Vorlesung Einführung in die Bioinformatik - U. Scholz & M. Lange Folie #4-1 Genom- und Proteomanalyse

Vorlesung Einführung in die Bioinformatik - U. Scholz & M. Lange Folie #4-1Genom- und Proteomanalyse

Genom- und Genom- und ProteomanalyseProteomanalyse


Begriffe (1)Begriffe (1)

Genom (Hans Winkler, 1920):- Gesamtheit der vererbbaren

Informationen einer Zelle- Speichermedium DNA- Kodiert die Ausprägungen

der spezifischen Eigenschaften eines Organismus

Genomics:- Erforschung des Genoms

Organismus Basenpaare

Escherichia coli 4,7*106

Saccharomyces cerevisiae

1,2*107

Drosophila melanogaster

1,3*108

Homo sapiens sapiens 3*109

Arabidopsis thaliana 1,2*108

Hordeum vulgare 4,8*109

Triticum aestivum 1,6*1010


Begriffe (2)Begriffe (2)

Proteom (Marc Wilkins, 1994):- Gesamtheit aller zu einem bestimmten Zeitpunkt

exprimierten Proteine eines Organismus

Proteomics:- Erforschung des Proteoms


GenomanalyseGenomanalyse

Genomanalyse: Ermittlung von funktionellen Bereichen (Genen) von Organismen

Ziel: Zuordnung von Funktionen zu genetischen Elementen

Einsatz der Bioinformatik zur Identifikation und Charakterisierung genetischer Elemente- z.B. Erkennung von Promotoren,

Transkriptionsfaktorbindungsstellen (TFBS) etc.


Sequenzierung kompletter GenomeSequenzierung kompletter Genome

1995: 1. vollst. sequenziertes Bakteriengenom Haemophilus influenza

neue Ära: alle Gene und regulatorische Bereiche 1998: erster Mehrzeller Caenorhabditis elegans Problem Größe der kodierenden Bereiche bei Eykaryoten:

- Mensch und Maus ca. 1,4% des Gesamtgenoms Mensch und Maus:

- 5% der Genome hoch konserviert- aber mehr als 80% orthologe Gene bzw. Proteine

Einschub (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/Orthology.html):

Homologous sequences. Orthologs and Paralogs are two typesof homologous sequences. Orthology describes genes in different species that derive from a common ancestor. Orthologous genesmay or may not have the same function. Paralogy describeshomologous genes within a single species that diverged by gene duplication.


Sequenzierung kompletter GenomeSequenzierung kompletter Genome

1995: 1. vollst. sequenziertes Bakteriengenom Haemophilus influenza

neue Ära: alle Gene und regulatorische Bereiche 1998: erster Mehrzeller Caenorhabditis elegans Problem Größe der kodierenden Bereiche bei Eykaryoten:

- Mensch und Maus ca. 1,4% des Gesamtgenoms Mensch und Maus:

- 5% der Genome hoch konserviert- aber mehr als 80% orthologe Gene bzw. Proteine

Einschub (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/Orthology.html):

Homologous sequences. Orthologs and Paralogs are two typesof homologous sequences. Orthology describes genes in different species that derive from a common ancestor. Orthologous genesmay or may not have the same function. Paralogy describeshomologous genes within a single species that diverged by gene duplication.


Genomcharakterisierung mit STS Genomcharakterisierung mit STS

STS - Sequence Tagged Sites: Orientierungspunkte z.B. im menschlichen Genom

kurze DNA-Sequenzen mit Länge von 200 – 500 Basenpaaren STS kommt nur einmal im Genom vor! Ort und Basissequenz bekannt Marker für Kartierung von Chromosomen bzw. Genom Generierung von STS durch PCR DNA-Klone können durch DB-Suche auf Existenz von passenden

STS durchsucht werden und anhand dieser Information auf Chromosomen bzw. in Genomen positioniert werden.

-> präzise physikalische Karte seit 1994 eigene DB am NCBI: dbSTS

- Name, Sequenz für Amplifikation, Größe des PCR-Produkts, Sequenz, …


EST = Expressed Sequence TagsEST = Expressed Sequence Tags

„Endeckung“ neuer Gene durch ESTs wird 1991 erkannt cDNA-Clone stammen von exprimierten Genen ab -> Name Generierung von ESTs durch Sequenzierung der cDNA von

beiden Enden viele Projekte zur EST-Sequenzierung -> Hochdurchsatz aber auch Kritik:

- schlechte Qualität durch single Run und automatische Generierung:Substitutionen und Insertionen/Deletionen -> Frameshifts (Verschiebung von Basentripletts; Kodierung anderer Aminosäuren)

- schlechte Qualität in internationalen Nukleotidsequenz-DBs- keine regulatorischen Elemente

NCBI: dbEST und Unigene TIGR: Gene Indicies


EST - SequenzierungsprojekteEST - Sequenzierungsprojekte

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Zellen, Gewebe, Organismus


QualitätsmerkmaleQualitätsmerkmale

Anwendung folgender Kriterien beim Trimming:- Mindestlänge der ESTs- Anzahl von Ns im Gegensatz zu

eindeutig identifizierten Nukleotiden (A/T/G/C)

- Quality Scores des SequenzierautomatenMaß für Sequenzqualität jedes einzelnen Nukleotids

- Kontamination mit Vektor- oder Bakterien-DNA




ZwischenergebnisseZwischenergebnisse

Sammlung von ESTs mit- unterschiedlicher Länge und- zufälliger Auswahl von cDNA-Sequenzen

aber auch ESTs von gleichen Transkripten besonders von hoch exprimierten Genen

Existenz von Redundanz Reduzierung durch Assemblierung und Alignments

aus ähnlichen ESTs Ergebnis sind Konsensussequenzen bei großen EST-Projekten vorher Clustern

- Zusammenfassung in Gruppen von EST mit identischen Nukleotiden in einem Bereich

- danach stringenteres Assemblieren und Alignen


ESTs, Contigs und ESTs, Contigs und KonsensussequenzenKonsensussequenzen

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Beispiel für Komplett-Software StackPACK™ Beispiel für Komplett-Software StackPACK™ http://www.egenetics.com/stackpack.htmlhttp://www.egenetics.com/stackpack.html


StackPACK™: Anwendung in CR-ESTStackPACK™: Anwendung in CR-EST


StackPACK™ - Ein ProblemfallStackPACK™ - Ein Problemfall


ESTs und die Identifizierung unbekannter ESTs und die Identifizierung unbekannter GeneGene

Annotations- und Sequenzsuchen gegen DBs BLASTX mit allen 6 Leserahmen: Achtung! Berücksichtigung von:

- Scores, E-Values, Identität, …- Beispiel: siehe Übung zu Sequenzvergleichen

weiterhin Motiv-Suche (Interpro): Unterscheidung der Sequenz aufgrund definierter Eigenschaften

zusätzliche Methode: ab-initio-Verfahren:- suchen nach Signalen in Sequenz:

• Translationsstart und -stop, • Exons/Introns, • Poly-Adenylierungssignal• 5‘ und 3‘ UTR• …

- Analysierung der Zusammensetzung der Sequenz• ORFs• G/C-Gehalt


Coding and Non-CodingCoding and Non-Coding

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Alternatives SpleißenAlternatives Spleißen

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Identifizierung neuer Mitglieder von Identifizierung neuer Mitglieder von ProteinfamilienProteinfamilien

© P.M. Selzer, R.J. Marhöfer, A. Rohwer: Angewandte Bioinformatik – Eine Einführung. Berlin et al: Springer Verlag, 2004.


Hyperlinks zwischen DatenbankenHyperlinks zwischen Datenbanken

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DBOra: Eine integrierte Datenbank DBOra: Eine integrierte Datenbank zur Annotationzur Annotation

integrierte relationale Datenbank Protein – Pathway – Literatur – Krankheits –

Beziehungen Import basiert auf BioDataServer GUI: http://pgrc.ipk-gatersleben.de/DBOraWeb/

Suchmöglichkeiten:• Text (Wortstamm, phonetisch, fuzzy, ...)

• AA (lokales BLASTP)

• NA (lokales BLASTX)

Navigation verwendet Schlüssel-Fremdschlüssel-Beziehungen

Erreichbarkeit ist vorberechnet

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DBOra: Technische ParameterDBOra: Technische Parameter

Datenbank-Schema:- 81 Tabellen- 85 Fremdschlüssel

Datenbank-Import:- SwissProt, TrEMBL, BRENDA, KEGG, OMIM- ~ 35 Millionen Einträge- ~ 6 GByte Daten

Index:- 381 Indizes- 5 GByte Textindizes- 836.013 AA-Sequenzen für BLAST-Vergleiche

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DBOra: Datenbank-Schema (I)DBOra: Datenbank-Schema (I)

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• Protein-Eigenschaften

• Literatur-Referenzen

• Krankheiten

• Enzymatische Funktionen

• Datenbank-Querverweise


DBOra: Datenbank-Schema (II)DBOra: Datenbank-Schema (II)

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EnzymatischeFunktionen


DBOra: Prozess der automatischen DBOra: Prozess der automatischen EST-AnnotationEST-Annotation

EST Blast Hits

DBOra Search

retrieval of allpossible data linksusing precomputed

„Reverence Spanning Graphs“

KEGG EC-No.

Retrieve KEGG EC Numbers

Mapping to KEGG Metabolic Pathways

KEGG MetabolicPathways

Assign Data to

DBO

ra Tables

DDBJ

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SWISS-PROT

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PIR

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DBOra: DBOra: Input CR-EST BLASTX Hit Description Input CR-EST BLASTX Hit Description


DBOra: DBOra: Result KEGG Pathway MappingResult KEGG Pathway Mapping


DBOra: Ergebnis der automatischen DBOra: Ergebnis der automatischen EST-AnnotationEST-Annotation

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Annotationen in CR-ESTAnnotationen in CR-EST


ProteomanalyseProteomanalyse

Messung von „mRNA“ für Aussagen zu Proteinen nicht ausreichend zum Verstehen von komplexen biologischen Systemen

Beispiel: Stoffwechselwege werden durch Proteine und nicht durch Gene (des Genoms) oder mRNA (des Transkriptoms) gesteuert!

auch Hochdurchsatzverfahren zur Proteom-Analyse:- klassische oder quantitative Proteomics:

• Identifizierung und Quantifizierung der Proteine

- funktionelle Proteomics:• Funktionen der Proteine finden


Klassische ProteomicsKlassische Proteomics

Ähnlichkeit zu Expression Profiling -> Protein Profiling exprimierte Proteine repräsentieren molekularen Fingerabdruck

einer Zelle Vergleich mehrerer „Fingerabdrücke“ -> Identifizierung

differentiell exprimierter Proteine (aber auch Gene) Protein Profiling erkennt:

- Proteine mit zellulären Funktionen- Messung quantitativer Veränderungen in Proteinzusammensetzung- postranslationale Veränderungen (Phosphorylierungen und

Glykosylierungen)- Proteinzusammensetzung von Zellkompartimenten

Protein Profiling erkennt nicht:- unlösliche Proteine- Transmembranproteine- schwach exprimierte Proteine


2D-Gelelektrophorese & 2D-Gelelektrophorese & MassenspektroskopieMassenspektroskopie

Kombination der beiden ist gängiges Verfahren zum Protein Profiling

2D-Gelelektrophorese:- Proteine eines Zellextrakts in Polyacrylamidgel (Trennmatrix) mit

geignetem Puffer ladungsabhängig in elektrischem Feld auftrennen- Nutzung von 2 Eigenschaften:

• Ladung• Masse

- Bsp: Protein Cytochrom enthält viele basische Aminosäuren und ist bei neutralem pH-Wert positiv geladen

- Veränderung des pH-Wertes der Umgebung -> Änderung der Nettoladung des Proteins

- isolektrischer Punkt pI: negative und positive Ladungen eines Proteins sind gegenseitig aufgehoben

- wenn pH dem pI entspricht -> keine Wanderung des Proteins im elektrischen Feld


2D-Gelelektrophorese2D-Gelelektrophorese jedes Protein besitzt charakteristischem pI -> Auftrennung in pH-Gradienten mit Hilfe des elektrischen Feldes -> 1.

Dimension 2. Dimension: Auftrennung nach Molekulargewicht:

- Peptide mit geringerem Molekulargewicht wandern schneller hoch-auflösende 2D-Gele: bis zu 10.000 verschiedene Proteine nach Auftrennung Anwendung spezieller Färbeverfahren zur

Sichtbarmachung:- Silberfärbung- Fluoreszensfarbstoffe

Digitalisierung der Gele und Auswertung mit bioinformatischen Methoden (z.B. mit Melanie von Expasy):- Spotdetection- Vergleich mehrer Gele – Identifizierung gleicher Spots und Erkennung

unterschiedlicher Intensitäten- Normalisierung- statistische Auswertung

Ergebnis: Liste mit differentiell exprimierten Proteinen (Unterscheidung nach pI und Molekulargewicht)


Beispiel eines 2D-Gel-BildesBeispiel eines 2D-Gel-Bildes

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MassenspektroskopieMassenspektroskopie 2D-Gelanalyse nicht ausreichend Identifizierung eines unbekannten Proteins durch Bestimmung von

Teilen der Aminosäuren-Sequenz Vergleich dieser Sequenz mit Protein-DB (aber auch DNA-DB) Anwendung bei der massenspektroskopischen Analyse von Peptiden

durch Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation – Time of Flight (MALDI-TOF)

sensitive Technik -> Proteinmengen im Pikomol-Bereich (10-12) ausreichend

Vorgehensweise:1. Spots aus 2D-Gel ausschneiden2. Inkubation mit Proteasen (z.B. „Schneiden“ mit Trypsin)3. Ergebnis sind spezifische Peptidmuster4. Isolierung dieser aus Gel 5. Analyse mittels Massenspektroskopie6. jedes Peptid wird durch spezifisches Massenspektrum repräsentiert


MALDI-TOF von BrukerMALDI-TOF von Bruker


Identifizierung durch Vergleich von Identifizierung durch Vergleich von experimentell ermittelten und experimentell ermittelten und theoretischen Massenspektrentheoretischen Massenspektren

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Weiterentwicklung der Weiterentwicklung der MassenspektroskopieMassenspektroskopie

Nachteil bei MALDI-TOF:- zur eindeutigen Identifizierung eines Proteins sind

Messungen mehrerer Massenspektren notwendig

Neuentwicklungen:- Tandem-Massenspektroskopie:

• direkte Bestimmung eines Teils der Aminosäure-Sequenz

• partielle Sequenz reicht für eindeutige Identifizierung in Protein-DB aus

- Elektrospray-Ionisations-Quadruploe-TOF-Spektroskopie:• sensitive und akkurate Analysen von posttranslationalen

Modifikationen


Funktionelle ProteomicsFunktionelle Proteomics

z.B. Suche nach Protein-Protein-Interaktionen

durch solche Interaktionen Vermittlung vieler zellulärer Prozesse

Beispiele:- Yeast Two-Hybrid System- Protein-Arrays:

a) Sandwich Assaysb) Antigen Capture Assayc) direktes Assay

…

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Vorlesung Einführung in die Bioinformatik - U. Scholz & M. Lange Folie #4-1 Genom- und Proteomanalyse