ZUR BIOCHEMIE DER NIEDEREN ORGANISMEN

I. Mitteilung :

DER SCHUTZEFFEKT DES KASEINS BEI DER VERGIFTUNG YON BAKTERIEN MIT NIKOTIN

u H. LE01~ITJEW und E. TRUSCHINA (Aus der biochemischen Abteilung des Proteinforschungslaboratoriums in Moskau. Vorstand:

Prof. Dr. Hans Leontjew)

Mit 6 Tex~figuren

Eingegangen am 16. Dezember 1935

Einleitung Von dem zum Eindringen in das Protoplasma einzelliger und mehrzelliger

Organismen f~higen ehemischen Verbindungen linden dank ihrer spezifisehen Wirkung Beachtung am meisten die Alkaloide.

Obgleieh diese in hohem Grade giftigen Agentien seit langer Zeit das Objekt zahlreicher Untersuchungen bilden, ist niehtsdestoweniger der Meeha- n i smus des Effektes dieser Stoffe nut wenig bekannt. Der Versueh, die Wirkung der Alkaloide einer ehemischen Reaktion zwischen Protoplasma und Gift gleichzustellen, gestattet es nicht, sieh fiber den Weg zu orientieren, auf dem das Alkaloid sehnell und in fast unver/tnderter Form, wie bekannt, aus dieser Reaktion hervorgehen kann, wobei das Einwirkungsobjekt - - das lebende Protoplasma - - quasi im Ausgangsstadium bleibt.

Es ist daher ganz natfirlieh, dab einige Forseher als Gegengewieht zum ehemisehen Standpunkt bestrebt sind, den pharmakodynamisehen Effekt der Alkaloide p h y s i k o - e h e m i s e h zu interpretieren (1, 2). Die experimentelle Be- grfindung dieses Standpunktes wurde yon Traube (3, 4) begonnen, der annahm, dab die Ver/~nderung der Oberfl/~ehenspannung der wAsserigen L6sungen der Alkaloide den Hauptfaktor ihrer Giftigkeit bildet.

Nach der Ansieht yon Traube (5) spielt die ehemisehe Struktur und Konfiguration fiberhaupt eine geringere Rolle, als die physikalisehe Struktur, d. h. die Oberfl/tchenaktivit/it und dig versehiedenen mit ihr verbundenen Er- scheinungen (Quellung, Adsorption, Pr/~zipitation usw.).

Traub e wies auch darauf hin, dab geringe, zu w/~sserigen AlkaloidlSsungen hinzugeffigte Blutserum-Mengen die Oberfl/tchenspannung dieser LSsungen be- deutend herabsetzen.

Diese Beobachtungen yon Traube , und besonders die physiko-chemisehen Theorien der Wirkung der Alkaloide, im Zusammenhang mit den unl/~ngst be- schriebenen Versuchen fiber den Schutz yon Infusorien (7) und verschiedenen

14"

212 Leont jew und Truschina

Tieren (8) bei Vergiftung derselben mit Nikotin mittels eines Proteinstoffes (Kasein), waren die Veranlassung, die Untersuehung der Wirkung yon Alkaloid- 16sung auf B a k t e r i e n aufzunehmen, um so mehr als dieses Thema noch gar nieht bearbeitet wurde.

Itierbei sollten festgestellt werden: 1. die Bedingungen des Absterbens yon Bakterien in L6sungen f r e i e r Alkaloide und 2. das Verhalten derselben Bakterien in AlkaloidlSsungen mit Proteinstoff.

Experimenteller Teil

Die enorme Giftigkeit des 1-Methyl-2-/~-pyridfi-pyrrolidins (N iko t in s ) bedingte es, dag in erster Linie Versuche mit diesem Alkaloid ausgefiihrt wurden.

Als Objekte bei diesen Versuehen dienten folgende zwei Bakterien: 1. StaI~hylococcus albus t~osenbaeh (9) 2. Bacillus dysenterlae Shiga (10)

In Anbetraeht dessen, dag es praktiseh guBerst sehwierig ist, die phy- siologisehen Reaktionen an einem isolierten Bakterium zu studieren, so wurde d ie M e t h o d e de r K u l t u r e n, d. h. der Aussaaten auf Nghrboden einer gewissen, aus der Versuehsl6sung genommenen Bakterienmenge angewandt. Diese Methode sehlog die dureh die geringe GrSge der Bakterien gegebenen Sehwierigkeiten aus, bewahrte jedoch die M6gliehkeit der Vermehrung der zu untersuehenden Mikroorganismen, um ihre biologisehe Aktivit/it zu ermitteln.

Die gesamte Teehnik der Untersuehung der Wirkung des Nikotins auf die Bakterien bestand in einigen h6ehst einfaehen ganipulationen.

Es wurde vor Mlem eine Bakterien-Suspension in Ringer -L6sung her- gestellt. Als Ausgangsmaterial dienten frisehe (48 Stunden) Agarkulturen. Als- dann wurde die gewiinsehte Bakterienkonzentration im L6sungsvolum standard- mgBig hergestellt.

Hierauf wurde in die Ringer-LSsung (pH = 7,0), die eine bestimmte Anzahl Bakterien enthielt, Nikotin eingefiihrt, so dab eine L6sung (pH = 8,5) yon 1,25 : 100 erhalten wurde.

Alle Experimente wurden in sorgfgltig mit GummistSpfel gesehlossenen Prober6hren der gebrguehliehen GrSge im Thermostat bei einer Temperatur yon 35--380 C ausgefiihrt.

Die Versuehe ergaben, d~l~ Staphylococcus in einer Suspension yon 1 Milliarde in 1 Milliliter nach 24 Stunden, und bei 200 Millionen in 1 Milliliter naeh 4 Stunden abstirbt.

Diese Feststellung bedarf keiner weiteren Erkl~irung, da der Zusammen- hang zwisehen der Menge der B~kterien und der Menge des Giftes ganz klar zu ersehen ist. Die Sch~digung - - das vollst/~ndige Fehlen eines Waehstums (Kontrolle 72 Stunden) - - der Staphylocoeeen in der Ringer-LSsung mit Nikotin wurde durch ~Jbertr~gung einer 0se der Suspension in ein bestimmtes Volum (5 ml) frischer, kein Alkaloid enthaltender Ringer-L6sung und darauffolgende Aussaat in Pe t r i -SehMen mit Agar festgestellt (Photo 2), Die Kontrolle der Ausg~ngskultur wurde auf demselben Wege der i)bertragung und Auss~at aus-

Zur Biochemie der niederen Organismen. I P~13

gefiihrt und ergab (Photo 1) das gewohnte Bild des Wachstums dieser Bakterie auf gew6hnlichem Agar.

Im Gegensatz zu den Staphylococcen erwiesen sich die Dysenterie-Bazillen weniger widerstandsf~hig. Sie gingen schon naeh 1 Stunde (Photo 5) bei einer

Photo 1

Photo 2

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Konzentration der Aufsehwemmung yon 500 Millionen im Milliliter bei der gleichen Temperatur, in dem sich die Staphylococeen befunden hatten, zu- grunde. Die Kontrolle entsprach der in den Versuchen mit Stgphyloeoccen (Photo 4).

Photo 4

Photo 5

Zur Biochemie der niederen Organismen. I 215

Ganz entgegengesetzte Ergebnisse k6nnen leicht konsta t ier t werden, wenn man L6sungen yon , ,proteinsaurem" Nikot in n immt und darin Staphylococcen und S h i g a s c h e St~bchen unterbringt .

Zwecks Gewilmung eindeutiger Resul ta te bei der Herstel lung der L6sungen der , ,st6chiometrischen" (8) Verbindung yon Nikot in und Proteinstoff empfiehlt es sich als letzteren ein Spezialpr/~parat yon Kasein alms Kuhmilch zu nehmen (Tab. 1 und 2).

T a b e l l e 1

Chemische Indexe

Titrationszahl . . . . . . . . .

Oxydationszahl . . . . . . . .

Gesamtstickstoff . . . . . . . .

Amido-N . . . . . . . . . . .

Diamino-N . . . . . . . . . .

Monoamino-N . . . . . . . . .

Iiumin-N . . . . . . . . . . .

Tyrosin . . . . . . . . . . . .

Tryptophan . . . . . . . . . .

Experimentelle Daten

8,21 )

7,5 15,7% 1,72% 3,0~%

10,65% 0,1% 4,6% 1,v%

T a b e l l e 2

Methode

Direkte Titration (mit Phenolphtalein)

v. S tSnek (11) K j e l d a h l

H a u s m a n n in der Modifi- kation von T i m a n (12)

Weiss (13) Voisenet (13)

Physikalische Experimentelle Konzentration T - - r

]ndexe Daten der LOsung

Dichte . . . . . .

Viskositgt (Dyn/em) . . . .

Oberfl~ehenspan- nung (Dyn/cm) .

Refraktion . . . .

Elektrisehe Leit- fiihigkeit . . . .

Isopunkt . . . . .

1,0025

0,015

60,8 1,3350

49,88 • 10 _5 4,7

1% in einer dem Protein ~quiwlenten

NaOH- LOsung 180 C

Methode

Mikropiknometer yon A r n d t

Viskosimeter naeh Os twa ld

Stalagmometer naeh T raube

Refl-aktometer yon A b b 6

Kohl rausehsche Briicke

Ansflockung nach Michael is

Spezifisches Dre- 1% in 0,5 n Polarimeter yon hungsverm6gen . - - 62,2 NaOH Z eis s

Ein derartiges Kaseinpr/~parat 16st sich (in der Kalte) leicht in einer L6sung yon folgender Zusammensetzung: KC1, NaC1, K~HPO 4 a 1 g und H20 ----- 1000 ml und bei schwacher Erw/~rmung (40 ~ C) in einer Ringer-L6sung.

Diese L6slichkeit und die Titrat ionszahl (14) sind (Tab. l) die wichtigsten Verfahren zur Standardisat ion derart iger Kaseinpr/~parate.

1) Hiernaeh bestimmt sieh das ~quivalentgewieht dieses Kaseins gleich 1220.

216 Leontjew und Truschina

Das Rezept zur Herstellung des ,,kaseinsauren" Nikotins besteht darin, dub das abgewogene Kasein in eine geringe Menge einer warmen Ringer-LSsung gebraeht wird, in der eine entsprechende Dosis Nikotin (Merck) gel6st ist. Danach wird die Menge der Ringer-L6sung bis zur gewiinschten Konzentration des Alkaloids aufgefiillt. Die erhaltene kolloide LSsung (pH = 6,5) wird im Kochschen Apparat in zugeschmolzenen ProberShren aus Jenaer Glas sterili- siert. Die mehrfaeh wiederholten Aussaaten yon Staphy]ococcen und Dysenterie- st/~bchen, die sich in einer ~Lquivalenten L6sung yon Nikotin und Kasein befanden, gaben stets mit der Kontrolle (Kulturen in Ringer-L6sung) iiberein- stimmende Resultate (Photo 3 und 6).

Die Staphylococeen fiir diese Aussaat wurden nach einem 72sttindigen Anfenthalt in einer mit Kasein gebundenen Nikotinl6sung genommen, die Shigaschen St/~bchen jedoch naeh 5 Stnnden. Die Konzentration der Bakterien- suspensionen war die gleiche, wie in den Versuchen mit L5sungen des freien Nikotins.

Die Versuehe, die die Unseh/~dlichkeit der ,,~quivalenten" Verbindung yon Nikotin mit Kasein ftir zwei Arten pathogener Bakterien zeigen, stimmen gut mit den Ergebnissen der mit dem gleiehen Pr/s an Infusorien (7) und verschiedenen kalt- und warmbliitigen Tieren (8) ausgefiihrten Versuchen iiberein.

Was jedoch den naeh T r a u b e (4) zwischen der Oberfl/ichenspannung der Alkaloidl6sung und ihrer Giftigkeit bestehenden Zusammenhang betrifft, so ist diese Auffassung, wie die Versuche mit den Bakterien zeigen, fiir ,,kaseinsaures" Nikotin nicht anwendbar.

Die Oberfl/s des Systems R i n g e r - A l k a l o i d - Kasein (Tab. 3) ist geniigend niedrig, die LSsung an sich ist jedoch nicht giftig.

T a b e l l e 3

l System 1)

Indexe b ~ ~

I OberfI~chenspannung (Dyn/cm) . . . ] 73,0 Wasserstoffzahl . . . . . . . . . . . I 7,0

R + A

58,5 8,5

R + A + P

55,3 6,5

Das Fehlen einer Abh~ngigkeit zwisehen der Giftigkeit und der Ober- fl~tchenspannung wurde in allerletzter Zeit an einer Reihe verschiedener Alkaloide - - Papaverin- und Chininderivate - - festgestellt (15).

So besitzt das Perpagin (ein Papaverinderivat) schwache Giftigkeit, jedoeh hohe Oberfl~tchenspannung. Dagegen wurden bei einigen Chininderivaten bei fast gleieher Toxit~tt sehr grof3e Untersehiede in der Oberfl/~ehenaktivit~t gefunden. Die Untersuchungen anderer Verfasser (16) haben gleichfalls gezeigt, dag die Verringerung der Oberfl/ichenspannung bei einer alkalischen Kokain- 16sung mit Hilfe yon Octylalkohol nm' in sehr geringem Mage die St~trke der

1) R = Ringer-LSsung; P = Protein; A = Alkaloid.

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Wirkung dieses Alkaloids bedingt. Analoge Tatsaehen wurden auch fiir Chinin beschrieben (17).

AuBerdem lassen sieh die T r a u b e s e h e n Daten besonders sehlecht mit den sorgf~ltigen Versuehen yon T s u y o s h i S u z u k i (i8) in Einklang bringen, der

Photo 3

Photo 6

218 Leont jew und Trusch ina

die M6glichkeit feststellte, die Alkaloide in drei Gruppen naeh der Effektivit/~t der Anwesenheit yon Protein (Eialbumin) auf die Oberfl/~chenspannung der Pufferl6sungen dieser Alkaloide einzuteilen.

Papaverin, Narkotin und Hydrast in geh6ren zur ersten Gruppe, d. h. die Oberfl~Lchenaktivitgt der L6sungen dieser Verbindungen ver/indert sich durch die Anwesenheit des Proteinstoffes kaum. Kokain, Emetin, Chinin, Physo- stigmin, Veratrin u. a. z/~hlte er zur zweiten Gruppe. Die Anwesenheit des Proteinstoffes in schwachen LSsungen dieser Alkaloide ruft eine scharfe Erh6hung ihrer Oberfl/~chenaktivit/~t hervor. End]ich zur dritten Gruppe gehSren: Codein, Atropin, Bruzin, Nikotin und andere Alkaloide, die in sehwachen LSsungen (> 0,0032 m) oberfli~eheninaktiv sind, in Gegenwart des Proteinstoffes jedoeh Oberfl/~chenaktivit/~t erwerben. Oberhaupt kann man gegenw&rtig behaupten, dab die Ansichten von T r a u b e fiir die theoretisehe Interpretat ion des Mecha- nismus der toxischen Wirkung der Alkaloide nicht genfigen (19, 20).

Die Einffihrung des Begriffes der A k t i v i t / ~ t de r G r e n z s p a n n u n g an Stelle des Begriffes der O b e r f l / i c h e n s p a n n u n g ist woh] kaum imstande, diese oder jene mit der T r a n b e s e h e n Hypothese (21) verkniipfte Schwierigkeit zu beseitigen.

Zum Schlu6 mul~ daranf hingewiesen werden, dab unsere Versnehe, die die giftige Wirkung des Nikotins auf Staphyloeoecen und Dysinteriestiibehen, sowie die Unschgdliehkei~ des ,,kaseinsauren" Nikotins fiir diese Bakterien zeigten, im wesentlichen auf das Problem der Aufnahme der in das Protoplasma der lebenden Organismen eindringenden Stoffe stSi~t. Dies ist jedoch das bisher noch nicht gelSste Problem der Permeabilit~t.

Eine befriedigende Erkl/~rung des Meehanismus der Wirknng des Nikotins und seiner Verbindungen mit Proteinstoff auf die Bakterien, wird somit erst dann gegeben werden k6nnen, wenn dieses Problem im allgemehlen gel6st sein wird.

Sehluilfolgerungen

1. W/isserige LSsungen yon Nikotin (Merck) in der Konzentration yon 1,25:100 ftihren (bei einer Temperatur yon 35--38 e) zum Absterben yon Staphylococcus albus R. (in Aufsehwemmung) nach 24 Stunden.

2. Gleiche Nikotin]Ssungen ist fiir yon Bac. dysinteriae Shigg (Suspension) sehon nach 1 Stunde ]etal.

3. Die wiisserigen LSsungen der ,,/iqnivalenten" Verbindnng yon Nikotin mit Kasein sind selbst bei langer Einwirkung fiir beide Bakterienarten unseh~Ldlieh.

Literatur

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