Zeitschrift fiir die gesamte experimentelle Medizin 144, 210--216 (1967)

Zum Ammoniakstoffwechsel der Leber*

PETER GLOGNER

Medizinische UniversitEtsklinik Tfibingen (Direktor: Prof. Dr. H. E. BOCK) und Medizinische Poliklinik der Universit~t Marburg/Lahn (Direktor: Prof. Dr. reed.

G. W. L6H~)

Eingegangen am 30. Juni 1966

Summary. 1. The effects of ammonia, on carbohydrate metabolites and urea in the perfusion medium of isolated rat livers and the mechanism of ammonia extrac- tion were studied. The influence of ammonia on oxygen consumption and carbon dioxide formation from glucose-6-14C of rat liver slices was also investigated.

2. After ammonia addition the levels of a-ketoglutarate and pyruvate fall in the medium. Ammonia disappears rapidly and the urea concentration rises with a slight retardation. The results are discussed.

3. Reduced blood flow and/or elevated portal blood levels result in higher ammonia extraction, suggesting non ionic diffusion of ammonia into the liver cell.

4. In liver slices ammonia inhibits g]ucose-6-14C decarboxylation in the citric acid cycle considerally more, than O 3 consumption. I t is concluded that glucose is substituted by other substrates maintaining tissue respiration.

Zusammen/assung. 1. An isoliert perfundierten Rattenlebern und Leberschnitten wurden der Mechanismus der Ammoniakextraktion und der EinfluB yon Ammoniak auf den Kohlenhydratstoffwechsel untersucht.

2. Nach Ammoniakbelastung fallen Pyruvat und a-Ketoglutaratspiegel im Perfusionsmedium ab. Ammoniak wird sehr raseh aufgenommen, und der Harnstoff- spiegel steigt verz6gert an.

3. Gedrosselte Durchblutung und/oder steigende NHs-Konzentrationen in der vena portae steigern die Ammoniakextraktion.

4. In Leberschnitten hemmt Ammoniak die Glucose-6-14C-Deearboxylierung erheblich, w~hrend der 02-Verbrauch kaum beeinflul~t wird.

5. Die erhobenen Befunde werden diskutiert.

R u n d 25 % des t/~glieh im mensehl iehen Organismus gebi lde ten t t a r n - stoffs d i f fundier t in den 1Vfagen-Darmtrakt, wird durch ureaseha l t ige Bak- te r ien gespa l ten und ge langt als A m m o n i a k fiber die P fo r t ade r in die Leber [13]. Dor t wird A m m o n i a k in Harns to f f fibergeffihrt , so dal3 im per ipheren Blur ein sehr n iedr iger Spiegel yon 0 ,5 - -1 ,0 7/ml A m m o n i a k - St ickstoff mel~bar ist. Bekann t l i ch finder sieh eine Hype rammon i i im ie vorwiegend bei schweren Lebere rk rankungen . Sic is t wahrscheinl ich ffir die Bewul~tseinsst6rung Lebe rk ranke r ve ran twor t l i eh . Ff i r die Neuro-

* Der Deutsehen Forschungsgemeinschaft sei ffir die Unterstiitzung der Arbeit gedankt.

Zum Ammoniakstoffweehsel der Leber 211

toxiciti~t des Ammoniak sprechen auch in letzter Zeit gefundene Enzym- defekte im Harnstoffcyclus [2, 6], die mit Erh6hung des Blutammoniak- spiegels einhergehen.

Veranlassung fiir die folgenden tierexperimentellen Untersuchungen war die Frage, welche physikochemischen Mechanismen fiir die Ammo- niakaufn~hme in der Leberzelle verantwortlich sind, urtd wie Ammoniak don Kohlenhydratstoffwechsel der Leber beeinflugt. Da fiber a-Keto- glutars/~ure Tricarbonsi~ureeyelus und Harnstoffsynthese verknfipft sind (reduktive Aminierung dutch Ammoniak mit NADI-I zu Glutamins~ure bzw. oxydative Decarboxylierung zu Suecinyl-Coenzym A), k6nnen StS- rungen im Gleichgewieht des Kohlenhydratstoffweehsels dureh Am- moniak erwartet werden.

Methoden Angaben fiber die Technik der Perfusion iso]ierter Rattenlebern und Substrat-

bestimmungen finden sich in der vorangegangenen Arbeit [3]. Als Perfusionsmedium wurde modifiziertes Rinderblut verwendet.

Versuehe mit Lebersehnitten: Jeweils 100 mg Leberschnitte wurden in Warburg- GefEflen mit Tyrodel5sung, enthMtend 0,2% Glucose, m/100 Phosphatpuffer pH 7,4 und 1 ~z Ci Glucose-6-14C (RadiochemicM Centre, Amersham, England) 1 Std unter 02 bei 370 geschiittelt. Stoppen der Reaktion dureh Einkippen yon 3% Pereh]orsEure (Endkonzentration) und Auffangen des retinierten C02 in kleinen Plastikbehiiltern, mit 0,1 ml Hyamine, Packard. Diese EinsEtze wurden direkt in PlastikmeBgefEBe der Fa. Medipha, Geislingen/Steige, iibergeffihrt und in iiblicher Weise mit 15 ml- Scintillator (4 g PPO und 100 mg Dimethyl-POPOP, Packard/1 Toluol) ira Flfissig- keitsseintillationszi~hler der Fa. Nuclear Corp., Chicago, gemessen.

Ergebnisse

Wie frfiher gezeigt [3], vermag die isoliert perfundierte Rattenleber Ammoniak dem Medium zu entnehmen und den Blutspiegel w~hrend der Perfusion konstant niedrig zu hM~en. Nach Belastung mit hohen Ammoniumkonzentrationen lassen sich im Perfunda~ mehrere Ver~nde- rungen nachweisen (Abb. 1). Ammoniak wird mit groBer Geschwindig- keit yon der Leber extrahiert, so dab nach 10 rain weniger Ms 10% der vorgegebenen Menge nachweisbar ist. I)er in der Vorperiode anstei- gende a-Ke~oglutaratspiegel fi~llt erheblich ab. Die Ammoniakbelastung bewirkt auBerdem einen kurzfristigen Abfall der Pyruvatkonzentration, der sich rasch wieder ausgleicht (s. Diskussion). Zwischen Ammoniak- abfall und Harnstoffanstieg liegt eine zeitliche Verz6gerung.

Um den 1YIechanismus der Ammoniakextraktion zu studieren, wurden Belastungsversuche unter verschiedenen Durehblutungsgr5Ben und Blut- spiegeha durchgef~ihrt.

Wie aus Abb. 2 hervorgeht, nimmt bei kontinuierlicher ErhShung des arteriellen (portalen) Ammoniakspiegels die Elimination zu. Bei

212 P. GLOG~E~:

kons tan te r arterieller Ammoniakkonzen t ra t ion wird die E x t r a k t i o n gr6Ber, wenn die Durehb lu tung gedrosselt wird (Tabelle 1).

Bei 1/~ngerer Verweilzeit von Blur gleioher Ammoniakkonzen t ra t ion wird damit die Extraktion gr6Ber.

Abb. 1.

' f & ' | (NH4) ~ 804 (NH4)~. S04

N 35

L I T z/z z l~ZlZZ 1~,I :~__ 1~1 T

700 �9 I

##

~ ,qS -

~ 8Z,-

2 8 -

0 30 80 ,90 TZO 15-0 f80 rain

gunchflug ~l,/g lebeP/ rain

2 0 - ~

" X l g ~ •

~ zz I "~, I \ : ~ k ' N ' " / z # • I , , l -~ ~ / \', !

0 ]0 80 80 IZO 750

i NHz+)~ S04 (NH4)zS04 , l . /

_~..~.~'~'/

Substratkonzentrationen im Medium belastung (6,6 m M = 440 7/ml NHa-N )

; b'O rain

nach doppelter Ammonsulfet-

Tabelle 1. Ammonia~extraktion bei verschiedener Durchblutung und gleichem arteriellen Spiegel. n = 3

Durehflug Art. Spiegel NHa-N (y/ml) ml/g/min 7/ml NH3-N Extraktion

1,35 9,75 4- 0,76 3,82 4- 0,45 "~ 0,50 9,70 4- 0,50 1,75 4- 0,51 .~ p < 0,01

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Aus den Ergebnissen ist zu entnehmen, dab Ammoniak keinem Trans- portmechanismus, sondern lediglich der Diffusion folgt. Nach dem Fick- schen Diffusionsgesetz ist ni~mlich

ds d n = - - D . q . dx dr .

Bei gleichem D (Diffusionskonstante), Q (Querschnitt) und d x (Ab- stand) ist die Menge (dn) eines diffundierten Stoffes proportional der

3 # -

2#

Z I

Z

3 6 # ~q 72 75 18

rain nach Infus/onsbeg/n#

Abb. 2. Ammoniakextraktion der Leber in Abh~ngigkeR vom port~len Spiegel. Infusion wechselnder Ammonsulfatmengen in die Pfortader. Bestimmung der Konzentrationen yon Ammoniakstiekstoff portal und lebervenSs im Abstand yon je

3 min; [] portale Spiegel, �9 eliminierte Menge

Konzentrat ion und der Zeit. Die Bedingungen gesteigerter Ammoniak- elimination durch l&ngere VerweilzeR und Konzentr~tionserhShung sind erffilR.

U m den EinfluB von Ammoniak auf die Glucoseoxydation zu prfifen, wurden Isotopenversuche mit Leberschnitten durchgeffihr~ (Tabelle 2).

14 Tabelle 2. Atmung und Glucose-6- C-Decarboxylierung unter Ammoniak (2 Versuche, Drei/achbestimmungen)

Kontrolle d- NHa Hemmung (0,0, m) (%)

mm a O~/Std --89 --59 34 --88 --79 10

DP)/I/Std 1560 310 81 1510 360 76

214 P. GLOGN~R:

W~hrend die Atmung dureh sehr hohe Ammoniakkonzentrationen (entsprechend 1,6 - 105 y/ml 1NHa-N) nur geringffigig beeintr~chtigt wird, kommt es zu einer starken Hemmung der Glueose-6-C-Decarboxylierung im Tricarbons/~urecyclus.

Diskussion

Die Untersuchungen zeigen, dab der Ketoglutaratspiegel im Perfu- sionsmedium nach Ammoniakbelastung abf~llt. Das Verhalten spricht ffir die besondere Bedeutung der ]~eaktion :

Ketoglutarat Jr NADH -~ H + ~- NtI4+ ---- Glutaminat -~ NAD [4]

als ersten Schritt der Ammoniakmetabolisierung. a-KGS ist im Gegen- satz zu Lactat and Pyruwt [10] wahrscheinlich night frei diffusibel. Schwankungen in der Mediumkonzentration kSnnen daher nieht die intracellularen Verhaltnisse, sondern nur die fallende Tendenz unter Am- moniak wiedergeben.

Der kurzfristige und reversible Abfall der Pyruvatkonzentration nach Ammoniakbelastung l~l~t mehrere Deutungen zu. Zu diskutieren ist eine besehleunigte NAD-Reduzierung, wodurch Pyruvat rascher oxydiert werden k~nn. Denkbar ist much eine gesteigerte l~aehbildung yon a-KGS aus Pyruvat, wobei NAD nieht den limitierenden Faktor darstellt. We- niger wahrscheinlich ist eine erhShte Glutamat-Pyruvat-Transaminie- rung, da diese Oxalacetat liefern wfirde, dieses jedoch unter Ammoniak intr~eellul~r erheblich absinkt [9]. Die VerzSgerung zwischen Ammoniak- abfall und tIarnstoffanstieg laBt darauf schlieBen, dab zun~ehst inter- mediare, stickstoffhaltige Produkte, wie Glutamins~ure, Glutamin and Asparagins~ure,intracellnls angeh~uft werden, bevor Harnstoff entsteht.

Ammoniak liegt bei 37 o und p g 7,4 ganz iiberwiegend ~ls NH4+-Ion vor (pK ~ 9). Dieses kann die Zellmembran night passieren [7], so dab aus der Elektronenreaktion NH4+ = NH 3 -~ I-I+ entsprechend den Gleichgewiehtsbedingungen permeables Ammoniak nachgebildet werden muB. In der Zelle wird es reionisiert und im Stoffwechsel aufgenommen.

Aus den Untersuchungen geht ferner hervor, dab der Ammoniak- anstieg im Blur durch l~tngere Verweilzeit und somit grSBere Extraktion verhindert werden kann. Diese Bedingungen sind bei einer Oesophagus- varicenblutung mit plStzlicher Drucksenkung im Pfortadersystem anzu- nehmen. AuI~erdem mug die Ammoniakextraktion naeh eiwei~reiehen Mahlzeiten, bei denen portale Spiegel von 10--15 N 1NHs-N/ml beob- aehtet warden [5], erheblich ansteigen. Dadurch bleibt die periphere Ammoniakkonzentration im 1Normbereich.

Nach unseren Ergebnissen wird Ammoniak durch Diffusion in die Leberzelle aufgenommen. Diffusion mul~ gleichzeitig der gesehwindig- keitsbegrenzende Schritt der Ammoniakextraktion sein: Der Konzen-

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trationsgradient kann nur dann aufreehterhalten werden, wenn jedes in die Zelle eintretende Molekfil im Sboffweehsel assimiliert wird. Dies ist naeh den vorliegenden Untersuchungen der Fall. Der gleiche Meehanis- mus gilt naeh Ammoniakverteilungsstudien (Blur/Liquor) bei Leber- kranken [8] auch fiir das Zentralnervensystem. In beiden Organsyste- men erfolgt demnach eine rasehe Assimilierung yon Ammoniak, wobei der Leber durch die groBe Kapazi tgt zur t tarnstoffsynthese die Haupt- rolle zuf/~llt, endogenes und exogenes Ammoniak zu entgfften. Ftir die Ammoniakaufnahme im Gehirn kommt zus~tzlieh der Aufnahmeweg a-Ketoglutarat--> Glutaminat--> y-Aminobutters/iure in Betraeht [11]. Seine Bedeutung ist noeh nieht vSllig aufgekl/~rt. Wie aus den vorliegen- den Befunden hervorgeht, kann die ammoniakbedingte Herabsetzung der Glueose-6-Deearboxylierung im Tricarbons/~ureeyelus in der Leber kompensiert werden: Die Zellatmung wird kaum beeintr/~chtigt, sic diirfte damit dureh Einsehleusen niehtglyeolytischer Zwisehenprodukte aufreehterhalten werden.

I m Gegensatz zur Leber ist das Gehirn ganz tiberwiegend auf die Glu- coseoxydation angewiesen. Ein Entzug yon a-Ketoglutarat aus dem Tri- earbons/~ureeyelus dureh Ammoniak, wie er yon RECKNAGEL U. POTTER [9] ffir die Leber gezeigt wurde, muB fiir das Zentralnervensystem sehwer- wiegende Folgen haben, da die Veratmung niehtglyeolytischer Stoff- weehselprodukte nieht ins Gewieh~ f/tilt [14].

Somit ergibt sieh ein weiterer Gesiehtspunkt fiir die yon B~ssMA~ u. B~SSMA~ [1] vertretene tIypothese, dab BewugtseinsstSrungen Leber- kranker mit I typerammonigmie darauf zuriiekzuf/ihren seien, dab Am- moniak-Ketoglutars~ure aus dem Tricarbons~urecyelus entfernt und die Zellatmnng gehemmt wird.

Der Beweis, dab Ammoniakkonzentrationen, wie sie bei komat6sen Leberkranken im Blur beobaehtet werden, die Atmung der Ganglien- zellen hemmen, steht ]edoch noch aus.

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Dr. PETER GLOGNER Medizinische Universit~ts-Poliklinik 3550 Marburg/Lahn