Vortrag MH 2012.ppt [Kompatibilitätsmodus] · 2013. 6. 18. · Schwämme (Porifera) Axinella Bubaris Corallistes Halichondrida Erylus Higginsia Scleritoderma Hamburg 14. Juni 2013

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Hamburg14. Juni 2013

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L E B ENSM I T T E LCHEM I E HAMBURG | F E S TVERANSTA LTUNG14 . J u n i 2013

COMPETENCE FOR FOODAWARDS 2012


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Washington DC

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U.S. Food and Drug Adminstration


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U.S. Food and Drug Adminstration

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DEVELOPMENT OF A MOLECULAR SUBTYPING METHOD &

PHYLOGENETIC AND GENETIC ANALYSIS OF VIBRIOISOLATES ASSOCIATED WITH MARINE SPONGE


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Gattung Vibrio

Vibrionaceae 91 Spezies

Gram‐negativ

Fakultativ anaerob

Stäbchenförmig

Polar begeißelte Bakterien

Halophil (salzliebend)

Natürlicher Bewohner der Meeresumwelt

Gelangen über Muscheln, Krebse und Fische in die Nahrungskette des Menschen

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Gattung Vibrio

Pathogen für Menschen, Fische, Korallen und Krusten‐ und Schalentiere

USA: jährlich 8028 Vibrio‐Infektionen (davon 5218 Lebensmittelinfektionen)

In Europa treten Vibrio‐Infektionen seltener auf

Erkrankungen an Vibrionen bedingten Wundinfektionen in

Mecklenburg‐Vorpommen, Schleswig Holstein, Dänemark,

Südschweden und den Niederlanden


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Gattung Vibrio

Gastroenteritische Infektionen

Wundinfektionen

Sepsis

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Gattung Vibrio

Verzehr von rohem oder unzureichend gegarten Meeresfrüchten oder kontaminiertem rohen Fisch

Sushi Garnelen Austern


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Vibrio cholerae

Weltgesundheitsorganisation schätzt 3‐5 Millionen Cholera‐Infektionen mit 100.000‐120.000 Toten jährlich

Haiti: Oktober 2010 ‐ Oktober 2011 464.000 Infektionen und

6.500 Tote

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Vibrio cholerae Ausbruch Hamburg 1892

16.956 Infektionen und 8.605 Tote


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Vibrio vulnificus

50% Gesamtmortalität

USA 237 von 459 erkrankten Personen sterben jährlich

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Vibrio parahaemolyticus

Weltweit bedeutendster Krankheitserreger im Zusammenhang mit Meeresfrüchten

USA: 4.500 Infektionen, davon 2.800 verursacht durch den Verzehr von rohen Austern

2005: erstmalig Infektionen durch ursprünglich aus Alaska stammende Austern

500‐800 Ausbrüche pro Jahr in Japan; ca. 10.000 Menschen/a betroffen


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Gattung Vibrio

Gefahr von Vibrio‐Infektionen nimmt durch die Erhöhung der Wassertemperaturen zu ( Klimaveränderung?)

Zunahme des Verzehrs und des Handels mit Fischereiprodukten und Meeresfrüchten erhöhen das Risiko für Vibrio‐Infektionen

Entdeckung neuer Vibrio Spezies

Ausgeprägte Homologien: 16S rRNA Gen Sequenzierung kann eine Unterscheidung aller Vibrio Spezies nicht mehr gewährleisten

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Zielsetzung

Entwicklung eines Nachweisverfahrens Zuverlässig

Schnell

Einfach

Verfahren muss allerdings in der Lage sein, alle Vibrio Spezies zu differenzieren


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Intergenic Spacer Region (ISR1)

16S, 23S und 5S rRNA Gene sind aufgebaut als ein Operon

ISR1 trennt 16S und 23S rRNA, ISR2 trennt 23S und 5S rRNA

rRNA ist hochkonserviert während ISR variabel ist

Vibrionen besitzen mehrere Kopien dieses Operons

Variable Länge der ISR kann für Identifizierungs‐ und Evolutions‐Studien genutzt werden

rRNA 23SISR1rRNA 16S rRNA 5SISR2

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Vibrio parahaemolyticus ISR 1 PCR product (bp)

782 640 637 544 819 391 391 391 637 782


782 640 637 544 819 391 391 391 637 782 814


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PCR Amplifikation des ISR1


782 640 637 544 819 391 391 391 637 782 814

MW (bp)

1,500

1,000900800700600

500

400

300

200

100

V p

782 640 637 544 819 391 391 391 637 782 814

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69 Vibrio Isolate (48 verschiedene Spezies)

-80 °C


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MW (bp)

1,500

1,000900800700600

500

400

300

200

100

V p

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V.c. V.c. V.c. V.c.V.v. V.v. V.v. V.v.V.p. V.p. V.p. V.p.

1. Durchgang 2. Durchgang 3. Durchgang 4. Durchgang


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Zusammenfassung

ISR Typisierungs‐Methode Vermeidung von zeitaufwändiger Agarose‐Gelelektrophorese

Hohe Sensitivität und hohe Spezifität

Kann Vibrionen auf Spezies Level differenzieren

Anwendung Charakterisierung von Ausbruch‐Stämmen und anlegen einer Datenbank

Untersuchung von Kulturen aus Umwelt‐ und Lebensmittel‐Proben

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Gattung Vibrio

In aquatischer Umgebung

Eukaryotischer Wirt: Korallen, Schalentiere, Zooplankton und Schwämme

Schwämme


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Submarine

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Schwämme (Porifera)

Axinella

Bubaris

Corallistes

ErylusHalichondrida

Higginsia

Scleritoderma


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Zielsetzung

Identität der Vibrionen aus Schwämmen bestimmen

Vergleich von phylogenetischen und genetischen Beziehungen von den schwamm‐assoziierten Vibrio‐Isolaten zu ihren entsprechenden Spezies von Küstengewässern

Methoden 16S rRNA Gen Sequenzierung

ISR‐Typisierung

Multilocus‐Sequence‐Analysis (MLSA) 6 Housekeeping‐Gene


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Sequenzierung

Alignment: Untereinanderstellen homologer Positionen von Nukleotidsequenzen verschiedener Sequenzstränge

Vibrio Isolate 1

Vibrio Isolate 2Vibrio Isolate 3Vibrio Isolate 4Vibrio Isolate 5Vibrio Isolate 6Vibrio Isolate 7Vibrio Isolate 8Vibrio Isolate 9Vibrio Isolate 10

Vibrio Isolate 12Vibrio Isolate 11

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Referenzstämme entsprachen nicht ihrer Deklaration

V. communis und V. owensii konnten der gleichen Art zugeordnet werden

Enthaltene Daten‐Matrizen weisen auf horizontalen Gentransfer (HGT) hin

Austausch von DNA Panmiktische Populationsstruktur

Ergebnisse


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Ergebnisse

Das Ökosystem Schwamm fördert die Artenselektion

Neue Spezies

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Kernäquivalent I Kernäquivalent II


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Neue Vibrio Spezies

Neue Spezies: Vibrio caribbeanicus

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Publikationen

• Hoffmann, M.,Monday, S. R., McCarthy, P. J., Lopez, J. V., Fischer, M. & Brown, E. W. (2013). Genetic and phylo‐genetic evidence for horizontal gene transfer among ecologically groups of marine Vibrio. Cladistics 29(1), 46‐64.

• Hoffmann, M., Monday, S. R., Fischer, M. & Brown, E. W. (2012). Genetic and phylogenetic evidence for misidentification of Vibrio species within the Harveyi clade. Lett Appl Microbiol 54, 160‐165.

• Hoffmann, M., Monday, S. R., McCarthy, P. J., Lopez, J. V., Whittaker P., NaumM., Fischer, M. and Brown, E. W., (2012). Vibrio caribbeanicus sp. nov., isolated from marine sponge Scleritoderma cyanea. Int J SystEvol Micr 62, 1736‐1743.

• Hoffmann, M., Fischer, M., Ottesen, A., McCarthy, P. J., Lopez, J. V., Brown, E. W. and Monday, S. R. (2010). Population dynamics of Vibrio spp. associated with marine sponge microcosms. ISME J 4, 1608‐1612.

• Hoffmann, M., Fischer, M. and Whittaker, P. (2010). Evaluating the use of fatty acid profiles identify deep‐sea Vibrio isolates. Food Chem 122, 943‐950.

• Hoffmann, M., Brown, E. W., Feng, P. C. H., Keys, C. E., Fischer, M. and Monday, S. R. (2010). PCR‐Based method for targeting 16S‐23S rRNA intergenic spacer regions among Vibrio species. BMC Microbiol 10:90.


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Dr. Eric Brown Dr. Steven Monday

Prof. Dr. Jose V. LopezNova Southeastern University

Dr. Peter J. McCarthyHarbor Branch Oceanographic Institute

Prof. Dr. Markus Fischer Dr. Paul Whittaker

Documents

Vortrag MH 2012.ppt [Kompatibilitätsmodus] · 2013. 6. 18. · Schwämme (Porifera) Axinella Bubaris Corallistes Halichondrida Erylus Higginsia Scleritoderma Hamburg 14. Juni 2013