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Zur Rolle von Platin-DNA-Addukten in
Tumorzellen für das zelluläre und klinische
Ansprechen auf eine Cisplatin-Behandlung
Neue Ansätze zur Prädiktion und Modulation
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
Dr. rer. nat.
der Fakultät für
Biologie
an der
Universität Duisburg-Essen
vorgelegt von
Margarita Melnikova
aus Kalatschi (Russland)
April 2018
I
Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden am Institut für
Zellbiologie, in der Abteilung DNA-Reparatur am Universitätsklinikum Essen der
Universität Duisburg-Essen durchgeführt.
1. Gutachter: PD Dr. Jürgen Thomale
2. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Horsthemke
Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. Dominik Boos
Tag der mündlichen Prüfung: 19.06.2018
II
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen und Akronyme ............................................................ V
1 Einleitung ...................................................................................................................... 1
1.1 Therapieansätze bei Tumoren ............................................................................. 1
1.2 Zytostatika ........................................................................................................... 5
1.2.1 Platinverbindungen ................................................................................. 6
1.2.2 Wirkungsmechanismus von Cisplatin ..................................................... 7
1.2.3 Zelluläre Antwort der Zelle ..................................................................... 9
1.3 Limitierenden Faktoren einer Cisplatin-basierten Tumortherapie .................... 15
1.3.1 Systemische Toxizität ........................................................................... 16
1.3.2 Organ-/Zelltyp-spezifische Toxizität .................................................... 17
1.3.3 Primäre und sekundäre Resistenz ......................................................... 18
1.4 Vorarbeiten ........................................................................................................ 22
1.5 Systemischer Ansatz mit primären Tumorzellen .............................................. 24
1.6 Das Ovarialkarzinom ......................................................................................... 25
1.6.1 Klassifizierung und Stadieneinteilung .................................................. 25
1.6.2 Prognosefaktoren .................................................................................. 27
1.6.3 Diagnostik ............................................................................................. 30
1.6.4 Therapie ................................................................................................ 30
2 Zielsetzung .................................................................................................................. 32
3 Materialien und Methoden .......................................................................................... 34
3.1 Material ............................................................................................................. 34
3.2 Geräte ................................................................................................................ 34
3.3 Chemikalien und Enzyme ................................................................................. 35
3.4 Puffer und Lösungen ......................................................................................... 36
3.5 Nährmedien ....................................................................................................... 38
3.6 Pharmakologisch wirksame Substanzen ........................................................... 39
3.7 Antikörper ......................................................................................................... 40
3.8 Software............................................................................................................. 40
3.9 Biologische Materialien .................................................................................... 41
3.9.1 Verwendete Zelllinien ........................................................................... 41
3.9.2 Primäres Tumormaterial ....................................................................... 42
3.9.3 Versuchstiere ......................................................................................... 42
3.10 Methoden ........................................................................................................... 43
3.10.1 Kultivierung von Zelllinien und primären Tumorzellen ....................... 43
3.10.2 Auftauen von kryokonservierten Aszites-Proben ................................. 43
3.10.3 Handhabung klinischer Biopsien .......................................................... 44
3.10.4 Ficoll-Dichtegradient zur Gewinnung humaner mononukleärer Zellen
aus Tumormaterial ................................................................................ 44
III
3.10.5 Ex-vivo Exposition mit Cisplatin und Inhibitoren ................................ 45
3.10.6 Immunphänotypisierung primärer OVK Zellen in der MNZ-Fraktion . 45
3.10.7 Lokalisation und Positionsspeicherung CA-125-positiver
Tumorzellen .......................................................................................... 46
3.10.8 Immunzytologischer Nachweis von Pt-(GpG)-Addukten in der DNA
von Zellen (ICA-Assay) ........................................................................ 46
3.10.9 Quantifizierung der Fluoreszenzsignale ................................................ 47
3.10.10 Bestimmung der Apoptose mittels Caspase-3 Aktivitäts-Assay ........... 48
3.10.11 Zellzyklus-Analyse ............................................................................... 49
3.10.12 Messung des intrazellulären Platin-Gehaltes (ICP-MS) ....................... 49
3.10.13 Zucht und Behandlung von Ratten und Mäusen ................................... 50
3.10.14 Präparation von Dorsalganglien der Ratte und
Kultivierung/Immunphänotypisierung von DRG-Zellen ...................... 50
3.10.15 Anfertigung von Gefrierschnitten ......................................................... 51
4 Ergebnisse ................................................................................................................... 52
4.1 Akkumulation von Platin-DNA-Addukten in physiologischen Zellen ............. 52
4.1.1 Reduktion der systemischen Toxizität bei Cisplatin-behandelten
Mäusen durch Ko-Applikation von DO9 .............................................. 52
4.1.2 In vivo und ex vivo Exposition von Neuronen und Gliazellen des DRG
mit Cisplatin .......................................................................................... 54
4.2 Quantifizierung und Modulation der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von OVK-
Zelllinien ........................................................................................................... 57
4.2.1 Analyse des Pt-(GpG)-Adduktspiegels der Cisplatin-sensitiven und
resistenten Zelllinien A2780 und A2780-res ........................................ 57
4.2.2 Wirkung der DO-Modulatoren auf den Pt-Adduktgehalt in der DNA
von Cisplatin-exponierten OVK-Zellen ................................................ 59
4.2.3 Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf die
Apoptose-indikativen Caspase 3-Aktivität ........................................... 65
4.2.4 Wirkung von DO-Modulatoren auf den intrazellulären
Gesamtplatingehalt bei Cisplatin-exponierten OVK- Zellen ................ 67
4.3 Quantifizierung der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von primärem Tumorzellen
nach Cisplatin-Behandlung ex vivo ................................................................... 70
4.3.1 Lokalisierung und Messung von Pt-(GpG)-Addukten in primären
Tumorzellen innerhalb einer komplexen Zellpopulation aus einer
Tumor-Probe ......................................................................................... 71
4.3.2 Analyse von Pt-(GpG)-Addukten in der DNA von primären
Tumorzellen aus unterschiedlichen Biopsien einer Patientin ............... 75
4.3.3 Analyse des individuellen Pt-(GpG)-Adduktspiegels nach Exposition
mit Cisplatin und DO-Modulatoren in der DNA von Tumorzellen
verschiedener Patientinnen ................................................................... 81
5 Diskussion ................................................................................................................... 84
5.1 Zur Rolle von Pt-(GpG)-Addukten in Physiologischen Zellen und dessen
Modulation ........................................................................................................ 85
IV
5.1.1 Die Ko-Applikation von DO9 reduziert die systemische Toxizität von
Cisplatin bei der Maus .......................................................................... 85
5.1.2 Hohe Adduktbelastung in der DNA von DRG-Mantelzellen bei der
Cisplatin-induzierten Polyneuropathie in Ratten .................................. 88
5.2 Zur Rolle von Pt-(GpG)-Addukten bei der Cisplatin-Resistenz im OVK-
Modell ............................................................................................................... 92
5.2.1 Die Cisplatin-Resistenz der A2780-res Zellen ist assoziiert mit einem
niedrigen Pt-(GpG)-Adduktspiegel ....................................................... 92
5.2.2 DO-Modulatoren erhöhen den Cisplatin-induzierten Adduktgehalt in
der DNA von humanen Tumorzellen .................................................... 95
Wirkungsmodell der DO-Modulatoren ....................................................................... 98
5.3 Zur Rolle von Pt-(GpG)-Addukten in primärem OVK-Tumorzellen ............. 102
5.3.1 Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von Tumorzellen aus Aszites und
primären Tumor .................................................................................. 102
5.3.2 DO-Modulatoren vermitteln bei behandelten primären Tumorzellen
einen erhöhten Pt-Adduktgehalt .......................................................... 105
6 Zusammenfassung .................................................................................................... 109
Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. 112
Tabellenverzeichnis .................................................................................................. 114
Anhang .................................................................................................................... 115
7 Literaturverzeichnis .................................................................................................. 119
Lebenslauf ................................................................................................................. 132
Publikationsübersicht ................................................................................................ 133
Danksagung .............................................................................................................. 134
Eidesstattliche Erklärung .......................................................................................... 135
V
Verzeichnis der Abkürzungen und Akronyme
5-HT3 5-Hydroxytryptamin 3
A Adenin
ADP Adenosindiphosphat
AFU arbitary fluorescence units
APAF1 Apoptotic protease activating factor 1
APC Antigen-presenting cell
ATM ataxia telangiectasia mutated
ATP7A/B ATPase, Cu2+-Transporter
ATR Ataxia-telangiectasia and Rad3-related protein
Bad Bcl-2-Antagonist of Cell Death
Bak Bcl-2-homologous antagonist/killer
Bax Bcl-2-associated X protein
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
Bcl-W Bcl-2-like protein 2
Bcl-xL B-cell lymphoma-extra large
Bcl-XS B-cell lymphoma-extra short
BER Basenexzisionsreparatur
Bfl-1 Bcl-2-related protein A1
Bid BH3 interacting-domain death agonist
Bik Bcl-2-interacting killer
Bim Bcl-2-like protein 11
BRAF B-Raf Protoonkogen
BRCA1 Breast cancer 1
BSA Bovine serum albumin
Bsp. Beispiel
bzw. beziehungsweise
C57BL/6 C57 black 6
Ca. Circa, ungefähr
CA-125
Cancer-Antigen 125
CACS Cancer Anorexia-Cachexia Syndrome
CAR-T-Zellen Chimeric Antigen Receptor T-Zellen
CASP3 Cysteine-aspartic acid protease 3 coding gene
CCL2 Chemokine (C-C motif) ligand 2
CD24 Signal transducer 24
CDC25 cell division cycle 25
CDK Cyclin-dependent kinase
CHK Checkpoint kinase
CisPt Cisplatin
c-KIT Proto-oncogene receptor tyrosine kinase
COX-2 Cyclooxygenase-2
CTNNB1 Catenin Beta 1 coding gene
CTR1 High affinity copper uptake protein 1
CXC Chemikone receptors
Cy3 Cyanine 3
DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol
VI
ddH2O Doppelt destilliertes Wasser
DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium
DNA Desoxyribonucleic acid
DNase Desoxyribonuklease
DRG Dorsalganglion
DTC
Disseminated tumor cells
ED50 Mittlere effektive Dosis
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
EMT Epithelial-mesenchymale transition
EOC Epithelial ovarian cancer
ERBB2 Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 2 coding gene
ERCC1 Excision-repair cross-complementing protein 1
et al. et alteri / et alterae
FACS Fluorescence-activated cell sorting
FCS Fetal calf serum
FIGO Fédération Internationale de Gynécologie et d´Obstétrique
G Guanin
ggf. gegebenfalls
GG-NER Global genomic nucleotide excision repair
GSH Gluthation
GSTπ Glutathione S-transferase Pi
HCL Hydrogen chloride
HER2 Human epidermal growth factor receptor 2
HMG High mobility group
HPV Humane Papillomviren
HR Homologe Rekombination
ICA Immunochistochemical assay
ICP-MS Inductively couples plasma mass spectrometry
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
KRAS V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
LD50 Mittlere letale Dosis
Mcl-1 myeloid leukemia cell diferentiaton protein 1
MDC1 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1
MET Mesenchymale-epithelial transition
M-
Kontrollpunkt
Mitose-Kontrollpunkt
MLH1 MutL homolog 1
MMP Matrix-Metalloproteinase
MMR Mismatch Repair
MNZ mononukleären Zellfraktion
MRP Multidrug resistance-related protein
mTOR Mechanistic target of Rapamycin
MUC-16 Mucin-16
NER Nucleotide excision repair
NHEJ Non-homologous end joining
NK-1 Neurokinin 1
Noxa Phorbol-12-Myristate-13-Acetate-Induced Protein 1 coding gene
NSCLC Non-small cell lung cancer
VII
OCT Organic cation transport protein
OVK Ovarialkarzinom
p.a. Pro analysi
p53 Tumor protein 53
PAI-1 Plasminogenaktivatorinhibitor Typ 1
PARP Poly (ADP-ribose) polymerase
PBS Phosphate-buffered saline
PBST Phosphate-buffered saline plus Tween20
PCNA Proliferatin cell nuclear antigen
PI Propidiumiodid
PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit
Alpha coding gene PMS1 PMS1 protein homolog
PMS2 PMS1 homolog 2
PNP Plyneuropathie
Pol η DNA polymerase eta
Pol ί DNA polymerase iota
Pol κ DNA polymerase kappa
POLH DNA polymerase eta coding gene
Pt Platin
PTC Proximale tubule cells
PTEN Phosphatase and Tensin homolog
Pt-GpA Platin-Guanin:Adenin Intrastrang Crosslink (1,2-d(ApG) Addukt)
Pt-GpG Pt-Guanin:Guanin Intrastrang Crosslink (1,2-d(GpG) Addukt)
Pt-GpNpG Pt-Guanin:Nukleotid:Guanin Intrastrang Crosslink (1,3-d(GpNpG)
Addukt) Puma p53 upregulated modulator of apoptosis
RFC replication factor C
RMPI Roswell Park Memorial Institute medium
RNA Ribonucleic acid
RNase Ribonuclease
RT Raumtemperatur
TACE transarterielle Chemoembolisation
TC-NER Transcription coupled nucleotide excision repair
TFIIH Transcription factor II human
TLR2/4 Toll-like receptor 2/4
TLS trans lesion synthesis
TNF-α Tumor necrosis factor alpha
TopBP1 DNA topoisomerase 2-binding protein 1
TP53 Tumor protein 53 coding gene
TRPA1 Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1
TRPM8 Transient receptor potential cation channel subfamily M member 8
u.a. Unter anderem
UAW unerwünschten Arzneimittelwirkungen
UICC Union international contre le cancer
VDAC1 Voltage-dependent anion-selective channel 1
VEGF Vascular endothelial growth factor
VGCC voltage-gated calcium channels
WHO World Health Organization
WT Wildtyp
XPA-G Xeroderma pigmentosum A-G
VIII
Einheiten
% Prozent
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM Mikromolar
cm Zentimeter
g Gramm
h Stunde
Hz Hertz
kg Kilo
L Liter
M Molar
mg Milligramm
min Minute
mL Mililiter
mM Milimolar
ng Nanogramm
pH -log[H+]
rpm Rotation per minute
1
1 Einleitung
1.1 Therapieansätze bei Tumoren
Die Krebstherapie stützt sich auf drei Säulen: Operation, Chemotherapie und
Strahlentherapie. Diese Therapiemöglichkeiten können jeweils allein oder in
Kombination zur Anwendung kommen. Für bestimmte Tumorarten kommen zusätzliche
zielgerichtete Therapien wie Hormontherapie oder Immuntherapie in Frage. Welche
Therapieform für den Patienten zum Einsatz kommt, hängt in erster Linie vom Tumortyp,
dem Ausmaß der Krebserkrankung (Gewebetyp, Wachstumstendenz, Größe,
Lokalisation und dem Stadium) und u.a. dem Alter des Patienten und dem Vorhandensein
anderer Erkrankungen ab.
Operation
Das Ziel einer Operation ist vorrangig die vollständige, kurative Entfernung allen
makroskopisch sichtbaren Tumorgewebes. Sie dient auch zur Sicherung der Diagnose
bzw. der Bestimmung des Karzinom-Stadiums für die weitere Therapieplanung.
Befindet sich die Krankheit noch im frühen Stadium, kann die Therapie nach der
Operation ohne weitere Maßnahmen abgeschlossen sein. Neben der herkömmlichen
offenen Operation sind minimal-invasive Operationstechniken (Laserchirurgie,
Endoskopie und Laparoskopie) mit kleinstem Trauma möglich. Der verbliebene
postoperative Tumorrest zählt, nach dem Tumorstadium, zum stärksten,
unabhängigen Prognosefaktor.
Chemotherapie
Die Chemotherapie ist im Vergleich zur Operation und Bestrahlung eine systemische,
den ganzen Körper betreffende, Behandlung. Diese umfasst die Behandlung von
Krebserkrankungen mit chemischen Substanzen, den sogenannten Zytostatika, die
u.a. in den Zellzyklus der Krebszellen eingreifen. Die Behandlung kann präoperativ
als neoadjuvante, postoperativ als adjuvante oder auch als palliative Therapie
eingesetzt werden. Das Ziel einer neoadjuvanten Chemotherapie ist, die Reduktion
der Tumormasse bei einer primär nicht operablen Erkrankung um eine verbesserte
Ausgangssituation für die Operation zu erzielen („Downstaging“ der
2
Tumorerkrankung). Nach der Abschätzung des individuellen Risikos für einen
Rückfall und bei fortgeschrittenen Tumorstadien mit erhöhtem
Metastasierungsrisiko, kann im Anschluss an die Operation eine adjuvante Therapie
durchgeführt werden. Dadurch lassen sich möglicherweise vorhandene gestreute
Krebszellen („Mikrometastasen“) behandeln. Das Ziel einer palliativen Therapie ist,
den Verlauf bei fortgeschrittener unheilbarer Erkrankung zu verlangsamen und die
Symptome zu lindern. Bei manchen Tumorerkrankungen ist zudem ebenso eine
lokale Chemotherapie (transarterielle Chemoembolisation (TACE)) möglich, bei der
die Zytostatika ihre Wirkung möglichst gezielt am Tumorgewebe entfalten sollen.
Strahlentherapie
Die Strahlentherapie (Radiotherapie) ist eine vorwiegend lokal wirkende Methode,
bei der die Wirkung hauptsächlich innerhalb des Bestrahlungsfeldes auftritt. Dabei
wird durch ionisierende Strahlung (Elektronenstrahlung, Ionenstrahlung oder
Photonenstrahlung) in den getroffenen Zellen u.a. die DNA geschädigt. Dies hat zur
Folge, dass die Zellteilung stagniert und die Zelle gegebenenfalls abstirbt. Aufgrund
der unspezifischen zellschädigenden Wirkung ist die Reparaturkapazität der
gesunden Zellen der begrenzende Faktor einer klassischen Strahlentherapie. Neue
Techniken der Präzisionsstrahlung erlauben eine genauere Eingrenzung auf das
Tumorgewebe, sodass das gesunde Gewebe besser geschont wird. Bei einer
nuklearmedizinischen Strahlentherapie werden kurzlebige radioaktive Substanzen in
Form von Arzneimitteln verwendet, die z.B. durch den Stoffwechsel in die
betroffenen Organe (bevorzugt Metastasen) gelangen, die krankhaften Zellen
zerstören und radioaktiv zerfallen (Deutsche Krebsgesellschaft2014).
Hormontherapie und Anti-Hormontherapie
Die Hormontherapie und Anti-Hormontherapie ist eine zusätzliche Option in der
Behandlung hormonempfindlicher Tumoren. Bei dieser Therapieform wird
ausgenutzt, dass das Wachstum mancher Krebsarten durch bestimmte Hormone
verstärkt wird. Das Tumorwachstum kann gebremst oder gestoppt werden, indem
körpereigene Hormone dabei gezielt ausgeschaltet (anti-Hormontherapie) oder
ersetzt (Hormonersatztherapie) werden (Deutsches Krebsforschungszentrum2015).
3
Immuntherapie
Das Prinzip einer Immuntherapie beruht auf der Erzeugung einer Interaktion
zwischen Abwehrsystem und Tumorzellen. Dazu zählen alle Methoden, die das
körpereigene Immunsystem nutzen, um verstärkt und gezielt die Malignomzellen zu
bekämpfen. Diese Therapieansätze werden bisher nur bei bestimmten Tumorentitäten
und überwiegend für Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung eingesetzt. Die
folgend aufgeführten Ansätze werden noch in der Grundlagenforschung untersucht
oder in klinischen Studien geprüft (Krebsinformationsdienst, et al.):
Prophylaktische Krebs-Impfung: bietet einen präventiven Schutz gegen bestimmte
krebsauslösende Viren (HPV, Hepatitis B) (Poethko-Müller, et al.2014).
Therapeutische Krebs-Impfungen: rufen mit Hilfe von Krebsvakzinen direkt oder
indirekt eine Immunreaktion gegen Tumorantigene hervor (Protein-/Peptid-basierte
oder DNA- oder RNA-basierte Impfungen) (Aldrich, et al.2010).
Dendritische Zelltherapie: beruht auf der Beladung von dendritischen Zellen mit
Antigenen, die im Körper weitere Immunzellen durch Antigenpräsentation aktivieren
und eine spezifische Immunantwort hervorrufen (Palucka, et al.2013).
Adoptiver T-Zell-Transfer (T-Zell-Therapie): Patienten erhalten außerhalb des
Körpers durch den Kontakt mit APCs aktivierte oder gentechnisch veränderte T-
Zellen (CAR-T-Zellen), die bestimmte Tumorantigene erkennen können (Hartmann,
et al.2017, Houot, et al.2015).
Virotherapie: tumorspezifische Viren, die bevorzugt menschliche Krebszellen
befallen und zerstören. Zusätzlich erfolgt durch den Virusbefall eine Aktivierung des
Immunsystems (Lawler, et al.2017).
Gentherapie
Die Gentherapie ist eine bereits sehr lange diskutierte, aber bisher kaum klinisch
eingesetzte Methode. Sie bezeichnet das Einfügen von therapeutischen Genen in
Zellen eines Menschen, durch deren Expression fehlerhafte oder unkontrollierte
Expression verhindert und somit hereditäre oder somatische Gendefekte behoben
werden sollen. Bei der ex-vivo Strategie werden dem Patienten Zellen entnommen,
4
im Labor kultiviert, mit einem geeigneten Vektor genetisch modifiziert und wieder
in den Körper des Patienten zurück transferiert. Bei der in-vivo Strategie findet der
Gentransfer im Körper des Patienten statt. Der Vektor wird entweder systemisch oder
lokal in das zu therapierende Gewebe oder Organe injiziert. Bei der somatischen
Gentherapie werden Gene in differenzierte Körperzellen oder deren Vorläuferzellen
eingeschleust. Diese transferierten Gene bleiben auf den Empfänger beschränkt und
können nicht weitervererbt werden. Die Keimbahn-Gentherapie, bei der die
eingebrachten Gene an die Nachkommen weitervererbt werden können, ist in
Deutschland aus ethischen Gründen verboten (Baum, et al.2013).
Zielgerichtete Krebstherapie („Targeted Therapies“)
Den typischen/klassischen Krebs gibt es nicht, denn jede Tumorart ist anders und der
Verlauf der Krebserkrankung kann sich von Mensch zu Mensch unterscheiden
(Entstehungsgeschwindigkeit, Aggressivität, Neigung zur Metastasierung). Das Interesse
der Krebsforschung richtet sich zunehmend auf Therapien, die auf die individuelle
Situation des Patienten zugeschnitten sind. Solche zielgerichteten Therapien richten sich
spezifisch gegen definierte molekulare Strukturen/Eigenschaften der Tumorzellen. Zur
Heilung führen diese Therapien in der Regel nicht, können jedoch den Krankheitsverlauf
aufhalten und Beschwerden lindern. Die neuen Wirkmechanismen führen jedoch oft zu
klinisch ungewöhnlichen und neuartigen Nebenwirkungen, die eine therapeutische
Herausforderung darstellen (Gutzmer, et al.2013). Ansatzpunkte zielgerichteter Therapie
sind: Botenstoffe („Liganden“), Bindungsstellen („Rezeptoren“) für Botenstoffe oder
Signalwege.
Zellwachstum
Mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern können Rezeptoren z.B. für
Wachstumsfaktoren wie HER2 oder EGFR blockiert werden, sodass die physiologischen
Liganden nicht mehr binden können und die Signaltransduktion der Zelle gehemmt wird.
Unter Verwendung von „small molecules“ können im Zellinneren Kinasen (Bsp.:
Tyrosinkinase, mTOR-Kinase), die an der Signalweiterleitung beteiligt sind, gehemmt
werden. Dazu gehören Multikinaseinhibitoren, die ein breites Spektrum von
Signalmolekülen hemmen oder selektive Kinaseinhibitoren die auf spezifischen Ebenen
5
in den Signalweg eingreifen (Bsp.: RGFR-Inhibitor, c-KIT-Inhibitor oder BRAF-
Inhibitor).
Angiogenese
Die tumorinduzierte Neubildung von Blutgefäßen kann mit Hilfe von monoklonalen
Antikörpern durch direktes „Abfangen“ des zugehörigen Wachstumsfaktors VEGF
gestoppt werden. Zum anderen ist ebenfalls eine Unterdrückung der Signalweiterleitung
vom VEGF-Rezeptor auf der Oberfläche von Blutgefäßzellen durch Kinasehemmer
möglich.
Proteasom
Die Proteasom-Funktion kann mit Hilfe von „small molecules“ blockiert werden. Ist diese
Funktion gestört, wird die Zelle in ihrer Teilung aufgrund von „Abfallprodukten“
gehindert und der programmierte Zelltod wird in Gang gesetzt.
Reparaturmechanismen
Als Beispiel dient das PARP-Enzym, welches den Reparaturenzymen ermöglicht, an der
DNA ihrer Funktion nachzugehen. Bei BRCA1 oder BRCA2-Mutationen kann mit
PARP-Hemmer dieser Prozess unterbunden werden und es kommt in Krebszellen
vermehrt zu fehlerhaften Reparaturen und demzufolge zur Apoptose („synthetic
lethality“). In gesunden Zellen können alternative Reparaturmechanismen diese Aufgabe
kompensieren (Krebsinformationsdienst, et al.2018).
1.2 Zytostatika
Zytostatika (Zytos = Zelle; statikos = hemmen) sind natürliche oder synthetische,
pharmazeutische Wirkstoffe. Ein Zytostatikum stört, verzögert oder blockiert den
Zellzyklus und verhindert somit die Proliferation. Die Substanzen lassen sich in folgende
Gruppen einteilen: Alkylantien, Platinanaloga, Interkalantien, Mitosehemmer, Taxane,
Antimetabolite, Antibiotika, Topoisomerasehemmer und weitere Zytostatika. Weiter
werden Zytostatika nach ihrer Wirkung auf den Zellzyklus in phasenspezifische (wirken
nur während bestimmter Phasen des Zellzyklus) zyklusspezifische (erfassen alle Phasen
des Zellzyklus außer der G0-Phase) und zyklusunspezifische (erfassen auch Zellen in der
6
G0-Phase) Medikamente eingeteilt (2011). Die Wirkungsweise der Substanzen beruht
entweder auf der Induktion von DNA-Schäden, einer Interferenz mit der DNA-Synthese
oder Interferenz mit den Mikrotubuli der Mitosespindel. Diese Zytostatika-induzierten
Schäden können, bis zu einem gewissen Punkt von den Zellen während eines induzierten
Zellzyklusarrests, repariert werden. Aus diesem Grund hat die zytotoxische Wirkung auf
langsam und schnell proliferierenden Zellen unterschiedliche Effekte. Die häufig stark
proliferierenden Tumorzellen sind in der Regel gegenüber Zytostatika empfindlicher als
sich langsam teilende oder terminal differenzierte gesunde Zellen. Der Unterschied
ermöglicht die Malignomtherapie mit diesen Substanzen. Jedoch werden oft auch
gesunde Zellen mit hoher Zellteilungsfrequenz durch die Substanzen beeinträchtigt und
ihr Funktionsausfall trägt wesentlich zum Nebenwirkungsspektrum bei. Dazu gehören
typischerweise viele Epithelzellen z.B. im Mund und Magen-Darm-Trakt, das
blutbildende System sowie die Haarwurzelzellen. Die unerwünschten
Arzneimittelwirkungen (UAW) können anhand ihres zeitlichen Auftretens in sofort, früh,
verzögert auftretende Wirkungen und in Spätschäden unterteilt werden. Verzögert
auftretende toxische Effekte in speziellen Organen, die neben der Myelosuppression
häufig dosislimitierend sind, können bei Überschreiten einer kumulativen Gesamtdosis
irreversible Organschäden zur Folge haben. Schweregrad und Dauer der früh
auftretenden Nebenwirkungen bestimmen die Intervalle, in denen Zytostatika verabreicht
werden können (2010).
1.2.1 Platinverbindungen
Platinkomplexe gehören zu den am häufigsten eingesetzten und wirksamsten
Tumortherapeutika. Die wichtigsten Wirkstoffe aus dieser Gruppe sind Cisplatin,
Carboplatin und Oxaliplatin. Der Platinkomplex Cisplatin (cis-Diamminedichlorplatinum
II) ist ein Übergangskomplex und wurde Ende der 70er Jahre in die Tumortherapie
eingeführt (Prestayko, et al.1979). Ende der 80er Jahre wurde das Platin-Derivat
Carboplatin (cis-Diammin-(1,1-dicarboxylatocyclobutan)-platin [II]) zugelassen,
welches bei äquivalenter Wirksamkeit häufig eine bessere Verträglichkeit aufweist
(Lebwohl, et al.1998). Heute zählen diese Platinkomplexe aufgrund des breiten
therapeutischen Spektrums zu den klinisch routinemäßig eingesetzten Zytostatika in der
Therapie von Ovarial-, Hoden-, Blasen-, Zervix-, Prostata-, Endometrium-, Ösophagus-
und Kopf-Hals-, sowie von Sarkomen und kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Für die
7
Behandlung von Dickdarmkrebs wurde 1999 das Platinderivat Oxaliplatin (Pt-(Oxalato)-
trans-I-diaminocyclohexan) eingeführt. Cisplatin hat im Vergleich zu Carboplatin
deutlich stärkere Nebenwirkungen in Niere, Innenohr und peripheren Nervensystem,
führt jedoch zu einer relativ geringeren oder reversiblen Schädigung der
Knochenmarksfunktionen (Myelosuppression) (Voigt, et al.2006). Sowohl Cisplatin als
auch Carboplatin liegen als inaktives Prodrug vor und werden erst in der Zelle in ihre
aktive Form umgewandelt, wobei durch die Aktivierung in beiden Fällen die gleiche
reaktive Komponente vorliegt. Im Folgenden wird Cisplatin als Modelverbindung für die
Darstellung der molekularen Wirkungsmechanismen verwendet.
1.2.2 Wirkungsmechanismus von Cisplatin
Abbildung 1: Hydrolyse von Cisplatin.
Das Platin-Atom besitzt einen Oxidationsstatus von +2. Dessen Chlorid-Liganden können durch Wasser-
Moleküle ersetzt werden, wodurch unterschiedliche Aqua- und Hydroxido-Komplexe entstehen können
(Esteban-Fernández, et al.2010).
8
1.2.2.1 Bioaktivierung
Cisplatin ist ein anorganischer Komplex mit einer planaren Struktur und Platin als
Zentralatom. An das Platinatom sind zwei cis-ständige Amin- und zwei Chlorliganden
gebunden (siehe Abbildung 1). Das Zytostatikum wird intravenös verabreicht und gelangt
durch die Blutbahn zu den Organen. Etwa zwei Stunden nach der Cisplatin-Gabe sind ca.
90 % des im Plasma vorhandenen Cisplatins an Proteine gebunden (Safaei, et al.2008).
Die höchsten Platinkonzentrationen weisen Leber, Prostata und Niere auf. Extrazellulär
liegt das Molekül aufgrund der hohen Konzentration an Chlorid-Ionen (~ 100 mM) als
elektroneutraler Komplex vor und kann entweder durch Diffusion oder aktiven Transport
ins Zellinnere gelangen (Lippert, et al.1983). Intrazellulär erfährt das inaktive Prodrug
aufgrund einer niedrigeren Chlorid-Ionen-Konzentration (~ 3 – 20 mM) eine spontane
Um Lagerung. Dabei entstehen durch den Austausch der Chlorid-Liganden durch
Wassermoleküle die hochreaktiven mono- oder dimeren Aquakomplexe cis-
[Pt(NH3)2Cl(OH2)]+ bzw. cis-[Pt(NH3)2(OH2)2]
2+ (Wang, et al.2005). Diese können mit
nukleophilen Bestandteilen der Zelle wie DNA, Proteinen, RNA,
Membranphospholipiden, Mikrofilamenten und thiolhaltigen Molekülen (Gluthation,
Cystein und Methionin) Platin-Addukte ausbilden. Die zytotoxische Wirkung beruht
jedoch hauptsächlich auf der Bildung von Platin-DNA-Addukten. Die Bindung von
Cisplatin an thiolhaltige Moleküle führt zu einer Neutralisierung von Cisplatin, welches
dann aktiv aus der Zelle sezerniert wird (Detoxifizierung) (Gonzalez, et al.2001).
1.2.2.2 Adduktbildung
Das aktivierte Cisplatin muss an einer Vielzahl potentieller Reaktionspartner vorbei, um
in den Zellkern zu diffundieren und dort mit nukleophilen Gruppen der DNA reagieren
zu können. Aufgrund der elektronenreichen N7-Position des Guanins bindet der Platin-
Komplex hier mit der stärksten Präferenz. Die Monoaquaspezies cis-[Pt(NH3)2Cl(OH2)]+
bildet dabei als erstes ein monofunktionales Addukt mit einer Purinbase (Jamieson, et
al.1999). Durch eine anschließende Hydrolyse des zweiten Chlorid-Liganden entsteht
dann eine weitere reaktive Position und nachfolgend eine Quervernetzung, beispielsweise
zu einer Base in räumlicher Nähe. Mögliche Interaktionen zwischen Cisplatin und DNA
beinhalten monofunktionelle Addukte, bifunktionelle Intrastrang-Verknüpfungen von
zwei Nukleotidbasen auf einem DNA-Strang, bifunktionelle Interstrang-Verknüpfungen
9
von zwei Basen in unterschiedlichen Strängen eines DNA-Moleküls oder auch Protein-
DNA Verbindungen. Aufgrund der cis-Anordnung der Chlorid-Abgangsgruppe wird als
Hauptaddukt das Intrastrang 1,2-d(GpG)-Addukt gebildet (60 – 65 %). Diese hohe
Bildungsfrequenz wird für die zytotoxische Wirkung von Cisplatin verantwortlich
gemacht. Weitere Bildungsprodukte sind Intrastrang 1,2-d(ApG)-Addukt (25 – 30 %) und
1,3-d(GpNpG)-Addukt (5 – 10 %) und die Interstrang-, Mono- und Intermolekulare
Addukte (1 – 3 %) (Voigt, et al.2006).
1.2.3 Zelluläre Antwort der Zelle
1.2.3.1 Erkennung des DNA-Schadens
Die Quervernetzung der Basen in der großen Furche der DNA-Helix durch Cisplatin, hat
große Auswirkungen auf die Sekundärstruktur und die Stabilität der DNA. Die Reaktion
der Zelle auf die Verzerrung der großen Furche, wodurch die kleine Furche für DNA-
bindende Proteine zugänglicher gemacht wird, führt u.a. zur Aktivierung und Bindung
von speziellen Proteinkomplexen (High-mobility-group (HMG) box Proteine, DNA-
Reparaturproteine oder Transkriptionsfaktoren) (Jung, et al.2007). Die Interaktion von
HMG box Proteinen mit Cisplatin-geschädigter DNA ist seit Langem bekannt und gut
untersucht. Die biochemische Bedeutung wird jedoch kontrovers diskutiert. In vitro
Studien belegen, dass durch die Bindung dieser Proteine die Nukleotid-Exzisions-
Reparatur (NER) inhibiert wird. Dies geschieht wahrscheinlich durch die Bindung des
Proteins an den DNA-Schaden, wodurch dieser von den Reparaturproteinen abgeschirmt
wird (Huang, et al.1994). Die Konzentration und Lokalisation von HMG-Proteinen wird
demnach mit der Cisplatin-Sensitivität einer Zelle in Verbindung gebracht (He, et
al.2000, Nagatani, et al.2001, Wei, et al.2003).
1.2.3.2 Inhibierung der RNA Polymerase II
Die RNA Polymerase II transkribiert die meisten Gene und ist mit ~ 300.000 Kopien pro
Zelle ein häufig vorkommendes Protein (Kimura, et al.1999). Es konnte belegt werden,
dass die Cisplatin-induzierten 1,2-d(GpG)- und 1,2-d(GpA)-Intrastrang-Addukte die
RNA-Polymerase II komplett inhibieren, wenn diese sich im Template-Strang befinden
und nur teilweise, wenn diese im nicht-kodierenden Strang liegen. Im Falle der 1,3-
10
d(GpNpG)-Intrastrang-Addukte wurde ebenfalls eine starke Inhibierung der
Transkription beobachtet, unabhängig davon, auf welchem Strang diese lokalisiert sind
(Tornaletti, et al.2003). Eine durch ein Cisplatin-Addukt gestoppte RNA-Polymerase II
führt zur Bildung eines stabilen Komplexes mit dem Addukt und kann neben der Funktion
als Schadenerkennungseinheit für die Einleitung transkriptionsgekoppelter Reparatur
(Svejstrup2002) auch den programmierten Zelltod induzieren (Svejstrup2003).
1.2.3.3 Zellzyklus-Arrest und Transduktion der DNA-Schaden Signale
Durch die Veränderung der helikalen Struktur kommt es zur Hemmung von DNA-
Replikation und Transkription, wodurch neben der Proteinbiosynthese auch der Ablauf
des Zellzyklus gestört wird. Eine Arretierung des Zellzyklus wird durch biochemische
Kontrollprozesse, den Zellzykluskontrollpunkten, nach der Detektion von strukturellen
Schäden in der DNA induziert. Die Aktivierung solcher Signalwege koordiniert Prozesse
wie Zellzyklusarrest, Reparatur und Apoptose. Diese Kontrollpunkte („Ckeckpoints“)
koordinieren, abhängig vom Ausmaß und Art des DNA-Schadens, einen verzögerten,
arretierten oder unveränderten Zellzyklusverlauf. Die Übergänge der Zellzyklusphasen
werden von Serin-/Threonin-Kinasen reguliert („cyclin dependent kinases“ CDK).
(Royer, et al.1999). Die Signalweiterleitung der DNA-schadensabhängigen Checkpoints
besteht aus drei Komponenten: Sensoren (sensor/signal initiator), Transduktoren
(transducer/mediator) und Effektoren (target/effector) (Gillet, et al.2006).
11
Abbildung 2: Zellzyklusregulation nach DNA-Schaden:
DNA-Schäden aktivieren die Kinasen ATM und ATR, welche durch Mediatoren die CHK 1/2 rekrutieren.
Über Phosphatase CDC25 und p53 werden die Cyclin/CDK-Komplexe inhibiert und die Zellen in
Zellzyklusarrest gezwungen. Durch Reparaturprozesse kann die Zelle entweder wieder in den Zellzyklus
eintreten oder die Apoptose einleiten (verändert nach: (Kastan, et al.2004) und (Zhou, et al.2000)).
Die Initiation von Checkpoint-Signalen erfolgt nach der Detektion des DNA-
Schadens durch die beiden Sensor-Moleküle ATM (ataxia telangiectasia mutated)
und ATR (ATM- and Rad3-related) (Sancar, et al.2004). Diese rekrutieren mittels
Mediatoren (MDC1, TopBP1, p53BP1 oder BRCA1) die beiden Checkpoint-Kinasen
(CHK 1/2) welche p53 durch Phosphorylierung aktivieren. Das aktive p53 kann in
der Zelle akkumulieren und nach der Translokation in den Zellkern als
12
Transkriptionsfaktor wirken. Zusätzlich inaktivieren die Checkpoint-Kinasen die
Phosphatasen CDC25 (cell division cycle 25) wodurch die Schrittmacher des
Zellzyklus, die Cycline und CDKs ebenfalls, inhibiert werden (Donzelli, et al.2003).
Im Zellzyklus gibt es drei Checkpoints, die durch spezifische Cyclin-CDK-Komplexe
reguliert werden (Cyclin D-CDK 4/6: G1-Kontrollpunkt; Cyclin A/E-CDK 2: G1/S-
Kontrollpunkt; Cyclin A-CDK 1/2: G2-Kontrollpunkt; Cyclin B-CDK 1: G2/M-
Kontrollpunkt) (Royer, et al.1999). Die zytotoxische Wirkung von Cisplatin ist nicht
Zellzyklus-Phasen-spezifisch. Aus diesem Grund sprechen Tumorzellen, die sich in
unterschiedlichen Zellzyklus-Phasen befinden, auf das Medikament gut an. Die weitere
Zellantwort hängt von der Art und von der Menge der DNA-Schäden ab. Die Zelle kann
die Schäden durch Reparaturprozesse beheben und weiter in den Zellzyklus eintreten oder
es kommt zur Auslösung von Apoptose oder nekrotischem Zelluntergang.
1.2.3.4 DNA-Reparatur
Die Reparatur geschädigter DNA unterliegt vier Haupt-Reparaturmechanismen:
Nukleotid-Exzision-Reparatur (NER), Basen-Exzisions-Reparatur (BER),
Mismatch-Reparatur (MMR), DSB-Reparatur via Homologer Rekombination (HR)
und/oder non-homologous end-joining (NHEJ). Zwischen den einzelnen Reparatur-
Wegen bestehen Kooperationen und Überschneidungen. Die Cisplatin-induzierten
DNA-Addukte werden zum Großteil durch NER, aber auch weniger aktiv durch
MMR, repariert (Martin, et al.2008). Führen die Cisplatin-induzierten DNA-
Schäden, zum Beispiel an arretierten Replikationsgabeln, zu Doppelstrangbrüchen,
können diese mittels der HR repariert werden, indem das Schwesterchromatid als
Synthesevorlage verwendet wird (Smith, et al.2010).
Nukleotid-Exzisions-Reparatur (NER)
An dem komplexen Reparaturprozess der Nukleotid-Exzisions-Reparatur sind über
30 Proteinkomponenten beteiligt. Die NER-Komponenten ERCC1, XPC, XPB und
XPA spielen hier eine wichtige Rolle (Gillet, et al.2006). NER umfasst einen
Transkriptions-unabhängigen, global-genomischen (GG-NER) und einen
Transkriptions-gekoppelten (TC-NER) Reparaturweg. GG-NER behebt DNA-
Schäden in transkriptionsinaktiven Bereichen der DNA, während die TC-NER
Schäden in der aktuell transkribierten DNA repariert. Dadurch unterscheiden sich die
13
Reparaturwege in der Erkennung des DNA-Schadens, während die weiteren Prozesse
wie Exzision, Reparatursynthese und Ligation gleich verlaufen. Im weiteren Verlauf
beider Mechanismen kommt es zur Bindung eines Multi-Enzymkomplexes (TFIIH)
an der DNA. Dieser Komplex besteht neben dem Transkriptionsfaktor aus Helikasen
(XPB, XPD) und Endonukleasen (XPG, XPF/ERCC1). Die DNA wird von den
Helikasen an der Schadenstelle entwunden und durch die spezifischen
Endonukleasen (XPG: 3´ - 5 ´; XPF/ERCC1: 5´ - 3´) ein 25-30 Nukleotide langes
Fragment aus der DNA herausgeschnitten. Die Neusynthese wird durch das Protein
PCNA, dem „replication factor C“ (RFC) und den DNA-Polymerasen δ und ε sowie
die Ligation durch die Ligase I koordiniert (Reardon, et al.2005). Der Ausfall
einzelner NER-Komponenten wie ERCC1 steht in einem positiven Zusammenhang
mit dem Ansprechen auf eine Platin-basierten Chemotherapie (Arora, et al.2010,
Dabholkar, et al.1992, Liu, et al.2017).
„Replicative Bypass“
Die Zelle ist mit Hilfe spezieller DNA-Polymerasen dazu in der Lage strukturelle
Schäden in der DNA zu „überlesen“ („replikative Bypass“). Eine funktionelle DNA-
Synthese kann so trotz persistierender DNA-Addukte und der daraus resultierenden
Inhibierung der Polymerasen α, δ und ε stattfinden. Die Zelle kann während der
DNA-Synthese spezielle Trasläsions-Polymerasen (Pol ί, Pol η, Pol κ, REV1, REV3
oder REV7) an die Schadenstellen rekrutieren, um durch eine „trans lesion
synthesis“- Reaktion (TLS) die Fehlstellen auffüllen und das Anhalten der
Replikationsgabeln aufheben (Shachar, et al.2009). Die Transläsions-Polymerasen
arbeiten im Vergleich zu den replikativen Polymerasen weit weniger präzise („error
prone“), können demgegenüber aber Cisplatin-DNA-Addukte tolerieren. Die TLS
kann fehlerfrei und fehlerhaft verlaufen, resultiert jedoch in einem Weiterlaufen des
Zellzyklus. Defekte im MMR-System können ebenfalls zu einer gesteigerten TLS der
Cisplatin-Addukte führen (Vaisman, et al.1998). Eine erhöhte TLS-Aktivität konnte
in Cisplatin-resistenten Zellen beobachtet werden (Mamenta, et al.1994).
14
1.2.3.5 Induktion der Apoptose
Apoptose ist ein von der Zelle regulierter Vorgang und wird als programmierter Zelltod
bezeichnet. Bei, nach Anzahl oder Struktur, irreparablen DNA-Schäden werden die
Zellen durch die Induktion der Apoptose eliminiert. In Energie-abhängigen, molekularen
Prozessen wird die Zelle abgebaut, der Nukleus der Zelle und die DNA werden
fragmentiert und es kommt an der Zellmembran zur Ausbildung von apoptotischen
Vesikeln. Ohne die Freisetzung des Zellinhaltes wird der Zellinhalt in Vesikel verpackt
und diese mit der Zeit von der Zellmembran abgeschnürt. Die Vesikeln werden dann von
Makrophagen phagozytiert und verdaut, um lokale Entzündungsprozesse zu vermeiden
(Poon, et al.2014, Savill, et al.2000).
Abbildung 3: Induktion der Apoptose.
Die Aktivierung der Caspasen-Kaskade kann durch den extrinsischen (1) oder den intrinsischen (2)
Signalweg erfolgen. Vor allem der intrinsische Signalweg wird durch DNA-Schaden induziert (Taylor, et
al.2008).
15
Die Induktion der Apoptose kann durch zwei unterschiedliche Signalwege eingeleitet
werden, dem intrinsischen mitochondrialen Weg und dem extrinsischen Rezeptorweg.
Bei Entwicklungsprozessen, Gewebshomöostase und Immunabwehr wird die Apoptose
durch externe Signale und den extrinsischen Apoptoseweg eingeleitet (Taylor, et
al.2008). Die Aktivierung der intrinsischen Signalkaskade erfolgt durch zelluläre Signale
wie DNA-Schäden, Hypoxie oder fehlerhafte Zellzyklusprogression. Dadurch kommt es
zur Akkumulation des p53-Proteins, welches die Transkription und Translation der
Schlüsselproteine der Bcl-2 Familie initiiert. Diese lässt sich in Mitglieder mit pro-
apoptotischen (Bax, Bak, Bad, Bcl-XS, Bik, Bid, Bim, Puma und Noxa) und anti-
apoptotischen (Bcl-2,Bcl-XL, Bcl-W, Bfl-1 und Mcl-1) Funktion einteilen (Shamas-Din,
et al.2011). Es kommt zu einer Überexpression von pro-apoptotischen Proteinen, welche
die Multidomänen-Proteine Bax oder Bak aktivieren und deren nachfolgender
Translokation an die Mitochondrien-Membran. Dadurch wird die anti-apoptotische
Funktion des Bcl-2 Proteins unterdrückt, die mitochondriale Membran permeabilisiert
und Cytochrom C freigesetzt. Im Zytosol bindet das Cytochrom C an APAF1, es kommt
zur Ausbildung von Apoptosomen und zur Aktivierung einer Caspasen-Kaskade (Wang,
et al.2005). Die Caspasen leiten durch Spaltung spezifischer Zielproteine die Apoptose
ein.
Welche Art des Zelltodes durch Cisplatin induziert wird, ist konzentrationsabhängig. Der
nekrotische Zelluntergang kann von der Zelle nicht beeinflusst werden. Während bei
hohen Konzentrationen (~800 µM) eine Zelle innerhalb von wenigen Stunden der
Nekrose unterliegt, wird bei einer kontinuierlichen Gabe von Cisplatin in geringen
Konzentrationen (~8 µM) in der Regel die Apoptose eingeleitet [187].
1.3 Limitierenden Faktoren einer Cisplatin-basierten Tumortherapie
Für die Bestimmung der zu verabreichenden Dosis eines Tumortherapeutikums wird auf
das Modell des „Therapeutischen Fensters“ zurückgegriffen. Dieses liefert für die zu
behandelnde Tumorart und die entsprechend gewählte Therapieform Richtwerte, die aus
internationalen Studien entstanden sind. Der Bereich zwischen der minimalen
therapeutischen und der minimalen toxischen Plasmakonzentration des Therapeutikums
wird als therapeutische Breite bezeichnet. Diese gibt Auskunft über die
Anwendungssicherheit eines Medikamentes durch das Verhältnis von Wirksamer
16
Dosierung (ED50: mittlere effektive Dosis, bei der bei 50 % der Individuen der erwünschte
therapeutische Effekt auftritt) und tödlicher Dosierung (LD50: mittlere letale Dosis, bei
der 50 % der behandelten Individuen sterben). Je höher der Quotient LD50/ED50 ist, desto
sicherer ist das Medikament in seiner Anwendung. Die therapeutische Effizienz der
Platinmedikamente hängt einerseits vom Ausmaß der DNA-Schädigung in den
Tumorzellen ab, aber auch von Bildung und Persistenz dieser Schäden in den gesunden
Körperzellen. Das therapeutische Fenster, beziehungsweise die klinische Anwendbarkeit
von Cisplatin, wird durch die hohe, Zelltyp-spezifische Toxizität in kritischen
Normalgeweben sowie durch die systemische Toxizität auf den Gesamtorganismus
deutlich eingeschränkt. Besonders kritisch wirkt sich dies beim Auftreten von Platin-
Resistenzen bei den Tumorzellen aus. Bei den verschiedenen Strategien zur Modulation
der Resistenzmechanismen liegt die besondere Herausforderung darin, solche Ansätze zu
wählen, durch die gezielt die Tumorzellen und nicht im gleichen Maße auch die
physiologischen Zellen von der durch Modulation erhöhten Zytotoxizität betroffen
werden (Siewert, et al.2010).
1.3.1 Systemische Toxizität
Die während einer Chemotherapie auftretende Kachexie (pathologischer
Gewichtsverlust) stellt eine therapeutische Herausforderung dar und ist eng assoziiert mit
einer Einschränkung der Lebensqualität, der Prognose und ist für die erhöhte Morbidität
und Mortalität der Tumorpatienten verantwortlich. Bei einer Chemotherapie-assoziierten
Anorexie (Appetitlosigkeit) kommt es durch Übelkeit, Veränderung der
Geschmacksempfindung und Appetitlosigkeit zu einer Reduktion der Nahrungsaufnahme
(Bachmann, et al.2008). Für die Steuerung und Auslösung des Erbrechens ist das
Brechzentrum im verlängerten Rückenmark verantwortlich. Dort erfolgt die Auswertung
von Informationen aus dem Magen-Darm-Trakt, dem Gleichgewichtsorgan, dem
Kleinhirn sowie höheren Hirnzentren mit einer Reaktion nach dem Alles oder nichts
Prinzip (Avoxa – Mediengruppe Deutscher Apotheker GmbH). Von allen Platin-haltigen
Präparaten besitzt Cisplatin das stärkste emetogene Potenzial. Durch die resultierende
Mangelernährung kommt es häufig zum Gewichtsverlust und der Entwicklung der
Kachexie. Zusätzlich kommt es bei manchen Tumoren durch Freisetzung von endogenen
Transmittern oder anderer Zellprodukte zur Tumorkachexie wodurch der Verlust an Fett-
und Muskelmasse verstärkt wird (Dodson, et al.2011, Ockenga, et al.2002). Die
17
Tumorkachexie tritt bei mehr als 70 % der Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren auf
und ist bei mindestens 30 % der Tumorpatienten als Co-Mortalitätsfaktor anzusehen (Del
Fabbro2015). Der als „Cancer Anorexia-Cachexia Syndrome“ (CACS) (Bennani-Baiti,
et al.2009) bezeichnete Zustand stellt einen Therapie-limitierenden Faktor dar, wodurch
die zu verabreichende Cisplatin-Dosis limitiert wird und in einigen Fällen für einen
vorzeitigen Abbruch der Chemotherapie sorgt. Ähnliche Symptome wurden auch bei
einer Mehrfachbehandlung von Mäusen oder Ratten mit höherdosiertem Cisplatin
beobachtet (Alves, et al.2017, Damrauer, et al.2008). Als Prophylaxe von Zytostatika-
induzierten Nebenwirkungen wie Nausea (Übelkeit) und Emesis (Erbrechen) werden
therapiebegleitend Antiemetika wie Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Kortikosteroide,
5-HT3-Rezeptor-Antagonisten (Setrone), NK-1-Rezeptor-Antagonisten,
Anticholinergika, Benzodiazepine und H1-Antihistaminika eingesetzt. Zur Zeit sind
jedoch wenige Therapieansätze vorhanden, die eine nachhaltige Stabilisierung des
Körpergewichts im Krankheitsverlauf bewirken (Bachmann, et al.2008). In der
Erstlinien-Therapie zur antiemetischen Prophylaxe von Zytostatika-induzierten Nausea
und Emesis spielen aktuell die Substanzklassen 5-HT3-Rezeptor-Antagonisten, NK-1-
Rezeptor-Antagonisten und die Kortikosteroide eine Rolle (Schmitt, et al.2010).
1.3.2 Organ-/Zelltyp-spezifische Toxizität
Daneben treten beim Einsatz von Platin-haltigen Medikamenten häufig weitere schwere
Nebenwirkungen auf. Das Ausmaß der Adduktbildung in der DNA ist Gewebe- bzw.
Zell-Typ-spezifisch (Krüger, et al.2015, Liedert, et al.2006). Es ist abhängig von diversen
Prozessen wie Bioverteilung des Wirkstoffes, Zell-Typ abhängige Transportvorgängen,
Hydrolyse-Reaktion der inaktiven Cisplatin-Form in die reaktive Form,
zytoplasmatischen Detoxifizierungs-Reaktion und von der zellulären DNA-
Reparaturkapazität. Die in den ersten Anwendungsjahren nach Zulassung stark
ausgeprägte akute und kumulative Nephrotoxizität (ca. 2 Wochen nach Therapiebeginn)
lässt sich mittlerweile durch forcierte Hydratisierung und Diurese verringern. Trotzdem
treten bei 15 – 30 % der Patienten glomeruläre und tubuläre Schäden auf, die durch
funktionelle Beeinträchtigungen der Niere zu Protein- und Glukosurie, zum Anstieg von
Harnstoff- und Kreatinkonzentration im Blut, zu Hypokaliämie und- calciämie und
dadurch zu einem akuten Nierenversagen führen können (Ciarimboli2014). Die
Nephrotoxizität gehört zu den irreversiblen Nebenwirkungen von Cisplatin und auch nach
18
Beendigung der Therapie bleiben einige Patienten Dialyse-abhängig. Weiter kommt es
durch wiederholte Gabe von Cisplatin zu einer Schädigung der sensorischen
Dorsalganglien (DRG) des peripheren Nervensystems (Dzagnidze, et al.2007).
Polyneuropathischen Sensibilitätsstörungen mit Parästhesien, afferenten Ataxien,
Areflexien und Paresen sind die typischen Merkmale der Neurotoxizität. Bei etwa 30 –
50 % der Patienten bleiben auch nach Ende oder Abbruch der Behandlung irreversible
Schäden im peripheren Nervensystem. Eine weitere dosislimitierende Nebenwirkung ist
die Cisplatin-induzierte Schädigung des Hörvermögens, die Ototoxizität. Die
Hörschädigung erstreckt sich überwiegend auf einen Verlust der Wahrnehmung im
Bereich hoher Frequenzen (über 4000 – 8000 Hz). In ca. 10 – 15 % der Fälle wird jedoch
auch der normale Hörfrequenzbereich (250 – 2000 Hz) beeinträchtigt. Der irreversible
Hörverlust ist besonders stark bei Kindern (Behandlung des Neuroblastom) und älteren
Patienten ausgeprägt (65 – 80%) (Rote Liste Service GmbH).
1.3.3 Primäre und sekundäre Resistenz
Die primäre (inhärente Resistenz) oder sekundäre Resistenz (indizierte Resistenz)
maligner Zellen gegenüber Zytostatika stellt ein großes Problem in der onkologischen
Klinik dar. Die primäre Resistenz ist bereits vor Beginn der Therapie in der Tumorzelle
angelegt. Die molekulare Ursache ist oft nicht klar erfassbar, da sie den Mutationen
zugeordnet wird, die auch zur Entstehung des Tumors führten. Die Entwicklung des
sekundären Resistenzphänotyps erfolgt, oft nach anfänglich gutem Ansprechen auf die
Chemotherapie, unter dem Druck wiederholter Zytostatika-Konzentrationen, die nicht für
die Gesamtpopulation an Tumorzellen tödlich sind (Bsp.: Ovarialkarzinom) (Reed, et
al.1993, Stöltin2015). Diese Art der Resistenz beruht auf der Selektion von Tumorzellen
mit verringerter Cisplatin-Empfindlichkeit und wird durch die genetische Instabilität und
die mutagene Eigenschaft (Induktion von resistenzbegünstigenden Mutationen) von
Cisplatin begünstigt. Diese Tumorzellen, welche im akuten Behandlungszyklus nicht
abgetötet werden, erfahren lediglich einen transienten Zellzyklusarrest und können im
Körper persistieren. Nach einer gewissen Zeit kann die Neubildung eines schließlich
aggressiveren und gegenüber Cisplatin refraktären Rezidivtumors erfolgen. Cisplatin-
unempfindliche Tumore sind aufgrund der Kreuzresistenz (Lebwohl, et al.1998) in der
Regel auch Carboplatin-resistent und begrenzen den Erfolg einer Platin-basierten
Therapie (Trimmer, et al.1999). Die klinische Resistenz gegenüber Cisplatin unterliegt
19
häufig multifaktoriellen Mechanismen, die die Empfindlichkeit eines Tumorzellklons
gegen das Medikament herabsetzen. Häufig findet man eine quantitativ oder qualitativ
veränderte Expression zellulärer Proteine, die Reaktionspartner der Zytostatika sind
(Oberdisse, et al.2002, Stöltin2015).
1.3.3.1 Mechanismen der Resistenzentstehung
Die Chemoresistenz ist auf molekular-pharmakologischer Ebene stein sehr komplexer
Vorgang, zu dessen Entwicklung mehrere Mechanismen beitragen können. Einen guten
Überblick über die Resistenzmechanismen bei Cisplatin-Behandlung liefert die
Klassifizierung nach Galluzzi et al. Die Einteilung erfolgt in Mechanismen, i) die vor der
Bindung von Cisplatin an die DNA wirksam sind (pre-target), ii) die im Zusammenhang
mit den Cisplatin-DNA Addukten greifen (on-target), iii) die die letalen Signalwege
betreffen, welche durch die DNA-Schäden aktiviert werden (post-target) und iv) die
andere physiologischen Vorgänge regulieren (off-target).
20
Abbildung 4: Molekulare Mechanismen der Cisplatin-Resistenz:
Veränderungen von Mechanismen durch die eine maligne Zelle ihre Sensitivität gegenüber der
zytotoxischen Wirkung von Cisplatin verlieren kann sind i) Prozesse die der Bindung von Cisplatin an die
DNA vorausgehen (pre-target), ii) Prozesse die im Zusammenhang mit den Cisplatin-DNA-Addukten
stehen (on-target), iii) Prozesse der letalen Signalwege, die durch den DNA-Schaden aktiviert werden
(post-target) und iv) Prozesse die physiologische Vorgänge der Zelle regulieren (off-target) (Galluzzi, et
al.2014).
Pre-target Resistenz und die Rolle von Transportern
Pre-target Resistenz beinhaltet alle Veränderungen der Zelle, die sich auf die
intrazelluläre Cisplatin-Konzentration zugunsten einer geringeren Akkumulation
auswirken. Für die Zytotoxizität ist der intrazelluläre Anteil an Cisplatin, welches für die
Bindung an Zielstrukturen zur Verfügung steht, ausschlaggebend (Loh, et al.1992,
Stöltin2015). Der intrazelluläre Cisplatin-Gehalt wird zum größten Teil durch das
Gleichgewicht von Wirkstoffimport und -export bestimmt. Die Reduktion der
intrazellulären Akkumulation von Cisplatin kann aufgrund einer Veränderung folgender
Mechanismen zustande kommen:
21
Verminderter Import: Die Cisplatin-Aufnahme kann vermittelt werden durch: i) passive
Diffusion; ii) Na+ K+-ATPase Pumpen; iii) Endozytose; iv) organische
Kationentransporter (OCT 1-3); v) Kupfer-Transporter CTR1 (Ciarimboli, et al.2010)
und CTR2 (Holzer, et al.2004).
Verstärkter Export: Umgekehrt können am Cisplatin-Efflux aus der Zelle folgende
Faktoren beteiligt sein: i) Melanosom; ii) ATP7B-abhängige Vesikel; iii) ATP7A/B
Proteine; iv) MRP 1-5 Proteine (Hall, et al.2008, Wen, et al.2014).
Erhöhte Detoxifikation: Nach der Bioaktivierung kann Cisplatin mit Gluthation (GSH)
oder anderen Metallothioneinen reagieren und somit für eine Reaktion mit DNA
inaktiviert werden. Die Katalyse der Sequestrierung erfolgt durch GSTπ, deren
Überexpression zur Resistenz führen könnte (Rolland, et al.2010).
On-target Resistenz
Als on-target Resistenz können Veränderungen in Cisplatin-induzierten Vorgängen
bezeichnet werden, bei denen trotz stattgefundener Bindung von Cisplatin an die DNA
eine Weiterleitung der DNA-Schadensignale ausbleibt (Stöltin2015). Folgende
Mechanismen werden in der Literatur beschrieben: Eine gesteigerte DNA-Reparatur
(über NER) aufgrund von ERCC1 Überexpression (Li, et al.2000) oder über HR durch
veränderte BRCA1- und BRCA2-Gene (Venkitaraman2014) sowie eine Fehlfunktion von
Polymerasen (POLH, REV3/REV7) mit gesteigerter Sensitivität für die Schadenstellen
(Roos, et al.2009). Des Weiteren kann der Cisplatin-induzierter Schaden weitestgehend
durch kompensatorische Reparaturmechanismen wiederhergestellt werden, wodurch
apoptotische Signale ausbleiben. Zusätzlich kann trotz fortschreitender Platinierung einer
Weiterleitung apoptotischer Signale an Apoptoseregulatoren wie p53 durch eine
Veränderung des MMR-Komplexes (Mutationen in MLH1 und MSH2) unterbunden
werden (Wu, et al.2008). Eine Bindung von Cisplatin an das Protein VDAC1 kann zu
einer Permeabilitätsveränderung der Mitochondrien auslösen (Yang, et al.2006).
Post-target Resistenz
Als post-target Resistenz können Veränderungen der Zelle bezeichnet werden, die
nach der Cisplatin-DNA-Adduktbildung und nach Initiation der Apoptose zu erhöhter
Cisplatintoleranz führen. Diese Mechanismen sind gekoppelt mit dem Ablauf der
22
intrinsischen und extrinsischen Apoptose und beschreiben Prozesse wie: Modulation
der Signaltransduktionen (p53, Bax, BAK, Bcl-2 oder Bcl-xL) (Stöltin2015),
Veränderung von Caspasen (Caspase 8/9) (Wang, et al.2006) oder Inhibition der
Apoptosekaskade (Obexer, et al.2014), durch die trotz Erkennung des DNA-Schaden
keine weitere Konsequenzen resultieren (Delbridge, et al.2015, Metzinger, et
al.2006, Righetti, et al.1996).
Off-target Resistenz
Als off-target Resistenz werden Veränderungen in kompensatorischen alternativen
Signalwegen bezeichnet, die ausgleichende physiologische Vorgänge wie das
Zellwachstum (Calikusu, et al.2009) und Überleben der Zelle regulieren (Galluzzi,
et al.2012).
1.4 Vorarbeiten
Die Cisplatin-induzierten Intrastrang 1,2-Pt-(GpG)- und 1,2-Pt(GpA)-Addukte, die für
den Funktionsverlust der Zellen verantwortlich gemacht werden, können mit Hilfe eines
in der Arbeitsgruppe entwickelten immunzytologischen Nachweisverfahrens (ICA, siehe
3.10.8) visualisiert und quantifiziert werden (Liedert, et al.2006, Ruhe2017). Durch
vorausgegangene Untersuchungen der Nebenwirkungs-sensitiven Organe Niere, DRG
und Cochlea von Cisplatin-behandelten Nagern (Maus, Ratte, Meerschweinchen),
konnten so die Cisplatin-empfindlichen Zielzellen in den aufgelisteten Organen
identifiziert werden (Dzagnidze, et al.2007, Thomas, et al.2006). Dabei konnte jeweils
ein stark erhöhter Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA der Marginalzellen der Stria
Vascularis, der äußeren Haarzellen des Corti-Organs, der proximalen Tubulus-Zellen der
Niere (Krüger, et al.2015, MendusNovember 2010) und der Zellen der Spinalganglien
(DRG) nachgewiesen werden (MelnikovaFebruar 2014). Ein Zusammenhang zwischen
der Menge an Cisplatin-induzierten DNA-Schadens und des Schweregrades des
Funktionsverlustes dieser Zellen konnte von (Dzagnidze, et al.2007)durch die Analyse
von Platin-Addukten in einer Reparatur-defizienten Maus hergestellt werden. Ein hoher
DNA-Platinierungsgrad in den sensitiven physiologischen Zellen ist demnach
höchstwahrscheinlich der initiale Trigger für den Funktionsverlust dieser Zellen mit der
Folge von teilweise irreversiblen Nebenwirkungen wie Nierenversagen, Polyneuropathie
und Hörverlust. Nach einer intensiven Literaturrecherche, mit dem Ziel der Entwicklung
23
einer pharmakologisch-präventiven Maßnahme zum Schutz der physiologischen Zellen,
wurde mit Hilfe von in vivo Substanzscreening ein Modulator (Diphenhydramin: DO7,
siehe Tabelle 7) identifiziert. Die kombinatorische Anwendung von DO7 mit einer
Cisplatin-Behandlung von Mäusen reduziert drastisch den hohen DNA-Adduktgehalt in
den identifizierten sensitiven Zellen (Marginal-Zellen der Stria Vascularis, sowie den
äußeren Haarzellen des Corti-Organs und den proximalen Tubulus-Zellen der Niere). Ein
funktioneller Hörtest bei Mäusen nach einer Kombinationsbehandlung mit Cisplatin plus
DO7 zeigte neben der reduzierten DNA-Platinierung im Innenohr auch eine
Schutzwirkung auf die Hörkapazität der Tiere. Zusätzlich wurde in einem Mausmodell
mit primärem Lungenkarzinom gezeigt, dass der Modulator DO7 die therapeutische
Effizienz von Cisplatin auf die Tumorzellen nicht negativ beeinflusst (MendusNovember
2010). In fortführenden Experimenten wurden zwei Derivate von Diphenhydramin,
Orphenadrin (DO8, siehe Tabelle 7) und 2-[(2,6-Dimethylphenyl)-(Phenyl)Methoxy]-
N,N-Dimethylethanamin Hydro-chloride (DO9, siehe Tabelle 7) ebenfalls erfolgreich
bezüglich ihrer schützenden Wirkung auf die empfindlichen physiologischen Zellen in
der Maus getestet (MelnikovaFebruar 2014). Beide Substanzen reduzieren bei Ko-
Applikation den starken Platin-Adduktgehalt in der Kern-DNA der proximalen Tubulus-
Zellen der Niere, sowie in den Marginal-Zellen der Cochlea und den äußeren Haarzellen
des Corti-Organs. Zusätzlich wurden für den Modulator DO9 eine reduktive Wirkung auf
die DNA-Adduktierung in den Zellen des Spinalganglions (DRG) nachgewiesen. Um
einen negativen Effekt auf die antineoplastische Aktivität auszuschließen, wurden alle
drei DO-Modulatoren bezüglich ihrer Wirkung auf den Cisplatin-induzierten DNA-
Adduktgehalt in Tumor-Zelllinien unterschiedlicher Entitäten (Neuroblastom,
Lungenkarzinom, Hodenkarzinom, Mammakarzinom und Prostatakarzinom) untersucht.
Die Vorinkubation der jeweiligen Zelllinien mit den DO-Modulatoren hatte in keinem
Fall einen negativen Effekt auf den DNA-Adduktgehalt der Zellen. Bei den meisten
Zelllinien wurde in der DNA sogar ein erhöhter DNA-Adduktspiegel gemessen
(MelnikovaOktober 2013, MelnikovaFebruar 2014)
24
1.5 Systemischer Ansatz mit primären Tumorzellen
Humane Tumor-Zelllinien werden in vielen verschiedenen Forschungsgebieten für die
Untersuchung von Mechanismen als Modellsysteme für unterschiedliche Fragestellungen
zu Tumorerkrankungen verwendet. Diese Experimente stellen den Anfang einer
experimentellen Kette dar und liefern wertvolle Erkenntnisse. Solche Zelllinien werden
aus dem Tumorgewebe von Patienten etabliert und sind in der Lage unter geeigneten
Bedingungen im Labor dauerhaft kultiviert zu werden. Durch die Verfügbarkeit einer
hohen Zahl einigermaßen homogener Tumorzellen können Kultivier- und
Versuchsbedingungen standardisiert werden. Die Zellen besitzen noch bestimmte
charakteristische Eigenschaften des Ausgangsgewebes und können, zumindest
eingeschränkt, als Modell für die jeweilige Tumorentität verwendet werden. Der Nachteil
einer langen Kultivierung von Tumor-Zelllinien, aber auch von primären Zellkulturen, ist
die Veränderung von charakteristischen Eigenschaften des Primärtumors aufgrund der
bekannten genomischen Instabilität. Das Interesse der Krebsforschung richtet sich
zunehmend auf Therapien, die für jeden Patienten individuell zugeschnitten sind. Dabei
geht es u.a. um gezielte Modulationen von pre-, on-, post- und off-target Prozessen der
Zelle. Eine pharmakologische Beeinflussung dieser Mechanismen ist jedoch in der Regel
problematisch, da viele der beteiligten Komponenten auch an anderen
Stoffwechselwegen und Signalkaskaden beteiligt sind und somit mit schweren und
unerwarteten Nebenwirkungen zu rechnen ist. Für die Entwicklung individueller
Therapieansätze haben die Zelllinien jedoch den entscheidenden Nachteil, dass diese
nicht unbedingt die in vivo Situation des Primärtumors wiederspiegeln und die daraus
resultierenden Erkenntnisse nur bedingt auf die Situation im Patienten übertragbar sind.
Denn den „typischen“ Krebs gibt es nicht, jede Tumorart und der Krankheitsverlauf bei
jedem Patienten ist anders. Die bisher an den humanen Zelllinien erhobenen Befunde zur
Wirkung der DO-Modulatoren müssen demnach auf ihre Relevanz für klinische
Fragestellungen überprüft werden, indem das etablierte mehrstufige Analyseverfahren für
Platin-DNA-Addukte auf frisch isolierte primäre menschliche Tumorzellen angewendet
wird. Das humane seröse Ovarialkarzinom (OVK) wäre aufgrund der Zugänglichkeit zu
primärem Tumormaterial aus der initialen Operation und der Möglichkeit, relativ große
Mengen an vitalen Tumorzellen aus dem Aszites zu isolieren, ein dafür gut geeignetes
experimentelles System.
25
1.6 Das Ovarialkarzinom
Beim Ovarialkarzinom handelt es sich um eine maligne Entartung der Eierstöcke. Es ist
die fünfthäufigste Krebserkrankung der Frau und in Deutschland mit derzeit ungefähr
7200 Neuerkrankungen und 5300 Todesfällen pro Jahr das zweithäufigste
gynäkologische Malignom (Robert Koch-Institut (RKI)2016). Laut der Statistik des
Robert Koch-Instituts erkrankt eine von 71 Frauen im Laufe ihres Lebens am
Ovarialkarzinom, wobei mit zunehmenden Alter das Risiko deutlich ansteigt. Zum
Zeitpunkt der Diagnosestellung liegt das mittlere Alter bei 69 Jahren. Das
Ovarialkarzinom wird als „stummes“ Karzinom bezeichnet, da es in der Regel lange Zeit
einen symptomfreien Verlauft aufweist. Aufgrund der fehlenden Frühsymptomatik und
unzureichender Screeningmethoden werden 70 % der Karzinome erst im
fortgeschrittenen Stadium mit Tumorbefall außerhalb des kleinen Beckens (FIGO IIB-
IV) diagnostiziert. In diesen Stadien liegt die 5-Jahresüberlebensrate unter 40 %, während
bei einer Diagnose in den frühen Tumorstadien (FIGO I-IIA) diese mit > 80 % sehr viel
günstiger ist (11.02.2018, Burges, et al.2011). Nur 30 % der Karzinome werden jedoch
in den frühen Stadien erkannt (Fehm, et al.2013). Die Primärtherapie des
fortgeschrittenen Ovarialkarzinoms besteht aus einer Kombination von zytoreduktiver
Chirurgie („Debulking“) mit dem Ziel der maximalen Tumorreduktion und Entfernung
sämtlicher makroskopisch fassbarer Tumorabsiedlungen und anschließender adjuvanten
Platin-Taxan Kombinations-Chemotherapie (Burges, et al.2011). Die initiale
Ansprechrate einer Platin-basierten Chemotherapie liegt bei 70-80 %. Allerdings erleiden
die meisten dieser Patientinnen in den ersten zwei Jahren einen Rückfall mit oft
auftretenden Resistenzen gegen die Standardtherapie. Die Identifizierung von
Tumormarkern zur Früherkennung eines OVK und die Entwicklung von verlässlichen
Screeningverfahren zur Prädiktion des Therapieansprechens steht derzeit im Mittelpunkt
der Forschung.
1.6.1 Klassifizierung und Stadieneinteilung
Der Begriff Ovarialkarzinom umfasst alle malignen Erkrankungen an den Eierstöcken
unterschiedlichen Ursprungs und Heterogenität. Zur Klassifizierung der Tumore werden
Einteilungen der WHO (World Health Organisation) und der UICC (International Union
against Cancer) angewendet. Die Einteilung nach dem Gewebetyp (histologische
26
Klassifikation oder Typing) entsprechend dem Ausgangsgewebe unterscheidet zwischen
13 Tumortypen der Eierstöcke (2014, Buser2002):
Tabelle 1: WHO-Klassifikation: histogenetische Gruppen maligner Ovarialtumore
Oberflächenepithel-Stromatumore (bis 90 %)
serös 46 %
muzinös 36 %
endometroid 8 %
mesonephroid (klarzellig) 3 %
mixed (gemischt epithelial) 3 %
Brenner (Übergangszelltumore) 2 %
undifferenziert 1 %
unklassifiziert 1 %
Keimstrangstromatumore (5 – 8 %)
Keimzelltumore (3 – 5 %)
Gonadoblastom (selten)
Keimzell-Keimstrangstroma-Tumor (selten)
Tumoren des Rete ovarii
Mesotheliale Tumoren
Tumoren unsicherer Histogenese und verschiedene Tumore
Gestationale trophoblastische Erkrankungen
Weichgewebstumoren, nicht ovarspezifisch
Maligne Lymphome, Leukämien und Plasmozytome
Unklassifizierbare Tumore
Metastasen
Den größten Anteil der malignen Eierstockerkrankungen bilden die epithelialen Tumore
(EOC – epithelial ovarian cancer) mit ca. 90 %. (Schmidt-Matthiesen2004). Auf
molekularer Ebene lassen sich die epithelialen Tumore in zwei Kategorien einteilen: Zu
den Typ I-Tumoren gehören die Subtypen low-grade serös, low-grade endometroid,
mesonephroid und muzinös. Dieser genetisch relativ stabile Typ ist charakterisiert durch
spezifische Mutationen (low-grade serös: KRAS, BRAF und ERBB2; low-grade
endometroid: CTNNB1, PTEN und PIK3CA; muzinös: KRAS; mesonephroid: PIK3CA)
und durch eine niedrigere Proliferationsrate (Kurman, et al.2011). Zu den Typ II-
Tumoren gehören die Subtypen high-grade serös, high-grade endometroid, gemischte-
und undifferenzierte Karzinome. Dieser Typ ist genetisch vergleichsweise instabil
(Mutationen in TP53, Inaktivierung von BCRA1/2) und ist durch die hohe
27
Proliferationsrate sehr aggressiv (Ahmed, et al.2010, Senturk, et al.2010). Etwa 50 – 60
% der epithelialen Tumore sind benigne, 10 – 20 % „borderline“ und 30 – 40 % maligne
Tumore (Colombo, et al.2006).
Weiteres wichtiges Einteilungsprinzip maligner Tumore ist die Klassifikation nach dem
Tumorstadium (Staging) auf der Basis der anatomischen Tumorausbreitung (Buser2002).
Die Einteilung basiert auf klinisch-präoperativen, intraoperativ makroskopischen sowie
histologischen und zytopathologischen Befunden. Für gynäkologische Tumoren wird die
Stadieneinteilung der FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics)
angewandt (Buser2002) (siehe Anhang, Tabelle 12).
1.6.2 Prognosefaktoren
Die Prognose von Patientinnen mit Ovarialkarzinom wird durch unabhängige etablierte
klinische Prognosefaktoren bestimmt.
Postoperativer Tumorrest
Bei den fortgeschrittenen Stadien hat sich als stärkster unabhängiger prognostische
Faktor, für das Gesamtüberleben der Patientinnen, das postoperativ verbliebene
Tumorrest ergeben. Patientinnen, die tumorfrei operiert werden können, leben signifikant
länger als Patientinnen mit einem postoperativen Residualtumor (2014). Bei nach einer
radikalen Operation verbliebenem Tumorrest von ≥ 2 cm wird eine 5-
Jahresüberlebensrate von 24,8 %, bei Residualtumoren < 2 cm von 32,9 % erreicht. Bei
makroskopischer Tumorfreiheit von < 2 cm wird eine 5-Jahresüberlebensrate von 63,5 %
erreicht (Du Bois, et al.2009, Heintz, et al.2006).
FIGO-Stadium (Staging)
Das Stadium der Tumorausbreitung bei der Erstdiagnose ist entscheidend für die
Prognose der Patientinnen und hat eine prognostische Bedeutung für das 5-
Jahresüberleben. Patientinnen mit Ovarialkarzinom im Stadium FIGO I haben eine 5-
Jahresüberlebensrate von 80 – 90 %, im Stadium FIGO II von 69 %. Im Stadium FIGO
III liegt die 5-Jahresüberleensrate, abhängig vom postoperativ verbliebenen Tumorrest,
bei 25 – 50 % und im Stadium FIGO IV nur noch 11 – 20 % (2014, Heintz, et al.2006).
28
Alter bei der Erstdiagnose
Ältere Patientinnen haben eine deutlich ungünstigere Prognose beim Auftreten eines
Ovarialkarzinoms als jüngere Patientinnen. Folgende altersabhängige prognostische
Bedeutung besteht für die 5-Jahresüberlebensrate. Im Alter von 40 – 49 Jahren liegt diese
bei 62,1 %, im Alter von 50 – 59 Jahren bei 53,2 %, im Alter von 60 – 69 Jahren bei 44
%, im Alter von 70 – 79 Jahren bei 33,3 % und bei den über 80-jährigen Frauen bei 23 %
(2007, Pfisterer, et al.2002).
Histologie
Für die pathologische Diagnostik spielt die Abgrenzung des Borderline-Tumors von den
invasiven Karzinomen eine entscheidende Rolle. Bezüglich des histologischen Subtyps
weisen in fortgeschrittenen Stadien seröse und endometroide Ovarialkarzinome im
Vergleich zu muzinösen oder klarzelligen OVK eine bessere Prognose auf (2014). Für die
am häufigsten vorkommenden Subtypen der Oberflächenepithel-Stromatumore gelten
folgende 5-Jahresüberlebensraten. Für seröse Karzinome im FIGO-Stadium I/II bzw.
III/IV 83,9 % bzw. 31,9 %, für muzinöse Karzinome 90 % bzw. 31 %, für endometroide
Karzinome 86,5 % bzw. 37 % und für mesonephroide Karzinome 81 % bzw. 23,9 %
(Ferlay, et al.2010).
Differenzirrungsgrad
Tumore der gleichen histologischen Klassifikation können sich stark in ihrem
Differenzierungsgrad, d.h. bezüglich ihrer morphologischen Ähnlichkeit zum
Ausgangsgewebe, unterscheiden. Je differenzierter ein Tumor ist, desto weniger maligne
verhält er sich häufig. Tumore mit raschem Wachstum und hoher Aggressivität sind in
der Regel histologisch schlecht differenziert und werden als „high-grade“ bezeichnet.
Tumor mit einem langsameren Wachstum und geringer Neigung zur Metastasierung sind
in der Regel histologisch durch eine bessere Differenzierung charakterisiert und werden
dementsprechend als „low-grade“ bezeichnet (Buser2002).
Klinischer Allgemeinzustand
Weiterhin ist der körperliche Allgemeinzustand der Patientinnen ein weiterer
prognostischer Faktor. Ein reduzierter präoperativer Allgemeinzustand mit einem
Karnofsky-Index von < 70 % ist mit einer geringeren Überlebenswahrscheinlichkeit und
29
einer Sterbewahrscheinlichkeit von > 70 % korreliert (Omura, et al.1991). Der
Tumormarker CA-125 steht für das Protein Mucin-16 (MUC-16), ein hochmolekulares
Transmembran-Glykoprotein das in erster Linie von serösen Ovarialkarzinomen gebildet
wird. Es wurde gezeigt, dass eine erhöhte präoperative Konzentration des CA-125
Proteins im Serum (Normalbereich 0 – 35 U/mL) eine schlechtere Prognose für
Patientinnen anzeigt und mit einem kürzeren rezidivfreien Intervall und einem geringeren
Gesamtüberleben assoziiert ist. Ein postoperativ persistierender hoher CA-125-Wert
korreliert mit dem Tumorrest und geht bei Anstieg häufig einer klinischen
Tumorprogression voraus (Bachmann, et al.2009).
Aszites
Aszites (pathologische Ansammlung von Gewebswasser im Peritoneum) wird bei
Patientinnen mit Ovarialkarzinom in ca. 22 – 30 % der Fälle beobachtet und ist in der
Regel mit einer Verschlechterung der Prognose assoziiert (Harter, et al.2006). Bei
Patientinnen im FIGO-Stadium I beträgt die 5-Jahresüberlebensrate ohne Aszites 80 %
und mit Aszites 25 %. Im FIGO-Stadium III und IV beträgt diese ohne Aszites 45 % und
mit Aszites 5 % (Harter, et al.2006, Sehouli, et al.2004). Zusätzlich wurde durch Studien
ein kürzeres rezidivfreies und ein deutlich geringeres Gesamtüberleben bei Patientinnen
mit Aszitesvolumen > 500 mL im Vergleich mit Fällen mit Aszitesvolumen < 500 mL
oder mit keinem Aszites gezeigt.
Mit Hilfe neuer molekularbiologischer Techniken lassen sich neben den konventionellen
Prognosefaktoren weitere potentielle tumorbiologische Faktoren identifizieren. In der
Literatur wird die Validität von weiteren Faktoren diskutiert: HER-2-Status, PAI-1
(Plasminogenaktivator Inhibitor), MMP (Metalloproteinase), VEGF (vascular
endothelial growth factor), CD24, COX-2 (Cyklooxygenase 2), p53-
Tumorsuppressorgen, verschiedene Zytokine (IL-6, IL-10, IL-12), DNA-Ploidie und
DNA-Index (Sehouli, et al.2004).
30
1.6.3 Diagnostik
Die wichtigste Früherkennungsmaßnahme heute ist die sorgfältige gynäkologische
Untersuchung. Standarddetektionsmethoden sind Bauchraumabtastungen und vaginale
Sonographie, Spiegelbefund, verbunden mit einer exakten Anamnese. Die
Doppelsonographie kann in Verbindung mi der vaginalen Sonographie additive
Informationen über Benignität bzw. Malignität eines Tumors liefern. Die Treffsicherheit
beim Ultraschall-Screening schwankt jedoch zwischen 44 und 91 % und ist stark
abhängig von der Erfahrung des jeweiligen Gynäkologen (Pfisterer, et al.2002). Aufgrund
der fehlenden Frühsymptome beim OVK und unspezifischer Symptomatik im
fortgeschrittenen Stadium, wird geschätzt, dass ein geübter Gynäkologe nur ein OVK-
Fall in 10.000 asymptotischen Frauen erkennen kann (Jelovac, et al.2011). Der Ca-125-
Wert ist im Serum bei 80 % der OVK-Patientinnen im fortgeschrittenen Stadium erhöht,
in einem frühen Stadium (FIGO I) jedoch nur bei 50 % (Colombo, et al.2006). In einer
Studie konnte beobachtet werden, dass durch die regelmäßige Messung des CA-125-
Spiegels im Serum, kombiniert mit Ultraschaluntersuchungen die Mortalitätsrate
reduziert werden kann (Jacobs, et al.2016). Erhöhte CA-125 Werte werden jedoch auch
bei anderen Erkrankungen (Infektionskrankheiten, Pankreatitis, Peritonitis, Leberzirrhose
und in der Schwangerschaft) beobachtet, wodurch die Spezifität des Tumormarkers
gesenkt und die Sensitivität als nicht ausreichend angesehen wird um das Screening-
Verfahren bei gesunden und/oder genetisch prädisponierten Frauen allgemein zu
empfehlen. Der Einsatz von CA-125 wird jedoch zum Therapiemonitoring bei der
systemischen Chemotherapie eingesetzt (Sehouli, et al.2004). Die endgültige Diagnose
und die Klassifizierung des Tumors kann nach jetzigen Stand der Technik erst zum
Zeitpunkt einer Operation erfolgen.
1.6.4 Therapie
Die Therapie des Ovarialkarzinoms beruht auf zwei Säulen. Der erste Schritt ist eine
zytoreduktive Chirurgie („Debulking“) mit dem Ziel der maximalen Tumorreduktion und
Entfernung sämtlicher makroskopisch fassbarer Tumorabsiedlungen. Der zweite Schritt
basiert auf einer adjuvanten Platin – Taxan Kombinations-Chemotherapie um die
möglicherweise vorhandenen Mikrometastasen zu erfassen und somit die
Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs zu reduzieren. Das Zytostatikum Cisplatin wurde 1977
31
für die Behandlung von OVK eingeführt, wurde jedoch aufgrund der Äquieffektivität und
besserer Verträglichkeit durch das weniger nephrotoxische Carboplatin ersetzt
(Harrap1985). Die heutige systemische Standardtherapie beim Ovarialkarzinom besteht
in der Applikation von Carboplatin und Paclitaxel (6 Zyklen mit jeweils dreiwöchigem
Intervall). Die initiale Ansprechrate auf die first-line Therapie liegt bei 70 – 80 %.
Allerdings erleiden die meisten dieser Patientinnen (ca. 80 %) innerhalb der ersten zwei
Jahre einen Rückfall, oft mit auftretenden Resistenzen gegen die Standardtherapie
(Anastasi, et al.2010). Die Strategie der second-line Therapie der Rezidive ist abhängig
vom Phänotyp des Tumors. Entscheidend ist der Zeitraum vom letzten Zyklus der
Standardtherapie bis zur Progression der Krankheit. Als Platin-sensitiv gelten die
Tumore, bei denen das Rezidiv-freie Intervall länger als 6 Monate ist. Diese werden mit
einer Kombination aus Carboplatin mit Gemcitabin, Paclitaxel oder Doxorubicin
behandelt. Tritt ein Rezidiv innerhalb von 6 Monaten auf, werden die Tumore als Platin-
refraktär eingestuft und haben in der Regel eine schlechte Prognose. Die Behandlung
solcher Tumore erfolgt mit Doxorubicin, Topotecan, Gemcitabin oder Paclitaxel
(Pfisterer, et al.2002).
Neue Strategien und neue Substanzen zeigten in präklinischen und klinischen Studien
ihre Wirksamkeit und werden mittlerweile klinisch eingesetzt. Dazu zählen PARP-
Inhibitoren wie Olaparib, die eine hemmende Wirkung auf die DNA-Reparatur aufweisen
(Olaussen, et al.2013). Dieser Inhibitor wird zusätzlich zur Standardtherapie bei Platin-
sensitiven, rezidivierenden, hochgradigen, serösen OVK mit BRCA-Mutation eingesetzt
und kann das progressionsfreie Überleben verlängern (Audeh, et al.2010, Hennessy, et
al.2010, Ledermann, et al.2014). Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem anti-VEGF-
Antikörper Bevacizumab erzielt, der sowohl in der first-line- als auch second-line-
Therapie eingesetzt wird (Perren, et al.2011). Neue Studiendaten zeigten, dass
Patientinnen mit Erstdiagnose oder auch bei einem Rezidiv von der Kombination aus
einer Operation und einer intraperitonealen Platin-Hochdosis-Hyperthermie-Behandlung
(HIPEC) profitieren. Dabei wird die Chemotherapie intraoperativ nach der Resektion der
befallenen Anteile des Peritoneums, mit einer Temperatur der Cisplatinlösung von 43 –
44 °C, durchgeführt (Keyver-Paik, et al.2015, van Driel, et al.2018, Zivanovic, et
al.2015).
32
2 Zielsetzung
Für die meisten soliden Malignome gibt es bisher keine etablierten prädiktiven und
prognostischen Marker, die frühzeitige Aussagen über das klinische Ansprechen auf
bestimmte Therapieschema erlauben und ein „Verlaufsmonitoring“ ermöglichen. Die
häufig auftretenden primären oder sekundären Resistenzen werden in der Regel erst in
späten Behandlungsphasen festgestellt und kosten die PatientInnen wertvolle Zeit.
Auf der Basis des derzeitigen Wissensstandes zu den Wirkmechanismen von Platin-
basierten Zytostatika sollen in dieser Arbeit neue Erkenntnisse über Bildung und
Persistenz von Platin-DNA-Addukten in Tumorzellen sowie in physiologischem
Normalgewebe erarbeitet werden. Als analytisches Werkzeug soll dafür hauptsächlich
ein immunhistochemisches Nachweisverfahren (ICA) eingesetzt werden, das die
quantitative Messung von Cisplatin-induzierten Pt-(GpG)-Addukten auf dem Niveau
einzelner Zellkerne ermöglicht.
Für die Entwicklung einer individuellen prädiktiven Analytik aus ex vivo-
Untersuchungen soll getestet werden, ob primäre Tumorzellen als Indikatorzellen für eine
Aussage über die Chemosensitivität genutzt werden können. Als Tumormodell wurde das
seröse Ovarialkarzinom ausgewählt, da hierbei Platin-Komplexe in der Erstlinien-
Chemotherapie eine zentrale Rolle spielen und vitale Tumorzellen außer aus frischem
OP-Material und häufig auch aus dem Aszites gewonnen werden können. Anhand von
Untersuchungen an ex vivo-exponierten Tumorzellen aus unterschiedlichen
Biopsieproben sollen folgende Fragen geklärt werden:
Unterscheiden sich die DNA-Adduktkinetiken in Tumorzellen des soliden
Primärtumors und solchen aus dem Aszites? Inwieweit repräsentieren die
Adduktmuster in Tumorzellen aus Aszites die des primären Tumors in situ?
Wie groß ist die Varianz der DNA-Platinierung innerhalb einer untersuchten
Tumorzellpopulation aus dem Primarius oder aus dem Aszites? (Hinweise auf
Selektion einer ortsmobilen Subpopulation oder eines Resistenzphänotyps)
Korrelieren bestimmte aus den DNA-Adduktkinetiken abgeleitete Parameter mit
dem klinischen Ansprechen der Patientinnen (maximale Adduktbildung,
Reparaturrate) und können diese damit ggf. als Prädiktoren genutzt werden?
33
Erhöhen die bisher an OVK-Zelllinien untersuchten DO-Modulatoren auch bei
primären Tumorzellen den DNA-Adduktgehalt nach Cisplatin-Behandlung?
Des Weiteren soll untersucht werden, ob spezielle Zelltypen in den Dorsalganglien
(DRG) bei Ratten mögliche Zielstrukturen für eine Cisplatin-induzierte, funktionelle
Schädigung des peripheren Nervensystems sind und wie sich DO-Modulatoren auf das
Gesamtsystem in der Maus auswirken.
34
3 Materialien und Methoden
3.1 Material
Tabelle 2: Verwendete Materialien
Materialien Hersteller
6-Well-Zellkulturplatten Sigma Aldrich
Cell-Strainer (70 µm) BD Falcon
Easy Grip Tissue Culture Dish BD Falcon™
Eindeckgläschen Roth
FACS Röhrchen BD Falcon™
Objektträger SuperFrost® Plus GOLD Thermo Scientific
Zellkulturflaschen (T25-T175) Cellstar
Zentrifugenröhrchen 15-50 mL Greiner Bio-One
3.2 Geräte
Tabelle 3: Verwendete Geräte
Bezeichnung Hersteller
Axioplan Fluoreszenzmikroskop Carl Zeiss AG, Oberkochen
CO2-Inkubator C200 Labotect
FACS FACSCalibur 750
Fluoreszenz-Mikroskop HS BZ-9000 Keyence
Kryostat Leica CM 1850 UV Thermo Scientific
35
pH-Meter Mettler-Toledo
Potter Homogenisator B.BRAUN
Sterilbank Bio-Flow Technick
TANGO Desktop Scanning-Tisch System Märzhäuser, Wetzlar
Tischzentrifuge 5415D Eppendorf
Zentrifuge Rotina 48 Hettich Lab Technology
3.3 Chemikalien und Enzyme
Tabelle 4: Verwendete Chemikalien und Enzyme
Bezeichnung Hersteller
BSA (bovine serum albumin) Sigma Aldrich
Kollagenase A usb
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol) Roche
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare
Fötales Kälberserum (FCS) PAA
Glycine Merck
Immunoselect Antifading Mounting Medium Squarix Biotechnology
Methanol Fluka
Penicillin/Streptomycin PAA
Pepsin ThermoFisher
Propidiumiodid (PI) (5 mg/mL) Thermo Fisher
36
Proteinase K ThermoFisher
RNase-A (100 mg/mL) Sigma Aldrich
Skim Milk Powder Roth
Tris-Base Sigma Aldrich
Trypsin/EDTA Sigma Aldrich
Tween 20 Merck
Alle weiteren verwendeten Chemikalien wiesen mindestens den Reinheitsgrad „p.a.“ auf
und wurden, sofern nicht in Tabelle 4 aufgeführt, von den einschlägigen Lieferanten
Merck, Roth oder Sigma-Aldrich bezogen.
3.4 Puffer und Lösungen
Tabelle 5: Verwendete Puffer und Lösungen
Puffer/Lösungen Zusammensetzung / Hersteller
Lösungen für ICA
Alkali Solution 70 mM NaOH
140 mM NaCl
40 % Methanol
Lagerung bei 4 °C
10x PBS 100 mM Na2HPO4 * 2H2O
1,5 M NaCl
pH 7,5
PBST 0,25 % Tween 20 in PBS
37
PBS/Glycin 0,2 % Glycin in PBS
Blockierungspuffer 5 % Skim Milk Powder in PBS
BSA-PBS-Lösung 1 % BSA in PBS
Pepsin Solution 10 µL 2M HCL/ mLddH2O
300µg Pepsin /mL
Proteinase K-Puffer 20 mM Tris- Base
2 mM CaCl
pH 7,5
Proteinase K-Solution Proteinase K-Puffer
200 µg/mL Proteinase K
Lösungen für Immunofluoreszenz
Blockierungspuffer 10 % Fetal bovine serum in FBS
0,3 % Triton X-100
Waschpuffer 0,1 % Polysorbat 20 (Tween 20)
PBS
Antikörperverdünnungspuffer 1 % BSA in PBS
0,3 % Triton X-100
Lösungen für FACS
Cytofix/Cytoperm Lösung BD Biosciences
Perm/Wash Puffer BD Biosciences
ICP-MS Lysis Puffer
38
50 % HNO3 (2%ig)
50 % H2O
3.5 Nährmedien
Tabelle 6: Verwendete Nährmedien
Nährmedium Zusammensetzung Hersteller
RMPI-1640 1 % Penicillin/Streptomycin Biozym
10 % FCS
300 mg/L L-Glutamin
4,5 g/L Glukose
DMEM 1 % Penicillin/Streptomycin Biozym
10 % FCS
580 mg/L L-Glutamin
4,5 g/L Glukose
F12-Medium 1 % Peniccilin/Streptomycin Biochrom
10 % FCS
146 mg/L L-Glutamin
1,8 g/L Glukose
Zur Herstellung von Nährmedien wurden Antibiotika und hitzeinaktiviertes fetales
Kälberserum steril hinzugefügt.
39
3.6 Pharmakologisch wirksame Substanzen
Tabelle 7: Pharmakologisch wirksame Substanzen
Bezeichnung IUPAC Name Struktur-/Summenformel Quelle
Diphenhydramin
(DO7)
2-Benzhydrylxy-N,N-
dimethyl-ethylamin
C17H21NO
Sigma
Aldrich
Orphenadrin
(DO8)
N,N-dimethyl-2-[(2-
methylphenyl)-phenyl-
methoxy]-ethanamin
C18H23NO
Sigma
Aldrich
DO9 2-[(2,6-Dimethylphenyl)-
Phenyl-Methoxy]-N,N-
DimethylethanamineHydro-
chlorid
C19H26CINO
Sigma
Aldrich
Cisplatin Cis-Diammindichloroplatin
(II)
Pt(NH3)2Cl2
TEVA
40
3.7 Antikörper
Tabelle 8: Antikörper
Bezeichnung Konz. Hersteller Information
Erstantikörper
R-C18 (rat-anti Pt-GpG) 0,2 µg/mL (Liedert, et al.2006) Pt-(GpG)-Intrastrang-
Addukte
Caspase 3 (CASP3) 1:300 Antikörper-online.de Caspase-3/Apoptose
Mouse anti-CA 125 1:1200 Zytomed Ovarialkarzinom-
Anti-Cav2.2 (rabbit) 1:200 Alomone Labs N-Typ VGCC
Zweitantikörper
Cy3 rabbit anti-mouse 1:200 Dianova
Cy3 rabbit anti-rat IgG 1:100 Jackson Immuno
Research
Alexa Fluor® 488
rabbit anti-mouse
1:800 Dianova
Alexa Fluor 555
Goat anti Rabbit
1:500 Life Technologies
3.8 Software
Tabelle 9: Software
Bezeichnung Hersteller
Ahrens Cytometry Analysis System II (ACAS) Ahrens Electronics, Bargteheide
Origin 8 (Graphik- und Datenanalysesoftware) Additive
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GraphPad Prism 6 GraphPad Software, Inc.
Axio Vision Bildanalyse-Software Carl Zeiss AG
TANGO Desktop Positionsspeicherung Märzhäuser, Wetzlar
3.9 Biologische Materialien
3.9.1 Verwendete Zelllinien
Tabelle 10: Zelllinien
Zelllinie Zelltyp Medium Cisplatin
Empfindlichkeit Quelle
A2780 Ovarialkarzinom RPMI sensitiv Sigma Aldrich
(93112519)
A2780-res Ovarialkarzinom RPMI resistent Sigma Aldrich
(93112517)
IGROV-1 Ovarialkarzinom RPMI sensitiv AG Translationale
Gynäkoonkologie,
Düsseldorf
OvCa-29 Ovarialkarzinom RPMI resistent AG Translationale
Gynäkoonkologie,
Düsseldorf
OAW-42 Aszites/ovarialer
Zystadenokarzinom
DMEM sensitiv AG Translationale
Gynäkoonkologie,
Düsseldorf
SKOV-3 Aszites/primäres
Ovarialkarzinom
RPMI resistent AG-Translationale
Gynäkoonkologie,
Düsseldorf
RT-112 Blasekarzinom RPMI sensitiv DSMZ (ACC-418)
RT-112 LTT Blasekarzinom RPMI resistent Forschungslabor
Urologie,
Universitätsklinikum
Düsseldorf,
Ursprünglich DSMZ
(ACC-418)
42
3.9.2 Primäres Tumormaterial
Der Zugang zu frisch resektiertem Tumorgewebe und zu frischen Aszites-Proben von
Patientinnen mit OVK erfolgte in Zusammenarbeit mit der Klinik für Frauenheilkunde
und Geburtshilfe am Univesitätsklinikum Essen (Dr. Kasimir-Bauer), sowie der
Universitätsfrauenklinik in Düsseldorf (Dr. Niederacher). Kryokonservierte Aszites-
Proben wurden von der Arbeitsgruppe Molekulare Gynäkologische Onkologie (Dr.
Kuhlmann) am Universitätsklinikum Carl Gustav Carus in Dresden bereitgestellt.
Tabelle 11: Primäres Tumormaterial
# Patientin Biopsie Information Stadium Platin-resistent
001 Aszites Rezidiv CA-125 schwach IV unbekannt
00.1 Aszites primär CA-125 erhöht IIIc unbekannt
003 Aszites Rezidiv unbekannt IIIc nein
102 Aszites
Solider Tumor
Rezidiv CA-125 erhöht IV unbekannt
100 Solider Tumor Rezidiv CA-125 stark erhöht IIIc unbekannt
101 Solider Tumor Rezidiv CA-125 erhöht IIIc nein
3.9.3 Versuchstiere
Die Ratten-Experimente wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe
Experimentelle Schmerzforschung an der Neurologischen Klinik des
Universitätsklinikums Essen durchgeführt. Für die Entnahme und Kultivierung von
DRG-Neuronen wurden Wistar-Ratten im Alter von drei Wochen verwendet. Für Maus-
Experimente wurden C57BL/6 Mäuse verwendet. Zucht und Haltung der Tiere erfolgte
unter SPF-Bedingungen im Zentralen Tierlabor des Universitätsklinikums Essen in
Käfigen mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
43
3.10 Methoden
3.10.1 Kultivierung von Zelllinien und primären Tumorzellen
Falls nicht anders angegeben, wurden alle Zellen im jeweiligen Medium (siehe Tabelle
6) in Zellkultur-Flaschen (siehe Tabelle 2) im Inkubator bei 37 °C, 5% CO2-Gehalt und
bei 80 – 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Medien wurden ergänzt durch Zugabe von
Penicillin und Streptomycin (jeweils 0,1 mg/mL) und 10 % hitzeinaktiviertem fetalem
Kälberserum (FCS). Primäre Tumorzellen wurden in RPMI-Medium kultiviert. Bei der
Cisplatin-resistenten Zelllinie A2780-res wurde dem Medium alle 2 – 3 Passagen
Cisplatin in einer Konzentration von 1 µg/mL zugesetzt, um auf den resistenten Phänotyp
zu selektionieren. Die Kulturen wurden in der Regel bei einer Konfluenz von 90 %
gesplittet. Dazu wurde das Medium abgesaugt und die Flasche mit PBS durchgespült.
Zum Ablösen adhärenter Zellen erfolgte eine kurze Exposition mit Trypsin/EDTA-
Lösung (siehe 3.3) bei 37 °C. Die Inaktivierung der Trypsin/EDTA-Reaktion erfolgte
durch Zugabe vom frischen Medium. Die abgelösten Zellen wurden anschließend in der
gewünschten Verdünnung (1:4, 1:5) auf neue Zellkulturflasche mit Medium verteilt.
3.10.2 Auftauen von kryokonservierten Aszites-Proben
Für die funktionelle Analyse primärer Tumorzellen wurden u.a. kryokonservierte
Aszites-Proben von OVK-Patientinnen verwendet. Diese, bei -80 °C gelagerten, Aszites-
Proben wurden von der Arbeitsgruppe Molekulare Gynäkologische Onkologie am
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus in Dresden bereitgestellt.
Kryoröhrchen wurden kurz im Wasserbad (37 °C) aufgetaut und die Probe schnell in
kaltes RPMI-Medium (10 mL) überführt. Die Zellen wurden vorsichtig gemischt und bei
300 g für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in vorgewärmtem RPMI-Medium (20
% FCS) resuspendiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen in 5 mL RPMI-
Medium (20 % FCS) aufgenommen, in T25 Zellkulturflaschen (siehe Tabelle 2) überführt
und bei 37 °C im Brutschrank, bis zu einer Konfluenz von 90 %, kultiviert.
44
3.10.3 Handhabung klinischer Biopsien
Um primäre humane Tumorzellen einer funktionellen Analytik zugänglich zu machen,
wurden diese sowohl aus operativ gewonnenem Gewebe des Ovarialkarzinoms in situ,
als auch aus frischen Aszites-Proben von Patientinnen dargestellt. In beiden Fällen wurde
das Ausgangsmaterial nach der Gewinnung schnellstmöglich steril aufgearbeitet. Frisch
entnommenes Aszitespunktat wurde für die Anreicherung der primären Tumorzellen mit
PBS verdünnt und für die Zentrifugation über einen Ficoll-Dichtegradienten vorbereitet.
Das operativ gewonnene Tumormaterial wurde bis zur Bearbeitung in PBS gelagert. Das
Gewebe wurde zunächst mechanisch mit einem Skalpell und Schere zerkleinert.
Anschließend folgte ein Verdau des Gewebes mit Kollagenase A (C=1mg/mL) für den
Abbau interzellulärer Matrix. Der enzymatische Verdau erfolgte unter Rühren auf einem
Roller bei 37 °C über einen Zeitraum von 1 h. Das Gewebe wurde weiter vorsichtig mit
einem Potter-Homogenisator zerkleinert. Die resultierende Zellsuspension wurde durch
einen „cell-strainer“ (70 µm) in ein 15 mL-Röhrchen überführt und zweimal mit PBS
gewaschen, um die Kollagenase zu entfernen und das Zellpellet für den Ficoll-
Dichtegradienten in PBS aufgenommen.
3.10.4 Ficoll-Dichtegradient zur Gewinnung humaner mononukleärer Zellen aus
Tumormaterial
Gewinnung der mononukleären Zellfraktion (MNZ) aus dispergiertem Tumormaterial
und aus Aszitesaspiraten erfolge mit Hilfe des Ficoll-Dichtegradienten. Dieses Verfahren
dient der Abtrennung mononukleärer Zellen von den Adipozyten und toten Zellen. Die
Tumorzell-haltige Fraktionen wurden 1:1 mit PBS gemischt und je 15 mL wurden
vorsichtig auf 20 mL Ficoll (siehe Tabelle 4) im 50 mL-Röhrchen überschichtet. Die
Zentrifugation erfolgte 30 min bei 800 rpm ohne Bremse. Um den Rest-Ficoll aus der
abgenommene Interphase zu entfernen, wurde diese mit dreifacher Volumenmenge PBS
verdünnt und 10 min bei 800 g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand
abgenommen und das Pellet in 1 mL PBS resuspendiert, die Zellzahl bestimmt und die
Zellen in 6-Well Platten mit 1mLRPMI-Medium pro Well (siehe Tabelle 6) transferiert.
45
3.10.5 Ex-vivo Exposition mit Cisplatin und Inhibitoren
Adhärente Zellen wurden vor der Exposition 24 h lang kultiviert. Die Platin-Behandlung
von Zellen wurde auf 6-Well-Platten (siehe Tabelle 2) durchgeführt. Vor der Behandlung
von Zelllinien oder primärer OVK Zellen mit Cisplatin (20 µg/mL, 3 h, siehe Tabelle 4)
erfolgte, wenn angegeben, eine 30-minütige Vorinkubation mit dem jeweiligen DO-
Modulator (DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9:10 µg/mL, siehe Tabelle 4). Nach
der Cisplatin-Exposition wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit PBS
gewaschen. Für die Durchführung einer Bildungskinetik für Pt-DNA-Addukte wurden
die Zellen weiter in Cisplatin-freiem Medium kultiviert und zum gewählten Zeitpunkt
weiterverarbeitet. Nach Beendigung eines Behandlungssatzes wurden die Zellen mit
Trypsin/EDTA abgelöst und zweimal mit PBS gewaschen. Pro Behandlungssatz wurden
ca. 2 x 104 Zellen in 10 µL auf spezielle Adhäsions-Objektträger (siehe Tabelle 2)
aufgebracht und an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet. Als biologische und
messtechnische Kontrolle wurde parallel zu jedem Experiment mit der Zelllinie A2780
eine Cisplatin-Dosisreihe (0-20 µg Cisplatin /mL) durchgeführt. Unbehandelte Zellen
wurden als Negativ-Kontrolle eingesetzt. Bis zur weiteren Bearbeitung wurden die
Objektträger bei -20 °C gelagert.
3.10.6 Immunphänotypisierung primärer OVK Zellen in der MNZ-Fraktion
Die Objektträger wurden für 30 min bei -20 °C in Methanol fixiert und anschließend in
PBS rehydriert (5 min). Durch die nachfolgende Behandlung mit der Blocking-Solution
(30 min, siehe Tabelle 5) wurden die unspezifischen Bindungsstellen abgesättigt. Die
Inkubation mit dem Erstantikörper (mouse anti-[CA-125], siehe Tabelle 8) erfolgte für 1
h bei RT in einer Feuchtkammer, mit anschließenden Waschschritten in PBST und PBS
(jeweils 5 min). Der Zweitantikörper (rabbit anti-[mouse Ig] Alexa488, siehe Tabelle 8)
wurde ebenfalls für 1 h bei RT in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Zellen wurden für
5 min mit PBST und anschließend mit PBS gewaschen. Der Nachweis der Gesamt-DNA
im Zellkern erfolgte mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI (30 min, siehe Tabelle 4). Die
Objektträger wurden erneut in PBS gewaschen und mit einem Deckglas und einem
PBS/dH2O Gemisch (1:1) vorsichtig abgedeckt. Die Mischung PBS/dH2O wurde als
reversibles Eindeckmedium verwenden um die Objektträger-immobilisierten Proben
nach der Detektion CA-125-positiver Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop für den
46
weiteren ICA-Färbeprozess (siehe 3.10.8) zugänglich zu machen. Das Entfernen des
Deckglases und Eindeckmediums erfolgte in PBS in horizontaler Lage des Objektträgers.
Als Positivkontrolle für die Färbung wurde die CA-125 positive Zelllinie OVCAR-3
(siehe Tabelle 10) verwendet.
3.10.7 Lokalisation und Positionsspeicherung CA-125-positiver Tumorzellen
CA-125-positive Tumorzellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop (siehe Tabelle
3) anhand der Alexa488-Fluoreszenz lokalisiert. Jede identifizierte Tumorzelle wurde
bildlich mit der Axio Vision Bildanalyse-Software dokumentiert und die entsprechenden
Positionsdaten (x-y-Koordinaten) mit dem TANGO Desktop Scanning-Tisch System
(siehe Tabelle 3) abgespeichert. Anschließend wurden die Proben der Pt-(GpG)-
Adduktfärbung (ICA, siehe 3.10.8) unterzogen. Nach der ICA Färbeprozedur wurden die
abgespeicherten Positionsdaten wieder aufgerufen und die Pt-DNA-Addukt Messung
wurde in den zuvor abgespeicherten CA-125-positiven Tumorzellen durchgeführt. Um
statistisch relevante Ergebnisse zu erhalten, wurden von jeder Probe mindestens 50
primäre Tumorzellen gemessen (siehe 3.10.9).
3.10.8 Immunzytologischer Nachweis von Pt-(GpG)-Addukten in der DNA von
Zellen (ICA-Assay)
Der immunzytologische Assay ist ein Verfahren zur Bestimmung des relativen Pt-(GpG)-
Adduktgehaltes in Relation zum DNA-Gehalt der einzelnen Zelle. Die Objektträger-
immobilisierte Proben wurden für mindestens 30 min bei -20 °C in Methanol fixiert,
permeabilisiert und anschließend in PBS rehydriert. Um die Zugänglichkeit der DNA für
den Pt-(GpG)-spezifischen Antikörper zu erleichtern, wurden die Proben für 5 min bei 0
°C in Alkali-Lösung (siehe Tabelle 5) denaturiert. Nach einem 5 min Waschschritt mit
PBS erfolgten für 10 min bei 37 °C zwei aufeinanderfolgende Proteolyse-Schritte mit
vorgewärmter Pepsin-Lösung sowie einer Proteinase K-Lösung (siehe Tabelle 5) um
einen kompletten Protein und- Membranverdau zu gewährleisten. Die Proteinase K-
Aktivität wurde durch einen 10 minütigen Waschschritt in PBS/Glycin-Lösung (siehe
Tabelle 5) gestoppt. Anschließend erfolgte die Absättigung unspezifischer Protein-
Bindungsstellen durch 30 min Behandlung mit der Blocking-Solution (siehe Tabelle 5).
Die Inkubation mit dem Erstantikörper (rat-anti-[Pt-GpG] R-C18, siehe Tabelle 8)
47
erfolgte für 2 h bei 37 °C in einer Feuchtkammer. Die Zellen wurden für je 5 min mit
PBST und mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem
Zweitantikörper (rabbit anti-[rat IgG] Cy3, siehe Tabelle 8) für 1 h bei 37 °C in einer
Feuchtkammer. Die Proben wurden jeweils 5 min mit PBST und PBS gewaschen und die
Gesamt-DNA im Zellkern mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI (30 min, siehe Tabelle 4)
angefärbt. Die Proben wurden erneut für 5 min mit PBS gewaschen und mit Deckglas im
Eindeckmedium (siehe Tabelle 4) eingebettet.
3.10.9 Quantifizierung der Fluoreszenzsignale
Die Aufnahme und Quantifizierung der Immun- und der DNA-Fluoreszenz erfolgte mit
Hilfe eines digitalen Mikroskop-gekoppelten „AHRENS ACAS-II„ Bildauswertesystems
(siehe Tabelle 3). Die Messung des Gesamt-Pt-(GpG)-Adduktgehaltes einer Zelle
erfolgte in zwei Schritten. Anhand der DAPI-Signale wurden Position und Größe
einzelner Zellkernflächen festgelegt und deren jeweilige Fluoreszenzintensität gemessen.
In den gleichen Arealen wurden dann im Cy3-Kanal die Addukt-spezifischen
Fluoreszenzsignale des Sekundärantikörpers aufgenommen. Der relative Pt-(GpG)-
Adduktgehalt im Kern einzelner Zellen wurde errechnet durch Normierung der
integrierten Cy3-Signale auf die zugehörigen DAPI-Signale im gleichen Areal und hier
als arbitary fluorescence units [AFU] angegeben. Somit kann nach Korrektur für den
jeweiligen DNA-Gehalt eine sichere Aussage über den relativen DNA-Gehalt jeder Zelle
gemacht werden. Um statistisch relevante Ergebnisse zu erhalten, wurden von jeder Probe
für die Berechnung der Mittelwerte und der Varianz mindestens 100 Zellen ausgewertet.
Die graphische Darstellung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism
6 (siehe Tabelle 9). Die dargestellten Fehlerbalken repräsentieren das 95 %
Konfidenzintervall, den Wahrscheinlichkeitsbereich um den berechneten Mittelwert, in
dem sich dieser bei unendlicher Stichprobengröße zu 95 % befindet. Für die statistische
Analyse wurde one-way ANOVA Signifikanztest verwendet. Die Signifikanz der
Ergebnisse einer statistischen Auswertung wird als p-Wert (probability) angegeben. Dies
Kennzahl gibt die Wahrscheinlichkeit des Eintritts eines Ereignisses an, wenn die
Nullhypothese wahr ist. Als Signifikanzniveau wurde 5 % (p = 0,05) festgelegt, das
Ergebnis ist umso signifikanter, je kleiner der p-Wert ist (*p<0,05, **p<0,01,
***p<0,001, ****p<0,0001).
48
3.10.10 Bestimmung der Apoptose mittels Caspase-3 Aktivitäts-Assay
Die Durchflusszytometrie ist ein optisches Messverfahren zur Analyse von Zellen in
Suspensionen. Das Prinzip beruht dabei auf einer spezifischen, mit Fluoreszenzfarbstoff-
markierten Antigen-Antikörper-Reaktion. Caspasen gehören zu der Gruppe der
Cysteinproteasen und sind die wichtigsten Enzyme der Apoptose. Die Effektor-Caspase-
3 ist eines der Schlüsselenzyme der Apoptose und ist verantwortlich für die partielle oder
totale proteolytische Spaltung von Schlüsselenzymen. Somit ist die Caspase-3-Aktivität
in den Zellen ein wichtiger Parameter für die Aktivität der Apoptose.
Pro Behandlungsansatz wurden ca. 7 x 105 Zellen in 10 cm Petrischalen mit Medium für
24 h kultiviert. Für kombinatorische Behandlungsansätze wurden die Zellen 30 min mit
dem jeweiligen DO-Modulator (DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9:10 µg/mL, siehe
Tabelle 7) vorbehandelt und währen der darauffolgender Cisplatin-Behandlung
draufgelassen. Anschließend wurden die Zellen für 24 h mit Cisplatin (10 µg/mL)
behandelt, mit Trypsin/EDTA-Lösung (siehe Tabelle 4) abgelöst, zentrifugiert (5 min bei
800 g) und das Pellet in 1 mL eiskaltem PBS resuspendiert. Die Zellen wurden im
eiskalten, 90 %igen Methanol für 30 min fixiert und anschließend in PBS mit 0,25 %
Triton-X100 gewaschen. Die Inkubation mit dem Erstantikörper (rabbit anti-[active
Caspase-3], siehe Tabelle 8) erfolgte für 2 h bei RT. Nach dem zweifachen Waschschritt
in PBS und 1 % BSA wurden die Zellen für 1 h bei RT mit dem Zweitantikörper (goat
anti-[rabbit IgG] Alexa Fluor 555, siehe Tabelle 8) inkubiert. Die Zellen wurden in 1 mL
PBS gewaschen und nach der Zentrifugation in 300 µL PBS mit Propidiumiodid (25
µg/mL) und DNase freie RNase A (100 µg/mL) resuspendiert und für 15 min bei RT
inkubiert. Anschließend erfolgte die Analyse der Fluoreszenzsignale am
Durchflusszytometer. Die Menge der erzeugten Fluoreszenzsignale korreliert dabei mit
der Caspase-3-Aktivität, welches als Maß für die Apoptoserate herangezogen werden
kann.
49
3.10.11 Zellzyklus-Analyse
Mit dem Propidiumiodid (PI) kann der DNA-Gehalt gemessen und die momentane
Zellzyklus-Phase der Zellen bestimmt werden. Anhand des PI-Signals, welches
proportional zum DNA-Gehalt einer Zelle ist, lassen sich die Zellen der G1-Phase
(einfache DNA-Menge), S-Phase (Zellen zwischen ein- und zweifacher DNA-Menge),
G2/M-Phase (Zellen mit zweifacher DNA-Menge) und der sub-G1-Phase (Zellen mit
weniger als einfache DNA-Menge, apoptotische Zellen) einteilen.
Es wurde der DNA-Gehalt von ca. 2 x 106 Zellen pro Behandlungsansatz mittels
Durchflusszytometrie untersucht. Die Zellen wurden 30 min mit DO-Modulatoren (DO7:
40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9:10 µg/mL, siehe Tabelle 7) behandelt und für 3 h mit
Cisplatin (20 µg/mL) exponiert, dann gewaschen und bis 48 h im Cisplatin-freien
Medium kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung
abgelöst und die Zell-Suspension zentrifugiert (5 min, 800 g). Das Zellpellet wurde
zweimal mit PBS gewaschen und erneut zentrifugiert (5 min, 800 g), anschließend in 250
µL Cytofix/Cytoperm Lösung resuspendiert und bei 4 °C für 20 min fixiert und
permeabilisiert. Nach erneuter Zentrifugation (5 min, 800g) wurde das Zellpellet zweimal
in 1 mL Perm/Wash Buffer gewaschen und bis zur Messung bei 4 °C gelagert. Kurz vor
der Messung wurde die Zellsuspension im Wasserbad (37 °C) erwärmt und mit 10 µL PI
und 20 µL RNase-A (siehe Tabelle 4) versetzt. Die Suspension wurde gut gevortext und
für 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert und direkt gemessen. Die Messung der Zellen
erfolgte mit FACSCalibur 750 (siehe Tabelle 3).
3.10.12 Messung des intrazellulären Platin-Gehaltes (ICP-MS)
Der Platin-Gehalt des Lysates wurde in Zusammenarbeit mit Dr. R-A. Hilger, Innere
Klinik-Tumorforschung, an einem ICP-MS-Gerät der Fa. Thermo Finnigan gemessen.
Das ICP-MS-Verfahren basiert auf der Verdampfung, Atomisierung und Ionisierung der
Probe für eine anschließende massenspektroskopische Analyse der einzelnen Elemente
und Isotope. Grundlage der Analytik bildet die Erzeugung des Plasmas durch Induktion
eines hochfrequenten Stroms in ionisiertem Argon bei sehr hohen Temperaturen. Dabei
ist die Masse eine charakteristische Eigenschaft der Elemente, da jedes Element
mindestens ein Isotop aufweist, dessen Masse bei keinem natürlichen Isotop eines
anderen Elements auftritt. Die quantitative Nachweisgrenze der Methode für die meisten
Elemente des Periodensystems liegt im Bereich von ng/L-bzw. im ppt-Bereich. Um den
Gesamt-Platingehalt und darüber die initiale Cisplatin-Aufnahme der Zellen zu
50
detektieren, wurden 107 Zellen in 10 cm Petrischalen ausgesät, über Nacht kultiviert und
dann für 4 h mit Cisplatin (20 µg/mL) exponiert, alleine oder in Kombination mit je einem
der DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL; 30 min vor
Cisplatin Zugabe). Nach zwei Waschschritten mit PBS wurden 106 Zellen durch Zugabe
von Lysis Puffer (siehe 3.4) bei 70 °C für 24 h lysiert. Der Platin-Gehalt der Zellen wurde
gemessen und als Nanogramm Platin pro 106 Zellen angegeben.
3.10.13 Zucht und Behandlung von Ratten und Mäusen
Die Wistar-Ratten und C57BL/6 Mäuse wurden vor der Behandlung im zentralen
Tierlabor der Universität Duisburg-Essen unter kontrollierten, spezifisch-pathogenfreien
Bedingungen (SFP) gehalten. Die einzusetzende Menge von Cisplatin wurde anhand des
ermittelten Körpergewichtes der Tiere berechnet. Die Verabreichung des Zytostatikums
erfolgte durch intraperitoneale Applikation. Nach der Behandlung der Tiere mit Cisplatin
wurden diese anschließend für die im Versuch angegebenen Zeitpunkte unter normalen
Bedingungen und sorgfältiger Beobachtung gehalten. Beim Auftreten auffälliger
Symptomatik wurden die Tiere aus dem Versuch genommen und falls notwendig sofort
eingeschläfert.
3.10.14 Präparation von Dorsalganglien der Ratte und
Kultivierung/Immunphänotypisierung von DRG-Zellen
Die behandelten Ratten wurden euthanasiert und der Tod der Tiere wurde durch den Test
der Reflexe bestätigt. Für die Entnahme der Dorsalganglien (DRG) wurde der Kopf
abgetrennt, die Wirbelsäule freigelegt und der gesamte Wirbelsäulenabschnitt
entnommen. Im distalen Bereich wurde der Wirbelkanal von apikal bzw. kaudal entlang
der Dornfortsätze eröffnet und die entstehenden Hälften nach lateral weggeklappt. Unter
dem Mikroskop wurde das Rückenmark herausgelöst, die DRGs lokalisiert, entnommen
und in F12-Medium (siehe Tabelle 6) gesammelt. Die Spinalnerven der DRGs wurden
entfernt und die Kapsel der Ganglien angeschnitten, in Kollagenase-Lösung (0,9 mLF12-
Medium und 0,1 mL Kollagenase) überführt und für 45 min bei 37 °C inkubiert. Zum
Entfernen der Kollagenase wurden die Ganglien dreimal in F12-Medim gewaschen und
in Trypsin-Lösung (0,9 mL F12-Medium und 0,1 mL Trypsin) für 2 min bei 37 °C
inkubiert. Ganglien wurden zweimal im F12-Medium gewaschen, in 0,7 mLF12-Medium
51
überführt und mit einer Pinzette bis zum Austritt der DRG-Zellen trituriert. Die
Zellsuspension wurde in Kulturschale mit F12-Medium überführt und 2 h bei 37 °C bis
zur Adhäsion der Neuronen kultiviert. Die Zellen wurden anschließend einer Cisplatin-
Exposition unterzogen (20 µg/mL, 2 h), geerntet (Trypsin/EDTA), auf Objektträger
aufgebracht und bei Raumtemperatur getrocknet. Bis zur weiteren Verwendung wurden
diese bei -20 °C gelagert.
Die Immunphänotypisierung der Neurone unter den DRG-Zellen wurde wie im
Methodenteil 3.10.6 beschrieben, mit dem Erstantikörper (rabbit anti-[Cav2.2], RT, 1 h,
siehe Tabelle 8) und dem Zweitantikörper (goat anti-[rabbit IgG] Alexa555, RT, 1 h, siehe
Tabelle 8) durchgeführt. Die Lokalisation und Positionsspeicherung der Neurone
(VGCC-positiv) erfolgte wie im Methodenteil 3.10.7 beschrieben.
3.10.15 Anfertigung von Gefrierschnitten
Die Herstellung der Gewebeschnitte erfolgte nach Einbettung der gefrorenen
Gewebeproben in TissueTec-Lösung (siehe Tabelle 4) mit Hilfe eines Kryomikrotoms
(siehe Tabelle 3), welches sich innerhalb einer Kühlkammer befindet. Die Arbeitsschritte
wurden bei -22 °C durchgeführt um die Härte der Probe zu erhöhen und diese damit
schneidefähig zu machen. Die Gewebeschnitte wurden mit einer Schnittdicke von 8 µm
hergestellt, auf die Objektträger platziert, anschließend bei Raumtemperatur getrocknet
und bei -20 °C gelagert.
52
4 Ergebnisse
4.1 Akkumulation von Platin-DNA-Addukten in physiologischen Zellen
4.1.1 Reduktion der systemischen Toxizität bei Cisplatin-behandelten Mäusen
durch Ko-Applikation von DO9
DNA-reaktive Zytostatika wie die Platin-Komplexe schädigen bei repetitiver
Behandlung, neben den Substanz-typischen Zielzellen, häufig auch in erheblichem Maße
das Immunsystem und das Verdauungssystem der Patienten. Diese Läsionen werden
derzeit als Auslöser der sogenannten Tumorkachexie angesehen, einer
Stoffwechselstörung, die im Therapieverlauf häufig zu starken Gewichtsverlust und
schlechtem Allgemeinzustand führt und deshalb eine Dosisreduzierung oder ein
Behandlungsabbruch erzwingt und somit einen wesentlichen Faktor für die hohe
Sterberate darstellt. Ähnliche Symptome treten auch bei einer Mehrfachbehandlung von
Mäusen oder Ratten mit höherdosiertem Cisplatin auf (Alves, et al.2017, Damrauer, et
al.2008). Hier wurde nun geprüft, ob eine Ko-Behandlung von Mäusen mit DO-
Modulatoren sich reduktiv auf die systemische Toxizität von Cisplatin auswirkt. Dazu
wurde zunächst der Modulator DO9 ausgewählt, da im Gegensatz zu DO7 und DO8 für
diese Substanz bisher noch keine toxikologischen Daten vorliegen.
Für ein Pilotexperiment wurden jeweils vier C57BL/6 Mäuse pro Gruppe eingesetzt. Die
Tiere wurden für die Dauer von vier Wochen einmal pro Woche mit Cisplatin (i.p., 10
mg/kg Körpergewicht) alleine oder in Kombination mit dem Modulator DO9 (i.p., 10
mg/kg Körpergewicht, jeweils 1 h vor Cisplatin) behandelt und weitere vier Wochen
nachbeobachtet. Neben der täglichen Kontrolle wurden alle Tiere im Experiment einmal
pro Woche gewogen. Dabei zeigte sich bei der Gruppe mit DO9-Vorbehandlung eine
signifikant verbesserte Überlebensrate im Vergleich zu den nur mit Cisplatin behandelten
Mäusen (siehe Abbildung 5). Während in der DO9-Gruppe 8 Wochen nach
Versuchsbeginn und einer kumulativen Cisplatin-Dosis von 40 mg/kg alle Tiere noch
lebten, betrug die Überlebensrate der Cisplatin-Gruppe nach 8 Wochen nur 25 % (1 von
4 Tieren, siehe Abbildung 5 A). Die Auswertung der Gewichtsdaten (auf das jeweilige
Ausgangsgewicht normierte Gruppenmittelwerte) ergab für beide Gruppen den typischen
kachektischen Verlauf, mit einem starken Abfall während der Behandlungsphase (siehe
Abbildung 5 B). Am Ende der vierwöchigen Behandlung wies die Cisplatin-Gruppe einen
Gewichtsverlust von 35 % auf. Bei der DO9-Gruppe wurde zu diesem Zeitpunkt ein
Gewichtsverlust von 24 % aufgezeichnet. Im Verlauf des Experimentes hatte die
Cisplatin-Gruppe nach 4 Wochen Behandlungszeit 15 % mehr Gewichtsverlust als die
53
DO9-Gruppe. Nach der vier wöchigen Behandlungszeit hielt sich bei beiden Gruppen das
Körpergewicht bis zur siebten Woche konstant. In der achten Woche wurde bei den die
Therapie überlebenden Mäusen beider Gruppen eine Zunahme des Körpergewichtes um
ungefähr 12 % aufgezeichnet.
Abbildung 5: Reduktion der systemischen Toxizität und des Gewichtverlustes durch Ko-Applikation
von DO9 bei C57BL/6 Mäusen währen einer Cisplatin-Therapie.
Mäuse (vier Tiere pro Gruppe) wurden für die Dauer von 4 Wochen jede Woche mit Cisplatin alleine (10
mg/kg Körpergewicht) oder in Kombination mit DO9 (10 mg/kg Körpergewicht, 1 h vor Cisplatin-
Injektion) behandelt und weitere vier Wochen nachbeobachtet. Die DO9-Gruppe zeigte eine statistisch
signifikant verbesserte Überlebensrate (A) und geringeren Gewichtsverlust (B) im Vergleich zu der
Cisplatin-Gruppe.
Ein entsprechend angelegtes Experiment mit dem Modulator DO7 ergab in der Tendenz
ähnliche Ergebnisse (Daten hier nicht gezeigt). Dabei zeigte sich bei der Gruppe mit
DO7-Vorbehandlung ebenfalls eine verbesserte Überlebensrate im Vergleich zu den nur
mit Cisplatin behandelten Mäusen.
Die Schädigung welches Zell- oder Gewebetyps für die Cisplatin-induzierte Kachexie bei
(gesunden) Mäusen und bei Tumorpatienten verantwortlich ist, konnte bisher nicht
eindeutig geklärt werden. Erste Untersuchungen an Intestinalgewebe von Cisplatin-
behandelten Mäusen zeigten keine Auffälligkeiten in Bezug auf gegebenenfalls erhöhte
DNA-Platinierungen in speziellen Zelltypen des Darms.
54
4.1.2 In vivo und ex vivo Exposition von Neuronen und Gliazellen des DRG mit
Cisplatin
Die chemotherapeutische Behandlung mit Cisplatin ruft nicht nur Funktionsstörungen im
Innenohr und der Niere hervor, sondern provoziert auch massive neurotoxische
Nebenwirkungen, häufig mit Folgen einer Polyneuropathie (PNP), bei der in der Regel
die Spinalganglion-Neuronen des peripheren Nervensystems betroffen sind. Als Ursache
wird unter anderem eine funktionelle Schädigung der Neuronen durch Cisplatin-
induzierte DNA-Addukte diskutiert (Gill, et al.1998). An einem Mausmodell der
Behandlungs-induzierten PNP nach repetitiver Cisplatin-Gabe konnte in unserer
Arbeitsgruppe ein klarer Zusammenhang zwischen der zunehmenden Akkumulation von
Platin-Addukten im Kern der Ganglienzellen und dem Schweregrad der PNP gefunden
werden (Dzagnidze, et al.2007). Hier deutete sich bereits eine starke Heterogenität der
Adduktbelastung zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Ganglien an, ohne
dass bisher eindeutig geklärt wurde, welches die eigentlich kritischen Zielzellen der
Cisplatin-induzierten Neurotoxizität sind. Um die zugrunde liegenden Mechanismen
weiter aufzuklären, wurde hier die Adduktbelastung der Ganglienzellen in einem PNP-
Rattenmodell näher analysiert (Leo, et al.2017).
55
Abbildung 6: Vergleich ex vivo und in vivo Cisplatin–Exposition von Zellen des DRG der Ratte.
A: bildliche Darstellung von Neuronen (VGCC-positiv) und Neurogliazellen mit unterschiedlichen Pt-
(GpG)-Adduktgehalt im DRG-Gewebeschnitt. B: in vivo Cisplatin–Exposition (10 mg/kg, 24 h):
Visualisierung der Pt-(GpG)-Addukte in Neuronen und Gliazellen. C: ex vivo Cisplatin–Exposition (20
µg/mL, 3 h): Visualisierung der Pt-(GpG)-Addukte in Neuronen und Gliazellen. D: Darstellung der
experimentellen Ansätze. E: Quantifizierung der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von Neuronen und
Gliazellen I und II, nach einer ex vivo Exposition mit Cisplatin.
An Gewebeschnitten (siehe 3.10.15) von Dorsalganglien Cisplatin-behandelter Ratten
(10 mg/kg Körpergewicht, 24 h) wurden in einem zweistufigen Färbe- und
Auswertungsverfahren zunächst die Neurone anhand des Ca++-Kanalproteins VGCC Typ
N lokalisiert und dokumentiert (siehe Abbildung 6 A, oben). Die Gewebeschnitte wurden
56
anschließend für das Pt-(GpG)-Addukt (siehe 3.10.8) immunhistochemisch nachgefärbt
(siehe Abbildung 6 A, unten). Auch im Ratten-Ganglion zeigten sich sehr große
Unterschiede im DNA-Platinierungsgrad. Etwa die Hälfte der Zellen wies im Kern einen
vergleichsweise niedrigen Adduktgehalt auf. Dazu zählen auch die auffällig großkernigen
Neurone (VGCC-positiv). Die Kern-DNA der anderen Hälfte zeigte eine deutlich stärkere
Pt-(GpG)-Adduktfärbung (siehe Abbildung 6 A, N-Typ VGCC/Pt-(GpG)). Bei stärkerer
Vergrößerung lässt sich erkennen, dass dies vor allem auf viele kleinkernige Zellen an
der Peripherie der Neuronen zutrifft (siehe Abbildung 6 B) . Hierbei handelt es sich
aufgrund der morphologischen Anordnung um Neurogliazellen, die sogenannten
Mantelzellen (auch als Satellitenzellen bezeichnet, siehe Abbildung 6 D), denen neben
einer Versorgungs- auch eine pharmakologische Schutzfunktion für die Neuronen
zugeschrieben wird. Daraus ergab sich die Frage, ob die umhüllten Mantelzellen
möglicherweise eine abschirmende Funktion haben und die Neuronen effizient vor der
Einwirkung von Cisplatin und der Akkumulation der Pt-(GpG)-Addukte schützen, oder
ob die Nervenzellen einen intrinsischen Schutzmechanismus aufweisen. Um dies zu
klären, wurden zwei experimentelle Ansätze verglichen: Neben der in vivo-Behandlung
der Ratte (siehe oben) wurden aus unbehandelten Tieren zunächst die Ganglien präpariert,
diese zu einer Einzelzell-Suspension dispergiert und dann einer ex vivo-Exposition mit
Cisplatin (20µg/mL, 3 h, siehe 3.10.14) unterworfen. Hier ergab die anschließende Pt-
(GpG)-Adduktfärbung ein ähnliches Bild wie bei der in vivo-Applikation (siehe
Abbildung 6 C). Die großkernigen, VGCC-positiven Neuronen waren vergleichsweise
niedrig platiniert, während es bei den Neurogliazellen sowohl hoch, wie auch niedrig-
adduktierte Einzelzellen gibt. Die quantitative Auswertung im ICA-Verfahren (siehe
3.10.9) bestätigt diesen Befund (siehe Abbildung 6 E). Die gemessenen AFU-Werte in
den Neurogliazellen unterschieden sich um den Faktor 2 (Neurogliazellen: Typ I/II:
5,9/2,8 AFU). Der AFU-Wert in den Neuronen (2,6 AFU) war um den Faktor 2,27
niedriger als in den Neurogliazellen Typ I (5,9 AFU). Die AFU-Werte der
Neurogliazellen Typ II (2,8 AFU) unterschieden sich nicht von dem gemessenen AFU-
Wert in den Neuronen (2,6 AFU). Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass die
geringe DNA-Platinierung der DRG-Neuronen sehr wahrscheinlich auf der Wirkung
zelleigener Faktoren, wie Import-/Export-Mechanismen für Cisplatin beruht und nicht in
erster Linie auf einer Abschirmung durch Mantelzellen. Als Gliazellen kommen im PNS
neben den Mantelzellen (Typ I) auch Schwannzellen (Typ II) vor, welche die
57
Axonausläufe umhüllen. Auch bei den Typ II-Zellen können spezifische Import/Export-
Mechanismen für ihre niedrige DNA-Platinierung verantwortlich sein.
4.2 Quantifizierung und Modulation der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von
OVK-Zelllinien
Zusätzlich zu den unerwünschten Nebenwirkungen einer Therapie mit Platin-Komplexen
im Normalgewebe stellt eine initiale oder erworbene Resistenz der Tumorzellen
gegenüber dem Medikament den wichtigsten limitierenden Faktor für eine erfolgreiche
Behandlung dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde einerseits untersucht, in wieweit die
Resistenz von Tumorzellen gegenüber Platin-Komplexen mit einer veränderten DNA-
Platinierung einhergeht. Zum anderen müsste vor einem möglichen klinischen Einsatz
geklärt werden, welchen Einfluss die bisher als Nebenwirkungs-reduzierend
identifizierten DO-Inhibitoren auf die Adduktbildung und die Chemosensitivität von
Cisplatin-exponierten Tumorzellen haben. Für diese Untersuchungen wurde
hauptsächlich das Modell „Ovarialkarzinom“ herangezogen, da hier die Behandlung mit
Platin-Medikamenten bei der Erstlinien-Therapie im Vordergrund steht und dabei
Resistenzen und schwerwiegende Nebenwirkungen häufig einen Therapiewechsel
erzwingen. Zunächst wurden mögliche Resistenzmechanismen in Bezug auf die
Akkumulation der Pt-Adduktspiegel in Cisplatin-sensitiven und Cisplatin-resistenzen
Ovarialkarzinom-Zelllinien in vitro analysiert. Dazu wurden die Cisplatin-sensitive
Ovarialkarzinom (OVK) Zelllinie A2780 und die Cisplatin-resistente Variante A2780-res
(siehe Tabelle 10) verwendet. Letztere war durch chronische Exposition der parentalen
Linie mit steigenden Cisplatin-Konzentrationen selektioniert worden und weist im
Vergleich eine 5-fach höhere Resistenz gegenüber Cisplatin auf (Masuda, et al.1988).
4.2.1 Analyse des Pt-(GpG)-Adduktspiegels der Cisplatin-sensitiven und
resistenten Zelllinien A2780 und A2780-res
Exponentiell wachsende OVK-Zelllinien A2780 und A2780-res wurden jeweils 3 h mit
Cisplatin (20 µg/mL) behandelt und danach weiter in Cisplatin-freien Medium kultiviert.
Zu den Zeitpunkten 0, 4, 8 und 24 h nach der Exposition wurden die Zellen geerntet, auf
Objektträger aufgebracht und anschließend in der Kern-DNA die Pt-(GpG)-Addukte
mittels ICA-Analyse (siehe 3.10.8) visualisiert und quantifiziert (siehe 3.10.9). Die
Messergebnisse zu den unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Cisplatin-Exposition sind
in der Abbildung 7 dargestellt.
58
Abbildung 7: Visualisierung und Quantifizierung von Pt-(GpG)-Addukten in A2780 und A2780-res
OVK-Zelllinien.
Zelllinien wurden 3 h mit Cisplatin (20 µg/mL) in vitro exponiert und weiter bis 24 h im Cisplatin-freien
Medium kultiviert. Zu den Zeitpunkten 0, 4, 8 und 24 h nach der Cisplatin-Exposition wurde der Pt-(GpG)-
Adduktgehalt in der DNA der Zellen mit Hilfe der ICA-Analyse visualisiert und gemessen. A: initialer Pt-
(GpG)-Adduktgehalt nach 3 h Cisplatin-Exposition. B: Kinetik der Pt-(GpG)-Addukte. C: Visualisierung
von Pt-(GpG)-Addukten in A2780 und A2780-res Zellen.
Der gemessene initiale Adduktgehalt (AFU-Mittelwert) der A2780 Zellen nach der 3-
stündigen Cisplatin-Exposition lag bei 0,31 AFU und für die A2780-res Zellen bei 0,07
AFU und damit um den Faktor 4 niedriger (siehe Abbildung 7 A). Die in der Abbildung
7 C, in den Einzelkanälen (DAPI und Cy3) und als Mischbild, dargestellten
Fluoreszenzbilder der Pt-(GpG)-Adduktfärbung spiegeln die gemessenen Unterschiede
zwischen den AFU-Mittewerten wider. In der Adduktkinetik wurde 8 h nach der
Cisplatin-Exposition der höchste Platinierungsgrad (AFU: 1,41) gemessen. Zwischen den
Zeitpunkten 8 h und 24 h erfolgte eine Abnahme des AFU-Wertes um ca. 30 % auf 0,96
AFU. Die resistenten A2780-res Zellen zeigten nach 4 h Cisplatin-Exposition den
höchsten Patinierungsgrad (AFU: 0,43) und zu den Zeitpunkten 8 h und bis 24 h auch
eine Abnahme um etwa 30 % auf 0,31 AFU. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Cisplatin-
Resistenz der Zelllinie A2780-res mit einer gegenüber der Parentalen-Linie deutlich
reduzierten DNA-Platinierung einhergeht, die sehr wahrscheinlich nicht auf deutlich
unterschiedliche DNA-Reparaturkapazität zurückgeführt werden kann. Der Befund, dass
59
Resistenz-Faktor und Addukt-Reduktionsfaktor für dieses Zellpaar relativ ähnlich sind,
legt einen kausalen Zusammenhang nahe.
Weiter bestätigt werden die hier gemachten Beobachtungen durch entsprechende
Befunde an Tumorzellpaaren anderer Entität. Die Messungen der initialen Pt-(GpG)-
Adduktspiegel in Cisplatin-sensitiven versus -resistenten Paaren von Blasenkarzinom-
Zellen (RT112 versus RT112 LTT , siehe Anhang 1) sowie von Neuroblastom-Zellen
(LAN-1 WT und LAN-1 res (MelnikovaOktober 2013) zeigten ebenfalls bei gleicher
Exposition einen jeweils höheren Platinierungsgrad in der DNA der sensitiven Variante
und bestätigen somit die Befunde bei OVK Zelllinien.
4.2.2 Wirkung der DO-Modulatoren auf den Pt-Adduktgehalt in der DNA von
Cisplatin-exponierten OVK-Zellen
Für die Untersuchung, welchen Einfluss die DO-Modulatoren auf den DNA-
Adduktgehalt von Cisplatin-behandelten Tumorzellen haben, wurden das OVK
Zelllinien-Paar A2780 und A2780-res (siehe oben) sowie die zwei Cisplatin-sensitiven
OVK-Linien IGROV-1 und OAW-42 und die zwei Cisplatin-resistenten OVK-Linien
OvCa-29 und SKOV-3 ausgewählt. Die Zellen wurden entweder nur mit Cisplatin (20
µg/mL) oder in Kombination mit den DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL, DO8: 20
µg/mL, DO9: 10 µg/mL; 30 min vor der Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 3 h
Expositionszeit wurden die Zellen geerntet, auf Objektträger aufgebracht und der Pt-
(GpG)-Adduktgehalt in der DNA mittels ICA-Analyse (siehe 3.10.8) untersucht und
quantifiziert (siehe 3.10.9). In Abbildung 8 sind die Ergebnisse der Addukt Messungen
für die sechs Zelllinien dargestellt.
60
Abbildung 8: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-(GpG)-
Adduktgehalt in Cisplatin-sensitiven und resistenten OVK Zelllinien.
Sensitive (A, C und E) und resistente (B, D und F) OVK Zelllinien wurden mit Cisplatin (20 µg/mL, 3 h)
alleine oder mit DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL, 30 min vor
Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 3 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, auf OT aufgebracht und
der Pt-(GpG)-Adduktgehalt mittels ICA angefärbt und quantifiziert.
61
Die OVK Zelllinien A2780 und A2780-res zeigten nach Cisplatin den aus 4.2.1
erwarteten Unterschied (3,75-fach, AFU 0,45 zu AFU 0, 12). Die Vorinkubation der
Zellen mit den DO-Modulatoren führte in beiden Linien und bei jeder der drei Substanzen
zu einer signifikanten Erhöhung des Adduktgehaltes in der DNA. Die Vorinkubation mit
DO7, DO8 und DO9 führte bei der Parental-Linie A2780 zu einem Anstieg um 100 %
(+DO7: auf 0,93 AFU) bzw. um 150% (+DO8 auf 1,12 AFU; + DO9: auf 1,12 AFU). Bei
der resistenten Zelllinie A2780-res erhöhte sich die DNA-Platinierung im Vergleich zur
Einzelbehandlung mit Cisplatin. Nach Vorbehandlung mit DO7 ebenfalls um 100% (von
0,12 auf 0,24 AFU), bei DO8 um 60% (auf 0,19 AFU) und mit DO9 um 65% (auf 0,20
AFU).
Die Addukt-Messungen in der DNA von OVK Zelllinien IGROV-1 (0,56 AFU), OvCa-
29 (0,41 AFU), OAW-42 (1,23 AFU) und SKOV-3 (0,57 AFU) nach der Cisplatin-
Exposition deuteten auf unterschiedliche Sensitivitäts-/ Resistenzparameter der Zelllinien
hin. Die AFU-Werte der Cisplatin-sensitiven Zelllinie IGROV-1 stiegen bei der
Vorexposition mit DO7 (0,81 AFU) und DO8 (0,86 AFU) signifikant um etwa 50 % an,
während die Vorbehandlung mit DO9 (0,57 AFU) zu keiner signifikanten Abweichung
der AFU-Werte von den nur mit Cisplatin behandelten Zellen führte (Abbildung 8 C).
Die zweite Cisplatin-sensitive Zelllinie OAW-42 zeigte keine signifikanten
Veränderungen des Adduktgehalts bei einer Kombination von Cisplatin mit den DO-
Modulatoren (Abbildung 8 E). Die AFU-Werte der Cisplatin-resistenten Zelllinie OvCa-
29 stiegen bei der Vorexposition mit DO7 (0,66 AFU), DO8 (0,77 AFU) und mit DO9
(1,06 AFU) signifikant um 65 %, 90 % bzw. 160 % an. Auch die zweite Cisplatin-
resistente Zelllinie SKOV-3 zeigte sich sensitiv gegenüber einer kombinatorischen
Behandlung mit DO7 (1,22 AFU), DO8 (1,33 AFU) oder DO9 (2,26 AFU). DO7 und
DO8 führen zu einer annähernden Verdoppelung des Pt-Adduktspiegels und DO9 sogar
zu einer Verdreifachung (Abbildung 8 F). Jede Zelllinie zeigte Unterschiede in der
Sensitivität gegenüber der Kombinationsbehandlung mit Cisplatin und den verschiedenen
DO-Modulatoren. Bei jeder der hier untersuchten Zelllinie induzieren die drei
Diphenhydramin-Derivate ein unterschiedliches und typisches Modulationsmuster.
Bemerkenswert ist jedoch, dass bei den OVK-Zellen bisher kein negativer Effekt auf den
Adduktgehalt gemessen werden konnte.
62
In der Tendenz sehr ähnliche Ergebnisse für die DNA-Adduktierung durch die
kombinatorische Anwendung von Cisplatin und den DO-Modulatoren konnten in
Neuroblastom-, Lungenkarzinom-, Hodenkarzinom-, Mammakarzinom-,
Harnblasekarzinom- und Prostatakarzinom-Zelllinien gefunden werden
(MelnikovaOktober 2013, MelnikovaFebruar 2014).
4.2.2.1 Wirkung einer kontinuierlichen Exposition mit DO9 auf die Kinetik der
Pt-(GpG)-Addukte nach Cisplatin-Behandlung
Die bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass eine Vorbehandlung der Zelllinien, vor der
Cisplatin-Gabe, mit den DO-Modulatoren zu einem erhöhten Niveau von DNA-Addukten
führt. Welcher Wirkungsmechanismus dahinter steht, ist bisher nicht genau bekannt. Es
wird vermutet, dass die Modulatoren Import- oder Exportmechanismen der Zelle für
Cisplatin beeinflussen, wodurch in der Zelle ein Cisplatin-Depot angereichert wird und
mit der DNA reagieren kann. Deshalb wurde in einem weiteren Experiment die Wirkung
einer Dauerexposition mit DO9 nach der Cisplatin-Behandlung auf die Pt-(GpG)-
Bildungs- und Reparaturkinetik untersucht. Um die Varianten der Behandlungsformen
miteinander zu vergleichen, wurde mit den Zelllinien A2780 und A2780-res drei
unterschiedliche experimentelle Ansätze durchgeführt. (1: CisPt): Die Zelllinien wurden
nach einer Cisplatin-Exposition (20 µg/mL, 3 h) bis 16 h weiter im Cisplatin-freien
Medium kultiviert. (2: CisPt + DO9): Die Zelllinien wurden für 30 min mit DO9 (10
µg/mL) vorbehandelt, anschließend für 3 h mit Cisplatin exponiert und bis 16 h weiter im
Cisplatin-freien Medium kultiviert. (3: CisPt + DO9+): Nach einer 30-minütigen
Vorinkubation mit DO9 und einer anschließenden 3 h Exposition mit Cisplatin wurden
die Zellen bis 16 h weiter im Cisplatin-freien Medium mit DO9 (10 µg/mL) Zusatz
kultiviert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, auf Objektträger aufgebracht und
DNA-Addukte gemessen. Die Ergebnisse für die Zelllinien A2780 und A2780-res sind
in Abbildung 9 dargestellt.
63
Abbildung 9: Wirkung einer DO9-Dauerexposition auf die Kinetik der Pt-(GpG)-Addukte nach
Cisplatin-Behandlung.
Behandlungsansatz (1: CisPt): Cisplatin-Exposition (20 µg/mL, 3 h) bis 16 h weitere Kultivierung im
Cisplatin-freien Medium. (2: CisPt + DO9): Vorinkubation für 30 min mit DO9 (10 µg/mL), anschließende
3 h Cisplatin-Exposition und bis 16 h weitere Kultivierung im Cisplatin-freien Medium. (3: CisPt + DO9+):
Vorinkubation für 30 min mit DO9 (10 µg/mL), anschließende 3 h Cisplatin-Exposition und bis 16 h
weitere Kultivierung im Cisplatin-freien Medium mit DO9 (10 µg/mL) Anschließend wurde der Pt-(GpG)-
Adduktgehalt in der DNA von OVK-Zelllinien A2780 (A) und A2780-res (B) quantifiziert.
Die gemessenen AFU-Werte 16 h nach der Cisplatin-Exposition lagen bei der A2780
Zelllinie bei 0,14 AFU (CisPt), 1,17 AFU (CisPt + DO9) und 2,25 AFU (CisPt + DO9+).
Die Dauerexposition mit dem Modulator DO9 nach der Cisplatin-Exposition führte zu
einer Verdopplung des gemessenen AFU-Wertes (siehe Abbildung 9 A). Die AFU-Werte
der A2780-res Zelllinie lagen bei 0,09 AFU (CisPt), 0,16 AFU (CisPt + DO9) und 0,15
AFU (CisPt+DO9+). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Kinetik der
DNA-Addukte bei Cisplatin mit DO9 und Cisplatin mit DO9+ behandelten A2780-res
Zellen gemessen.
4.2.2.2 Einfluss der DO-Modulatoren auf die Cisplatin-induzierten
Zellzykluseffekte
Um den Einfluss von Cisplatin alleine und in Kombination mit DO-Modulatoren auf die
Zellzyklus-Verteilung zu untersuchen, wurde der DNA-Gehalt von ca. 2 x 106 Zellen pro
Behandlungsansatz mittels Durchflusszytometrie untersucht. Für die Zellzyklus-Analyse
wurde die Cisplatin-sensitive A2780 Zelllinie ausgewählt, da bei dieser Zelllinie die Ko-
Behandlung mit DO-Modulatoren zu einer signifikanten Verstärkung der Adduktbildung
führt. Es wurde eine Cisplatin-Konzentration von lediglich 10 µg/mL gewählt um den
zytotoxische Effekt besonders für den Zeitpunkt 48 h zu begrenzen. Um einen möglichen
64
zytotoxischen Effekt der DO-Modulatoren selbst auszuschließen und deren Wirkung auf
den Zellzyklus zu analysieren, wurden die Zellen bis 48 h mit den DO-Modulatoren
alleine kultiviert. Die Ergebnisse der Zellzyklus-Messungen nach 24 h und 48 h sind in
Abbildung 10 dargestellt.
Abbildung 10: Einfluss von DO-Modulatoren in Kombination mit Cisplatin auf die
Zellzyklusverteilung.
Die Zellen wurden 30 min mit DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL, DO8: 20 µg/mL, DO9: 10 µg/mL)
behandelt und bis zu 48 h mit Cisplatin (10 µg/mL) inkubiert. Anschließend wurde der Zellzyklus mittels
Durchflusszytometrie bestimmt. Der Anteil an Zellen je Zellzyklus-Phase wurde in Prozent angegeben.
Unbehandelte A2780-Zellen (Kontrolle) zeigten nach 48 h Kultivierung 69 % der Zellen
in der G1-Phase, 13 % in der S-Phase, 13 % in der G2/M-Phase und lediglich 5 % in der
sub-G1-Fraktion. Zellen die mit den DO-Modulatoren alleine behandelt wurden waren
nach 48 h Kultivierung zu 64-68 % in der G1-Phase, 14-15 % in der S-Phase, zu 15-17 %
in der G2/M-Phase und zu 2-4 % in der sub-G1-Fraktion. Die DO-Modulatoren hatten
keinen Einfluss auf den Zellzyklus.
Cisplatin-behandelte Zellen waren 24 h nach der 3 h-Inkubation zu 16 % in der G1-Phase,
zu 54 % in der S-Phase, zu 12 % in der G2/M-Phase und zu 18 % in der sub-G1-Fraktion.
Nach einer 48 h Inkubation waren 7 % Zellen in der G1-Phase, 58 % Zellen in der S-
Phase, 19 % Zellen in der G2/M-Phase und 16 % in der sub-G1-Fraktion. Es kam zu einer
Abnahme an Zellen in der G1-Phase und einer leichten Zunahme an Zellen in der S-Phase
und der G2/M-Phase. Zu dem Zeitpunkt 48 h war im Vergleich zu den Kontrollzellen bei
Ko
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e
DO
7
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S -P h a s e
G 2 /M -P h a s e
G 1 -P h a s e
2 4 h 4 8 h4 8 h
65
den Cisplatin-behandelten Zellen ein deutlicher S-Phase Arrest eingetreten und es fanden
sich etwa dreimal mehr Zellen in der apoptotischen sub-G1-Fraktion.
Zellen die mit DO7, DO8 und DO9 vorbehandelt wurden, zeigten eine ähnliche
Zellzyklus-Verteilung wie nur Cisplatin-behandelte Zellen. Der Vergleich der
Zellzyklusverteilungen wurde auf die Messwerte der Cisplatin-behandelten Zellen nach
entsprechender Kultivierungszeit bezogen. Die mit DO7 vorbehandelten Zellen waren
nach 24 h Kultivierung zu 13 % in der G1-Phase, zu 57 % in der S-Phase, zu 14 % in der
G2/M-Phase und zu 17 % in der sub-G1-Fraktion. Nach 48 h Kultivierung zeigte sich eine
leichte Abnahme an Zellen in der S-Phase und eine leichte Zunahme an Zellen in der G1-
Phase (G1-Phase: 13 %, S-Phase: 53 %, G2/M-Phase: 17 % und sub-G1-Phase: 18 %). Mit
DO8 vorbehandelten Zellen zeigten nach 24 h Kultivierung eine leichte Zunahme an
Zellen in der sub-G1-Fraktion (24 %). Die restlichen Zellzyklus-Phasen blieben
annähernd unverändert (G1-Phase: 14%, S-Phase: 51 % und G2/M-Phase: 11 %). Nach
48 h Kultivierung zeigten sich außer einer leichte Abnahme an Zellen in der S-Phase (46
%) und Zunahme an Zellen in der sub-G1-Fraktion (24 %) keine Veränderungen in der
Zellzyklus-Verteilung (G1-Phase: 18%, G2/M-Phase: 12 %). Mit DO9 vorbehandelten
Zellen waren nach 24 h Kultivierung zu 12 % in der G1-Phase, zu 58 % in der S-Phase,
zu 11 % in der G2/M-Phase und zu 19 % in der sub-G1-Fraktion. Es zeigte sich eine leichte
Zunahme an Zellen in der S-Phase. Nach 48 h Kultivierung waren die Zellen zu 8 % in
der G1-Phase, zu 61 % in der S-Phase, mit 10 % zeigte sich eine Abnahme an Zellen in
der G2/M-Phase und mit 20 % Zellen eine leichte Zunahme an Zellen in der sub-G1-Phase
im Vergleich zu Cisplatin behandelten Zellen.
4.2.3 Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf die
Apoptose-indikativen Caspase 3-Aktivität
Die zytotoxische Wirkung von Cisplatin resultiert aus der Bildung von Pt-(GpG)-
Addukten in der DNA der Zelle, gefolgt von einem Zellzyklus-Arrest und der Einleitung
apoptotischer Prozesse. Im weiteren Verlauf des programmierten Zelltodes kommt es zur
Aktivierung von Casparen, wobei die Caspase-3 eine Schlüsselrolle einnimmt. Ein
erhöhter Adduktgehalt der Kern-DNA sollte also im Zusammenhang mit einer erhöhten
Caspase-3 Aktivität zusammenstehen. Um diesen Zusammenhang zu analysieren, wurde
die Cisplatin-sensitive OVK Zelllinie A2780 verwendet, die sich sensitiv gegenüber den
66
Modulatoren zeigte. Die Zellen wurde mit Cisplatin alleine (10 µg/mL) oder in
Kombination mit DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL, DO8: 20 µg/mL und DO9: 10
µg/mL, 30 min vor Cisplatin-Exposition) behandelt. 24 h nach Exposition wurde die
Caspase-3 Aktivität der Zellen immunanalytisch gemessen (siehe 3.10.10). Das Ergebnis
der Caspase-3-Messung bei der A2780 Zelllinie ist in Abbildung 11 dargestellt.
Abbildung 11: Wirkung von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Zelltod in
A2780-Zelllinie:
Zellen wurden mit Cisplatin alleine (10 µg/mL) oder in Kombination mit DO-Modulatoren (DO7: 40
µg/mL, DO8: 20 µg/mL und DO9: 10 µg/mL, 30 min vor Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach einer
Inkubationszeit von 24 h wurde die Caspase-3 Aktivität gemessen.
Als Negativ-Kontrolle für die Caspase-3 Aktivität wurde die unbehandelte A2780
Zelllinie verwendet. Um die zytotoxische Wirkung der DO-Modulatoren zu analysieren,
wurden die Zellen mit DO-Modulatoren ohne die Zugabe von Cisplatin bis 24 h inkubiert.
Die Messungen in diesen Zellen zeigten im Vergleich zu der negativ-Kontrolle keine
signifikante Veränderung in der Caspase-3-Aktivität. Dies weist darauf hin, dass die DO-
Substanzen im Beobachtungszeitraum keine Apoptose-induzierende Wirkung haben.
Zellen die mit Cisplatin und DO-Modulatoren behandelt worden waren, zeigten einen
erhöhten Spiegel aktiver Caspase-3 im Vergleich zu den Cisplatin alleine behandelten
Zellen. Die zusätzlich mit DO7 vorbehandelten A2780-Zellen zeigten eine um 30 %
höhere Caspase-3 Aktivität als die Cisplatin alleine behandelten Zellen (Cisplatin: 49 %,
Cisplatin + DO7: 61.7 %). Die Vorbehandlung der Zellen mit DO8 führte zu einem
quantitativ sehr ähnlichen Ergebnis (Cisplatin + DO8: 63,5 %). Die Vorbehandlung der
Zellen mit DO9 führte sogar zu 36 % mehr Caspase-3 Aktivität in den Zellen (Cisplatin
+ DO9: 74,3 %). Diese Ergebnisse bestätigen einen Zusammenhang zwischen erhöhtem
Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA der Zelle und einer erhöhten Caspase-3 Aktivität
bzw. einer erhöhten Apoptoserate der Zellen.
0
2 0
4 0
6 0
8 0
Ca
sp
as
e -
3 p
os
itiv
e Z
ell
en
[%
]
- C is P t + C is P t
C is P t
C is P t+ D O 7
C is P t+ D O 8
C is P T + D O 9
67
4.2.4 Wirkung von DO-Modulatoren auf den intrazellulären
Gesamtplatingehalt bei Cisplatin-exponierten OVK- Zellen
Um den Ursache(n) des Resistenz-Phänotyps der A2780-res Zelllinie und den
Wirkmechanismus der DO-Modulatoren besser verstehen zu können, wurde neben dem
Pt-(GpG)-Adduktspiegel in der DNA der OVK Zelllinien A2780 und A2780-res auch der
Gesamt-Platingehalt der Zelle gemessen. Dieser repräsentiert neben dem freien
intrazellulären Cisplatin auch die aktivierten Zwischenstufen, alle gebildeten Komplexe
und Reaktionsprodukte und spiegelt damit vor allem die Balance von Influx- und
Effluxaktivitäten der jeweiligen Zelle wider. Gemessen werden kann der atomare Pt-
Gehalt massenspektroskopisch mittels ICP-MS (siehe 3.10.12). Dazu wurden die Zellen
entweder nur mit Cisplatin (20 µg/mL) behandelt oder 30 min mit den DO-Modulatoren
vorinkubiert (DO7: 40 µg/mL, DO8: 20 µg/mL, DO9: 10 µg/mL). Nach einer Cisplatin-
Expositionszeit von 3 h wurden die Zellen gewaschen, lysiert und der Gesamtplatingehalt
im Lysat bestimmt. Die Ergebnisse der Gesamtplatin-Messungen sind in Abbildung 12
dargestellt.
Abbildung 12: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den intrazellulären
Platingehalt der Zelle.
Zellen wurden mit Cisplatin (20 µg/mL) alleine oder in Kombination mit DO-Modulatoren (DO7: 40
µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL, 30 min vor Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 3 h Cisplatin-
Exposition wurden die Zellen geerntet, nach der beschriebenen Methode verdaut und der intrazelluläre
Platingehalt mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppelten Plasma (ICP-MS) gemessen. A:
graphische Darstellung des Gesamtplatin Gehalts in den Zellen. B: Messergebnisse des Gesamtplatin
Gehalts der Zelle.
68
Die Zelllinien A2780 und A2780-res zeigten nach 3 h Expositionszeit einen deutlich
unterschiedlichen Gehalt an intrazellulärem Platin. Die sensitive Zelllinie A2780 hatte
mit 3,559 ng Platin/106 Zellen einen doppelt so hohen Gehalt wie die resistente Variante
A2780-res mit 1,736 ng Platin/106 Zellen. Aufgrund der Ergebnisse aus den Pt-(GpG)-
Addukt Messungen (siehe 4.2.1) kann man darauf schließen, dass der unterschiedliche
DNA-Platinierungsgrad in der A2780 und A2780-res Zellen aus einem differentiellen
Cisplatin-Import oder Export resultiert. Nach der Vorinkubation der Zelllinie A2780 mit
den DO-Modulatoren und Cisplatin wurde ein erhöhter intrazellulärer Platingehalt in den
Zellen gemessen. Die Vorbehandlung mit DO7 führte im Vergleich zur alleinigen
Cisplatin-Behandlung zu einem um 115% erhöhtem Platin-Gehalt (von 3,559 auf 7,585
ng Platin/106 Zellen). Mit DO8 stiegt der Wert auf 6,740 ng Platin/106 Zellen (plus 90 %)
und mit DO9 auf 8,304 ng Platin/106 Zellen (plus 150 %). Der Gesamtplatingehalt
korreliert demnach recht gut mit dem gemessenen Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA
der Zelle (siehe Abbildung 8 A). Diese Ergebnisse geben einen Hinweis auf die Wirkung
der DO-Modulatoren auf das Cisplatin Transport-System der Zelle. Nach einer
Vorinkubation der Cisplatin-resistenten Zelllinie A2780-res mit den DO-Modulatoren
und Cisplatin wurde keine signifikante Veränderung des intrazellulären Platingehalts
gemessen. Im Vergleich des Gesamtplatingehalts bei alleiniger Cisplatin-Behandlung
(1,736 ng Platin/106 Zellen), wurde in Kombination mit DO7 ein Platingehalt von 1,790
ng Platin/106 Zellen, mit DO8 1,987 ng Platin/106 Zellen und mit DO9 1,695 ng Platin/106
Zellen gemessen. Die Messung des Gesamtplatingehaltes in den DO-behandelten A2780-
res Zellen korreliert also nicht mit dem gesteigerten Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA
dieser Zellen (siehe Abbildung 12 B).
Die Messungen der intrazellulären Platinkonzentration in den Blasenkarzinom
Zellpärchen RT112 und RT112 LTT nach Exposition mit Cisplatin und DO-Modulatoren
ergaben tendenziell sehr ähnliche Ergebnisse wie bei den OVK Zelllinien (siehe
Abbildung 24, Anhang ).
4.2.4.1 Wirkung einer kontinuierlichen Exposition von DO9 mit Cisplatin auf die
Kinetik des intrazellulären Platingehalts der Zelle
Das in 4.2.2.1 beschriebene Experiment zeigte, dass eine Nachbehandlung mit dem
Modulator DO9 eine positive Wirkung auf die Kinetik der Pt-(GpG)-Addukte aufweist.
69
Bei A2780 Zellen ergab die Vor-und Nachinkubation mit DO9 zum Zeitpunkt 16 h nach
Cisplatin-Exposition eine kontinuierliche Zunahme von Pt-(GpG)-Addukten. Bei der
Cisplatin-resistenten A2780-res Zelllinie wurde bei Vor-und Nachinkubation mit DO9
zum Zeitpunkt 16 h keine Veränderungen im Pt-(GpG)-Adduktgehalt gemessen.
Zusätzlich zum Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA wurde der intrazelluläre Platingehalt
in diesen Zellen bestimmt. Die Behandlung und Handhabung der Zelllinien ist in 4.2.2.1
beschrieben. Die Ergebnisse der Gesamtplatin Messungen der Zelllinien sind in der
Abbildung 13 dargestellt.
Abbildung 13: Wirkung einer kontinuierlichen Exposition von DO9 mit Cisplatin auf die Kinetik des
intrazellulären Platingehalts der Zelle.
Behandlungsansatz (1: CisPt): Cisplatin-Exposition (20 µg/mL, 3 h) bis 16 h weitere Kultivierung im
Cisplatin-freien Medium. (2: CisPt + DO9): Vorinkubation für 30 min mit DO9 (10 µg/mL), anschließende
3 h Cisplatin-Exposition und bis 16 h weitere Kultivierung im Cisplatin-freien Medium. (3: CisPt + DO9+):
Vorinkubation für 30 min mit DO9 (10 µg/mL), anschließende 3 h Cisplatin-Exposition und bis 16 h
weitere Kultivierung im Cisplatin-freien Medium mit DO9 (10 µg/mL) Zusatz. Graphische Darstellung des
Gesamtplatingehalts in den A2780 (A) und A2780-res Zellen (B).
Die Messung des Gesamtplatingehaltes in Cisplatin-behandelten Zelllinie A2780 zeigte
16 h nach der Cisplatin-Exposition einen Platinspiegel von 2,93 ng Platin/106 Zellen.
Zellen die mit DO9 vorbehandelt wurden, zeigten höhere intrazelluläre Platinwert (4,09
ng Platin/106 Zellen). Bei A2780 Zellen die ein DO9+ Behandlungschema hatten, wurde
zu den Zeitpunkten 16 h ein intrazellulärer Platin-Wert von 4,85 ng Platin/106 Zellen
gemessen. Die Messung des Gesamtplatingehaltes in Cisplatin behandelten Zelllinie
A278-res zeigte einen intrazellulären Platingehalt von 0,84 ng Platin/106 Zellen. A2780-
res Zellen die mit DO9 vorbehandelt wurden und ein DO9+ Behandlungsschema hatten,
zeigten keine Veränderungen im intrazelluläre Platinspiegel (DO9/ DO9+: 0,86/0,84 ng
Platin/106 Zellen).
70
4.3 Quantifizierung der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von primärem
Tumorzellen nach Cisplatin-Behandlung ex vivo
Um die bisher an OVK- und anderen humanen Zelllinien erhobenen Befunde zum
Resistenzmechanismus und zur Wirkung der DO-Modulatoren auch auf ihre Relevanz für
klinische Fragestellungen zu prüfen, war es nötig das hier eingesetzte Messverfahren für
Platin-DNA-Addukte auf primäre menschliche Tumorzellen anwendbar zu machen.
Solche vitalen Tumorzellen lassen sich beim OVK sowohl aus soliden Tumorresektionen
aber auch, im fortgeschrittene Stadium, gegebenenfalls auch aus Aszites-Biopsien
darstellen. Sie liegen hier jedoch in der Regel in heterogenen Zellpopulationen vor, was
eine Analytik auf Einzelzellniveau deutlich erschwert. Deshalb wurden die Proben
zunächst zu Einzelzell-Suspensionen verarbeitet (siehe 3.10.3). Mononukleäre Zellen
(MNZ) wurden von Adipozyten, toten Zellen und Resten der interzellulären Matrix mit
Hilfe von Ficoll-Dichtegradienten (siehe 3.10.4) abgetrennt und ex vivo unterschiedlichen
Behandlungsformen unterzogen. Da diese Tumorzellproben in der Regel nur vor oder in
zeitlich großem Abstand nach einer chemotherapeutischen Behandlung der Patientinnen
gewonnen werden können, wurde eine Exposition mit Cisplatin auf dieser Stufe ex vivo
durchgeführt. Die primären, auf Objektträger immobilisierten, MNZ von OVK-
Patientinnen enthalten neben den Tumorzellen in der Regel verschiedene weitere
kernhaltige Zellpopulationen. Um die Adduktmessungen gezielt in den Tumorzellen
durchführen zu können, wurden diese zunächst mit Hilfe eines Tumorzellmarkers
identifiziert. Der hier verwendete Tumor-Zellmarker CA-125 steht für das Protein Mucin-
16 (MUC-16) bei dem es sich um ein langkettiges Transmembran-Glykoprotein handelt.
Aufgrund der hohen Spezifität und Sensitivität ist CA-125 zurzeit als einziger suffizienter
Marker beim Ovarialkarzinom anzusehen. Nach der Lokalisierung der CA-125-positiven
Tumorzellen unter dem Fluoreszenz-Mikroskop wurde die genaue Position jeder
Tumorzelle abgespeichert (siehe 3.10.7) und anschließend wurden die Pt-(GpG)-Addukte
in der DNA mit dem immunanalytischen Nachweißverfahren (ICA) gefärbt (siehe
3.10.8). Die Pt-(GpG)-Addukt Messung wurde in den zuvor abgespeicherten CA-125-
positiven Zellen gemessen und quantifiziert (siehe 3.10.9). Das gesamte mehrstufige
Analyse-Verfahren für die primären Tumorzellen ist in Abbildung 14 dargestellt.
71
Abbildung 14: Immunanalytisches Nachweis-Verfahren von Pt-(GpG)-Addukten in der DNA von
primären Tumorzellen.
Das speziell für die Analyse von primären Tumorzellen entwickelte Protokoll umfasst 7 Schritte.
Präparation von Biopsien zur Gewinnung von Einzelzell-Suspensionen. Isolation von mononukleären
Zellen (MNZ) mittels Ficoll-Dichtegradienten. Ex vivo Exposition der MNZ mit Cisplatin.
Immunzytochemischer Nachweis von CA-125 positiven Tumorzellen. Lokalisierung und
Positionsspeicherung von CA-125 positiven Tumorzellen. Immunanalytischer Nachweis von Pt-(GpG)-
Addukten (ICA) und deren Messung und Quantifizierung in den abgespeicherten CA-125 positiven Zellen.
4.3.1 Lokalisierung und Messung von Pt-(GpG)-Addukten in primären
Tumorzellen innerhalb einer komplexen Zellpopulation aus einer Tumor-
Probe
Die Messbarkeit der Pt-(GpG)-Addukte in primären Tumorzellen nach Cisplatin-
Exposition wurde anhand einer Gewebeprobe eines soliden Tumors untersucht. Die
hergestellte Einzelzell-Suspension (siehe 3.10.3) wurde ex vivo für 3 h unterschiedlichen
Cisplatin-Konzentrationen (5, 10 oder 20 µg/mL) ausgesetzt. Die primären Tumorzellen
wurden innerhalb der komplexen Zellpopulation wie oben beschrieben identifiziert und
die genaue Position einzelner Tumorzellen auf dem Objektträger mit Hilfe des TANGO-
72
Systems gespeichert (siehe 3.10.7). Die Pt-(GpG)-Addukte wurden in den zuvor
identifizierten CA-125-positiven Tumorzellen gemessen und ausgewertet (siehe 3.10.9).
Die Ergebnisse der ICA-Analytik in den CA-125-positiven Zellen sind in der Abbildung
15 dargestellt.
Abbildung 15: Analyse-Verfahren von (Pt-GpG)-Addukten in primären Tumorzellen einer
Tumorprobe nach ex vivo Cisplatin-Exposition.
A: pathologische HE-Färbung von Tumor-Gewebeschnitten. B: Immunfluoreszenz-Färbung mit
Tumormarker CA-125 von Tumor-Gewebeschnitten. C: Immunfluoreszenz-Färbung mit Tumormarker
CA-125 von vereinzelten Tumorzellen des soliden Tumors. D: Pt-(GpG)-Adduktfärbung nach ex vivo
Cisplatin-Exposition. E: Quantifizierung des Pt-(GpG)-Adduktgehalts in CA-125 positiven Zellen.
In der Abbildung 15 A ist die pathologische HE-Färbung eines Gewebeschnittes aus dem
resektierten Tumor einer Ovarialkarzinom-Patientin dargestellt. Die Tumorzellen sind als
73
große blau gefärbte Zellen in den tubulären Formationen erkennbar und die hell-violett
gefärbten lockeren Areale stellen das Bindegewebe dar. Anhand der gefärbten
Tumorzellen (CA-125+) in Abbildung 15 B sieht man innerhalb des Tumor-
Gewebeschnittes die Verteilung der Tumorzellen zum Bindegewebe. Die dargestellte
Immunfluoreszenz-Färbung mit dem Tumorzellmarker CA-125 zeigt eine ähnliche
Verteilung der Tumorzellen im Normalgewebe. Man erkennt die CA-125-positiven
Tumorzellen (grün) ebenfalls als kompakte Verbände zwischen den Zellen des
Bindegewebes. Anhand der Gewebeschnitte sieht man die Komplexität der
Zellpopulationen innerhalb eines soliden Tumors und dass bei der Messung der DNA-
Addukte zwischen den verschiedenen Zellarten differenziert werden muss. Nach der
Dispersion der Tumorprobe zu Einzelzell-Suspension (siehe Abbildung 15 C) konnten
die separat liegenden CA-125-positiven Tumorzellen lokalisiert und für die Pt-(GpG)-
Adduktfärbung (siehe Abbildung 15 D) und Messung verwendet werden. Das
Immunanalytische Färbeverfahren (ICA) wurde für die primären Tumorzellen optimiert,
so dass die Erhaltung aller Zellen auf dem Objektträger während und nach der
Färbeprozedur gewährleistet war (Vgl: Abbildung 15 C, DAPI und D, DAPI). Nach der
ICA-Färbung wurde in den CA-125-positiven Tumorzellen der DNA-Adduktgehalt
gemessen. Die Abbildung 15 D zeigt, dass die CA-125-positiven Tumorzellen aus diesem
Tumorgewebe ein vergleichsweise starkes Cy3-Signal aufweisen. In der Abbildung 15 E
sind die Ergebnisse der Addukt-Messung im Kern der Tumorzellen nach Exposition mit
unterschiedlichen Cisplatin-Konzentrationen (5, 10 oder 20 µg/mL) dargestellt. Ähnlich
wie bei den OVK-Zelllinien A2780 und A2780-res sieht man eine annährend lineare
Zunahme der Pt-(GpG)-Adduktsignale mit steigernder Cisplatin-Konzentration.
4.3.1.1 Zeitlicher Verlauf der Pt-(GpG)-Adduktspiegel in der DNA primärer
Tumorzellen nach Cisplatin-Exposition ex vivo
Für die Zelllinien A2780 und A2780-res hatte sich nach einer Exposition mit Cisplatin
während der anschließenden Kultivierung im Cisplatin-freien Medium eine Abnahme des
Addukgehaltes in der DNA gezeigt (siehe Abbildung 7 B). Um einen solchen
Reparatureffekt auch für primäre Tumorzellen (Patientin #101) zu untersuchen, wurden
diese zunächst 3 h mit Cisplatin (20 µg/mL) behandelt und anschließend bis zu 48 h weiter
im Cisplatin-freien Medium gehalten. Zu dem Zeitpunkt 0, 24 und 48 h nach der
Cisplatin-Exposition wurden die Zellen geerntet, auf Objektträger aufgebracht und wie
74
oben beschrieben die Pt-(GpG)-Addukte in den CA-125-positiven Tumorzellen
quantifiziert (siehe 3.10.9). Das Ergebnis der Kinetik von Pt-(GpG)-Addukten in der
DNA von primären Tumorzellen ist in Abbildung 16 dargestellt.
Abbildung 16: Kinetik von Pt-(GpG)-Addukten in der DNA von primären Tumorzellen eines soliden
Tumors nach Cisplatin-Exposition.
Primäre Tumorzellen wurden mit Cisplatin (20 µg/mL) behandelt und nach 3 h Behandlungszeit bis zu 48
h weiter im Cisplatin-freien Medium kultiviert. Zu dem Zeitpunkt 0, 24 und 48 h nach der Exposition mit
Cisplatin wurden die Zellen geerntet und auf Objektträger aufgebracht. Nach der Lokalisierung der CA-
125 positiven Tumorzellen und ICA-Färbung wurde der Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA der
Tumorzellen gemessen und quantifiziert.
Der gemessene initiale AFU-Wert nach 3 h Exposition mit Cisplatin (0 h-Wert) lag bei
3,124 AFU. Zum Zeitpunkt 24 h war der Adduktspiegel trotz Cisplatin-freier Kultur um
den Faktor 10 auf 30,38 AFU angestiegen. Ähnlich wie bei OVK Zelllinien (siehe
Abbildung 7 B) beobachtet kann es sein, dass zwischen den Zeitpunkten 0 und 24 h nach
der Cisplatin-Exposition die maximale, aber höhere als zum Zeitpunkt 24 h,
Adduktbildung erreicht wird. Zwischen den Zeitpunkten 24 und 48 h nach Cisplatin-
Exposition erfolgte eine Abnahme um 65 % auf 10,97 AFU. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die primären Tumorzellen dieser Patientin eine nennenswerte Reparaturkapazität für
Pt-(GpG)-Addukte in der DNA besitzen und insgesamt eine ähnliche Adduktkinetik
zeigen, wie die der OVK Zelllinien A2780 und A2780-res (siehe 4.2.1 B).
Ko
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Pt-
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NA
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FU
]
75
4.3.2 Analyse von Pt-(GpG)-Addukten in der DNA von primären Tumorzellen
aus unterschiedlichen Biopsien einer Patientin
Für funktionelle Untersuchungen zur Bildung und Reparatur von DNA-Addukten in
primären Ovarialkarzinomzellen stehen, wie oben angedeutet, prinzipiell zwei
zugängliche Zellquellen zur Verfügung. Neben frisch verarbeiteten Gewebeproben des
Primärtumors enthalten auch Aszites-Aspirate häufig abgesiedelte Tumorzellen. Welche
der beiden Biopsien gewonnen werden kann, ist unter anderem abhängig vom
Differenzierungsgrad, vom Stadium des Tumors und von der klinischen Logistik vor Ort.
Daraus ergibt sich die Fragestellung, ob die Messung der Pt-Adduktspiegel nach ex vivo-
Exposition von Tumorzellen aus dem Aszites repräsentativ für die Zellen des Tumors in
situ ist. Dazu wurden beide Biopsieformen von der gleichen Patientin (#102) gewonnen,
verarbeitet, exponiert und auf Pt-(GpG)-Addukte untersucht.
4.3.2.1 Analyse des initialen Pt-(GpG)-Adduktgehalts in der DNA von primären
Tumorzellen aus soliden Tumor und Aszites
Tumorzellen beider Biopsien wurden zu Einzelzell-Suspensionen dispergiert und nach
dem Ficoll-Dichtegradienten ex vivo mit Cisplatin (20 µg/mL) behandelt. Nach einer
Expositionszeit von 3 h wurden die Zellen geerntet und, wie oben angegeben, die
lokalisierten Tumorzellen für Platin-Addukte analysiert. Die Ergebnisse der Messungen
und die Visualisierung des Pt-(GpG)-Adduktgehalts in Tumorzellen des soliden Tumors
und des Aszites sind in Abbildung 17 dargestellt.
76
Abbildung 17: Visualisierung und Quantifizierung des Pt-(GpG)-Adduktgehalts in der DNA von
Tumorzellen aus primären Tumor und Aszites einer Patientin.
Tumorzellen wurden ex-vivo für 3 h mit Cisplatin (20 µg/mL) behandelt, am Ende der Expositionszeit
geerntet und auf Objektträger aufgebracht. Nach der Lokalisierung der CA-125 positiven Tumorzellen und
ICA-Färbung wurde der Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA der Tumorzellen gemessen und quantifiziert.
A: Dot Plot Auftragung einzelner Pt-(GpG)-Addukt Messungen der Tumorzellen aus primären Tumor und
Aszites. B: Lokalisierung von CA-125 positiven Tumorzellen und Visualisierung der Pt-(GpG)-Addukte.
Der gemessene initiale AFU-Mittelwert nach Cisplatin-Exposition der Tumorzellen aus
Aszites lag bei 0,76 AFU und derjenigen aus primärem Tumor fast doppelt so hoch bei
1,47 AFU. Der Unterschied in den AFU-Werten deutet auf eine unterschiedliche
Sensitivität der beiden primären Tumorzellpopulationen gegenüber Cisplatin hin. Die
Auftragung von Einzellmessungen im Dot Plot-Format zeigte eine unterschiedliche
Verteilung initialer DNA-Adduktwerte zwischen den beiden Biopsien (siehe Abbildung
17 A). Besonders die DNA-Addukte der Tumorzellen des primären Tumors sind stark
heterogen in der Verteilung. Anhand der graphischen Darstellung lassen sich die
Tumorzellen in zwei Subpopulationen einteilen, solche mit einem niedrigen und einem
hohen DNA-Platinierungsgrad. Die Tumorzellen aus Aszites sind weniger heterogen in
der Verteilung der DNA-Addukte und enthalten deutlich mehr Tumorzellen mit einem
niedrigen DNA-Adduktgehalt. Die Messung der DNA-Addukte in Tumorzellen aus dem
Aszites spiegelt offenbar nicht unbedingt die Situation im primären Tumor wieder. In der
Abbildung 17 B sind die CA-125-positiven Zellen und die entsprechenden DNA-
Adduktfärbungen dieser Zellen dargestellt. Man erkennt bei beiden Biopsien sowohl
Tumorzellen mit niedriger als auch solche mit hoher Adduktbelastung.
77
4.3.2.2 Kinetik der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von primären Tumorzellen
aus soliden Tumorgewebe und aus Aszites
Aufgrund des unterschiedlichen initialen Pt-(GpG)-Adduktgehaltes in der DNA primärer
Tumorzellen der beiden Biopsien wurde die Kinetik der Bildungs- und Reparaturraten
von Pt-Addukten dieser Tumorzellen untersucht. Primäre Tumorzellen aus dem soliden
Tumor und aus Aszites einer Patientin (#102) wurden unter gleichen Bedingungen
kultiviert und gleicher Cisplatin-Konzentration (20 µg/mL) ex vivo ausgesetzt. Nach einer
Expositionszeit von 3 h wurden die Tumorzellen weiter bis 24 h im Cisplatin-freien
Medium kultiviert. Zu den Zeitpunkten 0, 8, 16 und 24 h nach der Cisplatin-Exposition
wurden die Zellen geerntet und wie oben angegeben, die lokalisierten Tumorzellen für
Platin-Addukte analysiert. Die Kinetik der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von
Tumorzellen beider Biopsien ist in der Abbildung 18 dargestellt.
Abbildung 18: Kinetik der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA primärer Tumorzellen aus soliden Tumor
und Aszites einer Patientin.
Primäre Tumorzellen wurden 3 h mit Cisplatin (20 µg/mL) ex vivo exponiert und weiter bis 24 h im
Cisplatin-freien Medium kultiviert. Zu dem Zeitpunkt 0, 8, 16 und 24 h nach der Cisplatin-Exposition
wurden die Tumorzellen geerntet, die CA-125 positiven Tumorzellen identifiziert und lokalisiert und der
Pt-(GpG)-Adduktgehalt in der DNA mit Hilfe der ICA gefärbt und anschließend gemessen.
Die gemessenen AFU-Werte der Tumorzellen aus dem Aszites waren bei allen
Zeitpunkten bis um einen Faktor 3 niedriger als bei den entsprechenden Zellen aus dem
soliden Tumor (0 h: 0,766/1,471; 8 h: 1,072/3,133; 16 h: 1,444/3,074; 24 h: 1,233/3,330
[AFU; Aszites/solider Tumor]). Der höchste AFU-Wert der Tumorzellen aus dem Aszites
wurde zum Zeitpunkt 16 h (1,444 AFU) nach der Cisplatin-Exposition und bei
Tumorzellen aus dem soliden Tumor nach 24 h (3,330 AFU) gemessen. Zwischen den
Zeitpunkten 16 h und 24 h erfolgte bei den Tumorzellen aus dem Aszites eine leichte
0 8 1 6 2 4
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s o lid e r T u m o r
A s z ite s
T u m o r-Z e lle n a u s :
78
Abnahme der AFU-Werte (16 h/24 h: 1,444/1,233 AFU), während bei den Tumorzellen
aus dem soliden Tumor noch eine leichte Zunahme der AFU-Werte gemessen wurde (16
h/24 h: 3,074/3,330 AFU). Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die Kinetiken der Bildungs-
und Reparaturraten der Pt-(GpG)-Addukte in den Tumorzellen beider Biopsien stark
voneinander unterscheiden.
4.3.2.3 Modulation der initialen Pt-(GpG)-Adduktbildung in der DNA von
Cisplatin-exponierten primären Tumorzellen durch DO-Modulatoren
Im nächsten Schritt sollte geklärt werden, ob die bei OVK-Zelllinien beobachtete
Wirkung der DO-Modulatoren auf den Pt-(GpG)-Adduktspiegel nach einer Cisplatin-
Exposition auch in primären Tumorzellen von OVK-Patientinnen nachweisbar ist. Dazu
wurden die Tumorzellen aus dem primären Tumor und aus dem Aszites-Aspirat der
Patientin #102 getestet. Die Tumorzellen wurden entweder nur mit Cisplatin (20 µg/mL,
3 h) oder in Kombination mit den DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL, DO8: 20 µg/mL,
DO9: 10 µg/mL; jeweils 30 min vor der Cisplatin-Exposition) exponiert. Die Zellen
wurden geerntet und wie in Abschnitten 3.10.6 - 3.10.9 angegeben, die lokalisierten
Tumorzellen für Platin-Addukte analysiert. In der Abbildung 19 sind die Ergebnisse
dargestellt.
Abbildung 19: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-(GpG)-
Adduktgehalt in primären Tumorzellen aus soliden Tumor und Aszites einer Patientin.
Tumorzellen aus dem soliden Tumor (A) und aus Aszites (B) wurden ex vivo mit Cisplatin (20 µg/mL)
alleine oder in Kombination mit DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL, 30
min vor Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 3 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, auf OT
aufgebracht, CA-125 positive Tumorzellen wurden identifiziert und lokalisiert und der Pt-(GpG)-
Adduktgehalt mittels ICA angefärbt und quantifiziert.
79
Die Vorinkubation der Tumorzellen aus dem soliden Tumor mit den DO-Modulatoren in
Kombination mit Cisplatin führte zu einer leichten Erhöhung des Pt-(GpG)-
Adduktgehaltes um ca. 25 % in der DNA dieser Zellen. Die Vorinkubation mit DO7, DO8
und DO9 bewirkte einem Anstiegt von 1,47 AUF (Cisplatin alleine) auf 1,806 AFU
(DO7), auf 1,87 AFU (DO8) und auf 1,84 AFU (DO9). Bei den primären Tumorzellen
aus dem Aszites ergab die Kombination mit den DO-Modulatoren einen deutlich stärker
erhöhten DNA-Adduktgehalt im Vergleich zu Cisplatin alleine (AFU: 0,76). Der Wert
stieg nach der Vorbehandlung mit DO7 um 100 % auf 1,55 AFU, mit DO8 um fast 120
% auf 1,65 AFU und mit DO9 sogar um 170 % auf 2,04 AFU. Die Vorbehandlung der
Aszites-Zellen mit den DO-Modulatoren führte demnach zu einem DNA-
Platinierungsgrad, der vergleichbar ist mit dem DNA-Adduktgehalt in der DNA von
Tumorzellen aus dem soliden Tumor mit Cisplatin alleine (1,471 AFU).
4.3.2.3.1 Wirkung von DO-Modulatoren auf die DNA-Platinierung bei CA-125+
Tumorzellen und bei CA-125- MNZ aus Aszites-Proben
Nachdem bisher eine deutliche Tendenz zur einer erhöhten DNA-Schädigung durch die
DO-Substanzen bei Cisplatin-exponierten CA-125-positiven OVK-Zellen nachgewiesen
werden konnte, stellte sich die Frage, ob Ähnliches auch für die Fraktion der CA135-
negativen Zellen in den untersuchten Proben gilt. Da das Tumormaterial aus einer
komplexen Mischung unterschiedlicher Zellpopulationen besteht, wurde jetzt auch ohne
weitere Differenzierung die Fraktion der CA-125-negativen Zellen in die Messungen mit
einbezogen. Es wurde untersucht welche Wirkung die DO-Modulatoren in Kombination
mit Cisplatin auf den DNA-Adduktgehalt in den CA-125 negativen Zellen aufweisen. Die
Ergebnisse der Messungen des DNA-Adduktgehalts in der mononukleären Fraktion aus
dem Aszites einer weiteren Patientin (# 003) sind in der Abbildung 20 dargestellt.
80
Abbildung 20: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-(GpG)-
Adduktgehalt in CA-125+ Tumorzellen und CA-125- nicht-Tumorzellen aus Aszites.
Tumorzellen wurden ex vivo mit Cisplatin (20 µg/mL) alleine oder in Kombination mit DO-Modulatoren
(DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL, 30 min vor Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 3 h
Inkubation wurden die Zellen geerntet, auf OT aufgebracht, CA-125+ Tumorzellen und CA-125- nicht-
Tumorzellen identifiziert und lokalisiert und der Pt-(GpG)-Adduktgehalt mittels ICA angefärbt und
quantifiziert.
Die Vorinkubation der Zellen aus der Aszites-Probe # 003 mit den DO-Modulatoren in
Kombination mit Cisplatin führte bei den CA-125-positiven Tumorzellen, vor allem
durch DO8 und DO9, zu einem deutlich erhöhten DNA-Adduktspiegel. DO7 bewirkte
nur einen geringen Anstiegt um <20% von 1,52 AFU (Cisplatin alleine) auf 1,78 AFU.
Die Vorbehandlung mit DO8 oder DO9 führte jeweils zu einem signifikanten Anstiegt
um 55 % auf 2,35 AFU (DO8) bzw. um 42 % auf 2,16 AFU (DO9). Ähnlich, wie schon
bei der Tumorprobe # 102 (siehe Abbildung 19) fällt auf, dass sich auch hier die
gemessenen AFU-Werte der CA-125-positiven Tumorzellen und die der CA-125-
negativen Zellen drastisch unterscheiden. Letztere liegen um den Faktor 6,5 niedriger
(CA-125+/CA-125-: 1,52/0,23 AFU). Die große Differenz im DNA-Platinierungsgrad
deutet auf ein deutlich unterschiedliches Import-/Exportverhalten der beiden
Zellfraktionen für Cisplatin hin. Bei den CA-125-negativen Zellen bewirkte darüber
hinaus die Kombination der DO-Modulatoren keine signifikanten Veränderungen im
DNA-Adduktgehalt. Die Vorbehandlung mit DO7 und DO9 führte, bei vergleichsweise
großen interzellulären Varianz, zu einer leichten Verminderung von 0,23 AFU (Cisplatin
alleine) auf 0,10 AFU (DO7) bzw. auf 0,18 AFU (DO9) und mit DO8 zu einer leichten
Erhöhung auf 0,47 AFU. Die Ergebnisse zeigen, dass eine kombinatorische Anwendung
Ko
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Cis
Pt
Cis
Pt+
DO
7
Cis
Pt+
DO
8
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FU
]
C A -1 25+
C A -1 25-
*
**
81
von Cisplatin mit den DO-Modulatoren den DNA-Adduktgehalt und damit vermutlich
die zytotoxische Wirkung, bei CA-125-negativen Zellen aus dem Tumor-Biopsat nicht
sehr stark beeinflusst.
4.3.3 Analyse des individuellen Pt-(GpG)-Adduktspiegels nach Exposition mit
Cisplatin und DO-Modulatoren in der DNA von Tumorzellen
verschiedener Patientinnen
Abschließend sollte herausgearbeitet werden, ob die quantitative Verteilung der
Cisplatin-induzierten Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von primären OVK-Tumorzellen
individueller Patientinnen typische Muster aufweist, besonders unter der Einwirkung der
DO-Modulatoren. Sollte dies der Fall sein, könnte mittelfristig untersucht werden ob es
einen Zusammenhang gibt zwischen dem jeweiligen Platinierungsmuster in der DNA der
Tumorzellen und den entsprechenden klinischen Daten der Patientin, wie Status,
Prognose oder Therapieansprechen. Verwendet wurden dazu zwei Biopsien von soliden
Tumoren (#100 und #101) von Patientinnen mit einem Rezidiv. Zwei Aszites-Biopsien
von einer Patientin mit einer primären Krebserkrankung (#00.1) und einer Patientin mit
einem Rezidiv (#001). Primäre Tumorzellen wurden entweder nur mit Cisplatin (20
µg/mL) oder in Kombination mit DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL, DO8: 20 µg/mL,
DO9: 10 µg/mL; 30 min vor der Cisplatin-Exposition) exponiert. Die Zellen wurden
geerntet und wie oben angegeben, die lokalisierten Tumorzellen für Platin-Addukte
analysiert. Die Ergebnisse der jeweiligen DNA-Addukt Messungen sind in Abbildung 21
dargestellt.
82
Abbildung 21: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-(GpG)-
Adduktgehalt in primären Tumorzellen aus soliden Tumoren und Aszites unterschiedlicher
Patientinnen.
Tumorzellen aus dem soliden Tumor (A, #101; B, #100) und aus Aszites (C, #00.1; D, #001) wurden ex
vivo mit Cisplatin (20 µg/mL) alleine oder in Kombination mit DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL; DO8:
20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL, 30 min vor Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 3 h Inkubation wurden die
Zellen geerntet, auf OT aufgebracht, CA-125 positive Tumorzellen identifiziert und lokalisiert und der Pt-
(GpG)-Adduktgehalt mittels ICA angefärbt und quantifiziert.
Die gemessenen AFU-Werte der Ca-125-positiven Zellen aus den beiden soliden
Tumoren unterscheiden sich sehr stark (Vgl. Abbildung 21 A und B, Cisplatin). Der in
den Tumorzellen der Patientin #101 gemessener AFU-Wert nach Cisplatin (3,12 AFU)
liegt um den Faktor 5,4 höher als der entsprechende Wert bei den Tumorzellen der
Patientin #100 (0,57). Die AFU-Werte der Tumorzellen aus den beiden Aszites-Biopsien
nach der Cisplatin-Behandlung unterscheiden sich ebenfalls deutlich um einen Faktor 3,4
(Vgl. Abbildung 21 C und D, Cisplatin). Die in den Tumorzellen gemessenen
Unterschiede der initialen DNA-Adduktbelastung nach gleicher Exposition sind
möglicherweise ein funktioneller Indikator für die individuelle Sensitivität der
Tumorzellen jeder Patientin gegenüber Cisplatin. Die Vorbehandlung der Tumorzellen
von der Patientin #101 mit den DO-Modulatoren führte zum Anstieg von 3,12 AFU
83
(Cisplatin alleine) auf 3,60 (AFU, DO7), 4,27 (AFU, DO8) und 4,56 (AFU, DO9). Bei
den primären Tumorzellen des soliden Tumors der Patientin #100 wurde in Kombination
mit DO-Modulatoren DO7 und DO8 keine Veränderung im Adduktgehalt gemessen. Nur
durch die Vorbehandlung mit DO9 stieg der AFU-Wert von 0,57 AFU (Cisplatin alleine)
um 70 % auf 0,981 AFU an. Bei den Messungen der Tumorzellen aus dem Aszites sieht
man ebenfalls eine unterschiedliche Wirkung der DO-Modulatoren auf den Cisplatin-
induzierten DNA-Adduktgehalt der Zellen. Nach der Vorbehandlung der Tumorzellen
aus dem Aszites der Patientin #00.1 mit den Modulatoren DO8 und DO9 wurden erhöhte
DNA-Addukte in den Tumorzellen gemessen, während nach der Vorbehandlung mit DO7
keine Unterschiede im DNA-Adduktgehalt festgestellt werden konnten. Die
Vorinkubation mit DO8 und DO9 führte zum Anstieg von 4,72 AFU (Cisplatin allein)
auf 5,68 AFU (DO8) und 11,07 AFU (DO9). Nach der Vorbehandlung der Tumorzellen
aus dem Aszites der Patientin #001 wurde nur mit dem Modulator DO9 ein erhöhter
DNA-Adduktgehalt gemessen. Die Vorinkubation mit DO9 führte zu einem Anstieg von
0,36 AFU (Cisplatin alleine) auf 6,00 AFU. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es
offenbar in der Tat bei gleicher (ex vivo) Behandlung individuelle DNA-
Belastungsmuster in den Tumorzellen einzelner Patientinnen gibt und ebenfalls ein
individuelles Modulationsprofil der Adduktspiegel durch die DO-Inhibitoren.
84
5 Diskussion
Das Ovarialkarzinom ist die siebthäufigste Tumorerkrankung der Frau und die
fünfhäufigste Tumor-assoziierte Todesursache in den USA und Europa (Siegel, et
al.2017). Aufgrund eines Mangels an sensitiven und spezifischen Screeningverfahren
werden ca. 70 % der Ovarialkarzinome erst in den fortgeschrittenen Stadien (FIGO III)
diagnostiziert (Rescigno, et al.2013). Im Unterschied zu anderen Krebsarten ist eine
Früherkennungsuntersuchung beim Ovarialkarzinom aufgrund fehlender spezifischer
Symptomatik selten aussagekräftig und eine endgültige Diagnose kann erst bei der
Operation gestellt werden. Im Falle einer späten Diagnose hat das Ovarialkarzinom eine
schlechte Prognose, die 5-Jahresüberlebensrate liegt bei etwa 35 % (Vaughan, et al.2011).
Das Therapiekonzept beim Ovarialkarzinom besteht aus zwei Schritten. Die maximale
Tumorreduktion ist das Ziel einer primären Operation gefolgt von einer postoperativen
adjuvanten Chemotherapie mit Platin- und Taxanhaltigen Medikamenten. Trotz initial
gutem Ansprechen auf die Primärtherapie entwickeln etwa 25 % der Patientinnen mit
einem Platin-resistenten Tumor innerhalb von sechs Monaten und 60 % der Patientinnen
mit einem Platin-sensitiven Tumor innerhalb von 2 Jahren nach der Erstdiagnose ein
Rezidiv. Auch ein großer Anteil der Patientinnen mit einem zunächst als Platin-responsiv
eingestuften Tumor entwickelt ein Rezidiv mit einem Platin-resistenten Phänotyp
(Armstrong, et al.2006). Die Resistenz-Entwicklung von Tumorzellen gegen einzelne
Chemotherapeutika oder eine ganze Wirkstoffgruppe ist eines der größten Probleme in
der onkologischen Klinik. Ein weiterer limitierender Faktor einer effektiven Therapie mit
Cisplatin sind die schwerwiegenden Nebenwirkungen im Normalgewebe. Zusätzlich
stellt die Tumorkachexie und die Cisplatin-induzierte Anorexie (cancer anorexia-
cachexia syndrome (CACS) (Bennani-Baiti, et al.2009)) einen weiteren Therapie-
limitierenden Faktor dar. Die Zelltyp-spezifischen Nebenwirkungen und das CAC-
Syndrom beschränken die zu verabreichende Cisplatin-Dosis und sorgen in einigen Fällen
für einen vorzeitigen Abbruch der Chemotherapie.
In dieser Arbeit wurde die Cisplatin-induzierte Toxizität auf den Gesamtorganismus,
sowie im Normalgewebe des peripheren Nervensystems (PNS) näher untersucht.
Zusätzlich wurde die Bedeutung des Adduktspiegels für die Cisplatin-Resistenz beim
Ovarialkarzinom und deren Modulation durch DO-Modulatoren weiter analysiert. Als in
vitro Modell dienten etablierte ovariale Krebszelllinien sowie Tumormaterial aus OVK
Patientinnen. Das immunanalytische Nachweisverfahren von DNA-Addukten sollte am
85
primären Tumormaterial mit dem klinischen Ansprechen der Patientinnen verglichen und
als prädiktiver Marker für das Therapieansprechen auf Cisplatin etabliert werden.
5.1 Zur Rolle von Pt-(GpG)-Addukten in Physiologischen Zellen und dessen
Modulation
5.1.1 Die Ko-Applikation von DO9 reduziert die systemische Toxizität von
Cisplatin bei der Maus
Die während einer Chemotherapie auftretende Kachexie stellt eine therapeutische
Herausforderung dar und ist eng assoziiert mit einer Einschränkung der Lebensqualität,
der Prognose der Patientinnen und ist für erhöhte Morbidität und Mortalität der
Tumorpatientinnen verantwortlich. Bei einer Chemotherapie-assoziierten Anorexie
kommt es durch Übelkeit, Veränderung der Geschmacksempfindung und
Appetitlosigkeit zu einer Reduktion der Nahrungsaufnahme (Bachmann, et al.2008). Von
allen Platin-haltigen Präparaten besitzt Cisplatin das stärkste emetogene Potenzial. Durch
die resultierende Mangelernährung kommt es zum Gewichtsverlust und Entwicklung der
Kachexie. Zusätzlich kommt bei manchen Tumoren durch Freisetzung von endogenen
Transmittern oder Tumorprodukten zur Tumorkachexie wodurch der Verlust an Fett- und
Muskelmasse verstärkt wird (Dodson, et al.2011, Ockenga, et al.2002). Die
Tumorkachexie tritt bei mehr als 70 % der Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren auf
und ist bei mindestens 30 % der Tumorpatienten als Co-Mortalitätsfaktor anzusehen (Del
Fabbro2015). Der als Cancer Anorexia-Cachexia Syndrome (CACS) (Bennani-Baiti, et
al.2009) bezeichnete Zustand stellt einen Therapie-limitierenden Faktor dar, wodurch die
zu verabreichende Cisplatin-Dosis limitiert wird und in einigen Fällen für einen
vorzeitigen Abbruch der Chemotherapie sorgt. Ähnliche Symptome wurden auch bei
einer Mehrfachbehandlung von Mäusen oder Ratten mit höherdosiertem Cisplatin
beobachtet (Alves, et al.2017, Damrauer, et al.2008). Als Prophylaxe von Zytostatika-
induzierten Nebenwirkungen wie Nausea und Emesis werden therapiebegleitend
Antiemetika wie Dopamin-Rezeptor-Antagonisten, Kortikosteroide, 5-HT3-Rezeptor-
Antagonisten (Setrone), NK-1-Rezeptor-Antagonisten, Anticholinergika,
Benzodiazepine und H1-Antihistaminika eingesetzt. Zur Zeit sind jedoch wenige
Therapieansätze vorhanden, die eine nachhaltige Stabilisierung des Körpergewichts im
Krankheitsverlauf bewirken (Bachmann, et al.2008). In der Erstlinien-Therapie zur
86
antiemetischen Prophylaxe von Zytostatika-induzierten Nausea und Emesis spielen
aktuell die Substanzklassen 5-HT3-Rezeptor-Antagonisten, NK-1-Rezeptor-
Antagonisten und die Kortikosteroide eine Rolle (Schmitt, et al.2010).
Diphenhydramin (DO7) ist ein Arzneistoff aus der Klasse der H1-Antihistaminika der
ersten Generation zur Selbstmedikation, welches Histamin sowohl an peripheren
(antiallergische Wirkung) als auch an zentralen H1-Rezeptoren, die sich unter anderem
im Brechzentrum befinden, nicht-kompetitiv blockiert. Aufgrund seiner zusätzlichen
anticholinergen Wirkung wird es eingesetzt gegen Übelkeit, Erbrechen, Schwindel,
allergische Reaktionen und Schlafstörungen. In Deutschland spielt DO7 vor allem als
nicht-rezeptpflichtiges Schlafmittel und zur Prophylaxe und symptomatische Therapie
von Übelkeit und Erbrechen eine Rolle. Das Salz von Diphenhydramin in Kombination
mit 8-Chlortheophyllin (Dimenhydrinat) wird zur symptomatischen Therapie bei
Übelkeit und Erbrechen verabreicht, dessen Verordnungen haben jedoch abgenommen
(Schwabe, et al.2017). Anhand von Behandlungsprotokollen wird DO7 maximal als
unterstützendes Arzneimittel verwendet, um die Wirkung von Antiemetika zu verstärken,
wird jedoch nicht als Monopräparat bei Zytostatikum-indizierten Übelkeit eingesetzt
(Aapro, et al.1991, Köseoglu, et al.1998, Madero-Lopéz, et al.1991). Es liegen keine
Informationen über einen Einsatz von Diphenhydramin als Monopräparat in der primären
antiemetischen Prophylaxe vor.
Orphenadrin (DO8) gehört ebenfalls zur Klasse der H1-Antihistaminika und ist ein
Methyl-Derivat von Diphenhydramin. Neben seiner skelettmuskelrelaxierenden Wirkung
hat es ebenso geringe antihistaminische und milde anticholinerge Eigenschaften.
Ursprünglich wurde es aufgrund seiner anticholinergen Wirkung als Muskelrelaxans zur
Parkinsonbehandlung eigesetzt. Es wird hauptsächlich als Analgetikum zur
symptomatischen Behandlung schmerzhafter Verspannungen der Skelettmuskulatur
genommen.
2-[(2,6-Dimethylphenyl)-Phenyl-Methoxy]-N,N-Dimethylethanamine (DO9) ist ein
zweifachmethyliertes Derivat von Diphenhydramin. Zu dieser Substanz liegen bisher
keine zugänglichen Informationen zur pharmakologischen Wirkung. Es müssen noch
viele weitere präklinische Daten gesammelt werden, bevor die Substanz für die klinischen
Studien freigegeben werden kann
87
Vorangegangene Experimente zeigten bei einer kombinatorischen Anwendung von
Cisplatin mit DO-Modulatoren eine Reduktion der hohen DNA-Platinierung in den
sensitiven Zellen von Cochlea, Niere und Dorsalganglien (DRG) (MelnikovaOktober
2013, MelnikovaFebruar 2014). Neben der Reduktion der DNA-Adduktierung in den
Zellen der Cochlea, wurde auch eine funktionelle Schutzwirkung auf die Hörkapazität
der Maus gezeigt (MendusNovember 2010). Ob sich eine kombinatorische Therapie mit
Cisplatin und DO-Modulatoren im Vergleich zur Cisplatin-Monotherapie auch reduktiv
auf die systemische Toxizität auswirkt, wurde in C57BL/6 Mäusen untersucht. Die
Modulatoren DO7 und DO8 sind seit Jahren zugelassene Medikamente aus der Gruppe
der H1-Antihistaminika mit bekannter Pharmakokinetik und -Dynamik. Demgegenüber
gibt es zu dem Derivat DO9 neben den Befunden aus unserer Arbeitsgruppe bisher keine
pharmakologischen oder toxikologischen Daten. Die kombinatorische Behandlung der
Mäuse mit Cisplatin und DO9 (DO9-Gruppe) zeigte eine signifikante Verbesserung der
Überlebensrate und einen geringeren Gewichtsverlust im Vergleich zu Cisplatin alleine
(Cisplatin-Gruppe). Die DO9-Gruppe hatte nach 8 Wochen eine Überlebensrate von 100
% und einen Gewichtsverlust von 24 %, während die Überlebensrate der Cisplatin-
Gruppe nach 8 Wochen nur noch 25 % und der Gewichtsverlust 35 % betrug (siehe
Abbildung 5 A, B). Im Verlauf des Experimentes hatte die Cisplatin-Gruppe nach 4
Wochen Behandlungszeit 15 % mehr Gewichtsverlust als die DO9-Gruppe. In einem
ähnlichen in vivo Experiment wurde in dieser Arbeitsgruppe durch eine kombinatorische
Anwendung von Cisplatin mit DO7 in der Tendenz ähnliche Ergebnisse erzielt. Auch hier
war in der DO7-Gruppe im Vergleich zur Cisplatin-Gruppe das Überleben signifikant
erhöht. Die DO7-Gruppe hatte nach 8 Wochen eine Überlebensrate von 60 %, während
die Überlebensrate der Cisplatin-Gruppe bereits nach vier Wochen bei 0 % lag. Die
Wirkung von DO8 auf die systemische Toxizität von Cisplatin in vivo muss erst
ausgetestet werden. Die zusätzliche Schutzwirkung beider Modulatoren verbesserten
während der Therapie die Überlebensrate der Mäuse und stabilisierten das
Körpergewicht. Klinische Untersuchungen konnten zeigen, dass eine Stabilisierung des
Körpergewichtes mit einer Lebensverlängerung sowie einer besseren Lebensqualität
einhergeht (Davidson, et al.2004). Patienten könnten von der Ko-Applikation hinsichtlich
der Verbesserung des Allgemeinbefindens und der reduktiven systemischen Toxizität und
somit Ausbildung einer Zytostatika-induzierten Anorexie und Kachexie, sowie von der
Schutzwirkung vor der hohen Adduktierung in den empfindlichen gesunden Zellen
während einer Cisplatin-Therapie profitieren. In diesem Experiment wurde gezeigt, dass
88
die Cisplatin-induzierte Kachexie durch die Ko-Applikation reduziert werden kann. In
weiteren Experimenten soll in einem Maus-OVK-Modell in Zusammenarbeit mit Dr.
Kuhlmann (Dresden) die Wirkung der DO-Substanzen sowohl auf das antineoplastische
Potential von Cisplatin als auch auf die Cisplatin-induzierten Nebenwirkungen
einschließlich der Tumor-induzierten Kachexie untersucht werden.
5.1.2 Hohe Adduktbelastung in der DNA von DRG-Mantelzellen bei der
Cisplatin-induzierten Polyneuropathie in Ratten
Die zytotoxische Wirkung von Cisplatin ruft im Laufe der Behandlung neben den
gravierenden Funktionsstörungen im Innenohr (Ototoxizität) und der Niere
(Nephrotoxizität) auch massive neurotoxische Nebenwirkungen (Neurotoxizität) im
peripheren Nervensystem hervor (Argyriou, et al.2012). Die daraus resultierende
Polyneuropathie (PNP) wird in der Literatur als Folge einer funktionellen Schädigung
durch die Cisplatin-induzierten DNA-Addukte in den Spinalganglion-Neuronen
diskutiert (Dzagnidze, et al.2007, Gill, et al.1998). Da es sich bei Neuronen um
postmitotische Zellen handelt, kann die Wirkung von Cisplatin auf die DNA-Replikation
eher ausgeschlossen werden. Wahrscheinlicher ist der Mechanismus der Hemmung der
RNA- und Proteinsynthese, sodass eine Aufrechterhaltung des Proteinhaushaltes nicht
mehr gewährleistet werden kann und die Zelle dadurch einen Funktionsverlust erleidet.
Neuste Studien zeigten, dass verschiedene weitere Mechanismen zur Entwicklung der
peripheren Neurotoxizität beitragen können. Mechanismen wie strukturelle
Veränderungen in peripheren Nerven, Veränderungen der Mitochondrien, erhöhter
oxidativer Stress, Veränderungen der Ionenkanäle und Aktivierung von
Neuroinflammation.
Untersuchungen von Nervenbiopsien von Patienten unter Cisplatin-Therapie zeigten
strukturelle Veränderungen in Form von axonaler Degeneration und einen sekundären
Myelinabbau (Bennett, et al.2011, Roelofs, et al.1984, Thompson, et al.1984, Thompson,
et al.1984). Solche strukturelle Veränderungen in peripheren Nerven können zur
Entwicklung von klinischen Symptomen führen (Han, et al.2013). Weitere beschriebene
Mechanismen in der Literatur Stellen die alleinige Rolle von DNA-Addukten als Ursache
für die Genese von PNP in Frage. Eine wichtige Rolle in der Entstehung der PNP sollen
die Mitochondrien spielen.
Es wurden Verringerungen der funktionellen Mitochondrien und ein Verlust des
mitochondrialen Membranpotentials, sowie ultrastrukturelle Veränderungen beobachtet,
die auf eine subzelluläre Vakuolen-Degeneration hindeutet (Melli, et al.2008).
89
Zytostatika induzieren Schäden in den Mitochondrien hauptsächlich durch
Beeinträchtigung von ATPase-abhängigen Na/K-Pumpen und Veränderungen der
Kalziumhomöostase. So soll beispielsweise Cytochrom-c-vermittelte Aktivierung-der
Caspasen durch eine Calciumüberladung bedingt sein (Mattson, et al.2003). Cisplatin soll
die Expression von N-Typ VGCC Kalziumkanälen erhöhen (Leo, et al.2017), wodurch
es zu einer Kalziumüberladung der Zelle, Freisetzung von Cytochrom C aus den
Mitochondrien und dadurch zur Aktivierung von Caspasen gefolgt von Apoptose kommt
(Gill, et al.1998, McDonald, et al.2002). Die Ansammlung dysfunktionaler
Mitochondrien würde zum Anstieg von oxidativem Stress führen, der auch bei peripheren
Nervenschädigung eine Rolle spielt (Sandireddy, et al.2014).
Auch Ionenkanäle einschließlich spannungsgesteuerter Na+ -und TRP-Kanäle sollen bei
der Entstehung der PNP eine Rolle spielen (Goswami2012). Veränderungen im Na+-
Kanal induzieren ektopische Aktivität in primären afferenten Neuronen und führen zu
Parästhesien und Faszikulationen (Webster, et al.2005). Weitere wichtige Rolle in der
Modellentstehung von PNP sollen die transienten Rezeptorpotentialkanäle wie TRPV1,
TRPA1 und TRPM8, Sensoren für kalte, mechanische (TRPA1-Kanäle) und Wärme
(TRPV1-Kanäle) Stimuli, spielen (Goswami2012). Cisplatin soll die Expression von
TRPA1-, TRPM8- und TRPV1-mRNA in DRG-Neuronen erhöhen.
Eine Chemotherapie-induzierte periphere Neurotoxizität wird von einer
neuroinflammatorischen Reaktion begleitet. Durch eine Chemotherapie-induzierte
Verletzung akkumulieren zahlreiche Entzündungszellen, in Reaktion auf die Aktivierung
von Schwannzellen und Makrophagen, um die geschädigten Nerven herum. Es kommt zu
einer Produktion von Zytokinen und Chemokinen wie TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2
und CXC-Familie. Diese Entzündungsmediatoren sind in der Lage die Expression von
Ionenkanälen wie Na+ und Ca2+ hoch zu regulieren (Schäfers, et al.2008). Auch die Toll-
like-Rezeptoren TLR2 und TLR4 in der Peripherie können an mechanischer Allodynie,
die mit Chemotherapeutika assoziiert ist, beteiligt sein. Es wurde gezeigt, dass eine
Stimulation der TLR2 und TLR4 mit neurotoxischen Substanzen die Initiierung einer
Entzündung und Erhöhung proinflamatorischer Zytokine als Antwort hat (Akira, et
al.2004).
Ein weiterer Mechanismus der Sensitivität des peripheren Nervensystems und der Genese
einer Cisplatin-induzierten Neuropathie ist mit mehreren Klassen von
Membrantransportern assoziiert (Ceresa, et al.2011). Es wurde gezeigt, dass sowohl
Kupfer- als auch organische Kationentransporter den Transport von Platinmedikamenten
90
in das dorsale Wurzelganglion sensorischer Nerven erleichtern (Ciarimboli, et al.2010).
Es wurde gezeigt, dass CTR1 und OCT2 in den DRG-Neuronen exprimiert werden
(Cavaletti, et al.2014). Bei einer Untergruppe der DRG-Neuronen, die besonders anfällig
für die Platin-induzierte Toxizität sind, wurde eine Überexpression von CTR1 festgestellt.
Dessen Membranlokalisation deutet auf CTR1-assoziierten Mechanismus der neuronalen
Aufnahme von Platinmedikamenten und der Neurotoxizität hin (Liu, et al.2009). In
weiteren Studien wurde gezeigt, dass vor allem die Klasse der organischen
Kationentransporter (OCT), spezifisch die Subtypen OCT1 und OCT2, am Influx von
Platinmedikamenten in DRG-Neuronen beteiligt sind (Cavaletti, et al.2014).
An einem Mausmodell der Behandlungs-induzierten PNP nach repetitiver Cisplatin-Gabe
konnte in dieser Arbeitsgruppe ein klarer Zusammenhang zwischen der zunehmenden
Akkumulation von Platin-Addukten im Kern der Ganglienzellen und dem Schweregrad
der PNP gefunden werden (Dzagnidze, et al.2007). Untersuchungen von DNA-Addukten
an Gewebeschnitten in Ganglienzellen zeigten eine starke Heterogenität der
Adduktbelastung zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Ganglien. Die
Ganglien bestehen aus Nervenzellen (Neuronen) die epithelartig von Gliazellen umhüllt
werden. Neurogliazellen sind deutlich zahlreicher als Neurone. Sie erfühlen für die
Neurone verschiedene Funktionen: Hüll-, Stütz-, Ernährungs- und Schutzfunktion. Im
peripheren Nervensystem wird zwischen Schwann-Zellen und Satelliten- (oder Mantel-
)Zellen unterschieden. Die Schwann-Zellen bilden die Myelinscheide der zentralen
Axone während die Mantelzellen dem Stoffwechsel der Ganglienzellen dienen. Bisher
konnte nicht eindeutig gezeigt werden, welche die eigentlich kritischen Zielzellen der
Cisplatin-induzierten Neurotoxizität sind. Um diese Fragestellung weiter aufzuklären,
wurde die Adduktbelastung der Ganglienzellen in einem PNP Rattenmodell näher
analysiert (Leo, et al.2017). Auch im Rattenganglion wurde ein unterschiedlicher DNA-
Platinierungsgrad in den verschiedenen Zelltypen festgestellt. Die Hälfte der Zellen,
darunter auch die großkernigen Neurone, wies im Kern einen vergleichsweise niedrigen
Adduktspiegel auf. Die andere Hälfte der Zellen, vor allem um die Neurone angeordneten
kleinkernigen Mantelzellen, zeigte einen deutlich stärkeren DNA-Platinierungsgrad auf
(siehe Abbildung 6 A, N-Typ VGCC/Pt-(GpG)). Aufgrund der morphologischen
Anordnung der Mantelzellen um die Neuronen könnten diese eine Abschirmende
Funktion haben und somit die Neuronen vor der Cisplatin-Einwirkung und der
Adduktakkumulation schützen. Ebenso könnte ein intrinsischer Schutzmechanismus in
den Neuronen diese vor der DNA-Platinierung bewahren. Der Vergleich der DNA-
91
Adduktfärbung einer in vivo-Behandlung der Ratte und einer ex vivo-Exposition aus den
Ganglien präparierter Einzelzell-Suspension mit Cisplatin ergab ein ähnliches Bild wie
bei der in vivo-Applikation (siehe Abbildung 6 C). Die quantitative Auswertung der
DNA-Addukte zeigte, dass auch bei der ex vivo-Applikation haben die Gliazellen I
unabhängig von der in situ-Situation (morphologische Anordnung der Zellen), einen
zweifach höheren Adduktspiegel als die Neuronen (siehe Abbildung 6 E). Dieses
Ergebnis unterstützt die Annahme, dass die geringe DNA-Platinierung der DRG-
Neuronen eher auf die Wirkung zelleigener Faktoren, wie Import-/Export-Mechanismen
für Cisplatin beruht und nicht in erster Linie mit einer Abschirmung durch die
Mantelzellen zustande kommt. Anhand der DNA-Adduktmessung in den Gliazellen
lassen sich diese in hoch (Gliazellen I) und niedrig (Gliazellen II) adduktierte Glia-
Zelltypen einteilen. Die beiden Haupt-Typen der Gliazellen sind neben den Mantelzellen
die Schwann-Zellen. Letztere sind, wenn überhaupt, extrem niedrig platiniert. Dies
spricht ebenfalls für extrem Zelltyp-spezifische Import-/Export-Verhalten. Die
Adduktbelastung in den Mantelzellen deutet darauf hin, dass die Schädigung dieses
Zelltyps ebenfalls eine wichtige Rolle in der Cisplatin-induzierten Neurotoxizität spielen
kann und die Bedeutung der Gliazellen für die Funktion des Nervensystems bisher
unterschätzt wurde. Ein Beispiel bei dem dieser Mechanismus in Betracht gezogen
werden könnte ist das Coasting-Phänomen, ein Fortschreiten der PNP nach der
Beendigung der Cisplatin-Therapie. Anders als früher angenommen greifen Gliazellen
sehr aktiv in die Informationsverarbeitung ein und einige neurologische Erkrankungen
könnten auf pathologische Veränderungen der Gliazellen zurückgeführt werden. Es gilt
als sicher, dass Gliazellen von Nervenzellen Signale aufnehmen können. Diese
Ergebnisse werfen die Frage auf ob Cisplatin eine Neuropathie oder eher eine Mantelzell-
Pathologie induziert und ob ein Funktionsverlust der Gliazellen oder eine geänderte
Kommunikation mit Neuronen ursächlich für die PNP-Symptomatik ist.
92
5.2 Zur Rolle von Pt-(GpG)-Addukten bei der Cisplatin-Resistenz im OVK-
Modell
Neben den gravierenden Nebenwirkungen einer Cisplatin-Therapie im Normalgewebe
stellt die initiale und erworbene Resistenz der Tumorzellen gegenüber dem Zytostatikum
einen zusätzlichen limitierenden Faktor einer Platin-basierten Chemotherapie dar. Als in
vitro-Modell für die Untersuchung der Resistenzmechanismen in Bezug auf den Pt-
(GpG)-Adduktspiegel in Cisplatin-sensitiven und -resistenten Zelllinien wurde das
etablierte Ovarialkarzinom-Pärchen A2780 und A2780-res verwendet. Humane Tumor-
Zelllinien sind in der Regel aus dem Tumorgewebe etabliert und besitzen noch bestimmte
charakteristische Eigenschaften des Ausgangsgewebes. Deshalb können sie mit gewissen
Einschränkungen als ein in vitro-Modell für den Primärtumor verwendet werden. Neben
den Untersuchungen zum Resistenz-Mechanismus diente dieses Modell hier auch zur
Wirkungsanalyse der DO-Modulatoren im OVK-Tumorsystem. Im Gegensatz zu den
erwünschten Schutzeffekten im gesunden Gewebe soll keine Schutzwirkung bei
Tumorzellen stattfinden damit die Effizienz einer Cisplatin-Therapie nicht beeinträchtigt
wird.
5.2.1 Die Cisplatin-Resistenz der A2780-res Zellen ist assoziiert mit einem
niedrigen Pt-(GpG)-Adduktspiegel
Das Nichtansprechen auf eine Chemotherapie mit Cisplatin in der onkologischen Klinik
ist in der Regel multifaktorieller Natur, bei der oft mehrere zelluläre Funktionen involviert
sind. Die zugrundeliegenden Resistenzmechanismen können dabei in drei Kategorien
eingeteilt werden. Pre-target-Mechanismen werden alle Funktionen zusammengefasst,
die zu einer Verringerung der Bindung von Cisplatin an die DNA beitragen. On-target-
Mechanismen führen zu einer direkten Veränderung der einmal gebildeten Platin-DNA-
Addukte. Als Post-target-Mechanismen: gelten alle Veränderungen, durch die DNA-
Schadens-aktivierte letalen Signalwege negativ beeinflusst werden (Galluzzi, et al.2012).
Die etablierten OVK-Linien A2780 und A2780-res waren ein gutes in vitro Modell, um
die pre- und on-target-Mechanismen in Bezug auf den jeweiligen Pt-(GpG)-
Adduktgehalt näher zu untersuchen. Die Kinetiken der Pt-(GpG)-Addukte nach
identischer Cisplatin-Exposition zeigten die A2780-res-Zellen eine 3-fach niedrigere
Adduktbelastung in der DNA im Vergleich zu der parentalen Zelllinie A2780 (siehe
Abbildung 7 B). Die Resistenz steht hier also mit einer reduzierten DNA-
93
Adduktbelastung im Zusammenhang. Diese Ergebnisse wurden in weiteren Cisplatin-
sensitiven und resistenten Zellpärchen unterschiedlicher Tumorentitäten bestätigt. Die
Messungen der DNA-Addukte in Blasenkarzinom-Zellpärchen RT112 (Cisplatin-
sensitiv) und RT112 LTT (Cisplatin-resistent) (siehe Anhang, Abbildung 24) und in
Neuroblastom-Zellpärchen (MelnikovaOktober 2013) LAN-1 WT (Cisplatin-sensitiv)
und LAN-1 res (Cisplatin-resistent) (siehe Anhang, Abbildung 25) zeigten ebenfalls
einen höheren Adduktspiegel in der DNA der jeweiligen sensitiven Zellen. Für den
verminderten Adduktgehalt in der DNA der resistenten Zelllinien kommen mehrere
Mechanismen in Betracht: i) Reduktion des intrazellulären Cisplatin durch geringeren
Import oder gesteigerten Export; ii) verminderte Aktivierung von Cisplatin (Bildung von
Aquakomplexen) in der Zelle; iii) erhöhte zytoplasmatische Detoxifizierung von
Cisplatin (Sequestrierung durch Gluthation (GSH) oder Metallothioneine; iv) erhöhte
Reparatur von DNA-Schäden. Wie vielfältig die Mechanismen einer Cisplatin-Resistenz
sein können zeigten frühere Messungen in der Cisplatin-resistenten Lungenkarzinom-
Zelllinie A549. Ein Vergleich des Gesamtplatingehaltes und der DNA-Addukte zeigte
sogar bei einem sehr hohen Gesamtplatinspiegel in der Zelle eine sehr niedrige
Adduktierung der DNA (siehe Anhang, Abbildung 26) (MelnikovaOktober 2013).
Weitere Addukt-Messungen in der Cisplatin-resistenten OVK-Zelllinie SKOV-3 und
Cisplatin-sensitiven Zelllinie IGROV-1 zeigten ähnliche Adduktbelastung in der DNA
beider Zelllinien (siehe Abbildung 8). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die
Sensitivität der Zellen gegenüber Cisplatin mit weiteren post-target Effekten wie
Addukttoleranz und Aktivität des Apoptose-Signalweges in Zusammenhang steht. In der
Literatur werden zahlreiche Mechanismen beschrieben die zur Resistenzentwicklung im
Ovarialkarzinom beitragen können (siehe 1.3.3.1).
Die Analyse der intrazellulären Gesamtplatinkonzentration in den OVK-Zelllinien zeigte
in A2780-Zellen eine doppelt so hohe Gesamtplatinkonzentration wie in A2780-res (siehe
4.2.4). Zusammen mit dem sehr frühen Auftreten (bereits direkt nach Exposition) der
unterschiedlichen Adduktspiegel sprechen diese Daten für einen verminderten Import
bzw. erhöhen Export von Cisplatin als Ursache für den geringeren Platinierungsgrad in
A2780-res Zellen. In der Literatur werden verschiedene Transportmechanismen als
Ursache einer Cisplatin-Resistenz diskutiert. Bisher sind fünf Import- und vier Export-
Mechanismen für den Transport von Cisplatin durch Zellmembran bekannt. Die
Cisplatin-Aufnahme kann vermittelt durch: i) passive Diffusion; ii) Na+ K+-ATPase
94
Pumpen; iii) Endozytose; iv) organische Kationentransporter (OCT 1-3); v) Kupfer-
Transporter CTR1 und CTR2 (Holzer, et al.2004). Umgekehrt können laut Literatur am
Cisplatin-Efflux aus der Zelle folgende Faktoren beteiligt sein: i) Melanosom; ii) ATP7B-
abhängige Vesikel; iii) ATP7A Proteine; iv) MRP 1-5 Proteine (Hall, et al.2008). So
sollen Platinkomplexe Substrate für den ABC-Transporter MRP2 (ABCC2) sein (Cui, et
al.1999). Es konnte eine verstärkte Expression dieses Membrantransporters in
verschiedenen Platin-resistenten OVK-Zelllinien nachgewiesen werden (Kowalski, et
al.2005, Materna, et al.2005, Taniguchi, et al.1996). Neben der verstärkten Expression ist
ebenso die Lokalisation des Membranproteins für die Ausbildung der Platinresistenz von
Bedeutung. Eine Lokalisation in der Zellkernmembran korreliert mit der Resistenz
gegenüber Platinkomplexen, die „physiologische“ Lokalisation in der
Zytoplasmamembran hingegen nicht (Surowiak, et al.2006). Erste Immunfluoreszens-
Messungen des MRP2-Proteins deuteten auf eine leicht erhöhte Expression in der
Cisplatin-resistenten Zelllinie A280-res hin (Ergebnisse hier nicht gezeigt). Die zur ABC-
Transporter-Familie gehörende MDR-vermittelten (MDR = multidrug resistance)
Transporter werden mit Blick auf die Cisplatin-Resistenz kontrovers diskutiert. Daher
bleibt die alleinige Rückführung eines Resistenz-Phänotyps auf Expression oder Aktivität
von ABCG2 oder andre verwandte Transporter wie MDR3 und P-Glykoprotein (MDR1)
fragwürdig (Ren, et al.2007). Eine wichtige Rolle bei der Cisplatin-Aufnahme spielt in
einigen Zellsystemen der Kupfertransporter 1 (Ctr1) (Holzer, et al.2004, Holzer, et
al.2006, Larson, et al.2009). Eine erhöhte Expression von Ctr1 erhöht die Aufnahme von
Cisplatin und sensitiviert die Zellen gegenüber der zytotoxischen Wirkung (Pan, et
al.2018). Die Aufnahme des natürlichen Substrates Cu2+-Ionen durch Ctr1 löst eine
Internalisierung des Transporters aus und es wird diskutiert, ob bei Cisplatin-Transport
das gleiche Phänomen auftritt (Tsai, et al.2014). Der strukturell homologe
Kupfertransporter 2 (Ctr2), welcher hauptsächlich in Endosomen und Lysosomen
lokalisiert ist, soll bei der Spaltung der kupferbindenden Ecto-Domäne von Ctr1
mitwirken und somit indirekt die Cu2+- und Cisplatin-Aufnahme regulieren (Öhrvik, et
al.2013). Es wurde gezeigt, dass jedoch eine erhöhte Expression von Ctr2 mit der
Cisplatin-Resistenz assoziiert ist (Blair, et al.2009). Umgekehrt ist die Ausschaltung
(shRNAi) von Ctr2 in embryonalen Maus-Fibroblasten mit einer erhöhten Cisplatin-
Akkumulation und -Zytotoxizität verbunden, ohne die Cu2+-Aufnahme zu
beeinträchtigen (Blair, et al.2011). Eine weitere Rolle spielen die Kupfer-
transportierenden P-Typ ATPasen ATP7A (Samimi, et al.2004) und ATP7B (Katano, et
95
al.2003, Safaei, et al.2008), die den Efflux von Cisplatin aus der Zelle heraus oder dessen
Verteilung in spezifische subzelluläre Kompartimente vermitteln sollen (Katano, et
al.2004, Samimi, et al.2004). Die Expression dieser Transporter korreliert demnach mit
der zellulären Empfindlichkeit bzw. Resistenz gegenüber Cisplatin (Komatsu, et al.2000).
Dabei soll ATP7B stärker mit der Resistenz assoziiert sein als ATP7A und Ctr1
(Mangala, et al.2009, Yoshizawa, et al.2007). Eine differentielle Genexpressionsanalyse
des hier untersuchten A2780-Zellpaares würde durch den Vergleich des Transkriptoms
genauere Informationen über potentiell an dem Resistenzphänotyp beteiligten
Transportern ergeben.
5.2.2 DO-Modulatoren erhöhen den Cisplatin-induzierten Adduktgehalt in der
DNA von humanen Tumorzellen
In der klinischen Anwendung würden Cisplatin-behandelte Patienten durch die Ko-
Applikation von DO-Modulatoren im Hinblick auf die Reduktion der Nebenwirkungen
in physiologischen Zellen sowie der systemischen Toxizität von Cisplatin profitieren. Die
ausstehende wichtige Frage bei der Ko-Applikation wäre die Wirkung der Modulatoren
auf den Erfolg der Tumortherapie. Sollten in den Malignom-Zellen durch die
Modulatoren die gleichen Mechanismen beeinflusst werden, wie im kritischen
Normalgewebe, würde die Effizienz der Cisplatin-Behandlung beeinträchtigt werden. Die
Vorbehandlung der Zelllinien (A280, A2780-res, IGROV-1, OAW-42, OvCa-29 und
SKOV-3) mit DO-Modulatoren zeigte keine negativen Effekte auf den Adduktgehalt in
der DNA. Im Gegenteil, bei den meisten Zelllinien konnte in der DNA ein erhöhter
Adduktspiegel gemessen werden (siehe Abbildung 8). Nur in der Cisplatin-sensitiven
Zelllinie OAW-42 wurde keine signifikante Veränderung im Adduktspiegel festgestellt.
Besonders interessant sind diese Ergebnisse bei den Cisplatin-resistenten Zelllinien. Der
Adduktlevel konnte durch die Vorbehandlung auf den Level von Cisplatin-sensitiven
Zelllinien mit Cisplatin alleine erhöht werden (Abbildung 8; Vgl. A/B, C/D, E/F). Dies
bedeutet, dass durch die Erhöhung des Adduktspiegels die Zellen gegenüber Cisplatin re-
sensitiviert werden. Ähnliche Ergebnisse konnten durch die kombinatorische Anwendung
von DO-Modulatoren mit Cisplatin in Neuroblastom-, Lungenkarzinom-,
Hodenkarzinom-, Mammakarzinom-, Harnblasenkarzinom- und Prostatakarzinom-
Zelllinien quantifiziert werden (MelnikovaOktober 2013, MelnikovaFebruar 2014).
Theoretisch würden für die beobachteten Effekte folgende Wirkungsmechanismen der
96
DO-Modulatoren in Betracht kommen: Erhöhung der Cisplatin Akkumulierung durch i)
Stimulation von zellulären Import oder Blockierung des zellulären Exportes von
Cisplatin; ii) Stimulation der Hydrolysereaktion von Prodrug Cisplatin in der Zelle; iii)
verminderte zytoplasmatische Detoxifizierung von Cisplatin, iv) Verminderung der
Reparatur von DNA-Schäden. Ein Vergleich der intrazellulären Konzentration von Platin
in der Zelle mit dem jeweiligen Adduktgehalt in der DNA von A2780, bei einer Ko-
Applikation und mit Cisplatin alleine, bestätigte die Annahme einer Wirkung von
Modulatoren auf das Cisplatin-Transportsystem. Die Vorbehandlung mit den
Modulatoren führte zu einer verstärkten Akkumulation von Platin (siehe 4.2.4) in der
Zelle und korrelierte somit mit dem Adduktgehalt in der DNA (siehe 4.2.2). Eine
Langzeit-Exposition mit DO9 zeigte 16 h nach der Cisplatin-Behandlung eine um Faktor
8,5 höhere Adduktbelastung als in Zellen die mit DO9 nur vorbehandelt wurden und um
Faktor 16,3 höher im Vergleich zu nur mit Cisplatin-Behandelten Zellen. Es wird
angenommen, dass durch die Blockierung des Exports in der Zelle ein Cisplatin-Depot
angereichert wird, welches weiter mit der DNA reagieren kann. In der Klinik wäre diese
Behandlungsform durchführbar, jedoch müssten vorerst in vivo Maus-Daten gesammelt
werden um mögliche Nebenwirkung einer Dauerexposition ausschließen zu können.
Durch eine Cisplatin-induzierte DNA-Schädigung wird ein komplexes Signalnetzwerk in
der Zelle aktiviert. Es kommt zur Koordination von Prozessen wie Reparatur,
Zellzyklusarrest und Apoptose. Bestimmte Kontrollpunkte im Zellzyklusverlauf sorgen
für die genomische Stabilität und können von Ausmaß und Art des DNA-Schadens einen
verzögerten oder arretierten Zellzyklusverlauf einleiten. Eine Behandlung mit Cisplatin
induzierte in der OVK-Zelllinie A2780 einen S-Phase-Arrest. Zellen die mit DO-
Modulatoren vorbehandelt wurden, zeigten eine ähnliche Zellzyklus-Verteilung wie
Cisplatin behandelte Zellen. Der S-Phasen-Arrest kann als Ausgangspunkt für eine
weitere Proliferation sein oder bei irreversibler Schädigung in die Apoptose übergehen.
Im Verlauf des Zelltodes kommt es zur Aktivierung von einer Reihe von Caspasen, mit
Caspase-3 als Schlüsselenzym der Apoptose. Ein erhöhter DNA-Adduktgehalt sollte im
Zusammenhang mit einer erhöhten Caspase-3 Aktivität in Zusammenhang stehen. Die
Ergebnisse zeigen, dass die A2780-Zellen bereits in der S-Phase aufgrund von DNA-
Schäden arretieren und von dort aus in die Apoptose gehen (siehe 4.2.3.). Der gesteigerte
DNA-Adduktgehalt in DO-Modulatoren vorbehandelten Zellen steht im Zusammenhang
mit einer erhöhten Caspase-3 Aktivität bzw. einer erhöhten Apoptoserate der Zellen.
97
Der intrazelluläre Platingehalt in A2780-res (siehe 4.2.4, Abbildung 12) korrelierte
hingegen nicht mit dem Adduktgehalt in der DNA (siehe 4.2.2, Abbildung 8). Trotz fast
unverändertem Gesamtplatin in der Zelle erhöht sich die Adduktbelastung in der DNA
signifikant durch die Modulatoren. Dieser Effekt könnte durch eine erhöhte Aktivierung
von Cisplatin oder durch eine verminderte Sequestrierung durch Gluthation (GSH) oder
Metallothioneine zustande kommen. Es wurde gezeigt, dass durch eine Konjugation von
Platin mit Glutathion die antineoplastische Wirkung von Platin aufgehoben werden kann
(Godwin, et al.1992). In platinresistenten OVK-Zellen mit einer erhöhten MRP2-
Expression wurde auch eine erhöhte Konzentration an Glutathion gefunden. Bevorzugte
Substrate von MRP2 sind Gluthation-Konjugate und daher wäre eine koordinierte
Regulation beider Faktoren bei resistenten Zelllinien nicht überraschend (Materna, et
al.2005). Weitere Ergebnisse zeigten, dass eine Überexpression von Metallothionein zur
Cisplatin-resistenz führen kann (Kelley, et al.1988). Die zelluläre DNA-
Reparaturkapazität sollte für den gemessenen Pt-Adduktspiegel nach einer Cisplatin-
Expositionszeit von 3 h noch keine wichtige Rolle spielen. Eine Langzeit-Exposition mit
DO9 führte in diesem Fall zu keinen weiteren Veränderungen im DNA-Adduktgehalt
(siehe 4.2.2.1, Abbildung 9) und im Gesamtplatingehalt der Zelle (siehe 4.2.4.1,
Abbildung 13). Mögliche Mechanismus für den Effekt der Modulatoren in der resistenten
Zelllinie wäre entweder eine unterschiedliche Verteilung des Medikamentes selbst
und/oder eine Wirkung auf die Lokalisation des MRP2 Transporters. Bei der
Vorbehandlung könnte durch die Blockierung der MRP2 Transporter auf der
Zytoplasmamembran eine Translokation der Kernmembran-ständigen MRP2 Transporter
ins Zytoplasma oder zur Zytoplasmamembran erfolgen. In der Literatur gibt es Hinweise
über einen transepithelialen Transport von Diphenhydramin (DO7) durch pH-abhängige,
spezifische Transportsysteme ins Zellinnere (Mizuuchi, et al.2000). Daher könnt auch
eine direkte Blockierung des MRP2 Transporters in der Kernmembran durch die DO-
Moleküle erfolgen. Dieser Mechanismus würde die unveränderte intrazelluläre
Gesamtplatinkonzentration bei gleichzeitiger Addukterhöhung in der DNA erklären.
Erste Immunfärbung der MRP2 Transporter in situ zeigten bei der Ko-Applikation mit
Modulatoren sowohl bei den sensitiven als auch bei den resistenten Zelllinien eine
Verminderung der Fluoreszenz-Signale (hier nicht gezeigt). Diese Beobachtungen
sprechen ebenfalls für eine Translokation von MRP2 aus der Membran ins Zellinnere. Es
bedarf weiterer Untersuchungen von vorliegenden Cisplatin-Konjugaten und weitere
98
Untersuchungen des MRP2 Transporters (u.a. Lokalisation) in A2780-res Zellen, um den
Mechanismus besser zu verstehen.
Wirkungsmodell der DO-Modulatoren
Das Muster der Schutz-Wirkung auf das Normalgewebe unterscheidet sich zwischen den
Modulatoren. Während die Vorbehandlung von Mäusen und Ratten mit DO9 zu einer
signifikanten Reduktion der Cisplatin-induzierten DNA-Addukte in Zellen der Niere und
der DRG führt, hat DO8 nur eine leichte schützende Wirkung auf die Zielzellen der
Cochlea, jedoch eine starke in der Niere. DO7 reduziert hohe DNA-Schädigung in den
Zellen von DRG, Niere und Cochlea. Es wird vermutet, dass diese verminderte Addukt-
Akkumulation in den sensitiven Zellen entweder durch die Inhibierung eines für die
jeweilige physiologische Funktion wichtigen Import-Mechanismus zustande kommt
oder, weniger wahrscheinlich, durch die Stimulierung eines Efflux-Transporters für
Cisplatin (siehe Abbildung 22). Die unterschiedlichen Wirkungs-Muster der drei
Modulatoren sprechen dafür, dass in den Organen Niere, Cochlea und DRG
unterschiedliche Transporter exprimiert werden die für den Cisplatin-Transport
verantwortlich sind und die Modulatoren unterschiedliche Affinität zu den jeweiligen
Transportern aufweisen. In der Literatur gibt es einige Hinweise auf die Expression von
in Abschnitt 5.2.1 angesprochenen Transportern in den Cisplatin-empfindlichen Organen
die für die hohe Adduktierung in der DNA der kritischen Zellen und somit für die
Nebenwirkungen eine wichtige Rolle spielen könnten. In den Dorsalganglien (DRG)
wurde die Expression von Ctr1 in großen und von ATP7A in den kleinen Neuronen
nachgewiesen (Ip, et al.2010). Eine Interaktion von Cisplatin mit OCTs wurde ebenfalls
beschrieben (Ciarimboli, et al.2005). Die Expression dieser soll besonders stark in den
Ausscheidungsorganen wie Leber und Niere zu finden sein (Ciarimboli2008). Zudem
wurde gezeigt, dass OCT2 in der Maus-Cochlea in Haarzellen des Corti-Organs, in den
Zellen der Stria Vascularis (Ciarimboli, et al.2010) und in DRG exprimiert wird (Sprowl,
et al.2013).
Auch in den untersuchten Zelllinien wurden unterschiedliche Wirkungs-Muster der DO-
Modulatoren auf den Adduktgehalt festgestellt. Auf jede Zelllinie wirken die jeweiligen
DO-Modulatoren mit unterschiedlicher Effektivität. Es wird vermutet, dass die erhöhte
Adduktakkumulation in den Tumorzellen durch die Inhibierung von Export-
99
Mechanismus oder durch die Stimulierung von Import-Transportern für Cisplatin
zustande kommt. Auch hier ist das Modell einer funktionellen Blockade von
Transmembran-Exportern deutlich plausibler (siehe Abbildung 22). Ob es sich dabei in
beiden Fällen um eine direkte, länger anhaltende Hemmung durch Bindung der DO-
Modulatoren handelt oder um eine Kompetition von Modulator und Cisplatin um die
Transportfunktion, ist bisher ungeklärt. Ebenso ist eine indirekte, Rezeptor-vermittelte
Wirkung auf das Transportsystem vorstellbar. Das unterschiedliche Wirkungsmuster der
Modulatoren spricht dafür, dass in den untersuchten Zelllinien möglicherweise
unterschiedliche Transporter (siehe 5.2.15.2.2 ) exprimiert werden und die Modulatoren
unterschiedliche Affinitäten zu den jeweiligen Transportern aufweisen.
Abbildung 22:Wirkungsmodell der DO-Modulatoren in physiologischen- und in Tumorzellen.
Physiologische Zelle: Blockierung von Import in der Zell- (oder Kern)-Membran. Tumor Zelle: 1)
Blockierung von -Export in der Zellmembran bei Cisplatin-sensitiven Zelle. 2) Blockierung von Export in
der Kernmembran bei Cisplatin-resistenten Zelle.
In vivo-Experimente in der Maus mit unterschiedlichen DO8-Konzentrationen zeigten,
dass DO8 mit 20 mg/kg bereits bei der Hälfte der eingesetzten DO7-Konzentration von
40 mg/kg die gleiche protektive Wirkung auf die Cisplatin-empfindlichen proximalen
Tubuluszellen (PTC) der Niere hat. Die Dosis-abhängige Wirkung von DO9 wurde
ebenfalls in vivo getestet. Hier zeigte sich bereits bei einer Konzentration von 10 mg/kg
Körpergewicht die gleiche protektive Wirkung auf die Zellen der Niere (PTC) und DRG
wie bei DO7 mit 40 mg/kg (MelnikovaOktober 2013). Beide Derivate haben eine stärkere
Dosis-abhängige Schutz-Wirkung auf die empfindlichen Zellen als die Ausgangssubstanz
DO7. Die zusätzlichen funktionellen Gruppen an einem der Phenylreste können aufgrund
der veränderten sterischen Struktur zu verschiedenen chemischen und physikalischen
100
Eigenschaften führen, aus denen gegeben falls eine geänderte Affinität zu den
Transportern für Cisplatin resultiert. Durch die Drehbeweglichkeit der Phenylreste bei
DO7 kann die Substanz im gelösten Zustand sehr wahrscheinlich in unterschiedlichen
Formen vorliegen und somit mehr oder weniger aktiv gegenüber dem Cisplatin-
Transporter reagieren. Die zusätzlichen Methylgruppen reduzieren die Anzahl der
Rotationsfreiheitsgrade, wodurch die aktive Form möglicherweise stabilisiert wird und
das Molekül vorwiegend in der aktiven Form vorliegt. Mit steigernder Anzahl von
Methylgruppen würde die aktive Form des Moleküls weiter stabilisiert werden. Ein
weiteres Strukturanalogon von DO7 ist die Substanz Meclizine (DO10), welche ebenfalls
zur Gruppe der zugelassenen H1-Antihistaminika gehört. Erste Zelllinien-Versuche
haben gezeigt, dass DO10 bereits bei der Hälfte der eingesetzten DO9-Konzentration eine
effektive Modulation der DNA-Addukte bewirkt. Diese Substanz wurde jedoch noch
nicht in Ko-Applikation mit Cisplatin bei Mäusen getestet.
101
Abbildung 23: Strukturformel der DO-Modulatoren.
Der Modulator DO8 ist ein Methyl-Derivat von DO7. Der Modulator DO9 ist ein zweifach-methyliertes
Derivat von DO7. Der Modulator DO10 ist ein Piperazin-Derivat.
102
5.3 Zur Rolle von Pt-(GpG)-Addukten in primärem OVK-Tumorzellen
Weil zuverlässige und robuste Testverfahren zur Prädiktion des Therapieansprechens von
Patienten bislang nicht verfügbar sind, werden primäre oder sekundär auftretende
Resistenzen gegenüber den eingesetzten Chemotherapeutika oft zu spät erkannt.
Zusätzlich kann durch die Ausbildung von Kreuzresistenzen der weitere Therapieerfolg
stark beeinträchtigt werden. Die Quantifizierung von Behandlungs-induzierten DNA-
Addukten die zunächst erfolgreich bei humanen Zelllinien angewendet wurden, sollte in
der Folge auch für primäre Tumorzellen etabliert werden. Ein dafür gut geeignetes
experimentelles System stellt das humane OVK dar, weil oft relativ große Mengen an
vergleichsweise homogenen Tumorzellen aus dem Aszites isoliert werden können. Im
Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Tumorzellen sowohl direkt aus Tumorresektaten
des Primarius, als auch aus Aszites-Biopsien von OVK-Patientinnen verwendet. Die
DNA-Platinierung wird als das potentiell letal wirkende Ergebnis einer Cisplatin-
Exposition angesehen und spiegelt summarisch die Aktivitäten der wichtigsten pre- und
on-target Mechanismen wieder (Galluzzi, et al.2014). Deshalb wäre es plausibel, die
Bestimmung der Adduktbelastung in primären Tumorzellen als potentiellen Biomarker
für das klinische Therapieansprechen von OVK-Patientinnen zu etablieren. Dazu wurde
die Fragestellung untersucht, in wie fern DNA-Adduktmessungen in Tumorzellen aus
dem Aszites repräsentativ für den lokalen Primärtumor sind und ob eine Varianz des
DNA-Platinierungsgrades innerhalb einer Tumorzellpopulation auftritt. Die daraus
resultierenden Parameter sollen mit der klinischen Situation der Patientinnen verglichen
werden. Zusätzlich sollte die Wirkung der DO-Modulatoren zum ersten Mal ex vivo in
primären Tumorzellen untersucht werden.
5.3.1 Pt-(GpG)-Addukte in der DNA von Tumorzellen aus Aszites und
primären Tumor
Aufgrund ihrer genomischen und regulatorischen Instabilität und des Selektionsdruckes
bei ihrer Etablierung entsprechen Tumor-Zelllinien nicht unbedingt in allen
Eigenschaften den ursprünglichen malignen Ausgangszellen. Von primären Tumorzellen
wird angenommen, dass sie z.B. die generelle Zellantwort auf eine Zytostatika-
Behandlung aber auch das Verhalten bei individuellen Patienten sehr viel eher
repräsentieren. Die Messbarkeit der DNA-Addukte wurde hier zum ersten Mal in
103
primären Tumorzellen (CA-125+) eines Tumorresektates nach einer ex vivo Exposition
mit Cisplatin demonstriert (siehe 4.3.1). Die Behandlung der Tumorzellen mit steigenden
Cisplatin-Konzentrationen ergab bei der ICA-Analyse der DNA-Addukte
erwartungsgemäß eine lineare Zunahme der Messsignale (siehe Abbildung 15) und eine
Reparatur der DNA-Addukte zwischen 24 h und 48 h (siehe Abbildung 16). Die
Quantifizierung von Platin-Addukten im primären Tumorsystem ist somit auf Einzelzell-
Ebene durchführbar, jedoch nur nach ex vivo-Exposition, da diese Zellen zum Zeitpunkt
der Chemotherapie-Behandlung der Patientinnen klinisch nicht zugänglich sind. Damit
können bestimmte pharmakokinetische Variablen, wie individuelle Bioverteilung und
Clearance über die Niere, nicht mit abgebildet werden.
Um der Fragestellung nachzugehen ob die DNA-Addukte in der DNA von Tumorzellen
aus dem Aszites repräsentativ für den primären Tumor sind, wurden beide Biopsien von
einer Patientin (#102) nach identischer ex vivo-Exposition auf die induzierten Addukte
untersucht (siehe 4.3.2.1). Auffällig war dabei neben der unterschiedlich hohen mittleren
Adduktbelastung der Tumorzellen in beiden Proben auch eine deutlich größere
intrazelluläre Varianz der DNA-Platinierung bei den CA-125+ Zellen des Primärtumors
(siehe Abbildung 17). Die im Mittel etwa doppelt so hohe DNA-Platinierung der
Primarius-Zellen sollte mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber einer Cisplatin-
Behandlung einhergehen, ohne dass dies hier experimentell gezeigt wurde. Es ist zu
erwarten, dass diese Messergebnisse für jede Patientin individuell unterschiedlich sein
werden und die daraus abgeleiteten Parameter (Kinetik der Bildungs- und Reparaturrate
von DNA-Addukten) für die individuelle Prädiktion genutzt werden können. Anhand der
DNA-Adduktierung können die Zellen in eine Cisplatin-sensitive Zellpopulation und eine
Cisplatin-resistente Zellpopulation eingeteilt werden. Daher sind die Adduktmessungen
in der CA125+-Population des Aszites sicher nicht repräsentativ für alle Tumorzellen des
Primarius, sondern nur für die weniger suszeptible Subpopulation. Nach unseren
derzeitigen Vorstellungen sollten dabei die hoch adduktierten Zellen besser auf eine
Chemotherapie mit Cisplatin ansprechen. Sollten sich unter in vivo-Exposition eine
ähnliche heterogene Verteilung der DNA-Platinierung einstellen, könnte man eine
deutliche Selektion der niedrig adduktierten Zellpopulation erwarten, die im späteren
Verlauf dann auch für die Entwicklung von Rezidiven verantwortlich wäre. Das Ziel einer
effektiveren Chemotherapie müsste sein, die resistente Subpopulation (niedrig
adduktierte Zellen), die durch die Messungen der DNA-Addukte in Tumorzellen aus dem
Aszites gut repräsentiert wird, besser zu erfassen. Die Zellheterogenität ist ein
104
Kennzeichen vor allem bei soliden Tumoren. Sie ist mit der Entstehung von Resistenz
gegen Chemotherapeutika und mit der Krankheitsprogression assoziiert (Heppner1984).
Innerhalb von Malignomen finden sich häufig große Anteile nicht-proliferierender Zellen
(Clarkson, et al.1970). Es wird beschrieben, dass nur ein kleiner Teil über ein tumorigenes
Potential zur Ausbildung von Metastasen verfügt (Fidler, et al.1977). In den letzten Jahren
entstand die Theorie einer „Krebsstammzelle“, die die Fähigkeit zur Generierung von
Metastasen verfügt (Warner, et al.2004). Laut der Theorie können solche Zellen die
Fähigkeit zur Selbsterneuerung, asymmetrischer Zellteilung und somit resistente
Eigenschaften gegenüber Chemotherapeutika aufweisen. Die Entwicklung von Tumoren
aus Tumorstammzellen könnte die Heterogenität von Tumoren sowie Rezidive nach
Therapie erklären (Gründker, et al.2010). Es wurde aber auch gezeigt, dass eine repetitive
Behandlung von Zellen mit Cisplatin zur Entwicklung von multiresistenten Tumorzell-
Populationen mit Stammzellcharakter führt (Wintzell, et al.2012). Des Weiteren wird der
Zusammenhang zwischen Krebsstammzellen und der Epithelialen-Mesenchymalen-
Transition (EMT) diskutiert. Die Zellen sollen beim Durchlaufen der EMT ihre
epithelialen Eigenschaften verlieren wodurch das Verlassen des Tumorverbandes
ermöglicht wird.
Am Ort der Metastasierung erlangt die Zelle durch den umgekehrten Prozess (MET) ihren
Ursprungscharakter. Die hier untersuchten CA125+-Zellen aus dem Aszites sind
disseminierte Tumorzellen (DTC) des Primarius. Diese Zellen können an seröse
Membranen adhärieren, dann das Mesothel durchdringen und an der Extrazellulärmatrix
Metastasen bilden. Es ist denkbar, dass die CA125+-Zellen im Peritoneum aus der niedrig
adduktierten Subpopulation des primären Tumors stammen, die den Tumorverband nach
EMT verlassen haben. Untersuchungen haben gezeigt, dass in Aszites von OVK-
Patientinnen neben chemosensiblen auch chemoresistente Tumorzellpopulationen mit
Stammzellcharakter (Dyall, et al.2010) in größeren Sphäroiden Anordnungen vorliegen.
Im Vergleich zu Tumorzellen im Primarius sind die zum allergrößten Teil nicht
Proliferations-aktiv. Es konnte jedoch bisher keine eindeutige Korrelation von
Stammzellmarkern mit der Chemoresistenz beobachtet werden. Dafür findet sich jedoch
eine positive Assoziation zwischen Adhäsionspotential und Chemosensitivität von
Tumorzellen (Jansen, et al.2016, Warner, et al.2004). Wimberger und Kollegen konnten
zeigen, dass DTCs im Knochenmark von OVK-Patientinnen eine Platin-haltige Therapie
überleben (Wimberger, et al.2012) und sich unter Therapie vermutlich sogar vermehren
können (Chebouti, et al.2016). Demnach lassen sich möglicherweise aus Bildung und
105
Persistenz von Platin-Addukten in DTCs aus dem Aszites Rückschlüsse auf das
therapeutische Ansprechen gegenüber einer Behandlung mit Platin-Komplexen ziehen.
Diese vergleichsweise leicht zugängliche Zellpopulation kann dabei als funktionales
Surrogat für die Verlaufskontrolle und zur Austestung individueller Therapieansätze
verwendet werden.
5.3.2 DO-Modulatoren vermitteln bei behandelten primären Tumorzellen einen
erhöhten Pt-Adduktgehalt
Nachdem in vielen Cisplatin-exponierten OVK-Zelllinien durch Ko-Applikation der DO-
Modulatoren eine erhöhte DNA-Platinierung erzielt werden konnte, lag die Frage nahe,
ob diese gleichermaßen auch für primäre Tumorzellen z.B. aus Aszitesaspiraten oder aus
OP-Material gilt. Die CA125+-Zellen beider Biopsien (#102) sprachen nicht nur mit
einem unterschiedlich hohen DNA-Platinierungsgrad auf die Cisplatin-Exposition an,
sondern reagierten auch unterschiedlich auf die getesteten Modulatoren. Die DNA-
Addukte waren in beiden Proben nach der Modulator-Vorexposition erhöht. Besonders
interessant waren die Messergebnisse in den Tumorzellen aus dem Aszites. Durch die
Vorbehandlung mit Modulatoren konnten die DNA-Addukte auf den gleichen Level wie
in Tumorzellen aus dem soliden Tumor mit Cisplatin alleine gebracht werden (siehe
Abbildung 19). Dies bedeutet, dass die Cisplatin-resistente (niedrig adduktierte)
Subpopulation in Aszites gegenüber Cisplatin durch die Modulatoren re-sensitiviert
werden konnte. Für den Nachweis von DNA-Addukten wurden CA-125 positiven
Tumorzellen verwendet. Das Tumormaterial ist jedoch eine komplexe Zusammensetzung
aus unterschiedlichen Zellpopulationen. Zwar wurde bereits an in vivo-Mausmodell die
reduktive Wirkung der Modulatoren auf die DNA-Platinierung in physiologischen Zellen
gezeigt, dieses kann sich jedoch vom menschlichen System unterscheiden. Um die
Wirkung der Modulatoren auf nicht-Tumorzellen im Tumorsystem zu untersuchen
wurden neben den CA-125 positiven auch CA-125 negative Zellen aus dem Aszites
(#003) in die Messungen mit einbezogen. Die Messergebnisse bestätigten, dass die
Modulatoren spezifisch in Tumorzellen die DNA-Adduktierung erhöhen.
Untersuchungen von weiteren Tumorzellen von unterschiedlichen Patientinnen auf die
Modulatoren-Wirkung ergaben ähnliche Ergebnisse. Verwendet wurden zwei Biopsien
von soliden Tumoren (#100 und #101) von Patientinnen mit einem Rezidiv. Zwei
106
Aszites-Biopsien von einer Patientin mit einer primären Krebserkrankung (#00.1) und
einer Patientin mit einem Rezidiv (#001). Auch hier wurde ein individuelles Ansprechen
der Tumorzellen jeder Patientin auf die Cisplatin-Exposition und auf die Modulatoren
gemessen (siehe Abbildung 21). Die in den Tumorzellen der Patientin #101 gemessene
Adduktbelastung war um den Faktor 5,4 höher als bei der Patientin #100 (siehe
Abbildung 21 A/B). Bei beiden Patientinnen handelt es sich um eine Rezidiv-Erkrankung.
Die Zellen der Patientin #101 sind laut der Patienteninformation Cisplatin-sensitiv,
während dieser Status bei der Patientin #100 unbekannt ist. Da die Patientin #100 jedoch
nach kurzer Zeit verstorben war, kann man davon ausgehen, dass die Patientin auf die
Chemotherapie nicht angesprochen hat. Vergleicht man die Adduktmessungen in den
Tumorzellen beider Patientinnen, so spiegelt sich, relativ zu Patientin #100, der Cisplatin-
sensitive-Status der Patientin #101 in der Messung wieder. Der epitheliale Marker CA-
125 ist ein etablierter Serummarker zur Verlaufskontrolle beim OVK (Mogensen1992).
Eine starke Expression von CA-125 korreliert mit höheren Tumorstadien. Die sehr starke
Expression von CA-125 in den Tumorzellen der Patientin #100 bestätigt die Annahme
eines sehr weit fortgeschrittenen Tumorstadiums. Die in Tumorzellen von Patientin #00.1
gemessene Adduktbelastung war um Faktor 3,4 höher als bei der Patientin #001 (siehe
Abbildung 21 C/D). Die Tumorzellen der Patientin #00.1 mit einer primären Erkrankung
scheinen ein besseres Ansprechen auf Cisplatin zu haben als die Patientin #001 mit einer
rezidiven Erkrankung, wobei die niedrige Expression von CA-125 nicht zum
fortgeschrittenen Verlauf (#001) der Erkrankung passt. Der Vergleich von
Adduktmessungen mit den klinischen Daten konnte bei der untersuchten Anzahl von
Patientinnen keine nennenswerte Korrelation ergeben. In den Meisten Fällen befanden
sich die Patientinnen in einer Therapie und die Information über die klinische Cisplatin-
Ansprechbarkeit war unbekannt. Die Beurteilung von der Höhe der Adduktbelastung in
der DNA von Tumorzellen von Patientinnen stellt sich zurzeit als sehr schwierig heraus,
da die Anzahl der Messdaten zu niedrig ist und die Zellen jeder Patientin individuelle
Adduktierung aufweisen. Erst durch größere Fallzahlen kann eine Beurteilung der
Adduktbelastung und eine Einteilung der Patientinnen in unterschiedliche Cisplatin-
Sensitivität-Gruppen erfolgen.
Anhand der quantifizierten Adduktbelastungen in den Tumorzellen der Patientinnen sieht
man wie erwartet eine individuelle Sensitivität der Tumorzellen gegenüber Cisplatin und
eine individuelle Modulation von Pt-(GpG)-Addukten durch die DO-Modulatoren. Die
107
DO-Modulatoren scheinen, wie bereits in OVK-Zelllinien beobachtet, ein
unterschiedliches Wirkungs-Muster zu haben. Auf jede Patientin wirken die jeweiligen
DO-Modulatoren mit unterschiedlicher Effektivität (siehe Abbildung 21). Es wurde
gezeigt, dass die in Abschnitt 5.2.2 besprochenen Transporter auch in primären
Tumorzellen in der Resistenzentwicklung eine Rolle spielen und für den Mechanismus
der Modulatoren-Wirkung in Frage kommen würden. Eine MRP2-Expression wurde z.B.
in OVK beobachtet, während in gutartigen Tumoren keine Expression dieses
Transporters nachgewiesen werden konnte (Surowiak, et al.2006). Darüber hinaus soll
neben der Expressionsstärke (Materna, et al.2004) die Lokalisation auf der Kernmembran
(Surowiak, et al.2006) mit der klinischen Ansprechrate auf eine Platin-haltige Therapie
bei OVK-Patientinnen korrelieren. Auch eine Überexpression von Ctr1 soll mit dem
therapeutischen Erfolg von Cisplatin assoziiert sein (Lee, et al.2011, Liang, et al.2012).
Es wurde gezeigt, dass eine Ctr1-Mutation in Zusammenhang mit Cisplatin-Resistenz
steht (Xu, et al.2012). Eine Überexpression von Kupfertransporter ATP7A in OVK-
Zellen führt zur Entwicklung eines Cisplatin-resistenten Phänotyps und soll durch dessen
Expressionslevel die Cisplatin-Sensitivität von Patienten vorhersagen können
(Nakayama2004, Samimi, et al.2004).
Das Analyse-Verfahren in primären Tumorzellen liefert Informationen über das
individuelle Ansprechen von Patientinnen auf Cisplatin und Modulatoren. Die
Messungen sind an Zellen aus unterschiedlichen, zugänglichen Biopsien durchführbar
(primärer Tumor, Aszites und CTCs). Die Tumorzellen aus den Biopsien können als
Indikatorzellen für verschiedene Wirkstofftestungen eingesetzt werden. Es werden zur
Zeit neben der Standardbehandlungsformen weitere Therapien mit antiangiogenen
Wirkstoffen, Poly(Adenosidiphosphat [ADP]-Ribose)-Inhibitoren und epidermalen
Wachstumsfaktor-Rezeptoren ausgetestet (Coward, et al.2015). Bereits vor
Therapiebeginn kann bei jedem Patienten individuell die Chemosensitivität bestimmt
werden, die Informationen über die Notwendigen Behandlungen eines Tumors liefert.
Dadurch könnte die Zusammensetzung und Dosierung der Chemotherapie individuell
bestimmt und im Behandlungsverlauf angepasst werden. Dies ist besonders wichtig, da
die Eigenschaften der Tumorzellen sich unter Therapie verändern und neue
Tumorzellpopulationen entstehen können. Zusätzlich kann die Wirkung der Modulatoren
ausgetestet werden. Aufgrund der unterschiedlichen Wirkung der Modulatoren bezüglich
der Schutzwirkung in physiologischen Zellen und der sensitivierenden Wirkung in
Tumorzellen, ist noch zu prüfen ob eine kombinatorische Anwendung der Modulatoren
sinnvoll sein könnte. Erste Tests einer kombinatorischen Anwendung in Zelllinien
108
erzielten eine stärkere Adduktierung als mit jeweils einzelnen Modulatoren erreicht
werden konnte. Durch die Ausarbeitung des Verfahrens sollen auch primäre und
sekundäre Resistenzen bereits vor Therapiebeginn geprüft werden, um Patienten eine
unwirksame Therapie ersparen zu können. Um dieses Verfahren auf weitere Tumorarten,
die mit Platin-haltigen Chemotherapeutika therapiert werden, ausweiten zu können sollte
die Messung der DNA-Addukte in CTCs etabliert werden. Aufgrund der sehr geringen
Anzahl von CTCs im Blut, war die Analyse dieser für eine aussagekräftige statistische
Auswertung nicht ausreichend und sehr aufwendig. Außerdem beeinträchtigten die
ausgewählten Methoden zur positiven Anreicherung von CTCs wie ADNA-Test und
CellSearch-System die Vitalität der Zellen und eigneten sich eher für Untersuchungen
mit molekularbiologischen Fragstellungen. Zusätzlich beeinträchtigt beim ADNA-Test
die irreversible Kopplung der selektierten Zellen an die magnetischen Beads das
immunanalytische Nachweisverfahren. Ein sehr interessanter Ansatz zur Anreicherung
von CTCs ist die Verwendung einer Apherese, in der die mittels von Antikörpern
detektierte Tumorzellen zurückgehalten werden (Hengerer, et al.09-2013). Diese
Methode ist noch in der Testphase und stellt jedoch eine zusätzliche physische Belastung
für den Patienten dar, die viele Patienten währen einer Therapie ablehnen würden. Ein
Vergleich der DNA-Addukte in den Tumorzellen aus primären Tumor, Aszites und Blut
konnte bisher nicht erfolgen und würde die Eignung von CTCs als Surrogatzelle für das
therapeutische Ansprechen auf Zytostatika prüfen.
Ein wichtiger limitierender Faktor dieses Ansatzes sind die verfügbaren primären
Tumorzellen, sodass die Durchführung einer Kinetik von Platinaddukten oft nicht
möglich ist. Die Reparatur-Effizienz der Zellen gegenüber von DNA-Schäden ist aber ein
wichtiger Faktor der zur Resistenz beiträgt. Man bekommt normalerweise entweder
primären Tumor oder Aszites, beide Biopsien sind eine Seltenheit. Im Normalfall ergab
sich die Möglichkeit nur eine der Biopsien einer Patientin untersuchen zu können.
109
6 Zusammenfassung
Platin-Komplexe stellen eine der wichtigsten und wirksamsten Substanzgruppen in der
systemischen Tumortherapie dar und zählen aufgrund des breiten therapeutischen
Spektrums zu den klinisch routinemäßig eingesetzten Tumortherapeutika. Die
antineoplastische Wirkung der Platin-Komplexe beruht auf ihrer Reaktion mit
bestimmten Basenpositionen in der DNA-Doppelhelix und der Ausbildung zytotoxischer
DNA-Addukte. In der onkologischen Klinik wird die antineoplastische Wirksamkeit
dieser Medikamente begrenzt durch i) primäre oder sekundär auftretende Resistenzen der
Tumore gegenüber dem Wirkstoff und ii) den typischen gravierenden Nebenwirkungen
in bestimmten Organen.
In dieser Arbeit wurden am Beispiel des Zytostatikums Cisplatin wichtige Aspekte beider
Problemkreise adressiert und anhand von in vivo- (Mausmodell), in vitro- (Tumor-
Zelllinien) und ex vivo- (primäre humane Tumorzellen) Ansätzen funktionell untersucht.
Neben den Mechanismen, die dem Resistenzphänotyp beziehungsweise den
organspezifischen Nebenwirkungen zugrunde liegen, zielte ein Hauptaspekt dieser Arbeit
auf die Möglichkeit einer pharmakologischen Beeinflussung beider Prozesse mit der
Möglichkeit, das therapeutische Fenster dieser Substanzgruppe dadurch zu erweitern. Als
relevante Tumorentität habe ich mich dabei auf das Ovarialkarzinom (OVK) konzentriert,
da hier i) die Behandlung mit Platin-Medikamenten bei der Erstlinien-Therapie im
Vordergrund steht, ii) das Resistenzverhalten das entscheidende klinische Problem
darstellt, iii) ein Satz gut etablierter OVK-Zellkulturmodelle zur Verfügung steht und iv)
die Logistik für den Zugriff auf primäre humane Tumorzellen aufgebaut werden konnte.
Als wichtigste Ergebnisse ergaben sich aus meinen Untersuchungen:
Beim Vergl eich von Cisplatin-sensitiven und –resistenten OVK-Zelllinien zeigte
sich, dass die Resistenz gegenüber dem Zytostatikum mit einer reduzierten DNA-
Adduktbildung einhergeht, die wiederum auf einem verringerten intrazellulären
Medikamentenspiegel beruht. Das weist auf die Beteiligung von Import-
/Exportmechanismen bei der Resistenzselektion hin. Bei ex vivo mit Cisplatin
behandelten primären OVK-Zellen aus Tumorresektaten oder aus Aszites-Biopsien
konnte erstmals ähnlich große Unterschiede in der DNA-Adduktbildung detektiert
werden.
110
Eine Reihe pharmakologischer Transport-Modulatoren, die in dieser Arbeitsgruppe
ursprünglich zur Prävention der hohen DNA-Platinierung in nebenwirkungsrelevanten
Zellen des Normalgewebes etabliert worden waren, wurden hier auf ihre Wirkung bei
Ko-Applikation mit Cisplatin auf Tumorzellen untersucht. Hierbei sollte herausgefunden
werden, ob die Effizienz einer Platin-basierten Therapie durch die Modulatoren
beeinträchtigt wird. Dabei zeigte sich bei den getesteten OVK-Zelllinien keine negative
Wirkung auf den DNA-Adduktgehalt. Im Gegenteil führte die Vorbehandlung bei den
meisten Zelllinien sogar zu einer erhöhten DNA-Platinierung, die jeweils mit einer
erhöhten intrazellulären Gesamtplatin-Konzentration verknüpft war. Dies galt
gleichermaßen für sensitive wie auch resistente Zellvarianten, deren Pt-Adduktgehalt
dadurch in einigen Fällen auf das Ausgangsniveau der sensitiven Zellen angehoben
wurde.
Anhand eines Caspase-3-Aktivitätstests konnte gezeigt werden, dass die durch die
Ko-Applikation der Modulatoren vermehrte DNA-Platinierung zu einer erhöhten
Cisplatin-induzierten Apoptoserate bei den OVK-Zelllinien führt. Die Modulatoren
alleine zeigten hierbei kein zytotoxisches Potenzial.
Diese Befunde an OVK- und andren humanen Malignomzelllinien wurden auf ihre
Relevanz für klinische Fragestellungen an vitalen primären Tumorzellen aus dem
Primarius und aus Aszites geprüft. Die Ko-Applikation der Modulatoren mit Cisplatin
führte auch hier zu einer deutlichen Erhöhung des DNA-Adduktgehaltes. Besonders die
Fraktion der auffällig niedrig platinierten OVK-Zellen aus dem Aszites, die
möglicherweise den Ausgangspool für Platin-resistente Rezidive oder Metastasen
darstellt, konnten durch die Vorbehandlung auf ein deutlich höheres Adduktniveau
gebracht werden. Dies sollte, in Analogie zu den in vitro-Ergebnissen, zu einer
signifikanten Sensitivierung dieser kritischen Zellfraktion gegenüber einer Platin-
Therapie führen.
Schließlich wurde an einem Mausmodell gezeigt, dass der Transportmodulator
DO9 neben seiner markanten Schutzwirkung vor einer übermäßigen DNA-Adduktierung
in den nebenwirkungsrelevanten Zellen von Niere, Innenohr und Dorsalganglien
ebenfalls die systemische Toxizität einer mehrzyklischen Cisplatin-Therapie drastisch
reduzieren. Des Weiteren konnte bei der Cisplatin-induzierten Neurotoxizität die
111
Mantelzellen der Dorsalganglien aufgrund ihrer hohen Adduktbelastung als die sehr
wahrscheinlich kritischen Zielzellen identifiziert werden.
Da es für das Ovarialkarzinom wie auch für viele andre Tumorentitäten bisher keine
verlässlichen Parameter für das klinische Ansprechen auf eine Platin-basierte Therapie
gibt, böte die hier erarbeitete Analytik von ex vivo Cisplatin-exponierten primären
Tumorzellen bereits im Vorfeld einer Chemotherapie erstmalig die Möglichkeit, eine
Aussage über den zu erwartenden Behandlungserfolg zu machen. Die klinische
Anwendung der hier untersuchten Transport-Modulatoren, von denen zwei bereits als
Medikament für andre Indikationen zugelassen sind, könnte das therapeutische Fenster
für die eine Cisplatin-Behandlung deutlich erweitern, bei gleichzeitig drastischer
Reduktion der Therapie-induzierten Nebenwirkungen.
112
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Hydrolyse von Cisplatin. ............................................................................. 7
Abbildung 2: Zellzyklusregulation nach DNA-Schaden: ................................................ 11
Abbildung 3: Induktion der Apoptose. ............................................................................ 14
Abbildung 4: Molekulare Mechanismen der Cisplatin-Resistenz: .................................. 20
Abbildung 5: Reduktion der systemischen Toxizität und des Gewichtverlustes durch
Ko-Applikation von DO9 bei C57BL/6 Mäusen währen einer Cisplatin-
Therapie. ....................................................................................................... 53
Abbildung 6: Vergleich ex vivo und in vivo Cisplatin–Exposition von Zellen des DRG
der Ratte. ....................................................................................................... 55
Abbildung 7: Visualisierung und Quantifizierung von Pt-(GpG)-Addukten in A2780
und A2780-res OVK-Zelllinien. ................................................................... 58
Abbildung 8: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-
(GpG)-Adduktgehalt in Cisplatin-sensitiven und resistenten OVK
Zelllinien. ...................................................................................................... 60
Abbildung 9: Wirkung einer DO9-Dauerexposition auf die Kinetik der Pt-(GpG)-
Addukte nach Cisplatin-Behandlung. ........................................................... 63
Abbildung 10: Einfluss von DO-Modulatoren in Kombination mit Cisplatin auf die
Zellzyklusverteilung. .................................................................................... 64
Abbildung 11: Wirkung von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den
Zelltod in A2780-Zelllinie: ........................................................................... 66
Abbildung 12: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den
intrazellulären Platingehalt der Zelle. ........................................................... 67
Abbildung 13: Wirkung einer kontinuierlichen Exposition von DO9 mit Cisplatin auf
die Kinetik des intrazellulären Platingehalts der Zelle. ................................ 69
Abbildung 14: Immunanalytisches Nachweis-Verfahren von Pt-(GpG)-Addukten in der
DNA von primären Tumorzellen. ................................................................. 71
Abbildung 15: Analyse-Verfahren von (Pt-GpG)-Addukten in primären Tumorzellen
einer Tumorprobe nach ex vivo Cisplatin-Exposition. ................................. 72
Abbildung 16: Kinetik von Pt-(GpG)-Addukten in der DNA von primären Tumorzellen
eines soliden Tumors nach Cisplatin-Exposition. ........................................ 74
Abbildung 17: Visualisierung und Quantifizierung des Pt-(GpG)-Adduktgehalts in der
DNA von Tumorzellen aus primären Tumor und Aszites einer Patientin.... 76
Abbildung 18: Kinetik der Pt-(GpG)-Addukte in der DNA primärer Tumorzellen aus
soliden Tumor und Aszites einer Patientin. .................................................. 77
Abbildung 19: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-
(GpG)-Adduktgehalt in primären Tumorzellen aus soliden Tumor und
Aszites einer Patientin. ................................................................................. 78
113
Abbildung 20: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-
(GpG)-Adduktgehalt in CA-125+ Tumorzellen und CA-125- nicht-
Tumorzellen aus Aszites. .............................................................................. 80
Abbildung 21: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-
(GpG)-Adduktgehalt in primären Tumorzellen aus soliden Tumoren und
Aszites unterschiedlicher Patientinnen. ........................................................ 82
Abbildung 22:Wirkungsmodell der DO-Modulatoren in physiologischen- und in
Tumorzellen. ................................................................................................. 99
Abbildung 23: Strukturformel der DO-Modulatoren. ................................................... 101
Abbildung 24: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-
(GpG)-Adduktgehalt und intrazellulären Platin-Level in Cisplatin-sensitiven
RT112 und Cisplatin-resistenten RT112 LTT Blasenkarzinom-
Zelllinien. .................................................................................................... 116
Abbildung 25: Pt-(GpG)-Adduktgehalt in LAN-1 WT und LAN-1 res Zelllinien mit
Cisplatin alleine und in Kombination mit DO-Modulatoren. .................... 117
Abbildung 26: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO7 auf den Pt-(GpG)-
Adduktgehalt und intrazellulären Platin-Level in 833K, A549 und LAN-1
WT Zelllinien.............................................................................................. 117
Abbildung 27: Messung von (Pt-GpG)-Addukten in der DNA von zirkulierenden
Tumorzellen nach ex vivo Cisplatin-Exposition. ........................................ 118
114
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: WHO-Klassifikation: histogenetische Gruppen maligner Ovarialtumore ..... 26
Tabelle 2: Verwendete Materialien ................................................................................. 34
Tabelle 3: Verwendete Geräte ......................................................................................... 34
Tabelle 4: Verwendete Chemikalien und Enzyme .......................................................... 35
Tabelle 5: Verwendete Puffer und Lösungen .................................................................. 36
Tabelle 6: Verwendete Nährmedien ................................................................................ 38
Tabelle 7: Pharmakologisch wirksame Substanzen ........................................................ 39
Tabelle 8: Antikörper ...................................................................................................... 40
Tabelle 9: Software ......................................................................................................... 40
Tabelle 10: Zelllinien ...................................................................................................... 41
Tabelle 11: Primäres Tumormaterial ............................................................................... 42
Tabelle 12: FIGO Stadieneinteilung des Ovarialkarzinoms ......................................... 115
115
Anhang
Tabelle 12: FIGO Stadieneinteilung des Ovarialkarzinoms
FIGO Ausbreitung
I Tumor auf die Ovarien begrenzt
Ia Tumor auf ein Ovar begrenzt, Kapsel intakt, kein Tumor auf
der Ovaroberfläche; keine malignen Zellen in Aszites oder bei
Peritonealspülung
Ib Tumor auf beide Ovarien begrenzt, Kapsel intakt, kein Tumor
auf der Ovaroberfläche; keine malignen Zellen in Aszites oder
bei Peritonealspülung
Ic Tumor auf ein oder beide Ovarien begrenzt und eine der
folgenden Situationen
Ic1 Kapselruptur bei der Operation
Ic2 Kapselruptur vor der Operation oder Tumor an der Oberfläche
Ic3 Nachweis maligner Zellen im Aszites oder bei
Peritonealspülung
II Ein Ovar oder beide Ovarien befallen, Ausbreitung im kleinen
Becken oder primäres Peritonealkarzinom
IIa Übergreifen auf und/oder Metastasierung in den Uterus
und/oder die Ovarien
IIb Übergreifen auf das übrige intraperitoneale Beckengewebe
III Tumor befällt ein Ovar oder beide Ovarien oder primäres
Peritonealkarzinom, mit zytologisch oder histologisch
bestätigter Peritonealaussaat außerhalb des kleinen Beckens
und/oder retroperitonealen Lymphknotenmetastasen
IIIa1 Nur positive retroperitoneale Lymphknoten (zytologisch oder
histologisch verifiziert) (i) Metastasen ≤ 10 mm (ii) Metastasen > 10 mm
IIIa2 Mikroskopische Peritonelametastasen oberhalb des kleinen
Beckens mit oder ohne retriperitonealen
Lymphknotenmetastasen
IIIb Makroskopische Peritonealmetastasen ≤ 2 cm im größten
Durchmesser oberhalb des kleinen Beckens mit oder ohne
retroperitonealen Lymphknotenmetastasen
IIIc Makroskopische Peritonealmetastasen ≤ 2 cm im größten
Durchmesser oberhalb des kleinen Beckens (einschließlich
Kapselinfiltration von Leber und Milz) mit oder ohne
retroperitonealen Lymphknotenmetastasen
IV Fernmetastasen (ausgenommen Peritonealmetastasen)
IVa Maligner Pleuraerguss (zytologisch verifiziert)
IVb Parenchymatöse Metastasen der Leber/Milz und
extraabdominelle Metastasen einschließlich der inguinalen
Lymphknoten und Lymphknoten außerhalb der Bauchhöhle
116
Abbildung 24: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO-Modulatoren auf den Pt-(GpG)-
Adduktgehalt und intrazellulären Platin-Level in Cisplatin-sensitiven RT112 und Cisplatin-
resistenten RT112 LTT Blasenkarzinom-Zelllinien.
Sensitive (A) und resistente (B) Zelllinien wurden mit Cisplatin (20 µg/mL) alleine oder mit Cisplatin und
DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL, 30 min vor Cisplatin-Exposition)
behandelt. Nach 4 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, auf OT aufgebracht und der Pt-(GpG)-
Adduktgehalt mittels ICA angefärbt und quantifiziert. C-B: Quantifizierung der Pt-(GpG)-Addukte in
Cisplatin-sensitiven RT112 und Cisplatin-resistenten RT112 LTT. C-D: Intrazellulärer Platin-Level in
RT112 und RT112 LTT Zelllinien
117
Abbildung 25: Pt-(GpG)-Adduktgehalt in LAN-1 WT und LAN-1 res Zelllinien mit Cisplatin alleine
und in Kombination mit DO-Modulatoren.
Sensitive (A) und resistente (B) Zelllinien wurden mit unterschiedlichen Cisplatin-Konzentrationen, alleine
oder mit Cisplatin und DO-Modulatoren (DO7: 40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL; DO9: 10 µg/mL, 30 min vor
Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 4 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, auf OT aufgebracht und
der Pt-(GpG)-Adduktgehalt mittels ICA angefärbt und quantifiziert.
Abbildung 26: Effekt von Cisplatin in Kombination mit DO7 auf den Pt-(GpG)-Adduktgehalt und
intrazellulären Platin-Level in 833K, A549 und LAN-1 WT Zelllinien..
Zelllinien wurden mit Cisplatin (20 µg/mL) alleine oder mit Cisplatin und DO7 (40 µg/mL) behandelt.
Nach 4 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, auf OT aufgebracht und der Pt-(GpG)-Adduktgehalt
mittels ICA angefärbt und quantifiziert. A: Quantifizierung der Pt-(GpG)-Addukte. B: Intrazellulärer
Platin-Level. Ein Vergleich des Gesamtplatingehaltes und der DNA-Addukte bei A549 Zelllinie, zeigte bei
einem sehr hohen Gesamtplatinspiegel in der Zelle eine sehr niedrige Adduktierung der DNA.
118
Abbildung 27: Messung von (Pt-GpG)-Addukten in der DNA von zirkulierenden Tumorzellen nach
ex vivo Cisplatin-Exposition.
CTCs wurden ex vivo mit Cisplatin (20 µg/mL) alleine oder in Kombination mit DO-Modulatoren (DO7:
40 µg/mL; DO8: 20 µg/mL, 30 min vor Cisplatin-Exposition) behandelt. Nach 3 h Inkubation wurden die
Zellen geerntet, auf OT aufgebracht, pan-CK positive Zellen identifiziert und lokalisiert und der Pt-(GpG)-
Adduktgehalt mittels ICA angefärbt und quantifiziert. A: Immunfluoreszenz-Färbung mit anti-pan-CK. B:
Quantifizierung des Pt-(GpG)-Adduktgehaltes in pan-CK positiven Zellen.
119
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131
132
Lebenslauf
Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten
133
Publikationsübersicht
1. Tribbles 2 mediates cisplatin sensitivity and DNA damage response in
epithelial ovarian cancer
Daniel Kritsch, Franziska Hoffmann, Daniel Steinbach, Lars Jansen, Stella Mary
Photini, Mieczyslaw Gajda, Alexander S. Mosig, Jürgen Sonnemann, Sven Peters,
Margarita Melnikova, Jürgen Thomale, Matthias Dürst, Ingo B. Runnebaum and
Norman Häfne
International Journal of Cancer 141, 1600-1613 (2017); PMID: 28670762
2. Cisplatin-induced neuropathic pain is mediated by upregulation of N-type
voltage-gated calcium channels in dorsal root ganglion neurons
Markus Leo, Linda-Isabell Schmitt, Martin Erkel, Margarita Melnikova, Jürgen
Thomale, Tim Hagenacker
Experimental Neurology 288, 62-74 (2017); PMID: 27823926
3. Visualization and quantitative measurement of drug-induced platinum
adducts in the nuclear DNA of individual cells by an Immuno-cytological
assay
Margarita Melnikova and Jürgen Thomale
Urothelial carcinoma: Methods in Molecular Biology, Vol. 1655, 351-358
(2018); PMID: 28889396
4. Multifaceted mechanisms of cisplatin resistance in long-term treated
urothelial carcinoma cell lines
Margaretha A. Skowron, Margarita Melnikova, Joep G.H. van Roermund, Andrea
Romano, Peter Albers, Jürgen Thomale, Wolfgang A. Schulz, Günter Niegisch,
Michèle J. Hoffmann
International Journal of Molecular Sciences 19 (2): 590 (2018); PMID: 29462944
134
Danksagung
Ich möchte mich ganz herzlich bei allen bedanken, die mich bei der Anfertigung meiner
Dissertation unterstützt haben.
Besonderer Dank gilt PD. Dr. Jürgen Thomale, für die Möglichkeit der Anfertigung
meiner Promotionsarbeit in seinem Labor. Ich bedanke mich für die hervorragende
Betreuung, die zahlreichen Unterstützungen und die bemerkenswerte
Diskussionsbereitschaft.
Bei Prof. Dr. Bernhard Horsthemke und Prof. Dr. Dominik Boos bedanke ich mich für
die Übernahme des Zweit- bzw. Drittgutachtens.
Bei Prof. Dr. Sabine Kasimir-Bauer (Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Essen), sowie
Dr. Jan Kuhlman (Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Dresden)
und Dr. Dieter Niederacher (Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe, Düsseldorf)
bedanke ich mich für die tolle Zusammenarbeit und die Bereitstellung von Probematerial.
Bei Prof. Dr. Alexander Schramm (Labor für molekulare Onkologie, Essen) für die
bereitstellung von Zelllinien. Bei Prof. Dr. Agnes Bankfalvi (Institut für Pathologie,
Essen) für die Unterstützung in pathologischen Fragestellungen. Bei Dr. Ralf Axel Hilger
und Dennis Alex bedanke ich mich für die Möglichkeit der intrazellulären Messungen.
Ganz besonders bedanke ich mich bei meinen Arbeitskollegen Martin Erkel und Maria
Eynck, für die tolle Einarbeitung im Labor, die tolle Unterstützung und allgemein für die
schöne und lustige Zeit in der Arbeitsgruppe.
Abschließend bedanke ich mich bei meinen Eltern, meiner Schwester, meinem Schwager
und meinen Freunden für den starken emotionalen Rückhalt und für eure Motivation. Ich
danke euch, dass ihr mich den ganzen Weg begleitet habt!
135
Eidesstattliche Erklärung
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, gem. § 7 Abs. (2) d) + f) der Promotionsordnung der Fakultät für
Biologie zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich die vorliegende Dissertation selbständig
verfasst und mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel bedient, bei der
Abfassung der Dissertation nur die angegeben Hilfsmittel benutzt und alle wörtlich oder
inhaltlich übernommenen Stellen als solche gekennzeichnet habe.
Essen, den _________________ _______________________________________ Unterschrift des/r Doktoranden/in
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, gem. § 7 Abs. (2) e) + g) der Promotionsordnung der Fakultät für
Biologie zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich keine anderen Promotionen bzw.
Promotionsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe und dass diese Arbeit von
keiner anderen Fakultät/Fachbereich abgelehnt worden ist.
Essen, den _________________ _______________________________________ Unterschrift des/r Doktoranden/in
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. (2) g) der Promotionsordnung der Fakultät für Biologie
zur Erlangung der Dr. rer. nat., dass ich das Arbeitsgebiet, dem das Thema „Zur Rolle
von Platin-DNA-Addukten in Tumorzellen für das zelluläre und klinische Ansprechen auf
eine Cisplatin-Behandlung: Neue Ansätze zur Prädiktion und Modulation“ zuzuordnen
ist, in Forschung und Lehre vertrete und den Antrag von Margarita Melnikova befürworte
und die Betreuung auch im Falle eines Weggangs, wenn nicht wichtige Gründe dem
entgegenstehen, weiterführen werde.
Essen, den _________________ ________________________________________ Unterschrift eines Mitglieds der Universität Duisburg-Essen
