Zeitschrift ffir Krebsforschung, Bd. 60, S. 66--71 (1954).

Aus der Chemisehen Abtefluug des Physiologischen Institutes der Universit~t Heidelberg (Dh'ektor: Prof. Dr. Dr. W. K~TSCHE~).

Versuche zur enzymatisehen Depolymerisierung yon Desoxyribonueleoproteid dureh Zellen maligner

Tumoren*. Von

~u KUTSCHER und KARIN EGGERS.

(Eingegangen am 14. Januar 1954.)

Desoxyribonueleoproteide (DNP) bauen das Chromatin des Zell- kernes auf. Die Vorg~nge der Mitose und damit der Vermehrung der Zellzahl sowie die Vererbung werden wohl in erster Linie an die DNP gebunden sein, wi~hrend die Ribonucleoproteide mit der Bildung des EiweiBes und damit des Cytoplasma sowie mit den wichtigsten Stoff- wechselvorg~ngen verbunden sind.

Mit Hilfe der radioaktiven Isotopen wurden im Laufe der letzten Jahre einige interessante Ergebnisse fiber den Stoffwechsel der Nuclein- s~uren gewonnen. Untersuchungen mit 32 p ergaben, dab die Ribo- nucleins~ure in der S~ugetierleber etwa 30real schneller umgesetzt wird, als die Desoxyribonucleins~ure. Auch Versuche mit 15 N-Adenin und 14 C-Adenin fiihrten grunds~tzlich zu dem gleichen Ergebnis, nur dab die Umsatzgesch~dndigkeit noch grSBer gefunden wurde. Auch in anderen Organen (Milz und Darm) wird die Ribonueleins~ure schneller umgesetzt, wenn auch die Umsatzgeschwindigkeit bedeutend geringer, nur etwa 2--5real schneller ist. Dies i s t wahrscheinlich dadurch zu erklgren, dab die Leber das wichtigste Stoffwechselorgan ist und die Stoffwechselprozesse hier einen viel grSBeren Umfang haben als in anderen Organen.

Die Umsatzgeschwindigkeit der Desoxyribonucleinsaure f~]lt etwa in die GrSl~enordnung der Mitoserate. Die l~ucleins~uren des Kernes erfahren charakteristische Ver~nderungen wghrend der Kernteilung. In der Prophase beginn~ eine Anhiiufung der I~ucleinsi~uren in den Chromosomen, die ein Maximum in der Metaphase erreicht und in der Te]ophase weitgehend verschwindet. Auffallend ist jedenfalls, dab die hochmolekularen Bausteine der Zellkerne mehr oder weniger lebhaft umgesetzt werden.

Die Neubildung der l~ucleins~uren erfolgt sowohl aus vorgebildeten Purinen, wie auch aus Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden. Doch erfolgt auch eine Totalsynthese derPurine aus kleinenBausteinen,

*gerrn Prof. F. WASSerMANn, Chicago, zum 70. Gehurtstage gewidmet.

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und sie seheint sogar bevorzugt zu werden. Freie Pyrimidine werden dagegen zur Biosynthese der Nueleins~uren nieht verwertet. Der Ein- bau der Pyrimidine in die Nueleins~iuren erfolgt entweder in Form der Nueleoside oder ebenfalls dureh Totalsynthese, wobei diese etwas anders zu verlaufen seheint als bei den Purinen, da das C-Gerfist des Glyko- kolls nieht verwertet wird.

Jederffalls kann heutzutage mit Sieherheit angenommen werden, da/3 in der Zelle ein lehhafter Stoffweehsel der Nucleinsi~uren bzw. der Nueleoproteide sich vollzieht, wobei sowohl ein Aufbau wie aueh ein Umbau dieser Substanz stattfindet. Bei diesen Vorg~ingen werden fiber- all die kleinen Bausteine verwendet bzw. bewegt, so dal3 man verardal~t wird, Analogien zu enzymatisehen Vorgiingen zu suchen. Die uns be- kannten Enzyme bauen in erster Linie hoehmolekulare Stoffe zu ihren niedermo/ekularen Bausteinen ab; nach einer allgemeinen Auffassung muB dieser ProzeB aueh nmkehrbar sein, so dal~ man annehmen k6nnte, da/3 aueh der Aufbau der hoehmolekularen S~offe aus ihren ]3austeinen dureh die Enzyme katalysiert wird. Leider sind unsere Kenntnisse fiber die Beteiligung der Enzyme an der Neubildung der hoehmolekularen Zellbestandteile wie fiberhaupt unsere Kenntnisse fiber den Meehanis. runs der ]3iosynthese dieser Ze]lbestandteile ~ul~erst mangelhaft. Die ,,Autoreproduktion" bei den Viren ist ein noeh unbekannter Prozel3, d e r n u r in Analogie zu unseren Vorstellungen fiber die Wirkung der Enzyme gedeutet wird.

Es ist a]Igemein anerkannt, dal3 die mMignen Gesehwfilste und das ffir sie eharakteristisehe Wachs~um auf einer besonders h~ufigen Mitose bernhen. Der Umsatz der DNP mul3 in den malignen Gesehwfilsten bedeutend h6her sein als im gesunden Gewebe. Man k6nn~e erwarten, dab in malignen Geweben Desoxyribonucleins~uren oder ihr Proteid mehr oder weniger lebhaft umgesetzt wird, wobei sowohl niedermole- kulare Bausteine wie aueh hShere Produkte der Depolymerisation auf- t reten mfissen.

Im naehfolgenden berichten wir fiber verschiedene Versuehe, mit denen wir derartige Depolymerisationsvorg~nge im Gewebe yon malignen Tumoren nachzuweisen versuchten. Als Substrat verwendeten wir ein DNP, dargestellt aus Kalbsthymus naeh tier Methode yon A. M. MA~Ko und G. C. BCTLEE 2, die es erlaubt, das DNP in sehr schonender Weise zu gewinnen, so dal3 es sieh woh] um das native unver~nderte Zel]kern- material handelt.

Wir verwandten das Proteid aus der Erw~gung heraus, dat3 man primer nieht sagen kann, ob die Depolymerisationsprozesse mehr den Eiweil3- oder den Nucleins~ureanteil des DNP betreffen; es kam uns aber daranf an, m6glichst~alle nur denkbaren Depolymerisationsvorg~inge in einer Versuchsordnung zu erfassen, wobei man sp~ter die wichtigsten

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Prozesse einer genaueren Analyse unterziehen konnte. Aul~erdem mfissen mit dem malignen Wachstum zusammenh~ngende Depolymerisations- vorg~nge doch irgendwie zuerst am intakten DHP beginnen.

Den Vorgang der Depo]ymerisation suchten wir durch Bestimmung eventuell auftretender niedermolekularer Bausteine des DNP zu erfassen, wobei wir verschiedene Methoden heranzogen. Als maligne Tumoren verwandten wir das Walker-Ratten-Carcinom, Jensen-I%atten-Sarkom und das EH~LICHsche M~use-Ascites-Carcinom, wobei mSglichst steril gearbeitet wurde. Bei den Walker- und Jensen-Tumoren, die oft sterile zentrale Hekrosen enthalten, wurden nur nekroseffeie Teile verwandt. In unseren ersten Versuchen verwendeten wir Scherenhomogenisate yon Tumorgewebe. Da diese aber zu ungleichm~l~ig waren, gingen wir dazu fiber, das Tumormaterial in einem kleinen mit der Hand betriebenen Glashomogenisator zu verarbeiten. Um schliel~lich den Einwand, da]~ dadurch die Zellstruktur zerstSrt wird, auszuschlie~en, haben wit in einer Reihe yon Versuchen mit M~use-Ascites-Carcinom, und damit mit einer Suspension lebender Tumorzellen gearbeitet. Es wurden in keinem Fall Tumoren verwandt, die ~lter waren als 12 Tage, da wit ja mSglichst aktive Tumorzellen haben wollten.

Im ailgemeinen wurden Inkubationsversuche mit verschiedenen Mengen Tumorgewebe und DHP bei 37 o und 6 Std durchgeffihrt (ge- legentlich wurden auch Parallelversuche mit 14 Std und 23 Std In- kubationszeit angesetzt). Wenn ausreichend Tumormaterial vorhanden war, wurden Parallelversuche mit steigenden Tumormengen angesetzt, wobei die kleinste, allgemein verwendete Menge 1 g Gewebe betrug. Die DHP wurde als kolloidale gullertige LSsung verwendet, die etwa 30 mg Gesamt-H in 5 cm 3 enthielt. Der Rest-H betrug etwa 7,4 mg-H in 5 cm abei F~tllung mit Trichloressigs~ure. Das gegenseitige Verh~ltnis yon Tumormaterial und DHP betrug 1 :5- -4 :5 und 1:1.

Zum Nachweis etwa entstandener Abbaustufen des DNP wurden folgende Methoden herangezogen:

1. Rest-N-Bestimmung nach KJELDAHL [Mikromethode nach PARKAS und W A G ~ mit der yon RAVEN und BUCHKAa: Z. f. angew. Chemie 60, 209 (1948), angegebenen Modifikation der Veraschung].

Zur Bestimmung des Rest-H verwendeten wir 3 versehiedene Metho- den der Eiweifif~llung.

a) F~llung mit Trichloressigs~ure; b) F~llung nach Folin Wu; e) F~llung durch 2 rain langes Koehen. Wir w~hlten diese Arbeitsweise deswegen, weft bekanntlich bei den

verschiedenen Enteiwei[~ungsmethoden aui~er Eiwei~ in wechselndem Mal~e auch Abbauprodukte mitgef~llt werden. So unterscheidet sieh die F~llung mit Trichloressigs~ure yon derjenigen nachFolinWu dadurch,

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dal3 im Ietzteren Falle die hSheren Abbauprodukte stark gefallt werden, wahrend die Trichloressigs~ture im wesentliehen nur Eiweift und Pepton fiillt. Bei der Kochprobe bleiben die Peptone (oder besser biuret-positive Substanzen) in LSsung. Auf diese Weise hofften wir irgendwelehe Ab- bauprodukte, fiber deren MolekfilgrSge und Art man primer niehts aussagen kann, auf die eine oder andere Art zu erfassen.

2. Papierchromatographie. a) Ninhydrinf/irbung (Eiweil~e und Aminos~iuren); b) Purinf~rbung naeh ~{ICHL. [H. MICttL, Die NaturMssensehaften

23, 390, (1935).] 3. Papierelektrophorese, F/irbung mit Aminoschwarz (Eiweil3k5rpar). 4. Dilatometrisehe Methode naeh K. LINDEaswR6~-LANG 4. Als

Beispiel fiir unsere Methodik fiihren ~dr folgende 2 Varsuehe an: I. l0 Tinge alter WMkar-l~attentumor wurde naeh Entfernung der

nekrotisehen Teile im Glashomogenisator zerkleinert.

VersuchsansStze :

I. 1,0 g Tumor + 5 cm a DNP ~- 4,0 cm 3 NaCI' II. 1,5 g Tumor @ 5 cm a DNP -~ 3,5 cm 3 NaC1

6Std bei40 ~ III. 1,0 g Tumor ~ 9,0 cm a N~C1 IV. 5 cm a DNP ~- 5,0 cm 3 NaCl

Enteiwaigung durch Zugabe yon i0 cm a 7%iger Trichloressigs~ure.

Filtration. Je 5 cm 3 Filtrat nach KJELD~L 1 Std varascht. Ergebnis: I. 6,18 rag-N, II . 7,25 rag-N, I I I . 2,66 rag-N, IV. 4,03 mg-N.

I I I Jr IV = 6,69 mg-N = Learwert; I - - Leerwert = --0,512 rag-N; I I ---Leer-wart = 0,77 mg-N.

Es sind also keine N-haltigan Abbauprodukte aufgatretan, im Gagen- teil, es ist eine Maine Abnahme der Rest-N-Substanzen festzustellen. Kontrollversuche haben uns gezeigt, dab dies auf einer Adsorption an die ausfallenden Proteine beruht. Eine Neubildung yon f~llbaren Proteinanteilen oder ein Verbrauch findet nicht start, wie Kontroll- versuche unter Zusatz yon Aminos~uren gezeigt haben.

II . 11 Tage altar M~iuse-Ascites-Tumor-~ DNP im Verhaltnis 1:1 Brutzeit 6 Std bei 39 o C.

Naeh Inkubation wurde l0 rain bei 2000 rpm zentrifugiert, je 0,01 cm a 7 Std bei p~ 2 und Pn 12 der Papiarelektrophorese (Apparat naeh BENDER und HO]3EIN) bei ainar Spannung von l l 0 V unterworfen. Entsprachende Mangan reiner DNP und reinen Ascites ]iefen unter glei- then Bedingungen daneben. Die Chromatogramme der Leerversuehe nach Farbung mit Aminosehwarz zeigten nur die Komponenten des Hauptversuches, neue Anteile waren nicht zu erkennen.

Das Ergebnis unserer zahlreichen Versuche war ant~mtigend: Mit keiner der angewandtan Methoden war das Auftreten irgandweleher

70 WALDE:S//AR KUTSC~tER und KAR~ Ec~.~s:

Zerfallsprodukte nachzuweisen, weder niedermolekularer Abbaustufen wie Aminosiiuren oder Purine oder Primidine, noch yon Peptiden oder Nucleotiden und nicht einmal eiweii~hnlicher hShermolekularer Pro- dukte. Da die angewandten Methoden teilweise zu den empfindlichsten bekannten Methoden gehSren, glauben wir uns zu der Aussage bereehtigt, dal3 in den Zellen yon malignen Geschwfilsten eine mit den Methoden der klassisehen Enzymchemie mel3bare Depolymerisation yon DNP nicht stattfindet, und zwar weder an seinem Nueleins/iureanteil, noeh an der Eiweil3komp0nente. Selbstverst/~ndlich fiberzeugten wir uns bei jeder einzelnen neuen Methode dureh passend angesetzte Kontrollversuche davon, dal3 im Bereiche der Substratkonzentration unserer Ans~tze deutliche Aussehl/~ge auftreten miil3ten, wenn eine Desaggregation ein- getreten w/~re.

Dieses Ergebnis ist um so erstaunlieher, da der Zellkern reichlieh mit allen Enzymen ausgestattet ist, die zur Aufspaltung bzw. Synthese seiner biochemischen Bestandteile benStigt werden. Ihm fehlen dagegen alle Enzymsysteme der biologisehen Oxydation, die im Zellplasma und Mitoehondrien stattfindet. LA~G und Mitarbeiter 5 haben das Vorhanden- sein yon Kathepsin, Peptidasen, Ribonuclease und Desoxyribonuclease nachgewiesen; letzteres Enzym kommt sogar vollst/~ndig im Zelikern vor. In unseren Versuehen war aber aueh dieses Enzym im Homogenisat nieht wirksam. W e n n man aueh einwenden kSnnte, daI3 wir mit dem Proteid, und nicht mit der freien Desoxyribonueleins~ure gearbeitet haben, so heben wir andererseits hervor, dab weder eine Au~spaltung des DNP in Eiweil~anteil Und Nueleins/~ureantefl, noeh eine mel3bare Hydrolyse eines dieser beiden Antefle eingetreten war. Wenn man an- nimmt, daft Desoxyribonuclease, Kathepsin, Peptidasen usw. an den funktionellen Vorg/~ngen ira Zellkern beteiligt sind, so mul3 man dieses negative Ergebnis erstaunlieh finden: die Zellen der malignen Ge- sehwiilste, die durch zahlreiehe Mitosen charakterisiert sind, sollten besonders gfinstige Bedingungen ffir eine enzymatische Spaltung der DNP bieten. Wir bezweifeln daher die funktionelle Rolle dieser Enzyme bei den Vorg/~ngen der Zellteilung und glauben, dal3 sie im wesentlichen eine stoffwechselphysiologisehe Bedeutung besitzen. In diesem Zu- sammenhang Verweisen wir auf eine Untersuehung yon 1YI. WEBB~: hier wird gezeigt, dal3 die Desoxypentosenuelease versehiedener Gewebe ein Aktiviti~tsoptimum bei p~ 5,2 besitzt und beim NeutrMpunkt v61lig inaktiv ist. Sie wird dureh versehiedene Mitosegifte nieht gehemmt. Aus diesen Befunden wird der Schlul3 gezogen, dal3 die Desoxypentose- nuelease an der Regulierung der Mitose nieht beteiligt ist; es wird die Annahme ausgesproehen, dab dieses Enzym eine Funktion erst im Rahmen der Autolyse aus/ibt. Wir hal~en aueh diese Vermutung ffir durchaus mSglich.

Yersuche zur enzymatischen Depolymerisierung. 71

Zusammen/assung. Es wurde die enzymatische Spaltung yon Desoxyribonucleoproteid

dutch die Zellen verschiedener maligner Geschwfilste untersucht. Weder im Gewebebrei noch in einer Suspension maligner Zellen oder im Homo- genisat konnte ein Auftreten yon Spaltprodukten nachgewiesen werden. Es wird die Vermutung ausgesprochen, da.l~ die im Zellkern vorkommen- den Enzyme, wie Desoxyribonuclease, Kathepsin, Peptidasen usw. nichts mit den Vorg~ngen der Zellteilung zu tun haben, sondern entweder eine stoffweehselphysiologische Bedeutung besitzen oder erst im Ver- laufe der Au~olyse in Funktion treten.

Literatur. 1 :FLAsCHENTI~XGEI~, B., u. E. LEH-~ARTZ: Physiologische Chemie, Bd. I, S. 770,

1951. - - ~ MAI~:o, A. M., and G. C. ]~vrLn~: J. of Biol. Chem. 190, 165--176 (1951). a t~AWEZr H. M., u. M. BUCn~KA: Z. angew. Chem. 60, 209 (1948). - - a L~CDE~ST~O~r- LA~CG, K., L. WEIL u. H. HOLrE~: Hoppe-Seylers Z. 288, 174 (1953). - - 5 LA~cG, K. u. Mitarb. : Mikroskopische und chemische Organisation der Zelle, S. 24ff. Berlin: Springer 1952. - - 6 WEBB, ~ . : The Preparat ion and Properties of the Desoxy- pentosenucleases of Ca]f Thymus and Mouse Leukaemic Tissue, Exper. Cell Res. 5, 27 (1953).

Prof. Dr. Dr. W. Kursc~EE, (17a) Heidelberg, Chemische Abtei lung des Physiologisehen Inst i tutes.