Versuch 10 Immunochemische Methoden

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Studiengang Biotechnologie WS 2010/11(BTB3)

Biochemie-Praktikum

Protokoll

Versuchsthema 10: Immunchemische Methoden

am 03. Dezember 2013

Von

Daruich, Gallardo

Gruppe 8

Daruich M. Nahir, Gallardo NoeliaLabor Biochemie - Gruppe 8

Versuch 1 – Versuch 2 – Versuch 303.12.2013

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Einleitung

Die Immunchemie untersucht die Struktur von Antigenen, Antikörpern und die chemischen Grundlagen der Immunreaktionen.

Als Antigen-Antikörper-Reaktion wird in der Biochemie, der Immunologie und in verwandten Wissenschaften ein Bestandteil der Immunreaktion bezeichnet, bei dem sich ein Komplex aus Antigen und Antikörper bildet. Dieser wird als Antigen-Antikörper-Komplex oder auch Immunkomplex bezeichnet.

Alle Techniken der Bestimmung des Komplexes beruhen auf der Präzipitation von Antigen und Antikörper, wenn beide Reaktionspartner in annähernd gleichen Konzentrationen vorhanden sind.

Im Labor bilden sich sichtbare Komplexe nur unter optimalen Bedingungen. Sie können als sogenanntes Präzipitat (oder Trübung) ausgefällt werden. Diese sind die sogenannte Immunpräzipitation Techniken. Nutzbar ist diese Technik zur Quantifizierung des Antigens, in seltenen Fällen auch des Antikörpers.

Für den Nachweis von speziellen Antigenen und Reaktionen, die Ouchterlony-Doppelimmundiffusion wird benutzt. Diese Immundiffusion Technik ist ein einfaches und bewährtes Verfahren.

Versuch 1: Antikörper und Protein-Antigen bilden Komplexe, die präzipitieren

Aufgabe : Die Ausfällung von Antigen mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers untersuchen.

Materialen

Protein: Albumin (human) 1mg/mL in PBS BSA 1mg/mL in PBS Peroxidase (HRP) 1mg/mL in PBS

Antikörper: anti-Albumin Antiserum v. Kaninchen. anti-HRP (Kaninchen)

Reagenzlösung A: (Polyethylenglykol-PEG 4000, 4%)



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Teil 1:Albumin/anti-Albumin

Durchführung

In je 5 Mikrogefäße (1,5 mL) geben:- 400 L Reagenzlösung A- 15 L anti-Albumin Antiserum

Folgendes geben

1) 50 L hu-Albumin (0,2 mg/mL)2) 50 L hu-Albumin (0,4 mg/mL)3) 50 L hu-Albumin (1 mg/mL)4) 50 L hu-Albumin (2 mg/mL)5) 50 L hu-Albumin (4 mg/mL)

5 min warten und abzentrifugieren Die Trübung beurteilen.

Ergebnisse und Beobachtungen

Am Anfang, vor der Reaktion, alle die Mikrogefäße waren farblos. Danach 5 Minuten wurde eine weiße Trübung beobachten. In dem nächsten Bild kann man das sehen:

Abb.1: Trübung von den verschiedenen gebildeten Immunkomplexen Albumin/anti-Albumin. Von links nach rechts: hu-Albumin 0,2 mg/mL, hu-Albumin 0,4 mg/mL, hu-Albumin 1 mg/mL, hu-Albumin 2 mg/mL und hu-Albumin 4 mg/mL.

Zuletzt wurden alle die Mikrogefäße zentrifugieren und eine weiße Niederschlag wurde gebildet. Der Maximalen Präzipitation in den Äquivalenzbereich wurde in dem Mikrogefäß mit 1 mg/mL hu-Albumin beobachtet. Es ist wichtig sagen, dass es auch in dem Mikrogefäß mit 2 mg/mL hu-Albumin eine große Menge von Niederschlag gibt. Deshalb wird diese Konzentration auch wahrscheinlich in den Äquivalenzbereich gefunden.



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Abb.2: Niederschlag von den verschiedenen gebildeten Immunkomplexen Albumin/anti-Albumin. Von links nach rechts: hu-Albumin 0,2 mg/mL, hu-Albumin 0,4 mg/mL, hu-Albumin 1 mg/mL, hu-Albumin 2 mg/mL und hu-Albumin 4 mg/mL.

Teil 2: Peroxidase/anti-Peroxidase

Durchführung

In 4 Mikrogefäße (1,5 mL) je

- 300 µL Reagenzlösung A- 5 µL anti-Peroxidase (POD) Antiserum

folgendes geben:- 50 µL HRP (0,02 mg/mL)- 50 µL HRP (0,04 mg/mL)- 50 µL HRP (0,1 mg/mL)- 50 µL HRP (0,2 mg/mL)

Eine Kontrolle wie folgendes stellen: 50 µL HRP (0,01 mg/mL) + 15 µL H2O (statt anti-POD).

10 min warten. Die Trübung beurteilen Scharf abzentrifugieren. Den gesamten Überstand in ein weiteres Mikrogefäß geben. 100 µL POD-Substrat zum Pellet und zum getrennten Überstand dazu pipettieren.


Am Anfangs des Versucht alle die Proben waren farblos. Nach 10 Minuten,Trübung wurde erscheint (aber ganz wenig). Nach zentrifugieren, Niederschlag wird am Boden aufgekommen und man konnte deutlich die maximale Präzipitation in den 4. Mikrogefäß (Konzentration von Antigen 0,2 mg/mL) sehen.



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Abb. 3: Niederschläge nach zentrifugieren (von unten gesehen). Von links nach rechts: Kontrolle, HRP (0,02 mg/mL), HRP (0,04 mg/mL), HRP (0,1 mg/mL), HRP (0,2mg/mL).

Abb. 4: Niederschläge nach zentrifugieren (von vorne gesehen). Von liks nach rechts: Kontrolle, HRP (0,02 mg/mL), HRP (0,04 mg/mL), HRP (0,1 mg/mL), HRP (0,2mg/mL).

Nach Zugabe von POD-Substrat, der Niederschlag wurde blau und der Überstand bleibt gleich. Dass kann man durch das Vorhandensein eines Komplexes im Niederschlag, die gefärbt wird, erklären.



Maximale Präzipitation

Maximale Präzipitation

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Abb. 5: Niederschläge nach Zugabe von POD-Substrat. Alle die Proben wurden blau. Von liks nach rechts: Kontrolle, HRP (0,02 mg/mL), HRP (0,04 mg/mL), HRP (0,1 mg/mL), HRP (0,2mg/mL).

Versuch 2: Quantitative Bestimmung von Proteinen mittels Immunturbidimetrie

Aufgabe: Eine Standardkurve der Transferrinkonzentration im Trübunstest erstellen.

Durchführung

In 9 Halbmikroküvetten geben:- 500 L Reagenzlösung A- 40 L anti-Transferrin IgG Fraktion

Folgendes geben

1) 50 L Tf (0 mg/mL) (=Nullwert)2) 50 L Tf (0,01 mg/mL)3) 50 L Tf (0,025 mg/mL)4) 50 L Tf (0,05 mg/mL)5) 50 L Tf (0,075 mg/mL)6) 50 L Tf (0,1 mg/mL)7) 50 L Tf (0,2 mg/mL)8) 50 L Tf (0,4 mg/mL)9) 50 L Tf (1,0 mg/mL)

Min 3x mit einem T-Mischspatel mischen. Nach 5 min. die Extinktion bei 340 nm gegen die Kontrolle messen.




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Folgende kann man den linearen Messbereich sehen, hier sind die gebildete Immunkomplexe für die verschiedene Konzentrationen von Antigen in der Bereich wo es ein Antikörper Überschuss gibt. Hier führt die Antikörperüberschuss zu Trimeren mit 1 Antigen und 2 Antikörpern.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle beschrieben:

Tab.1: Extinktion der Immunkomplexe Transferrin/anti-Transferrin IgG bei 340 nm in der linearen Zone.

Probe Konzentration [mg/mL] E340

1 (Kont.) 0,000 0,0002 0,010 0,0403 0,025 0,1924 0,050 0,567

und in dem folgende Grafik analysieren:

0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.0600.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

f(x) = 11.6801762114537 x − 0.0484537444933922R² = 0.966071691274778

Standkurve der Transferrin-Konzentration

Transferrinkonzentration [mg/mL]

E340

(Trü

bung

smes

ung)

Abb.6: Bestimmung von Transferrin mittels Immunturbidimetrie (Trübung von Transferrin/anti-Transferrin IgG) bei 340 nm in der linearen Zone.

Folgende ist es die Tabelle mit den Werten für die gesamte Kurve (Heidelberger-Kurve):

Tab.2: Extinktion der Immunkomplexe Transferrin/anti-Transferrin IgG bei 340 nm.

Probe Konzentration [mg/mL] E340



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1 (Kont.) 0 0,0002 0,010 0,0403 0,025 0,1924 0,050 0,5675 0,075 0,6276 0,100 0,7297 0,200 1,7228 0,400 2,7409 1,000 1,274

Diese Werten sind in dem folgende Grafik analysieren:

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.2000.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

Heidelberger-Kurve der Transferrin-Kon-zentration

Transferrinkonzentration [mg/mL]

E340

(Trü

bung

smes

ung)

Abb.7: Bestimmung von Transferrin mittels Immunturbidimetrie (Trübung von Transferrin/anti-Transferrin IgG) bei 340 nm

Versuch 3: Radiale Immundiffusion nach Ouchternoly



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Teil 1: Bestimmung des Titers eines Antiserums.

Aufgabe: Titer von anti-Humanalbumin (Antiserum) bestimmen.

Durchführung

In ein Gel Löscher wie unten stanzen.

In das mittlere Loch 20 µL das Antigen Albumin (1 mg/mL) pipettieren. In die Löcher 1-6 20 µL folgende Antikörperverdünnung geben:

- 1. Loch: anti-Albumin Antiserum 1:8 verdünnt mit PBS:- 2. Loch: 1:16 verdünnt.- 3. Loch: 1:32 verdünnt.- 4. Loch: 1:64 verdünnt.- 5. Loch: 1:128 verdünnt.- 6. Loch: 1:256 verdünnt.

Die Schale schließen und über 2 Tage bei RT inkubieren. Die Ergebnisse im Dunkelfeld abfotografieren.


Unsere Ergebnisse kann man deutlich im folgenden Bild sehen.

Abb.8:Radiale Immundiffusion nach Ouchterlony, Bestimmung des Titers von anti-Humanalbumin mit Albumin.

Die Bildung des Präzipitates im Agarosegel wird bis die Verdünnung 1:32 erreicht. Das heißt, die Grenze der Reaktionsfähigkeit ist die Lösung 1:32 verdünnt.



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Teil 2:Bestimmung der Kreuzaktivität eines anti-Albuminserums

Aufgabe: Bestimme, ob das Anti-Humanalbumin Antiserum kreuzreagiert mit dem Rinderserumalbumin.

Durchführung

In ein Gel Löscher wie unten stanzen.

In das mittlere Loch 20 L einer BSA-Lösung (0,5 mg/mL). In Loch 1 (siehe Diagramm unten) das anti-Humanalbumin Antiserum 1:2 (=1+1) mit PBS

verdünnt. In Loch 2 Humanalbumin 1 mg/mL. In Loch 3 anti-Humanalbumin Antiserum 1:8 (=1+7) mit PBS verdünnt.


Unser Ergebnis kann man deutlich im folgenden Bild sehen:

Abb.8:Radiale Immundiffusion nach Ouchterlony, Kreuzreaktivität von anti-Humanalbumin mit Rinderalbumin (BSA-Lösung 0,5 mg/mL).

Es gibt eine Kreuzreaktivität zwischen Humanalbumin und die verdünnte Antikörper anti-Humanalbumin Antiserum 1:2. In dieser Kreuzreaktivität sind beide Proteine immunologisch identisch, das heißt dass die Proteine alle die Antigenen Determinanten teilen. Deshalb ist es die gleiche Molekül und der Niederschlag die folgende Form hat:



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Abb.9:Radiale Immundiffusion nach Ouchterlony, Kreuzreaktivität. Proteine immunologisch identisch.

Teil 3: Bestimmung der Blutgruppe im AB0- und Rhesus-System

Aufgabe 1 : Die eigene Blutgruppe im AB0- und Rhesus-System mittels Test-Antikörper durch Agglutination bestimmen.

Durchführung

In 3 Vertiefungen einer Tüpfelplatte jeweils ein Tropfen (ca. 50 µL) Anti-A (blaue Lösung), Anti-B (gelbe Lösung), Anti-D (=anti-Resus-Faktor, farblose Lösung) vorlegen.

Eines Bluttropfens herausnehmen. 10 µL Vollblut aus der Fingerbeere zu den Antikörpern geben. Mit einem T-Rührspatel vermischen und das Ergebnis beurteilen.


Folgende Bilder zeigen unsere Ergebnisse:

Abb. 9: Blutgruppen Bestimmung. Studentin A: Daruich. Nur die Anti-D Antikörper hat agglutiniert. Das heißt, die Blutgruppe dieser Studentin ist O Rhesus Positiv.



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Abb. 8: Blutgruppen Bestimmung. Studentin B: Gallardo. Keine Antikörper haben agglutiniert. Das heißt, die Blutgruppe dieser Studentin ist O Rhesus Negativ.



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