier Peptide (PW 34b46b; 2225; 34a43; 33b45a) kommen im coe- liakieaktiven Peptid B 3142 [8] vor.

Charakteristisch fiir die Prolaminpeptide aus Wei- zen ist die relativ gleichm/il3ige Verteilung von Prolin [P]. Lfingere Abschnitte ohne P sind selten: Die lfingste Partialsequenz ohne P umfal3t 8 Aminos/iurereste (PW 23a4a2, PW 33b45c). Andererseits kommt eine Kumulation von P insgesamt nur viermal vor und zwar ausschliel31ich in Form der Dipeptidsequenz PP. Im Gegensatz dazu ist Glutamin (Q) sehr h/iufig ku- muliert, fiberwiegend als QQ. Die Folgen QQQ und QQQQ treten demgegenfiber deutlich zurfick. Beson- ders typisch sind offenbar Sequenzen der Art PXP und PXXP. Bei PXP ist X meist mit Q oder den aromati- schen Aminosfiuren F oder Y besetzt und bei PXXP fast ausschlieBlich mit QQ. Die erw/ihnten Partialse- quenzen wiederholen sich in einigen Peptiden mehr- mals (z. B. in PW 2003, PW 2121/2222).

Die in Tabelle lb wiedergegebenen 18 Peptide aus Roggenprolamin (PR) konnten durchweg nur partiell sequenziert werden, und zwar fiber 8 bis 22 Aminos/iu- rereste. Einige Peptide (PR 210a3/PR 210a4, PR 3233/PR 3236) sind in den analysierten Sequenz- abschnitten identisch, wfihrend andere Peptide (PR 3232, PR 3235b, PR 3231) fiberlappende Sequen- zen zeigen. Die Peptide PR 210a3 und PR 210a4 stim- men bis zur Position 14 mit dem Peptid PW 2221 fber- ein. Zwei Peptide (PR 3233, PR 3236) stammen aus dem N-terminalen Bereich von Roggenprolamin [20]. Die Verteilung der dominierenden Aminos/iuren Q und P ergibt insgesamt ein fihnliches Bild wie bei den Peptiden aus Weizenprolamin. P ist sehr gleichm/iBig verteilt und kommt nie kumuliert vor. Q dagegen liegt am h/iufigsten als QQ vor, w/ihrend die Folge QQQQ im Gegensatz zu Weizen fehlt. Die neben PQQP sehr hfiufig vorkommende Sequenz QPFPQ ist in einigen Fallen zu QPVPQ und QPLPQ variiert.

Bei den 27 analysierten Peptiden aus Gerstenprol- amin (PG) wurden 16 Gesamtsequenzen mit 5 bis 24 Resten und 11 Partialsequenzen mit 5 bis 23 Resten er- mittelt (Tabelle lc). F fn f Peptide (PG 1102, PG 222d5, PG 2104, PG 212a8a, PG219a9a) sind in den analysierten Sequenzabschnitten identisch; PG 34b45b stimmt in der Gesamtsequenz mit dem Peptid PW 34b47b fberein. PG 34a4bl, PG 34a4b5b sowie PG 34b45b kommen im C-terminalen Bereich von B1-Hordein [21] vor.

Wie bei den Peptiden aus Roggenprolamin ist P re- lativ gleichm/iBig verteilt und nicht kumuliert. Neben dem h/iufigen Vorkommen als QQ liegt Q auch isoliert und in jeweils zwei Fallen als QQQ und QQQQ vor. PQQP ist auch in den PG-Peptiden die dominierende

370

Partialsequenz. Interessant ist, dab die Sequenz QPXPQ am hfiufigsten mit X = I (8 x ), besetzt ist, ge- folgt von X = Fund Y (je 5 x ). Diese drei Sequenzele- mente sind auch mit kurzen Unterbrechungen in ei- nem Peptid (PG 2104) anzutreffen. Peptide, in denen Q und P mengenmfigig stark zurficktreten, zeigen ein geh~uftes Auftreten einzelner anderer Aminos~iuren. Ein Beispiel ist die Hfiufung von G und V in den Pep- tiden PG 34b43b (GVGTGVGV) und PG 34a4b5a (GVGPSVGV).

Zur weiteren Charakterisierung der Prolamine wurde die H~iufigkeitsverteilung aller in den chymo- tryptischen Peptiden vorkommenden Di- bis Penta- peptidsequenzen berechnet. In Tabelle 2 sind die je- weils sechs h/iufigsten Sequenzen wiedergegeben. Bei den Dipeptidsequenzen stehen QP, PQ und QQ in al- len Getreidearten mit Abstand an der Spitze, gefolgt von FP und PF. Unterschiede zwischen den PW-, PR- und PG-Peptiden kommen erst in den weniger hfiufi- ger Sequenzen (z. B. QL, QV, pI) zum Tragen. Domi- nierende Tripeptidsequenzen sind fibereinstimmend QQP und in unterschiedlicher Plazierung QPQ und PQQ. Bei den PW- und PR-Peptiden folgen FPQ, PFP und QPF. Im Gegensatz dazu kommen bei den PG- Peptiden PQP, IPQ und QPI hinzu. PQQP steht inner-

Tabelle 2. H/ iuf igkei t von Di- bis Pen tapep t idsequenzen in den hier beschr iebenen P ro lamin -Pep t iden

PW PR PG

Peptide % a Peptide % Peptide %

(521) (240) (275) QP 20,4 QP 18,6 QP 21,5 PQ 19,5 PQ 18,2 PQ 20,7 QQ 19,5 QQ 18,2 QQ 20.4 FP 8,3 FP 7,0 IP 4,0 PF 6,7 PF 4,5 PF 3,3 QL 2,3 Qv 2,9 P1 3,3

(466) (222) (248) QQP 14,4 QQP 15,8 QQP 16,5 QPQ 12,3 PQQ 14,0 PQQ 15,7 PQQ 11,8 QPQ 8,6 QPQ 9,7 FPQ 7,1 FPQ 6,3 PQP 6,5 PFP 6,5 PFP 5,0 [PQ 4,4 QPF 6.5 QPF 5,0 QPF 3,6

QPI 3,6

(412) (204) (221 ) PQQP ! 1,7 PQQP ! 1,8 PQQP 14,9 QPQQ 9,7 QPQQ 8,8 QQPQ 8,6 QPFP 6.6 QQPQ 5,9 QPQP 7,2 QQPQ 6,6 QPFP 5,4 IPQQ 5,0 QQPF 6,1 QQPF 5,4 QQPt 4,1 PFPQ 5,4 PFPQ 3,9 PIPQ 3,6

QPtP 3,6 QPQQ 3,6

(358) (186) (194) QPQQP 9,8 QPQQP 9,1 QQPQP 8,2 PQQPF 6,7 QQPQQ 6,5 PQQPQ 7,2 QQPQQ 6,7 PQQPF 5,9 IPQQP 5,7 QQPFP 6,2 QQPFP 5,9 PIPQQ 4,1 QPFPQ 5,9 QPFPQ 4,3 QPIPQ 4,l PQQPQ 3,9 PQQPQ 3,8 QQPIP 4,l

a Bezogen a u f G e s a m t a n z a h l der be t rach te ten Sequenzen (in Klam- mern); 0 wurde als Q berechnet

halb der Tetrapeptidsequenzen an der Spitze. Bei den darauffolgenden Sequenzen treten die Unterschiede zwischen PW- und PR-Peptiden einerseits und PG- Peptiden andererseits deutlich hervor: PW- und PR- Peptide enthalten neben QPQQ und QQPQ h~iufig die F-haltigen Sequenzen QPFP, QQPF und PFPQ, die PG-Peptide hingegen die I-haltigen Sequenzen IPQQ, QQPI, QPIP und PIPQ. Die entsprechenden Unter- schiede sind auch in den Pentapeptidsequenzen zu fin- den.

Zum Vergleich sind die Hfiufigkeiten von Di- bis Pentapeptidsequenzen in A-Gliadin [12] und in Prolaminen vom ~-Gliadin-[12], 7-Gliadin-[l 7, 18] und Hordein-Typ [21] wiedergegeben, deren Sequenzen fiber die entsprechenden Nucleinsfiuren abgeleitet wurden (Tabelle 3). Bei den Gliadinen, die dem ~-Typ entsprechen (A-Gliadin, pGli A-42), dominieren im Gegensatz zu den PW-Peptiden, die aus Gesamtglia- din isoliert wurden, Q-haltige Partialsequenzen (Q2 Q5). Dies ist auf die langen Folgen von Q in den Glia- dinen zurfickzuffihren, die fiber die chymotryptischen Spaltpeptide von Weizenprolamin offensichtlich nicht erfal3t wurden. Wie bei den hier beschriebenen Pepti- den kommen Q und P in verschiedenen Sequenzva- rianten (z. B. QPQ, QQP) h~iufig vor. Dazu kommen noch L- und S-haltige Sequenzen (z. B. LQQ, SQQ), w/ihrend F-haltige Sequenzen im Gegensatz zu den chymotryptischen Peptiden nur eine untergeordnete Rolle spielen.

Der N-terminale Abschnitt vom 7-Typ (pW 10) zeigt in der Hfiufigkeit einzelner Partialsequenzen mehr Ubereinstimmung mit den PW-Peptiden als der C-terminale Bereich (pTag 544). Der C-terminale Ab- schnitt von B1-Hordein (pchor 2-4) stimmt mit den PG-Peptiden in der Hgufigkeit Q- und P-haltiger Par- tialsequenzen (z. B. QPQ, PQQ, QQPQ) fiberein, wfih- rend die mit den Peptiden erfal3ten typischen I-halti- gen Partialsequenzen fehlen.

Die lfingsten wiederkehrenden Sequenzen in den hier beschriebenen Peptiden aus Weizenprolaminen und den erwfihnten Gliadinen sind in Tabelle 4 wie- dergegeben. Als gemeinsames Strukturelement ffir PW-Peptide und ~-Gliadine kann die Folge PQQPXPQ angesehen werden, wobei X ffir eine aro- matische Aminos~iure (F oder Y) steht. Dabei ist F ffir die Peptide und Y ffir ~-Gliadine typisch. Das Struk- turelement PFP dfirfte fiberwiegend auf die ~o-Glia- dinfraktion zurfickgehen, die zu fiber 80% aus den Aminos~iuren Q, P und F besteht [22, 23]. M6glicher- weise liegen hier, fihnlich wie bei C-Hordeinen [24], Se- quenzen vom Typ (QQPQQPFP), gehfiuft vor. Die Sequenz (n = 1) kommt in den PW-Peptiden insgesamt t 7mal (= 8,1% aller Octapeptidsequenzen) vor, da- von im Peptid PW2003 mit n=3 und im Peptid PW 2121/2222 mit n =2.

371

Origina| papers

Tabelle 3. H~iufigkeit von Di- bis Pentapeptidsequenzen in Gliadinen und Hordein der Literatur

PW PW PW PW PG

A-Gliadin %~ pGliA-42 % pW10 % pTag544 % [12] [12] [181 [17]

pchor2~l % [21]

(265) (297) (231 ) (218) QQ 15,8 QQ 21,9 QQ 16,9 QQ 17,4 QP 7,2 PQ 6,1 PQ 10,8 QP 4,6 PQ 6,4 QP 6,1 QP 9,1 PQ 4,1 LQ 3,8 LQ 4,4 FP 3,5 LQ 2,8 SQ 3,4 QL 3,4 Qv 2,2 SQ 2,8 QL 2,3 SQ 2,7 b 1,7 QL 2,3

(264) (296) (230) (217) QQQ 9,1 QQQ 14,2 PQQ 7,8 QQQ 8,3 QPQ 3,4 QPQ 3,0 QPQ 5,7 QQP 3,7 QQP 3,0 QQP 2,7 QQP 5,2 PQQ 3,2 PQP 2,3 LQQ 2,4 QQQ 4,3 QPQ 1,8 LQQ 1,9 PQQ 2,0 FPQ 3,0 QQL 1,8 PQQ 1,5 QQL 2,0 PQP 1,7 SOO 1,8 QFP 1,5 QQF 1,7 SQQ 1,5

(263) (295) (229) (216) QQQQ 6,5 QQQQ 10,5 QPQQ 5,7 QQQQ 3,2 PQPQ 1,5 b 1,0 PQQP 3,1 QQQP 1,9 b 1,1 QQPQ 3,1 SQQQ 1,9

PQQQ 2,6 b 1,4 QQQF 1,7 FPQP 1,3 PQPQ 1,3

(262) (294) (228) (215) QQQQQ 5,3 QQQQQ 8,5 QQPQQ 3,1 QQQQP 1,9 b 0,8 b 0,7 QPQQP 2,2 FSQQQ 1,4

PQQPQ 1,8 PFSQQ 1,4 PQQQF 1,8 PPFSQ 1,4 QPQQQ 1,8 QPPFS 1,4 FPQPQ 1,3 QQPPF 1,4 PQPQQ 1,3 SQQQQ 1,4

(180) QQ 7,2 LQ 4,4 PQ 4,4 QL 3,9 QP 3,9

1,7

(179) QPQ 2,8 LQQ 2,2 PQQ 2,2 QQL 2,2 FLQ 1,7 QQQ 1,7

(178) QPQQ 2,2 LQQQ 1,1 QQQC 1,1 VFLQ 1,1 b 0,6

(177) LQQQC 1,1 b 0,6

a Bezogen auf Gesamtzahl der betrachteten Sequenzen b Mehr als 6 Sequenzen mit gleicher H~iufigkeit

Tabelle 4. Lfingste wiederkehrende Sequenzen in Prolaminen und Prolaminpeptiden

Protein/Peptid Sequenz Hfiufigkeit

PW-Peptide QQPQQPFPQ 2 x " PW-Peptide QQPQQPFP 3 x " PR-Peptide QQPQQPFPQP 2 × ~ PG-Peptide PQQPQP 2 x a PG-Peptide PQQPQPXPQQP c 2 x a PW A-Gliadin [ 1 2 ] PQQPYPQPQP 2 × PW A-Gliadin [ 1 2 ] QQQQQQQQQ 2 x PW pGliA-42 [ 1 2 ] QQQQQQQQQQ 2 x PW pGliA-42 [ 1 2 ] QQLQQQQQQQ 2 x PW pGliA-42 [ 1 2 ] QLQQQQQQQQ 2 × PW pGliA-42 [ 1 2 ] LQQQQQQQQQ 2 x PW pGliA-42 [12] FPPQQPYPQ 2 x PW pW 10 [ 1 8 ] QPQQQFPQPQQPQQ 2 x PW pTag 544 [ 1 7 ] LPQQPPFSQQQQ 2 x PM A30 [ 2 5 ] QQFLPFNQLAALNS 2 × PM 2ZG99 [ 2 6 ] QFLPFNQLAALNS 2 x PM 2ZG99 [ 2 6 ] QQQQLLPFSQLAA 2 x PM pz22.3 [27] QQFLPALS 2 × PM pz22.3 [27] NPVAYLQQ 2 x

(15x) b (17x) b (Sx) ~

(12x) b (9x) b

In einem Peptid b In allen Peptiden c X fiir F ode r Y

PR-Peptide weisen diese Sequenz 8mal auf ( = 6,1% aller Octapeptidsequenzen); bei der l~ingsten wiederkehrenden Sequenz (Peptid PR 210a4) ist zu- sfitzlich das Dipeptid PQ eingeschoben

(QQPQQPFPQP).. Diese und /ihnliche Sequenzab- schnitte stammen offenbar aus den co-Secalinen [23]. Auf den bei einigen PR-Peptiden vorliegenden Aus- tausch von F durch V wurde bereits hingewiesen.

Da der Austausch von F durch I und auch durch Y bei PG-Peptiden noch h/iufiger auftritt, ist die l~ng- ste wiederkehrende Sequenz in PG-Peptiden relativ kurz (PQQPQP). FaBt man F und Y zu X zusammen, so besteht die 1/ingste wiederkehrende Sequenz aus 11 Aminosfiuren (PQQPQPXPQQP). Auff/illig ist bei X = I das Fehlen des Dipeptids PQ (PQQPIPQQP).

Auf die g~inzlich anderen Partialsequenzen der Maisprolamine (PM, Tabelle 4) sei hier am Rande hingewiesen [25-27].

Zusammenfassend lfiBt sich folgendes feststellen: Typische, sich wiederholende Sequenzabschnitte sind bei den Prolaminen von Weizen, Roggen und Gerste /ihnlich aufgebaut und bestehen fiberwiegend aus Q, P und hydrophoben Aminosfiuren X wie F, Y, I, V und L, die meist zwischen zwei Reste P eingeschoben sind. Sequenzen dieser Art, wie z.B. QQPQQPXP, kom- men offenbar vor allem in ~o-Gliadinen, oJ-Secalinen und C-Hordeinen vor und beginnen im N-terminalen Bereich dieser Proteine etwa ab Position 13 [23].

372

Originalarbeiten

Literatur

1. Wieser H, Seilmeier W, Belitz H-D (1980) Z Lebensm Unters Forsch 170:17

2. Wieser H, Seilmeier W, Belitz H-D (1982) Z Lebensm Unters Forsch 174:374

3. Wieser H, Seilmeier W, Belitz H-D (1983) Z Lebensm Unters Forsch 177:101

4. Wieser H, Seilmeier W, Belitz H-D (1984) Z Lebensm Unters Forsch 178:173

5. Wieser H, Seilmeier W, Belitz H-D (1984) Z Lebensm Unters Forsch 179:40

6. Wieser H, Belitz H-D, Ashkenazi A, Idar D (1983) Z Lebensm Unters Forsch 176:85

7. Tkachuk R, Irvine GN (1969) Cereal Chem 46:206 8. Wieser H, Belitz H-D, Ashkenazi A (1984) Z Lebensm Unters

Forsch 179:371 9. Burzynski SR (1976) Anal Biochem 70:359

10. Rivier JE (1978) J Liquid Chromatogr 1:343 11. Rivier 3E (1980) J Chromatogr 202:211 12. Kasarda DD, Okita TW, Bernardin JE, Baecker PA, Nimmo

CC, Lew EJ-L, Dietler MD, Greene FC (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:4712

13. Sumner-Smith M, Rafalski JA, Sugiyama T, Stoll M, S/ill D (1985) Nucleic Acids Res 13:3905

14. Rafalski JA, Sheets K, Metzler M, Peterson DM, Hedgcoth C, $611 DG (1984) Embo J 3:1409

15. Anderson OD, Litts JC, Gautier M-F, Greene FC (1984) Nu- cleic Acids Res 12:8129

16. Okita TW, Cheesbrough V, Reeves CD (1985) J Biol Chem 260:8203

17. Bartels D, Thompson RD (1983) Nucleic Acids Res 11:2961 18. Scheets K, Rafalski JA, Hedgcoth C, S/ill DG (1985) Plant Sci

Lett 37:221 19. Okita TW (1984) Plant Mol Biol 3:325 20. Shewry PR, Field JM (1982) J Exp Bot 33:261 21. Rasmussen SK, Hopp HE, Brand A (1983) Carlsberg Res Com-

mun 48:187 22. Wieser H, Springer G, Belitz H-D, Ashkenazi A (1982) Z Le-

bensm Unters Forsch 175:321 23. Kasarda DD, Autran J-C, Lew E J-L, Nimmo CC, Shewry PR

(1983) Biochim Biophys Acta 747:138 24. Miflin BJ, Forde BG, Shewry PR, Kreis M, Forde J (1984) Ox-

ford Surv Plant Mol Cell Biol 1:231 25. Geraghty D, Peifer MA, Rubenstein J, Messing J (1981) Nucleic

Acids Res 9:5163 26. Pedersen K, Devereux J, Wilson DR, Sheldon E, Larkins BA

(1982) Cell 29:1015 27. Marks MD, Larkins BA (1982) J Biol Chem 257:9976

Eingegangen am 10. November 1986

373