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Aus dem Institut für Virologie Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztliche Hochschule Hannover Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest: Analysen der Blutgerinnungsstörungen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Sandra Blome aus Herne Hannover 2006

Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest: Analysen der ... · NaCl Natriumchlorid nAk neutralisierender Antikörper NaOH Natronlauge ND 50 Neutralisationsdosis 50 NF κB Nuclear

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Aus dem Institut für Virologie

Zentrum für Infektionsmedizin

der Tierärztliche Hochschule Hannover

Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest:

Analysen der Blutgerinnungsstörungen

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Sandra Blome

aus Herne

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Volker Moennig

1. Gutachter: Prof. Dr. Volker Moennig

2. Gutachter: Prof. Dr. Ingo Nolte

Tag der mündlichen Prüfung: 31.05. 2006

Das Promotionsvorhaben wurde gefördert durch ein Stipendium

des Evangelischen Studienwerks e. V. Villigst

Meiner Familie in Dankbarkeit

1 EINLEITUNG....................................................................................................... 1

2 LITERATURÜBERSICHT ................................................................................... 2

2.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest .............................................................................................. 2

2.1.1 Taxonomie ........................................................................................................................................... 2

2.1.2 Morphologie und Genomorganisation ................................................................................................. 2

2.1.3 Virale Proteine ..................................................................................................................................... 3

2.2 Die Klassische Schweinepest .................................................................................................................. 3

2.2.1 Übertragungswege und Epidemiologie ................................................................................................ 4

2.2.2 Verlaufsformen der Klassischen Schweinepest ................................................................................... 5

2.2.3 Pathologie ............................................................................................................................................ 8

2.2.3.1 Makroskopische Veränderungen ................................................................................................ 8

2.2.3.2 Mikroskopische und ultrastrukturelle Veränderungen................................................................ 9

2.2.4 Pathogenese........................................................................................................................................ 10

2.3 Virale hämorrhagische Fieber ............................................................................................................. 18

2.3.1 Klassische Vertreter ........................................................................................................................... 19

2.3.2 Pathogenese der viralen hämorrhagischen Fieber .............................................................................. 20

2.4 Hämostase und Hämostasekomponenten ........................................................................................... 23

2.4.1 Zelluläre Bestandteile ........................................................................................................................ 24

2.4.2 Endothel ............................................................................................................................................. 25

2.4.3 Das plasmatische Gerinnungssystem ................................................................................................. 26

2.4.3.1 Der extrinsische Aktivierungsweg............................................................................................ 27

2.4.3.2 Der intrinsische Aktivierungsweg ............................................................................................ 27

2.4.3.3 Gemeinsame Endstrecke und Regulation ................................................................................. 28

2.4.4 Fibrinolyse ......................................................................................................................................... 30

2.4.5 Diagnostik des plasmatischen Gerinnungssystems - Globaltests ....................................................... 31

2.4.6 Fibrinogenkonzentration .................................................................................................................... 32

2.4.7 Disseminierte intravasale Gerinnung ................................................................................................. 33

2.5 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems................................................................ 36

2.5.1 Direkt wirkende Antikoagulantien ..................................................................................................... 36

2.5.1.1 Hirudin...................................................................................................................................... 36

2.5.2 Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation bzw. –funktion ............................................................. 37

2.5.2.1 Acetylsalicylsäure..................................................................................................................... 37

2.5.2.2 Abciximab ................................................................................................................................ 37

2.5.2.3 Tirofiban................................................................................................................................... 38

2.5.2.4 Clopidogrel ............................................................................................................................... 38

3 MATERIAL UND METHODEN.......................................................................... 39

3.1 Tiere und Material................................................................................................................................ 393.1.1 Tiere und Versuchsaufbau.................................................................................................................. 39

3.1.2 Pharmakologisch wirksame Substanzen ............................................................................................ 44

3.1.3 Gewinnung und Aufbereitung der Blutproben................................................................................... 45

3.1.4 Viren .................................................................................................................................................. 45

3.1.5 Diagnostische Antikörper .................................................................................................................. 46

3.1.6 Zelllinien ............................................................................................................................................ 46

3.1.7 Sonstige Materialien .......................................................................................................................... 47

3.2 Methoden............................................................................................................................................... 48

3.2.1 Behandlung der Versuchstiere und klinische Parameter .................................................................... 48

3.2.1.1 Applikation und Dosierung der eingesetzten Pharmaka........................................................... 48

3.2.1.2 Bestimmung des Clinical Score nach MITTELHOLZER et al. (2000).................................... 48

3.2.1.3 Erfassung der Körpertemperatur............................................................................................... 49

3.2.1.4 Erfassung pathologisch-anatomischer Veränderungen............................................................. 49

3.2.2 Virologische Methoden...................................................................................................................... 49

3.2.2.1 Zellkulturtechnik ...................................................................................................................... 49

3.2.2.2 Virusvermehrung und Virusernte ............................................................................................. 50

3.2.2.3 Virusisolierung ......................................................................................................................... 51

3.2.2.4 Virustitration ............................................................................................................................ 52

3.2.2.5 Virusneutralisationstest ............................................................................................................ 53

3.2.2.6 Direkte Immunfärbung (Peroxidase-linked assay, PLA).......................................................... 54

3.2.2.7 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)......................................................................... 55

3.2.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR).............................................................................................. 56

3.2.3 Hämatologische Methoden................................................................................................................. 58

3.2.3.1 Parameter des weißen Blutbildes.............................................................................................. 58

3.2.3.2 Thrombozytenparameter........................................................................................................... 58

3.2.4 Hämostaseologische Methoden.......................................................................................................... 59

3.2.4.1 Prothrombinzeit (Quick-Test)................................................................................................... 59

3.2.4.2 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) ....................................................................... 60

3.2.4.3 Thrombinzeit ............................................................................................................................ 61

3.2.4.4 Fibrinogenbestimmung............................................................................................................. 62

3.2.4.5 Ethanol-Gelation-Test (EGT) ................................................................................................... 64

3.2.4.6 Thrombozytenaggregationstest................................................................................................. 65

3.2.5 Pharmakokinetik ................................................................................................................................ 67

3.2.6 Statistik .............................................................................................................................................. 69

3.2.7 Sonstige Methoden............................................................................................................................. 69

3.2.7.1 Ecarin Clotting Time ................................................................................................................ 69

3.2.7.2 Einzelfaktorenbestimmung....................................................................................................... 70

3.2.7.3 Histopathologische Untersuchungen ........................................................................................ 71

4 ERGEBNISSE................................................................................................... 73

4.1 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit KSPV- Stamm CSF0634 ............................... 73

4.1.1 Clinical Score und Körpertemperatur ................................................................................................ 73

4.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde ................................................................................................... 76

4.1.3 Histopathologie .................................................................................................................................. 76

4.1.4 Virus-, Antigen- und Antikörpernachweis ......................................................................................... 78

4.1.5 Hämatologische Parameter................................................................................................................. 79

4.1.6 Hämostaseologische Parameter.......................................................................................................... 84

4.2 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin ............. 93

4.2.1 Nachweis des therapeutischen PEG-Hirudinspiegels......................................................................... 93

4.2.2 Nachweis der Infektion ...................................................................................................................... 93

4.2.3 Entwicklung der Körpertemperatur.................................................................................................... 93

4.2.4 Dokumentation der klinischen Symptome ......................................................................................... 94

4.2.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde........................................................................... 96

4.2.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen ............................................................................. 98

4.2.6.1 Gesamtleukozytenzahl.............................................................................................................. 98

4.2.6.2 Thrombozytenzahl und Thrombozytenparameter..................................................................... 99

4.2.6.3 Hämostaseologische Parameter .............................................................................................. 101

4.3 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo .................................................................... 105

4.4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und ASS ................. 107

4.4.1 Nachweis der Wirkung..................................................................................................................... 107

4.4.2 Nachweis der Infektion .................................................................................................................... 107

4.4.3 Entwicklung der Körpertemperatur.................................................................................................. 108

4.4.4 Dokumentation der klinischen Symptome ....................................................................................... 108

4.4.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde......................................................................... 110

4.4.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen ........................................................................... 110

4.4.6.1 Gesamtleukozytenzahl............................................................................................................ 110

4.4.6.2 Thrombozytenzahl .................................................................................................................. 112

4.4.6.3 Hämostaseologische Parameter .............................................................................................. 113

5 DISKUSSION .................................................................................................. 116

5.1 Auswahl und Virulenz des KSPV-Isolates........................................................................................ 117

5.2 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 .............................................................. 117

5.3 Auswirkungen der Hemmung des plasmatischen Gerinnungssystems .......................................... 123

5.4 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung.............................................................. 124

5.5 Schlussfolgerungen ............................................................................................................................. 128

5.5.1 Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems und einer disseminierten intravasalen Gerinnung.... 128

5.5.2 Rolle der Thrombozyten und Thrombozyteninteraktionen .............................................................. 131

5.6 Ausblick ............................................................................................................................................... 134

6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................. 135

7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................ 139

8 ANHÄNGE ...................................................................................................... 167

8.1 Tabellen und Abbildungen................................................................................................................. 167

8.2 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Reagenzien ....................................................... 173

8.2.1 Zellkulturmedien.............................................................................................................................. 173

8.2.2 Lösungen und Reagenzien ............................................................................................................... 174

8.3 Sonstige Chemikalien ......................................................................................................................... 177

8.4 Pharmakologisch wirksame Substanzen........................................................................................... 178

8.5 Kommerzielle Reagenzien und Kits .................................................................................................. 179

8.6 Geräte und Gebrauchsgegenstände................................................................................................... 180

8.7 Verbrauchsmittel ................................................................................................................................ 183

8.8 Abbildungsverzeichnis........................................................................................................................ 185

8.9 Tabellenverzeichnis ............................................................................................................................ 187

DANKSAGUNG ..................................................................................................... 189

Abkürzungsverzeichnis

A. bidest. Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser

ADP Adenosindiphosphat

AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol

α alpha

α1-PI α1-Proteaseinhibitor

α2-AP α2-Antiplasmin

α2-MG α2-Makroglobulin

APACT automated platelet and coagulation tracer

aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit

ASP Afrikanische Schweinepest

ASPV Virus der Afrikanischen Schweinepest

ASS Acetylsalicylsäure

ATV adjusted trypsin-versen

BD Border Disease

BDV Border Disease Virus

BMHC-Zellen bone marrow hematopoietic cells

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

BVD Bovine Virus Diarrhoe

BVDV Bovines Virus Diarrhoe Virus

cDNA komplementäre DNA

CO2 Kohlenstoffdioxid

COX Cyclooxygenase

CS Clinical Score

CSFV Classical Swine Fever Virus, Virus der Klassischen

Schweinepest

Da Dalton

DIC disseminated intravascular coagulation, disseminierte

intravasale Gerinnung

DIF direkte Immunfärbung

DIN Deutsches Institut für Normung

Abkürzungsverzeichnis

DNA Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Didesoxynukleotidtriphosphate

ECT Ecarin Clotting Time

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EDulb EMEM modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN

EGT Ethanol-Gelation-Test

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

EMEM Eagle´s Minimum Essential Medium

et al. et alii, und andere

EU Europäische Union

EURL Europäisches Referenzlabor für Klassische Schweinepest

FKN fetale Kälbernierenzellen

FKS fetales Kälberserum

fl Femtoliter

g Erdanziehungskonstante

G Giga

GPIIb/IIIa Glykoprotein IIb/IIIa, Integrin der

Thrombozytenmembran

H2O Wasser

H2O2 Wasserstoffperoxid

HE Hämatoxylin/Eosin

HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung

HMWK High Molecular Weight Kininogen

i.v. intravenös

IL Interleukin

κ kappa

kb Kilobasen

KID50 kulturinfektiöse Dosis50

KSP Klassische Schweinepest

KSPV Virus der Klassischen Schweinepest

Lnn. Lymphonodi, Lymphknoten

log10 Logarithmus zur Basis 10

LPS Lipopolysaccharid

Abkürzungsverzeichnis

M Molarität

mAk monoklonaler Antikörper

µl Mikroliter

µm Mikrometer

min Minute

MW Mittelwert

N Normalität

NaCl Natriumchlorid

nAk neutralisierender Antikörper

NaOH Natronlauge

ND50 Neutralisationsdosis50

NFκB Nuclear Factor κB (Transkriptionsfaktor)

nm Nanometer

nt Nukleotide

NTR nicht-translatierte Region

OIE Office International des Èpizooties, internationales

Tierseuchenamt

ORF Open reading frame, offener Leserahmen

p.i. post infectionem, nach der Infektion

p.o. per os

Pa Pascal

PAF plättchenaktivierender Faktor

PAI Plasminogenaktivatorinhibitor

PALS periarterielle lymphatische Scheiden

PBS phosphate buffered saline

PBSM phosphat buffered saline minus

PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion

PEG Polyethylenglykol

PK(15)A Porzine Zelllinie, porcine kidney (15) Amsterdam

PLA peroxidase linked assay

pmol Picomol

PO Peroxidase

PPP platelet poor plasma, plättchenarmes Plasma

Abkürzungsverzeichnis

PRP platelet rich plasma, plättchenreiches Plasma

RNA Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

RT Reverse Transkriptase

RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction

sec Sekunde

SFT-R permanente Schafthymuszelllinie

TF Tissue factor, Gewebefaktor

TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor

TNF-α Tumornekrosefaktor α

t-PA tissue-type plasminogen activator

TXA2 Thromboxan A2

ut-PA urokinase-type plasminogen activator

VEGF vascular endothelial cell growth factor

VNT Virusneutralisationstest

vWF von-Willebrand-Faktor

1 Einleitung

Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine weltweit vorkommende, verlustreiche Tierseuche

mit großer handelspolitischer und ökonomischer Relevanz. Sie zählt zu den Krankheiten, die

beim internationalen Tierseuchenamt, dem Office International des Épizooties (OIE), und in

allen europäischen Staaten, anzeigepflichtig sind. Die KSP wird durch ein kleines, behülltes

RNA-Virus aus dem Genus Pestivirus hervorgerufen. Natürliche Wirte des Virus sind

ausschließlich Haus- und Wildschweine.

Die akute Verlaufsform der Infektion mit dem KSP-Virus (KSPV) geht mit den klinischen

Symptomen und pathologisch-anatomischen Befunden eines viralen hämorrhagischen Fiebers

einher, wie man sie auch bei Ebola- oder Hantavirusinfektionen des Menschen beobachten

kann. Bis heute ist die Pathogenese dieser Erkrankung nicht hinreichend geklärt.

Die klinischen Symptome der KSP wurden in den 1970er Jahren im Sinne einer

disseminierten intravasalen Gerinnung bzw. einer Verbrauchskoagulopathie gedeutet. In

jüngerer Zeit konnte jedoch gezeigt werden, dass andere Mechanismen beteiligt sind, und eine

Fehlregulierung des plasmatischen Gerinnungssystems, die mit der disseminierten

intravasalen Gerinnung gemeinhin verknüpft wird, nicht die Hauptursache für die Entstehung

der Blutungen zu sein scheint.

Im Rahmen dieser Arbeit sollen die pathogenetischen Mechanismen der Gerinnungsstörungen

sowie der Haut- und Organblutungen näher untersucht und charakterisiert werden. Zu diesem

Zweck wurden zwei Versuchsansätze gewählt, die die pharmakologische Intervention an

unterschiedlichen Stellen der Hämostase vorsahen.

2 Literaturübersicht

2.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest

2.1.1 Taxonomie

Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) wird mit den Erregern der Border Disease

der Schafe (BD) und der Bovinen Virus Diarrhoe (BVD) in das Genus Pestivirus der Familie

Flaviviridae eingruppiert (WENGLER et al., 1995; RICE, 1996; PRINGLE, 1999).

Zur Familie Flaviviridae gehören neben dem Genus Pestivirus die Genera Flavivirus und

Hepacivirus (PRINGLE, 1999). Das Genus Hepacivirus enthält ausschließlich das Virus der

Hepatitis C (BARTENSCHLAGER und LOHMANN, 2000). In das Genus Flavivirus sind

u. a. das Dengue-Virus, das Virus der Frühsommer-Meningoenzephalitis, das West-Nile-

Virus und das Gelbfiebervirus sowie das veterinärmedizinisch relevante Louping-Ill-Virus

eingruppiert. Einige dieser Erkrankungen können mit hämorrhagischen Symptomen

einhergehen. Zu den klassischen viralen hämorrhagischen Fiebern zählen u. a. das Dengue

Haemorrhagic Fever und das Gelbfieber (BRAY, 2005).

2.1.2 Morphologie und Genomorganisation

Das KSPV ist ein behülltes, ikosaedrisches RNA-Virus. Der Durchmesser des vollständigen

Viruspartikels beträgt zwischen 40 und 60 nm (HORZINEK et al., 1967; MOENNIG und

PLAGEMANN, 1992a; WENGLER et al., 1995).

Das Genom liegt in Form eines einzelsträngigen, linearen RNA-Moleküls vor, welches

Plusstrangorientierung besitzt. Das Genom besitzt eine durchschnittliche Länge von 12,5 kb

und kodiert in einem einzigen offenen Leserahmen („open reading frame“ - ORF) für ein

hypothetisches Polyprotein von ca. 4000 Aminosäuren, das sowohl post- als auch

kotranslational prozessiert wird. Nach den Prozessierungsschritten durch virale und zelluläre

Enzyme liegen elf virale Proteine vor. Der ORF wird von zwei nicht-translatierten Regionen

(NTR) flankiert (RÜMENAPF et al., 1991; COLLETT, 1992; RÜMENAPF et al., 1993;

MEYERS und THIEL, 1996).

2 Literaturübersicht 3

Abbildung 2-1: Genomorganisation von Pestiviren. Strukturproteine sind in dunkelblau,

Nichtstrukturproteine in hellblau dargestellt (modifiziert nach MEYERS und THIEL, 1996). Die

unterschiedliche Breite der Rechtecke symbolisiert ohne direkte oder indirekte Skalierung die

unterschiedlichen Längen der Proteine im Genom.

2.1.3 Virale Proteine

Das Genom kodiert vom 5´- zum 3´-Terminus für die Proteine Npro

, C, Erns

, E1, E2, p7,

NS2-3, NS4A sowie NS5A und NS5B (Abbildung 2-1). Zu den Strukturproteinen, die das

Viruspartikel bilden, gehören die Proteine C, Erns

, E1 und E2. Während das Core-Protein C

das Nukleokapsid bildet, besteht die Virushülle aus den Glykoproteinen Erns

, E1 und E2

(THIEL et al., 1991).

Das Nichtstrukturprotein Npro

ist charakteristisch für das Genus Pestivirus und besitzt

autoproteolytische Aktivität (WISKERCHEN et al., 1991; STARK et al., 1993; TRATSCHIN

et al., 1998). Die anderen Nichtstrukturproteine p7, NS2-3, NS4A sowie NS5A und NS5B

nehmen unterschiedliche, zum Teil nicht im Detail bekannte Funktionen in der

Virusreplikation wahr (MEYERS et al., 1989; GREISER-WILKE et al., 1992a; ELBERS et

al., 1996; STEFFENS et al., 1999; HARADA et al., 2000; TAUTZ et al., 2000).

2.2 Die Klassische Schweinepest

Die KSP zählt zu den wichtigsten Tierseuchen weltweit und ist daher sowohl in allen Staaten

der Europäischen Union (EU) als auch bei der OIE anzeigepflichtig. Das Virus ist weltweit

verbreitet, wurde jedoch in einigen Ländern erfolgreich bekämpft. So sind z. B. Australien

und Neuseeland sowie die USA KSPV-frei (VAN OIRSCHOT, 1999; EDWARDS et al.,

2000). Aktuelle Informationen wurden dem Handistatus der OIE entnommen

(http://www.oie.int/hs2/report.asp, besucht am 18.12. 2005).

5´ 3´

Strukturproteine

Npro C Erns E1 E2 p7 NS2-3 NS4A NS4B NS5A-B

NS2 NS3 NS5A NS5B

2 Die Klassische Schweinepest 4

Der Ursprung der KSP ist nicht genau festzulegen (VAN OIRSCHOT, 1999), ein Bericht des

Bureau of Animal Industry (United States Department of Agriculture) aus dem Jahre 1887

weist jedoch darauf hin, dass die KSP erstmals 1833 in Ohio, USA offiziell festgestellt wurde

(LIESS, 1981). Im Jahre 1903 wurde der Erreger als filtrierbares Virus nachgewiesen (DE

SCHWEINITZ und DORSET, 1904).

Natürliche Wirte des KSPV, die an KSP erkranken, sind ausschließlich Haus- und

Wildschweine (LIESS, 1981; LADDOMADA, 2000). Von subklinischen Infektionen wurde

auch bei Kälbern, Ziegen, Schafen, Hirschen und Pekaris berichtet (LOAN und STORM,

1968).

2.2.1 Übertragungswege und Epidemiologie

Unter natürlichen Bedingungen scheint die oronasale Infektion mit dem KSPV die wichtigste

Übertragungsroute darzustellen (DUNNE, 1970; PATON und GREISER-WILKE, 2003b).

Die künstliche Besamung bzw. der Deckakt stellen ebenfalls mögliche Infektionswege dar

(FLOEGEL et al., 1998; DE SMIT et al., 1999), was auch retrospektive Studien zum

Seuchengeschehen 1997/98 in den Niederlanden zeigten (HENNECKEN et al., 2000). Das

Virus wird im Verlaufe der Erkrankung mit allen Sekreten und Exkreten, wie Urin, Kot,

Speichel und Tränenflüssigkeit ausgeschieden und kann bei infizierten, tragenden Sauen die

Plazentarschranke überschreiten und somit die Feten in der Gebärmutter infizieren (DAHLE

und LIESS, 1992a; VAN OIRSCHOT, 1999).

Direkter Kontakt zwischen infizierten und empfänglichen Schweinen ist als Hauptweg der

Virusausbreitung anzusehen (RIBBENS et al., 2004). Sowohl die (illegale) Verfütterung nicht

ausreichend erhitzter Speiseabfälle als auch mechanische Vektoren wie Transportfahrzeuge

und Stallgeräte spielen bei der Verbreitung des KSPV ebenfalls eine Rolle (VAN

OIRSCHOT, 1999). Die retrospektive Analyse der KSP-Epidemie in den Niederlanden

1997/98 sowie die Quantifizierung der Übertragungsraten zeigten, dass dem Transport

lebender Tiere die größte Bedeutung zukam, gefolgt von Transportfahrzeugen und

Personenkontakt (STEGEMAN et al., 2002).

In Ländern mit endemischem KSP-Krankheitsgeschehen in der Wildschweinpopulation,

kommt dem Eintrag des Virus in Hausschweinbestände durch infizierte Wildschweine eine

wichtige Rolle zu (DAHLE und LIESS, 1992a; KADEN, 1998; KERN et al., 1999;

2 Literaturübersicht 5

LADDOMADA, 2000; FRÖLICH et al., 2002). Neben der oben erwähnten illegalen

Fütterung von Speiseabfällen ist der direkte oder indirekte Kontakt mit infizierten

Wildschweinen die häufigste Ursache für primäre KSP-Ausbrüche in Hausschweinbeständen

(FRITZEMEIER et al., 2000). Infizierte Wildschweine stellen daher eine ständige

Infektionsgefahr für die Hausschweinpopulation dar (MOENNIG, 2000).

2.2.2 Verlaufsformen der Klassischen Schweinepest

Die KSP kann mit einer Vielzahl von Symptomen einhergehen, die äußerst variabel auftreten

und kaum spezifisch sind. Die Ausprägung der Symptome wird durch verschiedene Faktoren

sowohl des Wirtes, als auch des Virus beeinflusst. So ist das Krankheitsbild stark vom Alter

der betroffenen Tiere abhängig. Weitere Faktoren sind die Virulenz des KSPV-Stammes

sowie Wirtsfaktoren, wie Immunstatus und Sekundärinfektionen (VAN OIRSCHOT, 1999;

MOENNIG et al., 2003). Die Inkubationszeit beträgt für das Einzeltier etwa eine Woche,

wobei zwei bis zehn Tage oder noch längere Zeiträume möglich sind.

Prinzipiell können drei Verlaufsformen der KSP unterschieden werden: Die akute, die

chronische und die pränatale Form. Unter Feldbedingungen sind diese Verlaufsformen nicht

immer gut zu trennen, da verschiedene Krankheitsbilder in einem Bestand nebeneinander

auftreten können (DEPNER et al., 1996a).

Akute Verlaufsform

Die akute Verlaufsform betrifft vor allem Absatzferkel und junge Mastschweine, wenn diese

mit moderaten oder hochvirulenten KSPV-Stämmen in Berührung kommen. Zu den ersten

Anzeichen der akuten KSPV-Infektion gehören hohes Fieber (häufig über 41°C),

Abgeschlagenheit, verminderte Futteraufnahme und Bindehautentzündungen (DUNNE,

1970). Viele Tiere stehen mit aufgekrümmtem Rücken und gesenktem Kopf, wenn sie

aufgetrieben werden (VAN OIRSCHOT, 1999) und legen sich rasch wieder ab, wobei sie

Wärme suchend in Stapeln aufeinander liegen. Geschwollene Lymphknoten, die vor allem in

der Leistengegend sichtbar werden, sowie Atemwegsbeschwerden wie Husten, Niesen und

Atemgeräusche treten hinzu. Während der ersten Phase des hohen Fiebers zeigen die

betroffenen Tiere häufig Erbrechen, Hyperämie der Haut und Verstopfung (VAN

OIRSCHOT, 1999). Im weiteren Verlauf tritt schwerer Durchfall auf. Im Verlauf der

2 Die Klassische Schweinepest 6

Erkrankung können zentralnervöse Symptome auftreten, die sich in Hinterhandschwäche,

unkoordinierten Bewegungen, Lähmungen oder Krämpfen äußern können (MOENNIG et al.,

2003). In der Spätphase der Erkrankung können punktförmige (Petechien) und flächige

(Ekchymosen) Blutungen in der Haut sowie unregelmäßig blaurote Verfärbungen an Ohren,

Schwanz und im Bereich der Gliedmaßen und des Unterbauchs auftreten (VAN OIRSCHOT,

1999; MOENNIG et al., 2003). Die betroffenen Tiere versterben in der Regel zehn bis 20

Tage nach der Infektion.

Labordiagnostisch ist eine schwere Leukopenie zu finden. Die dadurch bedingte

Immunsuppression ist verantwortlich für teils schwere Sekundärinfektionen der Lunge bzw.

des Magen-Darm-Traktes (SCHMIDT und KAADEN, 1968; VAN OIRSCHOT, 1999). Diese

Symptome überlagern häufig die typischen Schweinepestanzeichen, was unter

Feldbedingungen zu Problemen in der Diagnose führen kann (DEPNER et al., 1999;

MOENNIG et al., 2003). Neben der Leukopenie tritt eine schwere Thrombozytopenie auf

(DUNNE, 1970).

Bei letal verlaufenden KSPV-Infektionen werden keine oder nur geringe Mengen

neutralisierender Antikörper gebildet, die ggf. kurz vor dem Verenden der Tiere nachweisbar

sind (RESSANG, 1973a; LIESS et al., 1977; DEPNER et al., 1994).

Neben dieser typischen akuten Verlaufsform treten auch perakute und subakute bzw.

transiente Verläufe auf. Die perakute Verlaufsform kann bei jungen Ferkeln auftreten, die

nach einer kurzen Phase hohen Fiebers plötzlich versterben (DUNNE, 1970). Untersucht man

diese Tiere, sind in der Regel ausschließlich Schocksymptome zu verzeichnen

(TRAUTWEIN, 1988). Transiente, oft subklinische Verläufe, die mit der vollständigen

Genesung der Tiere enden, treten bei älteren Mastschweinen oder Zuchttieren sowie im

Zusammenhang mit schwach virulenten Virusstämmen auf. Nach einer kurzen Phase milder

klinischer Symptome bilden diese Tiere eine effektive Immunantwort aus. Während ein

Antigen- bzw. Virusnachweis in diesen Fällen zeitweilig möglich ist, deuten die klinischen

Befunde nicht auf eine KSPV-Infektion hin. Dieser Umstand hat zur Bezeichnung „atypische“

Verlaufsform geführt (DAHLE und LIESS, 1992b; DEPNER et al., 1996a).

2 Literaturübersicht 7

Chronische Verlaufsform

Die chronische Verlaufsform tritt auf, wenn die betroffenen Tiere nicht in der Lage sind, eine

adäquate und effektive Immunantwort auszubilden. Sie ist gekennzeichnet durch eine

Krankheitsdauer von mehr als 30 Tagen (MENGELING und PACKER, 1969) und ist häufig

mit moderat virulenten KSPV-Stämmen assoziiert (VAN OIRSCHOT, 1999). Während der

Erkrankung, die in diesem Fall einen protrahierten Verlauf nimmt, zeigen die Tiere

abwechselnd Phasen akuter klinischer Erkrankung und zeitweiliger Besserung (DEPNER et

al., 1996a; DEPNER et al., 1996b). Chronisch erkrankte Schweine können mehrere Monate

überleben, die Erkrankung endet jedoch immer tödlich (MENGELING und PACKER, 1969;

VAN OIRSCHOT, 1999). Unspezifische Krankheitszeichen wie Mattigkeit und Fressunlust,

wiederkehrende Fieberschübe, Hautveränderungen, chronische Darmentzündungen und

fortschreitende Auszehrung sind im Verlauf der Erkrankung zu verzeichnen. Jungtiere sind in

ihrer Entwicklung gestört und kümmern (VAN OIRSCHOT, 1999; MOENNIG et al., 2003).

Pränatale Infektion

Das KSPV ist in der Lage, die Plazentarschranke tragender Sauen zu überschreiten (VAN

OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977). Während die Infektion bei der Sau häufig mild oder

subklinisch verläuft, hängen die Folgen für die Feten vom Entwicklungsstadium und der

Virulenz des Erregers ab (MOENNIG und PLAGEMANN, 1992b). In der frühen Phase der

Trächtigkeit führt eine KSPV-Infektion meistens zu Aborten bzw. Totgeburten, aber auch zu

Mumifikationen und Missbildungen. Eine Infektion zwischen dem 50. und 70. Tag der

Trächtigkeit kann zur Geburt persistierend infizierter Ferkel führen (VAN OIRSCHOT und

TERPSTRA, 1977; MEYER et al., 1981). Diese Ferkel können bei der Geburt gesund

erscheinen, zeigen jedoch im weiteren Verlauf die so genannte Spätform („late onset“) der

KSP und verenden schließlich. Wachstumsstörungen, Kümmern, Bindehautentzündungen,

Hautentzündungen und Bewegungsstörungen stehen dabei im Vordergrund. An der Spätform

erkrankte Tiere können bis zu elf Monate überleben und scheiden konstant große Mengen an

Virus aus, was sie zu einer bedeutsamen Gefahr für andere Schweine werden lässt (VAN

OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977). Nach dem 85. Tag der Trächtigkeit infizierte Ferkel

werden i. d. R. nicht virämisch geboren (MOENNIG und PLAGEMANN, 1992b).

2 Die Klassische Schweinepest 8

2.2.3 Pathologie

2.2.3.1 Makroskopische Veränderungen

Die Ausprägung des pathologischen Bildes hängt vom Alter der Tiere, dem

Infektionszeitpunkt und vom involvierten KSPV-Stamm ab. Das typische pathologisch-

anatomische Bild der akuten KSPV-Infektion ist geprägt durch multiple Blutungen

unterschiedlichen Ausmaßes in nahezu allen Organen und durch Entzündungssymptome

katarrhalischen, fibrinösen und hämorrhagischen Charakters, die sich v. a. in der Lunge, im

Magen-Darm-Trakt sowie im Urogenitaltrakt finden (RÖHRER und PEHL, 1960). Die

Entzündungssymptome sind nicht selten die Folge sekundärer Infektionen (VAN

OIRSCHOT, 1999). RÖHRER und PEHL (1960) beschreiben das Sektionsbild als

hämorrhagische Septikämie, deren charakteristische Blutungen auf eine Permeabilitätsstörung

im Blutgefäßsystem hindeuten.

Die augenfälligsten Befunde treten in Lymphknoten und Nieren auf. Die Lymphknoten sind

hochgradig vergrößert, ödematös und in vielen Fällen hämorrhagisch infarziert. In den Nieren

sind petechiale und ekchymatöse Blutungen häufig, die vor allem die Nierenrinde, seltener

auch das Nierenmark und die Hilusregion betreffen und vielfach von einer lehmartigen Farbe

des Parenchyms begleitet sind (RÖHRER und PEHL, 1960; VAN OIRSCHOT, 1999).

Ein pathologisch-anatomischer Befund, der als fast pathognomonisch für die KSP angesehen

wird, jedoch nicht immer auftritt, sind Milzrandinfarkte (RÖHRER und PEHL, 1960;

TRAUTWEIN, 1988; VAN OIRSCHOT, 1999).

Nekrotische, durch Infarkte hervorgerufene Herde treten nicht selten in den Tonsillen auf, wo

sie durch bakterielle Besiedlung zu eitrigen Entzündungen führen (DUNNE, 1970; VAN

OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000). Ein typischer Befund, welcher durch

Sekundärinfektionen mit bakteriellen Erregern hervorgerufen wird, sind schwere

katarrhalisch-eitrige und fibrinöse Pneumonien, die in einigen Fällen von interstitiellen

Ödemen begleitet sind (RÖHRER und PEHL, 1960). Eine nicht-eitrige Enzephalitis ist in fast

allen Fällen nachweisbar (RÖHRER und PEHL, 1960; GRUBER et al., 1995).

Chronisch erkrankte Schweine zeigen weniger ausgeprägte Befunde. Hämorrhagien und

Infarkte können vollständig fehlen. Charakteristische Befunde sind Thymusatrophie und

Lymphozytendepletion in peripheren lymphatischen Organen (VAN OIRSCHOT, 1999). Bei

chronisch erkrankten Tieren ist eine Hyperplasie der Nebennierenrinde charakteristisch

2 Literaturübersicht 9

(CHEVILLE und MENGELING, 1969; VAN DER MOLEN und VAN OIRSCHOT, 1981).

Nekrotische und ulzerative Veränderungen in der Darmwand sind ebenfalls häufig mit der

chronischen Verlaufsform assoziiert. Diese so genannten „Boutons“ treten v. a. in Zäkum und

Kolon auf und bilden kraterförmige Ulzerationen. Ossifikationsdefekte bzw. Läsionen im

Bereich von Knorpel-Knochen-Übergängen treten v. a. an den Rippen als deutliche

Auftreibungen mit heller Streifung zu Tage (DUNNE, 1970; TEIFKE et al., 2002).

2.2.3.2 Mikroskopische und ultrastrukturelle Veränderungen

Das Ausmaß der histopatholgischen Veränderungen steht ebenfalls in Beziehung zur Virulenz

des beteiligten KSPV-Stammes. Eine generalisierte Vaskulitis und Lymphozytennekrose

sowie Enzephalitis ist für die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen charakteristisch

(NARITA et al., 2000). Die genannten Läsionen konnten mit der Lokalisation des Antigens in

Verbindung gebracht werden. Die Lymphozytendepletion betrifft v. a. die B-Lymphozyten

(SUSA et al., 1992; QUEZADA et al., 2000).

Die oben beschriebenen makroskopischen Veränderungen in den Lymphknoten korrellieren

mit einer ausgeprägten Lymphozytendepletion und retikulärer Hyperplasie im histopatho-

logischen Bild (VAN OIRSCHOT, 1999). Kleinste Gefäße können Thrombosierungen,

Nekrosen und fibrinoide Quellungen zeigen. Größere Gefäße sind dagegen nicht betroffen

(RÖHRER und PEHL, 1960).

Mit den makroskopischen Veränderungen in den Nieren korrespondiert ein Blutaustritt in das

Nierenparenchym aus interstitiellen Kapillaren, die Glomeruli scheinen hingegen nicht

betroffen. Die Kapillarschlingen können fibrinoide Veränderungen zeigen, was sekundär zu

einer Verödung der Glomeruli führt (RÖHRER und PEHL, 1960). QUEZADA et al. (2000)

beschreiben Hämorrhagien und Mikrothromben vor allem in glomerulären Kapillaren.

Die Milzrandinfarkte zeigen sich im histopathologischen Bild als gemischte Infarkte mit

ischämischer zentraler Nekrose und sekundär ausgebildetem hämorrhagischen Hof.

Mikrothromben und hyalinisierende Veränderungen in arteriellen Endothelien wurden in

diesem Zusammenhang von QUEZADA et al. (2000) beschrieben. In dieser Arbeit wurden

auch Fibrinnetze in der roten Pulpa nachgewiesen (QUEZADA et al., 2000).

Fast alle KSPV-infizierten Schweine zeigen eine nicht-eitrige Enzephalitis, deren

Hauptcharakteristikum perivaskuläre Infiltrationen sind (RÖHRER und PEHL, 1960;

GRUBER et al., 1995; VAN OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000).

2 Die Klassische Schweinepest 10

In den Krypten der Tonsillen finden sich leukozytäre Infiltrationen des Epithels und

Veränderungen der lymphoiden Zellsubstanz die in späten Erkrankungsstadien nekrotischen

Charakter haben können. Die ersten Veränderungen sind jedoch follikuläre Hyperplasie,

Proliferation der Retikulumzellen und Aktivierung der Endothelzellen (RÖHRER und PEHL,

1960).

Das histopathologische Äquivalent der Veränderungen an den Knorpel-Knochen-Grenzen

sind hypertrophierte Chondrozyten, erweiterte Lakunen, hyperämische Kapillaren und

multifokale Blutungen (TEIFKE et al., 2002). TEIFKE et al. (2002) fanden im Bereich der

Metaphyse zudem ein fast vollständiges Fehlen von Osteoblasten und Osteozytennekrosen.

Die dort entstehende osteoporotische Zone wurde auch von anderen Autoren beschrieben

(DUNNE et al., 1957).

Chronisch erkrankte Tiere zeigen hämotopoietische Aktivität in der Milz (VAN OIRSCHOT

und TERPSTRA, 1977; SUMMERFIELD et al., 1998a; NARITA et al., 2000).

Disseminierte Mikrothrombosen wurden im Zusammenhang mit akuten KSPV-Verläufen

beschrieben (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; QUEZADA et al., 2000).

2.2.4 Pathogenese

Die primäre Virusvermehrung erfolgt in den Tonsillen (DUNNE, 1970; RESSANG, 1973b;

LIESS, 1987). Von dort aus findet eine Ausbreitung des Virus in das umliegende

lymphoretikuläre Gewebe statt. Über die Lymphgefäße bzw. den Lymphstrom gelangt das

Virus in die regionären Lymphknoten. Hier findet eine ausgeprägte Virusreplikation mit

anschließender Ausbreitung über das Blutgefäßsystem mit massiver Virämie statt. Das Virus

gelangt so an die sekundären Replikationsorte. Die sekundäre Virusvermehrung findet vor

allem in Milz, Knochenmark, viszeralen Lymphknoten und den lymphatischen Geweben des

Darms statt. (RÖHRER und PEHL, 1960; RESSANG, 1973b). Hauptzielzellen des Virus sind

Makrophagen (SUMMERFIELD et al., 1998b; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2001;

SANCHEZ-CORDON et al., 2003), Endothelzellen (TRAUTWEIN, 1988), lymphoretikuläre

Zellen und Epithelzellen (MOENNIG, 2000). Nach fünf bis sechs Tagen ist die

Virusausbreitung im Organismus abgeschlossen (RESSANG, 1973b).

2 Literaturübersicht 11

Das klinische Bild der akuten KSP gleicht anderen viralen hämorrhagischen Erkrankungen,

zu denen u. a. auch die Afrikanische Schweinepest (ASP) gehört. Beide Erkrankungen haben

die Replikation des Virus in monozytären Zellen und einen ähnlichen pathogenetischen

Mechanismus gemein, der zu den charakteristischen Blutungen führt (ANDERSON, 1986;

GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).

Im Folgenden soll daher besonders auf die Veränderungen der Makrophagenpopulationen, die

möglichen Ursachen der Lymphopenie und Thrombozytopenie sowie die

Entstehungsmechanismen der Hämorrhagien während der akuten Verlaufsform der KSP

eingegangen werden.

Einfluss der KSPV Infektion auf Makrophagen

Veränderungen der Zahl der Makrophagen während einer KSPV-Infektion treten im Sinne

eines kurzfristigen Anstiegs in der Anfangsphase der Erkrankung bzw. eines Abfalls im

weiteren Verlauf zu Tage. Infektion, apoptotische Prozesse sowie phagozytotische und

sekretorische Aktivierung treten in allen Makrophagenpopulationen auf (GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2003a). Betroffen sind Makrophagenpopulationen der Milz

(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2001; SANCHEZ-CORDON et al., 2005b), des Knochen-

marks (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 1998; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b),

der Nieren (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001), der

Lunge (CARRASCO et al., 2001), des Thymus (SANCHEZ-CORDON et al., 2002), des

Darms (SANCHEZ-CORDON et al., 2003) sowie der Leber (NUNEZ et al., 2005).

GOMEZ-VILLAMANDOS et al. (2001) konnten für Milzmakrophagen nachweisen, dass die

phagozytotische und sekretorische Aktivität der Makrophagen zunimmt und apoptotische

Prozesse stattfinden. Es wird angenommen, dass die Makrophagen der periarteriellen

lymphatischen Scheiden (PALS) in andere Gebiete auswandern. Die Phagozytose infizierter

apoptotischer Körperchen (Makrophagen, Lymphozyten, neutrophile Granulozyten) könnte

zur Ausbreitung des Virus beitragen und das Fehlen entzündlicher Veränderungen in durch

Zelltod betroffenen Arealen in der frühen Phase der Infektion erklären (GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2003a).

Es wird angenommen, dass aktivierte bzw. qualitativ veränderte Makrophagen und deren

Mediatoren, die sie an unterschiedlichen Orten freisetzen, eine Hauptrolle in der Pathogenese

2 Die Klassische Schweinepest 12

der KSPV-Infektion spielen (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Eine direkte

Schädigung durch das KSPV wurde für viele Läsionen, die im Rahmen der KSP-Erkrankung

auftreten, weitgehend ausgeschlossen. So ließen sich weder die Lymphopenie

(SUMMERFIELD et al., 1998b; SATO et al., 2000; SANCHEZ-CORDON et al., 2002), noch

die beschriebenen Hämorrhagien in den Nieren (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000) auf

direkte Viruseinwirkung zurückführen. Auch für die Thrombozytopenie konnte ein solcher

pathogenetischer Mechanismus nicht nachgewiesen werden (GOMEZ-VILLAMANDOS et

al., 1998). Es ist vielmehr anzunehmen, dass unterschiedliche Zytokine ursächlich beteiligt

sind. Zu diesen Mediatoren gehören der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-

1β) und 1α (IL-1α) (SANCHEZ-CORDON et al., 2002) sowie Interleukin-6 ( IL-6).

In KSPV-infizierten Alveolarmakrophagen (in vitro) und den Lymphknoten infizierter

Schweine konnte eine erhöhte Expression von TNF-α bzw. TNF-α-Protein nachgewiesen

werden (CHOI et al., 2004). TNF-α ist in der Lage, Apoptose in unterschiedlichen

Zellpopulationen auszulösen (ZHENG et al., 1995; NAGATA, 1997) und kommt somit als

Induktor der Leukopenie in Frage. Bei den betroffenen Zellen handelt es sich vorwiegend um

Leukozyten, den morphologischen Kriterien nach speziell um Makrophagen. Ferner konnten

CHOI et al. (2004) apoptotische Vorgänge sowohl in KSPV-infizierten als auch nicht-

infizierten lymphatischen Zellen nachweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass

KSPV sowohl auf direktem, als auch auf indirektem Wege Apoptose auslösen kann (CHOI et

al., 2004). Wie die KSPV-Infektion die TNF-α Produktion anregt, ist bisher nicht ausreichend

geklärt. Das Vorhandensein von KSPV-Antigen in den TNF-α positiven Makrophagen legt

jedoch nahe, dass virale Komponenten über die Bindung an einen Rezeptor auf der

Zelloberfläche oder Mechanismen im Inneren der Zelle den Trigger für die TNF-α Synthese

darstellen (CHOI et al., 2004).

Neben TNF-α können auch IL-1 und IL-6 Apoptose in unterschiedlichen Zellspezies

induzieren. Dies wurde für andere virale Erkrankungen bereits nachgewiesen (RAZVI und

WELSH, 1993; GOMEZ DEL MORAL et al., 1999). Für die KSP konnte die Rolle des

TNF-α und IL-1 demonstriert werden (SANCHEZ-CORDON et al., 2002). Eine erhöhte IL-1-

Produktion nach einer KSPV-Infektion wurde auch in vitro gezeigt (KNOETIG et al., 1999),

in diesem Fall in Kombination mit erhöhter Prostaglandin-E2-Produktion. Eine Beteiligung

des TNF-α oder IL-6 konnte in vitro nicht nachvollzogen werden (KNOETIG et al., 1999).

2 Literaturübersicht 13

Für die Makrophagen der Leber konnte gezeigt werden, dass im Verlauf der akuten KSPV-

Infektion neben einer Aktivierung der Phagozytose eine Überexpression pro-

inflammatorischer Zytokine stattfindet. Sowohl TNF-α, als auch IL-6 und IL-1α wurden

vermehrt exprimiert (NUNEZ et al., 2005). Besonders der Verlauf der IL-1α Produktion wies

einen Zusammenhang mit dem Auftreten klinischer Symptome und pathologisch-anatomisch

nachweisbarer Hämorrhagien auf (NUNEZ et al., 2005).

Einfluss des KSPV auf Lymphozyten und Pathogenese der Lymphopenie

Die KSPV-Infektion verursacht vor allem in ihrer akuten Verlaufsform eine schwere

Lymphopenie und eine damit verbundene Immunsuppression, die bereits vor Auftreten der

ersten Symptome nachweisbar ist (TRAUTWEIN, 1988; PAULY et al., 1998). Eine

Depletion verschiedener Lymphozytenpopulationen konnte schon vor dem Auftreten einer

nachweisbaren Virämie gezeigt werden (SUMMERFIELD et al., 2001a). In den lympho-

retikulären Organen kommt es zu einer ausgeprägten Depletion der Lymphozyten, v. a. der B-

Lymphozytenpopulation (SUSA et al., 1992; NARITA et al., 2000; QUEZADA et al., 2000).

Eine direkte Schädigung der Lymphozyten durch das Virus konnte nicht nachgewiesen

werden (SATO et al., 2000; SUMMERFIELD et al., 2001b; SANCHEZ-CORDON et al.,

2002), obwohl eine Nekrose lymphatischer Zellen durch direkte Viruseinwirkung (NARITA

et al., 1996) bzw. Apoptoseinduktion durch virale Komponenten (BRUSCHKE et al., 1997)

diskutiert wurden. Das Phänomen der außerordentlich früh auftretenden Leukopenie wird mit

einer indirekt induzierten Apoptose lymphatischer Zellen in Verbindung gebracht (SATO et

al., 2000, SUMMERFIELD et al., 1998). Jedoch könnten sowohl eine direkte als auch

indirekte Apoptoseinduktion durch das KSPV ein Rolle spielen (CHOI et al., 2004). Eine

Möglichkeit der direkten Einwirkung ist die Wirkung viraler Proteine auf umliegende Zellen.

BRUSCHKE et al. (1997) zeigten, dass das Glykoprotein Erms

in Lymphozyten

unterschiedlichster Spezies Apoptose auslöst. Da Erns

in bedeutsamen Mengen in die

Umgebung der infizierten Zellen abgegeben wird, könnte es in diesem Zusammenhang eine

Rolle spielen (BRUSCHKE et al., 1997; CHOI et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass

die Depletion der Lymphozyten in Thymus und Milz zeitlich mit dem vermehrten Auftreten

von Makrophagen zusammenfiel, die phagozytierte Zelltrümmer enthielten („tingible body“

macrophages). Zudem ging die Lymphozytendepletion mit eindeutigen Hinweisen

2 Die Klassische Schweinepest 14

apoptotischer Veränderungen wie Kernpyknose und Karyorrhexis einher (SANCHEZ-

CORDON et al., 2005a). Quantitative Veränderungen der T-Lymphozytenpopulationen sowie

qualitative Veränderungen der Zytokinexpression durch diese Zellen wurden von SANCHEZ-

CORDON et al. (2005) im Sinne einer zellvermittelten Immunantwort vom Typ 1

interpretiert, die im späteren Verlauf von einer Typ 2 Immunantwort abgelöst wird.

Neben einer ausgeprägten Lymphopenie, kommt es im Verlauf der Infektion mit dem KSPV

auch zu einer markanten Granulozytopenie (SUSA et al., 1992; SUMMERFIELD et al.,

1998a; SUMMERFIELD et al., 1998b). Die Depletion der Granulozyten, die bereits drei Tage

nach der Infektion auftritt, betrifft sowohl reife Blutgranulozyten als auch unreife

Vorläuferzellen im Knochenmark (SUMMERFIELD et al., 2000). Es konnte von

SUMMERFIELD et al. (2000) gezeigt werden, dass sowohl apoptotische, als auch

nekrotische Veränderungen im Knochenmark eine Rolle spielen. Für die Caspasen 3 und 9

konnten erhöhte Aktivitäten besonders an Tag sieben der Infektion ermittelt werden, wobei

letzteres für die Beteiligung des mitochondrialen Weges der Apoptoseinduktion spricht

(BUDIHARDJO et al., 1999). Die Fähigkeit zur Differenzierung und somit der

Granolozytopoese war in Knochenmarkszellen infizierter Tiere über den gesamten Verlauf

der Erkrankung nicht gestört. Unreife Granulozyten nahmen, relativ gesehen, über den

Zeitraum der Infektion zu. Eine Zellschädigung bzw. Apoptoseinduktion durch die KSPV-

Infektion an sich erscheint in diesem Zusammenhang unwahrscheinlich, da die Anzahl

apoptotischer bzw. toter Zellen die Anzahl infizierter Zellen, besonders zu Beginn der

Infektion, bei weitem überstieg (SUMMERFIELD et al., 2000). Eine weitere Beobachtung in

einem in vitro Modell an BMHC-Zellen (bone marrow hematopoietic cells) war, dass die

Mehrzahl infizierter Zellen keine Anzeichen einer Apoptose zeigten, bzw. fast alle

apoptotischen Zellen nicht mit KSPV infiziert waren. Somit scheint ein indirekter

Mechanismus der Apoptoseinduktion die Hauptrolle zu spielen (SUMMERFIELD et al.,

2001b). In vitro konnten SUMMERFIELD et al. (2001b), im Gegensatz zu den Ergebnissen

in vivo (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b), keine Beteiligung von Makrophagen,

Zytokinen oder reaktiven Sauerstoffspezies nachweisen.

2 Literaturübersicht 15

Einfluss der KSPV Infektion auf Thrombozyten

Ein charakteristisches Symptom im Verlauf der akuten KSP ist eine hochgradige

Thrombozytopenie, deren Beginn mit dem Auftreten von Fieber und einer messbaren Virämie

korrelliert (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; GOMEZ-VILLAMANDOS et

al., 1998). Prinzipiell kann eine Thrombozytopenie durch verminderte oder fehlende

Thrombozytopoiese (Bildungsstörung), erhöhten peripheren Verschleiß durch Verbrauch,

Verlust bzw. Zerstörung (Umsatzstörung oder Verlust) oder eine veränderte

Plättchenverteilung (Verteilungsstörung) hervorgerufen werden (BAUTISTA et al., 2002).

Als Ursache der Thrombozytopenie im Rahmen der KSPV-Infektion werden verschiedene

Mechanismen diskutiert. HOFFMANN et al. (1971) und CALDERON et al. (1998) führten

dieses Phänomen auf eine massive Degeneration der Megakaryozyten im Knochenmark

zurück. HEENE et al. (1971) und HOFFMANN et al. (1971) brachten die auftretende

Thrombozytopenie zudem mit den Auswirkungen einer Verbrauchskoagulopathie bzw.

disseminierten intravasalen Gerinnung in Verbindung. WEISS et al. (1973) wies Virus in

Thrombozyten akut erkrankter Schweine nach und brachte die Thrombozytopenie in

Zusammenhang mit einer vorausgehenden Infektion von Megakaryozyten und nachfolgenden

Zerstörung der Thrombozyten.

GOMEZ-VILLAMANDOS et al. konnten 1998 zeigen, dass nur eine geringe Zahl

Megakaryozyten (2-4%) eine Infektion aufweist und postulierten, dass die Intensität der

Thrombozytopenie durch eine Zerstörung der Megakaryozyten im Zuge einer Infektion nicht

hinreichend erklärt werden kann. BAUTISTA et al. (2002) beschreiben Zellveränderungen an

Tag zwei und vier post infectionem in Milz und Leber, die auf eine Plättchenaktivierung und

-aggregation sowie sekretorische und phagozytotische Aktivierung der residenten

Makrophagen hindeuten. In diesem Zusammenhang wird eine massive Aktivierung und

nachfolgende Phagozytose der Plättchen, ausgelöst durch die Freisetzung

plättchenaktivierender Faktoren durch aktivierte Makrophagen als primäre Ursache der

massiven Thrombozytopenie im Verlauf der KSP diskutiert. Eine Aktivierung und

Aggregation der Plättchen durch den Tissue Factor (TF, Gewebefaktor) wird von oben

genannten Autoren aufgrund mangelnder Fibrinablagerungen in den betroffenen Organen

ausgeschlossen, während eine disseminierte intravasale Gerinnung mit der Begründung

ausgeschlossen wird, dass Mikrothromben erst in der Finalphase der Erkrankung, also nach

2 Die Klassische Schweinepest 16

Auftreten der Thrombozytopenie zu finden sind (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).

Morphologische Zeichen eines Endothel- oder sonstigen Gewebeschadens, der eine

Aktivierung des Gerinnungssystems herbeigeführt haben könnte, konnten von BAUTISTA et

al. (2002) ebenfalls nicht aufgespürt werden.

In verschiedenen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass es zu ausgeprägten

Veränderungen im Knochenmark KSPV-infizierter Schweine kommt, die jedoch erst nach

dem Auftreten der Thrombozytopenie nachweisbar sind (GOMEZ-VILLAMANDOS et al.,

1998; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b).

Die von HOFFMANN et al. (1971) und CALDERON et al. (1998) beschriebenen

degenerativen Veränderungen der Megakaryozyten konnten auch in diesen Studien als

„nackte Megakaryozytenkerne“ gezeigt werden, werden jedoch hier im Sinne einer Folge

(Versuch einer Wiederherstellung normaler Plättchenzahlen) diskutiert (GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2003b).

In vitro konnte gezeigt werden, dass in KSPV-infizierten Endothelzellen der Transkriptions-

faktor NFκB aktiviert wird, welcher für die Kontrolle der Aktivierung von Endothelzellen

verantwortlich ist. Es kommt zusätzlich zu einer erhöhten Expression von

proinflammatorischen (IL-1α, IL-6 und IL-8) und prokoagulatorischen Faktoren

(BENSAUDE et al., 2004). Sowohl die Expression des Gewebefaktors als auch des

Endothelzellwachstumsfaktors VEGF (vascular endothelial cell growth factor) und des

Zelloberflächen-Adhäsionsmoleküls E-Selektin waren in vitro erhöht. Somit könnten

aktivierte Endothelzellen eine wichtige Rolle in der Entstehung hämostaseologischer

Störungen spielen (BENSAUDE et al., 2004). NUNEZ et al. (2005) konnten

Plättchenaggregate und aktivierte Plättchen in der Leber infizierter Tiere nachweisen, die in

räumlicher Nähe zu von Kupffer-Zellen auftraten. Es wird diskutiert, ob die IL-1 Produktion

durch die von Kupffer-Zellen eine Rolle bei der Entstehung der Thrombozytopenie spielt

(NUNEZ et al., 2005), da IL-1 nachgewiesenermaßen zu einer Aktivierung von Plättchen

führen kann (REALE et al., 1996).

Pathogenese der Hämorrhagien im Verlauf der akuten KSPV Infektion

Hämorrhagien, vor allem in den Lymphknoten und Nieren, gehören zum klassischen Bild der

akuten KSPV-Infektion (RÖHRER und PEHL, 1960; VAN OIRSCHOT, 1999). Die

2 Literaturübersicht 17

zugrunde liegenden pathogenetischen Mechanismen wurden in verschiedene Richtungen

diskutiert (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Zu diesen Mechanismen gehören die

direkte Schädigung des Endothels durch das KSPV (HEENE et al., 1971), die ursächliche

Beteiligung der Thrombozytopenie durch veränderte Plättchen (WEISS et al., 1973) und eine

disseminierte intravasale Gerinnung (HOFFMANN et al., 1971a; GRUBER et al., 1995;

BENSAUDE et al., 2004) bzw. eine diffuse Aktivierung des Blutgerinnungssystems durch

eine Schädigung des Endothels (TRAUTWEIN, 1988). TRAUTWEIN (1988) diskutiert

zudem, dass eine durch Mikrothromben hervorgerufene Endothelschädigung die Ursache für

Plasmaverluste und perivaskuläre Hämorrhagien sein könnte. Petechien, die v. a. in

Assoziation mit Kapillaren auftreten, sind in den Nieren akut an KSP erkrankter Schweine ab

dem siebten Tag nach der Infektion in Kombination mit Erythrodiapedese (Austritt von

Erythrozyten aus den Blutgefäßen durch Lücken der Gefäßwand) nachgewiesen worden

(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001). Mit der

beschriebenen Erythrodiapedese gehen eine Vergrößerung der Kapillarlichtung,

mononukleäre Infiltrate und eine Erhöhung der Mastzellzahl und -degranulierung einher

(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001; GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2003a). Ultrastrukturelle und morphometrische Untersuchungen

zeigten in diesem Zusammenhang, dass es zu einer ausgeprägten Vasodilatation und

herabgesetzter Wanddicke des Endothels kommt (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000).

Die mononukleären Infiltrate, die im Zusammenhang mit den renalen Hämorrhagien

auftraten, wurden hauptsächlich als T- und B-Lymphozyten charakterisiert, Makrophagen

wurden nur in geringer Zahl gefunden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000). Sowohl die

kapilläre Vasodilatation und erhöhte Permeabilität, als auch die Auswanderung von

Erythrozyten und Leukozyten aus den Kapillaren, können durch Zytokine vermittelt werden

(MANTOVANI et al., 1992). Makrophagen, die zu den Hauptzielzellen des KSPV gehören

(RESSANG, 1973a; TERPSTRA, 1991), sind zwar nur in geringem Maße an den

perivaskulären Infiltraten im Bereich renaler Hämorrhagien beteiligt (GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2000), besitzen jedoch eine ausgeprägte Kapazität, die vaskuläre

Permeabilität zu beeinflussen, was auch im Zusammenhang mit anderen viralen

hämorrhagischen Fiebern gezeigt werden konnte (BRAY, 2005). Im Verlauf der KSPV

Infektion zeigen sie eine sekretorische Aktivierung und können somit eine wichtige Rolle für

2 Virale hämorrhagische Fieber 18

den Entstehungsmechanismus KSPV induzierter Hämorrhagien spielen (GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2000; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).

Weitere pathogenetische Mechanismen

Als pathogenetischer Auslöser wird eine hypoxische Nekrose der Osteoklasten und

Osteoblasten ausgelöst durch geschädigte Kapillarendothelien (PALMER 1992, zitiert durch

TEIFKE et al. 2002) bzw. ein Stillstand des Knorpelabbaus und der Ossifikation durch einen

KSPV induzierten Verlust osteoblastischer Aktivität diskutiert (TEIFKE et al., 2002). Eine

erhöhte Produktion von Zytokinen und Entzündungsmediatoren wird im Zusammenhang mit

Knochenerkrankungen unterschiedlicher Genese ursächlich mit der erhöhten osteoklastischen

Aktivität, aber auch einer Osteoblasten-Apoptose in Verbindung gebracht (BOYCE et al.,

1999).

In den Nieren KSPV-infizierter Schweine konnten im chronischen Verlauf der Infektion bzw.

ab dem zehnten Tag nach der Infektion Immunkomplexe nachgewiesen werden (CHEVILLE

et al., 1970; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001), die aus den Immunglobulinen M und G sowie

dem Komplementfaktor C1q bestanden; virales Antigen war nicht als Komponente dieser

Komplexe nachweisbar (RUIZ-VILLAMOR et al., 2001). Es wird diskutiert, ob diese

Immunkomplexe aus einer Überproduktion nicht-spezifischer Antikörper resultieren, wie sie

für persistent BVDV-infizierte Rinder beschrieben wurden (HEWICKER et al., 1987).

2.3 Virale hämorrhagische Fieber

Virale hämorrhagische Fieber, zu denen auch die akute Verlaufsform der KSP zählt, weisen

trotz unterschiedlicher Genese einige Gemeinsamkeiten auf, die sich besonders in der

Pathogenese der Erkrankungen widerspiegeln (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).

Zum Verständnis der pathogenetischen Mechanismen der KSP könnten daher auch

Erkenntnisse beitragen, die für andere virale Erkrankungen gewonnen wurden, die mit den

Symptomen eines hämorrhagischen Fiebers einhergehen. Aus diesem Grund wird ein kurzer

Einblick in die pathogenetischen Mechanismen gegeben, die für klassische Vertreter viraler

hämorrhagischer Fieber bekannt sind.

2 Literaturübersicht 19

2.3.1 Klassische Vertreter

Die Erreger charakteristischer viraler hämorrhagischer Fieber finden sich in den

Virusfamilien Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae und Filoviridae (FELDMANN et al.,

1996; CHEN und COSGRIFF, 2000). Die genannten Familien enthalten behüllte,

einzelsträngige RNA-Viren (BRAY, 2005). Das Virus der ASP (ASPV) stellt insofern eine

Ausnahme dar, als es sich um ein DNA-Virus aus der Familie Asfarviridae handelt (DIXON

et al., 2004). Zur ersten Familie gehören z. B. die Erreger des Lassa-Fiebers (Lassavirus), des

argentinischen hämorrhagischen Fiebers (Juninvirus) und des bolivianischen

hämorrhagischen Fiebers (Machupovirus) (OLDSTONE, 2002a; OLDSTONE, 2002b; JAY et

al., 2005). Vertreter der Familie Bunyaviridae sind u. a. das Hantaanvirus und das Sin-

Nombre-Virus sowie das Virus des Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (SIMMONS und

RILEY, 2002; LEDNICKY, 2003; TAI et al., 2005). Diese Viren verursachen beim

Menschen oftmals schwere fieberhafte Erkrankungen mit hämorrhagischen Symptomen, die

in Abhängigkeit vom Virustyp zudem mit schweren renalen und pulmonalen

Begleitsymptomen einhergehen können (WHITEHOUSE, 2004). Ein Vertreter des Genus

Phlebovirus, das Virus des Rift-Valley-Fiebers, kann beim Menschen in seltenen Fällen

ebenfalls zu einem hämorrhagischen Fieber führen (GERDES, 2004). Das Rift-Valley-Fieber-

Virus besitzt tiermedizinische Bedeutung, da es neben dem zoonotischen Potential zu

schweren Erkrankungen bei Wiederkäuern führt, die mit gastrointestinalen Symptomen,

Hepatitiden und seuchenhaften Aborten einhergehen (GERDES, 2004).

Die Familie Flaviviridae beinhaltet in den Genera Flavivirus (NEYTS et al., 1999;

SOLOMON und MALLEWA, 2001) und Pestivirus (BAKER, 1995; GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2003a) Erkrankungen, die mit hämorrhagischen Symptomen

einhergehen können. Zu den hämorrhagischen Erkrankungen des Genus Flavivirus gehören

das Dengue hämorrhagische Fieber (JOHN, 2003; MALAVIGE et al., 2004) und die schwere

Verlaufsform des Gelbfiebers (MONATH, 2001). Im Genus Pestivirus können Infektionen

mit dem KSPV und dem BVDV mit Symptomen eines hämorrhagischen Fiebers einhergehen.

Die Erreger der schwersten hämorrhagischen Fieber sind in der Familie Filovirus zu finden

(FELDMANN et al., 1996; PETERS und KHAN, 1999; CASILLAS et al., 2003). Die

Ebolaviren und das Marburgvirus verursachen schwerste Erkrankungen mit hoher Mortalität

(30-80%).

2 Virale hämorrhagische Fieber 20

2.3.2 Pathogenese der viralen hämorrhagischen Fieber

Eine Gemeinsamkeit viraler hämorrhagischer Fieber ist die primäre Replikation des Virus in

Monozyten bzw. Makrophagenpopulationen (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a;

BRAY, 2005) und ihre Affinität zu Endothelzellen. Eine Ausnahme bilden die Hantaviren,

die primär in Endothelzellen replizieren. Obwohl einige dieser Viren auch einen direkt

zellschädigenden Effekt haben, werden die meisten klinischen Erscheinungen durch

Reaktionen des Immunsystems und durch Mediatoren der infizierten Makrophagen verursacht

(BRAY, 2005). Die Erreger fast aller hämorrhagischer Fieber sind in der Lage, sehr

unterschiedliche Zelltypen zu infizieren (GEISBERT und JAHRLING, 2004).

Untersuchungen zur Pathogenese der Ebolavirusinfektion haben gezeigt, dass Interaktionen

des Virus mit Makrophagen und dendritischen Zellen eine tragende Rolle bei der Entstehung

unterschiedlichster Läsionen spielen (GEISBERT et al., 2003b; GEISBERT et al., 2003c;

GEISBERT et al., 2003d). Die Erreger viraler hämorrhagischer Fieber sind nicht nur in der

Lage, das unspezifische Abwehrsystem zu umgehen, sie können sich in Makrophagen, die

eigentlich eindringende Pathogene abwehren sollten, vermehren und diese als

Transportvehikel zu parenchymatösen Organen nutzen. Die Hemmung der Typ 1

Interferonproduktion spielt dabei eine unterstützende Rolle (BRAY, 2005). Die Infektion

aktiviert die sekretorische Aktivität der Makrophagen, die Zytokine und andere Mediatoren

ausschütten. Dadurch wird Fieber hervorgerufen und das Gefäßsystem im Sinne einer

Endothelzellaktivierung beeinflusst. Das Blutgerinnungssystem wird in einen

prokoagulatorischen Zustand versetzt (HENSLEY et al., 2002; GEISBERT und JAHRLING,

2004; HENSLEY und GEISBERT, 2005). Für das Ebolavirus konnte gezeigt werden, dass es

zu einer, von den infizierten Makrophagen induzierten, Aktivierung des extrinsischen Weges

der Blutgerinnung kommt. Die Überexpression des TFs scheint hier eine Schlüsselrolle zu

spielen (GEISBERT et al., 2003c). GEISBERT et al. (2003) sehen zudem Parallelen zwischen

Ebolavirusinfektionen und dem septischen Schock (Lymphozytenapoptose, Dysregulation

proinflammatorischer Zytokine, Aktivierung der Gerinnungskaskade im Sinne einer

disseminierten intravasalen Gerinnung).

Infizierte dendritische Zellen scheinen in ihrer Fähigkeit gestört zu sein, naïve Lymphozyten

zu aktivieren. In Kombination mit durch Mediatoren hervorgerufenen Effekten könnte dies zu

der massiven Lymphozytenapoptose beitragen, die im Krankheitsverlauf zu verzeichnen ist

2 Literaturübersicht 21

(GEISBERT et al., 2000; GEISBERT et al., 2003b; MAHANTY und BRAY, 2004; BRAY

und GEISBERT, 2005).

Im Gegensatz zum KSPV induzieren Filoviren einen direkten zytopathischen Effekt, der sich

sowohl in den infizierten Makrophagen und dendritischen Zellen als auch in parenchymatösen

Zellen der Leber, der Nebenniere und anderer Organe manifestiert. Der Mechanismus ist noch

weitgehend ungeklärt. Die entstehenden nekrotischen Zelltrümmer verstärken die systemische

Entzündungsreaktion und die Freisetzung von Zytokinen aus aktivierten Zellen (BRAY und

MAHANTY, 2003; HOTCHKISS und KARL, 2003; BRAY, 2005).

Die indirekten Wirkungen der Infektionen mit den angesprochenen Viren wurden besonders

anhand der Ebolavirusinfektion erforscht.

Die Replikation der Viren in Makrophagen resultiert in einer Interaktion einzelsträngiger

viraler RNA, doppelsträngiger RNA-Intermediate und anderer virus-spezifischer Substanzen

mit Typ 1 Transmembranproteinen, Toll-like receptors sowie anderen Mustererkennungs-

molekülen des unspezifischen Immunsystems. Dadurch werden NFκB, Interferon

regulierende Faktoren bzw. andere Aktivierungspfade angesprochen. Diese Aktivierung führt

zur Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren wie IL-1, IL-6, TNF-α und Stickstoffoxid

(HOTCHKISS und KARL, 2003; BRAY, 2005).

Dendritische Zellen setzen Chemokine frei, die zusätzliche Monozyten und dendritische

Zellen zu den Orten viraler Replikation locken. Damit gelangen weitere empfängliche Zellen

an die Orte der Virusreplikation und tragen zur Verbreitung des Virus bei (HENSLEY et al.,

2002; MAHANTY et al., 2003; BRAY und GEISBERT, 2005).

Die vaskulären Permeabilitätsstörungen und Koagulopathien wurden in älteren Studien häufig

direkten Wirkungen des Virus auf infizierte Endothelzellen zugeschrieben (PETERS und

ZAKI, 2002; SCHNITTLER und FELDMANN, 2003). In jüngster Zeit konnte jedoch gezeigt

werden, dass eine Virusreplikation in Endothelzellen erst in der Finalphase der Erkrankung

nachweisbar wird, wenn Gerinnungsstörungen und Schocksymptomatik bereits ausgeprägt

sind. Die auftretenden Vasodilatationen, die erhöhte Gefäßpermeabilität sowie die Expression

von Adhäsionsmolekülen im Bereich des Endothels werden daher mit der Wirkung

unterschiedlicher Entzündungsmediatoren in Verbindung gebracht (MAHANTY und BRAY,

2004; BRAY, 2005).

2 Virale hämorrhagische Fieber 22

Die systemische Entzündungsreaktion ist eng verknüpft mit der Aktivierung des

Gerinnungssystems. Entzündungsmediatoren wie IL-6 können die Synthese des TFs initiieren

und somit einen starken Aktivator der Gerinnung einbeziehen (BRAY, 2005).

Fibrinablagerungen konnten ebenfalls nachgewiesen werden (GEISBERT et al., 2003c). Die

bedeutsame Beziehung zwischen viraler Infektion, Entzündungsreaktion und Blutgerinnung

konnte experimentell belegt werden (GEISBERT et al., 2003a).

Für Infektionen mit Erregern viraler hämorrhagischer Fieber ist eine ausgeprägte Apoptose

vorwiegend nicht-infizierter lymphatischer Zellen charakteristisch, die zu einer massiven

Immunsuppression führt. Die Apoptoseinduktion scheint in allen Fällen durch Zytokine

infizierter monozytärer Zellen herbeigeführt zu werden (MAHANTY und BRAY, 2004;

BRAY, 2005; BRAY und GEISBERT, 2005).

2 Literaturübersicht 23

2.4 Hämostase und Hämostasekomponenten

Im Folgenden werden zum besseren Verständnis der pathologischen Vorgänge bei schweren

Virusinfektionen kurz die physiologischen Vorgänge im Rahmen der Blutgerinnung

dargestellt. Detailliertere Beschreibungen sind u. a. bei TROY (1988) und DODDS (1988)

bzw. in einschlägigen humanmedizinischen Monographien (NAWROTH, 1998;

HARBRECHT, 1998; GAWAZ, 1999) und Übersichtspublikationen zu finden (BLOOM,

1990; BOON, 1993; NARAYANAN und HAMASAKI, 1998; STASSEN et al., 2004; JURK

und KEHREL, 2005).

Die Hämostase umfasst die Vorgänge, die im intakten Gefäßsystem die kontinuierliche

Strömung des Blutes gewährleisten und im Bedarfsfall, d. h. bei Verletzungen und Störungen

dieses Systems, die rasche Blutstillung aktivieren und auf den Ort des Geschehens

beschränken (TROY, 1988). Somit laufen unter physiologischen Bedingungen ständige

Antikoagulations- und Koagulationsprozesse ab. Die Antikoagulation ist auf die besonderen

Eigenschaften des intakten, nicht benetzbaren Endothels, das Nichtaggregieren der inaktiven

Thrombozyten und die Inaktivität der als Proenzyme vorliegenden Gerinnungsenzyme

gestützt (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). Die Aktivatoren der Blutgerinnung

befinden im extravasalen Bereich. Die Blutstillung kann, da die Komponenten nicht

synthetisiert, sondern nur aktiviert werden müssen, energiearm und schnell erfolgen. Wichtige

Prozesse sind dabei die Kontraktion der Arterienwände, die Aktivierung der Thrombozyten

und der Zellen der verletzten Zelloberflächen sowie die Aktivität des fibrinolytischen

Systems. Beide Prozesse, d. h., Gerinnungsprozesse und Fibrinolyse müssen auf den Ort des

Geschehens beschränkt werden, dafür sorgt u. a. die Inaktivierung der Enzyme durch ihre

physiologischen Inhibitoren (LEWIS, 1996; NAWROTH, 1998).

Nach Virchow werden drei Hämostasebereiche unterschieden (Virchow´sche Trias, benannt

nach Rudolf Virchow, der diese Bereiche 1856 beschrieb): Thrombozyten (zelluläre

Bestandteile), Gefäßsystem (Endothel) und das plasmatische Gerinnungssystem.

2 Hämostase und Hämostasekomponenten 24

2.4.1 Zelluläre Bestandteile

Inaktive Thrombozyten liegen als Scheiben mit einem Durchmesser von 1-5 µm vor und

zirkulieren endothelnah am Rande des Blutstromes (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a).

Sie werden im Knochenmark durch Abschnürung aus Megakaryozyten generiert. Ihre Zahl

wird für Hausschweine mit einer sehr großen Bandbreite von 220 – 620 G/l angegeben

(HAHN et al., 1996; MISCHKE, 1999a).

Zu den Plättcheninhaltsstoffen gehören gerinnungsaktive Phospholipide, Serotonin und

Adenosindiphosphat (ADP). Der inaktive Thrombozyt präsentiert diese Stoffe nicht nach

außen, die gerinnungsaktiven Phospholipide befinden sich in der Plättchenmembran. Bei einer

Endothelverletzung kommt es durch Plättchenadhäsion und –aggregation zur Bildung des

primären Thrombozytenpfropfes und damit zur Abdichtung des Gefäßdefektes (BARTHELS

und VON DEPKA, 2003a). Das bei einer Gefäßverletzung freiliegende Kollagen des

Subendothels bildet den Anhaftungspunkt der zirkulierenden Thrombozyten, die im

Folgenden aggregieren. Bei diesen Vorgängen werden die Plättchen aktiviert und präsentieren

nun die gerinnungsaktiven Phospholipide der Plättchenmembran nach außen. Durch diesen

Flip-Flop-Mechanismus der Thrombozytenmembran wird die Matrix für die anschließend

ablaufenden Gerinnungsprozesse geschaffen (HARBRECHT, 1998; GAWAZ, 1999).

Verknüpfungen zwischen Gerinnungssystem und Thrombozyten erfolgen durch Rezeptoren

auf der aktivierten Thrombozytenoberfläche wie den Glykoprotein (GP) IIb/IIIa-Rezeptor, der

Fibrinogen und den Von-Willebrand-Faktor (vWF) bindet (GAWAZ, 1999). Die

Thrombozytenaktivierung kann in verschiedene Teile untergliedert werden. Primär kommt

neben dem Kollagen des Subendothels dem Thrombin eine entscheidende Bedeutung zu. Die

sekundäre Aktivierung ist an den Thrombozytenstoffwechsel gebunden, der Thromboxan A2,

ADP und den plättchenaktivierenden Faktor (PAF) bereitstellt (BARTHELS und VON

DEPKA, 2003a). Die Verbindung zwischen Endothel und Thrombozyten wird u.a. durch den

Von-Willebrand-Faktor über den Thrombozytenrezeptor GPIIb/IIIa vermittelt.

Relevante Komponenten der Thrombozyten sind nach BARTHELS und VON DEPKA (2003)

in Tabelle 2-1 aufgeführt.

2 Literaturübersicht 25

Tabelle 2-1: Rezeptoren und weitere relevante Komponenten der Thrombozyten, die für die Blut-

gerinnung von Bedeutung sind (nach BARTHELS und VON DEPKA, 2003). Die rechte Spalte gibt die

Hauptfunktion in Bezug auf die Gerinnung an.

Komponente Funktion

Rezeptor GPIIb/IIIa bzw. Integrin αIIbβ3 Bindung von Fibrinogen und vWF

Rezeptor GPIb/IX/V Bindung des vWF

Phospholididschicht Bindung von Gerinnungsfaktoren,

insbesondere Prothrombinkomplex,

Faktor V, Faktor VIII

Prostaglandine bzw. das Endprodukt

Thromboxan

Plättchenaggregation

2.4.2 Endothel

Neben seinen strömungsfördernden Eigenschaften durch fehlende Benetzbarkeit, verfügt das

Endothel über eine Reihe von Substanzen, die für die Hämostase eine Rolle spielen. So

stammt das Prostacyclin, ein potenter Inhibitor der Plättchenaggregation, aus dem Endothel.

Heparane (Heparansulfat), Stickstoffoxid und Prostaglandin I2 spielen bei der Antikoagulation

am Endothel eine Rolle (STASSEN et al., 2004). Die Freisetzung des tissue-type plasminogen

activators t-PA führt über die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin zur Fibrinolyse. Der

Plasminogenaktivatorinhibitor PAI ist der Gegenspieler und hemmt die Fibrinolyse. Treten

Störungen oder Verletzungen im Bereich des Endothels auf, kommt es über freiliegendes

Kollagen und den vWF bzw. den aus verletzten Gewebszellen freigesetzten TF zu einer

Aktivierung der Gerinnung (STASSEN und NYSTROM, 1997; BARTHELS und VON

DEPKA, 2003a; STASSEN et al., 2004). In Tabelle 2-2 sind die relevanten Komponenten des

Endothels und des Gewebes dargestellt.

2 Hämostase und Hämostasekomponenten 26

Tabelle 2-2: Substanzen des Endothels und Subendothels, die für die Blutgerinnung relevant sind (nach

BARTHELS und VON DEPKA, 2003).

Substanz Funktion

Kollagen Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten

Prostacyclin Hemmung der Thrombozytenaggregation

Heparansulfat Antikoagulation am Endothel

Thrombomodulin Aktivierung von Protein C als Kofaktor des

Thrombins

vWF Bindeglied zwischen Subendothel und Thrombo-

zyten. Schützt den Faktor VIII vor vorzeitiger

Degradierung (factor VIII related antigen)

TF Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems

(extrinsischer Weg) über Komplexbildung mit

Faktor VII

t-PA und ut-PA Fibrinolyseaktivatoren

PAI-1 Fibrinolyseinhibitor

2.4.3 Das plasmatische Gerinnungssystem

Nach allgemeiner Vorstellung verläuft die Aktivierung der plasmatischen Gerinnung in Form

einer feinregulierten Kaskade (NAWROTH, 1998). Obwohl die gängigen Lehrmodelle nicht

der Situation in vivo gerecht werden (HOFFMAN, 2003), bieten sie ein gutes Grundgerüst um

auftretende Gerinnungsstörungen in vitro diagnostizieren zu können (BARTHELS und VON

DEPKA, 2003a).

Im Rahmen der Blutgerinnung werden die inaktiv vorliegenden Faktoren der Enzymkaskade,

eine Reihe von Serinproteasen (NORRIS, 2003), aktiviert, was zur Aktivierung des zentralen

Gerinnungsenzyms Thrombin führt, welches Fibrinogen in Fibrin umwandelt (TROY, 1988;

NORRIS, 2003). Die Thrombinbildung findet über zwei Reaktionswege statt, den

extrinsischen und intrinsischen, die beide in einer gemeinsamen Endstrecke münden. Eine

strikte Trennung zwischen den Systemen besteht nicht (RADCLIFFE et al., 1977; TROY,

1988). Im Folgenden sind die aktivierten Faktoren durch ein hinter die römische Zahl

gestelltes a gekennzeichnet. Eine stark schematisierte Übersicht beider Aktivierungswege ist

in Abbildung 2-2 dargestellt.

2 Literaturübersicht 27

2.4.3.1 Der extrinsische Aktivierungsweg

Der extrinsische Weg wird i. d. R. durch eine Gefäßverletzung aktiviert (BARTHELS und

VON DEPKA, 2003a). Bei der Verletzung der Gefäßintegrität kommt es zur Freisetzung von

TF. Dieser bildet einen Komplex mit der Protease Faktor VII. Dieser Komplex regt über die

Aktivierung des Faktors X, und die Bildung des Prothrombinasekomplexes, die gemeinsame

Endstrecke der Gerinnung an (TROY, 1988; MANN, 1999; MORRISSEY, 2001). Über einen

Rückkopplungsmechanismus wird Faktor VII sowohl durch den entstandenen TF-Faktor-

VII-Komplex als auch durch Faktor Xa vermehrt aktiviert. Faktor VIIa ist eine allein kaum

wirksame Serinprotease, die ihre optimale Wirkung entfaltet, wenn TF in gerinnungsaktive

Phospholipide der verletzten Zellmembranen eingebunden ist (NAWROTH, 1998; MANN,

1999). Neben der Aktivierung des Faktors X, aktiviert Faktor VIIa auch Faktor IX, Faktor

IXa wiederum Faktor X. Gegenspieler dieses Weges ist der Tissue Factor Pathway Inhibitor

TFPI, der durch Komplexbildung mit Faktor Xa und dem TF-Faktor VII-Komplex den

Aktivierungsprozess rasch eindämmt (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a).

2.4.3.2 Der intrinsische Aktivierungsweg

Der intrinsische Weg wird über die Kontaktfaktoren Faktor XII, Faktor XI, Präkallikrein und

High Molecular Weight Kininogen (HMWK) initiiert, wobei Präkallikrein und Faktor XI

gebunden an den Kofaktor HMWK vorliegen. Diese Faktoren binden an negativ geladene

Oberflächen wie Plättchenmembranen, Kollagen, aber auch Glas, Kaolin, Ellagsäure oder

andere künstliche Oberflächen (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). Die

Kontaktfaktoren, insbesondere Faktor XIIa und Kallikrein, sind außerdem in der Lage, Faktor

VII zu aktivieren bzw. die intrinsischen Fibrinolyse zu initiieren (MANN, 1999). Mittelpunkt

dieses Systems ist der so genannte Tenasekomplex, der aus Faktor IXa, seinem Kofaktor VIII

sowie Phospholipiden und Calciumionen besteht (TROY, 1988). Dieser Komplex aktiviert

Faktor X und mündet damit in die gemeinsame Endstrecke. In der „Josso-Schleife“ besteht

eine Interaktion zwischen dem intrinischen und extrinsischen Weg der plasmatischen

Gerinnung. Sie beschreibt die Aktivierung des Faktors IX durch den TF-Faktor-VII-Komplex

und die Rückkopplung über Faktor Xa (MANN, 1999).

2 Hämostase und Hämostasekomponenten 28

2.4.3.3 Gemeinsame Endstrecke und Regulation

Den Endpunkt der Gerinnung bildet die Umsetzung des wasserlöslichen Fibrinogens in Fibrin

durch das Enzym Thrombin (TROY, 1988). Thrombin entsteht durch die Aktivität des sog.

Prothrombinasekomplexes aus der inaktiven Vorstufe Prothrombin. Dieser Komplex enthält

neben dem aktivierten Faktor X (Xa) dessen Akzelerator Faktor V sowie Calciumionen und

Phospholipide (NAWROTH, 1998; BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). In der

thrombinkatalysierten Reaktion werden die Fibrinopeptide A und B aus den Bereichen der

Aα- und Bβ-Ketten des Fibrinogens (siehe 2.4.6) abgespalten, wodurch Bindungsstellen

freiwerden, die eine Interaktion verschiedener Fibrinmoleküle ermöglichen. Die

Zusammenlagerung thrombinaktivierter Fibrinmoleküle führt zunächst zur Bildung von

Fibrinmonomeren, die durch weitere Anlagerungen zu Fibrinfasern werden. Erst in der

Faktor-XIII-katalysierten Reaktion erfolgt eine kovalente Vernetzung, und damit

Stabilisierung, des Fibrinnetzes (MOSESSON, 1998). Die Aktivierung des Faktors XIII

erfolgt direkt durch Thrombin (MANN, 1999). In Abbildung 2-3 ist eine stark schematisierte

Darstellung der Fibrinbildung abgebildet.

Die Kontrolle der Thrombinbildung gehört aufgrund ihrer Bedeutung für die Fibrinbildung

und Thrombozytenaktivierung zu den wichtigsten Prozessen der Hämostase. Die Generierung

von Thrombin wird über eine Feedback-Inaktivierung durch das Thrombmodulin/Protein C-

und S-System sowie direkte Hemmwirkungen durch Antithrombin kontrolliert (NAWROTH,

1998). Das Antithrombin hemmt auch Faktor Xa sowie mit geringerer Aktivität andere

Gerinnungsfaktoren (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). An den Endothelfaktor

Thrombmodulin gebundenes Thrombin aktiviert Protein C, welches in Zusammenspiel mit

seinem Kofaktor Protein S die Faktoren Va und VIIIa proteolytisch inaktivieren kann

(BARTHELS und VON DEPKA, 2003a).

Dieser Komplex hemmt zudem den Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) und hat insofern

profibrinolytische Aktivität. Reguliert wird das Thrombmodulin/Protein C-System über den

heparinabhängigen Protein Ca-Inhibitor PAI-3 und den heparinunabhängigen α1-

Proteaseinhibitor α1-PI (DOLAN et al., 1989).

2 Literaturübersicht 29

Abbildung 2-2: Schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der plas-

matischen Blutgerinnung. Schema modifiziert nach BARTHELS und VON DEPKA (2003).

Abbildung 2-3: Stark schematisierte Darstellung der Fibrinbildung. Durch die Abspaltung der

Fibrinopeptide A und B (nicht im Detail dargestellt) werden Bindungsstellen im Molekül frei, die

die Polymerisierung der so entstehenden Fibrinmonomere erlauben. Durch seitliche Assoziation

der Fibrinmonomere findet eine Fibrinfaserbildung statt, deren Struktur durch Faktor-XIII-

katalysierte Quervernetzung stabilisiert wird.

Prothrombin

Fibrin

F XIII � XIIIa

Vernetzung

Fibrinmonomere

Polymerisation

T h r o m b i n

-S--S- α β γ γ β α

Intrinsischer Weg Extrinsischer Weg

Negativ geladene Oberflächen

XIa, XIIa, Kallikrein

IXa + VIIIa + Phospholipide + Ca2+

Josso-SchleifeTenasekomplex

IXa + VIIIa + Phospholipide + Ca2+

Gefäßverletzung/Endothelschaden

TF-Faktor VIIa-Komplex

TF + VIIa + Phospholipide + Ca2+

Prothrombinasekomplex

X � Xa

V � Va

Calciumionen

Phospolipide

Prothrombin ���� Thrombin

Fibrinogen ���� Fibrin (polymer) Fibrin

FXIII � FXIIIa

2 Hämostase und Hämostasekomponenten 30

Plasminogen

Plasmin

PAI-1

α2-Antiplasmin

α2-Makroglobulin

t-PA, ut-PA

Kallikrein

Faktor XIIa

Fibrinogen/Fibrin Spaltprodukte, D-Dimere

2.4.4 Fibrinolyse

Die Fibrinolyse, d. h. die Wiederauflösung eines Gerinnsels erfolgt durch das proteolytische

Enzym Plasmin. Plasmin kann sowohl Fibrin, als auch Fibrinogen spalten. Das kleinste

Abbauprodukt des Fibrins im Verlauf der Fibrinolyse ist das wasserlösliche D-Dimer.

Plasmin entsteht aus der inaktiven Vorstufe Plasminogen durch enzymatische Einwirkung von

Plasminogenaktivatoren (PRIGLINGER und BINDER, 1998).

Es gibt zwei Typen der Serinproteasen, die als Plasminogenaktivatoren (PA) tätig werden.

Dies sind der Gewebetyp (t-PA), der aus Endothelzellen freigesetzt wird, sowie der

Urokinasetyp (ut-PA). Die Gegenspieler, die freies Plasmin sofort inaktivieren, sind das α2-

Antiplasmin (α2-AP) und das unspezifische α2-Makroglobulin (α2-MG). Auf der Stufe der

Plasminogenaktivatoren wird die plasminvermittelte Proteolyse durch vier Inhibitoren (PAI-1

bis 4) reguliert, wobei der PAI-1 der wichtigste Inhibitor ist (PRIGLINGER und BINDER,

1998). PAI-1 kommt auch in relevanten Mengen in Thrombozyten vor (GAWAZ, 1999). Eine

stark vereinfachte Darstellung der Fibrinolyse ist in Abbildung 2-4 zu finden.

Abbildung 2-4: Schematische Darstellung des Fibrinolysesystems. Die Aktivierung des

Plasminogens wird durch die Plasminogenaktivatoren t-PA bzw. ut-PA sowie die

Kontaktfaktoren Kallikrein und Faktor XIIa initiiert. Gegenspieler sind die

Plasminogenaktivatorinhibitoren (stellvertretend ist hier der wichtigste, der PAI-1, dargestellt)

sowie auf Ebene des Plasmins das α2-Antiplasmin und das α2-Makroglobulin. Endprodukt der

Fibrinolyse stellen D-Dimere dar.

2 Literaturübersicht 31

2.4.5 Diagnostik des plasmatischen Gerinnungssystems - Globaltests

Zu den Globaltests der Gerinnung gehören neben der Thromboplastinzeit (Synonyme: Quick-

Test, Prothrombinzeit) die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die

Thrombinzeit (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b).

Thromboplastinzeit

Die Thromboplastinzeit wurde bereits 1935 in die Blutgerinnungsdiagnostik eingeführt

(QUICK et al., 1935) und unterliegt in der Humanmedizin der Norm 58910, Teil 1-4 des

Deutschen Instituts für Normung (DIN).

Bei Menschen und Haustieren wird die Thromboplastinzeit als Screening-Test für den

extrinsischen Weg (s. 2.4.3.1) der Blutgerinnung eingesetzt.

Zusammengefasst beruht das Testprinzip auf der Zugabe von Gewebethromboplastin und

Calciumionen zu plättchenarmem Citratplasma. Über die so erfolgte Aktivierung des

extrinsischen Weges der Blutgerinnung kommt es zu einer Fibrinbildung, deren erstes

Auftreten automatisch erfasst und in Sekunden angegeben wird (MISCHKE, 1999a;

BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). In der Humanmedizin und weniger häufig auch in

der Veterinärmedizin wird der ermittelte Wert in Sekunden in den sog. Quick-Wert

transformiert, der die Gerinnungsaktivität in Prozent angibt (MISCHKE, 1999a; BARTHELS

und VON DEPKA, 2003b).

Aktivierte partielle Thromboplastinzeit

Die aPTT ist ein thrombozytenunabhängiger Globaltest, der die Faktoren des intrinsischen

Weges erfasst (PROCTOR und RAPAPORT, 1961). Neben den Gerinnungsfaktoren VIII, IX,

XI, XII, Präkallikrein und HMWK erfasst er auch die Faktoren X, V und Prothrombin sowie

Fibrinogen und überschneidet sich hier mit dem Quick-Test (LUSHER, 1996; BARTHELS

und VON DEPKA, 2003b). Die aPTT ist in der Humanmedizin über die DIN Norm 58908

spezifiziert. Einsatz findet er sowohl in der Human- als auch Veterinärmedizin v. a. in der

Diagnose von Hämophilien, Faktor-XI- und Faktor-XII-Mangelzuständen (BARNA und

TRIPLETT, 1989; MISCHKE, 1993). Da der Test heparin-, und in gewissem Masse auch

hirudinabhängig ist, wird er zudem in der Therapieüberwachung mit direkten

Antikoagulanzien eingesetzt (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Die Aussagekraft,

2 Hämostase und Hämostasekomponenten 32

speziell für die Hirudintherapie ist nur im unteren Konzentrationsbereich gegeben, während

sie im hohen bzw. toxischen Bereich verloren geht (NOWAK, 2001).

Das Testprinzip beruht auf der Inkubation plättchenarmen Citratplasmas mit partiellen

Thromboplastinen und oberflächenaktiven Substanzen, die während der Inkubationszeit in

ihre aktivierte Form umgewandelt werden können. Nach der Zugabe von Calciumionen wird

die Gerinnung ausgelöst und die Zeit bis zum Eintritt der Fibrinbildung in Sekunden

gemessen (JOHNSTONE, 1988).

Thrombinzeit

Mit der Thrombinzeit wird die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen beurteilt. Die gemessene

Zeit gibt an, wie lange eine standardisierte Thrombinlösung braucht, um im plättchenarmen

Citratplasma die Gerinnung auszulösen (JÜRGENS, 1952). Dieser Test umgeht somit die

vorgeschaltete Thrombinbildung über den extrinsischen oder intrinsischen Weg der

Blutgerinnung. Calciumionen sind für die Thrombin-Fibrinogen-Reaktion nicht notwendig,

beschleunigen jedoch die Fibrinpolymerisation (JOHNSTONE, 1988; BARTHELS und VON

DEPKA, 2003b). Der Test liefert eine Aussage über die Gerinnbarkeit des Fibrinogens und

damit zu Fibrinbildungsstörungen. Zudem eignet er sich als Suchtest bei Verdacht auf

schwere Fibrinogenmangelzustände (MISCHKE, 1999a).

2.4.6 Fibrinogenkonzentration

Die Fibrinogenkonzentration wird auch in der Veterinärmedizin regelmäßig im Rahmen

hämostaseologischer Untersuchungen bestimmt (CADE und ROBINSON, 1975; MISCHKE

und NOLTE, 1992). Ein Fibrinogenmangel ist häufig erworben und steht in Zusammenhang

mit gesteigertem intravasalem Umsatz bzw. Verlust. Eine Erhöhung der

Fibrinogenkonzentration ist ein unspezifischer Marker für Entzündungsvorgänge (MISCHKE,

1999a), da Fibrinogen zu den Akutphasenproteinen gehört, deren Syntheserate durch TNF-α

sowie IL-1 und IL-6 erhöht wird. Sowohl akute, als auch chronische Entzündungen gehen

daher häufig mit einer Erhöhung des Fibrinogenspiegels einher (MOSESSON, 1998).

Der Referenzbereich für das Schwein wird mit 1,6-3,9 g/l (Methode nach CLAUSS, 1957)

bzw. 3,2-7,2 g/l (Gravimetrie) angegeben (MISCHKE, 1999a). Die Messung erfolgt durch

verschiedene, semiquantitative Methoden, deren Aussage entweder die Menge gerinnbaren

2 Literaturübersicht 33

Fibrinogens (z. B. CLAUSS, 1957; STRASSLE, 1981) oder die Menge des Fibrinogen-

moleküls an sich ist (z. B. RATNOFF und MENZIE, 1951; INGRAM, 1952).

2.4.7 Disseminierte intravasale Gerinnung

Die disseminierte intravasale Gerinnung (disseminated intravascular coagulation, DIC) ist

ein erworbenes komplexes Syndrom, das im Verlaufe unterschiedlichster Erkrankungen

auftreten kann (SCHIEFER und SEARCY, 1975; MAMMEN, 2000). Sie ist ein dynamischer

Prozess, der durch eine Dysbalance zwischen pro- und antithrombotischem Potential des

Hämostasesystems ausgelöst wird (MADLENER und PÖTZSCH, 1998). Im deutschen

Sprachgebrauch findet sich häufig das Synonym Verbrauchskoagulopathie (LASCH et al.,

1971). Die DIC ist immer ein sekundäres Geschehen, das in milden, kompensierten

Verlaufsformen häufig asymptomatisch, in ihren schweren Formen jedoch mit einer hohen

Mortalität einhergehen kann (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Alle Aspekte,- von der

Definition bis zu den pathophysiologischen Zusammenhängen- werden kontrovers diskutiert

(MADLENER und PÖTZSCH, 1998).

Kennzeichen einer DIC ist eine abnorme intravasale Thrombinbildung, die v. a. in der

Mikrozirkulation, also den kleinsten Kapillaren der Endstrombahn, zu diffuser Fibrinbildung

führen kann (CAREY und RODGERS, 1998). Diese diffuse Formation von Fibrin führt zu

einem hohen Umsatz („Verbrauch“) an Thrombozyten, Fibrinogen, Gerinnungsfaktoren und

Gerinnungsinhibitoren (MULLER-BERGHAUS et al., 1999). Der hohe Verbrauch an

Inhibitorpotenzial sowie eine initial häufig reduzierte fibrinolytische Aktivität verstärken den

Prozess (MULLER-BERGHAUS, 1989).

Entzündliche und insbesondere septische Prozesse zählen zu den Hauptursachen einer DIC,

wobei grundsätzlich alle Erreger in der Lage sind, eine DIC zu verursachen (LEVI und TEN

CATE, 1999). Häufig sind es jedoch gramnegative Bakterien bzw. deren Endotoxine, die zu

einer Expression des TFs und damit zu einer Aktivierung des extrinischen Weges der

Blutgerinnung führen (MADLENER und PÖTZSCH, 1998). Experimentelle Studien mit

gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterien zeigten, dass es schon kurz

nach der Infusion zu einem Anstieg der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1,

etwas später auch des IL-6 kommt. LPS und TNF-α induzieren die TF-Expression auf

Endothelzellen und Monozyten und stellen damit die Auslöser für die Gerinnungsaktivierung

2 Hämostase und Hämostasekomponenten 34

dar (VAN DER POLL et al., 1995; BIEMOND et al., 1995a; BIEMOND et al., 1995b;

ESMON, 1999; MAMMEN, 2000; LEVI et al., 2003). IL-6 ist an der Induktion der Synthese

von Akutphaseproteinen wie Fibrinogen beteiligt und scheint ebenfalls eine wichtige Rolle in

der Gerinnungsauslösung im Rahmen der DIC zu spielen (STOUTHARD et al., 1996;

MADLENER und PÖTZSCH, 1998). Untersuchungen mit IL-1-Rezeptorantagonisten im

Tiermodell (Pavianmodell) konnten zeigen, dass auch IL-1 einen Beitrag zur

Gerinnungsaktivierung leistet (FISCHER et al., 1992). Die von Makrophagen freigesetzten

Zytokine stellen Bindeglieder zu anderen Mediatorsystemen dar, deren Effekte

zusammengenommen zu einer generellen endothelialen Entzündungsreaktion führen

(MADLENER und PÖTZSCH, 1998).

Die klinischen Symptome der DIC sind sehr stark vom Ausprägungsgrad abhängig und

können in schweren Fällen thrombotische Verschlüsse der Endstrombahn mit Ausfall der

dazugehörigen Gebiete und/oder generalisierte Blutungsneigung einschließen (TEN CATE et

al., 1999; LEVI und TEN CATE, 1999). Während die akute, dekompensierte DIC mit

markanten klinischen Symptomen einhergeht, bleibt die chronische bzw. kompensierte DIC

häufig unerkannt oder wird nur anhand von Laborbefunden diagnostiziert (MAMMEN,

2000). Die abnorme intravasale Thrombinbildung führt zu einer Erhöhung der

Aktivierungsprodukte der Gerinnung im Blut. Daneben kommt es zu einer Thrombozytopenie

und einem Abfall des Fibrinogens sowie der Gerinnungsfaktoren und Antithrombin, wenn der

Verbrauch die Syntheserate überwiegt. In der Regel ist im Verlauf der DIC auch die

Fibrinolyse gesteigert (MADLENER und PÖTZSCH, 1998; BARTHELS und VON DEPKA,

2003c).

Die DIC kann schematisch in drei Phasen eingeteilt werden (LASCH et al., 1971; MULLER-

BERGHAUS, 1989), denen aus klinischer Sicht noch eine vierte Phase, die Phase der

Erholung, angefügt werden kann (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Die erste Phase

der kompensierten Aktivierung des hämostatischen Systems geht mit einem

Thrombozytenabfall, einer erhöhten (oder pseudonormalen) Fibrinogenkonzentration, einer

Aktivitätssteigerung der Faktoren V und VIII, einem Verbrauch an Antithrombin und Protein

C sowie einer erhöhten Konzentration von Aktivierungsprodukten der Gerinnung einher. In

der Regel sind die Gerinnungszeiten der Globaltests in dieser Phase verkürzt oder noch

normal (MADLENER und PÖTZSCH, 1998; BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Eine

2 Literaturübersicht 35

Verminderung des fibrinolytischen Potentials in dieser Phase wird als begünstigender Faktor

für die Entwicklung einer voll ausgeprägten DIC angesehen (MULLER-BERGHAUS, 1989;

MULLER-BERGHAUS et al., 1999; LEVI und TEN CATE, 1999). Die zweite Phase der

dekompensierten Aktivierung des hämostatischen Systems und eines u. U. messbaren Defizits

des Gerinnungspotentials geht mit einem verstärkten Thrombozytenabfall, einer

Verminderung des Faktors V, einer Verminderung des Fibrinogens und einer Verlängerung

der Gerinnungszeiten in den Globaltests aPTT und Quick-Test einher. Die

Aktivierungsprodukte der Gerinnung sowie lösliches Fibrin sind im Plasma erhöht.

Mikrothromben können in dieser Phase in der Mikrozirkulation entstehen und zu

Organdysfunktionen v. a. in den Nieren, der Leber und der Lunge führen (MADLENER und

PÖTZSCH, 1998). Die dritte Phase entspricht dem Vollbild der DIC. Häufig liegt in der

späten dritten Phase ein Defibrinierungssyndrom mit nicht mehr messbaren

Fibrinogenspiegeln vor, da als Gegenregulation der intravasalen Gerinnung eine Aktivierung

des Fibrinolysesystems stattfindet. Die Fibrin(ogen)-Degradationsprodukte sind stark erhöht.

In dieser Situation besteht Blutungsneigung, Gefäßverschlüsse sind aufgrund des erschöpften

Fibrinolysepotenzials häufig irreversibel und führen in der Terminalphase zu

Organschädigungen. Die Gerinnungszeiten in den Globaltests sind stark verlängert oder nicht

mehr messbar. Thrombozyten, Fibrinogen sowie die Faktoren V und VIII sind stark

vermindert. Sowohl die Aktivierungsprodukte der Gerinnung als auch die Fibrin(ogen)-

Degradationsprodukte sind stark erhöht (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Wird die

dritte Phase überlebt, erholen sich in der vierten Phase die Werte aufgrund einer adäquaten

Gegensteuerung wieder (BARTHELS und VON DEPKA, 2003c).

2 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems 36

2.5 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems

2.5.1 Direkt wirkende Antikoagulantien

Zu den direkt wirkenden Antikoagulantien gehört neben Heparin und Heparinoiden auch das

Hirudin (GLUSA et al., 2001).

2.5.1.1 Hirudin

Hirudin ist ein selektiver Hemmstoff der Serinproteinase Thrombin, der ursprünglich aus dem

Speichel des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis gewonnen wurde (NOWAK, 1998).

Hirudin ist ein einkettiges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 7000 Da, welches

aus 65 Aminosäuren besteht. Die intramolekulare Stabilität wird durch Disulfidbrücken

gewährleistet (MARKWARDT et al., 1982; MARKWARDT, 1991). Hirudin und Thrombin

bilden einen hochaffinen monovalenten stöchiometrischen Komplex im Verhältnis 1:1

(NOWAK, 1998), der ausserordentlich stabil ist (GLUSA et al., 2001). Thrombin verliert

dabei sowohl seine katalytische Aktivität im Gerinnungssystem als auch seine Fähigkeit, an

Zellrezeptoren zu binden. Bei entsprechender Dosierung wird das gesamte Thrombin im Blut

irreversibel gehemmt, andere Proteasen werden dabei selbst im mikromolaren

Konzentrationsbereich nicht beeinflusst (GLUSA et al., 2001).

Hirudin wird nur nach parenteraler Applikation wirksam, da das Polypeptid im

Gastrointestinaltrakt zerstört wird (MARKWARDT et al., 1982). Die Eliminations-

halbwertszeit nach subkutaner Applikation beträgt zwei bis vier Stunden wobei das Hirudin

über die Nieren inaktiviert und ausgeschieden wird. Durch die Kopplung an einen

hochmolekularen Träger wie Polyethylenglykol (PEG) ändert sich die Pharmakokinetik

beträchtlich. PEG-Hirudin hat eine achtfach verlängerte Eliminationshalbwertszeit und wird

verzögert aus subkutanen Injektionsdepots resorbiert (GLUSA, 1988; NOWAK, 1998).

Die antithrombotische Wirksamkeit wurde in einer Vielzahl von Thrombosemodellen

nachgewiesen, dabei ist für die vorliegende Arbeit besonders die Wirksamkeit im Rahmen der

experimentell induzierten intravasalen Gerinnung von Bedeutung (NOWAK und

MARKWARDT, 1980c; MARKWARDT et al., 1982; NOWAK und MARKWARDT, 1991).

2 Literaturübersicht 37

NOWAK et al. konnten 1980 nachweisen, dass Hirudin in der Lage ist, die Entstehung einer

DIC nach Endotoxininfusion vollständig zu unterbinden.

Die Therapiekontrolle kann anhand der sog. Ecarin Clotting Time erfolgen, da dieser

Gerinnungstest im therapeutischen Bereich des Hirudins eine lineare Dosis-

Gerinnungszeitbeziehung zeigt (NOWAK und BUCHA, 1996; NOWAK, 2003).

2.5.2 Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation bzw. –funktion

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten bzw. im Vorfeld getesteten Wirkstoffe sollen im

Folgenden kurz dargestellt werden.

2.5.2.1 Acetylsalicylsäure

Acetylsalicylsäure (ASS) wurde 1897 erstmals in chemisch reiner Form hergestellt. Neben

der analgetischen, antipyretischen und antiinflammatorischen Wirkung besitzt die ASS eine

Hemmwirkung auf die Thrombozytenaggregation (CRAVEN, 1950). Die Wirkung beruht auf

einer Hemmung der Cyclooxygenase (COX), welche prinzipiell in zwei Isoformen, COX-1

und COX-2, auftritt. Beide Isoformen werden durch die ASS gehemmt, für die Thrombozyten

ist jedoch nur COX-1 relevant (PATRONO, 1994).

Es kommt durch eine irreversible Acetylierung der COX zu einer Hemmung der Thromboxan

A2 (TXA2) Bildung (ROTH und MAJERUS, 1975; ROTH et al., 1975). Da die kernlosen

Thrombozyten über einen limitierten Proteinsyntheseapparat verfügen, kann COX nur

begrenzt resynthetisiert werden. Somit findet eine nahezu irreversible Hemmung statt. Die

parallel stattfindene Prostacyclinsynthese ist von untergeordneter Bedeutung, da Prostacyclin

von Endothelzellen rasch wieder synthetisiert wird (REILLY und FITZGERALD, 1988;

PATRONO, 1994).

2.5.2.2 Abciximab

Die Bildung stabiler Plättchenaggregate wird durch die Bindung von Fibrinogen an den in der

Plättchenmembran lokalisierten GPIIb/IIIa-Rezeptor vermittelt. Diese Interaktion ist

Angriffspunkt des Fab-Fragments des chimären monoklonalen Antikörpers 7E3 (Abciximab,

ReoPro®), der den Rezeptor quasi irreversibel blockiert (FAULDS und SORKIN, 1994;

COLLER et al., 1995). Abciximab muss intravenös verabreicht werden; dabei ist die

2 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems 38

biologische Halbwertszeit erheblich länger als die Plasmahalbwertszeit, die mit zehn bis 30

min angegeben wird (ROSOVE, 2004).

2.5.2.3 Tirofiban

Tirofiban (Aggrastat®) ist ein nichtpeptiderger Antagonist des GPIIb/IIIa-Rezeptors. Auch

diese Substanz muss parenteral appliziert werden, die Halbwertszeit beträgt 1,4-1,8 Stunden

(ARTOIS et al., 2002). Auch Tirofiban fand Anwendung in Schweinemodellen (SHEN et al.,

2000).

2.5.2.4 Clopidogrel

Clopidogrel, ein Thienopyridinderivat, hemmt irreversibel die ADP-Bindung an den ADP-

Rezeptor P2 der Thrombozyten. Es ist das chemische Analog des Ticlopidins (QUINN und

FITZGERALD, 1999). Beide Wirkstoffe werden erst in ihrer metabolisierten Form wirksam

und müssen durch das Cytochrom P450 System der Leber aktiviert werden (SAVI et al.,

1994). In Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass die Kombination mit ASS die Wirkung

des Clopidogrels bzw. des Ticlopidins potenziert (HERBERT et al., 1996; HERBERT et al.,

1998; HARKER et al., 1998).

3 Material und Methoden

3.1 Tiere und Material

3.1.1 Tiere und Versuchsaufbau

Für alle Versuchsvorhaben, die in den Stallungen des Europäischen Referenzlabors für

Klassische Schweinepest (EURL) in Hannover durchgeführt wurden, fanden Läuferschweine

der Deutschen Landrasse Verwendung. Die Tiere stammten aus der Zucht des Lehr- und

Forschungsguts der Tierärztlichen Hochschule Hannover, Schäfersberg, Ruthe. Zum

Zeitpunkt der Einstallung waren die Tiere acht bis zehn Wochen alt und zeigten bei der

klinischen Untersuchung am Tag der Einstallung keine klinischen Auffälligkeiten. Zur

individuellen Kennzeichnung wurden Ohrmarken und farbliche Markierungen eingesetzt. Die

Tiere wurden einstreulos unter Hochsicherheitsbedingungen bei einem negativen Luftdruck

von -100 Pa gehalten und einmal täglich mit einem kommerziell erhältlichen Futter versorgt

(Gekörntes Ferkelfutter S 110, Gebrüder Weiterer, Algermissen). Die Wasserzufuhr erfolgte

ad libitum über eine automatische Tränkeeinrichtung. Alle Tiere wurden zu Versuchsbeginn

auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen Pestiviren untersucht und erwiesen

sich als negativ. Im Versuchsverlauf wurden Tiere mit einem Clinical Score über 20 aus

Tierschutzgründen schmerzlos durch Euthanasie getötet (intravenöse Applikation einer

Überdosis Pentobarbital). Gleiches galt für Tiere, die bei niedrigerem Clinical Score nicht

vertretbare Leiden zeigten. An allen Tieren wurde zur Einschätzung der pathologisch-

anatomischen Befunde eine postmortale Untersuchung vorgenommen.

In Vorversuchen, die in den Räumen der Arbeitsgruppe (AG) „Pharmakologische

Hämostaseologie“ der Medizinischen Fakultät der Universität Jena durchgeführt wurden,

wurden Läuferschweine der Deutschen Landrasse und Hybridschweine eingesetzt. Die Tiere

wurden in einer Gewichtsklasse von 10-18 kg aus einem kommerziellen Schweinemastbetrieb

in Thüringen bezogen. Auch diese Tiere wurden vor Versuchsbeginn einer klinischen

Untersuchung unterzogen.

3 Tiere und Material 40

In den Stallungen des EURLs in Hannover wurden folgende Tierversuche unter den unten

aufgeführten Aktenzeichen und Zielsetzungen durchgeführt:

A) Nach § 8a des Tierschutzgesetzes vom 25.05.1998 anzeigepflichtige Tierversuche mit der

Zielsetzung der Charakterisierung der Pathogenese von KSP-Feldvirusisolaten unter dem

Aktenzeichen 01A 78:

1. Studien zur Pathogenese der KSP: Hämatologische, hämostaseologische und

histopathologische Untersuchungen.

Dazu wurden sieben Läufer eingestallt und randomisiert in zwei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1

umfasste fünf Tiere, die mit dem hochvirulenten KSPV-Isolat CSF0634 infiziert wurden. Die

Infektion erfolgte mit fünf ml virushaltigen Zellkulturüberstandes. Die Virusdosis betrug

103,5

KID50 (kulturinfektiöse Dosis50) pro ml. Gruppe 2 diente als Negativkontrolle und

umfasste zwei Tiere, die nicht infiziert wurden. An den Tagen drei, sieben, elf und 14 nach

der Infektion erfolgte eine Blutentnahme. Die Proben wurden hämatologischen,

hämostaseologischen und virologischen Untersuchungen zugeführt. Die klinischen Symptome

inklusive der Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes Bewertungsschema erfasst,

bewertet und dokumentiert. Dieser sog. Clinical Score modifiziert nach MITTELHOLZER et

al. (2000) belegt die auftretenden Symptome mit einer Punktzahl, deren Addition eine

Bewertung der Symptomatik möglich macht und ist unter 3.2.7.1 näher beschrieben. Die

Versuchsdauer wurde durch die klinischen Verläufe der Erkrankung bestimmt und betrug 21

Tage. Organmaterial (Niere, Leber, Lunge, Milz, Lymphknoten) wurde in Formalin fixiert

und für die Lichtmikroskopie aufgearbeitet.

2. Voruntersuchungen zur Blutgerinnung im Verlauf der Klassischen Schweinepest

Für dieses Versuchsvorhaben wurden ebenfalls sieben Läufer eingestallt und zufällig in zwei

Gruppen geteilt. Gruppe 1 umfasste fünf Tiere, die mit dem hochvirulenten KSPV-Isolat

CSF0634 infiziert wurden, Gruppe 2 enthielt zwei Kontrolltiere, die unter gleichen

Bedingungen gehalten, jedoch nicht infiziert wurden. Um den Stress der Tiere durch die

Untersuchungen und Zwangsmassnahmen sowie die damit verbundenen Veränderungen

hämatologischer und hämostaseologischer Parameter zu minimieren, wurde eine

Eingewöhnungsphase von 14 Tagen eingeräumt. An den ersten vier Tagen des Experimentes

wurde den Tieren täglich Blut entnommen, danach wurde ein Entnahmeintervall von drei

3 Material und Methoden 41

bzw. vier Tagen gewählt. Das entnommene Blut wurde für die Untersuchung mittels

hämatologischer und hämostaseologischer Methoden aufbereitet. In diesem Versuch fand

zusätzlich eine Untersuchung des Plasmas im Ethanol Gelation Test statt. An den Tagen null,

vier, sieben und zehn nach der Infektion wurden Leukozyten gewonnen und mittels

Virusisolierung auf KSPV untersucht. Die klinischen Symptome inklusive der

Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes Bewertungsschema erfasst und

dokumentiert. Die Versuchsdauer wurde durch die klinischen Verläufe der Erkrankung

bestimmt und betrug 24 Tage. Organmaterial wurde in Formalin fixiert bzw. bei -80°C

eingefroren.

B) Nach § 8 des Tierschutzgesetzes vom 25.05.1998 genehmigungspflichtige Tierversuche:

1. Tierversuchsvorhaben mit der Bezeichnung:

Untersuchung zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest (KSP): Pharmakologische

Beeinflussung des plasmatischen Gerinnungssystems mittels Hirudin zum Zwecke der

Abklärung der Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems. Das Vorhaben wurde bei der

Bezirksregierung Hannover unter dem Aktenzeichen 04/899 geführt.

Ziel dieses Versuches war, die Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems in der

Pathogenese der Klassischen Schweinepest zu bewerten. Zu diesem Zweck fand eine

pharmakologische Intervention mit PEG-Hirudin, einem spezifischen Thrombininhibitor

(Gerinnungshemmer), statt. Dieses Medikament hemmt die Endstrecke der plasmatischen

Blutgerinnung und findet in der Humanmedizin Anwendung in der Prophylaxe

thrombembolischer Ereignisse und wird in der Dialyse eingesetzt, wenn vom Patienten das

Standardmittel Heparin nicht oder nicht mehr vertragen wird. Zur Sicherung eines

therapeutischen Plasmaspiegels war die Überwachung mittels Ecarin Clotting Time (ECT)

notwendig. Es handelt sich dabei um ein standardisiertes Verfahren zur Erfassung und

Überwachung des Plasmahirudinspiegels. Die Methode ist unter 3.2.7.2 näher beschrieben,

die genaue Vorgehensweise im Tierversuch unter 3.2.1.

Der Versuchsaufbau sah vor, zwei Gruppen zu je fünf Läuferschweinen mit dem hoch-

virulenten KSPV-Isolat CSF0634 intranasal zu infizieren (fünf ml virushaltiger

Zellkulturüberstand). Die Infektionsdosis lag bei 104,75

KID50 pro ml. Eine Gruppe (Gruppe

2) blieb als positive Kontrolle ohne Behandlung, der anderen Gruppe (Gruppe 1) wurde

3 Tiere und Material 42

einmal täglich PEG-Hirudin subkutan appliziert. Die Dosierung des PEG-Hirudins erfolgte

anhand der ECT mit dem Ziel, einen Plasmahirudinspiegel von 0,5 –1,5 µg/ml zu erhalten.

Den Tieren beider Gruppen wurde täglich ca. fünf ml venöses Blut aus der Vena jugularis

externa entnommen. Aus dem gewonnenen Vollblut wurden zunächst die Parameter des

Differentialblutbildes (Leukozytenzahl, Thrombozytenzahl, Plättchenvolumen und

-verteilung) bestimmt. Anschließend wurde (Citrat-) Plasma gewonnen und in der ECT,

sowie verschiedenen gerinnungsanalytischen Tests eingesetzt (Globaltests der Gerinnung,

Bestimmung des Fibrinogengehaltes). Vor Versuchsbeginn, am zehnten Tag nach der

Infektion und am Tag der Euthanasie wurde zudem eine kleine Menge EDTA-Blut (ca. 2 ml)

entnommen, die dann der virologischen Diagnostik (Virusneutralisationstests, Virusnachweis

mittels Zellkultur und Polymerasekettenreaktion) zugeführt wurde. Die klinischen Symptome

inklusive der Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes Bewertungsschema erfasst

und dokumentiert. Die Versuchsdauer wurde durch die klinischen Verläufe der Erkrankung

bestimmt und betrug 18 Tage gemessen vom Tag der Infektion. Organmaterial (Niere, Leber,

Lunge, Milz, Lymphknoten) wurde zur späteren Aufbereitung für die Lichtmikroskopie

entnommen und in Formalin aufbewahrt.

2. Tierversuchsvorhaben mit der Bezeichnung:

Untersuchung zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest (KSP): Pharmakologische

Beeinflussung der Thrombozytenaggregation mittels ADP-Rezeptorblockern und COX-1-

Inhibitoren zum Zwecke der Abklärung der Rolle von Thrombozyteninteraktionen in der

Pathogenese der Klassischen Schweinepest.

Das Vorhaben wurde bei der Bezirksregierung Hannover unter dem Aktenzeichen 04/835

geführt. Die Zielsetzung des Vorhabens lässt sich wie folgt charakterisieren:

Durch die pharmakologische Intervention mit den Medikamenten ASS und Clopidogrel

(s. 3.1.2) sollte die Rolle der Plättcheninteraktionen in der Pathogenese der KSP bewertet

werden. Beide Medikamente hemmen auf unterschiedlichen Wegen irreversibel die

Plättchenaggregation und finden in der Humanmedizin Anwendung in der Prophylaxe

thrombembolischer Ereignisse, wie z.B. des Herzinfarkts. Zur Sicherung eines

therapeutischen Plasmaspiegels war die Überwachung mittels Thrombozytenaggregationstest

notwendig. Es handelt sich dabei um ein turbidimetrisches Verfahren zur Messung der durch

3 Material und Methoden 43

lösliche Induktoren ausgelösten Thrombozytenaggregation unter standardisierten

Bedingungen. Die nähere Beschreibung der Methode befindet sich unter 3.2.4.7, die genaue

Vorgehensweise im Tierversuch unter 3.2.1.

In einem viertägigen Vorversuch sollte die Wirksamkeit der Wirkstoffe Clopidogrel

(Iscover®) und ASS (ASS ratiopharm®) überprüft, und ein Dosierungsschema erarbeitet

werden. Drei Läuferschweine wurden zu diesem Zweck eingestallt und an drei aufeinander

folgenden Tagen mit Clopidogrel und ASS behandelt (s. 3.2.1). Die Wirksamkeit wurde

anhand einer Thrombozytenaggregationsmessung (s. 3.2.4.7) überprüft. Anhand der

gewonnen Ergebnisse wurde ein Dosierungsschema erstellt und in das unten aufgeführte

Vorhaben integriert.

Der Versuchsaufbau des Hauptversuchs sah vor, zwei Gruppen zu je sechs Läuferschweinen

der Deutschen Landrasse mit dem hochvirulenten KSPV-Stamm CSF0634 intranasal zu

infizieren. Die Infektion erfolgte mit fünf ml virushaltigen Zellkulturüberstandes. Die

Virusdosis betrug 104,5

KID50 pro ml. Die Tiere wurden bei der Ankunft randomisert in zwei

Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde täglich mit ASS und Clopidogrel behandelt, während die

Kontrollgruppe keine Medikamente erhielt. Beiden Gruppen wurde täglich ca. fünf ml

venöses Blut aus der Vena jugularis externa entnommen. Aus dem gewonnenen Vollblut

wurden zunächst hämatologische Parameter bestimmt, bevor durch Zentrifugation

Citratplasma gewonnen, und in Thrombozytenaggregationstests sowie weiteren

gerinnungsanalytischen Untersuchungen eingesetzt wurde (Globaltests der Gerinnung,

Bestimmung des Fibrinogengehaltes). Vor Versuchsbeginn, am zehnten Tag nach der

Infektion und am Tag der Euthanasie wurden zudem kleine Mengen EDTA-Blut und

Nativblut (ca. zwei ml) entnommen, die dann der virologischen Diagnostik im Sinne eines

Virusneutralisationstests und eines Virusnachweises zugeführt wurden. Die klinischen

Symptome inklusive der Körpertemperatur wurden über ein standardisiertes

Bewertungsschema erfasst und dokumentiert. Die Versuchsdauer wurde durch die klinischen

Verläufe der Erkrankung bestimmt und betrug 18 Tage gemessen vom Tag der Infektion.

Organmaterial (Niere, Leber, Lunge, Milz, Lymphknoten) wurde zur späteren Aufbereitung

für die Lichtmikroskopie entnommen und in Formalin aufbewahrt.

3 Tiere und Material 44

C) Vorversuche, die in den Räumen der der AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ der

Medizinischen Fakultät der Universität Jena durchgeführt wurden.

Zur Etablierung der hämostaseologischen Methoden, der Auswahl der geeigneten Wirkstoffe

und zur Untersuchung der Pharmakokinetik der gewählten Wirkstoffe, wurden Vorversuche

in Kooperation mit der AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ der Medizinischen Fakultät

der Universität Jena durchgeführt. Die Wirksamkeit des Hirudins im Schwein war bereits

belegt (NOWAK und MARKWARDT, 1980b), die Wirkstoffe zur Beeinflussung der

Thrombozyteninteraktion sowie die Monitoringmethoden mussten vorab getestet werden.

Unterschiedliche, in der Humanmedizin gebräuchliche Wirkstoffe wurden daher zunächst in

vitro und nachfolgend in verschiedenen Formulierungen, Applikationsarten und Dosierungen

an narkotisierten Schweinen getestet, und ihre Wirkung anhand von Thrombozyten-

aggregationstests mit verschiedenen Induktoren untersucht. Parameter des Gerinnungssystems

und hämatologische Parameter wurden dabei ständig überwacht. Nur die pharmakologisch

wirksamen Substanzen mit hinreichender Wirksamkeit im Schwein wurden weiterhin geprüft.

Die geprüften Wirkstoffe und die verwendeten Versuchsansätze sind unter 3.2.5 näher

charakterisiert.

3.1.2 Pharmakologisch wirksame Substanzen

Für das Versuchsvorhaben unter Verwendung von Clopidogrel und ASS wurden kommerziell

erhältliche Formulierungen aus der Humanmedizin eingesetzt. Clopidogrel wurde in der

Formulierung der Fa. Bristol-Myers Squibb Pharma EEIG, Hounslow, Großbritannien

eingesetzt. Die unter dem Markennamen Iscover® erhältlichen Filmtabletten enthielten je

75 mg Clopidogrel als Clopidogrelhydrogensulfat. ASS fand in der Formulierung der

Fa. Ratiopharm GmbH, Ulm, Verwendung. Die Tabletten, ASS-ratiopharm® 500, enthielten

je 500 mg Acetylsalicylsäure.

Das im Versuch verwendete PEG-Hirudin sowie das zur Überprüfung des Plasmaspiegels

notwendige Ecarin, wurden freundlicherweise von Prof. Goetz Nowak zur Verfügung gestellt

(AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ der Medizinischen Fakultät der Universität Jena).

Aus dem Ecarin wurde gebrauchsfertiges Ecarin-Reagenz hergestellt, welches lyophilisiert

und gekühlt bis zum Gebrauch gelagert wurde (s. 3.2.7.2).

3 Material und Methoden 45

3.1.3 Gewinnung und Aufbereitung der Blutproben

Für die Blutentnahme aus der Vena jugularis wurden kommerziell erhältliche

Blutentnahmeröhrchen und Adaptersysteme der Fa. KABE®

Labortechnik GmbH,

Nümbrecht-Elsenroth, verwendet. Zur Blutentnahme wurden die Tiere von zwei

Hilfspersonen auf dem Rücken fixiert. Je nach Verwendungszweck wurde das

kontaminationsfrei entnommene Blut in die entsprechenden Blutentnahmeröhrchen

aufgenommen und somit Nativblut, EDTA- oder Citratblut gewonnen.

EDTA-Blutproben zur Bestimmung des Differentialblutbildes wurden noch am selben Tag

ohne weitere Aufarbeitung der Untersuchung zugeführt. Die Aufarbeitung von EDTA-

Blutproben zur Gewinnung von Leukozyten für die Virusisolierung ist unter 3.2.2.3

beschrieben. Blutproben zur Gewinnung von Serum aus Nativblut wurden für 15 min bei

1215 x g zentrifugiert, das gewonnene Serum in Kryoröhrchen (Fa. Greiner, Nürtingen)

portioniert und bis zur weiteren Bearbeitung bei -80°C aufbewahrt. Für die Globaltests der

Gerinnung sowie die Bestimmung des Fibrinogenspiegels (s. 3.2.4.1-3 und 3.2.4.5) wurden

die Citratblutproben für 10 min bei 437 x g zentrifugiert und der Überstand in Kryoröhrchen

portioniert. Für die Untersuchungen der Gerinnungsparameter konnte das Plasma bei -80°C

für einige Wochen tiefgefroren werden, für den Ethanol Gelation Test (s. 3.2.4.6) musste es

sofort verarbeitet werden. Citratblutproben für die Thrombozytenaggregationstests wurden

zunächst zur Gewinnung des plättchenreichen Plasmas bei 31 x g für 20 min (ohne Bremse)

zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und der Rest zur Gewinnung des

plättchenarmen Plasmas für 15 min bei 941 x g zentrifugiert. Der dort entstandene Überstand

wurde ebenfalls abpipettiert und in Kryoröhrchen abgefüllt.

3.1.4 Viren

Für alle Infektionsversuche im Rahmen dieser Arbeit wurde das KSPV Isolat mit der

Datenbanknummer CSF0634 eingesetzt. Dieses Isolat wurde 1999 aus einem

niedersächsischen Hausschwein isoliert und dem Genotyp 2.3* Uelzen zugeordnet

(WONNEMANN et al., 2001). Die passwortgeschützte Datenbank des EURLs ist im Internet

unter: http://viro08.tiho-hannover.de/eg/eurl.virus.db.htm zu finden und enthält neben den

Daten zur Herkunft auch Informationen zur genetischen Einordnung sowie Sequenzen

3 Tiere und Material 46

ausgewählter viraler Genomabschnitte. Isolat CSF0634 wurde als hochvirulent eingestuft

(FLOEGEL-NIESMANN et al., 2003).

Als Referenzstamm in Virusneutralisationstests und als Positivkontrolle in Virusisolierungen

wurde der KSPV-Stamm Alfort 187 eingesetzt. Dieses Virus ist in der Datenbank unter der

Nummer CSF0902 zu finden und gehört zum Genotyp 1.1. Virusneutralisationstests zum

Nachweis kreuzreagierender Antikörper wurden mit dem BVDV Laborstamm NADL und

dem BDV Stamm Moredun durchgeführt.

3.1.5 Diagnostische Antikörper

Der Nachweis des KSPV in Zellkulturen erfolgte mit dem pestivirusspezifischen

monoklonalen Antikörper (mAK) BVD/C16. Der Antikörper ist gegen das

Nichtstrukturprotein NS2-3 aller Pestiviren gerichtet (GREISER-WILKE et al., 1992b) und

wurde am Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt (PETERS

et al., 1986; MOENNIG et al., 1987). Er wird am EURL routinemäßig in der

Schweinepestdiagnostik verwendet. Zu diesem Zweck wird der monoklonale Antikörper

(mAk) an Peroxidase gekoppelt eingesetzt (C16-PO-Konjugat).

3.1.6 Zelllinien

Für alle zellkulturellen Arbeiten mit dem KSPV bzw. für die serologischen Untersuchungen

wurde die permanente porcine Zelllinie PK(15)A (porcine kidney (15) Amsterdam)

eingesetzt. Die epitheloide Zelllinie wird am EURL routinemäßig in der KSP-Diagnostik

eingesetzt. Sie wurde 1974 durch Einzelzellklonierung erhalten (LIESS, persönliche

Mitteilung). Die Zelllinie wird regelmäßig auf Mykoplasmen untersucht und ist frei von

Pestiviren. Die Kultivierung ist unter 3.2.2.1 beschrieben.

Serologische Untersuchungen zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen das BDV

wurden auf der permanenten Schafthymuszelllinie (SFT-R) durchgeführt, die aus der

Zellbank des Friedrich-Loeffler-Institutes (Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit)

stammte und dort unter der Katalognummer 43 geführt wird.

Die serologische Überprüfung der Versuchstiere auf Antikörper gegen das BVDV erfolgte auf

primären, fetalen Kälbernierenzellen (FKN) (FREY und LIESS, 1971).

3 Material und Methoden 47

3.1.7 Sonstige Materialien

Die Rezepturen für verwendete Medien, Puffer, Lösungen und Reagenzien, sowie die

Herkunft der dafür benötigten Chemikalien sind im Anhang unter und 8.3 aufgelistet.

Kommerziell erhältliche Reagenzien für die Gerinnungsdiagnostik, Enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA) Testkits sowie Reagenzien für die Thrombozyten-

aggregationstests finden sich im Anhang unter 8.5. Eine Aufstellung der Geräte und

Gebrauchsgegenstände ist unter 8.6 aufgeführt. Die Verbrauchsmittel sind unter Punkt 8.7

zusammengestellt.

3 Methoden 48

3.2 Methoden

3.2.1 Behandlung der Versuchstiere und klinische Parameter

3.2.1.1 Applikation und Dosierung der eingesetzten Pharmaka

Clopidogrel und ASS wurden den Tieren oral verabreicht. Um die Aufnahme zu

gewährleisten, wurden die Tabletten fein zerkleinert und über eine 20 ml Einwegspritze

(Terumo®

, Terumo Deutschland GmbH, Eschborn) per os verabreicht. Die Dosierung wurde

nach Vorgabe der Vorversuche auf 500 mg Acetylsalicylsäure und 75 mg Clopidogrel pro

Tier und Tag festgesetzt. Nach der Voreinstellung im Haupttierversuch stellte sich heraus,

dass diese Dosierung auf längere Sicht zu niedrig angesetzt war. Daher wurde die Dosierung

der Acetylsalicylsäure auf 1000 mg pro Tier und Tag heraufgesetzt, die des Clopidogrels auf

150 mg pro Tier und Tag.

PEG-Hirudin wurde als subkutane Injektion an der Bauchwand bzw. im Nackenbereich

appliziert. Für die Applikation wurde eine zwei ml Einwegspritze mit aufgesetzter 22 G

Kanüle (beide Terumo®

, Terumo Deutschland GmbH, Eschborn) verwendet. Zwei Stunden

nach der PEG-Hirudin-Applikation wurde eine Blutprobe zur Bestimmung des

Plasmahirudinspiegels entnommen und mittels ECT untersucht (s. 3.2.7.1). Die Dosierung

wurde täglich anhand des Plasmahirudinspiegels individuell angepasst. Die Initialdosis betrug

für alle Läufer fünf mg PEG-Hirudin. Der therapeutische Plasmahirudinspiegel sollte

zwischen 0,5 und 1,5 µg/ml liegen.

3.2.1.2 Bestimmung des Clinical Score nach MITTELHOLZER et al. (2000)

Die Bewertung und Dokumentation der klinischen Symptome wurde im Verlauf der Versuche

täglich anhand des Standardprotokolls, welches am EURL gebräuchlich ist, vorgenommen.

Das Untersuchungsschema stützt sich auf die Dokumentation der klinischen Erscheinungen

anhand eines Punktesystems (MITTELHOLZER et al., 2000). Dabei wurden neun KSP-

relevante Parameter (Lebhaftigkeit, Haltung, Nährzustand, Atmung, Gang, Haut,

Augen/Konjunktiven, Appetit und Kotabsatz) je nach Ausprägungsgrad mit einer Punktzahl

von null bis drei belegt (ohne besonderen Befund (o.b.B.), +, ++ und +++). Die Addition der

vergebenen Punkte ergab die klinische Punktzahl (clinical score) eines Tieres. Die maximale

3 Material und Methoden 49

Punktzahl betrug 27 Punkte. Der Clinical Score (CS) wurde sowohl für das Einzeltier

errechnet, als auch als Gruppenmittelwert dokumentiert. Das Untersuchungsschema von

MITTELHOLZER et al. (2000) enthält einen zehnten Parameter, „Futter im Trog“, der

aufgrund der Haltungsbedingungen (Gruppenhaltung) für das Einzeltier nicht zu errechnen

war und somit routinemäßig nicht dokumentiert wurde.

3.2.1.3 Erfassung der Körpertemperatur

Die Körpertemperatur wurde einmal täglich bei jedem Tier mit einem digitalen

Fieberthermometer (Geratherm®plus, Geratherm Medical AG, Geschwenda) rektal ermittelt

und dokumentiert.

3.2.1.4 Erfassung pathologisch-anatomischer Veränderungen

Analog zur Bestimmung des CS wurde für die Erfassung der pathologisch-anatomischen

Befunde ein standardisiertes Untersuchungsschema angewandt. In Anlehnung an das von

FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003) zur Errechnung eines Pathological Score erarbeitete

Untersuchungsschema wurden alle Organsysteme untersucht und nach Maßgabe des EURL

Standardprotokolls festgehalten. Besonderes Augenmerk galt Haut, Unterhaut und Serosen,

den Lymphknoten, Tonsillen, Milz, Nieren, Ileum inklusive Ileocaecalklappe, Rektum sowie

Herz und Respirationstrakt.

3.2.2 Virologische Methoden

3.2.2.1 Zellkulturtechnik

Für die Routineverfahren der virologischen und serologischen Diagnostik wurden PK(15)A

Zellen angezüchtet und passagiert. Die Kultivierung der Zelllinie erfolgte in 75 cm2

Kunststoff-Zellkulturflaschen unter Verwendung von Eagle´s Minimum Essential Medium

(EMEM) mit einem Zusatz von 5% fetalem Kälberserum (FKS) im Brutschrank bei 37°C.

Das FKS wurde vor der Benutzung auf Freiheit von Pestiviren und gegen sie gerichtete

Antikörper untersucht. Die Zellkultur wurde in regelmäßigen Abständen makroskopisch und

mikroskopisch kontrolliert. Nach drei bis vier Tagen war der Zellrasen konfluent und eine

weitere Passagierung konnte vorgenommen werden. Zur Passagierung wurde das

Erhaltungsmedium entfernt und der Zellrasen mit fünf ml adjusted trypsin-versen (ATV)

gewaschen. Es erfolgte ein zweiter Waschschritt mit fünf ml ATV mit kurzer Inkubation.

3 Methoden 50

Nach ca. 30 sec wurde das ATV abpipettiert und durch zwei ml frisches ATV ersetzt. Es

erfolgte nun eine 15- bis 20-minütige Inkubation bei 37°C zur Ablösung des Zellrasens. Die

nun abgelöst vorliegenden Zellen wurden in acht ml Kulturmedium (EMEM mit 5% FKS)

resuspendiert und durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren möglichst vollständig vereinzelt.

Die Zellzahl wurde mit der Thoma-Zählkammer (Heiland Vet GmbH, Hamburg) bestimmt.

Die angestrebte Zellzahl für die Aussaat in eine neue Flasche betrug 1,6 x 106 Zellen. Das

entsprechende Volumen der Zellsuspension, welches die gewünschte Zellzahl enthielt, wurde

in eine neue Kulturflasche überführt und mit ca. 20 ml Erhaltungsmedium aufgefüllt.

Für die Aussaat der Zellsuspension in Zellkulturröhrchen, Makro- oder Mikrotiterplatten

wurde das entsprechende Volumen der Zellsuspension zunächst auf das benötigte

Gesamtvolumen mit Kulturmedium aufgefüllt und mit diesem zusammen in die

entsprechenden Kulturgefäße verbracht.

Die Kultivierung der SFT-R Zelllinie erfolgte analog zu der der PK(15)A Zellen, allerdings

mit dem Erhaltungsmedium EDulb (EMEM modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN

[1959]) und einem Zusatz von zehn % FKS.

Die FKN-Zellen wurden aus bei -80°C eingefrorenen Primärkulturen angezüchtet. Die

Passagierung erfolgte für die gebrauchsfertige Kultur im drei bis vier Tage Rhythmus. Die

Zellen wurden dazu mit 0,125 %iger Versen-Trypsin-Lösung abgelöst, einmal mit phosphat

buffered saline minus (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium,

PBSM) gewaschen, bei 200 x g für 10 min zentrifugiert, und das Zellpellet in EDulb

Erhaltungsmedium resuspendiert. Die Zellen wurden daraufhin in einer Zählkammer nach

Thoma (Heiland Vet GmbH, Hamburg) ausgezählt und in entsprechende Kulturgefäße

ausgesät und mit Erhaltungsmedium versehen.

3.2.2.2 Virusvermehrung und Virusernte

Für die Verwendung in den Tierversuchen bzw. in den Virusneutralisationstests zur

serologischen Diagnostik, musste das KSPV Isolat CSF0634 vermehrt und bevorratet werden.

Die Anzüchtung des Virus erfolgte auf PK(15)A Zellen in 25 cm2 Zellkulturflaschen. Die

Zelleinsaat erfolgte mit 4,2 x 105 Zellen. Auf den semikonfluenten Zellrasen einer am Vortag

angesetzten Zellkulturflasche wurde, nach Entfernung des Mediums, ein ml virushaltiger

3 Material und Methoden 51

Zellkulturüberstand verimpft. Während der Adsorptionszeit von ein bis zwei Stunden bei

37°C wurde die Flasche mehrmals geschwenkt um eine gleichmäßige Verteilung und

Adsorption des Virus zu erreichen. Anschließend wurde mit ca. sieben ml Erhaltungsmedium

(EMEM mit 10% FKS) aufgefüllt und die Kultur einer 72-stündigen Inkubationszeit bei 37°C

zugeführt. Zur Freisetzung des Virus aus den Zellen schloss sich ein Gefrier-Tau-Zyklus an.

Zu diesem Zweck wurde die Zellkulturflasche bei -80°C eingefroren und nach frühestens

einer Stunde zügig aufgetaut. Das Zell-Virus-Gemisch wurde nun in Zentrifugenröhrchen

überführt und bei 4°C für 15 min bei 437 x g zur Abtrennung der zellulären Bestandteile

zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und in 0,5 ml Portionen bei -80°C

eingefroren. Vor Verwendung der so hergestellten Viruscharge im Tierversuch erfolgte eine

dreimalige Virustitration zur Bestimmung des Virustiters (s. 3.2.2.4).

3.2.2.3 Virusisolierung

Die Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion ist bis heute der „Goldstandard“ zum

labordiagnostischen Nachweis des KSPV (ANONYM,2004). Die Abtrennung der

Leukozytenfraktion erfolgt durch die Zugabe von EDTA-Dextran-Lösung. Die Leukozyten

binden an das Dextran und bleiben nach Sedimentation der Erythrozyten im Überstand, wo

sie abgenommen werden können. Durch Verimpfung der aufgearbeiteten

Leukozytensuspension (s.u.) auf PK(15)A Zellen erfolgten die Vermehrung und der Nachweis

des möglicherweise vorhandenen Virus. Routinemäßig wird die Vermehrung über zwei

Passagen durchgeführt.

Für die Abtrennung der Leukozytenfraktion wurden zu ca. zehn ml EDTA-Blut 0,5 ml steriler

EDTA-Dextran-Lösung hinzugefügt. Durch vorsichtiges Schwenken wurden die Bestandteile

durchmischt. Dieser Ansatz wurde daraufhin für ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur

inkubiert, bis sich eine deutliche, helle Phase abgesetzt hatte. Dieser leukozytenhaltige

Überstand wurde mit einer Pipette vorsichtig abgenommen und in ein Kahnröhrchen

überführt. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 437 x g waren die Leukozyten als Pellet am

Boden des Röhrchens sichtbar. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Pellet in drei bis

fünf ml PBSM resuspendiert und erneut unter den oben genannten Bedingungen zentrifugiert.

Der Vorgang wurde insgesamt dreimal wiederholt. Abschließend wurde das Leukozytenpellet

in zwei ml PBSM aufgenommen, in zwei Portionen geteilt und bei -80°C in Kryoröhrchen

tiefgefroren.

3 Methoden 52

Die erste Passage zur Vermehrung des Virus erfolgte in Zellkulturröhrchen. In die

Zellkulturröhrchen wurden zu diesem Zweck PK(15)A Zellen ausgesät und für 24 Stunden

bei 37°C inkubiert. Die Zelleinsaat betrug nach Zählung in der Thoma-Zählkammer ca. 8,5 x

104 Zellen. Nach Entfernung des Erhaltungsmediums wurde der semikonfluente Zellrasen mit

200 µl der wieder aufgetauten Leukozytensuspension beimpft. Als positive Kontrolle wurden

zwei Kulturröhrchen mit ca. 106,5

KID50 des Referenzstammes Alfort 187 (CSF0902) beimpft,

zwei Röhrchen wurden als Negativkontrolle unbeimpft mitgeführt. Nach einer

Adsorptionszeit von ein bis zwei Stunden bei 37°C wurde jedes Kulturröhrchen zweimal mit

1,5 ml PBSM gewaschen und danach mit einem ml Kulturmedium (EMEM mit

Antibiotikazusatz und 10% FKS) befüllt. An eine Inkubationszeit von 72 Stunden

anschließend fand ein Gefrier-Tau-Zyklus zur Freisetzung des vermehrten Virus statt. Dazu

wurde die Zellkultur bei -80°C für mindestens eine Stunde eingefroren. Nach einem raschen

Auftauprozess wurden die Röhrchen für zehn min bei 941 x g zentrifugiert.

Für die zweite Passage der Virusisolierung wurden daraufhin je 200 µl des Überstands in die

Vertiefungen einer Makrotiterplatten gegeben, in die am Vortag PK(15)A Zellen eingesät

wurden. Die Zelleinsaat betrug ca. 1,6 x 106 Zellen. Neben der Verimpfung der positiven

Kontrolle aus der ersten Passage, wurden erneut ca. 106,5

KID50 Alfort 187 in zwei Kavitäten

inokuliert. Die beimpften und mit Kulturmedium (EMEM mit Antibiotikazusatz und 10%

FKS) aufgefüllten Makrotiterplatten wurden für 72 Stunden bei 37°C im Brutschrank mit

CO2-Begasung (4%) inkubiert. Der Nachweis des KSPV wurde auf der hitzefixierten Makro-

titerplatte mittels direkter Immun(peroxidase)färbung (DIF) vorgenommen (s. 3.2.2.6).

3.2.2.4 Virustitration

Zur Bestimmung des Virustiters einer Virussuspension wurden Titrationen nach der

Endpunkt-Verdünnungsmethode in Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Verdünnungsreihen

wurden in log10-Stufen von 10-1

bis 10-8

angelegt und in vierfachem Ansatz getestet. Dazu

wurden jeweils vier Kavitäten der Mikrotiterplatte mit je 100 µl der verdünnten

Virussuspensionen beschickt. Für die mitzuführende Zellkontrolle wurden in vier Spalten der

Mikrotiterplatte jeweils 100 µl Medium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz)

einpipettiert. Danach wurden jeweils 50 µl einer, auf 1,6 x 106 Zellen eingestellten,

Zellsupension zugegeben. Die Inkubation erfolgte in einer feuchten Kammer bei 37°C im

Brutschrank mit 4%-iger CO2-Atmosphäre für 72 Stunden. Nach dieser Zeit wurden die

3 Material und Methoden 53

Mikrotiterplatten bei 80°C für drei Stunden hitzefixiert und das Virusantigen mittels DIF

(3.2.2.6) nachgewiesen. Die Kalkulation des Titers als KID50 pro 100 µl erfolgte anhand der

Schätzformel nach KÄRBER (1931).

Viruschargen, die für den Einsatz im Tierversuch bestimmt waren, wurden an drei

unterschiedlichen Tagen titriert und berechnet.

3.2.2.5 Virusneutralisationstest

Der qualitative und quantitative Nachweis neutralisierender Antikörper (nAk) gegen das

Virus der KSP im Serum der Versuchstiere wurde mittels Virusneutralisationstest (VNT)

geführt. Das Testprinzip beruht auf der Inkubation einer Verdünnungsreihe des zu testenden

Serums mit einer definierten Virusmenge. Nach Verimpfung des Virus-Serum-Gemisches auf

eine empfängliche Zellkultur erfolgt ein Virusnachweis durch DIF (s. 3.2.2.6). Waren in der

Serumprobe nAk vorhanden, wurde das Virus vollständig oder bis zu einer gewissen

Verdünnungsstufe neutralisiert, d.h., es war kein Virusnachweis in der DIF möglich. Anhand

der Verdünnungsreihe lässt sich dann der Antikörpertiter, ausgedrückt als

Neutralisationsdosis50 (ND50), unter Verwendung der Formel nach KÄRBER (1931)

kalkulieren. Die ND50 ist diejenige Verdünnung, bei der noch 50% einer empfänglichen

Zellkultur vor der Infektion mit dem entsprechenden Testvirus geschützt sind.

Der VNT wurde im Verlauf der Versuche für zwei unterschiedliche Zwecke eingesetzt.

Einerseits wurde zu Versuchsbeginn nachgewiesen, dass die entsprechenden Tiere keine nAk

gegen Pestiviren besaßen, andererseits wurde das Serum vom Tag der Euthanasie auf das

Vorhandensein nAk getestet.

Frisch aufgearbeitetes bzw. aufgetautes Serum wurde direkt in einer Mikrotiterplatte

verdünnt. Alle Tests wurden im Doppelansatz ausgeführt. Für die erste Verdünnungsstufe

wurden 80 µl Erhaltungsmedium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz) und 20 µl

log KID50= L1,0 - Lint (S-0,5)

Mit:

L1,0 = Logarithmus der höchsten Verdünnungsstufe mit der Reaktionsrate 1,0

Lint = Logarithmus des Verdünnungsintervalls

S = Summe der Reaktionsraten, begonnen bei der letzten Reaktionsrate, die 1,0 beträgt

3 Methoden 54

Serum in jeweils zwei Vertiefungen der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte gegeben und

durch Auf- und Abpipettieren gut durchmischt. Die Initialverdünnung betrug somit 1:5. In

alle benötigten weiteren Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden 50 µl Medium vorgelegt.

Mit einer Zwölfkanalpipette wurde nun eine log2-Verdünnungsreihe des Serums dergestalt

angelegt, dass jeweils 50 µl der vorherigen Verdünnungsstufe entnommen, und in die nächste

Reihe der Kavitäten einpipettiert wurden. Nach Verwerfen von 50 µl aus der letzten Reihe der

Kavitäten entstand somit eine Verdünnungsreihe des Serums von 1:5 bis 1:640. Das jeweilige

Testvirus wurde so in Medium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz) aufgenommen,

dass die Virussuspension ca. 200 KID50/100 µl enthielt. 50 µl, d.h. 100 KID50, wurden nun zu

den Serumverdünnungen hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C

im Brutschrank mit 4% CO2-Atmosphäre in einer feuchten Kammer wurden 50 µl einer

Zellsuspension hinzugegeben, die auf 1,6 x 106 Zellen/ml eingestellt worden war. Eine

Negativkontrolle, die ausschließlich Medium (EMEM mit 10% FKS und Antibiotikazusatz)

und Zellen enthielt, wurde mitgeführt. Um die Validität des Tests zu überprüfen, wurde die

eingesetzte Virussuspension rücktitriert, d.h., es wurde eine Verdünnungsreihe von 100 bis

104 angelegt und in jeweils 4 Kavitäten nach den oben beschriebenen Grundsätzen einer

Virustitration (s. 3.2.2.4) behandelt. Die auf diese Weise ermittelte, tatsächlich eingesetzte

Virusdosis wurde als valide angesehen, wenn sie zwischen 30 und 500 KID50/50 µl lag.

Neben dieser Rücktitration wurde eine Virustitration der eingesetzten Viruscharge

durchgeführt um die Werte in Beziehung zu setzen und etwaige Fehlerquellen aufzuzeigen.

Die Platten wurden für 72 Stunden in einer feuchten Kammer bei 37°C im Brutschrank mit

4% CO2-Atmosphäre inkubiert. Nach einer Hitzefixierung schloss sich eine direkte

Immunfärbung (s. 3.2.2.6) an. Die Kalkulation der ND50 erfolgte nach der Formel nach

KÄRBER (1931).

3.2.2.6 Direkte Immunfärbung (Peroxidase-linked assay, PLA)

Der Nachweis des KSPV Antigens erfolgte in hitzefixierten Mikro- bzw. Makrotiterplatten als

direkte Immunperoxidasefärbung (SAUNDERS, 1977) mit einem PO-Konjugat des mAks

BVD/C16, der pestivirusspezifisch ist (s. 3.1.5).

Für die Hitzefixierung wurde das Kulturmedium mit Hilfe einer Vakuumpumpe aus den

Kavitäten der entsprechenden Platten entfernt und der Zellrasen einmal mit 1/3 PBS

(phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen. Die Fixierung

3 Material und Methoden 55

der Platten erfolgte anschließend bei 80°C für drei Stunden im Heißluftsterilisator. Der wieder

erkaltete Zellrasen wurde vor dem Färbevorgang mit PBS-Tween (PBS mit einem Zusatz von

0,1% Tween20) befeuchtet. Nun wurden pro Mikrotiterplattenvertiefung 50 µl und pro

Makrotiterplattenvertiefung 200 µl der Konjugat-Gebrauchsverdünnung einpipettiert. Die

Konjugatverdünnung richtete sich nach der Charge des BVD/C16-PO-Konjugates und

bewegte sich zwischen 1:150 und 1:500 in PBS-Tween. Nach einer Inkubationszeit von einer

Stunde bei 37°C wurde das Konjugat entfernt und der Zellrasen dreimal mit PBS-Tween

sowie einmal mit Aqua bidestillata (A. bidest.) gewaschen, um ungebundenes Konjugat zu

entfernen. Die chromogene Substratlösung enthielt 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) in einer

AEC-Dimethylformamid-Stammlösung, Natriumazetatpuffer sowie 3 %iges Wasserstoff-

peroxid (H2O2) und wurde jeweils frisch angesetzt. Die Kavitäten der Platten wurden mit

jeweils 50 µl (Mikrotiterplatte) bzw. 200 µl (Makrotiterplatte) dieser Substratlösung

überschichtet und für zehn bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das H2O2 diente

dabei als Substrat der Peroxidase. Die Substratumsetzung führte zu einem rot-braunen

Niederschlag im Bereich des Zytoplasmas infizierter Zellen. Die Auswertung der Platten

erfolgte im Lichtmikroskop nach Entfernung der Substratlösung, zweimaligem Waschen und

Auffüllen mit A. bidest. Eine Kavität galt als „positiv“ wenn das Zytoplasma einer bzw.

mehrerer Zellen gefärbt, der Zellkern jedoch ungefärbt war.

3.2.2.7 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Neben dem Virusneutralisationstest wurden zwei Antikörper-ELISA zum

Antikörpernachweis in Serumproben eingesetzt. Dies waren:

• CHEKIT-CSF-Sero (ehemals Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Schweiz)

• Classical Swine Fever Virus (CSFV) Antibody Test Kit, HerdChek (IDEXX

Laboratories, Wörrstadt)

Beide Test-Kits wurden entsprechend den Herstellerangaben verwendet.

Im Rahmen der Vorversuche wurde zudem folgender Antigen-ELISA nach

Herstellerprotokoll eingesetzt:

• CSFV Antigen Test Kit, HerdChek (IDEXX Laboratories, Wörrstadt)

3 Methoden 56

Die Extinktionswerte der Proben und Kontrollen wurden im ELISA-Lesegerät (Spectra II,

Labinstruments, Österreich) gemessen und nach Herstellerangaben ausgewertet und validiert.

3.2.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)

In Versuchen mit aus Tierschutzgründen limitiertem Probenvolumen wurde der Nachweis der

erfolgreichen Infektion mittels PCR erbracht. Da der Nachweis der Pestivirus-Freiheit vor

Versuchsbeginn geführt wurde, fand ausschließlich eine SYBR®

Green real-time RT-PCR

(reverse transcription polymerase chain reaction) mit den Panpesti-Primern 324 und 326 statt

(VILCEK, 1994), die ein 288 bp Fragment der 5`-NTR Region des Pestivirusgenoms

amplifizierten. Alle PCRs wurde in der MX 4000 PCR-Maschine (Stratagene, La Jolla,

California, USA) durchgeführt. Das während der PCR entstehende Amplifikat wurde in

Echtzeit mittels SYBR® Green angefärbt und die entstehende Fluoreszenz bei einer

Wellenlänge von 520 nm gemessen. Die zu erwartende Schmelztemperatur des Amplifikats

betrug 85°C. Im Folgenden sind RNA-Isolierung, reverse Transkription und PCR näher

erläutert.

RNA-Isolierung

Die Isolierung der RNA aus EDTA- bzw. Citratblutproben erfolgte mit dem QIAamp Blood

Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben.

Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Synthese der komplementären DNA (cDNA) und PCR erfolgten in einem Ansatz (single

tube two enzyme system). Die Primer nach VILCEK et al. (1994) besaßen folgende Sequenzen

(in Klammern sind die Lokalisationen der Primer im Pestivirusgenom (Nukleotide, nt)

angegeben):

Primer 324 5`-ATG-CCC-(AT)TA-GTA-GGA-CTA-GCA-3` (nt 107-127)

Primer 326 5`-TCA-ACT-CCA-TGT-GCC-ATG-TAC-3` (nt 376-396)

3 Material und Methoden 57

Der Mastermix enthielt für jede Probe folgende Komponenten: 25 µl QuantiTECT SYBR®

Green RT-PCR Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden), jeweils einen µl (30 pmol) der Primer

324 und 326, 0,5 µl Reverse Transkriptase und 16,5 µl H2O. 44 µl des sorgfältig gemischten

Mastermixes und sechs µl der RNA wurden in die Reaktionsgefäße eingefüllt und in die PCR

Maschine verbracht. Die Reaktionsbedingungen sahen folgendermaßen aus:

50°C 30 min Reverse Transkription

95°C 15 min Aktivierung der Polymerase

95°C 15 sec

56°C 30 sec*

72°C 30 sec

81°C 15 sec* * Messung der Fluoreszenz

Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte computergestützt.

x 40 Zyklen

3 Methoden 58

3.2.3 Hämatologische Methoden

3.2.3.1 Parameter des weißen Blutbildes

In den Experimenten zur Untersuchung der klinischen, hämatologischen, hämostaseo-

logischen sowie (histo-)pathologischen Veränderungen wurden die Parameter des weißen

Blutbildes mit dem halbautomatischen Sysmex F-800 System (Sysmex Deutschland GmbH,

Norderstedt) erhoben. Gleiches gilt für das Versuchsvorhaben zur Rolle des plasmatischen

Gerinnungssystems.

Für das Versuchsvorhaben zur Untersuchung der Thrombozyteninteraktionen wurden die

Messungen mit dem mölab Hämatologie-System Modell 8702/6 (Fa. Mölab, Hilden)

durchgeführt. Mit diesem System wurde ausschließlich die Gesamtleukozytenzahl in [G/l]

nach Herstellerangaben bestimmt. Die Dokumentation und Auswertung der ausgegebenen

Ergebnisse erfolgte manuell.

3.2.3.2 Thrombozytenparameter

Die Messung der Thrombozytenparameter erfolgten mit dem halbautomatischen Sysmex

F-800 System (Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt) Die ermittelten Parameter und

Referenzbereiche sind in Tabelle 3-1 dargestellt.

Tabelle 3-1: Thrombozytenparameter, die im Rahmen der Versuchsvorhaben mittels Sysmex F-800

untersucht wurden. Der Parameter Large Platelets wird auch im deutschsprachigen Bereich nicht

übersetzt, daher wird auch hier der englische Begriff verwendet.

Parameter Einheit Referenzbereich

Thrombozytenzahl (PLT) 103 /µl 138,2 – 467,8

Mittleres Thrombozytenvolumen (MPV) fl 6,8 – 12,6

Large Platelets 103 /µl nicht bekannt

Im Rahmen des Versuchsvorhabens zur Untersuchung der Thrombozyteninteraktionen

wurden die Messungen mit dem mölab Hämatologie-System Modell 8702/6 (Fa. Mölab,

Hilden) durchgeführt. Es wurde ausschließlich die Thrombozytenzahl in [G/l] nach

Herstellerangaben bestimmt.

3 Material und Methoden 59

3.2.4 Hämostaseologische Methoden

Global- bzw. Gruppentests der Blutgerinnung

Die Global- oder Gruppentests sind Screeningmethoden, die bestimmte Bereiche des

plasmatischen Gerinnungssystems überprüfen, d.h. intrinsischen und extrinsischen Pfad sowie

die gemeinsame Endstrecke. Zur Beurteilung der verschiedenen Anteile werden

stellvertretend der Quick-Wert (Synonyme: Thromboplastinzeit bzw. Prothrombinzeit) für

den extrinsischen Pfad, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit für den intrinsischen Pfad

und die Thrombinzeit für die gemeinsame Endstrecke gemessen.

Für die Durchführung der Globaltests wurde das Kugelkoagulometers KC 4 A der Fa.

Amelung, Lemgo. Bei dieser Meßmethode befindet sich der Gerinnungsansatz in leicht

schräg gelagerten Küvetten, die sich um die eigene Achse drehen. Eine dem Ansatz

zugegebene kleine Edelstahlkugel läuft vor Eintritt der Gerinnung an vorgegebener Stelle.

Gerinnt der Ansatz, verbleibt die Kugel nicht mehr an dieser Stelle, sondern wird durch die

Fibrinfasern mitgezogen. Die Lageänderung der Kugel wird von einem magnetischen Sensor

aufgenommen und elektronisch registriert.

3.2.4.1 Prothrombinzeit (Quick-Test)

Die Messung der Prothrombinzeit erlaubt eine Einschätzung des extrinsischen Weges der

Blutgerinnung. Dabei werden die Faktoren II, V, VII und X erfasst. Das Testprinzip beruhte

auf der Gerinnungsaktivierung durch die Inkubation der Plasmaproben mit einer definierten

Menge Thromboplastin und Calcium. Es wurde die Zeit bis zur Bildung eines

Fibringerinnsels gemessen.

Zur Bestimmung der Prothrombinzeit im Citratplasma der Schweine wurde Thromborel® S

der Fa. DADE Behring (Marburg) in einem nach MISCHKE modifizierten Protokoll

eingesetzt (MISCHKE, persönliche Mitteilung). Für die Testdurchführung wurde das frisch

entnommene Citratblut zentrifugiert aliquotiert, und bis zum Verbrauch bei -80°C gelagert.

Direkt vor dem Test wurden die Proben rasch im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und innerhalb

einer Stunde gemessen. Das Thromborel®

S Reagenz wurde durch Zugabe der vom Hersteller

angegebenen Menge A. bidest. rekonstituiert und vor Gebrauch auf 37°C vorgewärmt sowie

mindestens 30 min bei dieser Temperatur gehalten.

3 Methoden 60

Zur besseren Differenzierung des physiologischen und pathologischen Bereichs wurde eine

Verdünnung der Plasmaproben mit Diäthylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (Fa. DADE

Behring, Marburg) vorgenommen (NOWAK; MISCHKE, persönliche Mitteilungen). Zu

diesem Zweck wurden die Proben nach Optimierung anhand einer Eichkurve 1:10 mit der

Pufferlösung verdünnt. Um trotz Verdünnung des Plasmas die Bildung eines ausreichend

festen Gerinnsels zu gewährleisten, wurde dem Gerinnungsansatz plasminogenarmes

humanes Fibrinogen (FIB 1 der Fa. Haemochrom Diagnostica, Essen) in einer Konzentration

von 2 g/l zugesetzt (MISCHKE, persönliche Mitteilung). Dazu wurde das lyophilisierte

Fibrinogen unter ständigem Rühren vorsichtig in A. bidest. gelöst und in 1000 µl Aliquots bei

–20°C eingefroren. Erst direkt vor dem Gebrauch wurde es rasch wieder aufgetaut und

eingesetzt.

Der eigentliche Testansatz sah folgendermaßen aus: 100 µl der verdünnten Probe wurden mit

100 µl Fibrinogenlösung eine min bei 37°C inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 100 µl

Thromborel®

S wie auch die Messung und Protokollierung der Gerinnungszeit. Zur

Evaluierung des Tests wurden täglich die Gerinnungszeiten an humanem Kontrollplasma und

gepooltem Plasma gesunder Schweine überprüft (Kontroll-Plasma N, Fa. DADE Behring,

Marburg).

3.2.4.2 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)

Die Messung der aPTT erlaubte eine schnelle Aussage zur Funktion des intrinsischen Pfades

des plasmatischen Gerinnungssystems; sie erfasst die Faktoren VIII und IX sowie die

Kontaktfaktoren. Das Prinzip der Meßmethode beruhte auf der Aktivierung des intrinsischen

Pfades durch Inkubation des Plasmas mit Phospholipiden und einem Oberflächenaktivator.

Durch Zugabe von Calcium-Ionen wurde der Gerinnungsvorgang ausgelöst.

Zur Bestimmung der aPTT im Citratplasma der Schweine fanden zwei verschiedene

Reagenzien Verwendung. Zum einen das Pathromtin®

der Fa. DADE Behring (Marburg),

zum anderen das Actin FS®

derselben Firma. Der Wechsel der Reagenzien war darin

begründet, dass die Fa. DADE Behring Pathromtin®

zugunsten eines Nachfolgeproduktes

vom Markt nahm. Das neue Testsystem (Pathromtin SL®

) war jedoch nicht für

Schweineplasma geeignet.

3 Material und Methoden 61

Für die Testdurchführung wurde das frisch entnommene Citratblut bei 1215 x g für zehn min

zentrifugiert und danach sofort in kleinen Aliquots (600-1000 µl) bei –80°C eingefroren.

Direkt vor dem Test wurden die Proben rasch aufgetaut und innerhalb einer Stunde gemessen.

Die Verwendung von Pathromtin® erfolgte nach Herstellerangaben. Das aufgeschüttelte

Aktivator-Reagenz wurde in das Fläschchen mit Pathromtin® überführt, um damit das

Lyophilisat zu lösen. Nach fünf min bei Raumtemperatur war das Reagenz einsatzbereit. Der

Gerinnungsansatz wurde als Doppelansatz in eine, auf 37°C vorgewärmte Küvette pipettiert:

100 µl Citratplasma wurden mit 100 µl Pathromtin® gemischt und für zwei min bei 37°C

inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Calciumchlorid-Lösung (0,025 mol/l) wurde die Messung

gestartet und das Ergebnis protokolliert.

Bei der Verwendung von Actin FS®

wurde eine Verdünnung der Plasmaproben nach Vorgabe

einer im Vorfeld für jede Actin FS®

Charge erstellten Eichkurve mit Diäthylbarbiturat-Acetat-

Pufferlösung (Fa. DADE Behring, Marburg) vorgenommen, um die Gerinnungszeiten des

physiologischen und pathologischen Bereichs besser abgrenzen zu können. Die weitere

Vorbereitung der Proben und der Reagenzien sowie die Messung der Gerinnungszeit erfolgte

nach Herstellerangaben. 100 µl Actin FS®

wurden mit 100 µl der verdünnten Plasmaprobe

gemischt und bei 37°C für drei Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl CaCl2-Lösung

wurde die Gerinnungszeit gemessen.

3.2.4.3 Thrombinzeit

Die Thrombinzeit erlaubt eine Einschätzung der Endstrecke der Gerinnung, die allerdings

auch im Rahmen der oben genannten Tests erfasst wird. Das Testprinzip beruht auf der

Zugabe von Thrombin und nachfolgender Messung der Umwandlung des in der Probe

enthaltenen Fibrinogens in Fibrin.

Zur Bestimmung der Thrombinzeit im Citratplasma der Schweine wurde Test-Thrombin-

Reagenz der Fa. DADE Behring (Marburg) verwandt. Für die Testdurchführung wurde das

frisch entnommene Citratblut (ein Teil Natriumcitrat-Lösung, neun Teile venöses Blut) wie

für die aPTT und Prothrombinzeit beschrieben zentrifugiert und aliquotiert. Direkt vor dem

Test wurden die Proben rasch im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und innerhalb einer Stunde

gemessen. Die Vorbereitung des Testreagenz ebenso wie die Messungen erfolgte nach

Herstellerangaben. Für den Gerinnungsansatz wurden 100 µl Citratplasma eine Minute bei

37°C inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl Test-Thrombin-Reagenz und die

3 Methoden 62

Messung der Gerinnungszeit. Auch für diesen Test erfolgte die interne Kontrolle mit

humanem Kontrollplasma (Kontroll-Plasma N, DADE Behring, Marburg).

3.2.4.4 Fibrinogenbestimmung

Photometrische Fibrinogenbestimmung im Plasma nach RATNOFF und MENZIE (1951)

Testprinzip: Durch Zusatz von Thrombin und Calciumionen wurde das in der

Citratplasmaprobe enthaltene Fibrinogen zum Gerinnen gebracht. Das ausgefallene

Fibringerinnsel wurde aus der Probe extrahiert, zur Beseitigung von Plasmaresten gewaschen

und in NaOH (0,75 mol/l) hydrolysiert. Der Proteinanteil im Hydrolysat wird unter

Ausnutzung der Biuretreaktion photometrisch bestimmt. Die Intensität der Färbung verhielt

sich zur Peptidbindungszahl linear und erlaubt eine quantitative Aussage zur

Proteinkonzentration. Die Ermittlung der Fibrinogengehalte in g/l erfolgt anhand einer

Fibrinogenstandardkurve. Ein Vorteil dieser Methode ist die Tatsache, dass die Messwerte

durch Fibrinogen-Degradationsprodukte nicht beeinflusst werden (BARTHELS u. VON

DEPKA, 2003). Das verwendete Testprotokoll wurde freundlicherweise von der AG

Pharmakologische Hämostaseologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena zur Verfügung

gestellt.

Zur Erstellung der Standardkurve wurde eine Fibrinogenverdünnungsreihe angelegt. Der

100 % Wert entsprach 12 mg Fibrinogen (F-4883 der Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen) in

einem ml Lösung. Für die gesamte Kurve wurden drei ml der 100 %igen Lösung benötigt.

Dazu wurde lyophilisiertes Fibrinogen in ein Polystyrol-Röhrchen eingewogen und bei 37°C

im Wasserbad unter vorsichtigem Schwenken in A. bidest. gelöst. Aus der Ausgangslösung

wurden unter Zugabe einer Sicherheitsmarge die restlichen Standardwerte hergestellt (Tabelle

3-1):

Tabelle 3-2: Fibrinogenverdünnungsreihe (Standardkurve).

75% Wert mit 9 mg/ml 825 µl Ausgangslösung 275 µl NaCl-Lösung

50 % Wert mit 6 mg/ml 550 µl Ausgangslösung 550 µl NaCl-Lösung

25 % Wert mit 3 mg/ml 275 µl Ausgangslösung 825 µl NaCl-Lösung

12,5 % Wert mit 1,5 mg/ml 137,5 µl Ausgangslösung 962,5 µl NaCl-Lösung

3 Material und Methoden 63

Für die Thrombinlösung wurde Thrombin in ein Polystyrol-Röhrchen eingewogen und in

NaCl-Lösung dergestalt gelöst, dass eine Lösung mit 100 U/ml entstand.

Die Gerinnungsansätze wurden in Polystyrol-Röhrchen unter Beachtung folgender

Mengenverhältnisse vorbereitet (Tabelle 3-3):

Tabelle 3-3: Gerinnungsansätze für die Fibrinogenbestimmung aus Plasma.

Prüfansatz Standardwerte

Plasmaprobe 0,5 ml -

Fibrinogenstandards - 0,5 ml

NaCl (154 mmol/l) 1,5 ml 1,5 ml

CaCl2 (50 mmol/l) 1,5 ml 1,5 ml

Thrombinlösung (100 U/ml) 0,5 ml 0,5 ml

Die Gerinnungsansätze wurden mit einem Deckel verschlossen und eine Stunde bei 37°C im

Wasserbad inkubiert. Das entstandene Fibringerinnsel wurde mit Hilfe eines rauhen

Holzstabes (Schaschlik-Stäbchen der Firma Fackelmann, Hersbruck) auf den Stab

aufgewickelt und am Röhrchenrand ausgedrückt. Plasmareste wurden durch mehrfaches

Abspülen mit NaCl und Abrollen des aufgewickelten Gerinnsels auf Filterpapier entfernt.

Nach dem Waschvorgang wurde das Gerinnsel vom Stab abgerollt und in ein neues Röhrchen

überführt. Zur Hydrolyse des Gerinnsels wurden nun zwei ml NaOH zugegeben. Das

verschlossene Röhrchen wurde über Nacht bei Raumtemperatur bzw. für eine Stunde bei

37°C im Wasserbad inkubiert. Nach vollständiger Lyse des Gerinnsels wurden vier ml Biuret-

Gebrauchslösung zugegeben und ohne Schaumbildung untergemischt. Als Leerwert wurden

zwei ml NaOH mit vier ml Biuret-Gebrauchslösung gemischt. Nach 30 bis 60 min wurden die

Ansätze durch eine Filtrationseinheit in ein neues Gefäß gegeben und unverzüglich am

Photometer (Ultraspec 2000, Amersham, Freiburg) bei einer Wellenlänge von 546 nm gegen

den Leerwert gemessen. Die Standardwerte wurden in eine Microsoft Excel Tabelle überführt

und in einem x,y-Diagramm unter Hinzufügen einer Trendlinie und der abgeleiteten Formel

graphisch dargestellt. Das Bestimmtheitsmaß R2 sollte im günstigsten Fall eins betragen. Die

3 Methoden 64

Fibrinogenkonzentrationen der Plasmaproben konnten dann anhand dieser Standardkurve,

bzw. der daraus abgeleiteten Formel, rechnerisch ermittelt werden.

Da im Versuchsvorhaben zur Rolle der Thrombozyteninteraktionen die verhandene

Plasmamenge aus Tierschutzgründen limitiert war, wurde der Ansatz für dieses Experiment

halbiert. Der Ansatz der Fibrinogenstandardkurve wurde diesen Bedingungen angepasst.

Bestimmung des gerinnbaren Fibrinogens nach CLAUSS (1957)

Abweichend von der oben beschriebenen Methode wurden die Fibrinogenbestimmungen in

den Vorversuchen nach den Vorgaben der Methode nach CLAUSS (1957) durchgeführt. Die

Methode nach CLAUSS ist in der Humanmedizin über die DIN 58 906-Fib1 festgeschrieben

und beruht auf einer Variation der Thrombinzeit. Nach Zugabe einer standardisierten Menge

Thrombins ist die gemessene Gerinnungszeit der Fibrinogenkonzentration proportional

(HOFFMAN und GREENBERG, 1987). Anhand einer Bezugskurve, die mit verschiedenen

Verdünnungen eines Plasmas bekannter Fibrinogenkonzentration erstellt wurde, konnte der

Fibrinogengehalt in g/l errechnet werden.

3.2.4.5 Ethanol-Gelation-Test (EGT)

Das Testprinzip beruht auf der Beobachtung, dass Fibrinmonomere und kleine

Fibrinpolymere in der Gegenwart einer niedrigen Ethanolkonzentration präzipitieren

(GODAL und ABILDGAARD, 1966; BREEN und TULLIS, 1968). Das Probenmaterial war

Citratplasma, welches durch zehnminütige Zentrifugation bei 1750 x g aus der mit

Natriumcitrat versetzten Blutprobe isoliert wurde. Der vorliegende Testansatz eignete sich nur

für frische, nicht für gefrorene Plasmaproben. Es fanden zwei Testprotokolle Anwendung:

Protokoll 1: In einem Glasröhrchen wurden 500 µl der Plasmaprobe für drei min bei 37°C

inkubiert. Danach wurden 150 µl Ethanol zugegeben und der Ansatz für weitere zehn min bei

37°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde der Ansatz makroskopisch auf die Bildung von

Fibringel untersucht. Der Test wurde als negativ betrachtet, wenn keine Reaktion eintrat oder

eine körnige Ausfällung stattfand. Im Falle einer Gelierung oder beim Sichtbarwerden von

definitiven Fibrinsträngen wurde der Test als positiv erachtet.

Da dieses Protokoll keine Differenzierung zwischen positiven und falsch positiven

Ergebnissen erlaubt, wurde es im Verlaufe der Untersuchungen durch das Originalprotokoll

3 Material und Methoden 65

von BREEN und TULLIS ersetzt. Der Aufbau des dort beschriebenen Tests beinhaltet die

Herstellung eines alkalischen Reaktionsmilieus (pH > 7,70), was eine Differenzierung

ermöglicht. Dieses Protokoll (Protokoll 2) sah folgende Verfahrensweise vor:

Neun Tropfen Plasma wurden mit einem Tropfen 0,1 N NaOH sowie drei Tropfen 50 %

Ethanol gemischt. Der Testansatz wurde vorsichtig gemischt und für eine Minute bei

Raumtemperatur inkubiert. Trat eine Gelformation binnen einer min auf, wurde der Test als

positiv betrachtet. Später auftretende Präzipitate bzw. Gelformationen in den folgenden neun

min wurden durch Zugabe eines weiteren Tropfens 0,1 N NaOH überprüft. Unspezifische

Präzipitate lösten sich unter diesen Bedingungen wieder auf, während Fibringele erhalten

blieben.

3.2.4.6 Thrombozytenaggregationstest

Testprinzip und Vorarbeiten:

Die Thrombozytenaggregation ist ein in zwei Phasen verlaufender Prozess, der am Ende zur

irreversiblen Zusammenballung der Plättchen führt. Bei dem eingesetzten Verfahren zur

Messung der Aggregation, der turbidimetrischen Bestimmung von Zellsuspensionen im

Verfahren nach BORN (1962), wurde die Trübungsabnahme im plättchenreichen

Citratplasma nach Zusatz verschiedener Induktorsubstanzen wie ADP, Arachidonsäure,

Ristocetin oder Kollagen photometrisch, im vorliegenden Versuchsansatz durch das APACT

(automated platelet and coagulation tracer) System (LABiTec GmbH, Ahrensburg) erfasst

und ausgewertet. Das Plasma wurde für die Messung auf 37°C vorgewärmt und durch einen

Magnetrührer in Bewegung gehalten. Die Methode beruht auf der Eigenschaft, dass die

optische Dichte einer Partikelsuspension abhängig von der Partikelzahl und nicht der

Partikelgröße ist. Während plättchenreiches Plasma (PRP) nur eine geringe Durchlässigkeit

für langwelliges Licht besitzt, ist plättchenarmes Plasma (PPP) nahezu vollständig

durchlässig. Die prozentuale Lichtdurchlässigkeit diente als Maß für die Aggregation, in

deren Verlauf sich die Partikelgröße erhöhte, die Partikelzahl jedoch reduzierte. Die

Transmissionsänderung wurde zur Betrachtung und Auswertung kontinuierlich aufgezeichnet

und als Kurve ausgegeben. Zur Erlangung einer ausreichenden Vergleichbarkeit und

Reproduzierbarkeit erfolgte der Test mit einer standardisierten Thrombozytenzahl. Der

3 Methoden 66

Ausgleich der Transmissionsunterschiede wurde durch Einstellung des PRP als 0%-Wert und

des PPP als 100%-Wert erreicht.

Durch tierartspezifische Unterschiede lassen sich für das Schwein nicht alle Induktoren

verwenden. In Vorversuchen wurde daher die Eignung der verschiedenen Induktoren in

verschiedenen Konzentrationen getestet. Für die weiteren Untersuchungen wurden ADP und

Kollagen eingesetzt. Die physiologische Aggregationskurve nach ADP-Zugabe sollte wie

folgt aussehen: Zunächst stellte sich eine Formveränderung der Thrombozyten ein (shape

change), die als kurze Abnahme der Transmission zu sehen war. Danach folgte ein Anstieg

der Aggregationskurve (primäre Aggregation) auf ca. 55-60 %, die im Verlauf entweder eine

rückläufige Tendenz zeigte (Desaggregation), oder nach dem Erreichen eines Plateaus in die

zweite Phase der Aggregation überging (sekundäre Aggregation). Der Verlauf war u.a. von

der Konzentration des Induktors abhängig. Die Kollagen-induzierte Aggregationskurve wies

keine shape change Phase auf und erreichte eine maximale Aggregation von bis zu 85 %.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das beschriebene Verfahren eingesetzt, um die Wirkung des

Clopidogrels und der Acetylsalicylsäure zu überwachen. Die Wirkung des Clopidogrels liess

sich an der ADP-induzierten Aggregationskurve, die der Acetylsalicylsäure an der Kollagen-

induzierten Aggregationskurve ablesen, da die genannten Stoffe Inhibitoren dieser

Aggregationswege sind.

Testdurchführung:

Das PRP wurde durch niedertourige Zentrifugation für 20 min bei 31 x g gewonnen. Der

Überstand wurde sofort mit einer Plastikpipette abgenommen und in ein verschließbares

Plastikröhrchen verbracht. Der Rückstand wurde zur Herstellung des PPP erneut zentrifugiert

(2200 x g, 15 min) und das so gewonnene PPP aliquotiert. Sowohl das Citratblut, als auch das

PRP und PPP wurden mit dem mölab Hämatologie-System 8702/6 (Fa. Mölab, Hilden) auf

ihren Thrombozytengehalt untersucht. Die Messung der Thrombozytenzahl aus Citratblut

erfolgte nach Angaben des Geräteherstellers aus der 1 : 45000 Verdünnung des Blutes in

Cello Ton (Fa. Mölab, Hilden). Für die Messungen wurde das PRP mit autologem PPP auf

500.000 Thrombozyten/µl eingestellt. Die Einstellung des Plasmas wurde durch

Thrombozytenzählung mit oben genanntem Gerät überprüft; die Toleranzgrenze lag bei

500.000 ± 10.000 Thrombozyten pro µl. Da die Messung plättchenreichen Plasmas nicht

3 Material und Methoden 67

unter Standardtestbedingungen des Gerätes durchführbar war, wurde nach einer Testreihe mit

verschiedenen Verdünnungsmethoden und –stufen eine Vorverdünnung des Plasmas mit

Diäthylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (Fa. DADE Behring, Marburg) im Verhältnis 1 : 7

vorgenommen. Die Messung der Plättchenzahl erfolgte sodann nach Erstellung der

Messlösung in der Primärverdünnungsstufe des zum mölab Hämatologie-System gehörenden

Diluters. Die Aggregationsmessung erfolgte innerhalb von zwei Stunden nach der

Blutentnahme. Da die Tiere im Verlauf der KSP Infektion eine hochgradige

Thrombozytopenie entwickelten, wurde das Plasma zu den späteren Messzeitpunkten auf

250.000 bzw. 125.000 Thrombozyten pro µl eingestellt.

Nach der Vorwärmphase des APACT Gerätes, der Rekonstitution der lyophilisierten

Reagenzien mit destilliertem Wasser sowie dem Starten der Software, erfolgten die

Messungen dergestalt, dass nach einer Abgleichung des Gerätes ohne Küvetten zunächst das

PPP als 100 %-Wert bzw. PRP als 0 %-Wert gesetzt wurden. Danach erfolgte die eigentliche

Messung unter Zugabe des entsprechenden Induktors. Dazu wurden 200 µl des eingestellten

PRPs 2-3 min bei 37°C inkubiert und dann mit 50 µl ADP Reagent (AMAX, Trinity Biotech,

Ireland) bzw. 100 µl Collagen Reagent (AMAX, Trinity Biotech, Ireland) versetzt. Kontrolle

und Auswertung der Aggregationskurven erfolgten mit der APACT-Software.

Die Aggregation errechnete sich aus folgenden Werten:

%100×−

−=

PRPPPP

PRPMesswertnAggregatio

Die Messkurven ergaben folgende Parameter: Maximale Aggregation, maximale Steigung der

Kurve, Steigung der Desaggregation, Desaggregationswert, Flächeninhalt des Shape Change

und Flächeninhalt unter der Kurve.

3.2.5 Pharmakokinetik

Für den Wirkstoff PEG-Hirudin waren sowohl ein Therapieschema als auch eine Methode

zum Monitoring im Schweinemodell etabliert. Dosierungsschemata und das entsprechende

Protokoll für die Therapieüberwachung wurden freundlicherweise von Prof. Goetz Nowak zur

Verfügung gestellt und vor Versuchsbeginn am EURL etabliert und kalibriert.

3 Methoden 68

Um einen geeigneten Thrombozytenaggregationshemmstoff zu finden, wurden im Vorfeld in

vitro und in vivo unterschiedliche, in der Humanmedizin gebräuchliche Substanzen getestet

und anhand ihrer Wirkung und Kinetik ausgewählt. Für die ersten Testschritte wurden die

Substanzen zunächst in verschiedenen Konzentrationen einem frisch gewonnenen

Schweineplasma in vitro zugesetzt. Dieses wurde anschließend in Thrombozyten-

aggregationstests (siehe 3.2.4.6) mit den zuvor ausgewählten löslichen Induktoren, ADP und

Kollagen, überprüft. Folgende Substanzen wurden in vitro getestet: Der chimäre monoklonale

Antikörper Abciximab (Reopro®

), das nicht-peptidische Tyrosinderivat Tirofiban

(Aggrastat®

) und der Cyclooxigenase-Hemmstoff Acetylsalicylsäure (Aspisol®

).

Aufbauend auf die in vitro Untersuchungen wurden nachfolgend Tirofiban (Aggrastat®

),

Acetylsalicylsäure (ASS®

ratiopharm) und der Hemmstoff der ADP-induzierten Plättchen-

aggregation Clopidogrel in vivo getestet. Die letzteren Substanzen wurden zusätzlich in

Kombination getestet. Die pharmakokinetischen Untersuchungen in vivo wurden am

narkotisierten Schwein über einen Zeitraum von acht bis zwölf Stunden durchgeführt. Die

Narkose wurde über einen venösen Zugang am Ohr mit Pentobarbital-Natrium (Narcoren®,

Merial GmbH, Hallbergmoos) eingeleitet (20 mg/kg in NaCl-Lösung) und mit Ethylurethan

25% vertieft und erhalten. Ethylurethan wurde intraperitoneal nach Wirkung appliziert. Der

Venenzugang zur Entnahme der Blutproben und Applikation der pharmakologisch wirksamen

Substanzen wurde an der freipräparierten Vena jugularis durch einen eingelegten

Verweilkatheter (Heiland Vet, Hamburg) gewährleistet. Nach der Entnahme der

Nullwertprobe und Applikation des Medikaments fand eine Blutentnahme und Auswertung

der Messergebnisse nach 15 min, 30 min sowie 60 min statt. Danach wurden stündliche

Intervalle gewählt. Neben der Thrombozytenaggregation wurden die Parameter des weißen

und roten Blutbildes sowie die Thrombozytenzahlen überprüft. Nach Beendigung der

Untersuchungen wurden die Tiere durch eine Überdosis Ethylurethan schmerzlos getötet.

3 Material und Methoden 69

3.2.6 Statistik

Die Versuchsvorhaben waren als Orientierungsstudien angelegt und wurden aufgrund der

Gruppengröße nicht statistisch ausgewertet. Zur Abschätzung der Tendenzen wurden

Gruppenmittelwerte und deren Standardabweichungen berechnet. Alle Untersuchungen zur

Bestimmung der Gerinnungsparameter wurden mindestens im Doppelansatz ausgeführt, die

dokumentierten Werte verstehen sich als Mittelwerte dieser Ansätze.

3.2.7 Sonstige Methoden

3.2.7.1 Ecarin Clotting Time

Die ECT wurde zur Überwachung des Hirudinspiegels im Blut der behandelten Schweine

eingesetzt. In Gegenwart von Hirudin wandelt das, der zu untersuchenden Plasmaprobe

zugegebene Ecarin, Prothrombin hochspezifisch in Meizothrombin um. Meizothrombin wird

durch Hirudin inaktiviert. Erst wenn das Hirudin der Plasmaprobe verbraucht ist, kann das

freigesetzte Meizothrombin (bzw. dessen Aktivierungsprodukt) die Gerinnung induzieren

(NOWAK, 2003). Die Gerinnung kann mit Koagulometern erfaßt werden. Mit steigendem

Hirudinspiegel verlängerte sich die Ecarin Clotting Time.

Für die Messung der ECT wurde zunächst Ecarin-Reagenz vorbereitet, welches aus Ecarin

(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Goetz Nowak, Jena), Calcium und

Puffersubstanzen bestand. Zur Herstellung von einem ml Ecarin-Reagenz wurden 800 µl Tris

mit 3 % BSA (Tris 0,05 M, pH 7,5 bei 37°C in 0,1 M NaCl), 100 µl 0,1 M CaCl2-Lösung und

100 µl Ecarin-Lösung (10 U/ml in 0,9 % NaCl) durchmischt und bei –80°C eingefroren.

Um eine Interpretation der ECT Werte zu ermöglichen und die Vergleichbarkeit zu

gewährleisten, wurde eine Kalibrationskurve für das Ecarin-Reagenz erstellt. Zu diesem

Zweck wurde eine Hirudin-Verdünnungsreihe wie folgt hergestellt:

Eine PEG-Hirudin-Ausgangslösung mit 10 mg/ml PEG-Hirudin (freundlicherweise zur

Verfügung gestellt von Prof. Goetz Nowak, Jena) wurde mit 0,9 %iger NaCl-Lösung auf

200 µl/ml verdünnt. Für einen Plasmahirudinwert von zwei µg/ml wurden zehn µl der PEG-

Hirudin-Verdünnung mit 990 µl Plasma gemischt und im Weiteren geometrisch bis zu einer

Konzentration von 0,0625 µg/ml verdünnt. Der Gerinnungsansatz am KC 4A (Amelung,

Lemgo) sah wie folgt aus: 100 µl Plasma wurden nach einer Inkubationszeit von zwei min bei

3 Methoden 70

37°C mit 100 µl vorgewärmtem Ecarin-Reagenz gemischt und die Gerinnungszeit

protokolliert. Die ermittelten Gerinnungszeiten für die verschiedenen Plasmakonzentrationen

wurden in eine Microsoft Excel© Tabelle übertragen und graphisch dargestellt. Aus einer

unbekannten Plasmaprobe konnte nun der PEG-Hirudin-Spiegel ermittelt werden, indem die

Formel der Kalibrationskurve umgestellt und eingesetzt wurde.

Die Probenentnahme und –aufbereitung fand folgendermaßen statt: Neun Teile venöses Blut

wurden mit einem Teil 0,11 mol/l Natriumcitrat gemischt und baldmöglichst bei 1215 x g für

10 min zentrifugiert. Das gewonnene Plasma wurde sofort in Kunststoffröhrchen aliquotiert

(500 µl pro Kryoröhrchen) und entweder unverzüglich gemessen oder bei –80°C bis zum

endgültigen Verbrauch eingefroren. Eingefrorene Proben wurden vor der Messung rasch bei

37°C im Wasserbad aufgetaut und nach 15 min bei Raumtemperatur gemessen. Die

Überprüfung der Methode fand täglich mit humanem Kontrollplasma (Kontrollplasma N der

Fa. DADE Behring, Schwalbach) und gepooltem Plasma gesunder Schweine statt.

3.2.7.2 Einzelfaktorenbestimmung

Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden die Aktivitäten der Faktoren II und V mittels

koagulometrischer Verfahren untersucht. Untersuchungsmaterial war plättchenarmes

Citratplasma. Die Untersuchungsmethode wurde als Modifikation der Prothrombinzeit (siehe

3.2.4.3) durchgeführt. Die Probe wurde dabei durch eine vorverdünnte Probe in Kombination

mit einem kommerziellen Mangelplasma (Fa. DADE Behring, Schwalbach) ersetzt.

Grundprinzip war, dass durch diesen Aufbau die Gerinnungszeit der Testansätze nur von der

Aktivität des zu messenden Faktors in der Probe abhing. Der Testablauf erfolgte wie für die

Prothrombinzeit beschrieben. Mit Verdünnungsstufen eines Poolplasmas gesunder Schweine

wurde eine Referenzkurve erstellt und die Ergebnisse anhand dieser Kurve in Prozent der

Norm ausgedrückt.

Die Aktivität des Inhibitors der Serinproteasen des Gerinnungssystems, Antithrombin III

(AT III), wurde mittels eines chromogenen Substrats in plättchenarmem Citratplasma

bestimmt. Das Reagenz (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) enthält Heparin und eine

definierte Menge Thrombin. Heparin bildet mit AT III einen Komplex und katalysiert die

Inaktivierungsreaktion. Das AT III der Probe geht mit dem zugesetzten Thrombin eine

3 Material und Methoden 71

Verbindung ein, das dann für die thrombininitiierte Freisetzung von p-Nitroanilin aus dem

chromogenen Substrat nicht mehr zur Verfügung steht und somit die Extinktion verringert.

Aus der Restaktivität des Thrombins lässt sich der AT-III-Gehalt der Probe berechnen. Der

Test wurde nach Herstellerangaben mit der Ausnahme durchgeführt, dass die Vorverdünnung

des Plasmas höher (1:80 in NaCl) gewählt wurde. Zur Kalibrierung des Testsystems wurde

gepooltes Schweineplasma verwendet. Die Ergebnisse wurden anhand der Werte für das

Poolplasma in Prozent der Norm ausgedrückt.

3.2.7.3 Histopathologische Untersuchungen

Für die histopathologischen Untersuchungen wurden formalinfixierte Organproben in Paraffin

eingebettet. Daraus erstellte Mikrotomschnitte wurden vollautomatisch (Varistain 24-3, Fa.

Shandon, Frankfurt) mit Hämatoxylin/Eosin (HE) gefärbt und im Lichtmikroskop

begutachtet.

Fixierung der Organe:

Bei der Sektion wurden die Organe zunächst grob zerteilt und in eine 10 %ige, gepufferte

Formalinlösung für mindestens 24 Stunden eingelegt. Die auf diese Weise fixierten Proben

wurden daraufhin mit einem Skalpell so zugeschnitten, dass sie in standardisierte

Einbettungskassetten passten.

Einbettung in Paraffin:

Die Einbettung der Gewebestücke erfolgte mit dem Gewebeeinbettungsautomaten

Hypercenter II der Fa. Shandon, Frankfurt. Zur Entwässerung wurden die Proben, nach einer

mindestens einstündigen Nachfixierung in frischem Formalin, zunächst mit Leitungswasser

gespült und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 85 %, 96 %) dehydriert. Durch

anschließende Isopropanol- und Essigsäure-n-Butylester-Schritte wurden die Proben sodann

wieder vom Alkohol befreit und für die Paraffineinbettung vorbereitet. In Metallschalen

wurden die Präparate mit 60°C warmem Paraffin (Paraplast, Fa. Shandon, Frankfurt)

ausgegossen und auf einer Kühlplatte bei -5°C zum Erstarren gebracht.

3 Methoden 72

Anfertigung der Schnitte und Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Aus den Paraffin-eingebetteten Präparaten wurden mit dem Schlittenmikrotom (Fa. Mikrom,

Heidelberg) ca. vier µm dicke Schnitte angefertigt und nach Streckung im Wasserbad bei ca.

55°C auf Glasobjektträger (Fa. Engelbrecht, Edermünde) aufgezogen. Zur Entfernung des

überschüssigen Paraffins wurden die Schnitte für ca. 30 min in einen 60°C Wärmeschrank

(Fa. Medite, Burgdorf) verbracht. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) erfolgte im

Färbeautomaten Varistain 24-3 der Fa. Shandon, Frankfurt. Nach der Färbung wurden die

Deckgläser mittels Eindeckautomaten auf die Objektträger gebracht. Die Eindeckung erfolgte

mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel).

Die HE-Färbung ist eine Routine-Übersichtsfärbung. Sie färbt die Zellkerne dunkelviolett, die

anderen Gewebestrukturen rötlich an. Vor der eigentlichen Färbereaktion wurden die Schnitte

in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert. Abschluss der Entparaffinierung bildete

ein Spülschritt mit A. bidest.

Der erste Färbeschritt wurde in einer Hämalaun-Lösung nach MAYER für 15 min

durchgeführt. Anschließend wurde überschüssiger Farbstoff durch einen 20-minütigen

Spülschritt mit Leitungswasser entfernt, und die Schnitte abschließend eine min in 1 %iger

Eosin-Lösung gefärbt. Nach der Eindeckung und Trocknung erfolgte die Begutachtung im

Axiostar plus Lichtmikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen).

4 Ergebnisse

4.1 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV-

Stamm CSF0634

Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden zwei Tierexperimente mit je sieben

Läuferschweinen durchgeführt. Für beide Untersuchungen wurden jeweils fünf

Läuferschweine mit dem als hochvirulent eingestuften KSPV-Stamm CSF0634 intranasal

infiziert (103,5

KID50 pro Tier). Je eine Gruppe mit zwei Schweinen diente als negative

Kontrolle.

Diese Versuche sollten eine Übersicht über die zu erwartenden klinischen, hämatologischen,

hämostaseologischen, pathologisch-anatomischen und histopatholgischen Befunde erbringen

nach einer Infektion mit CSF0634 erbringen und zeigen, ob sich dieser Stamm für weitere

Untersuchungen eignete. Die Ergebnisse wurden für die weitere Versuchplanung eingesetzt.

Im zweiten Vorversuch wurde besonderes Augenmerk auf die Frühphase (Tag 0 - 4 post

infectionem, p.i.) der Erkrankung gelegt, da in diesem Bereich gemeinhin die ersten

Veränderungen der hämatologischen und hämostaseologischen Parameter, vor allem der

Leukozyten- und Thrombozytenzahlen, auftreten (DUNNE, 1970). Ziel war es, diese

Ereignisse mit Befunden der Gerinnungstests und Fibrinogenbestimmungen zu korrelieren.

4.1.1 Clinical Score und Körpertemperatur

Neun KSP-relevante klinische Parameter wurden täglich nach Vorgabe des am EURL ge-

bräuchlichen Erfassungsbogens untersucht und die Ausprägung der Symptome mit einer

Punktzahl von null bis drei belegt. Die Addition ergab die klinische Punktzahl Clinical Score

(CS) eines Tieres. Zusätzlich wurde täglich die rektale Körpertemperatur erfasst und

dokumentiert.

Die Tiere 153, 156 und 157 entwickelten das klassische Bild der akut-letalen KSPV-Infektion

mit hohem Fieber, gastrointestinalen und respiratorischen Symptomen sowie zentralnervösen

Ausfallserscheinungen. Diese Tiere entwickelten ab dem 14. Tag p.i. petechiale Blutungen.

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 74

Tier 154 erkrankte zunächst ebenfalls an der akuten KSP, erholte sich jedoch ab dem 14. Tag

p.i. wieder. Das Tier 155 zeigte schwere, unspezifische Allgemeinsymptome. Der maximale

CS der Einzeltiere lag zwischen 15 und 21. Die Kontrolltiere zeigten über den gesamten

Versuchsverlauf weder eine erhöhte Körpertemperatur noch andere Krankheitsanzeichen.

Die Tiere 176, 178 und 179 entwickelten schwere, klassische Symptome einer KSPV-

Infektion und erreichten einen maximalen CS von 17 (Tiere 176 und 179) bzw. 16 (Tier 178).

Diese Tiere entwickelten in der Finalphase der Erkrankung (ab 14 Tage p.i.) petechiale

Blutungen im Bereich der Akren. Tier 175 zeigte im Versuchsverlauf schwere

Allgemeinsymptome ohne hämorrhagische Erscheinungen und erreichte einen maximalen CS

von 10. Milde Allgemeinsymptome mit Fieber, geringgradiger Konjunktivitis und Diarrhoe

konnten bei Tier 177 verzeichnet werden, sein maximaler CS betrug 7. Die Kontrolltiere

zeigten zu keinem Zeitpunkt klinische Auffälligkeiten, die auf eine Infektion mit KSPV

hindeuteten. Kontrolltier 181 zeigte eine hochgradige Entzündung des rechten Sprunggelenks,

die am zweiten Tag des Versuches sichtbar wurde und bis zum Versuchsende ausheilte.

Charakteristische KSP-Symptome sind in Abbildung 4-1 und Abbildung 4-2 dargestellt. Die

Fotographien zeigen exemplarisch für Tier 179 die unterschiedlichen Ausprägungen

klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-Infektion.

Abbildung 4-1: Die Abbildung zeigt das Tier 179, links 14 und rechts 15 Tage p.i.

Hämorrhagische Symptome entwickelten sich in der Finalphase der KSPV-Infektion

innerhalb von wenigen Stunden.

4 Ergebnisse 75

Abbildung 4-2: Unterschiedliche Ausprägungen klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-

Infektion. Exemplarisch sind hier unterschiedliche Krankheitsstadien für das Tier 179 dargestellt.

Das obere Bild wurde an Tag zehn p.i. aufgenommen. Das Tier zeigte zu diesem Zeitpunkt

Apathie, Konjunktivitis, einen aufgekrümmten Rücken, Diarrhoe, ein struppiges Borstenkleid,

leichte respiratorische Symptome und hohes Fieber. Das untere Bild wurde an Tag 15 p.i. erstellt

und zeigt, dass hämorrhagische Symptome in den Vordergrund traten. Das Tier war hochgradig

abgemagert, auffallend blass, zeigte zentralnervöse Ausfallserscheinungen und Somnolenz.

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 76

4.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde

Alle Tiere wurden nach der Euthanasie einer pathologisch-anatomischen Untersuchung nach

dem Protokoll des EURL unterzogen. Die Tiere 153, 155, 156 und 157 zeigten typische KSP-

Befunde mit vergrößerten, hämorrhagisch infarzierten Lymphknoten im gesamten

Organismus, petechiale Blutungen in der Nierenrinde und der äußeren Haut (exklusive Tier

155), eine katarrhalische Enteritis sowie eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie

unterschiedlichen Schweregrades. Bei der Untersuchung des Tieres 154 wurden

ausschließlich eine Pneumonie und mittelgradig vergrößerte Lymphknoten gefunden. Die

Kontrolltiere zeigten keine augenfälligen pathologisch-anatomischen Veränderungen.

KSP-typische Veränderungen mit generalisierten Lymphknotenschwellungen und

-hämorrhagien sowie petechialen Blutungen in den Nieren, der Blasenwand und der äußeren

Haut sowie Sekundärinfektionen der Lunge konnten bei den Tieren 176, 178 und 179

gefunden werden. Zwei dieser Tiere zeigten zudem Milzrandinfarkte. Während Tier 175

vergrößerte Lymphknoten und eine Bronchopneumonie aufwies, zeigte Tier 177 keine KSP-

typischen Befunde zum Zeitpunkt des Versuchsendes. Die Kontrolltiere waren, abgesehen

von einer geringgradigen Spitzenlappenpneumonie, ohne besonderen Befund zum Zeitpunkt

der Euthanasie. Charakteristische Veränderungen, die im Rahmen der Infektion mit dem

KSPV-Isolat CSF0634 auftraten, sind in Abbildung 4-3 gezeigt.

4.1.3 Histopathologie

Paraffin-eingebettete Organschnitte der Leber, der Lunge, der Nieren sowie eines

Lymphknotens der Tiere 153 – 159 wurden HE-gefärbt und im Lichtmikroskop ausschließlich

auf das Vorhandensein sichtbarer Thromben untersucht. In keinem der angefertigten Schnitte

konnten unter diesen Bedingungen Thromben nachgewiesen werden.

4 Ergebnisse 77

Abbildung 4-3: Charakteristische pathologisch-anatomische Befunde. In der ersten Reihe sind

hochgradig vergrößerte und hämorrhagische Darmlymphknoten abgebildet. Reihe zwei zeigt

hämorrhagische Hautveränderungen im Bereich der distalen Hintergliedmaßen. Ein vergrößerter,

hämorrhagischer Mandibularlymphknoten sowie multiple Milzinfarkte sind in Reihe drei von

rechts nach links dargestellt. In der unteren Reihe sind die Veränderungen in den Nieren sichtbar.

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 78

4.1.4 Virus-, Antigen- und Antikörpernachweis

Zur Bestätigung der erfolgreichen Infektion und zum Nachweis der Virusfreiheit der

Kontrolltiere wurde für die Tiere 153 – 159 eine Virusisolierung aus Leukozyten (s. 3.2.2.3)

am Tag vor der Infektion und am Tag des Todes bzw. der Euthanasie vorgenommen.

Zusätzlich wurde ein Antigen-ELISA (s. 3.2.2.7) an den Tagen zehn und 14 p.i. durchgeführt.

Alle Tiere erwiesen sich als negativ in der Virusisolierung am Tag vor der Infektion. Positive

Ergebnisse wurden am Tag der Euthanasie in der Virusisolierung für die Tiere 153, 155, 156

und 157 erzielt. Sowohl die Kontrolltiere (158 und 159) als auch Tier 154 waren negativ. Der

Antigen-ELISA ergab positive Ergebnisse für alle infizierten Tiere an Tag zehn p.i., während

die Kontrolltiere negativ waren. An Tag 14 p.i. waren positive Ergebnisse für die Tiere 153,

155, 156 und 157 zu verzeichnen, Tier 154 erwies sich als negativ. Alle Kontrolltiere zeigten

auch hier eine negative ELISA-Reaktion. Die Ergebnisse der Virus- bzw.

Antigennachweisese sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-1 aufgeführt.

Für die Tiere 175 – 181 wurde die Virusisolierung an den Tagen vier, sieben, zehn und 14 p.i.

durchgeführt. Alle infizierten Tiere waren positiv an den Tagen sieben und zehn p.i.. Während

die Tiere 175, 176, 178 und 179 an Tag 14 p.i. ebenfalls positiv reagierten, erwies sich Tier

177 als negativ. Die Kontrolltiere blieben im gesamten Versuchsverlauf negativ. Die

Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-2 dargestellt.

Um die Immunantwort der Tiere zu beurteilen, wurden am Tag der Euthanasie

Antikörpernachweise geführt. Zur quantitativen Einschätzung der Antikörperproduktion

wurden VNTs nach Vorgabe der Standardmethoden des EURLs mit den diagnostischen

Referenzstämmen CSF0902 (Alfort 187), BVDV NADL und BDV Moredun einerseits, und

dem homologen KSPV-Stamm CSF0634 andererseits durchgeführt. Zusätzlich wurden

ELISA-Testkits (s. 3.2.2.7) zum qualitativen Antikörpernachweis eingesetzt. Die Ergebnisse

dieser Untersuchungen sind für die Tiere 153 - 159 im Anhang 8.1 in Tabelle 8-3 dargestellt.

Tier 154 entwickelte einen niedrigen Antikörpertiter von 40 ND50 gegen CSF0902 sowie

einen moderaten Antikörpertiter (120 ND50) gegen den homologen Stamm CSF0634. In den

differentialdiagnostischen VNTs mit den oben aufgeführten Pestiviren, konnten bei diesem

Tier kreuzreagierende Antikörper gegen BDV Moredun festgestellt werden. Tier 155 zeigte

ausschließlich einen niedrigen Antikörpertiter (30 ND50) gegen das homologe Virus. Sowohl

4 Ergebnisse 79

Tier 154, als auch Tier 155 reagierten positiv im Antikörper-ELISA. Beide Antikörper-

ELISAs befundeten Tier 156 als fraglich. Die Kontrolltiere sowie alle anderen Tiere

reagierten in allen Tests negativ.

Für die Tiere 175 – 181 wurden am Tag der Euthanasie die oben genannten VNTs sowie ein

Antikörper-ELISA durchgeführt. Die Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-4

aufgeführt. Tier 177 entwickelte einen Antikörpertiter von 480 ND50 gegen das homologe

Virus und einen niedrigen Antikörpertiter (30 ND50) gegen den Referenzstamm CSF0902.

Dieses Tier wies zudem kreuzreagierende Antikörpertiter gegen BDV auf. Tier 178 wies

einen niedrigen Antikörpertiter (40 ND50) gegen das homologe Virus auf. Alle anderen Tiere

zeigten in den durchgeführten VNTs negative Ergebnisse. Die Tiere 177 und 178 wurden

auch im Antikörper-ELISA positiv befundet, fragliche Reaktionen zeigten die Tiere 175 und

179. Die Kontrolltiere waren negativ in allen durchgeführten Antikörpernachweisen.

4.1.5 Hämatologische Parameter

Aus den EDTA-Blutproben aller Tiere wurden sowohl die Leukozyten- als auch

Thrombozytenzahlen bestimmt. Zusätzlich erfolgte für die Tiere des zweiten Vorversuches

(Tiere 175 – 181) eine Untersuchung des Plättchenvolumens über den Parameter MPV.

Die Leukozytenzahlen der Tiere 153 bis 157 zeigten eine Depletion im Verlauf des

Experiments. Bereits ab dem dritten Tag p.i. war bei den Tieren 153, 154, 156 und 157 ein

anhaltender Abwärtstrend feststellbar, der zu einer Reduktion der Leukozytenzahlen um

80-90% führte. Durchschnittlich fielen die Leukozytenzahlen im Versuchsverlauf von

23,2 G/l auf 4,5 G/l ab. Tier 154 zeigte zu Versuchsende wieder einen leichten Aufwärtstrend

von 4,9 G/l an Tag 14 p.i. auf 6,7 G/l an Tag 17 p.i.. Die Leukozytenzahlen der Kontrolltiere

blieben, abgesehen von intraindividuellen Schwankungen, im Normbereich. Die

Entwicklungen der Leukozytenzahlen sind in Abbildung 4-4 dargestellt.

Alle infizierten Tiere des zweiten Vorversuches zeigten nach der Infektion eine deutliche

Leukopenie, wobei die Leukozytenzahlen beginnend an Tag drei p.i. durchschnittlich von

22,4 G/l auf 7,9 G/l abfielen. Dies entsprach einer Reduktion der Leukozytenzahlen um

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 80

70-90 % für die einzelnen Schweine. Abweichend von den Verläufen der anderen infizierten

Tiere, zeigten die Leukozytenzahlen der Tiere 175 und 177 eine Erholung zum Versuchsende.

Während Tier 175 jedoch mit 6,5 G/l unter dem Normalbereich blieb, kehrte Tier 177 nach

dem zehnten Tag p.i. in den Normalbereich zurück. Zu Versuchsende lag die Leukozytenzahl

für dieses Tier bei 13,8 G/l (Tag 21 p.i.). Die Kontrolltiere wiesen zu keinem Zeitpunkt eine

Leukopenie auf. Tier 181 zeigte jedoch eine Leukozytose, die zwischen dem zweiten und

vierten Tag des Versuches ihr Maximum erreichte. Die Leukozytenzahlen sind in Abbildung

4-5 dargestellt.

Analog zu den Entwicklungen der Leukozytenzahlen begann bereits drei Tage p.i. ein Abfall

der Thrombozytenzahlen für die Tiere 153, 155, 156 und 157. Diese Tendenz verstärkte sich

bis zum Versuchsende. Durchschnittlich fielen die Thrombozytenzahlen von 583 G/l auf 102

G/l an Tag 17 p.i., was einer Abnahme von 82,5 % entsprach. Für Einzeltiere konnte eine

prozentuale Abnahme von 93 % (Tier 157) bzw. 98 % verzeichnet werden (Tier 153). Die

Thrombozytenzahlen des Tieres 154 folgten zunächst diesem Trend, zeigten jedoch

beginnend an Tag zehn p.i. eine Normalisierung bis hin zu Normalwerten (307 G/l) an Tag 17

p.i.. Die Thrombozytenzahlen der Kontrolltiere zeigten ausschließlich Schwankungen im

Normalbereich. Die Darstellung der Thrombozytenzahlen für die Tiere 153 bis 159 ist in

Abbildung 4-6 zusammengefaßt.

Bei der Ermittlung der Thrombozytenzahlen war festzuhalten, dass die Werte der Tiere 175,

177, 179 und 181 bei Ermittlung des Referenzwertes vor der Infektion unter dem

Normalbereich lagen. Die Werte an Tag eins p.i. lagen jedoch für alle Tiere im

Normalbereich. Die Tiere 175, 176, 178 und 179 zeigten einen anhaltenden Abwärtstrend der

Thrombozytenzahlen ab Tag zwei bzw. vier p.i., der sich bis zur Euthanasie der Tiere

fortsetzte. Die Thrombozytenzahlen sanken durchschnittlich auf 100 G/l an Tag 17 p.i.. Der

maximale Abfall war bei Tier 176 mit 96 % zu verzeichnen. Die Thrombozytenzahlen für

Tier 177 zeigten einen Abfall bis Tag sieben p.i., erholten sich jedoch wieder vollständig

(616 G/l an Tag 21 p.i.). Die Kontrolltiere zeigten deutliche intraindividuelle Schwankungen,

blieben jedoch über den gesamten Versuch im Referenzbereich bzw. darüber. Die ermittelten

Werte sind in Abbildung 4-7 festgehalten.

4 Ergebnisse 81

Der Parameter MPV zeigte große intra- und interindividuelle Schwankungen. Ein Anstieg des

Thombozytenvolumens war für infizierte Tiere zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. zu

verzeichnen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich von 6,8 – 12,6 fl wurde

mit geringfügigen Ausnahmen nicht verlassen. Tier 181 unterschritt den unteren Referenzwert

zu Beginn des Versuches, das andere Kontrolltier, Tier 180, zum Ende des Versuchs. Tier 176

zeigte zudem am Tag der Euthanasie einen Abfall des MPV auf 6,4 fl. Das MPV ist für die

Tiere 175 - 181 in Abbildung 4-8 dargestellt.

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 82

Leukozytenzahlen

0

5

10

15

20

25

30

0 3 7 10 14 17

Tage pi

Leu

ko

zyte

n [

G/l

]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-4: Leukozytenzahlen der Tiere 153 - 159 im Versuchsverlauf. Tiere, die mit dem

hochvirulenten KSPV-Stamm CSF0634 infiziert wurden, zeigten, beginnend an Tag drei bzw.

sieben p.i. (Tier 155) eine deutliche Leukozytendepletion. Die Kontrolltiere 158 und 159 sind in

dunkelgrau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom Gerätehersteller mit 11,3 – 22,8 G/l

angegeben und ist durch die gestrichelten Linien verdeutlicht (Ref. 1 für den unteren, Ref. 2 für

den oberen Referenzwert).

Leukozytenzahlen

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 1 2 3 4 7 10 14 17 21

Tage pi

Leu

ko

zyte

n [

G/l

]

Tier 175

Tier 176

Tier 177

Tier 178

Tier 179

Tier 180

Tier 181

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-5: Leukozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf. Alle infizierten Tiere

zeigen eine Leukozytendepletion. Die Werte des Tieres 177 erreichen zu Versuchsende den

Normbereich. Die Kontrolltiere 180 und 181 sind in dunkelgrau dargestellt. Der Referenzbereich

wurde vom Gerätehersteller mit 11,3 – 22,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien

verdeutlicht (Ref. 1 für den unteren, Ref. 2 für den oberen Referenzwert).

4 Ergebnisse 83

Thrombozytenzahlen

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 3 7 10 14 17

Tage pi

Th

rom

bo

zyte

n [

G/l

]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-6: Thrombozytenzahlen der Tiere 153 bis 159 im Verlauf des Experiments. Die

Kontrolltiere 158 und 159 sind in grau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom

Gerätehersteller mit 138,2 – 467,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien im

Diagramm gekennzeichnet (Ref. 1 und Ref. 2).

Thrombozytenzahlen

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 1 2 3 4 7 10 14 17 21

Tage pi

Th

rom

bo

zyte

n [

G/l

]

Tier 175

Tier 176

Tier 177

Tier 178

Tier 179

Tier 180

Tier 180

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-7: Thrombozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf. Die Kontrolltiere

180 und 181 sind in grau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom Gerätehersteller mit

138,2-467,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien im Diagramm gekennzeichnet

(Ref. 1 und Ref. 2).

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 84

Mittleres Thrombozytenvolumen (MPV)

5

6

7

8

9

10

11

12

13

0 1 2 3 4 7 10 14 17 21

Tage pi

Th

rom

bo

zyte

nv

olu

men

[fl

]

Tier 175

Tier 176

Tier 177

Tier 178

Tier 179

Tier 180

Tier 181

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-8: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere 175 bis 181 im Versuchsverlauf.

Der Referenzbereich (6,8 – 12,6 fl) liegt zwischen den gestrichelten Linien (Ref. 1 und Ref. 2).

4.1.6 Hämostaseologische Parameter

Neben den Globaltests der Gerinnung wurde für alle Tiere die Fibrinogenkonzentration im

Plasma bestimmt. Da unterschiedliche Methoden zum Einsatz kamen, konnte der Vergleich

ausschließlich auf Ebene der Verläufe und der prozentualen Veränderungen stattfinden.

Im Rahmen des ersten Vorversuches wurde zusätzlich eine Einzelfaktorenbestimmung der

Gerinnungsfaktoren II und V sowie von Antithrombin III durchgeführt (Tiere 154 – 159).

Die aPTT zeigte im Versuchsverlauf Schwankungen von maximal 20% für alle Tiere.

Ähnliches galt für die Thrombinzeit, deren Schwankungen mit einer Ausnahme ebenfalls

unter 20% lagen und alle Tiere betrafen. Tier 157 zeigte ausgeprägtere Schwankungen, die

sich vor allem in einem Anstieg um 28 % zwischen den Tagen drei und sieben p.i. sowie

einem nachfolgenden Abfall bis auf 43 % des Maximalwertes an Tag 14 p.i. manifestierten.

Die Verläufe sind in Abbildung 4-9 (aPTT) und Abbildung 4-10 (Thrombinzeit)

wiedergegeben.

4 Ergebnisse 85

Für die Prothombinzeit war ab dem zehnten Tag p.i. bis zum Tag der Euthanasie ein Anstieg

bei den infizierten Tiere, abgesehen von Tier 154, feststellbar. Die Werte stiegen dabei um 70

(Tier 156) bis 94 % (Tier 157), wobei der durchschnittliche Anstieg 83 % betrug. Die

Kontrolltiere zeigten nur geringfügige Schwankungen (mit wenigen Ausnahmen unter

zehn Prozent) in allen durchgeführten Globaltests. Die Prothrombinzeit ist in Abbildung 4-11

gezeigt.

Die unter 3.2.4.2 genannten Inkompatibilitäten in den Reagenzien zur aPTT-Bestimmung

führten, da das Plasma für eine erneute Bestimmung mit dem neuen Reagenz nicht ausreichte,

dazu, dass die aPTT-Ergebnisse des zweiten Vorversuchs erst ab dem vierten Tag p.i.

aufgezeichnet werden konnten. In allen Globaltests wurde ein kommerzielles, humanes

Kontrollplasma mitgeführt.

Bei den Werten der aPTT kam es zu Schwankungen von weniger als 20% bei allen Tieren.

Abweichend zeigte Tier 176 einen Anstieg von ca. 30% vom zehnten auf den 14. Tag p.i. Das

mitgeführte humane Kontrollplasma gab über den gesamten Versuchsverlauf Werte im vom

Hersteller vorgegebenen Referenzbereich. Die ermittelten Werte sind in Abbildung 4-12

dargestellt.

Die Probenaliquots der Tage 14 bis 24 p.i. zur Bestimmung der Thrombinzeit und

Prothrombinzeit für die Tiere 175 bis 181 wiesen nach dem Auftauen teilweise gelartige

Konsistenzveränderungen auf. Standen keine weiteren Proben zur Verfügung, wurden diese

Aliquots versuchsweise eingesetzt.

Die Thrombinzeit zeigte intra- und interindividuelle Schwankungen in den Werten aller Tiere

von Tag null bis zehn p.i., die im Bereich zwischen <10 % (Tiere 175, 180, 181) und 26%

(Tier 176) lagen. Das Plasma der Tiere 176, 178 und 179 wies an den Tagen 14, 21 und 24

p.i. die oben genannten Veränderungen auf und wurde nicht in die Auswertung einbezogen.

Für die Tiere 175 und 177 war ein Anstieg an Tag 21 p.i. zu verzeichnen, dessen Werte

jedoch nur acht bzw. 13 % über dem Ausgangswert an Tag null p.i. lagen. Die Kontrolltiere

wiesen über den gesamten Versuchsverlauf ausschließlich Schwankungen unter 10 % auf.

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 86

Das humane Kontrollplasma zeigte durchgängig Werte im angegebenen Referenzbereich. Die

Verläufe sind in Abbildung 4-13 zu finden.

Die Bestimmung der Prothrombinzeit wurde durch Konsistenzveränderungen einiger

Plasmaaliqouts erschwert. Das Plasma der Tiere 176, 178 und 179 wurde an den Tagen 14, 21

und 24 p.i. nicht in die Auswertung einbezogen. Die Plasmaaliquots der Tage eins p.i. für Tier

179 bzw. drei p.i. für Tier 180 zeigten ähnliche Veränderungen. Die Prothrombinzeit wies

einen leichten Anstieg an Tag zehn p.i. für die Tiere 177, 178 und 179 bzw. 14 Tage p.i. für

die Tiere 175 und 176 auf, allerdings war auch für Kontrolltier 180 ein Gipfel zehn Tage p.i.

nachweisbar. Im Vergleich mit dem Nullwert lagen die genannten Verlängerungen unter 10 %

bzw. lagen noch unter den absoluten Zahlen der Nullwerte. Die auswertbare Messwerte der

Kontrolltiere (Tiere 180, 181) zeigten geringe Schwankungen (<10 %). Das humane

Kontrollplasma lag stets im zuvor laborintern ermittelten Bereich für das modifizierte

Protokoll zur Prothrombinzeitbestimmung. Die Darstellung der ermittelten Werte ist in

Abbildung 4-14 abgebildet.

4 Ergebnisse 87

aPTT

0

5

10

15

20

25

0 3 7 10 14 17

Tage pi

aP

TT

[s]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Abbildung 4-9: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Die aPTT im Verlauf der KSPV-

Infektion.

Thrombinzeit

0

5

10

15

20

25

30

0 3 7 10 14 17

Tage pi

Th

rom

bin

zeit

[s]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Abbildung 4-10: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Thrombinzeit im Verlauf der KSPV-

Infektion.

Abbildung 4-11: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Prothrombinzeit im Verlauf der

KSPV-Infektion.

Prothrombinzeit

0

10

20

30

40

50

0 3 7 10 14 17

Tage pi

Pro

thro

mb

inze

it [

s]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 88

aPTT

10

15

20

25

30

35

4 7 10 14 17 21 24

Tage pi

Ger

inn

un

gsz

eit

[s]

Tier 175

Tier 176

Tier 177

Tier 178

Tier 179

Tier 180

Tier 181

Kontrolle

Abbildung 4-12: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der aPTT-Bestimmung. Die Werte für

das humane Kontrollplasma sind hellgrau dargestellt.

Thrombinzeit

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 7 10 14 17 21 24

Tage pi

Th

rom

bin

zeit

[s]

Tier 175

Tier 176

Tier 177

Tier 178

Tier 179

Tier 180

Tier 181

Kontrolle

s

Abbildung 4-13: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Thrombinzeitbestimmung. Die Werte

für das humane Kontrollplasma sind hellgrau dargestellt.

Prothrombinzeit

10

12

14

16

18

20

22

24

26

0 1 2 3 4 7 10 14 17 21 24

Tage pi

Pro

thro

mb

inze

it [

s]

Tier 175

Tier 176

Tier 177

Tier 178

Tier 179

Tier 180

Tier 181

Kontrolle

Abbildung 4-14: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Prothrombinzeitbestimmung. Die

Werte des humanen Kontrollplasmas sind hellgrau dargestellt.

4 Ergebnisse 89

Die Ergebnisse der Fibrinogenbestimmungen für die Tiere beider Vorversuche sind in

Abbildung 4-15 (Tiere 153 – 159) und Abbildung 4-16 (Tiere 175 – 181) dargestellt. Die

absoluten Werte waren nur in der Tendenz vergleichbar, da sie mit unterschiedlichen

Methoden ermittelt wurden (s. 3.2.4.4).

Die Fibrinogenkonzentrationen wiesen für die Tiere 153 – 159 ausgeprägte interindividuelle

Schwankungen auf, welche jedoch für die infizierten Tiere deutlicher ausfielen. Der

Referenzbereich der Methode nach CLAUSS wird von MISCHKE (1999) mit 1,6 – 3,9 g/l

angegeben. Somit sank die Konzentration für keines der Tiere unter den Referenzbereich. Die

oberen Referenzwerte wurden von allen infizierten Tieren im Versuchsverlauf überschritten,

wobei der prozentuale Anstieg, bezogen auf den Vergleich zwischen Nullwert und

Maximalwert, 40,7 (Tier 155) bis 64,1 % (Tier 156) betrug. Tier 157 bildete insofern eine

Ausnahme, als dass bereits der Nullwert über dem Referenzbereich lag.

Die Tiere 176, 178 und 179 zeigten einen erkennbaren Anstieg der Fibrinogenkonzentration

beginnend mit leichten Schwankungen ab dem vierten Tag p.i.. Gleiches galt für die Tiere

175 und 177, deren Werte jedoch daraufhin wieder sanken. Für Tier 177 war zu Versuchsende

der Ausgangswert wieder erreicht, Tier 175 blieb deutlich darüber. Für das Tier 179 konnte an

Tag eins p.i. nur ein hämolytisches Plasma gewonnen werden, welches zudem bereits

Gerinnsel enthielt. Der Anstieg für die infizierten Tiere lag zwischen 32,9 (Tier 177) und

41,9 % (Tier 159) gemessen am Verhältnis zwischen Nullwert und Maximalwert. Für die

Kontrolltiere waren nur geringe Schwankungen erkennbar. Ein Poolplasma der Versuchstiere

vor der Infektion erbrachte Werte von 2,5 ± 0,4 g/l.

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 90

Fibrinogenkonzentration

(Methode nach CLAUSS)

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

0 3 7 10 14 17 18 21

Tage pi

Fib

rin

og

en [

g/l

]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Abbildung 4-15: Fibrinogenkonzentrationen. Die Bestimmungen erfolgten für die Tiere 153 bis

159 mit der Methode nach CLAUSS (Referenzbereich 1,6 – 3,9 g/l).

Fibrinogenkonzentration

(Methode nach RATNOFF und MENZIE)

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

0 1 2 3 4 7 10 14 17 21 24

Tage pi

Fib

rin

og

en [

g/l

]

Tier 175

Tier 176

Tier 177

Tier 178

Tier 179

Tier 180

Tier 181

Abbildung 4-16: Fibrinogenkonzentrationen. Die Bestimmungen erfolgten für die Tiere 175 bis

181 mit der Methode nach RATNOFF und MENZIE (Normalwert für Poolplasma 2,5 ± 0,4 g/l).

4 Ergebnisse 91

Für den Gerinnungsfaktor II (Prothrombin) war bereits vor der Infektion eine große

interindividuelle Schwankungsbreite zu verzeichnen. Für die Tiere 153, 154 und 155 sowie

in geringerem Ausmaß auch für Tier 156 war ein Gipfel an Tag sieben p.i. zu verzeichnen,

der sich nicht bei den Kontrolltieren fand. Der prozentuale Anstieg lag für diesen Gipfel,

bezogen auf den vorangegangenen Wert bei 38 (Tier 153), 53 (Tier 154) und 48 % (Tier

155), für Tier 156 bei 15 %. Die Werte erreichten Tag 14 p.i. jedoch wieder annähernd den

Wert des vorangegangenen Entnahmetages (Tag drei p.i.). Tier 156 zeigte auf den Gipfel

folgend eine Abnahme der Aktivität, die bis zum Tag der Euthanasie anhielt. Die Aktivität

halbierte sich in dieser Phase. Dieser Abfall war auch für Tier 157 zu verzeichnen. In diesem

Fall sank die Aktivität um mehr als 50 %. Die Verläufe sind in Abbildung 4-17 abgebildet.

Der für den Faktor II beschriebene Gipfel an Tag sieben p.i. fand sich auch in der Aktivität

des Gerinnungsfaktors V. Hier zeigten besonders die Tiere 154 und 155 eine Steigerung der

Aktivität auf Werte von fast bzw. über 300 %. Eine geringere Aktivitätssteigerung war auch

für die Tiere 153 (50 %) und 156 (24 %) zu verzeichnen, deren Faktor-V-Aktivitäten im

Folgenden absanken. Tier 157 zeigte ausschließlich einen Aktivitätsabfall beginnend an Tag

zehn p.i., der zu einer Halbierung der Aktivität führte. Die Kontrolltiere zeigten

Aktivitätsschwankungen bis zu 25 %, wobei die Werte durchschnittlich zwischen 80 und

110 % lagen. Die ermittelten Werte sind in Abbildung 4-18 dargestellt.

Die Aktivität des Antithrombins III nahm bei allen Tieren der infizierten Gruppe im

Versuchsverlauf ab. Besonders ausgeprägt war dieser Verlauf bei den Tieren 153, 155 und

157, bei denen sich die Aktivität halbierte. Kontrolltier 158 wies einen leichten Abwärtstrend,

jedoch keine auffallenden Schwankungen auf, während die Werte von Tier 159 zwischen

110 % und 85 % schwankten. Die Verläufe sind in Abbildung 4-19 abgebildet.

Der EGT, der ausschließlich für die Tiere 175 – 181 durchgeführt wurde, zeigte positive

Reaktionen für die Tiere 175 und 176 an Tag 17 p.i. und für das Tier 179 an den Tagen 14

und 15 p.i. Alle verbleibenden Tiere reagierten über den gesamten Versuchsverlauf negativ.

4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634 92

Aktivität des Gerinnungsfaktors II

20

40

60

80

100

120

140

0 3 7 10 14 17 18 21

Tage pi

Ak

tiv

itä

t [%

]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Abbildung 4-17: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-II-Aktivität.

Aktivität des Gerinnungsfaktors V

0

50

100

150

200

250

300

350

0 3 7 10 14 17 18 21

Tage pi

Ak

tiv

itä

t [%

]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Abbildung 4-18: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-V-Aktivität.

Aktivität des Antithrombins III

40

50

60

70

80

90

100

110

120

0 3 7 10 14 17 18 21

Tage pi

Ak

tiv

itä

t [%

]

Tier 153

Tier 154

Tier 155

Tier 156

Tier 157

Tier 158

Tier 159

Abbildung 4-19: Einzelfaktorenbestimmung. Antithrombin-III-Aktivität.

4 Ergebnisse 93

4.2 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels

PEG-Hirudin

Die zehn Läuferschweine für dieses Experiment, die nach dem Zufallsprinzip in zwei

Gruppen aufgeteilt worden waren, wurden mit 5 x 104,5

KID50 des KSPV Isolats CSF0634

intranasal infiziert. Gruppe I, bestehend aus den Tieren 182 - 186, erhielt täglich PEG-Hirudin

als subkutane Injektion. Gruppe II, die Tiere 187-191 umfassend, diente als unbehandelte

Kontrolle.

4.2.1 Nachweis des therapeutischen PEG-Hirudinspiegels

Der Plasmahirudinspiegel der Tiere 182 – 186 (Gruppe I) wurde täglich mittels ECT

bestimmt, um zu gewährleisten, dass der Plasmahirudinspiegel im therapeutischen Bereich

(ca. 0,5 – 1,5 µg/ml) lag, ohne jedoch toxische Werte zu erreichen. Die Messung erfolgte aus

Citratplasma. Alle Tiere der Gruppe I zeigten über den gesamten Versuch einen den oben

genannten Kriterien entsprechenden PEG-Hirudinspiegel. Die Kalibration der ECT und die

gemessenen Werte für die Einzeltiere befinden sich im Anhang unter 8.1 in Abbildung 8-1

und Abbildung 8-2.

4.2.2 Nachweis der Infektion

Für den Nachweis der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 wurde an Tag zehn nach der

Infektion eine EDTA-Blutprobe gewonnen und die daraus gewonnenen Leukozyten in der

Virusisolierung untersucht. Alle Tiere erwiesen sich als KSPV positiv an Tag zehn p.i. Die

Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-5 dargestellt.

4.2.3 Entwicklung der Körpertemperatur

Die rektale Körpertemperatur der Schweine wurde einmal täglich erfasst und dokumentiert.

Als Fieber wird nachfolgend eine Körpertemperatur über 40°C verstanden. Nach der Infektion

mit dem KSPV-Isolat CSF0634 entwickelten die Tiere der Gruppe I zwischen dem vierten

und siebten Tag Fieber, das bei allen Tieren auf Werte über 41°C anstieg.

Die Tiere der Gruppe II zeigten zwischen dem fünften und sechsten Tag nach der Infektion

erstmals febrile Temperaturen. Die durchschnittliche Maximaltemperatur betrug 41,5°C.

4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 94

Der Verlauf der Körpertemperaturen beider Gruppen wurde anhand der Gruppenmittelwerte

verglichen. Wie aus Abbildung 4-20 zu ersehen ist, ergaben sich nur geringfügige

Abweichungen in den Kurvenverläufen.

Gruppenmittelwerte der Körpertemperaturen im Versuchsverlauf

38

39

40

41

42

43

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tage pi

Tem

per

atu

r in

°C

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-20: Temperaturkurven dargestellt als Gruppenmittelwerte (Mittelwerte ±

Standardabweichung) der Gruppen I und II.

4.2.4 Dokumentation der klinischen Symptome

Die Dokumentation der klinischen Symptome wurde nach der Inkubationszeit (Zeit zwischen

Infektion und dem Auftreten der ersten Symptome, hier Fieber) gemäß den

Standardprotokollen des EURLs zur Erfassung des CS modifiziert nach MITTELHOLZER

vorgenommen.

Die Tiere der Gruppe I entwickelten nach vier bis sieben Tagen zunächst unspezifische

Krankheitssymptome. Dazu gehörten Apathie, Konjunktivitis, Fressunlust, Diarrhoe und

Obstipation. Tier 182 zeigte bereits neun Tage p.i. schwerste Allgemeinsymptome,

hochgradige Dyspnoe, Ataxie und Hautblutungen und wurde daraufhin moribund

euthanasiert. Bei den anderen Tieren aus Gruppe I entwickelten sich erste Hautblutungen und

zentralnervöse Symptome zwischen dem elften (Tier 183) und 15. Tag p.i. (Tier 185). Alle

Tiere zeigten die akute Verlaufsform der KSP mit hämorrhagischen Symptomen, die sich v. a.

in petechialen Blutungen im Bereich der Akren äußerten, sowie zentralnervöse Symptome.

4 Ergebnisse 95

Vier der fünf Tiere zeigten Anzeichen einer schweren Atemwegsinfektion. Die Euthanasie der

Tiere wurde zwischen dem neunten und 17. Tag nach der Infektion durchgeführt. Der

Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die Tiere der Gruppe I 17,6.

Desgleichen entwickelten alle Tiere der Gruppe II die akute Verlaufsform der KSP. Nach

einer anfänglichen Phase mit unspezifischen Symptomen (s. o.) entwickelten alle Tiere

hämorrhagische Symptome unterschiedlicher Ausprägung. Erste Hautblutungen traten

zwischen dem elften (Tier 189) und 14. Tag p.i. (Tier 190) auf. Wie die Tiere der Gruppe I,

entwickelten auch diese Tiere unterschiedlich ausgeprägte zentralnervöse Symptome. Alle

Tiere zeigten respiratorische Symptome. Die Euthanasie erfolgte zwischen dem 15. und 18.

Tag nach der Infektion. Der Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die

Tiere der Gruppe II 21,6.

Um die Krankheitsverläufe zu vergleichen, wurde der CS auch als Gruppenmittelwert

dokumentiert. Die Gruppenmittelwerte und die entsprechenden Standardabweichungen sind

in Abbildung 4-21 zu sehen. Wie aus der Abbildung ersichtlich wird, zeigten die Tiere der

Gruppe I einen geringfügig niedrigeren CS, die Verläufe präsentierten sich jedoch sehr

ähnlich.

Entwicklung der klinischen Symptome

(Gruppenmittelwerte)

0

5

10

15

20

25

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tage pi

CS

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-21: Gruppenmittelwerte für den CS beider Tiergruppen. Die Angabe des CS erfolgt

in Punkten von maximal 27. Gruppe I erhielt täglich Hirudin, Gruppe II diente als

Positivkontrolle. Die Erfassung begann mit dem Auftreten erster klinischer Symptome.

4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 96

4.2.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde

Die Erfassung und Dokumentation der pathologisch-anatomischen Befunde erfolgte nach dem

Standardprotokoll des EURLs in Anlehnung an das von FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003)

erarbeitete Verfahren.

Die Tiere der Gruppe I wurden zwischen dem neunten und 17. Tag p.i. euthanasiert. Alle

Tiere zeigten in den postmortalen Untersuchungen klassische Befunde, die gemeinhin mit der

KSPV-Infektion in Verbindung gebracht werden. In unterschiedlicher Ausprägung zeigten die

Tiere petechiale und ekchymatöse Blutungen im Bereich der Akren und des ventralen

Abdomens sowie in den Nieren. Alle Tiere wiesen vergrößerte, zum großen Teil

hämorrhagisch-infarzierte Lymphknoten auf. Bei den Tieren 185 und 186 waren

Milzrandinfarkte zu verzeichnen. Schwere Sekundärinfektionen des Respirationstraktes

zeigten die Tiere 183, 184, 185 und 186. Tier 185 zeigte zudem eine purulente Pyelonephritis.

Die Tiere der Gruppe II wurden zwischen dem 15. und 18. Tag nach der Infektion

euthanasiert. Die Sektion zeigte bei allen Tieren klassische Befunde der KSPV Infektion.

Ohne Ausnahme, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung, zeigten die Tiere hämorrhagische

Symptome. Hochgradig vergrößerte Lymphknoten im gesamten Körper konnten ebenfalls bei

allen Tieren gefunden werden. Milzrandinfarkte zeigten die Tiere 187 und 191. Die Tiere 187,

188, 189 und 190 zeigten schwere Sekundärinfekionen des Respirationstraktes, die Tiere 187

und 188 wiesen zudem eine hochgradige Pyelonephritis auf.

Die vergleichende Betrachtung der pathologisch-anatomischen Befunde beider Gruppen zeigt

keine Unterschiede in der Ausprägung oder der Art der Befunde.

Einige Bilder charakteristischer pathologisch-anatomischer Befunde sind in Abbildung 4-22

festgehalten.

4 Ergebnisse 97

Abbildung 4-22: Pathologisch-anatomische Veränderungen, die während der postmortalen

Untersuchungen der Tiere beider Gruppen erhoben wurden. Bild A: Hämorrhagisch-infarzierte

Dünndarmlymphknoten des Tieres 190. Bild B: Charakteristische Hautveränderungen im Bereich

der Ohren. Bild C: Petechien im Verlauf der Herzkranzgefäße und im Myokard. Bild D:

Multifokale Petechien in der Nierenrinde. Bild E: Eitrige Tonsillitis. Bild F: Sekundärinfektion

der Lunge.

BA

E F

DC

4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 98

4.2.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen

4.2.6.1 Gesamtleukozytenzahl

Im Verlauf der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 zeigten alle Tiere der Gruppe I eine

hochgradige Leukopenie. Die durchschnittliche Leukozytenzahl sank von 25,58 G/l auf

3,61 G/l. Der Abfall betrug für die Einzeltiere zwischen 48 (Tier 182, neun Tage pi) und 86 %

(Tier 186, 16 Tage pi).

Auch die Tiere der Gruppe II entwickelten eine ausgeprägte Leukopenie im Verlauf der

KSPV-Infektion. Die durchschnittliche Leukozytenzahl betrug zu Beginn des Versuchs 22,68

G/l. Unter der Infektion verringerte sie sich auf 9,85 G/l. Der prozentuale Abfall lag zwischen

32 (Tier 187, 17 Tage p.i.) und 87,2 % (Tier 188, 16 Tage p.i.).

Der Vergleich der beiden Gruppen macht deutlich, dass die Leukopenie in Gruppe II etwas

weniger ausgeprägt war, wobei der Verlauf jedoch einen nahezu parallelen Charakter zeigte

(Abbildung 4-23).

Leukozytenmittelwerte

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17

Tage pi

Leu

ko

zyte

n [

G/l

]

Gruppe I

Gruppe II

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-23: Gruppenmittelwerte (MW ± Standardabweichung) für die Leukozytenzahlen

beider Gruppen. Der Referenzbereich ist durch die gestrichelten Linien (Ref. 1 und Ref. 2)

dargestellt.

4 Ergebnisse 99

4.2.6.2 Thrombozytenzahl und Thrombozytenparameter

Alle Tiere entwickelten im Infektionsverlauf eine ausgeprägte Thrombozytopenie. Zwischen

dem zweiten und fünften Tag bzw. dem sechsten und neunten Tag nach der Infektion zeigten

beide Gruppen Gipfel in den Thrombozytenwerten, die der Verlaufkurve ein wellenförmiges

Aussehen verlieh. Die inter- und intraindividuellen Schwankungen waren ausgeprägt.

Die durchschnittliche Thrombozytenzahl sank für die Tiere der Gruppe I von 549 G/l zu

Versuchsbeginn auf 39 G/l, bzw. für das letzte verbleibende Tier (184) auf 13 G/l ab.

Prozentual lag der Abfall für die Einzeltiere zwischen 75 (Tier 182, zehn Tage p.i.) und 96 %

(Tier 184, 17 Tage p.i.). Für Gruppe II war ein Thrombozytenabfall von 395 G/l auf 106 G/l

zu verzeichnen, wobei die prozentuale Änderung, bezogen auf den Nullwert, 30 (Tier 190, 17

Tage p.i.) bis 96 % (Tier 188, 16 Tage p.i.) betrug. Im Vergleich der Maximalwerte mit den

Minimalwerten lag die prozentuale Änderung zwischen 79 (Tier 190) und 97 % (Tier 188).

Die Thrombozytenmittelwerte, deren Verläufe quasi parallel waren, finden sich in unten

stehender Abbildung (Abbildung 4-24).

Thrombozytenzahlen

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17

Tage pi

Th

rom

bo

zyte

n [

g/l

]

Gruppe 1

Gruppe 2

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-24: Thrombozytenmittelwerte (MW ± Standardabweichung) für die Tiere beider

Gruppen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich ist durch die gestrichelten

Linien gekennzeichnet.

Das MPV zeigte inter- und intraindividuelle Schwankungen, die Gruppenmittelwerte

spiegelten den Verlauf wieder. Die Darstellung befindet sich in Abbildung 4-25.

4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 100

Gruppe I zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem Gipfel zwischen dem fünften und

sechsten Tag p.i. und einem zweiten Gipfel zwischen dem 14. und 16. Tag p.i.. Der obere

Referenzwert von 12,6 fl wurde dabei von den Tieren mit Ausnahme des Tieres 185 für den

ersten Gipfel erreicht (Tier 186) bzw. um 0,2 und 2,5 fl (Tiere 182 und 186) überschritten.

Alle Tiere, die zu diesem Zeitpunkt noch lebten, überschritten den oberen Referenzwert

zwischen dem 14. und 16. Tag p.i. um 0,5 (Tier 185) bis 1,9 fl (Tier 184).

Die MPV-Verläufe der Gruppe II stellten sich ähnlich dar. Alle Tiere zeigten, unterschiedlich

ausgeprägt, einen Gipfel zwischen Tag fünf und sechs p.i. sowie einen ähnlichen Gipfel an

Tag 14 p.i.. Tier 187 zeigte dabei ausgeprägte Schwankungen und erreichte fünf Tage p.i. ein

MPV von 20 fl. Tier 188 zeigte einen ersten Gipfel von 14,8 fl und einen nur sehr flach

ausgeprägten Gipfel an Tag 14, der den Referenzbereich nicht verließ. Für die Tiere 189 und

191 konnte zwischen dem fünften und sechsten Tag p.i. kein Blut gewonnen werden, daher

fehlen Informationen über den Verlauf in diesem Bereich. Der erste Gipfel verließ nur bei

Tier 187 den Normalbereich. Für den zweiten Gipfel waren es die Tiere 187, 189 und 191.

Tier 188 unterschritt an den Tagen 15 und 16 p.i. den Referenzbereich. Die Verläufe beider

Gruppen waren somit annähernd parallel.

Mittleres Thrombozytenvolumen

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17

Tage pi

MP

V [

fl]

Gruppe I

Gruppe II

Ref. 1

Ref. 2

Abbildung 4-25: Mittleres Thrombozytenvolumen (MW ± Standardabweichung) für die Tiere

beider Gruppen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich ist mit gestrichelten

Linien angedeutet (Ref. 1 und Ref. 2).

4 Ergebnisse 101

Der Parameter Large Platelets zeigte für alle Tiere einen Gipfel an Tag fünf bzw. sechs p.i.

Große intra- und interindividuelle Schwankungen waren zu beobachten, die

Gruppenmittelwerte geben jedoch den Verlauf wieder. Insgesamt lagen die Maxima für die

Gruppe I zwischen 42000 (Tier 182) und 66000 (Tier 186) Large Platelets pro µl, für die

Gruppe II zwischen 40000 (Tier 191) und 81000 (Tier 187) Large Platelets pro µl. Die

Gruppenmittelwerte sind in Abbildung 4-26 wiedergegeben.

Large Platelets

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17

Tage pi

La

rge

Pla

tele

ts [

10

*3

/µl]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-26: Large Platelets (MW ± Standardabweichung) für die Tiere beider Gruppen.

4.2.6.3 Hämostaseologische Parameter

Die Verläufe der Gruppenmittelwerte für die Globaltests der Gerinnung sind in Abbildung

4-27 (aPTT), Abbildung 4-28 (Thrombinzeit) und Abbildung 4-29 (Prothrombinzeit)

abgebildet.

Im Vorfeld dieses Versuches wurde die aPTT so kalibriert, dass die eingesetzte

Plasmaverdünnung in Diäthylbarbituratacetatpuffer im physiologischen Bereich eine

Gerinnungszeit von 30 ± 3 sec aufwies (Kalibrierungsdaten sind im Anhang unter 8.1 in

Abbildung 8-3 zu finden). Das gepoolte Plasma wurde im Versuchsverlauf zur Überprüfung

der Methode eingesetzt.

Die aPTT zeigte für beide Gruppen einen leichten Anstieg zwischen dem vierten und sechsten

Tag p.i.. Die Werte der Gruppe I lagen durchschnittlich zehn sec über denen der Gruppe II,

die Werte zeigten jedoch ansonsten einen annähernd parallelen Verlauf. Die Tiere der

Gruppe II wichen vom laborinternen Normalwert an den Tagen drei bis sechs, acht und 16 p.i.

4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 102

ab, wobei Verlängerungen der Gerinnungszeit zwischen 1,3 und 6,6 sec zu verzeichnen

waren. Die prozentualen Schwankungen der Gruppenmittelwerte im Versuchsverlauf

betrugen maximal 25 % für Gruppe I und 31 % für Gruppe II. Das Kontrollplasma ergab über

den gesamten Versuchsverlauf Werte im laborinternen Referenzbereich.

Die Gabe des Thrombininhibitors Hirudin machte die Messung der Thrombinzeit für die Tiere

der Gruppe I unmöglich, daher wurde dieser Test nur für die Tiere 187 – 191 durchgeführt

(Gruppe II). Der Verlauf zeigte Gipfel an den Tagen fünf und acht p.i. An Tag fünf p.i.

wurden Gerinnungszeiten gemessen, die drei bis vier sec über dem Ausgangswert lagen. Für

den zweiten Gipfel an Tag acht p.i. lagen die Werte drei bis 3,5 sec darüber. Die Werte

erreichten zu Versuchsende annähernd den Ausgangwert. Das mitgeführte Poolplasma ergab

Thrombinzeiten von 15,5 ± 0,3 sec.

Die Prothrombinzeit zeigte nach einem Abfall an den Tagen eins und zwei p.i. einen bis zum

Versuchsende andauernden Anstieg, dessen Verlauf für die Tiere beider Gruppen quasi

parallel war. Gruppe I lag dabei immer etwas über den Werten der Gruppe II und erreichte zu

Versuchsende einen ca. 7 sec höheren Wert. Im Versuchsverlauf war für die Gruppe I ein

durchschnittlicher Anstieg von fast 20 sec (110 %) zu verzeichnen. Der Ausgangswert lag

durchschnittlich bei 17,8 sec. Die Tiere der Gruppe II zeigten einen durchschnittlichen

Anstieg von 17,4 sec auf 30,2 sec (73,5 %). Das mitgeführte Poolplasma zeigte Werte von

13,1 ± 0,5 sec.

4 Ergebnisse 103

Aktivierte partielle Thromboplastinzeit

20

25

30

35

40

45

50

55

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tage pi

aP

TT

[s]

Gruppe I

Gruppe II

Ref.

Abbildung 4-27: aPTT für die Tiere der Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Der

laborintern an gepooltem Schweineplasma vor der Infektion ermittelte Standard ist in grau

dargestellt.

Thrombinzeit

10

12

14

16

18

20

22

24

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tage pi

Th

rom

bin

zeit

[s]

Gruppe II

Abbildung 4-28: Thrombinzeit für die Tiere der Gruppe II (MW ± Standardabweichung). Da

Hirudin als spezifischer Thrombininhibitor die Messung der Thrombinzeit bei den behandelten

Tieren unmöglich machte, ist hier nur die Kontrollgruppe dargestellt.

4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin 104

Prothrombinzeit

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tage pi

Pro

thro

mb

inze

it [

s]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-29: Prothrombinzeit für die Tiere der Gruppen I und II. Dargestellt sind die

Gruppenmittelwerte (MW ± Standardabweichung).

Die Fibrinogenkonzentration ist als Gruppenmittelwert für beide Gruppen in Abbildung 4-30

festgehalten. Die Werte beider Gruppen zeigten einen anhaltenden Aufwärtstrend ab dem

dritten Tag p.i.. Der Ausgangswert von ca. 2,25 g/l erhöhte sich dabei durchschnittlich auf

2,85 g/l für die Tiere der Gruppe I und auf 3,15 g/l für die Tiere der Gruppe II. Der

Gruppenmittelwert der Gruppe I erreichte seinen Gipfel von 3,07 g/l an Tag 13 p.i. und fiel

daraufhin wieder geringfügig ab. Das Maximum für die Gruppe II wurde an Tag elf mit

3,37 g/l erreicht. Zu Kontrollzwecken wurde ein kommerzielles humanes Plasma mitgeführt.

Dieses Plasma zeigte über den gesamten Versuchsverlauf Werte von 2,01 bis 2,12 g/l und lag

damit im unteren Referenzbereich des Herstellers. Die Kalibrationskurve zur Errechnung der

Fibrinogenkonzentration ist im Anhang 8.1 beispielhaft in Abbildung 8-4 dargestellt.

4 Ergebnisse 105

Fibrinogenkonzentration

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tage pi

Fib

rin

og

en [

g/l

]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-30: Fibrinogenkonzentration für die Tiere der Gruppen I und II (MW ±

Standardabweichung).

4.3 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo

Eine Vorprüfung der verfügbaren Wirkstoffe in vitro ergab, dass Tirofiban und ASS zu einer

Hemmung der Thrombozytenaggregation in Schweineplasma führten. Diese Wirkstoffe

wurden daraufhin in vivo getestet. Dabei stellte sich heraus, dass Tirofiban aufgrund seiner

Kinetik nicht für den Einsatz in einem längeren Experiment geeignet war. Nach subkutaner

Gabe des Wirkstoffs konnte eine 20 %ige Hemmung erreicht werden, die sich jedoch nicht

aufrechterhalten ließ. Nach einer Stunde konnte keine Hemmwirkung mehr in der

Thrombozytenaggregation nachgewiesen werden. Dieser Wirkstoff wurde daher nicht weiter

geprüft. ASS zeigte bei intravenöser (i.v.) Gabe nach 60 Minuten eine irreversible Hemmung

der Kollagen-induzierten Thrombozytenaggregation; die ADP-induzierte Aggregation blieb

dabei fast unbeeinflusst. Der monoklonale Antikörper Abciximab zeigte weder in vitro noch

in vivo eine messbare Wirkung und wurde daher nach ersten Versuchen ausgeschlossen. Das

oral zu verabreichende Clopidogrel wurde ausschließlich in vivo getestet und erwies sich in

diesem Vorversuch als wirksam.

Clopidogrel und ASS wurden daraufhin kombiniert in einem dreitägigen Experiment in vivo

eingesetzt. Es kamen orale Formulierungen der Wirkstoffe zum Einsatz, deren Dosierungen in

Tabelle 4-1 aufgeführt sind. Den Tieren wurde nach der Nullwertprobe vor Versuchsbeginn

zweimal täglich Blut entnommen, einmal vor der erneuten Wirkstoffapplikation und einmal

vier bis sechs Stunden danach. Es zeigte sich im Thrombozytenaggregationstest, dass die

4 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo 106

ADP-induzierte Thrombozytenaggregation durch eine einmal tägliche Applikation der oben

genannten Kombination dauerhaft um 30 – 50 % gehemmt wurde. Die Kollagen-induzierte

Thrombozytenaggregation konnte bei zwei von drei Tieren über die gesamte Versuchsdauer

um ca. 30% gehemmt werden. Für das Tier 229 traten starke Schwankungen auf, eine

kontinuierliche Hemmung konnte nicht erreicht werden. Insgesamt zeigte die Kollagen-

induzierte Thrombozytenaggregation stärkere Schwankungen. Die zu Kontrollzwecken

untersuchten Thrombozytenzahlen zeigten im Versuchsverlauf keine nennenswerten

Änderungen.

Die verwendeten Wirkstoffe, Monitoringverfahren, Dosierungen und Ergebnisse sind

zusammenfassend in Tabelle 4-1 dargestellt.

Tabelle 4-1: Wirkstoffe, Monitoringmethoden, Dosierungen und Ergebnisse der pharmakokinetischen

Vorversuche. Abkürzungen i.v. für intravenös, p.o. für per os.

Wirkstoff

(Handelsname)

Methode zur Überprüfung

der Wirksamkeit

Dosierung Wirksamkeit

Tirofibanhydrochlorid

(Aggrastat®)

Thrombozytenaggregationstests

(ADP)

0,4 mg/kg s.c. Hemmung der

Aggregation nur

kurzfristig und nicht

ausreichend

Abciximab (ReoPro®) Thrombozytenaggregationstests

(ADP)

0,4 mg/kg i.v. Keine Wirkung

Acetylsalicylsäure

(Aspisol®)

Thrombozytenaggregationstests

(Kollagen)

150 mg/kg i.v. Hemmung der Kollagen-

induzierten Aggregation

irreversibel ab 60 min

post injectionem, keine

bzw. geringfügige

Beeinflussung der ADP-

induzierten Aggregation

Clopidogrel

(Iscover®)

Thrombozytenaggregationstests

(ADP)

150 mg/Tier

p.o.

Hemmung in der ADP-

induzierten Aggregation

um 30 – 40%

Clopidogrel

(Iscover®)

+

Acetylsalicylsäure

(ASS ratiopharm®)

Thrombozytenaggregationstests

(ADP und Kollagen)

150 mg/Tier

Clopidogrel

p.o.

+

500 mg ASS

Hemmung der ADP- und

Kollagen-induzierten

Aggregation im

Vorversuch über 3 Tage

4 Ergebnisse 107

4.4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels

Clopidogrel und Acetylsalicylsäure

Das Experiment umfasste zehn Läuferschweine, die nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen

aufgeteilt wurden. Gruppe I, bestehend aus den Tieren 248 - 253, erhielt täglich eine orale

Clopidogrel- und ASS-Gabe. Gruppe II umfasste die Tiere 254 und 256 - 258 und diente als

Kontrolle. Die Einstellung der Medikamentengabe erfolgte eine Woche vor Beginn des

Infektionsversuches. Die Infektion der Tiere wurde mit 5 x 104,5

KID50 des KSPV-Isolats

CSF0634 intranasal durchgeführt.

4.4.1 Nachweis der Wirkung

Im Versuchsverlauf konnte eine Hemmung der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation

um durchschnittlich 20 – 30% erreicht werden. Die Darstellung der Gruppenmittelwerte ist im

Anhang unter 8.1 in Abbildung 8-5 zu finden. Bis zum siebten Tag pi verliefen die Werte für

die Gruppen I und II in oben genanntem Abstand von 20 – 30 % quasi parallel, die Werte für

beide Gruppen näherten sich jedoch bis zum Tag elf p.i. an. Zu Versuchsende konnte für drei

Tiere (Tiere 249, 250 und 257) keine Aggregation mehr induziert werden.

Die Ergebnisse für die Kollagen-induzierte Thrombozytenaggregation wiesen sowohl für die

behandelten als auch die Kontrolltiere ausgeprägte intra- und interindividuelle Schwankungen

auf. Ein eindeutiger Verlauf oder Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht zu

erkennen.

4.4.2 Nachweis der Infektion

Für den Nachweis der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 wurde an Tag neun p.i. eine

RNA-Isolierung aus EDTA-Blut vorgenommen und das gewonnene Material in der RT-PCR

untersucht. Für alle Tiere war der KSPV-Nuleinsäurenachweis positiv (siehe Tabelle 8-6).

4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 108

4.4.3 Entwicklung der Körpertemperatur

Alle Tiere der Gruppen I und II zeigten Fieber (Temperatur >40°C) am vierten Tag p.i.. Die

Temperatur stieg für alle Tiere durchschnittlich bis zum sechsten oder siebten Tag an und

erreichte danach ein Plateau von durchschnittlich 41 bis 41,5°C. Die febrilen Temperaturen

waren bis zum Zeitpunkt der Euthanasie feststellbar, wobei Tiere, die moribund euthanasiert

wurden, einen Temperaturrückgang zeigten. Es konnten keine augenfälligen Unterschiede

zwischen den Gruppen festgestellt werden. Der Verlauf der Temperaturentwicklung ist in

Abbildung 4-31 als Darstellung der Gruppenmittelwerte festgehalten.

Körpertemperatur im Versuchsverlauf

37

38

39

40

41

42

43

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Tage pi

Tem

per

atu

r [°

C]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-31: Körpertemperatur im Versuchsverlauf für die Gruppen I und II.

(Gruppemittelwerte und deren Standardabweichungen).

4.4.4 Dokumentation der klinischen Symptome

Die Dokumentation der klinischen Symptome wurde nach der Inkubationszeit gemäß den

Standardprotokollen des EURLs zur Erfassung des CS modifiziert nach MITTELHOLZER et

al. (2000) vorgenommen.

Die Tiere der Gruppe I entwickelten nach sieben Tagen zunächst unspezifische

Krankheitssymptome. Dazu gehörten Apathie, Konjunktivitis, Fressunlust, Obstipation und

Diarrhoe. Alle Tiere der Gruppe I entwickelten im weiteren Verlauf unterschiedlich

ausgeprägte zentralnervöse Symptome wie Schwäche in der Nachhand,

Koordinationsprobleme und Krampfneigungen. Hautblutungen im Bereich der Akren traten

4 Ergebnisse 109

bei allen Tieren zwischen dem 13. und 14. Tag auf. Alle Tiere zeigten zudem respiratorische

Symptome ab dem achten bzw. neunten Tag p.i.

Die ersten Krankheitssymptome zeigten die Tiere der Gruppe II fünf Tage p.i.. Nach einer

Phase mit unspezifischen Symptomen entwickelten auch diese Tiere typische Symptome einer

KSPV-Infektion mit zentralnervösen Symptomen und Hautblutungen unterschiedlichen

Ausmaßes. Die Hautblutungen wurden ab dem zehnten (Tier 254) bis 14. Tag p.i. (Tier 256)

offensichtlich. Auch diese Tiere zeigten respiratorische Symptome ab dem achten Tag p.i..

Der CS stieg für die Tiere der Gruppe II etwas früher und bis Tag elf p.i. zudem etwas steiler

an. Danach verliefen die Gruppenmittelwerte der Gruppen I und II quasi parallel. Der

maximale CS für ein Einzeltier der Gruppe I betrug 21 (Tier 253), der maximale

Gruppenmittelwert 17. Für die Gruppe II lag der maximale Einzelwert bei 18 (Tier 257), der

maximale Gruppenmittelwert bei 15.

Die Euthanasie der Tiere wurde zwischen dem 13. und 16. Tag p.i. durchgeführt. Der

Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die Tiere der Gruppe I 16,67, für

die Tiere der Gruppe II 15,75. Die Gruppenmittelwerte und die entsprechenden

Standardabweichungen sind in Abbildung 4-32 dargestellt.

Clinical Score

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Tage pi

CS

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-32: Clinical Score für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Die

Darstellung erfolgt in Punkten von 27.

4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 110

4.4.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde

Die Erfassung und Dokumentation der pathologisch-anatomischen Befunde erfolgte nach dem

Standardprotokoll des EURLs in Anlehnung an das von FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003)

erarbeitete Verfahren.

Alle Tiere zeigten in den postmortalen Untersuchungen klassische Befunde, die gemeinhin

mit der KSPV-Infektion in Verbindung gebracht werden, eine augenfällige Differenz

zwischen den Gruppen gab es nicht.

In unterschiedlicher Ausprägung zeigten die Tiere petechiale und ekchymatöse Blutungen im

Bereich der Akren und des ventralen Abdomens sowie in den Nieren. Alle Tiere wiesen

vergrößerte, zum großen Teil hämorrhagisch-infarzierte Lymphknoten auf.

Schwere Lungenentzündungen wiesen die Tiere 248, 249 und 250 auf. Multifokale

Milzrandinfarkte wurden bei den Tieren 248 und 251 gefunden. Tier 252 zeigte auffällige

petechiale Blutungen in der Magen- und Darmwand, die mit einem kaffeesatzartigen Inhalt

vergesellschaftet waren; dieses Tier wies zudem nekrotische Veränderungen im Bereich der

Ileocaecalpapille auf. Tier 258 zeigte ähnliche Veränderungen der Magen- und Darmwand.

4.4.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen

4.4.6.1 Gesamtleukozytenzahl

Bei der Bewertung der ermittelten Leukozytenzahlen wurde in Ermangelung eines

gerätespezifischen Referenzbereiches für Schweineblut der von MISCHKE (1999)

angegebene Referenzbereich von zehn bis 22 G/l zugrunde gelegt.

Im Verlauf der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 zeigten alle Tiere eine hochgradige

Leukopenie. Die Leukozytenzahlen begannen bereits nach dem ersten Tag p.i. zu sinken und

ausschließlich die Leukozytenzahlen des Tieres 256 zeigten gegen Versuchsende wieder

einen Aufwärtstrend. Die in Abbildung 4-33 abgebildeten Gruppenmittelwerte zeigten einen

annähernd parallelen Verlauf.

Für die Tiere der Gruppe I sank die durchschnittliche Leukozytenzahl von 19,5 G/l auf

4,7 G/l, was einem prozentualen Abfall von 76 % entsprach. Der maximale Rückgang war für

Tier 253 zu verzeichnen, dessen Leukozytenzahlen im Verlauf der Infektion von 14 G/l um

4 Ergebnisse 111

89 % auf 1,6 G/l absanken. Am geringsten ausgeprägt war die Leukozytendepletion bei

Tier 252 mit einem Rückgang um 50 % von 13,1 G/l auf 6,5 G/l.

Durchschnittlich sanken die Leukozytenzahlen der Tiere aus Gruppe II um 74 % von 25,4 G/l

auf 6,55 G/l. Abweichend von diesen Verläufen zeigte Tier 256 nach einem Rückgang der

Leukozytenzahlen von 23,7 G/l auf 6,7 G/l an Tag elf p.i. eine Normalisierung der Werte bis

auf 10,4 G/l an Tag 16 p.i.. Der Rückgang der Leukozytenzahlen war bei Tier 258 mit 91 %

von 32 G/l auf 2,9 G/l am stärksten ausgeprägt. Die Verläufe der Gruppenmittelwerte sind in

Abbildung 4-33 dargestellt.

Abbildung 4-33: Leukozytenzahlen für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichungen). Als

Referenzbereich wurde der von MISCHKE (1999) angegebene Bereich von zehn bis 22 G/l

zugrunde gelegt. Dieser ist in der Graphik mit gestrichelten Linien markiert (Ref. 1, Ref. 2).

Leukozytenzahlen

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Tage pi

Leu

ko

zyte

n [

G/l

]

Gruppe I

Gruppe II

Ref. 1

Ref. 2

4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 112

4.4.6.2 Thrombozytenzahl

Für die Bewertung der Thrombozytenzahlen wurde der von MISCHKE (1999) angegebene

Referenzbereich für Schweineblut von 220 bis 620 G/l zugrunde gelegt.

Alle Tiere entwickelten im Infektionsverlauf eine ausgeprägte Thrombozytopenie. Die

Gruppenmittelwerte beider Gruppen zeigten einen nahezu parallelen Verlauf mit einem ersten

Abfall der Thrombozytenzahlen ab dem dritten Tag p.i., einem leichten Anstieg zwischen den

Tagen vier und sieben p.i. und darauf folgendem Abfall bis zum Versuchsende.

Der Gruppenmittelwert für Gruppe I sank von 449 G/l auf 79 G/l (durchschnittlicher Abfall

von 82 %). Der Abfall lag zwischen 67 % (Tier 251) und 89 % (Tier 252).

Die Tiere der Gruppe II zeigten einen durchschnittlichen Abfall um 90 % von 582 G/l auf

58 G/l. Die Verluste lagen zwischen 72 % (Tier 254) und 95 % (Tier 258).

Abbildung 4-34: Thrombozytenzahlen für die Gruppen I und II im Versuchsverlauf (MW ±

Standardabweichung). Als Referenzbereich wurde der von MISCHKE (1999) angegebene

Bereich von 220 bis 620 G/l zugrunde gelegt. Dieser Bereich ist mit gestrichelten Linien (Ref. 1,

Ref. 2) angedeutet.

Thrombozytenzahlen

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Tage pi

Th

rom

bo

zyte

n [

G/l

]

Gruppe I

Gruppe II

Ref. 1

Ref. 2

4 Ergebnisse 113

4.4.6.3 Hämostaseologische Parameter

Die Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung sind in Abbildung 4-35 (aPTT), Abbildung

4-36 (Thrombinzeit) und Abbildung 4-37 (Prothrombinzeit) festgehalten.

Im Vorfeld dieses Versuches wurde die aPTT wiederum so kalibriert, dass die eingesetzte

Plasmaverdünnung in Diäthylbarbituratacetatpuffer im physiologischen Bereich eine

Gerinnungszeit von 30 ± 3 sec aufwies (Kalibrierungsdaten sind im Anhang unter 8.1 in

Abbildung 8-6 zu finden).

Die aPTT zeigte für die Tiere der Gruppe II nur geringfügige Schwankungen, die mit wenigen

Ausnahmen den für das Poolplasma gesunder Schweine ermittelten Wertebereich nicht

verließen. An Tag fünf und sechs p.i. war ein Anstieg um 40% zu beobachten, der sich an den

Tagen 16 und 17 für das einzige verbleibende Tier (256) wiederholte.

Die Werte der Tiere aus Gruppe I lagen im Versuchsverlauf etwas über denen der Gruppe II,

folgtem dem Verlauf jedoch im Wesentlichen. Der Gruppenmittelwert zeigte einen Anstieg an

Tag zwei p.i. um sieben sec (24 %) und zwischen den Tagen 13 und 15 p.i. einen

zweigipfeligen Anstieg um maximal 44 % bezogen auf den Ausgangswert.

Das zu Kontrollzwecken mitgeführte Humanplasma zeigte Werte zwischen 32,1 und 33,3 sec

und lag damit im vom Hersteller angegebenen Referenzbereich (25,5 – 34,5 sec).

Die Thrombinzeit zeigte einen nahezu parallelen Verlauf der Gruppenmittelwerte bis Tag 14

p.i. mit maximalen Schwankungen von 32 % (ca. 5,5 sec). Tier 250 zeigte 14 Tage p.i. einen

Anstieg der Thrombinzeit um fast 250 % und darauf folgend einen rapiden Abfall. Das

humane Kontrollplasma zeigte Thrombinzeiten von 18,65 – 19,9 sec und lag damit über den

gesamten Versuch im Referenzbereich des Herstellers (14,3 – 21,5).

Die Prothrombinzeit zeigte einen parallelen Verlauf der Gruppenmittelwerte mit geringen

Schwankungen von maximal 15 % bis Tag elf p.i.. Zwischen dem zwölften und 14. Tag p.i.

zeigten die Tiere der Gruppe I einen Anstieg um nahezu 200 %, wobei der Maximalwert für

Tier 249 mit einem Anstieg um über 700 % zu verzeichnen war.

Der Anstieg konnte auch für die Tiere der Gruppe II gezeigt werden. Hier stieg der

Gruppenmittelwert zwischen dem zwölften und 17. Tag p.i. um ca. 600 %.

4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure 114

aPTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Tage pi

aP

TT

[s]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-35: aPTT für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Der Test wurde

anhand eines Poolplasmas gesunder Schweine kalibriert. Die Werte für das Poolplasma lagen bei

30 ± 3 sec.

Thrombinzeit

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Tage pi

Th

ro

mb

inzeit

[s]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-36: Thrombinzeit für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung).

Prothrombinzeit

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Tage pi

Pro

thro

mb

inzeit

[s]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-37: Prothrombinzeit für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung).

4 Ergebnisse 115

Die Fibrinogenkonzentration der Gruppen I und II zeigten einen annähernd parallelen Verlauf

mit einem Anstieg ab Tag sechs bis sieben p.i.. Die Gruppenmittelwerte spiegelten die

individuellen Verläufe wider. Der durchschnittliche Anstieg der Fibrinogenkonzentration

betrug für Gruppe I ca. 45 % (von 4,78 auf 6,92 g/l), für Gruppe II ca. 52 % (von 4,97 auf

7,56 g/l). Die Werte für das mitgeführte humane Kontrollplasma lagen mit 3,0 ± 0,4 g/l im

oberen Referenzbereich. Die Verläufe der Gruppenmittelwerte sind in Abbildung 4-38

dargestellt.

Fibrinogenkonzentration

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Tage pi

Fib

rin

og

en [

g/l

]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 4-38: Fibrinogenkonzentration (MW ± Standardabweichung) für die Gruppen I und II.

5 Diskussion

Die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen kann v. a. bei jungen Tieren zu einem

akuten Krankheitsbild führen, das durch hämorrhagische Symptome gekennzeichnet ist, die

dem Bild eines klassischen viralen hämorrhagischen Fiebers entsprechen (GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 2003a). Gemeinsamkeiten mit anderen viralen hämorrhagischen

Fiebern wie z. B. der Ebolavirusinfektion betreffen sowohl die klinischen Symptome als auch

die Zielzellen des Virus und die pathogenetischen Mechanismen (GOMEZ-VILLAMANDOS

et al., 2003a).

Bisher konnten weder die Genese der hämorrhagischen Symptome, die im Verlauf der akuten

KSPV-Infektion auftreten, noch die der Thrombozytopenie und Leukopenie hinreichend

aufgeklärt werden. Während Thrombozytopenie und Hämorrhagien in den 1970er Jahren im

Sinne einer DIC bzw. Verbrauchskoagulopathie gedeutet wurden (HEENE et al., 1971;

HOFFMANN et al., 1971a), werden gegenwärtig v. a. Makrophagen und deren Zytokine für

die Symptomatik verantwortlich gemacht (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).

Im Rahmen dieser Arbeit sollten die pathogenetischen Mechanismen, die den

hämorrhagischen Symptomen und hämostaseologischen Veränderungen zugrunde liegen,

näher charakterisiert werden. Nach Vorversuchen zur Auswahl des geeigneten KSPV-Isolates

und zur Untersuchung des Verlaufs klinischer, pathologisch-anatomischer, hämatologischer

und hämostaseologischer Parameter wurden dazu zwei Ansätze gewählt, welche eine

pharmakologische Intervention an unterschiedlichen Stellen des Hämostasesystems vorsahen.

Es wurde einerseits die Endstrecke der plasmatischen Gerinnung und andererseits die

Thrombozytenaggregation gehemmt. Zu diesem Zweck wurden der Thrombininhibitor PEG-

Hirudin und die Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel und Acetylsalicylsäure

verwendet.

5 Diskussion 117

5.1 Auswahl und Virulenz des KSPV-Isolates

Für die Zielsetzung dieser Arbeit war es unabdingbar, die Tierversuche mit einem

hochvirulenten KSPV-Stamm durchzuführen, der in der Lage war, die KSP-typischen

Hämorrhagien zu induzieren.

Aus vorangegangenen Versuchen am EURL war bekannt, dass das KSPV-Isolat CSF0634

anhand des modifizierten Untersuchungsschemas nach MITTELHOLZER et al. (2000) mit

einem CS >14 als hochvirulent eingestuft werden konnte (FLOEGEL-NIESMANN et al.,

2003). Mit diesem Isolat infizierte Tiere zeigten zudem reproduzierbar unterschiedlich

ausgeprägte hämorrhagische Symptome.

Das Isolat wurde für die vorliegende Arbeit zunächst im Rahmen der Vorversuche eingesetzt.

Da alle infizierten Tiere (n = 10) an der akuten Verlaufsform der KSP erkrankten und die

überwiegende Mehrzahl (80 %) unterschiedlich ausgeprägte Hämorrhagien entwickelte,

wurde das Isolat als geeignet eingeschätzt und in den Hauptversuchen eingesetzt. Alle Tiere

der Hauptversuche erkrankten ebenfalls akut und zeigten hämorrhagische Symptome sowie

einen CS ≥ 14.

5.2 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634

Neben den klinischen Symptomen wurden in allen Versuchen die pathologisch-anatomischen

Befunde sowie hämatologische und hämostaseologische Parameter bewertet.

Die erhobenen pathologisch-anatomischen Befunde entsprachen mit vergrößerten,

hämorrhagisch-infarzierten Lymphknoten im gesamten Organismus, hämorrhagischen

Veränderungen in den Nieren und anderen inneren Organen, entzündlichen Veränderungen

des Respirationstraktes sowie Milzrandinfarkten den Ergebnissen, die von RÖHRER und

PEHL (1960) und VAN OIRSCHOT (1999) für die akute Verlaufsform der KSP beschrieben

wurden.

In einer Übersichtsfärbung (HE) wurde an Paraffin-eingebetteten Organschnitten von fünf

infizierten Tieren versucht, eine Thrombosierung der kleineren bis mittelgroßen Gefäße

nachzuweisen, die zu den histopathologischen Äquivalenten der oben beschriebenen

makroskopischen Veränderungen gehören sollten (RÖHRER und PEHL, 1960; HEENE et al.,

5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 118

1971; HOFFMANN et al., 1971a; QUEZADA et al., 2000). In den großen Gefäßen wurden,

den Berichten in der Literatur entsprechend, keine Thromben gefunden (RÖHRER und

PEHL, 1960; HOFFMANN et al., 1971a).

Während HOFFMANN et al. (1971) eine Thrombosierung kleiner und mittlerer Gefäße

verschiedener Organe in der HE-Färbung Paraffin-eingebetteter Organschnitte nachwies,

konnte dieser Befund in der vorliegenden Studie nicht nachvollzogen werden.

Für diese Diskrepanz der Befunde sind mehrere Erklärungen denkbar. Zum einen sind

Mikrothromben und Plättchenaggregate in Kapillaren auch mit spezifischen Färbemethoden

sehr schwer nachweisbar, da sie von unterschiedlichsten Proteasen des fibrinoytischen

Systems und leukozytärer Zellen aufgelöst und durch aktivierte Makrophagen phagozytiert

werden (SCHIEFER und SEARCY, 1975). Diese Prozesse laufen auch postmortal weiter und

beeinflussen die Aussagekraft negativer Befunde. Daher ist nicht auszuschließen, dass eine

perimortale Auflösung der Thromben den Nachweis unmöglich machte. Eine Hemmung des

proteolytischen Abbaus könnte zur Abklärung sinnvoll sein, dieser Ansatz ließ sich jedoch

unter den gegebenen Umständen nicht umsetzen.

Zum anderen ist die HE-Färbung als Nachweismethode kritisch zu hinterfragen, da die HE-

Färbung nur eine Übersichtsfärbung ist, die aus Praktikabilitätsgründen durchgeführt wurde.

Kleinste Thromben und Fibrinablagerungen wären mit Färbungen wie der PTAH-Färbung

(phosphotungstic acid-hematoxilin) besser und sicherer nachweisbar gewesen, jedoch waren

diese Färbungen unter den gegebenen Möglichkeiten nicht durchführbar. Wie oben erwähnt,

waren Thrombosierungen in der Studie von HOFFMANN et al. (1971) allerdings auch in der

HE-Färbung nachweisbar.

Des Weiteren ist die Rolle des verwendeten Virusstamms zu betrachten. Die Versuche in den

1970er Jahren wurden mit einem anderen KSPV-Stamm durchgeführt, der u. U. andere

pathologisch-anatomische Befunde induzierte. Leider ist der Publikation von HOFFMANN et

al. (1971) die genaue Beschreibung des Virusstammes nicht zu entnehmen, es hat sich jedoch

gezeigt, dass in den letzten Jahrzehnten ein Wandel in der Virulenz und Klinik der KSP-

Stämme zu beobachten war (WILLIAMS und MATTHEWS, 1988; KOENEN et al., 1996;

PATON und GREISER-WILKE, 2003a). Das KSPV-Isolat CSF0634, welches für die

vorliegende Studie verwendet wurde, gehört zu den aktuellen Stämmen der 1990er Jahre und

könnte daher abweichende Charakteristika aufweisen.

5 Diskussion 119

Der Virus- bzw. Antigennachweis, der zum Beweis der Infektion mit dem KSPV

durchgeführt wurde, zeigte, dass alle Tiere erfolgreich infiziert werden konnten. Negative

Antigen- und Virusnachweise für zwei der 30 Tiere zu Versuchsende zeigen, dass diese Tiere

trotz der hohen Virulenz des KSPV-Isolates in der Lage waren, das Virus zu eliminieren und

in die Phase der Rekonvaleszenz eintraten; diese Tiere zeigten zudem auch eine moderate

Antikörperproduktion und Normalisierung der Blutparameter. Für die vorliegende Arbeit

waren Rekonvaleszenten für eine weitere Auswertung nicht mehr nutzbar. Ihr Auftreten

zeigte jedoch, dass die Virulenz des Erregers stark von der Konstitution des betroffenen

Tieres abhängt.

Alle Tiere entwickelten im Verlauf der KSPV-Infektion eine markante Leukopenie, die

sowohl in ihrem Verlauf als auch in der Ausprägung den für die akute Verlaufsform der

KSPV-Infektion publizierten Beobachtungen entsprach (TRAUTWEIN, 1988; PAULY et al.,

1998; SUMMERFIELD et al., 2001a).

Alle infizierten Tiere entwickelten eine Thrombozytopenie, die für einige Tiere zum fast

vollständigen Verlust der Thrombozyten führte (Absinken um 98 %). Die Verläufe der

Thrombozytenzahlen entsprachen ebenfalls den publizierten Daten (HEENE et al., 1971;

HOFFMANN et al., 1971a), wobei im vorliegenden Fall die von GOMEZ-VILLAMANDOS

et al. (1998) postulierte direkte Korrelation zwischen dem Auftreten der ersten Symptome und

dem Absinken der Thrombozytenzahlen nicht nachvollziehbar war. Dies könnte u. U. daran

liegen, dass diese Arbeitsgruppe ein KSPV-Isolat verwendete, das früher zu klinischen

Symptomen führte. Während diese Autoren für den KSPV-Stamm „Quillota“ vom ersten

Auftreten klinischer Symptome an Tag zwei p.i. berichten, traten die ersten Symptome mit

dem Isolat CSF0634 vier bis sieben Tage p.i. auf, was den allgemeinen Beobachtungen

entspricht (FLOEGEL-NIESMANN et al., 2003).

Auffällig war, dass der Referenzbereich des Geräteherstellers (Sysmex Deutschland,

Norderstedt) für Thrombozytenwerte des Schweins bei 16 von 24 Tieren an den ersten Tagen

überschritten wurde. Da dies sowohl für die Einzeltiere als auch für das gepoolte Plasma

gesunder Schweine der Fall war, ist die Gültigkeit der oberen Grenze des Referenzbereiches

kritisch zu hinterfragen. Legte man den Referenzbereich nach MISCHKE (1999) zugrunde,

lägen über 95% der Tiere im Normalbereich.

5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 120

Trotz fehlender Referenzbereiche für Schweinethrombozyten in der Literatur wurden die

Thrombozytenparameter MPV und Large Platelets in die hämatologischen Untersuchungen

und Auswertung einbezogen, da sie als Marker für die Aktivität der Thrombozyten gelten. Für

das MPV lagen Referenzbereiche des Geräteherstellers vor, nach denen sich die Auswertung

richtete. Ein Anstieg des MPV wird als regenerative Veränderung gedeutet, die durch den

Nachschub junger, größerer Thrombozyten aus dem Knochenmark entsteht. Sie ist somit

indirekt auch ein Anzeiger kompensierter Verbrauchsreaktionen (mit funktionsfähigem

Knochenmark). Im Verlauf der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 zeigte sich eine sehr

große intra- und interindividuelle Schwankungsbreite. Es war jedoch bei den infizierten

Tieren ein tendenzieller Anstieg zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. zu verzeichnen.

Der Parameter Large Platelets zeigte einen gleichsinnigen Gipfel. Betrachtet man diese

Tendenzen zusammen, ist anzunehmen, dass eine regenerative Kapazität des Knochenmarks

vorhanden war, und vermehrt junge Thrombozyten freigesetzt wurden. Das Auftreten dieser

Thrombozyten ist jedoch auch als Indiz einer Verbrauchsreaktion zu werten.

Die Globaltests der Gerinnung aPTT, Thrombinzeit und Prothrombinzeit wurden als

Screeningtests des plasmatischen Gerinnungssystems durchgeführt. Die aPTT diente dabei

der thrombozytenunabhängigen Untersuchung des intrinsischen Weges der Blutgerinnung

(MISCHKE, 1999a; MISCHKE, 1999b; BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Abgesehen

von den in 5.3 genannten Verschiebungen durch die Hirudintherapie, zeigte die aPTT hier nur

moderate Schwankungen (bis 20%). Einzelwerte, die deutlich außerhalb des erwarteten

Bereichs lagen, konnten eindeutig mit Problemen bei der Blutentnahme und zu langen

Auftauzeiten in Verbindung gebracht werden. Kam es bei der Blutentnahme durch Verletzung

des Endothels zu einer verstärkten lokalen Aktivierung der Gerinnung, wurde häufig eine

Verkürzung der Gerinnungszeiten beobachtet. Es zeigte sich zudem, dass sowohl die

Auftaugeschwindigkeit als auch die Temperatur des Diäthylbarbituratacetatpuffers wichtige

Einflussgrößen auf die Aussagekraft und Reproduzierbarkeit der Gerinnungszeiten

darstellten. Die besten Ergebnisse wurden mit vorgewärmtem Puffer und rasch aufgetauten

Proben erzielt. Dabei war dem schnellen Auftauen im Wasserbad bei 37°C gegenüber dem

Auftauen bei Raumtemperatur der Vorzug zu geben.

5 Diskussion 121

Der Verlauf der aPTT im Infektionsgeschehen legt nahe, dass dem intrinsischen Weg des

plasmatischen Gerinnungssystems keine entscheidende Bedeutung in der Pathogenese der

KSP zukommt. Eine dekompensierte DIC geht gemeinhin mit einer Verlängerung der aPTT

einher, die im vorliegenden Fall nicht in Erscheinung trat. Auch die Verkürzung der aPTT,

die für die kompensierte Phase einer DIC charakteristisch ist, trat nicht auf.

Die Thrombinzeit gilt als Suchtest bei Verdacht auf Fibrinogenmangelzustände und beurteilt

die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung, die auch von aPTT und Prothrombinzeit

abgedeckt wird (MISCHKE, 1999a). Die Thrombinzeit zeigte analog zu den Werten der aPTT

nur moderate Schwankungen. Einige Werte mit ausgeprägten Abweichungen konnten mit

Konsistenzveränderungen der Plasmaaliquots korreliert werden, was die Bedeutung der

Probenqualität für die Aussagekraft dieses Tests unterstreicht.

Markante Änderungen traten ausschließlich in den Werten der Prothrombinzeit auf, die als

Screeningtest für den extrinischen Weg der Blutgerinnung (BARTHELS und VON DEPKA,

2003b) gilt. Für alle infizierten Tiere zeigte sich ein Anstieg ab dem zehnten Tag pi, der

jedoch unterschiedlich ausgeprägt war. Wie die oben genannten Gerinnungstests reagierte

auch die Prothrombinzeit empfindlich auf Änderungen der Entnahme-, Lagerungs- und

Auftaubedingungen.

Für die Prothrombinzeit ist bekannt, dass sie im Verlauf einer DIC häufig erhöht ist

(BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Werte

zeigten, dass es in der Finalphase der Erkrankung zu einem Verbrauch der Faktoren des

extrinsischen Systems kommt. Dieser Befund entsprach den Befunden, die in den 1970er

Jahren erhoben wurden (HEENE et al., 1971).

Die Fibrinogenbestimmung zeigte einen Aufwärtstrend für alle infizierten Tiere, der in

seinem Verlauf mit den Befunden von HEENE et al. (1971) übereinstimmte.

Die Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere des ersten Vorversuches zeigten ausgeprägte

Schwankungen, die eine exakte Auswertung nicht zuließen. Die in diesem Vorversuch

durchgeführte Methode nach CLAUSS erwies sich als störanfällig und war für den

Versuchskomplex mit Hirudin nicht geeignet (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Sie

wurde durch die Methode nach RATNOFF und MENZIE ersetzt, die zwar arbeits- und

zeitintensiv ist, jedoch weder durch Gerinnungshemmer noch Fibrinogen-

Degradationsprodukte beeinflusst wird (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b).

5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 122

Fibrinogen kann als Akutphaseprotein schnell und in großer Menge bereitgestellt werden und

ist daher bei inflammatorischen Prozessen erhöht. Es ist zudem von wesentlicher Bedeutung

bei der Thrombozytenaggregation, wo es über die Bindung an den GPIIB/IIIa Rezeptor die

Verbindung der aktivierten Thrombozyten realisiert.

Die auftretenden, moderaten Erhöhungen können als Anpassungs- bzw. Regenerationsversuch

nach einem erhöhten Verbrauch gewertet werden. Der für eine dekompensierte DIC häufig

charakteristische Abfall der Fibrinogenkonzentration (BATEMAN et al., 1999) konnte im

Verlauf der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 nicht nachgewiesen werden.

Das Auftreten löslicher Fibrinmonomere im Plasma wurde mit dem EGT überprüft, der als

Schnelltest eine rein qualitative Auskunft gibt. Erhöhte Konzentrationen werden bei

gesteigerter intravasaler Gerinnung und Gefäßverschlüssen erwartet (BARTHELS und VON

DEPKA, 2003d). Der EGT wurde bei den Tieren des zweiten Vorversuchs durchgeführt und

erbrachte positive Ergebnisse erst in der Finalphase der Erkrankung bei drei von fünf

infizierten Tieren. Der Test erwies sich als störanfällig. Da lösliches Fibrin sehr instabil ist,

eine Fehlinterpretation durch präanalytische Fehler (Thrombinbildung bei der Entnahme)

relativ häufig auftritt sowie Kreuzreaktionen mit plasmininduzierten Fibrin(ogen)derivaten

gegeben sein können (BARTHELS und VON DEPKA, 2003d), gibt der Test nur einen ersten

Anhaltspunkt. Dennoch sind die positiven Ergebnisse als Indiz dafür zu werten, dass eine

überschießende Aktivierung des Gerinnungssystems in der Finalphase der KSP-Erkrankung

vorlag.

Einzelfaktorenbestimmungen wurden für die Tiere des ersten Vorversuches für die Faktoren

II, V und Antithrombin III durchgeführt. Gerinnungsfaktor II (Prothrombin) zeigte

ausgeprägte Schwankungen und konnte nur in einer Trendanalyse ausgewertet werden. Vier

von fünf infizierten Tieren zeigten im Gegensatz zu den Kontrolltieren einen deutlichen

Anstieg an Tag sieben p.i.. Diese Aktivitätssteigerung indiziert eine Aktivierung des

Gerinnungssystems, die jedoch kompensiert zu sein scheint, da auffällige Entsprechungen in

den Globaltests nicht nachweisbar waren.

Die Faktor-V-Aktivität stellt einen besonders sensiblen Indikator für intravasale

Thrombinaktivität und damit eine Verbrauchskoagulopathie dar (HEENE et al., 1971), wobei

eine erhöhte Faktor-V-Aktivität in der Phase I einer Verbrauchskoagulopathie zu erwarten ist

(BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Die Messwerte für Faktor V reagierten empfindlich

5 Diskussion 123

auf eine Aktivierung des Gerinnungssystems bei Blutentnahmeproblemen im Sinne eines

falsch erhöhten Spiegels. Dessen ungeachtet, zeigte Faktor V gleiche Veränderungen wie

Faktor II. Der Gipfel an Tag sieben p.i. ist Anzeichen einer kompensierten

Gerinnungsaktivierung, während der Abfall gegen Ende des Versuchs für eine

Verbrauchsreaktion spricht.

Antithrombin III ist der natürliche Inhibitor der Gerinnungsfaktoren und zeigt verminderte

Aktivität v. a. im Rahmen einer Hyperfibrinolyse und in der dekompensierten Phase einer

DIC (MISCHKE, 1999a). Die Antithrombin-III-Aktivität nahm bei allen infizierten Tieren ab,

wobei sich die Werte bei drei von fünf Tieren in etwa halbierten. Diese Reaktion korreliert

mit den oben genannten Befunden und ist hinweisend für eine Verbrauchssituation.

5.3 Auswirkungen der Hemmung des plasmatischen Gerinnungssystems

auf den Infektionsverlauf

Der Thrombininhibitor PEG-Hirudin wurde gewählt, um die Endstrecke der plasmatischen

Gerinnung zu hemmen und damit den Einfluss dieses Systems auf den Krankheitsverlauf

näher zu untersuchen. Die Wirksamkeit von Hirudin war bereits in einem Versuch zur

Prävention der endotoxininduzierten DIC im Schweinemodell belegt worden (NOWAK und

MARKWARDT, 1980a). Für das Experiment in der vorliegenden Arbeit wurden zehn

Läuferschweine mit dem KSPV-Isolat CSF0634 infiziert. Fünf Schweine (Gruppe I) erhielten

eine tägliche, subkutane PEG-Hirudininjektion, fünf unbehandelte Schweine dienten der

Kontrolle. Im Versuchsverlauf wurden klinische, hämatologische und hämostaseologische

Parameter erhoben und für beide Gruppen verglichen. Gleiches galt für die Ergebnisse der

postmortalen Untersuchung nach der Euthanasie der Tiere.

Mittels ECT konnte über den gesamten Versuchsverlauf gezeigt werden, dass ein

therapeutischer Plasmahirudinspiegel von ca. 0,5 – 1,5 µg/ml bei allen Tieren der behandelten

Gruppe erreicht und erhalten werden konnte, ohne in den toxischen Wertebereich zu

kommen.

Alle infizierten Tiere entwickelten die akute Verlaufsform der KSP mit unterschiedlich

ausgeprägten hämorrhagischen Symptomen und pathologisch-anatomischen Befunden, wobei

die hämorrhagischen Erscheinungen durch eine PEG-Hirudingabe über das erste Auftreten

5 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den Infektionsverlauf 124

petechialer Blutungen hinaus, nicht negativ beeinflusst wurde. Die Ausprägung der

Hämorrhagien zeigte keine Korrelation mit der Gruppenzugehörigkeit.

Der Vergleich beider Gruppen hinsichtlich des Krankheitsverlaufs und der hämatologischen

und hämostaseologischen Parameter zeigte keinen augenfälligen Einfluss der PEG-

Hirudingabe auf die erhobenen Parameter. Auch die Gruppenmittelwerte für die Parameter

Körpertemperatur, CS, Globaltests der Gerinnung, Leukozyten- und Thrombozytenzahlen,

MPV, Large Platelets und Fibrinogen zeigten einen nahezu parallelen Verlauf. Eine

Ausnahme bildete die aPTT, deren Verläufe der Gruppenmittelwerte sich versetzt parallel

darstellten. Die aPTT-Werte der behandelten Gruppe lagen über den gesamten

Versuchsverlauf ca. zehn sec über denen der Kontrollgruppe, was durch die Wirkung des

PEG-Hirudins zu erklären ist. Es ist bekannt, dass die aPTT im unteren therapeutischen

Konzentrationsbereich eine nahezu lineare Korrelation zwischen Hirudinkonzentration und

Verlängerung der Gerinnungszeit zeigt. Sie wurde deshalb zur Überwachung der

Hirudintherapie in der Humanmedizin herangezogen (MONREAL et al., 1995; BARTHELS

und VON DEPKA, 2003d; GOSSELIN et al., 2004) und von den Herstellern teilweise noch

immer dafür empfohlen. Die mangelnde Linearität im oberen und toxischen

Konzentrationsbereich sowie ihre großen interindividuellen Unterschiede machen sie jedoch

für eine aussagekräftige Überwachung ungeeignet (NOWAK, 2001). Dennoch belegen die

aufgetretenen Verlängerungen der aPTT und der parallele Verlauf zu den Werten der

Kontrollgruppe die Hirudinwirkung und ihre Konstanz.

Die Thrombinzeit war durch die Gabe des direkten Inhibitors PEG-Hirudin so ausgeprägt

verlängert, dass eine Messung mit den etablierten Methoden unmöglich war. Für die

Kontrollgruppe ergab sich ein Anstieg der Thrombinzeit zwischen dem fünften und achten

Tag p.i., der jedoch vor dem Hintergrund, dass Referenzwerte für die Thrombinzeit beim

Schwein mit einer Spannbreite von mehreren Sekunden angegeben werden (KARGES et al.,

1994), zu vernachlässigen zu sein scheint.

5.4 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den

Infektionsverlauf

In Vorversuchen wurde in vitro und in vivo ein geeigneter Wirkstoff zur Hemmung der

Thrombozytenaggregation gesucht, dessen Wirksamkeit sich über einen Aggregationstest

5 Diskussion 125

nachweisen ließ. Da der Thrombozytenaggregationstest für Schweineplasma nicht etabliert

war, musste die Anwendbarkeit der gebräuchlichen Aggregationsinduktoren zunächst getestet

werden. Als Vergleichswert wurde humanes Plasma eingesetzt. Von den Induktoren ADP,

Kollagen, Ristocetin und Arachidonsäure zeigten nur die beiden ersten eine zufriedenstellende

Induktion der Thrombozytenaggregation.

Wirkstoff der ersten Wahl zur Thrombozytenaggregationshemmung wäre der monoklonale

Antikörper Abciximab gewesen, da er über die Hemmung des GPIIb/IIIa-Rezeptors nicht nur

die Thrombozyteninteraktionen, sondern auch die Interaktionen mit polymorphkernigen

neutrophilen Granulozyten gehemmt hätte (HABAZETTL et al., 2000). Der Interaktion der

Thrombozyten mit neutrophilen Granulozyten über den GPIIb/IIIa-Rezeptor wird in der

Humanmedizin v. a. eine Rolle in der Pathogenese thrombotischer Ereignisse beigemessen, da

diese Interaktion die Thrombusbildung fördert und zur weiteren Plättchenaktivierung führen

kann (DE GAETANO et al., 1999; ANDREWS und BERNDT, 2004). Im Zusammenhang mit

dieser Studie wäre die Hemmung der Plättchenaktivierung das Ziel gewesen.

Da jedoch schon in vitro Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen zeigten, dass

Abciximab keine Wirksamkeit im Schwein besitzt, musste ein anderer Wirkstoff gefunden

werden. Für die GPIIb/IIIa-vermittelte Thrombozytenaggregation wurden speziesspezifische

Unterschiede nachgewiesen (JENNINGS et al., 1995), so dass die mangelnde Wirksamkeit

des chimären monoklonalen Antikörpers, der im entscheidenden Teil humane Spezifikationen

zeigt, auf dieser Grundlage erklärt werden kann.

Der GPIIb/IIIa-Rezeptorblocker Tirofiban, der bereits im Schweinemodell angewendet wurde

(SHEN et al., 2000), erwies sich nach den in vitro Studien zunächst als Erfolg versprechender

Kandidat, zeigte jedoch in vivo eine sehr ungünstige Kinetik und musste daher ebenfalls

ausgeschlossen werden. Es zeigte sich, dass Daten zu den Wirkstoffen, die in kurzfristigen

Studien an häufig narkotisierten Schweinen und bei überwachter intravenöser Gabe der

Substanzen gewonnen wurden, für die Anwendung außerhalb dieser Modelle nicht

übertragbar waren.

Der Wirkstoff Clopidogrel, welcher die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation hemmt,

wurde, da er oral zu verabreichen ist und erst in seiner metabolisierten Form wirksam wird,

ausschließlich in vivo getestet. Es zeigte sich, dass sich mit einer Dosierung von 150 mg/Tier

die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation um 30 bis 40 % hemmen ließ. 150 mg

5 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den Infektionsverlauf 126

entsprechen der doppelten Dosis, die für einen erwachsenen Menschen pro Tag veranschlagt

wird. Diese Unterschiede in der Dosis-Wirkungsbeziehung könnten auf die unterschiedliche

physiologische Thrombozytenzahl zurückzuführen sein. Während der Referenzbereich für

einen erwachsenen Menschen bei 150 – 400 G/l liegt, liegen die physiologischen Werte für

das Schwein trotz großer individueller Schwankungsbreite bei 600 G/l und darüber. In

Tiermodellen wurde gezeigt, dass ASS die Wirkung des Clopidogrels potenzieren kann

(HERBERT et al., 1996; HERBERT et al., 1998; HARKER et al., 1998), daher wurde auch

die Wirksamkeit der ASS überprüft. Die Versuche mit ASS zeigten, dass sie sowohl in vitro

als auch in vivo eine Hemmung der kollageninduzierten Thrombozytenaggregation hervorrief.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die Kombination Clopidogrel und ASS in einem

dreitägigen in vivo Versuch getestet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kombination aus

150 mg/Tier/Tag Clopidogrel und 500 mg/Tier/Tag ASS zu einer stabilen Hemmung der

ADP- und kollageninduzierten Thrombozytenaggregation führte. Die Hemmung betrug ca.

30 – 50 % für die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation und ca. 30 % für die

kollageninduzierte Thrombozytenaggregation, wobei die Hemmung der kollageninduzierten

Aggregation nur für zwei von drei Tieren sicher belegt werden konnte, da das dritte Tier

starke Schwankungen zeigte, die eine Auswertung unmöglich machten.

Da sowohl ASS als auch Clopidogrel irreversible Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation

sind, ist es auffallend, dass derart hohe Dosierungen für ein Läuferschwein von ca. 15 kg

Lebendgewicht notwendig waren. Die hohen physiologischen Thrombozytenzahlen des

Schweins und die große Reservekapazität des Knochenmarks könnten jedoch eine Rolle dabei

spielen.

Da im Vorversuch eine kontinuierliche Hemmung der ADP-induzierten Aggregation erreicht,

und auch die ASS-Wirkung für die Mehrzahl der Schweine hinreichend gezeigt werden

konnte, wurde die Kombination aus Clopidogrel und ASS für den Infektionsversuch

ausgewählt.

Im Rahmen des Infektionsversuchs wurden zehn Läuferschweine mit dem KSPV-Isolat

CSF0634 intranasal infiziert. Sechs Schweine erhielten täglich eine orale Gabe der

Clopidogrel/ASS-Kombination, vier Schweine dienten als unbehandelte Kontrolle. Über die

Versuchsdauer wurde den Tieren täglich Blut zur Bestimmung hämatologischer und

hämostaseologischer Parameter, inklusive der Thrombozytenaggregationstests, entnommen

5 Diskussion 127

und die Ergebnisse zwischen den Gruppen verglichen. Zudem wurde die Entwicklung des

Krankheitsbildes sowie die pathologisch-anatomischen Befunde dokumentiert und

gegenübergestellt.

Die Kontrolle der Wirksamkeit des Clopidogrels mittels ADP-induzierter

Thrombozytenaggregation erbrachte mit einer kontinuierlichen Hemmung um

durchschnittlich 30 % ein zufriedenstellendes Ergebnis, die Wirksamkeit der ASS konnte

nicht hinreichend belegt werden. Die Tatsache, dass die Schweine des Hauptversuches nicht

aus dem Betrieb kamen, aus dem die Tiere des Vorversuches stammten, lässt die Vermutung

zu, dass es einen Zusammenhang der ASS-Wirksamkeit mit dem genetischen Hintergrund der

Schweine gibt. Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass es Menschen gibt, die eine ASS-

Resistenz aufweisen (MASON et al., 2004; WONG et al., 2004; EIKELBOOM et al., 2005;

SCHNEIDER, 2005; SZCZEKLIK et al., 2005; ANGIOLILLO et al., 2006; HANJIS et al.,

2006) und es ist nicht auszuschließen, dass ein ähnliches Phänomen bei Schweinen existiert.

In einer humanmedizinischen Studie zur Langzeittherapie mit Clopidogrel und ASS wurde

gezeigt, dass 44 % der Studienteilnehmer eine ASS-Resistenz aufwiesen und wesentlich

schlechter auf die Kombinationstherapie ansprachen (ANGIOLILLO et al., 2006).

Ob es ein mit der ASS-Resistenz des Menschen vergleichbares Phänomen gab, kann aus den

vorliegenden Daten nicht schlüssig beantwortet werden. Eine mangelnde Aufnahme durch die

Tiere scheidet aus, da die Verabreichung mit Clopidogrel zusammen in Pulverform per

direkte orale Eingabe mittels Spritze erfolgte, und dieses durchweg eine Wirksamkeit zeigte.

Eine Dosiserhöhung erbrachte keine höheren Hemmwerte, was ebenfalls auf eine mögliche

Resistenz hindeuten könnte. Es ist festzuhalten, dass beide Testsysteme sehr empfindlich auf

Entnahmeprobleme und Lagerungszeiten reagierten. Hämolytisches Plasma war nicht

geeignet zur Messung in der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation und ergab nicht

auswertbare Ergebnisse. Da Erythrozyten bei der Zerstörung u. a. auch ADP in nicht

unerheblichen Mengen freisetzen (NOWAK, persönliche Mitteilung), ist eine vorzeitige

Aktivierung und Aggregation durch den physiologischen Induktor anzunehmen.

Blutentnahmeprobleme im Sinne eines Durchstechens der Vene beeinflussten die

kollageninduzierte Aggregation. Es ist anzunehmen, dass die bereits aktivierten

Thrombozyten nicht mehr für den Test zur Verfügung standen. Im Versuchsverlauf musste

die Zahl der eingestellten Thrombozyten halbiert werden, da der Wert von 500.000 /µl auch

5 Schlussfolgerungen 128

im PRP durch die markante Thrombozytendepletion nicht mehr erreicht wurde. Die

Thrombozytenzahl spielte somit zum Versuchsende eine bedeutende Rolle für das

Testsystem.

Der Vergleich der beiden Gruppen erbrachte keinen Hinweis bezüglich einer Beeinflussung

des Krankheitsgeschehens durch die pharmakologische Intervention. Alle klinischen,

hämatologischen und hämostaseologischen Parameter zeigten, abgesehen von unterschiedlich

ausgeprägten inter- und intraindividuellen Schwankungen, einen quasi parallelen Verlauf.

5.5 Schlussfolgerungen

5.5.1 Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems und einer disseminierten

intravasalen Gerinnung

Für die Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 konnte gezeigt werden, dass es zu

unterschiedlichen Veränderungen im plasmatischen Gerinnungssystem kam. Insbesondere

konnte eine Aktivierung des extrinsischen Weges der Gerinnung reproduzierbar anhand der

Prothrombinzeit in der Finalphase der Erkrankung nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der

aPTT legten nahe, dass der Aktivierung des intrinsischen Systems im Verlauf der KSPV-

Infektion keine wesentliche Bedeutung zukommt. Diese Ergebnisse konnten für drei bzw. vier

Tiere des ersten Vorversuchs mit deutlichen Veränderungen in den Einzelfaktorenaktivitäten

korreliert werden. Ab dem zehnten Tag p.i. konnte ein Verlust der Aktivität der Faktoren II, V

und Antithrombin-III gezeigt werden, der ebenfalls für eine Verbrauchsreaktion in der

plasmatischen Gerinnung sprach. In diesem Zeitraum konnte zudem für einige Tiere mittels

EGT eine erhöhte Fibrinmonomerkonzentration nachgewiesen werden.

Die genannten Befunde wurden in entsprechender Form auch von HEENE et al. (1971)

erhoben. Diese Autorengruppe interpretiert die Ergebnisse dahingehend, dass in der

Finalphase der Erkrankung eine dekompensierende intravasale Gerinnung zu einer

eindeutigen Verbrauchskoagulopathie führt. In der Arbeit von HEENE et al. (1971) konnten

diese Befunde mit den histopathologischen Nachweisen einer Mikrothrombosierung korreliert

werden. In der vorliegenden Arbeit konnte dies nicht nachvollzogen werden. Die Thromben,

die als histopathologisches Äquivalent der überschießenden Gerinnungsaktivierung bei einer

5 Diskussion 129

disseminierten intravasalen Gerinnung auftreten, wurden von anderen Arbeitsgruppen

ausschließlich und nur in geringem Maße in der Finalphase der Erkrankung gefunden

(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Fibrinablagerungen in betroffenen Organen

fehlten in diesen Studien.

Neben den oben erwähnten Befunden wurde für vier von fünf Tieren des ersten Vorversuches

eine Erhöhung der Faktor-V- und Faktor-II-Aktivität an Tag sieben p.i. gefunden, was für

eine Aktivierung der Gerinnung zu diesem Zeitpunkt spricht. Die Ergebnisse konnten jedoch

nicht mit den Globaltests der Gerinnung korreliert werden, die zu diesem Zeitpunkt keine

deutlichen Veränderungen zeigten. Da die Globaltests keine sehr hohe Sensitivität aufweisen

und bei kompensierten Aktivierungs- und Verbrauchsreaktionen häufig im Normalbereich

bleiben, stehen diese Befunde nicht im Widerspruch zueinander. Im Rahmen weiterer Studien

wäre es sinnvoll, die Einzelfaktorenbestimmung für eine größere Anzahl Tiere durchzuführen,

nicht zuletzt, um durch Probleme bei der Blutentnahme bedingte Artefakte sicher

auszuschließen. Das Auftreten dieser Veränderungen ausschließlich bei infizierten Tieren,

und am gleichen Tag nach der Infektion, deutet jedoch stark darauf hin, dass es sich um eine

reelle Aktivitätssteigerung handelte. Für die Faktor-V-Aktivität ließ sich auch in der Arbeit

von HEENE et al. (1971) ein leichter Anstieg feststellen, der jedoch dort als nicht signifikant

bewertet wurde.

Die Aktivierung des Gerinnungssystems scheint über einen langen Zeitraum in kompensierter

Form zu verlaufen. Erst in der Finalphase der Erkrankung kommt es zu

Dekompensierungserscheinungen, die teilweise für eine DIC sprechen. Fraglich ist jedoch, ob

dieser Mechanismus für die klinischen Hämorrhagien verantwortlich ist.

Der initiale Mechanismus, der zur Entstehung einer DIC führt, ist die forcierte Ausschüttung

von TF durch geschädigte Endothelzellen oder aktivierte Monozyten, die zu einer

überschießenden Aktivierung der plasmatischen Gerinnung führt. Die vermehrte

Fibrinbildung durch systemisch zirkulierendes Thrombin führt im Folgenden zu einer diffusen

mikrovaskulären Thrombenbildung, die einerseits Thrombozyten und Gerinnungsfaktoren

verbraucht, jedoch auch andererseits die Fibrinolyse aktiviert (CAREY und RODGERS,

1998; LEVI und TEN CATE, 1999; MAMMEN, 2000). Das gleichzeitige Zirkulieren von

Thrombin und Plasmin in hohen Konzentrationen ist das Hauptcharakteristikum einer DIC

(BATEMAN et al., 1999).

5 Schlussfolgerungen 130

In den letzten Jahren wurde deutlich, dass die inadäquate Expression des TFs durch

zirkulierende Monozyten eine wichtige Rolle bei der Entwicklung unterschiedlichster

pathologischer Zustände mit überschießender Gerinnung spielt (ESMON, 2001). Auch für

virale hämorrhagische Fieber, v. a. die Ebolavirusinfektion, ist die TF-Expression durch

aktivierte Makrophagen als Hauptmechanismus der Pathogenese auftretender

Gerinnungsstörungen anzusehen (BRAY und MAHANTY, 2003; GEISBERT et al., 2003c;

BRAY, 2005). Die TF-Expression auf der Monozytenoberfläche, die beispielsweise durch IL-

1, IL-6 und TNF induziert werden kann, ermöglicht die Interaktion der Monozyten mit

aktivierten Thrombozyten und Endothelzellen über die Bindung von P-Selektin (CAREY und

RODGERS, 1998; SHEBUSKI und KILGORE, 2002) und fördert auf diesem Wege die

Thrombusbildung. Monozyten stellen auf diesem Wege ein wichtiges Bindeglied zwischen

Entzündungs- und Gerinnungsreaktionen dar (NAPOLEONE et al., 1997). GEISBERT et al.

(2003) stellten in diesem Zusammenhang heraus, dass sowohl die TF-Expression durch

Monozyten und Makrophagen als auch die hohen Level zirkulierender proinflammatorischer

Zytokine und die Lymphozytenapoptose bei viralen hämorrhagischen Fiebern und dem

septischen Schock gleichermaßen auftreten. Die Ähnlichkeiten zwischen diesen beiden

Krankheitsgeschehen könnten für die Erforschung der Pathogenese viraler hämorrhagischer

Fieber von Bedeutung sein (PETERS und ZAKI, 2002; BRAY und MAHANTY, 2003).

Analog zu den Befunden bei klassischen viralen hämorrhagischen Fiebern, geht auch die

KSPV-Infektion sowohl mit einer erhöhten Expression von TNF als auch IL-1 einher

(KNOETIG et al., 1999; SANCHEZ-CORDON et al., 2002; CHOI et al., 2004; NUNEZ et

al., 2005), wobei besonders die erhöhte IL-1-Synthese mit dem Auftreten klinischer

Symptome korrelierte (NUNEZ et al., 2005). In vitro konnte zudem eine erhöhte TF-

Expression nachgewiesen werden (BENSAUDE et al., 2004). In vivo existieren hierfür bisher

keine konkreten Daten, da jedoch eine Aktivierung des extrinsischen Weges der Gerinnung

nachweisbar war, ist davon auszugehen, dass der TF-Überexpression durch Monozyten auch

in vivo eine Rolle in der Entstehung der Gerinnungsstörungen zukommt. Eine Untersuchung

des Gerinnungspotentials und der Thrombingenerierung im Verlauf der KSPV-Infektion

könnte in diesem Bereich Aufschluss geben.

Bei der Beantwortung der Frage, ob es sich bei den festgestellten Veränderungen um eine

klassische DIC handelt, muss man sich vor Augen führen, dass das Bild einer DIC sehr

5 Diskussion 131

vielfältig sein kann und für die labordiagnostische Diagnose mehrere Parameter verändert

sein müssen. Die am häufigsten veränderten Parameter sind eine erniedrigte

Thrombozytenzahl, eine verlängerte aPTT, erhöhte Fibrinspaltprodukte und eine verlängerte

Prothrombinzeit (MISCHKE und NOLTE, 1992). Abgesehen von der aPTT sind diese

Befunde auch im Verlauf der KSPV-Infektion zu erheben.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Befunde in der Finalphase der

Erkrankung und die pathogenetischen Erkenntnisse auf molekularer Ebene für eine

Aktivierung und Verbrauchsreaktion des Gerinnungssystems sprechen. Dabei gleichen die

erhobenen Befunde in weiten Teilen den in der Literatur beschriebenen Erkenntnissen zur

Pathogenese viraler hämorrhagischer Fieber. Ihre Ausprägung stellt jedoch v. a. im

Zusammenhang mit dem zeitlichen Ablauf der klinischen Erkrankung keine befriedigende

Erklärung für die auftretenden Hämorrhagien dar. Die zum Zeitpunkt des Auftretens erster

Hämorrhagien erhobenen hämostaseologischen Befunde erklären nicht eine weitreichend

erhöhte Blutungsneigung, da sowohl die Anzeichen für ein Zusammenbrechen des

fibrinolytischen Systems als auch eines Fibrinogenmangels fehlten und die

thrombozytenunabhängige aPTT keine Veränderungen zeigte. Für wenige Tiere sank die

Thrombozytenzahl so weit ab, dass dies alleine für eine Blutungsneigung verantwortlich sein

konnte. Die mangelnde Beeinflussbarkeit des Krankheitsverlaufs durch eine therapeutische

PEG-Hirudingabe ist ein Indiz dafür, dass der alleinigen Aktivierung des plasmatischen

Gerinnungssystems keine entscheidende Bedeutung im Krankheitsgeschehen zukommt. Ein

weiterer Hinweis ist die Tatsache, dass eine PEG-Hirudingabe nicht zu einer Verstärkung der

hämorrhagischen Symptome führte.

Auf der Grundlage der vorliegenden Ergebnisse und der in der Literatur publizierten Daten

kann postuliert werden, dass eine DIC an der Pathogenese der KSP beteiligt ist. Sie ist jedoch

nicht klassisch ausgeprägt und spielt als Ursache der Krankheitserscheinungen eine

untergeordnete Rolle. Die DIC ist somit mehr eine Folgeerscheinung anderer

pathogenetischer Mechanismen.

5.5.2 Rolle der Thrombozyten und Thrombozyteninteraktionen

Wie in der Literatur beschrieben (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; GOMEZ-

VILLAMANDOS et al., 1998), kam es auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit zu einer

5 Schlussfolgerungen 132

hochgradigen Thrombozytopenie, wobei der erste Abfall der Werte schon vor dem Auftreten

klinischer Symptome zu verzeichnen war. Zum Ende der Versuche zeigten drei von 30 Tieren

Thrombozytenzahlen, die nach MISCHKE (1999) mit dem Auftreten lebensgefährlicher

Blutungen (< 30 G/l) bzw. Spontanblutungen (< 10 G/l) einhergehen könnten. Diese Tiere

zeigten deutlich ausgeprägte Hämorrhagien, an deren Ausmaß die extrem niedrige

Thrombozytenzahl höchstwahrscheinlich ursächlich beteiligt war.

Der frühe Abfall der Thrombozytenzahlen im Rahmen der KSPV-Infektion wurde von

verschiedenen Arbeitsgruppen mit massiven Degenerationen der Megakaryozyten im

Knochenmark in Verbindung gebracht (HOFFMANN et al., 1971b; CALDERON et al.,

1998). Eine schwerwiegende Störung der Thrombozytopoese erscheint in Zusammenhang mit

den vorliegenden Ergebnissen jedoch unwahrscheinlich, da die Anstiege in den Parametern

MPV und Large Platelets andeuten, dass eine regenerative Kapazität vorhanden war, und

vermehrt junge, reaktive Thrombozyten freigesetzt wurden. Das Auftreten der jungen

Thrombozyten zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. ist auch ein Indiz für eine

Verbrauchsreaktion, die durch vermehrte thrombozytopoetische Aktivität ausgeglichen

werden sollte. Die Kompensationsmöglichkeiten wurden im weiteren Krankheitsverlauf

jedoch offensichtlich überschritten und die Thrombozytenzahl nahm rasch ab. Es ist

anzunehmen, dass die hohe Reaktivität junger Thrombozyten den Vorgang beschleunigte.

Korreliert man diese Ergebnisse mit den Daten von GOMEZ-VLLAMANDOS et al. (1998),

die nachweisen konnten, dass nur eine geringe Anzahl Megakaryozyten KSPV-infiziert war,

kann die These, dass die Intensität der Thrombozytopenie nicht über eine Zerstörung

infizierter Megakaryozyten im Knochenmark zu erklären sei, gestützt werden.

Die von HEENE et al. (1971) und HOFFMANN et al. (1971) geäußerte Theorie, dass die

Thrombozytopenie mit der Entwicklung einer DIC ursächlich zu erklären sei, ist vor dem

Hintergrund, dass die Thrombozyten bereits lange vor dem Auftreten erster fassbarer

Veränderungen in den Gerinnungsparametern einen deutlichen Abfall zeigten, nicht

nachvollziehbar. BAUTISTA et al. (2002) zeigten, dass es zwei bis vier Tage p.i. zu einer

Thrombozytenaktivierung und -aggregation in Milz und Leber kommt, wobei dieses

Phänomen mit einer Aktivierung der residenten Makrophagenpopulation verbunden war.

Aktivierungsreaktionen aufgrund einer mutmaßlichen Zytokinwirkung (NUNEZ et al., 2005)

5 Diskussion 133

stellen eine plausible Erklärung für die auftretenden Thrombozytenverluste und die

nachfolgenden Regenerationsversuche durch das Knochenmark dar. Die Annahme, dass

kleinste Thrombozytenaggregate unter Einbeziehung von Fibrinogen in der Mikrozirkulation

entstehen, wird auch durch die Erhöhung des Fibrinogens im Plasma gestützt, da Fibrinogen

über die Bindung an den GPIIb/IIIa-Rezeptor der Thrombozytenmembran direkt an dem

Vorgang der Thrombozytenaggregation beteiligt ist (MOSESSON, 2005; LISMAN et al.,

2005). Der Verlauf der ermittelten Fibrinogenkonzentration im Plasma lässt sich im Sinne

einer Anpassungsreaktion auf einen Verbrauch in kleinsten Plättchenaggregaten deuten.

Auch diese Befunde wurden in gleichsinniger Form von HEENE et al. (1971) erhoben. Stellt

man dies in Zusammenhang mit der Gesamtheit der Befunde, fällt auf, dass der Anstieg der

Fibrinogenkonzentration nach dem ersten Abfall der Thrombozyten und in zeitlicher Nähe zu

den Spitzen der Einzelfaktorenaktivitäten auftrat, was die Theorie einer „Nachschub“-

Reaktion stützt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es zu einer Aktivierung der Gerinnung

bzw. der Thrombozytenaggregation in der frühen Phase der Infektion kommt, die durch die

Globaltests nicht fassbar ist.

Die Interaktionen aktivierter Thrombozyten spielen in der Pathogenese der KSP eine wichtige

Rolle. Der Versuch diese Interaktionen mit Hemmstoffen der Thrombozytenaggregation zu

beeinflussen, zeigte jedoch keine positive Beeinflussung des Krankheitsgeschehens. Die

Einflussmöglichkeiten waren aufgrund der Anwendbarkeit und Wirksamkeit der aus der

Humanmedizin stammenden Wirkstoffe beim Schwein limitiert und ließen eine optimale

Intervention nicht zu. So war die Hemmung der GPIIb/IIIa-vermittelten Aggregation unter

den gegebenen Umständen nicht möglich, obwohl sie ein sehr lohnender Angriffspunkt

gewesen wäre.

Thrombozyten verfügen über eine Vielzahl von Aktivierungsmöglichkeiten, von denen in der

vorliegenden Arbeit nur ein Bereich, nämlich die ADP-induzierte Aggregation, erfolgreich

gehemmt werden konnte. Die Hemmung dieses Weges um durchschnittlich 30 % reichte nicht

aus um einen sichtbaren oder messbaren Erfolg bezüglich der Symptome der Erkrankung zu

zeigen. Da die Hemmung der COX-1 nicht durchgängig erreicht werden konnte, standen den

Thrombozyten alle anderen Möglichkeiten der Aktivierung und Aggregation fast

uneingeschränkt zur Verfügung.

5 Ausblick 134

Nimmt man die in dieser Studie erhobenen Daten und die in der Literatur publizierten

Ergebnisse zusammen, wird deutlich, dass der vermutlich Zytokin-vermittelten Aktivierung

der Thrombozyten und deren Interaktionen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der

KSP zukommt. Die Bildung kleinster Thrombozytenaggregate ist als treibende Kraft der

KSPV-assoziierten Gerinnungsstörung anzusehen.

5.6 Ausblick

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass v. a. den Thrombozyteninteraktionen

eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Gerinnungsstörungen im Verlauf der akuten

KSP zukommt. Diese sind anhand der in der Literatur publizierten Daten mit

Zytokinwirkungen in Verbindung zu bringen, die durch aktivierte Makrophagenpopulationen

induziert werden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a; NUNEZ et al., 2005; SANCHEZ-

CORDON et al., 2005b). An erster Stelle stehen dabei IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α

(BENSAUDE et al., 2004; CHOI et al., 2004; SANCHEZ-CORDON et al., 2005b). Diesen

proinflammatorischen und prokoagulatorischen Zytokinen wurden auch in der Pathogenese

der Ebolavirusinfektion eine entscheidende Bedeutung beigemessen (BRAY, 2005; BRAY

und GEISBERT, 2005). Allerdings werden diese Reaktionen dort nicht explizit mit

Thrombozyten und deren Interaktionen in Verbindung gebracht.

Die KSPV-Infektion weist sowohl auf der Ebene der Symptome als auch der

pathogenetischen Mechanismen Gemeinsamkeiten mit klassischen viralen hämorragischen

Fiebern auf (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a), daher sollte die Übertragbarkeit der in

diesem Zusammenhang gewonnenen Erkenntnisse geprüft werden. Beispielsweise konnten

die Mechanismen, die der Makrophagenaktivierung zugrunde liegen für die Ebolainfektion

bereits teilweise charakterisiert werden. Es wurde gezeigt, dass die Interaktion

einzelsträngiger viraler RNA, doppelsträngiger Replikationsintermediate und

virusspezifischer Substanzen mit Toll-like Rezeptoren bzw. pattern-recognition Molekülen

einen Trigger für NFκB, Interferon Regulationsfaktor 3 und andere Aktivierungswege

darstellt (BRAY, 2005). Diese Erkenntnisse sollten in weiterführende Studien zur

Erforschung der Mechanismen der Makrophagen- und Thrombozytenaktivierung bzw. der

involvierten Signalwege und Interaktionen im Rahmen der KSPV-Infektion einfließen.

6 Zusammenfassung

Sandra Blome

Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest:

Analysen der Blutgerinnungsstörungen

Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine weltweit vorkommende, verlustreiche Tierseuche

mit großer handelspolitischer und ökonomischer Relevanz. Sie zählt zu den Krankheiten, die

beim internationalen Tierseuchenamt, dem Office International des Épizooties (OIE),

anzeigepflichtig sind und wird durch ein kleines, behülltes RNA-Virus aus dem Genus

Pestivirus der Virusfamilie Flaviviridae hervorgerufen.

Die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen kann v. a. bei jungen Tieren zu einem

akuten Krankheitsbild führen, das durch hämorrhagische Symptome und

Blutbildveränderungen gekennzeichnet ist, die dem Bild eines klassischen viralen

hämorrhagischen Fiebers entsprechen. Bisher konnte weder die Genese der hämorrhagischen

Symptome, die im Verlauf der KSPV-Infektion auftreten, noch die der Thrombozytopenie

und Leukopenie hinreichend aufgeklärt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die pathogenetischen Mechanismen, die den

hämorrhagischen Symptomen und hämostaseologischen Veränderungen zugrunde liegen,

näher charakterisiert. Nach Vorversuchen zur Auswahl des geeigneten KSPV-Isolates und zur

Untersuchung des Verlaufs klinischer, pathologisch-anatomischer, hämatologischer und

hämostaseologischer Parameter wurden zu diesem Zweck zwei tierexperimentelle Ansätze

gewählt, welche eine pharmakologische Intervention an unterschiedlichen Stellen des

Hämostasesystems vorsahen. Es wurde einerseits die Endstrecke der plasmatischen

Gerinnung mit PEG-Hirudin und andererseits die Thrombozytenaggregation durch eine

Kombination der Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel und Acetylsalicylsäure

gehemmt.

In beiden Experimenten wurden zwei Läuferschweingruppen mit dem hochvirulenten KSPV-

Stamm CSF0634 infiziert. Während eine Gruppe täglich mit den erwähnten Medikamenten

6 136

behandelt wurde, diente die zweite Gruppe der Kontrolle. Es erfolgte eine tägliche

Blutentnahme und Durchführung gerinnungsanalytischer und hämatologischer Tests. Die

klinischen Symptome im Verlauf der Infektion wurden nach einem Punkteschema

dokumentiert und analysiert.

Alle Tiere entwickelten die akute Verlaufsform der KSP mit unterschiedlich ausgeprägten

hämorrhagischen Symptomen. Neben einer ausgeprägten Leuko- und Thrombozytopenie

konnte bei allen Tieren eine Verlängerung der Prothrombinzeit, die für einen Verbrauch der

Faktoren des extrinsischen Pfades spricht, reproduzierbar in der Finalphase der Erkrankung

gezeigt werden. Des Weiteren kam es zu einem Anstieg der Fibrinogenkonzentration sowie

zu einem Gipfel in den Parametern Large Platelets und mittleres Plättchenvolumen zwischen

dem vierten und zehnten Tag nach der Infektion. Der Vergleich der beiden Gruppen erbrachte

keine Anhaltspunkte für eine Beeinflussung des Krankheitsgeschehens durch die

pharmakologische Intervention.

Obwohl es im Verlauf der KSPV-Infektion zu einer Aktivierung der Gerinnung und zu einem

Verbrauch der Faktoren des extrinischen Pfades kommt, bieten diese Vorgänge keine

schlüssige Erklärung für das Auftreten der Hämorrhagien bzw. der Thrombozytopenie, die

bereits vor den ersten Dekompensationsanzeichen auftreten. Die mangelnde Beeinflussbarkeit

des Geschehens durch die Gabe des Thrombininhibitors PEG-Hirudin unterstützt die

Annahme, dass das plasmatische Gerinnungssystem nicht die Hauptrolle in der Pathogenese

der KSP spielt.

Der Anstieg des Fibrinogens spricht zusammen mit der Thrombozytopenie für eine

kompensierte Verbrauchsreaktion, welche durch die Bildung kleinster

Thrombozytenaggregate in der Frühphase der Infektion zu erfolgen scheint. Über den

GPIIb/IIIa-Rezeptor vermittelt Fibrinogen die Aggregation aktivierter Thrombozyten und

wird in diesem Zusammenhang vermehrt umgesetzt. Für die Aktivierung der Thrombozyten

werden in der Literatur Makrophagenzytokine als auslösendes Moment diskutiert. Weitere

Studien sollten daher die Makrophagen-Thrombozyten-Interaktionen näher beleuchten, denen

eine wichtige Rolle in der Pathogenese der KSP zuzukommen scheint.

137

Summary

Sandra Blome

On the pathogenesis of classical swine fever:

Analyses of coagulation disorders

Classical swine fever (CSF) is one of the most important diseases of pigs with worldwide

distribution and high impact on trade and economy. CSF is caused by a small enveloped RNA

virus that is grouped into the genus Pestivirus within the Flaviviridae family. The disease is

notifiable to the OIE (Office International des Épizooties).

Especially in young animals, infections with highly virulent CSF virus (CSFV) strains may

lead to an acute clinical picture that is characterized by hemorrhagic lesions and changes in

blood count that resemble the signs seen with viral hemorrhagic fevers. So far, neither the

mechanisms underlying the hemorrhages occurring in the course of CSFV infections nor the

genesis of thrombocytopenia and leukopenia are sufficiently elucidated.

In the context of this project the pathogenetic mechanisms underlying the hemorrhagic lesions

and coagulation changes were investigated. After preliminary trials to select an adequate

CSFV strain and to investigate the course of clinical, pathological, hematological, and

hemostaseological parameters upon infection, two animal experiments were designed

targeting two parts of the coagulation system with direct pharmacological interventions. On

one hand the common final pathway of the plasmatic coagulation system was arrested using

direct thrombine inhibitor PEG-Hirudin and on the other hand platelet aggregation was

inhibited with a combination of Clopidogrel and Acetyl Salicylic Acid.

In both experiments, two groups of piglets were infected with highly virulent CSFV strain

CSF0634. While one group was treated daily with the above mentioned drugs, the second

group acted as control. Blood samples were taken daily and coagulation tests as well as blood

counts were performed. Clinical signs observed in the course of CSFV infection were

assessed using a clinical score scheme.

All animals developed acute CSF with variable hemorrhagic lesions. Beside marked

leukopenia and thrombocytopenia, all animals displayed prolongations of prothrombin time

during the final phase of the disease that are indicative for the consumption of coagulation

6 138

factors of the extrinsic pathway. Furthermore, an increase in fibrinogen as well as peaks in

parameters Large Platelets and Mean Platelet Volume between days four and ten post

infection were observed. Comparison of groups did not provide any indication for an

influence of the pharmacological interventions on the course of the disease.

Although activation of the coagulation system and consumption of coagulation factors of the

extrinsic pathway were observed upon CSFV infection, these processes do not provide a

conclusive explanation for the occurrence of hemorrhages and thrombocytopenia respectively,

as these signs occur prior to any decompensation. The lack of influence of PEG-Hirudin

corroborates the assumption that the plasmatic coagulation system does not play a major role

in the pathogenesis of CSF.

The increase in fibrinogen together with thrombocytopenia are indications for a compensated

consumption caused by generation of platelet microaggregates in the early phase of infection.

Fibrinogen mediates aggregation of activated platelets through binding to the GPIIb/IIIa

receptor and is consumed in this context. Cytokines released by activated macrophages are

discussed in literature as triggers for platelet activation. Further studies should therefore

elucidate interactions of macrophages and platelets that seem to play an important role in CSF

pathogenesis.

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8 Anhänge 167

8 Anhänge

8.1 Tabellen und Abbildungen

Tabelle 8-1: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion und des Antigen-ELISAs für

die Tiere 153 bis 159. Die Virusisolierung wurde vor der Infektion und am Tag der Euthanasie

durchgeführt, der Antigen-ELISA an den Tagen 10 und 14 p.i.

Tiernummer Virusisolierung Antigen-ELISA

Tag 0 Tag der Euthanasie Tag 10 p.i. Tag 14 p.i.

Tier 153 negativ positiv positiv positiv

Tier 154 negativ negativ positiv negativ

Tier 155 negativ positiv positiv positiv

Tier 156 negativ positiv positiv positiv

Tier 157 negativ positiv positiv positiv

Tier 158 negativ negativ negativ negativ

Tier 159 negativ negativ negativ negativ

Tabelle 8-2: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion für die Tiere 175 bis 181. Die

Virusisolierung wurde an den Tagen vier, zehn und 14 p. i. durchgeführt (dpi = Tage nach der

Infektion).

Tiernummer 4 dpi 7 dpi 10 dpi 14 dpi

Tier 175 negativ positiv positiv positiv

Tier 176 negativ positiv positiv positiv

Tier 177 negativ positiv positiv negativ

Tier 178 negativ positiv positiv positiv

Tier 179 negativ positiv positiv positiv

Tier 180 negativ negativ negativ negativ

Tier 181 negativ negativ negativ negativ

8 Anhänge 168

Tabelle 8-3: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 153 bis 159. Die

Untersuchung auf Antikörper ist für die Seren dargestellt, die am Tag der Euthanasie gewonnen

wurden. Der im VNT ermittelte Antikörpertiter ist in ND50 angegeben. ELISA 1 = Chekit-CSF-Sero

(Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Bern, Schweiz); ELISA 2 = Classical Swine Fever Virus Antibody Test

Kit, HerdChek (IDEXX Laboratories, Wörrstadt).

Tiernummer Virusneutralisationstest Antikörper-ELISA

CSF0902 CSF0634 BVDV NADLBDV

MoredunELISA 1 ELISA 2

Tier 153 <5 <5 <10 <5 negativ negativ

Tier 154 40 120 <10 15 positiv positiv

Tier 155 <5 30 <10 <5 positiv positiv

Tier 156 <5 <5 <10 <5 fraglich fraglich

Tier 157 <5 <5 <10 <5 negativ negativ

Tier 158 <5 <5 <10 <5 negativ negativ

Tier 159 <5 <5 <10 <5 negativ negativ

Tabelle 8-4: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 175 bis 191. Die

Untersuchung auf Antikörper ist für die Seren dargestellt, die am Tag der Euthanasie gewonnen

wurden. Der im VNT ermittelte Antikörpertiter ist in ND50 angegeben. ELISA 1 = Chekit-CSF-Sero

(Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Bern, Schweiz).

Tiernummer Virus Neutralisation Test Antibody ELISA

CSF0902 CSF0634BVDV

NADL

BDV

Moredun ELISA 1

Tier 175 <5 <5 <10 <5 fraglich

Tier 176 <5 <5 <10 <5 negativ

Tier 177 30 480 <10 30 positiv

Tier 178 <5 40 <10 <5 positiv

Tier 179 <5 <5 <10 <5 fraglich

Tier 180 <5 <5 <10 <5 negativ

Tier 181 <5 <5 <10 <5 negativ

8 Anhänge 169

Eichkurve für die PEG-Hirudin-Bestimmung im

Citratplasma mittels ECT

y = 13,434x + 48,587

R2 = 0,9989

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15

PEG-Hirudinkonzentration [µg/ml]

Zei

t [s

]

PEG-Hirudin-

Verdünnungsreihe

Linear (PEG-Hirudin-

Verdünnungsreihe)

Abbildung 8-1: Eichkurve aus einer PEG-Hirudin-Standardverdünnungsreihe. Diese Eichkurve

wurde der Berechnung der ECT zugrunde gelegt. R2 beschreibt das Bestimmtheitsmass der

Kurve.

Ecarin Clotting Time für Gruppe I

45

50

55

60

65

70

75

80

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Tage pi

EC

T [

s]

Tier 182

Tier 183

Tier 184

Tier 185

Tier 186

Tier 187

Maximum

Minimum

Abbildung 8-2: Ecarin Clotting Time für die Tiere 182 bis 186 (Gruppe 1). Diese Tiere wurden

mit PEG-Hirudin behandelt. Der therapeutische Dosisbereich von 0,5 bis 1,5 µg/ml PEG-Hirudin

ist durch die Kurven mit der Bezeichnung „Minimum“ und „Maximum“ eingegrenzt. Das

unbehandelte Tier 187 wurde als Kontrolle mitgeführt.

8 Anhänge 170

Tabelle 8-5: Nachweis der KSPV-Infektion. Ergebnisse der Virusislierung an Tag zehn p.i. für die

Tiere 182 bis 191 unter Angabe der Gruppenzugehörigkeit im Versuch zum Einfluss einer PEG-

Hirudinbehandlung auf das Krankheitsgeschehen.

Tiernummer Gruppenzugehörigkeit Virusisolierung

Tier 182 Gruppe 1 positiv

Tier 183 Gruppe 1 positiv

Tier 184 Gruppe 1 positiv

Tier 185 Gruppe 1 positiv

Tier 186 Gruppe 1 positiv

Tier 187 Gruppe 2 positiv

Tier 188 Gruppe 2 positiv

Tier 189 Gruppe 2 positiv

Tier 190 Gruppe 2 positiv

Tier 191 Gruppe 2 positiv

Poolplasma-Verdünnungsreihe für aPTT

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 20 40 60 80 100

Konzentration in % des Poolplasmas

Ger

inn

un

gsz

eit

[s]

Abbildung 8-3: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die

Messung der aPTT mit Actin®

FS im Versuch zur Beeinflussung des plasmatischen

Gerinnungssystems. Die orange Linie zeigt den Bereich der gewünschten aPTT für Poolplasma

an. Die Ergebnisse wurden für die Auswahl des Verdünnungsverhältnisses verwendet.

8 Anhänge 171

Kalibrationskurve für Biuret-Methode

y = 0,0171x - 0,0026

R2 = 0,9995

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 3 6 9 12

Fibrinogenkonzentration [g/l]

Ab

sorb

an

z Fibrinogen-Standard

Linear (Fibrinogen-

Standard)

Abbildung 8-4: Kalibrationskurve zur Fibrinogenbestimmung. Diese wurden für jedes

Versuchsvorhaben im Rahmen der Methodenetablierung ermittelt und anhand eines humanen

Kontrollstandards und eines porzinen Poolplasmas überprüft. Erstellt wurde eine

Standardverdünnungreihe mit 1,5, 3, 6, 9 und 12 mg/ml Fibrinogen in NaCl. Die aus der

linearisierten Standardkurve errechnete Funktion wurde der Berechnung der

Fibrinogenkonzentrationen zugrunde gelegt.

ADP-induzierte Thrombozytenaggregation

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Nu

llw

ert 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

11

12

13

14

Tage pi

Ag

gre

ga

tio

n [

%]

Gruppe I

Gruppe II

Abbildung 8-5: Verlauf der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation im Infektionsverlauf.

Gruppe I erhielt täglich Clopidogrel und ASS p.o., Gruppe II diente der unbehandelten Kontrolle.

Dargestellt sind die mittels APACT ermittelten Aggregationsmaxima. Es wurden 50 µl des

gebrauchsfertigen ADP-Reagenz eingesetzt.

8 Anhänge 172

Tabelle 8-6: Nachweis der KSPV-Infektion. Ergebnisse der RT-PCR an Tag neun p.i. für die Tiere

248 bis 254 und 256 bis 258 unter Angabe der Gruppenzugehörigkeit im Versuch zum Einfluss einer

Clopidogrel- und ASS-Behandlung auf das Krankheitsgeschehen.

Tiernummer Gruppenzugehörigkeit RT-PCR

Tier 248 Gruppe 1 positiv

Tier 249 Gruppe 1 positiv

Tier 250 Gruppe 1 positiv

Tier 251 Gruppe 1 positiv

Tier 252 Gruppe 1 positiv

Tier 253 Gruppe 1 positiv

Tier 254 Gruppe 2 positiv

Tier 256 Gruppe 2 positiv

Tier 257 Gruppe 2 positiv

Tier 258 Gruppe 2 positiv

Verdünnungsreihe für aPTT mit Actin FS

10

15

20

25

30

35

40

45

0 20 40 60 80 100

Konzentration in % des Poolplasmas

Ger

inn

un

gsz

eit

[s]

Abbildung 8-6: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die

Messung der aPTT mit Actin®

FS im Versuch zur Beeinflussung der Thrombozyteninterkationen.

Die orange Linie zeigt den Bereich der gewünschten aPTT für Poolplasma an. Die Ergebnisse

wurden für die Auswahl des Verdünnungsverhältnisses verwendet.

8 Anhänge 173

8.2 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Reagenzien

8.2.1 Zellkulturmedien

EMEM (Eagle´s minimum essential medium)

Pulvermedium 9,60 g Fa. Invitrogen, Karlsruhe

NaHCO 2,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Phenolrot 0,016 g Fa. Merck, Darmstadt

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.

EMEM wurde als Erhaltungsmedium für die PK(15)A-Zelllinie unter Zugabe von 50 ml

Fetalem Kälberserum (Fa. Biochrom, Hamburg) eingesetzt.

Für zellkulturbasierte Nachweissysteme in Mikro- und Makrotiterplatten wurden dem EMEM

folgende Inhaltsstoffe zugefügt:

Penicillin G 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Streptomycinsulfat 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Fetales Kälberserum 100 ml Fa. Biochrom, Hamburg

EDulb (EMEM, modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN [1959])

EDulb-Pulvermedium 13,53 g Fa. Serva, Heidelberg

NaHCO2 2,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Penicillin G 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Streptomycin Sulfat 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Fetales Kälberserum 100 ml Fa. Biochrom, Hamburg

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.

Einfriermedium

EMEM 700 ml

DMSO 100 ml Fa. Sigma, Deisenhofen

Fetales Kälberserum 200 ml Fa. Biochrom, Hamburg

8 Anhänge 174

8.2.2 Lösungen und Reagenzien

ATV (adjusted trypsin-versen)-Lösung

NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt

KCl 0,40 g Fa. Merck, Darmstadt

NaHCO3 0,58 g Fa. Merck, Darmstadt

Dextrose 1,00 g Fa. Sigma, Deisenhofen

EDTA (Versen) 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Trypsin(3U/mg) 0,50 g Fa. Serva, Heidelberg

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

Versen-Trypsin-Lösung (0,125%)

NaCl 8,0 g Fa. Merck, Darmstadt

KCl 0,2 g Fa. Merck, Darmstadt

KH2PO4 0,2 g Fa. Merck, Darmstadt

Na2HPO4 x 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt

CaCl2 x 2 H2O 0,132 g Fa. Merck, Darmstadt

Trypsin (3 U/mg) 1,25 g Fa. Serva, Heidelberg

EDTA (Versen) 1,25 g Fa. Merck, Darmstadt

Penicillin G 50 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Streptomycinsulfat 60 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

MgCl2 x 6 H2O 0,1 g Fa. Sigma, Deisenhofen

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 mit 1 N NaOH

AEC-Lösung

3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) 20,00 mg Fa. Sigma, Deisenhofen

Dimethylformamid 3,00 ml Fa. Merck, Darmstadt

Natriumazetat-Puffer

(0,05 M, pH 5,0) ad 50,00 ml Fa. Merck, Darmstadt

H2O2 (3 %) 0,40 ml Fa. Merck, Darmstadt

8 Anhänge 175

PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt

KCl 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Na2HPO4 x 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt

KH2PO4 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

CaCl2 x 2 H2O 0,132 g Fa. Merck, Darmstadt

MgCl2 x 6 H2O 0,10 g Fa. Sigma, Deisenhofen

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

PBSM (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium)

NaCl 8,00 g Fa. Merck, Darmstadt

KCl 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Na2HPO4 x 12 H2O 2,37 g Fa. Merck, Darmstadt

KH2PO4 0,20 g Fa. Merck, Darmstadt

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

PBS/Tween

PBSM 1000,00 ml

Tween® 20 100,00 µl Fa. Serva, Heidelberg

Biuret-Stammlösung

Kaliumnatriumtartrat

(C4H4KnaO6 x 4 H2O) 45,0 g Fa. Merck, Darmstadt

NaOH (0,2 mol/l) ad 400 ml Fa. Roth, Karlsruhe

Kupfer-II-Sulfat ad 15,0 g Fa. Merck, Darmstadt

Kaliumjodid ad 5,0 g Fa. Merck, Darmstadt

NaOH (0,2 mol/l) ad 1000 ml Fa. Roth, Karlsruhe

Filtrierung der Lösung durch einen Faltenfilter und lichtgeschützte Aufbewahrung.

Kaliumjodidlösung

Kaliumjodid 5,0 g Fa. Merck, Darmstadt

NaOH (0,2 mol/l) ad 1000 ml Fa. Merck, Darmstadt

8 Anhänge 176

Biuret-Gebrauchslösung

Biuret-Stammlösung 100 ml

Kaliumjodidlösung ad 500 ml

Ecarin-Reagenz

Ecarin-Lösung (10 U/ml)

in 0,9 %iger NaCl-Lösung) 100 µl

Tris mit 3 % BSA

(0,05 M, pH 7,5 in 0,1 M NaCl) 800 µl

CaCl2-Lösung (0,1 M) 100 µl

Hämalaunlösung nach MAYER

Hämatoxylin 1 g

Aqua bidest. ad 1000 ml

Natriumjodad ad 0,2 g

Kaliumaluminiumsulfat x 12 H2O ad 50 g

Lösung erwärmen, weitere Bestandteile nach Erkalten lösen.

Chloralhydrat ad 50 g

Citronensäure (kristallin) ad 1 g

8 Anhänge 177

8.3 Sonstige Chemikalien

Aceton Fa. Applichem, Darmstadt A 0993

AEC Fa. Sigma, Deisenhofen A 5754

Bovines Serumalbumin Fa. Serva, Darmstadt 11930

Calciumchlorid Dihydrat Fa. Merck, Darmstadt 1.02382

Citronensäure Fa. Merck, Darmstadt 1.00247

Dimethylformamid Fa. Merck, Darmstadt 1.02952

Essigsäure Fa. Roth, Darmstadt 3738.2

Ethanol Fa. Merck, Darmstadt 1.00983

Glycerin Fa. Gibco BRL 15514-011

Kaliumchlorid Fa. Merck, Darmstadt 1.04936

Kaliumdihydrogenphoshat Fa. Merck, Darmstadt 1.04877

Kalium-EDTA Fa. Merck, Darmstadt 1.04819

Kaliumhydrogencarbonat Fa. Merck, Darmstadt 1.04854

Magnesiumchlorid Fa. Merck, Darmstadt 0059097

Natriumacetat-Trihydrat Fa. Merck, Darmstadt 1.06267

Natrium-Carbonat, wasserfrei Fa. Merck, Darmstadt 1.06392

Natriumchlorid Fa. Roth, Karlsruhe 9265.2

Natriumhydrogencarbonat Fa. Merck, Darmstadt 1.06329

Phenolrot Fa. Merck, Darmstadt 7241.0005

Salzsäure Fa. Roth, Karlsruhe 6331.2

TRIS Fa. Roth, Karlsruhe 5429.2

Tween 20 Fa. Serva, Heidelberg 37470

Wasserstoffperoxid Fa. Merck, Darmstadt 1.07209

Paraplast (Paraffin) Fa. Shandon, Frankfurt

Corbitbalsam Fa. Hecht, Kiel

8 Anhänge 178

8.4 Pharmakologisch wirksame Substanzen

Abciximab (ReoPro®

) Centocor B.V., Leiden, NL

Acetylsalicylsäure (Aspisol®

) Bayer, Leverkusen

Acetylsalicylsäure (ASS ratiopharm®

) Ratiopharm, Ulm

Clopidogrel (Iscover®

) Bristol-Myers Squibb Pharma, Hounslow, GB

PEG-Hirudin zur Verfügung gestellt von Prof. Nowak, Jena

Pentobarbital (Narcoren®

) Merial, Halbergmoos

Tirofibanhydrochlorid (Aggrastat®

) MSD Sharp und Dohme, Haar

8 Anhänge 179

8.5 Kommerzielle Reagenzien und Kits

Actin®

FS Fa. DADE Behring, Schwalbach B4218-100

AMAX ADP Reagent Fa. Trinity Biotech, Darmstadt 885-3

AMAX Collagen Reagent Fa. Trinity Biotech, Darmstadt 885-1

AMAX Platelet Aggregation

Screening Test

Fa. Trinity Biotech, Darmstadt 885-A

Antithrombin III Fa. Roche Diagnostics, Mannheim

CaCl2-Lösung, 0,025 mol/l Fa. DADE Behring, Schwalbach ORHO 37

CELLaTOXIK Fa. Mölab, Hilden 0200050

Cello-clean Enzym Fa. Mölab, Hilden 0200020

Cello-ton Verdünnungslösung Fa. Mölab, Hilden 0200003

Chekit-CSF-Sero Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern,

Schweiz

CST113-

413

CSFV Anitgen Test Kit,

HerdChek

IDEXX Laboratories, Wörrstadt ESF113-

556

CSFV Antibody Test Kit,

HerdChek

IDEXX Laboratories, Wörrstadt 43220-

3492

Diäthylbarbiturat-Acetat-

Pufferlösung Fa. DADE Behring, Schwalbach ORHW 61

Fibrinogen (human) Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen F-4883

Fibrinogen, plasminogenfrei Fa. Haemochrom Diagnostica, Essen FIB1

Gerinnungsfaktor II-

Mangelplasma Fa. DADE Behring, Schwalbach OSGR 13

Gerinnungsfaktor V-

Mangelplasma DADE Behring, Schwalbach ORSM 19

Kontrol-Plasma N Fa. DADE Behring, Schwalbach ORKE 41

mö-lyse Hämolaysemittel Fa. Mölab, Hilden 0200012

Pathromtin®

Fa. DADE Behring, Schwalbach OTXA 31

QIAamp Blood Mini Kit Fa. Qiagen GmbH, Hilden 51106

QuantiTECT SYBR®

Green

RT-PCR Mastermix

Fa. Qiagen GmbH, Hilden 204243

Test-Thrombin-Reagenz Fa. DADE Behring, Schwalbach OWHM 13

Thrombin (bovin) Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen T-4648

Thromborel®

S Fa. DADE Behring, Schwalbach OUHP 49

8 Anhänge 180

8.6 Geräte und Gebrauchsgegenstände

Autoklav

Autoklav 17 Melag, Berlin

Einbettungsautomat

Hypercenter II Shandon, Frankfurt

ELISA-Reader

Spectra II Tecan, Crailsheim

Färbeautomat

Varistain 24-3 Shandon, Frankfurt

Fieberthermometer

Geratherm®

plus Geratherm Medical AG, Geschwenda

Geräte zur Blutuntersuchung

Sysmex F-800 System Sysmex Deutschland, Norderstedt

Mölab Hämatologie System 8702/6 Mölab, Hilden

Glaspipetten und –gefäße Jürgens, Hannover

Inkubator

CO2-Inkubator Typ B 5060 EK/CO2 Heraeus, Hanau

Kugelkoagulometer

Amelung Coagulometer KC 4A Amelung, Lemgo

Mikroskop

Inverses Mikroskop (715075) Leitz, Wetzlar

Axiostar plus Lichtmikroskop Zeiss, Oberkochen

Mikrotom

Schlittenmikrotom Mikrom, Heidelberg

8 Anhänge 181

PCR-Maschine

MX 4000 PCR Maschine Strategene, La Jolla, California, USA

pH-Meter Jürgens, Hannover

Photometer

Ultraspec 2000 Amersham, Freiburg

Pipetten und Pipettierhilfen

Pipetman, P20, P100, P200, P1000 Abimed Analysen Technik

Blutmischpipetten für Leukozyten Landgraf Laborgeräte, Langenhagen

pipettus®

-standard Hirschmann Laborgeräte

Pipetboy plus®

Tecnomara AG, Wallisellen, Schweiz

12-Kanal-Pipette Brand

Multipette®

4780 Eppendorf, Hamburg

Micro-Pipettierhelfer BRAND Heiland Vet, Hamburg

Sicherheitswerkbänke

NUAIRE™ Klasse II Typ A/B3 NUAIRE, Plymouth, Minnesota, USA

Nunc Mikroflow adv. biosafety cabinet Schnakenberg, Bremen

Thermocycler

T personal Cycler Biometra, Göttingen

Thrombozytenaggregationsmessung

APACT System LABiTec, Ahrensburg

Trockenschrank (80°C) Ehret, Emmerdingen

Vakuumpumpe

Vacusafe Integra Biosciences, Chur, Schweiz

Vortex

Reax 2000 Heidolph, Schwabach

8 Anhänge 182

Waagen

1213 MP Sartorius GmbH, Göttingen

Analysenwaage, 1712 MP 8 Sartorius, Göttingen

Wärmeschrank Fa. Medite, Burgdorf

Wasserbad

Type 1003 Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel

Zählkammer

Thomakammer Heiland Vet GmbH, Hamburg

Neubauer, improved Landgraf Laborgeräte, Langenhagen

Zentrifugen

Labofuge 400R Heraeus-Christ, Osterode/Harz

Multifuge 3 S-R Heraeus- Christ, Osterode/Harz

Mikroliter-Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg

8 Anhänge 183

8.7 Verbrauchsmittel

Blutentnahme

Kabavette®

G EDTA 3,5 Kabe, Nürmbrecht 102325

Kabavette®

G EDTA 7,5 Kabe, Nürmbrecht 102200

Kabavette®

G Gerinnung 5,5 Kabe, Nürmbrecht 102100

Kabavette®

G Gerinnung 4 Kabe, Nürmbrecht 102125

Kabavette®

G Serum 7,5 Kabe, Nürmbrecht 102600

Adapter zur Mehrfachentnahme

mit Luer-Konus Kabe, Nürmbrecht 104300

Terumo®

Einmalkanülen 18 G Heiland Vet, Hamburg 370-690

Terumo®

Einmalkanülen 20 G Heiland Vet, Hamburg 370-692

Terumo®

Einmalkanülen 22 G Heiland Vet, Hamburg 370-218

Gewebeschnitte

Objektträger, Mattrand Engelbrecht, Edermünde

SuperFrost®

Objektträger Roth, Karlsruhe

Deckgläschen Roth, Karlsruhe

Pipettenspitzen

Combitips 1,25 ml Eppendorf, Hamburg 0030 048.083

Volumen bis 1000 µl Ratiolab, Dreieich 2100611

Volumen bis 200 µl Ratiolab, Dreieich 2100601

Reaktionsgefäße

Mikrotiterplatten Greiner, Nürtingen 653190

Makrotiterplatten Greiner, Nürtingen 662160

Polystyrol- Reagenzröhrchen Heiland Vet, Hamburg 370-470

Polyethylen-Stopfen für

Reagenzröhrchen Heiland Vet, Hamburg 370-495

Makro-Küvetten, Polystyrol Heiland Vet, Hamburg 370-485

Küvetten und Kugeln für KC 4A Trinity Biotech, Lemgo Z 05100

mölab-cups, klein Mölab, Hilden 0300002

Mikro-Küvetten inkl. Mixer Greiner BioChemica, Flacht 6130005

8 Anhänge 184

Sonstiges

Schachlik-Stäbchen Fackelmann, Hersbruck

Kryo-Vials, 2 ml Greiner, Nürtingen 126263

Latex Handschuhe Zentralbestand TiHo

Rotilabo®

-Spritzenfilter, 0,22 µm Roth, Karlsruhe P666.1

Parafilm®

„M“ Heiland Vet, Hamburg 371-053

Spritzen

Terumo®

Einwegspritzen, 5 ml Heiland Vet, Hamburg 710-2096

Terumo®

Einwegspritzen, 10 ml Heiland Vet, Hamburg 710-2094

Terumo®

Einwegspritzen, 20 ml Heiland Vet, Hamburg 710-2092

Transcoject Einmalspritzen, 30 ml Tierärztebedarf Hannover 60.530

Zellkultur

Gewebekulturflaschen, 50 ml Greiner, Nürtingen 690160

Gewebekulturflaschen, 250 ml Greiner, Nürtingen 658170

185

8.8 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2-1: Genomorganisation von Pestiviren................................................................... 3

Abbildung 2-2: Schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der

plasmatischen Blutgerinnung ........................................................................................... 29

Abbildung 2-3: Stark schematisierte Darstellung der Fibrinbildung. ...................................... 29

Abbildung 2-4: Schematische Darstellung des Fibrinolysesystems ........................................ 30

Abbildung 4-1: Hämorrhagische Symptome in der Finalphase der KSPV-Infektion.............. 74

Abbildung 4-2: Klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-Infektion.................................. 75

Abbildung 4-3: Charakteristische pathologisch-anatomische Befunde ................................... 77

Abbildung 4-4: Leukozytenzahlen der Tiere 153 - 159 im Versuchsverlauf........................... 82

Abbildung 4-5: Leukozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf .......................... 82

Abbildung 4-7: Thrombozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf ..................... 83

Abbildung 4-8: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere 175 bis 181 im

Versuchsverlauf................................................................................................................ 84

Abbildung 4-9: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Die aPTT im Verlauf der KSPV-

Infektion. .......................................................................................................................... 87

Abbildung 4-10: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Thrombinzeit im Verlauf der

KSPV-Infektion................................................................................................................ 87

Abbildung 4-11: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Prothrombinzeit im Verlauf der

KSPV-Infektion................................................................................................................ 87

Abbildung 4-12: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der aPTT-Bestimmung................... 88

Abbildung 4-13: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Thrombinzeitbestimmung........ 88

Abbildung 4-14: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Prothrombinzeitbestimmung.... 88

Abbildung 4-15: Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere 153 bis 159 .................................. 90

Abbildung 4-16: Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere 175 bis 181 .................................. 90

Abbildung 4-17: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-II-Aktivität. .......................................... 92

Abbildung 4-18: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-V-Aktivität........................................... 92

Abbildung 4-19: Einzelfaktorenbestimmung. Antithrombin-III-Aktivität. ............................. 92

Abbildung 4-20: Temperaturkurven für die Gruppen I und II. ................................................ 94

Abbildungsverzeichnis 186

Abbildung 4-21: Gruppenmittelwerte für den CS beider Tiergruppen .................................... 95

Abbildung 4-22: Pathologisch-anatomische Veränderungen der Tiere beider Gruppen ......... 97

Abbildung 4-23: Gruppenmittelwerte für die Leukozytenzahlen beider Gruppen .................. 98

Abbildung 4-24: Thrombozytenmittelwerte für die Tiere beider Gruppen.............................. 99

Abbildung 4-25: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere beider Gruppen ............... 100

Abbildung 4-26: Large Platelets für die Tiere beider Gruppen. ............................................ 101

Abbildung 4-27: aPTT für die Tiere der Gruppen I und II .................................................... 103

Abbildung 4-28: Thrombinzeit für die Tiere der Gruppe II................................................... 103

Abbildung 4-29: Prothrombinzeit für die Tiere der Gruppen I und II ................................... 104

Abbildung 4-30: Fibrinogenkonzentration für die Tiere der Gruppen I und II...................... 105

Abbildung 4-31: Körpertemperatur im Versuchsverlauf für die Gruppen I und II................ 108

Abbildung 4-32: Clinical Score für die Gruppen I und II ...................................................... 109

Abbildung 4-33: Leukozytenzahlen für die Gruppen I und II................................................ 111

Abbildung 4-34: Thrombozytenzahlen für die Gruppen I und II im Versuchsverlauf .......... 112

Abbildung 4-35: aPTT für die Gruppen I und II .................................................................... 114

Abbildung 4-36: Thrombinzeit für die Gruppen I und II ....................................................... 114

Abbildung 4-37: Prothrombinzeit für die Gruppen I und II................................................... 114

Abbildung 4-38: Fibrinogenkonzentration für die Gruppen I und II. .................................... 115

Abbildung 8-1: Eichkurve aus einer PEG-Hirudin-Standardverdünnungsreihe .................... 169

Abbildung 8-2: Ecarin Clotting Time für die Tiere 182 bis 186 (Gruppe 1) ......................... 169

Abbildung 8-3: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die

Messung der aPTT mit Actin®

FS .................................................................................. 170

Abbildung 8-4: Kalibrationskurve zur Fibrinogenbestimmung ............................................. 171

Abbildung 8-5: Verlauf der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation ............................ 171

Abbildung 8-6: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die

Messung der aPTT mit Actin®

FS .................................................................................. 172

187

8.9 Tabellenverzeichnis

Tabelle 2-1: Rezeptoren und weitere relevante Komponenten der Thrombozyten.................. 25

Tabelle 2-2: Substanzen des Endothels und Subendothels ...................................................... 26

Tabelle 3-1: Thrombozytenparameter, die mittels Sysmex F-800 untersucht wurden ............ 58

Tabelle 3-2: Fibrinogenverdünnungsreihe (Standardkurve). ................................................... 62

Tabelle 3-3: Gerinnungsansätze für die Fibrinogenbestimmung aus Plasma. ......................... 63

Tabelle 4-1: Wirkstoffe, Monitoringmethoden, Dosierungen und Ergebnisse der

pharmakokinetischen Vorversuche ................................................................................ 106

Tabelle 8-1: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion und des Antigen-

ELISAs für die Tiere 153 bis 159 .................................................................................. 167

Tabelle 8-2: Ergebnisse der Virusisolierung für die Tiere 175 bis 181 ................................. 167

Tabelle 8-3: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 153 bis 159.

........................................................................................................................................ 168

Tabelle 8-4: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 175 bis 191.

........................................................................................................................................ 168

Tabelle 8-5: Nachweis der KSPV-Infektion .......................................................................... 170

Tabelle 8-6: Nachweis der KSPV-Infektion .......................................................................... 172

Tagungsbeiträge

Teile dieser Arbeit wurden vorab veröfffentlicht:

BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK und V. MOENNIG (2004):

Does disseminated intravascular coagulation (DIC) play a major role in the pathogenesis of

Classical Swine Fever? In: Annual Meeting of the "Gesellschaft für Virologie" Joint Meeting

with Società Italiana di Virologia, Tübingen, March 17–20, 2004, 208.

BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK, R. MISCHKE und V. MOENNIG

(2005): Characterisation of Coagulation Disorders occuring in the Course of Classical Swine

Fever using Thrombocyte Aggregation Inhibitors Clopidogrel and Acetyl Salicylic Acid.

In: Annual Meeting of the "Gesellschaft für Virologie", Hannover, Germany, March 16-19,

2005, 179.

BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK und V. MOENNIG (2005):

Characterisation of coagulation disorders occuring in the course of acute classical swine fever

virus (CSFV) infections using direct thrombine inhibitor Hirudin and thrombozyte

aggregation inhibitors Clopidogrel and acetyl salicylic acid.

In: 6th ESVV Pestivirus Symposium, Thun, Switzerland, 13 - 16 September 2005, 75.

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. V. Moennig für die Überlassung des Themas, die

wissenschaftliche Betreuung der Arbeit sowie die freundliche Aufnahme am Institut für

Virologie.

Ich danke Herrn Prof. Dr. G. Nowak und der Arbeitsgruppe „Pharmakologische

Hämostaseologie“ für die freundliche Unterstützung in allen hämostaseologischen Fragen und

Techniken, die geduldige Diskussionsbereitschaft sowie die Bereitstellung diverser

Reagenzien und Protokolle.

Frau Prof. Dr. I. Greiser-Wilke danke ich besonders dafür, dass sie die Zusammenarbeit mit

der AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ durch ihr persönliches Engagement möglich

gemacht hat.

Frau Dr. A. Meindl-Böhmer danke ich für ihre stete Diskussionsbereitschaft, die

konstruktiven Vorschläge für die Überarbeitung des Schrifttums und ihre Hilfe und Betreuung

bei der Durchführung der experimentellen Arbeiten.

Dem Evangelischen Studienwerk e. V. Villigst danke ich für die finanzielle Unterstützung im

Rahmen eines Promotionsstipendiums.

Mein Dank gilt Prof. Dr. W. Baumgärtner, Institut für Pathologie TiHo Hannover, für die

Beratung in histopathologischen Fragen und die Erlaubnis, die Geräte des Instituts zu nutzen.

Insbesondere danke ich auch den Mitarbeiterinnen des Instituts Frau P. Grünig und Frau K.

Rohn für die Einarbeitung in die Anfertigung histopathologischer Präparate.

Ich danke Herrn Prof. Dr. R. Mischke und Herrn Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere

TiHo Hannover, für die Beratung während der Ausarbeitung der Vorversuche und Herrn D.

Menzel für die freundliche Einarbeitung in die hämostaseologische Diagnostik.

Für die exzellente Pflege der Versuchstiere und die weit über das übliche Maß hinausgehende

Einsatzbereitschaft danke ich insbesondere Günter Thiem, Helmut Schulz und Monika Berg.

Ich danke Frau Gabriele Müller für die freundliche Einarbeitung in alle virologischen

Techniken und die umfassende und verständnisvolle Unterstützung während des gesamten

Projektes.

Meinen Mitdoktoranden Andreas Gavrilenko und Stefan von Rüden sowie Frau Dr. Stefanie

Bendfeldt danke ich für ihre Diskussionsbereitschaft, die Korrektur der schriftlichen Arbeit

und die moralische Unterstützung.

Ich danke Christina Fuest für die unermüdliche Hilfe bei der Aufarbeitung diverser Proben.

Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Virologie gilt mein herzlicher Dank

für die freundliche Aufnahme und stete Hilfsbereitschaft.

Meinen Freunden und meiner Familie danke ich für ihre Geduld und Unterstützung.

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Zur Pathogenese der Klassischen

Schweinepest: Analyse der Blutgerinnungsstörung“ selbstständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

• Die automatischen Schritte der Einbettung, Färbung und Eindeckung der

histopathologischen Präparate erfolgte am Institut für Pathologie der Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir

unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im

Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

• Institut für Virologie, Europäisches Referenzlabor für Klassische Schweinepest

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

31.05. 2006

Sandra Blome