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Zur Synthese peptidahnlicher K6rper aus Amino- zuckern und Aminosauren I.

Blucosamin als Koniponente'); von Alfied Bertho, Fritz Hiilder, Werner Meiser und Franz Hutlier.

[Aus dem Chemischen Laboratorium der Bayerischen Akademie der Wissenschaften zu Munchen.]

(Eingelaufen am 1. Dezember 1930.)

Die Amino-2-liexosen Glucosarnin und Chovdrosainin sind in betrachtlichem Ausma5 bei der Hydrolyse der sogenannten Glucoproteide und verschiedener einf'acher Proteine erhatlten worden. Die Frage, melche speziellen chemischen Bindungs- verhaltnisse bei der Eingliederung des Aminozuckers in das groDe EiweiBmoIekiil obwalten, lBBt sich nur in jenen Fallen bis zu einem gewissen Grad beantworten, wo durch partielle Hydrolyse die Ab trennnng von aminozuckerhaltigen Kom- plexeii moglich war, deren verhaltnisma5ig einfache chemische Natur i n den Hauptziigen erkannt werden konnte. Die bestcharakterisierten und allgemeiner verbreiteten Komplexe dieser Art sind die von C. Th. Morne r2 ) entdeckte, von 0. S c h m i e d e b e r g 3 zuerst untersuchte Chondroitinschwefel- sLure und die von P. A. L e v e n e und 5. LOpez-JuArez4) aufgefundene, weniger gut definierte Nucoitinschwefelshre, die beide, letztere in stark wecliselndem Reinheitsgrad, aus einer Reihe von Mucinen und Mucoiden gewonnen merden konnen. Sie liefern, wie insbesondere P. A. L e v e n e und seine N i t a r b e i t e r 5 ) zeigten, bei der vollstgndigen Hydro- lyse Hexosaminbase (Chondrosnmin bzw. Glucosamin), Essig-

l) 2. Mitteilung uber stickstoffhaltige Zucker. 1. Mitteilung vgl.

p, Skandinav. Arch. f. Physiol. I , 210 (1889); €1. 20, 357 (1895);

3, A. Pth. 28, 358 (1891); 87, 1 (1920). 4, J. of. biol. chem. 25, 511 (1916); 26, 373 (1917); 36, 105 (1919). 5, P. A. L e v e n e u. F. B. La Forge, J. ofbiol. chem. 16, 69 u.

155 (1913); lS , 123, 237 (1914); 20, 95, 433 (1915); 26, 143 (1917); vgl. auch Anm. 4.

B. 63, 836 (1930).

23, 311 (1897).

128 Bertho, HiiIder, Meiser und Huther,

saure, Glucuronsaure und Schwefelsaure, jedoch keine Amino- saure. Charakteristisch fur sie ist das Fehlen reduzierender Zuckergruppen, die Blockierung der Aminogruppen durch Acetyl und die Veresterung einzelner Hydroxyle mit Schwefel- saure. Andererseits konnte man bei vorsichtiger Hydrolyse oder enzymatischer Verdauung aus Albuminen oder Globulinen ebenso wie aus einigen den Glucoproteiden zuzurechnenden Substanzen andersartige Komplexe isolieren , die schwefel- frei und in gewissen Fallen sicher ausschliefllich ails Zuckern uud Aminozuckern zusammengesetzt sind. I n ihrer chemischen Natur am weitesten aufgeklgrt sind die nur aus Mannose und Glucosamin bestehenden, allcalische Kupferlosung nicht reduzierenden Komplexe, wie sie zuerst einerseits von S. Fr i inke l und C. Je l l inek ' ) und spater insbesondere von P ,A .Levene und T.Moriz) aus Eieralbumin bzw. dem darin enthaltenenOvomucoid sowie andererseits vonC.Rimin @,on3) aus Serumalbumin und -globulin durch Hydrolyse mit Baryt oder durch Trypsinverdauung isoliert wurden. I n diesen FLHen, ausgenommen den ersten, so verschieden sie sich auch sonst darstellen, sind die Aminogrnppen des Glucosamin- anteils unbesetzt und nach v a n S l y k e nachweisbar. Uiese Tatsachen, die erst bekannt wurden, als die nachfolgende Arbeit schon langere Zeit betrieben worden war, erscheinen uns bedeutungsvoll und haben uns in unsereu nachfolgend ausgefiihrten Absichten bestarkt. Sie geben namlich die ersten durch das Experiment ermittelten Hinweise dafiir, ad3 sich der Aminozucker bzw. der ihn enthaltende Komplex in grundsatzlich ahnlicher Weise als Baustein des EiweiS- molekiils betatigen konnte wie die einfache Aminosaure.

Eine derartige Anf faesung bestand schon liinger. Die typische Zuckerkomponente der EiweiSkarper, Glucosamin , ,,nimmt" nach E. Abderhalden') ,,zwischen Aminosliuren und Kohlehydraten eine Zwischenstellung ein und ist im Protein hochstmahrscheinlich ebeaso gebunden wie die anderen Aminosauren".

I) Bio. Z. 186, 392 (1927). Biol. Chem. 84, 49 (1929). Derselbe u. A. Rothen, 84, 63

(1929). VgLauchYutaka Komori , The Journ. ofBiochem. VI, l(1926). ') Bio. J. 23, 430 (1929). 3 Handbuch der biol. Arbeitsmethoden 8, 535 (1923).

Synthese peptidihnlichei. Kiirpcr aus Aminozuckern usw. 129

Eine xweite Moglichkeit, die in entsprechender Form auch f i r OxyaminosBuren diskutiert werden kann, ergibt sich durch die gleich- artige Besetzung der Zuckerhydroxyle durch Aminoacyle bzw. Peptid- ketten und zwar mit Ausnahme des glucosidischen, denn das fehleude Reduktionsvermiigen der erwlhnten Substanzen beweist die Abwesen- heit glucosidischer Hydroxylc.

Ein dritles fur die Zuckerkomponente spezifisches Aufbauprinzip ist schliefilich abseits der obigeu Anuahmen in der hochbedeutsamen Kondensation von reduzierenden Zuckergruppen mit der freien oder monosubstituierten Aminogruppe zu erblicken, sei es unter Glucosid- bildung (aldehyd-ammoniakartige Verkniipfung) oder, soweit freie Amino- gruppen und die Zuckerkomponenten in der Aldehydform beteiligt sind, unter Bildung S chiffscher Basen. Verbindungen dieser beiden Typen sind synthetisiert worden.') Es sind Derivate der Amino-1-hexoside und -pentoside bew. -KBrper, die sich von deren tautomeren Iminformen ableiten. I n die gleiche Linie sind die Vorgange in den Gleichgewichten zwischen Aminosiiuren und Zuckerne) und bei der Zucker-EiweiB- Kondensation zu setZen*), die in den letzten Jahren zahlreiche Be- arbeiter gefunden haben.

Nine Klarung der Prage, jnwieweit Carbonamidbin- dungen bei der Eingliederung der Aminozucker in das Eiweifimolekiil iiberhaupt eine Rolle spielen, wird man in erster Linie durch das Studium der enzymatischen Hydro- lyse einfachsten synthetischen Materials erreichen konnen, in ahnlicher \\'eke, wie es bisher durch das Studium der Peptidspaltung vermittels tierischer oder pflanzlicher pro- teolytischer Enzyme von verschiedener Seite geschah.

Wir haben uns zur Aufgabe gemacht, derartige den Peptiden ahnliche Verbindungen, in denen Aminozucker, mit Aminosauren durch Carbonamidbindung vereinigt sind, und die man zweckmLDig als ,,Glncopeptide'( bezeichnen wird, zu synthetisieren. Als Zuckerkomponente haben wir

I) Vgl. z. B. Sc l i i f f , A. 154, 30 (1870); S o r o k i n , J. pr. [2], 37, 291 (1888); M a r c h l e w s k i , J. pr. [2], 60, 95 (1894); W. v. M u l l e r u. J. PlBchl , B. 27, 1285 (1894); J. C. I r v i n e u. R. G i l m o u r , SOC. 93, 1429 (1908); 96, 1545 (1909); d e m u. D. Mc.Nicol1, SOC. 97, 1449 (1910); ders. u. A. H y n d , Soc. 99, 161 (1911); M. A m a d o r i , C. 1929 I, 2409, 11, 32.

*) Vgl. e. B. H. v . E u l e r u. E. B r u n i u s , A. 467, 201 (1928); C. N e u b e r g und M. K o b e l , Bio. 2. 200, 459 (1928).

n, H. P r i n g s h e i m u. M. W i n t e r , B. 60, 278 (1927); S. P. L. S o e r e n s e n u. L. L o r b e r , B. 60, 999 (1927).

Annalen der Chemie 486. Band. 9

130 Bertiio, Hclder, Meiser und Hiither,

zunachst das leicht zugangliche Glucosamin gewahlt l), in dessen Aminogruppe Aminoacyle bzw. kurze Yeptidketten eingefuhrt werden sollten. An Methoden standen uns die bei der Peptidsynthese bewahrten aur Verfugung.

J. C. I r v i n e und A. Hynda) und gleichzeitig Ch. Weiz- m a n n nnd A. Hopwoo d3) haben vor langerer Zeit ahn- liches angestreb t. Jene hatten Glucoside des Glucosamins synthetisiert, die einen Betainring enthalten (Ia) und dem- entsprechend ein vollkommen abweichendes Verhalten von den normalen Glucosiden bei der Saurehydrolyse zeigen. Sie sind bemerkenswert beatandig gegen Salzsaure. Die Hydrolyse ihrer Acylderivate in 2,5-proc. Saure fuhrt nur zur Abspaltung der Acyle. Da man eine ahnliche Resistenz gegenuber hydrolysierenden Agentien bei den Mucinen wiederfindet, bei denen 2,5-proc. Salzsaure ebenfalls keine reduzierenden Zuckergruppen freilegt, brachten l r v i n e nnd H y n d fur manche Glucoproteide in Analogie zu ihren synthetischen acylierten Glucosaminglucosiden eine betain- artige Formulierung in Vorschlag, nach der die Wasserstoff- atome der Zuckerhydroxyle durch Aminoacyle bzw. kurze Polypeptidketten, die Wasserstoffatome des Betainstickstoffs, in gleicher Weise und durch die glucosidische Gruppe er- setzt waren. Derartige Korper wiirden bei der Hydrolyse mi t verdiinnter Salzsaure oder mit Alkali nur die Bmino- sauren liefern, ohne daf3 die glucosidische Gruppe verandert wiirde. Auch stunden die analytischen Daten der Mucine und die Menge ihrer Spaltprodukte mit derartigen Formu- lierungen in Einklang. Dieser AnalogieschluB verliert aber in dieserForman Wert, nachdem J . C . I r v i n e und J.C.Xar14) gezeigt hatten, daB nur fur das freie Methylglucosamin, jedoch nicht fur sein Triacetylderivat die Betainformel

l) Darstellung aus Hummerschalen nach C. N e u b e r g , Bio. 43, 501 (1912); J. C. I r v i n e , Chem. SOC. 99, 256 (1911); Darstellung aus Pilsmehl, E. S c h o l l , M. 29, 1023 (1908).

Chem. SOC. 103, 41 (1913). 3, Chem. SOC. l’roc. 28, 261 (1912); Proc. Royal SOC, London,

3 Chem. SOC. 121, 2378 (1922). A. 88, 455 (1913).

Synthese peptidiihnlicher KGrper aus AminorueRern uszv. 131

wahrscheinlich ist. Entgegen der damaligen Mitteilung I r v i n e s und H y n d s ist keine weitere den Gegenstand betreffende Veroffentlichung erfolgt.

C. R i m i n g t o n l ) hat fur seinen eingangs erwiihnten Zuckerkomplex, den er als Disaccharid anspricht, die For- mulierung als Glucosamino-mannose mit betainartiger Atom- anordnung (Ib), wie sie I r v i n e und H y n d beim Methyl- glucosid des Glucosamins (Ia) annehmen, als moglich dis- kutiert. Hierfiir spricht vor allem die langsame Stickstoff- bildnng bei der v a n Slyke-Bestimmung (unter Verwendung schwacher Sauren), die fur die in den Betainring ein- gegliederte Aminogruppe typisch zu sein scheint und die in gleicher Weise im Gegensatz zu seinen mineralsauren Salzen am freien Glucosamin beobachtet wird.q Die Mog- lichkeit, daB daher dem freien Blucosamin eine betainartige Struktur (Ic) zugeschrieben werden muD, haben bereits I r v i n e und Hynds ) unter anderem wegen des Fehlens der Mutarotation beim freien Blucosamin zur Diskussion ge- stellt. Ebenso hat dann P. K a r r e r 4 ) in allerjungster Zeit eine derartige Formulierung als den zur Zeit besten Aus- drack des chemischen Verhaltens beim Chitosan (Id), dem dem Chitin am nachsten stehenden Abbauprodukte, gefordert. So sehr wir jedoch einerseits eine betainartige Struktur fur das R imin g t onsche Uisaccharid (Ib), das Methylglucosid des Glucosamins (Ia) und das Chitosan ( l d ) , die samtlich alkalische Kupferlosung nicht reduzieren, zu befiirworten vermogen, zumal sie im zweiten Fall durch Abspaltung von Methylamin bei der Hydrolyse bewiesen ist 3)? halten wir andererseits ebensosehr eine derartige Annahme fur das freie Glucosamin (Ic) trotz der erwahnten Abnormitlten fur gewagt. Diese Verbindung reduziert Fehl ing-Losung spielend, und es ware dann nicht einzusehen, warum diese Eigenschaft, die doch von der Riickbildung des glucosi- dischen Hydroxyls abhangig ist , und die in allen Fiillen

l) Bio. J. 23, 439 (1929). %) A. H y n d u. M. G. Macfarlane, Bio. J. 20, 1264 (1926). s, Chem. SOC. 101, 1136 (1912). 3 Helv. XIII, 11, 1105 (1930).

9*

132 Bertho, H o l d e r , Meiser und Huther,

generell verlangt werden miiSte, bei jenen drei Korpern fehlt. Vie1 eher halten wir es auf Grund unserer eigenen Beobachtungen an N- aminoacylierten Glucosaminen (vgl. S. 140) fur wahrscheinlich, daS beim freien Glucosamin und manchen seiner N-acylierten Derivaten I), die samtlich reduzieren und bis zu einem gewissen Grad eben jene Ab- normitaten aufweisen, das glucosidische Hydroxyl in seiner normalen Betatigung infolge der Nachbarschaft der freien oder substituierten Aminogruppe ganz oder teilweise ge- hemmt w i d . Wahrend es also in jenen Fallen unter Ver- schiebung des $glycons ziir Ausbildung einer ionogenen Valenz kommt, eben zur Betainbildung, sind in diesen wahr- scheinlich statische Krafte zwischen Hydroxyl- und Amino- gruppen wirksam, die diese beiden schwach polaren Gruppen in konstantem Abstand halten. Damit is t optische Umkehr am C, (Mutarotation) unmoglich.

0 1 NBAc OH

? RNH,---O 'de.r

I I I H

H , 4 1 7 I

I + 3 € I y C H

H Ie R = CH, I b R = Mannoserest I I I c R = H I d R = Glucosaminrest H CH,OH

I1

Weizmann und H o p w o o d andererseits haben in zwei- jahriger Arbeit unter Erhaltung der reduzierenden Zucker- gruppe zunachst drei N-Bromacylglucosamine synthetisiert, die sie der Umsetzung mi t wahigem Amnioniak unterwarfen. Nach ihren Versuchsergebnissen erfolgt dabei nicht nur Austausch des Halogens gegen die Aminogruppe, sondern eine weitergehende Anhydrisierung unter Austritt von 1 Mole- kul Wasser zu Produkten, deren Konsti tution von den beiden Autoren offengelassen wird (vgl. unten). Auch von ihrer Seite ist eine Fortsetzung der Untersuchungen zwar an-

I) Fur Acetyl-N-glucosamin ist keine Mutarotation beeehrieben R. Breuer , B. 31, 2198 (1898); S. Frankel und A. K e l l y , M. 23,125 (1902). Die auf S. 142 ff. beschriebenen Halogenacyl-N-glncosamine zeigen jedoch Mutarotation.

Synthese peptidaAnlicher KGrper aus Aminozuckern usw. 133

gekundigt worden, eine weitere VertXentlichung jedoch nicht erfolgt.

I n den ersten Monaten unserer eigenen vor drei Jahren begonnenen Untersuchungen, waren uns die beiden Arbeiten von W e i z m a n n und Hopwood leider entgangen. Wir haben damit begonnen, Halogenacylreste in die Aminogruppe des Glucosamins ') einzufuhren und gelangten, da die Amino- gruppe gegeniiber den Hydroxylgruppen bevorzugt reagiert, ahnlich wie man dies auch an Oxyamino-Sauren beob- achtet2), ohne groBe Schwierigkeit und in gnter Ausbeute zu Brompropionyl-N-ylucosamin (11, Ac = GO. CHBr . CH,) und Bromisocapronyl-N-glucosamita, wahrend die Gewinnung des ChZoracetyl-N-glueosamins, das vonWeizmann und Ho pwood nicht beschrieben wurde, sich wesentlich schwieriger ge- staltete. Diesen am haufigsten benutzten Weg E. F i s c h e r s 3 ) zur Peptidsynthese sind auch W e i z m a n n und Hopwood gegangen. Wir konnten ihre Befunde iiber Brompropionyl- und Bromisocapronyl-N-glucosamin bestatigen und auf a rund der von uns ermittelten optisehen Daten erganzen. Be- merkenswert ist an diesen Verbindungen, da13 sie, wie wir im Einklang mit jenen Autoren feststellten, leicht alkalische Kupferlosung nnd ammoniakalische Silberlosung rednzieren, womit sich einwandfrei reduzierende Zuckergruppen mani- festieren, andererseits aber unter keinen Umstanden mit Aldehydreagentien, Phenylhydrazin und Semicarbohydrazid reagieren. Da sie jedoch eindeutig betrachtliche Mutarota- tion zeigen - fur das einfache, schon lange bekannte Acetyl- N-glucosamin ist allerdings eine solche nicht beschrieben - steht nichts im Wege, diesen Glucosaminderivaten die Acetal- zuckerformel zuzuerteilen. Die mangelnde Reaktionsfahig- keit gegeniiber Ketoreagentien mull demnach durch einen sterischen Faktor bedingt sein und nicht auf einer betain- artigen Atomanordnung beruhen, die hier wegen der sauren Reste an und fur sich unmahrscheinlich ist (vgl. S. 131).

I) Dessen Darstellung vgl. Breuer, B. 31, 2193 (1898). 2, E. Fischer, B. 37, 2686 (1904); 40, 3704 (1907); deraelbe u.

W. F. Kijlker, A. 340, 180 (1905); derselbe u. H. R o e s n e r , A. 376, 199 (1910). 3, B. 36, 2982 (1903); 37, 2486 (1904).

134 B e r t h o , Hi i lder , N e i s e r und H u t h e r ,

Weizmann und H o p w o o d haben den Austausch des Broms gegen die Aminogruppe bei Brompropionyl- und Bromisocapronylglucosamin dadurch bewerkstelligt, daB sie die Bromacylkorper mit konz. wa/?rigem Ammoniak bei Zimmertemperatur 5 Tage schuttelten. Bei der Aufarbeitung erhielten eie jeweils eiiie Verbindung, die halogenfrei war, weder mit Phenylhydrazin noch mit Semicarbohydrazid reagierte und Feh l ingsche Losung ebenso wie ammonia- kalische Silberlosung iiur auBerordentlich wenig nach langem Kochen reduzierte. lhre Zusammensetznng entspricht uach jenen Autoren nicht derjenigen der erwarteten Aminoacyl- glucosamine, sondern jener von Anhydriden dieser Kiirper, da sie angeblich ein Molekiil Wasser weniger enthalten sollen. Als wir Brompropionylglucosamin mit iiberschiissigem konz. methylalkoholischem Bmmoniak 5 Tage lang im Eis- schrank stehen lieden, erfolgte keine Umsetzung. Ein gleich- artiger Versuch von 3 Monaten Dauer fuhrte zu zwei halogen- freien Produkten. Das zuerst anfallende, in der Haupt- sache entstehende, erwies sich als identisch mit dem von W e i z m a n n nnd H o p w o o d als Alanylglucosamin - anhy- drid beschriebenen von der angeblichen Zusammensetzung C,E,,OsNz vom Zersetxungspunkt 269-272 O, wlhrend ans der Mutterlauge in geringer Dlenge ein KGrper vom Schrnelz- punkt 199' isoliert werden konnte, der ebenfalls Fehling- losung nur aulerordentlich schwer und in sehr geringem MaBe reduzierte. Die Bildung dieses Korpers ist bei inten- siveren Reaktionsbedingungen bevorzugt. Daher entsteht er neben dem ersten als Hauptprodukt, wenn man die Um- setzung mit methy2alkoholischem Ammoniak wahrend 6 Stun- den bei etwa 60° in der Bombe vornirnmt und ausschlieB- lich, wenn die Umsetzung bei 100' bewerkstelligt wird. Seine Zusammensetzung ergibt sich zu C,H,,O,N,. Er besitzt also zwei DiIolekule Wasser weniger als das offene Glucopeptid. Andererseits liefert Brompropionylglucosamin bei 3 monatigem Stehen im Eisschrank mit konz. wakrigem Ammoniak ebenso wie unter den von Weizmaun und H o p w o o d angewandten Bedingungen neben geringen Mengen des Dianhydrids das von diesen ausschliedlich beschriebene Anhydrid.

Synthese peptidahnlicher Kiirper aus Bminozuchern usw. 135

Die Konstitution dieser beiden Verbindungen haben wir aufgeklart. F u r den Anhydrisierungsvorgang kommen grundsatzlich zwei Moglichkeiten in Betracht: 1. Wasser- austritt zwischen der glucosidischen Hydroxylgruppe oder einer der ubrigen drei Hydroxylgruppen des Zuckers und der Aminogruppe des Aminoacylrestes, 2. eine Anhydrid- bildung, bei der ausschlie5lich die Hydroxylgruppen des Glucosaminanteils beteiligt sind. F u r die Anhydride der Aminoacyl-glucosamine geben Weizmann und Hopwood') der letzteren Annahme den Vorzug in Analogie zu unter- einander dnrchaus wesensverschiedenen Umsetzungen von Glucose und Glucosederivaten mit Ammoniak und Alkalia), ein SchluS, der auch damals schon - wie wir glauben - nur teilweise berechtigt war. Die weitere Diskussion dieser Annahme fur die 0-reichere Verbindung eriibrigt sich aus folgenden Grunden. Die Substanz ist auf Grund wieder- holter Analysen um 2 Wasseretoffatome armer als der Formel C,H,,O,N, entspricht. Sie hat die Zusammensetzung C,H,,O,N, und besitzt, wie eine Nolekulargewichtsbestim- mung nach der kryoskopischen Methode in Acetamid er- gab, das einfache Molekulargewicht. Sie reduziert nur bei sehr langem Kochen in geringem Mafie alkalische Kupfer- losung, enthalt also keine freie, rednzierende Zuckergruppe. Im v a n Slyke-Apparat entbindet sie keinen Stickstoff, Dain ihr auch keine Kohlenstoff-Doppelbindung nachzuweisen ist, ergibt sich der Schlu5, daS die Wasserabspaltung zwischen NH, und OH am C, vor sich gegangen ist. Aus dem primaren Produkt 111 mu5 dann dnrch Dehydrierung das Anhydrid C,H,,O,N, mit der Konstitution IV hervorgegangen sein. Es ist als Behydroderivat des Alanyl-ylucosaminanhydrz'ds oder als 2-Tetraoxybutyl-5-methy2-6-oxo-pyrazin-dihydrid (5,6) zu be- zeichnen. Wasserstoffverlust, zumal unter dem EinfluS von alkoholischem Ammoniak an partiell hydrierten Pyrazin-

l) Proc. Roy. SOC. London A. 88, 461 (1913). a) J. C. Irv ine , R. F. Thompson u. C. S. Garrett , Soc. 103,

238 (1913); E. F i s c h e r u. K. Zach, B. 45, 456, 2068 (1912); vgl. auch H. Ohle, L. v. Vargha u. H. Erlbach, B. 61, 1211 (1928); P. A. L e - vene , Bio. Z. 124, 37 (1921).

136 B e r t h o , HGlder, Meiser und Huther ,

ringen, ist eine seit langem bekannte, wiederholt beob- achtete Erscheinung. Das aus Fructose und methylalko- holischem Ammoniak bzw. aus Glucosamin als freiwilliges Umwandlungsprodukt entstebende 2,5-Bis-(tetraoxybutyl)- pyrazinl) (Fructosazin) kommt unter ahnlichen Erscheinungen zustande, ebenso die Bildung des 2,6-l)iphenylpyrazins 2, aus Diphenacylamin und alkoholischem Ammoniak. Auch hier konnten die urn 2 H-Stome reicheren, hydrierten Pyrazine nicht gefadt werden. Besondere Snzeichen, daB die Sub- stanz in der tautomeren Form als Oxy-pyrazin zu formu- lieren ist, haben wir nicht gefunden, doch ist eine derartige Tautomerisierung wegen der Ausbildung des Pyrazingefuges moglich. Die Bindungsverhaltnisse sind ahnlich wie bei den Osazonen. Die noch mogliche Formel V scheint uns die stabilen Eigenschaften des Stoffes, vor allem aber auch seine Entstehungsweise, weniger gut zum Ausdruck zu bringen als IT.

x HC-N-CH . CH, HC=N-CH. CH,

I I 13 4 51

HC---NH-CO I I

HCOH I

HCOH I CH,OH

111 HOCH

HC-N-C . CH, r Hi-NH-CO I

V 0 HOCH I

HCOH I I CH,OH

d=N-CO I

1 8

11' HO 8 H I

HCOH I

HCOH I CH,OH

H C - N H - ~ ~ , C H ~ ~ I I ~ - N H - - - CO I

VI 0 CH--,

I 0

72, 82 (1899); K. Sto l t e , B. Ph. P. l) Lobry d e Bruyn, R. 18, '

a) Vgl. Meyer-Jacobson, Bd. 11, Teil 3, S. 1369. 11, 19 (1908); Bio. Z. 12, 499 (1908).

Synthese peptidahnlicher Korper aus Bminozuckem usw. 137

VI I l:~:HC0.CA,.IIBCOC.H.0*CH2.NHCOC6H6 \ I

Das von uns als neues Reaktionsprodukt erhaltene, gegeniiber dem offenen Glucopeptid urn zwei Molekiile W asser armere anhydrisierte Alanyl-glucosamin C,H,,O,N, besitzt ebenfalls kein Reduktionsvermogen und keine freie Aminogruppe, denn unter den gewohnlichen Bedingungen der v a n Slyke-Bestimmung wird keine wesentliche Stick- stoffentwicklung erzielt. Sein Molekulargewicht entspricht, wie eine Bestimmung in Eisessig ergab, der einfachen Formel. Das Fehlen des Reduktionsvermogens und der freien Aminogruppe fiihrt zur naheliegenden Annahme eines heterocyclischen Seclisrings. Bei der Abspaltung eines weiteren Molekiils Wasser muS es zur Ausbildung einer Sauerstoffbriicke oder einer Doppelbindung am Giucose- anteil C, bis C, gekommen sein, denn eine Wasserabspal- tung am Heterocyclus selbst ist nicht moglich. I n Ana- logie zur 3,B-Anhydroglucose E. l? i s c h e r s l) erscheint eine Wasserabspaltung an den Hydroxylen des C, und des C, unter Ausbildung einer Sauerstoff briicke am wahrschein- lichsten. Weil die Verbindung keine C=C-Doppelbindung besitzt, kann es nicht zutreffen, daB unter der Wirkung des starken Ammoniaks ein Glucoseen-5,6-Derivat entstanden ist.,) Die beiden Korper C,H,,05N, und C,H,,04N, konnten nicht ineinander iibergefuhrt werden, waren also in der Reaktion unabhangig voneinander entstanden. Das Dehydro- Alanylglucosaminanhydrid blieb beim Erhitzen mit methyl- alkoholischem Ammoniak unverandert. Das Dianhydrid andererseits gab bei Behandlung mi t Salzsaure nicht die gut fafibare, schwerer lijsliche Verbindung C,H,,O,N,. Das verschiedene Ergebnis der v a n Slyke-Bestimmungen in beiden Fallen bei seltr langer Versuchsdauer fiihrte zur Klarstellung der VerhLltnisse. Es zeigte sich, daI3 aus dem

9 E .F i sche r u. K,Zach, 3.45, 456, 2068 (1912); H.Ohle,

*) Vgl. hiereu H. Ohlc u. L. v. Vargha, B. 62, 2427 (1929). T,. v. Vargha u. H. Er lbach , B. 61, 1211 (1928).

138 B e r t h o , I l i i lder , Me i ser und IIGther,

Dianhydrid unter der Einwirkiing der salpetrigen Saure langsam Stickstoffentwicklung eintrat. Nach 7 Stunden waren 40-50 Proc. des erwarteten Stickstoffs entstanden. Ein Teil des Materials wird wahrscheinlich oxydativ weiter verhder t , denn die Stickstoffentwicklung kam nach dieser Zeit nahezu zum Stillstand. Diese Tatsachen stehen nur mit einer glucosidischen Bindung und fieiem Iminwasserstoff in Einklang. Der Ruckstand aus der v a n Slyke-Bestim- mung, der reduzierenden Zucker enthalten mubte, wies ta tskhl ich nach dem Entfernen des Eisessigs und Uber- sattigen mi t Alkali kraftiges Reduktionsvermb'yetz gegenuber F e h l i n g-Losung auf.l) Somit ergibt sich unter Beibehaltung der Sauerstoffbriicke von C, nach C, fur das Dianhydrid ein Formelbild gema0 VL2) Wegen dieser tatsachlichen, aber geringen Reaktionsfahigkeit bei der v a n Slyke-Bestim- mung, die nur bei glucosidischer Verbindung der Amino- gruppe moglich ist, sind alle anderen Moglichkeiten, n%m- lich diejenigen, da13 die Aminogruppe nicht mit dem gluco- sidischen, sondern mi t den ubrigen Hydroxylen reagiert hatte, auszuschlieben. I n diesen Fallen muBte iiberdies wegen des mangelnden Reduktionsvermogens die Substanz noch zwei von C, ausgehende Sauerstoffbrucken enthalten (vgl. Lavoglucosan), was zu einem sterisch kaum moglichen System von drei Ringen fuhrt.

nber die Grunde, die zur Bildung der beiden KBrper fiihren, lassen sicb nur Vermutungen anstellen. Im ersten Fall ist der pri- mare Vorgang beim RingschluS offenbar die Bildung des Imins des Brompropionylglucosamins 3), wahrend im zweiten Fall, also unter ener- gischeren Bedingungen, zuniichst der Austausch des Halogens durch die Aminogruppe bevorzugt einzutreten scheint, worauf d a m die Glu- cosidifizierung erfolgt.

D a offensicbtlich nach den bisher benutzten Verfahren der Pep-

') Vgl. P. K a r r e r , Helv. 7, 1041 (1924). Formuliert man den Lactolring furoid, so ware a u h der Sauer-

stoffbriicke von C, nach C, eine solcbe von C, nach C, mBglich. Die entsprechenden Bindungsverhaltnisse zeigen zwei Monoacetonanhydro- glucosen. H. Ohle , L. v. V a r g h a und H. E r l b a c h , B. 61, 1211 (1928) und H. Ohle und L. v. V a r g h a , B. 62, 2435 (1929).

*) Vgl. L o b r p d e B r u y n , B. 25, 3083 (1895); J. C. I r v i n e , R. F . T h o m p s o n u. C. S. G a r r e t t , SOC. 103, 243 (1913).

Synthese peptidahihalicher Korper nus Aminozuckern usw. 139

tidsynthese eine Bildung offener Ketten, wie wir sie anstrebten, nicht maglich erschien, andererseits eine Aufspaltung an der Kondensations- stelle bei gleichzeitiger Schonung der Peptidbildung nicht bewerk- stelligt werden konnte, sind wir daeu iibergegangen , die Einwirkung salzsaurer Aminosaurechloride, des salxsaurelz If Zycylchlorids und des salxsauren Alamybhlorids, auf freies GLluoosamim zu studieren, und zwar unter ahnlichen Bedingungen wie sie E. F i s c h e r l ) bei seinen Peptid- synthesen gewlhlt hat. Diese Versuche fiihrten bisher noch nicht zum gewiinschten Ziel. Ebenso gelang es unter keinen Umstianden, freiea CSluoosamin mit Bromisoeapronylglycyle?~lorid oder mit Bromiso- eapron ytbriglycylchEorid3) in Reaktion zu bringen. Wir hofftcn in diesen Fallen nach Austausch des Halogens gegen die Aminogruppe eine Kondcnsation wegen der Fingeren Kette vermeiden zu k8nnen.

Nach diesen MiBerfolgen wLhlten wir einen Umweg. Wir syn- thetisierten von Brompropionylglucosamin und Bromisocapronylglucos- amin ausgehend, die in den Hydroxylen benxoylierten Derivate dieser KGrper, die in guter Ausbeute zu erhalten sind. Durch Umsetzung mit methylalkoholischem Ammolziak sollte aus ihnen im gleichen An- sate zunachst der Austausch des Halogens gegen die Aminogruppe und darauffolgend bei Erhaltung der offenen Peptidkette die zweifel- 10s schwieriger eintretende Abspaltung der Benzoylreste erzielt werden. Man hiitte so zu den Aldehydammoniak- bzw.Iminverbindungen der beiden Aminoacylglucosamine kommen mii~sen.~) Die Versuche fuhrten nicht eum Ziel. Auch die beiden heschriebenen Alaninglucosamin-anhydride, deren Bildung wir j a in diesem Fall vermeiden wollten, waren auch nicht spurenweise entstanden. Unter der Wirkung des starken Ammo- niaks wird offentar die Zuckerkomponente bei der Verseifung weit- gehend verlndert.

Gelegentlich der Darstellung des Brompropionyl-N-glucosamin- tetrabenzoats begegneten wir in betriicbtlichem AusmaS einem zweiten halogenfreien tetrabenzoylierten Produkt, in dem unter der Wirkung des starken Alkalis das Brom unter Bildung einer Hydroxylgruppe eliminiert war, die uicht weiter benzoyliert wurde.

Zu Vergleichszwecken haben wir auch das Glucosamin durch- benzoyliert und erhielten in genugender Ubereinstimmung mit P. A. L e - vene6) ein Pentabenxoat des ffluoosamins vom Drehwert [a]b8 = + 43,83 bis -t- 43,91°.

Jedoch sollte wenigstena der bloBe Austausch des Halogens gegen

l) B. 38, 605, 2914 (1905). 8 ) E. F i s c h e r , Untersuchungen iiber Aminosauren, Polypeptide

a) E. F i s c h e r , a. a.O., S. 553. 4] L o b r y d e B r u y n , B. 28, 3082 (1895); J. C. I r v i n e , R. F.

und Proteine 1899-1906, S. 377.

T h o m p s o n u. C. S. G a r r e t t , SOC. 103, 243 (1913). Journ. of biol. Chem. 26, 155 (1916).

140

eine substituierte Aminogruppe mBglich sein.l) Primare und sekundare Arrziabasen, Methyl-, Benzyl-, Dimethyl- und Digthylamin reagierten in indifferenten Medien wie Benzol, ebenso in Methyl- oder Athylalkohol mit dem Halogen unserer benxoylierten Halogenacyl-N-glucosamine auch bei mehrtagiger Einwirkungsdauer nur vereinzelt (bei Benzyl- amin) und dann nur in sehr geringem Umfaug.

W-ir haben schliefllich nach der Methode von Th. C u r - t ius m i t Hilfe der benzoylierten Aminosaureazide irz der Amino- gruppe benzoylierte Aminoacpl- N-glucosami?$e synthetisieren konnen, wobei uns wieder die bevorzugte Reaktionsfahig- keit der Aminogruppe (vgl. oben) zu Hilfe kam. Damit ist unsere Absicht, offene Peptidketten zu synthetisieren, im Prinzip verwirklicht. So entsteht bei der Einwirkung von Hippurazid3) auf Glucosaminchlorhydrat in 2 n-Lauge das Benroyl-glycyl-ni-glucosamin, aus racemischem Benzoyl-alanin- &d4) und Glucosamin ein Qemisch zweier stereoisomerer Benzoyl-alan?ll-N-glueosamine, die, da sie nicht im Antipoden- verhaltnis stehen, durch Krystallisat,ion zu trennen sein mussen.

Eigenartigerweise lieE sich bei der Einwirkung von p-Brom- hippuraxid5) auf salzsaures Glucosamin, die wesentlich bessere Aus- beuten als in den obigen Fallen ergibt, kein einheitlicher KSrper ab- scheiden. Den Analysen zufolge entstand hier in der Hauptsache ein nicht zu trennendes und nicht krystallisierbares, jedoch reduzierendes Gemisch von acylierten Derivaten mit durchschnittlich etwa zwei Acylen.

Benzoylglycyl-N-glucosamin und Benzoylalunyl-N-glucos- amin besitzen ausgesprochenes Reduktionsvermogen gegeniiber F e h l i n g scher Losung. Ihre reduzierende Gruppe ist also unbesetzt. Sie iihneln im Verhalten den beiden eingehender beschriebenen Halogenacylglucosaminen insofern, als sie mit Phenylhydrazin ebenfalls nicht reagieren; jedoch fehlt ihnen die dort beobachtete Mutarotation. Die Griinde fur dieses Verhalten haben wir bereits auf S. 132 diskutiert.

Da es bisher noch keine Methode gibt, die gestattet, unter Erhaltung der Peptidbindung Benzoyl aus der Smino-

B e r t h o , Hii lder , Me i ser und Hi i ther ,

Vgl. H o u b e n - W e y l , Bd. 4, 531 (1924). *) B. 35, 3226 (1902); J. pr. 70 [11], 73 (1904). 9 J. pr. 62 [II], 252 (1895). 3 J. pr. 70 [II], 145 (1904). 5, J. pr. 89 [II], 502 (1914).

Synthese peptidiihnlicher Kiirper aus Aminosuckern uszu. 141

gruppe abzuspaltenl), diirften in den obigen, besonders heiklen Fallen dahinzielende Bemuhungen erfolglos sein. I n unseren weiteren Untersuchnngen werden wir Acyle wahlen miissen, fur die es Methoden zur Eliminierung aus der Aminogruppe gibt und daher einerseits Versuche mit Acetylaminosaureaziden z, und mit I’oZuoZsuZf~arninosaureaziden~) anstellen. Andererseits sollen glucosidische Yerbindungen des Glucosamins beider Typen und Chondrosamin, Amino-2-galak- tose, an Stelle von Glucosamin benutzt werden.

Die besprochenen Verbindungen sind zweifellos dann optisch nicht einheitlich, wenn durch die Verwendung von racemischen Saurehalogeniden bzw. Saureaziden theoretisch die Entstehung von zwei epimeren Glucosaminderivaten ge- geben ist , die sich in ihren Eigenschaften, vom Drehwert abgesehen, nicht sehr unterscheiden diirften. Hierbei ist die sterische Wandlungsfahigkeit des C, (a- und p-Formen) auBer acht gelassen. E s ist nach den sonstigen Erfah- rungen anzunehmen, daB am C, eine Konfiguration bevorzugt ist. Andererseits mu13 theoretisch bereits bei der Acyliernng der Aminogruppe des Glucosamins in den erwahnten Fallen eine sterische Auswahl und damit bevorzugte Entstehung einer Form stattfinden, wobei die schliedliche mehrmalige Umkrystallisation in einer fiir die Entstehung eines optisch einheitlichen Produktes gunstigen oder nngunstigen Weise - je nach den Mengen und den Loslichkeiten der beiden Epimeren - beitragen kann. Bei den Benzoylkorpern wird au13erdem durch die Renzoylierung eine Auslese er- zielt. Es lie13 sich denn auch tatsachlich beim Brompro- pionyl-N-glucosamin und seinem Tetrabenzoat zeigen, da8 durch wiederholtes Umkrystallisieren in beiden Fallen voii den beiden Formen die starker rechtsdrehende Form an- gereichert wird (vgl. Versuchsteil). Die optisch einheit- lichen Verbindungeu haben wir jedoch in keinem Falle isoliert. Wegen ihrer Mutarotation nach abwarts 1aBt sich von den Bromacyl-Derivaten (11) mit Bestimmtheit sagen,

l) St. G o l d s c h m i d t u. V. Funer , A.483, 190 (1930).

a) R. Schanheimer , H. 154, 214 (1926). M. Bergmann, F. Stern u. Ch. Witte, A. 449, 277 (1926).

142

daD in ihnen a-Formen vorliegen. Ein Gleiches gilt wegen der hohen positiven Drehwerte fur die zugehorigen Benzoate.

Versuchsteil. C/iZo7.acetyZ-N-gZucosamin l) (11, Ac = CH2C1. CO).

8,64 g (1/z5 Mol) sazzsuures Glucosamin wurdeii in 400 ccm "/,-Natronlauge (2/25 Mol) gelost und im Verlauf von 20 Mi- nuten unter Eiskiihlung 4,52 g Chloracetylchlorid (1/25 Mol) unter Verwendung eines Ruhrwerks hinzutropfen lassen. Nach weiterem einstundigen Ruhren wurde das Reaktions- gemisch, das eben neutral war, im Vakuuin eingedunstet. Der trockne Riickstand wurde mit kaltem Alkohol extra- hiert, der Extrakt im Vakuum zur Trockne gebracht. Es hinterblieb eine von Krystallchen durchsetzte braunliche Masse, die in wenig heiBem Methylalkohol gelost wurde. Uiese Losung wurde so lange mit Essigester versetzt, bis keine Schmieren mehr ausfielen und eine weiSe Substanz sich eben abzuscheiden begann. Die von Schmieren filtrierte Losung wurde zur Trockne gebracht. E s bildeten sich am Boden langsam kleine Biindel von weiden Krystallen, die einen Schmelzpunkt von 168-169O zeigten. Ausbeute etwa 5 Proc. an reinem Produkt.

Auch unter stark variierten Bedingungen wird keine groDere Ausbeute erhalten.

Chloracetyl-N-glucosamin ist lijslich in Wasser, Methylalkohol, F e h-

B e r t h o , Hii lder , Meiser und Hi i ther ,

Athylalkohol, Essigester, unloslich in Ather und Chloroform. l i n g-Lijsung wird leicht reduziert.

4,452 mg Subst.: 6,225 mg CO,, 2,36 mg H,O.

[a]6' = f 0,08.10/0,0322.1 = f 24,8* in Methylalkohol. C,H,,O,NCl (255,62) Ber. C 37,57 H 5,52 Gef. C 38,15 H 5,93.

Dieser Wert lnderte sich nicht mehr wesentlich.

u- Brompropionyl-N-glucosamin. 1,79 g Glucosamin2) oder 2,16 g GLChlorhydrat Mol) wurden

in 20 (oder 40) ccm "/,-Natronlauge geliist und unter Wasserkuhlung

l) Fur die aberlassung grijBerer Quantititen Krebsschalen sind wir den Firmen T h . B o e s e l , KrebsgroBhandlung, Berlin und A. W. Ap pel, Hannover, zu besonderem Dank verpflichtet.

Darstellg. des freienGlucosamins vgl. B r e u e r , B.31. 2193 (1898).

Synthese peptidahnlicher Korper aus Amiriozuckern usw. 143

mittels Ruhrwerk im Verlauf von 10 Minuten tropfenweise 1,72 g Mol) a-Brompropionylchlorid hinzugefiigt. Ausbeute 1,7 g. Weiz -

m a n n und Hopwood ' ) erzielten durch abwechselndes Zugeben von n-Natronlauge und n-Brompropionylchlorid zu einer eisgekuhlten Lo- sung von Glucosaminchlorbydrat eine etwas hohere Ausbeute. Nach- dem uns ihre Vorschrift bekanot geworden war, haben wir uns ihrer bedient. Aus verdiinntem Alkohol schone Nadeln vom Schmelzp. 200 bis 201O.

Die Substanz reagiert nicht mit Jodmethyl, enthalt also keine freie Aminogruppe. F e h 1 i n g- Losung wird leicht reduziert.

4,670 mg Subst.: 5,970 mg CO,, 2,24 mg H,O. - 6,085 mg Subst.: 0,252 ccm N (21°, 723 mm).

C,H,,O,NBr (314,ll) Ber. C 34,40 A 5,14 N 4,46 Gef. ,, 34,87 ,, 5,37 ,, 4,57.

Bestimmung der Nutarotation. 1. Einmal umkryst. PrBparat. 0,6044 g Wasser (nach Beginn des AuflSsens), 50 ccm, 4 dm-Rohr. Min. 15 18 21 60 [.]ha + 33,9O 32,9O 32,1° 26,5O 24,6O 23,78" const.

2. Wie 1. Anderes Praparat. 0,1932 g, Wasser, 20 ccm, 2 dm-Rohr.

Schmelzp. 199-200'.

140 18 Std.

Min. 12 70 130 190 54 Std. [el? + 39,3 O + 34,2 -I- 29,5 + 26,9 4- 26,9O const.

3. Wiederholt umkryst. Praparat. 0,0376 g, Wasser, 5 ccm, 2 dm-Rohr.

Schmelzp. 200-201 '. Min. 11 80 140 18 Std. [n]ho +52,5O +41,9O +39,2O +35,2Oconst.

Somit wird beim wiederholten Umkrystallisieren die hoher drehende Komponente angereichert.

a- ~ r o m i s o c ~ p r o n y LN-y lucosamin. Beste Darstellung auch durch W e i z m a n n und H o p w o o d

(a. a. 0.). Sollte sich die Rohsubstanz schmierig abscheiden, SO emp- fiehlt sich kurzes Anreiben mit Aceton. Nach dem Umkrystallisieren aus Wasser schmilzt der Korper bei 178O unter Zersetzung. Leicht loslich in kaltem Alkohol, hei6em Wasser.:, schwer in kaltem Wasser.

Auch von diesem Produkt waren in Ubereinstimmung mit W e i z - m a n n und H o p w o o d weder ein Semicarbazon, noch ein Phenyl- hydrason zu erhalten. Fehl ing-LSsung wird leicht reduziert.

Die Substanz zeigt Mutarotation.

l) a. a. 0.

144 Bertho , H c l d e r , J l e i s e r und H u t h e r ,

1. Zweimal umkryst. Praparat. 0,2164 g, Wasser, 50 ccm, 4 dm-Rohr. Min. 30 90 150 18 Std. [a]b2 + 28,30° + 23,68O + 22,52O const.

Die Substans wurde durch Anwarmen gelBst. 2. zweimal umkryst. Praparat anderer Darstellung. 0,1670 g , Wasser, 50 ccm, 4 dm-Rohr. Min. 30 100 175 24 Std. [a]h2 f 39,6'i0 + 32,93O + 25,44O + 24,70° const.

Umse t z u n g des a -Br om p r o p i oily1 -N- g lucosamins m i t Ammo ni a k.

1. Mit methylalkohdischem Ammoniak in der Kalte. 0,5 g a-Brom-propionyl-N-glucosamin wurden mit einem UberschuD von rnit Ammoniak gesattigtem Nethylalkohol iibergossen, mobei die Substanz langsam in Losung ging. Nach 3-mona- tigem Stehen im Eisschrank hatte sich eine schwach gelb- gefarbte feste Substanz abgeschieden, die abfiltriert wurde unit roh bei 236O schmolz. Nach einmaligem Umkrystalli- sieren aus absolutem Methylalkohol wnrde sie i n weil3en Nadelchen erhalten, die bei 253 O unter Zersehung schmolzen. 8ie is t mi t De?i~dro-alanyl-~-glucosaminanhydrid (IV) id en tis ch. Wie die Analyse ergab, entsprach sie aber noch nicht scharf der geforderten Zusammensetzung.

Die Restlosung wurde im Vakuum eingedunstet. Der zuruckbleibende dunkelbraune Sirup wurde rnit ganz wenig absolutem Methylalkohol angerieben und eine geringe Menge ungelost bleibende gelbe, pulvrige Substanz abgesangt. Diese schmolz nach mehrmaligem Umkrystallisieren aus Methanol bei 199 O. Sie ist mi t dem AlanyZ-N-an~~~drog2ucos- aminanhydrid (VI) identisch.

Ein analoger Versuch von 5 Tagcn Daucr gab das Ausganga- produkt unverlndert euriick. Nach 14 tagigem Stehen bei Zimmer- temperatur war aber in einem anderen Versuch eine Umsetsung zu- stande gekommen.

0,5 g der Substanz wurden mit einem UberschuE von konz. waErigem Ammoniak versetzt und im verschlossenen GefiiE 3 Monate im Eisschrank stehengelassen. Nach dem Eindampfen im Vakuum hinterblieb eine braune Schmiere,

2. Mit tua/3rBrigem Ammoniak in der Kalte.

Syntltese peptidahnlicher KiirpeF aus Aminozuchern usw. 145

aus der unter Anreiben rnit wenig Methanol eine schwach gelbe Sub- stanz vom Schmelep. 250° isoliert werden konnte. Nach einmaligem Umkrystallisieren wie oben Schmelzp. 253 O. Diese Feststellung steht in Ubereinstimmung mit den Angaben von W e i z m a n n u. Hopwoodl), die nur mit wiifhigem Ammoniak gearbeitet haben; doch lie13 sich aus den Mutterlaugen in diesem Versuch eine geringe Menge Alanyl-N-anhydro- glucosaminalzhydrid isolieren. Auch wenn man genau den Angaben von W e i z m a n n und H o p w o o d folgt (kons. wahiger Ammoniak, 5 tiigiges Schutteln bei Raumtemp.), entsteht dieser letztere Korper in geringer Menge.

3. Mit methylalkoholischem Ammoniak bei 100° entsteht so gut wie ausschliefilich Alanyl-N-anhydro-glucosamin. 0,5 g a-Brompropionyl-N-glucosamin wurden rnit 20 ccm konz. methylalkoholischem Ammoniak in einer Bombe eingeschlossen und 6 Stunden auf looo erhitzt. Nach dem Eindampfen der dunkelgefarbten Losang im Vakuum hinterblieb ein dunkelbrauner Ruckstand. E r wurde rnit wenig Methyl- alkohol verrieben und zur Entfernung der Schmieren auf Ton abgepre8t. Die Substanz wurde hierauf zweimal aus Athylalkohol unter Zusatz von Tierkohle umkrystallisiert, sie zeigte d a m den Schmelzpunkt des reinen Dianhydrids 199 O.

4. Mit methyldkoholisehm Ammoniak bei 60-70°. Im Verlauf von 3-4 Stunden erfolgt in der Bombe ebenfalls eine Umsetzuog, jedoch unter Bildung beider Korper, wobei der niedriger schmelzende Korper als Hauptprodukt in einer Ausbeute von 17 Proc. neben wenig des hochschmelzenden eu erhalten ist.

In allen Reaktionsflussigkeiten laat sich das bei der Umaetzung in betriichtlicher Menge entstehende Bromammonium leicht nachweisen.

Dehydro-alanyZ-3-glucosaminanhydrid (IV). (2-Tetraoxybutyl-5-methyl-6-oxopyrazin-dihydrid (5,6))

Durch wiederholtes Umkrystallisieren aus Wasser oder Alkohol wird die Substanz von anhaftendem Alanyl-N- anhydroglucosaminanhydrid befreit und in Form von schwach gelbstichigen Nadelchen rein erhalten. Die vollkommene Entfernung des Dianhydrids ist offenbar schwierig. Die Snbstanz reduziert Fenling-Losung erst nach sehr langem Erhitzen in ganz geringem AusmaD. Sie lost sich spielend in Alkali and zeigt keine Enolreaktion. Der von uns beob-

l) A. a. 0. Annalen der Chemie 486. Band. 10

146 Bertho, HGlder, Meiser und Hiither,

achtete hochste Schmelzpunkt betrug 272 O uuter Zersetzung in Ubereinstimmung mit Weizmann und Hopwood.

Der KSrper ist in der Kalte in allen Losungsmitteln sehr schwer loslich. In kaltem Wasser lost er sich im Verhaltnis 1 : 1000. In der Hitze lost er sich einigermafien in Pyridin, Alkoholen, Phenol, Acetamid und am besten in Wasser. Nur eine wiederholt umkrystallisierte Sub- stanz gibt hrauchbare Analysenwerte.

4,069, 4,900, 4,968 mg Subst.: 7,030, 8,425, 8,485 mg Go,, 2,35, 2,64, 2,73 mg H,O. - 2,973 mg Subst.: 0,309 ccm N (23,5O, 767 mm).

Ber. C 46,54 H 6,95 N 12,07

Ber. C 46,98 H 6,14 N 12,18 Gef. ,, 47,13, 46,89, 46,59 ,, 6,46 6,03, 6,15 ,, 12,08.

W e i z m a n n und H o p w o o d finden:

C,H,,O,N, (232J5)

CJ&,O,N, (230,131

C 46,61 H 6,50 N 12,27.

Auch bei mehrstundiger Versuchsdauer wird nach v a n S l y k e

0,068 g Subst.:

Die gefundene Menge N wurde im analogen Blindversuche er- mittelt, sie entspricht der ublichen Reststickstoffmenge. Glucosamin- chlorhydrat gab die richtigen Werte.

kein Stickstoff in Freiheit gesetzt. 0,9 ccm N (710 mm, 22'). (Nach 3 Stunden).

Mo1.-Gew. kryosk. 0,1377 g Subst., 23,62 g Acetamid (aus Methylalkohol umkrystal-

lisiert). A = 0,112O. Mo1.-Gew. Ber. 230 Gef. 189.

[u]h3 = - 0,16 X 40/0,0421 x 4 = - 38,0° in Wasser. Der Dreh- wert blieb konstant.

50 mg dieses Korpers wurden in einer Bombe mit methylalkoholischem Ammoniak (8 ccm) zunachst 3 Stunden auf 70-75O und dann zwecks vollkommener Losung 3 Stunden auf 100' erhitzt. Bei der Aufarbeitung wurde das unveranderte Produkt restlos wiedergefunden.

Alanyl-N-anhydroglucosaminanhydrid (VI). Die Verbindung unterscheidet sich vom Dehydro-alanyl-

N-glucosaminanhydrid durch grol3ere Loslichkeit in Wasser, Methylalkohol und Athylalkohol. Auf Grund dieser Tatsache

S'nthese peptidahnlicher Korper aus Bminozuckern usw. 147

konnen die beiden Substanzen, falls sie im Gemisch vor- liegen, durch fraktionierte Krystallisation aus Wasser evtl. unter Zusatz von Tierkohle voneinander getrennt und rein darges tell t werden. Alanyl- N - anhydroglncosaminanhydrid krystallisiert &us wenig Wasser in schonen Nadeln. Die Substanz reduziert F e h l i n gsche Losung erst nach sehr langem Kochen in sehr geringem MaBe. Schmelzp. 199O ohne Zersetzung.

4,929, 4,637 mg Subst.: 9,040, 8,550 m g CO,, 2,83, 2,79 mg H,O. -

C,R,,O,N, (214,13) Ber. C 50,46 H 6,55 N 13,08

3,928 mg Subst.: 0,358 ccm N (20,5O, 776 mm).

Gef. ,, 50,04, 50,30 ,, 6,43, 6,73 ,, 12,93. Mo1.-Gew. kryosk.

0,2016 g Subst. 20,'16 g Eisessig = 0,178O.

Mo1.-Gew. Ber. 214 Gef. 211,7.

[a]? = - 1,62 x 5/0,0451 x 2 = - 89,s' in Wasser. Der Dreh- mert blieb konstant.

Beslimmwg des Amilioslieksloffs nach warn Slyke: 1. 0,0534 g Subst. Leervers. 2. 0,0563 g Subst. Leervers.

Nach 2 Stdn. 2,64 mg N 0,82 mg N

In 1. sind 3,SO mg N = 47,2 Proc., in 2. 3,09 mg N = 41,9 Proc. der Theorie entstanden.

Die ReaktionslGsungen reduzieren nach dem Entfernen des Eis- essigs im Vakuum Fehl ingsche Losung.

Eine Probe der Substanz wurde in l-proz. Salzsiiure 1 Stunde unter IliickfluB erhitet. Nach dem Eindampfen im Vakuum wurden auBer unveriindertem Produkt nur Schmieren aufgefunden.

Nach 5 Stdn. 4,84 mg N 2,O mg N I , 7 7, 5735 ,, >, 2706 91 7, 7 , 7 77 4,98 9 , ,, 1,89 9 , 7,

Tetra benzoyl-(a-6rompropionyZ-~-~glucosamin. Zu 3,5 g fein pulverisiertem una in 25 ccm Wasser

suspendiertem a-Brompropionyl-N-glucosamin wurden 12 g Benzoylchlorid und 15 ccm 50-proc. Natronlauge abwechselnd und in kleinen Portionen hinzugegeben. Das Reaktions- gemisch wurde zunachst 1/2 Stunde in Eiswasser, dann 24 Stdn. in einem moglichst kiihlen Raum auf der Maschine geschiittelt. Die Rohausbeute an ausgefallenem Benzoat- gemisch, das stets klebrig war, betrug 11 g.

Dieses Rohprodukt wurde mit 30 ccm abs. Methanol 10*

148 Bertho, Hiilder, Meiser und Huther,

so lange verrieben, bis die Schmieren in Losung gegangen waren. Hierbei bleibt eine feste Substanz ungelost (siehe weiter unten). Saugte man von dieser Substanz ab, so krystallisierte aus dem stark gekiihlten methylalkoholischen Fi l t ra t das Benzoat des a-Brompropionyl-N-glncosamins in schonen Nadeln aus. Es wurde aus wenig Nethylalkohol umkrystallisiert und schmolz bei 189O. Ausbeute an reiner Substanz 1,7 g. Loslich in den Alkoholen und in Chloroform.

4,810 mg Subst.: 10,735 mg CO,, 1,94 mg H,O. C,,H,,O,,NBr (730,19) Ber. C 60,81 H 4,42. Gef. 60,87 4,51.

1. [a]b6= f 1,95°*10/0,1322*2 = + 73,75O in Chloroform. 2. Wiederholt umkrystallisiert

[a]b8= f 1,29°.5/0,0372.2 = + 86,7O in Chloroform.

Diese Werte blieben im Verlauf von 24 Stunden konstant. Aus ihnen ist zu entnehmen, daS durch wiederholtes Umkrystallisieren die stiirker rechtsdrehende Komponente angereichert wird.

Die qualitative Probe auf Halogen mit Calciumoxyd ist ebenso wie die Beilsteinprobe stark positiv. Fehl ing-Losung wird nicht reduziert.

Die beim Verreiben mit Methylalkohol nngelSst gebliebene Sub- stanz aus dem vorigen Versuch (0,7 g) wurde in Chloroform geltist und von unloslichen Verunreinigungen abfiltriert. Die Chloroformlosung wurde zur Troekne gebracht und der Riickstand aus vie1 Methanol umkristallisiert. Nadelchen vom Schmelep. 238 9 Dieses Benzoyl- derivat enthalt kein Brom. Fehl ing-Losung wird von der Substanz nicht reduziert. Bei Berucksichtigung der verschiedenen MGgliehkeiten stimmt die Analyse am ehesten fur TetrabellxoyZ-(a-o~~~ro~io~~Z-~-) glucosamin, dessen sekundlire Bildung aus dem in der Hauptsache entstehenden Benzoat einleuchtet.

5,069 mg Subst.: 12,200 mg GO,, 2,27 mg GO. - 4,061 mg Subst.: 0,095 mg N (22O 765 mm).

C8,H,,0,,N (667,27) Ber. C 66,54 H 4,99 N 2,10 Gef. ,, 65,66 ,, 5,Ol ,, 2,73.

Die Drehwertsbestimmung ergab [a]h5 = + 0,53'* 10/0,1670.2 = -t- 15,87O in Chloroform. Der Wert blieb im Verlauf von 24 Stdn. konstant.

Tetra~enzoyl-(a-bromisocapronyl-iV-)glucosami~i. 5 g Bromisocapronyl-N-glucosamin wurden in 25 ccm

Wasser suspendiert. Zur Suspension wurden unter Kuhlung mit Eiswasser abwechselnd 15 g Benzoylchlorid und 18 ccm

Synthese peptidahnlicher Korper aus Bhinozuckern USW. 149

50-proc. Natronlauge hinzugegeben. Uann wurde das Ge- misch l/% Stunde in Eiswasser und weitere 16 Stan. in einem kuhlen Raum auf der Maschine geschuttelt. Danach war die Flussigkeit im Reaktionsgefal vollkommen erstarrt. Der GefLdinhalt wurde zunachst auf einen Tonteller ab- geprelt, mit Wasser verruhrt und ausgewaschen. Ungelost bleibt das zahe und schmierige Benzoatgemisch, das auch im Exsiccator nicht trocken erhalten werden konnte (9,6 g). Dieses Rohprodukt wurde wiederholt mit Natrium- bicarbonatlosung kraftig durchgeschuttelt und dazwischen haufig mit Wasser gewaschen, so lange bis der Geruch des hartnackig anhaftenden Benzoylchlorids nahezu verschwun- den war. Die Substanz konnte nunmehr i n trockener Form erhalten werden. Das einheitliche Benzoat wurde aus abs. Methyl- oder Athyl-Alkohol in schonen Nadelchen vom Schmelzp. 189 O erhalten. Gut loslich in Aceton Chloroform. Fehl ing-Losung wird nicht reduziert. Starke Halogen- reaktion.

0,059 ccm N (20,5O, 772 mm). 4,928 mg Subst.: 11,250 mg CO,, 2,14 mg H,O. - 2,966 mg Subst.:

C,,H,,O,,NBr (772,24) Ber. C 62,16 H 4,96 N 1,82 Gef. ,, 62,28 ,, 4,86 ,, 2,35

Ein wiederholt umkryst. Praparat wurde zur Drehwertsbestim-

[ u I ~ ~ = + 3,62 * 5/0,0878 + 2 = f 103,l O in Chloroform. Der Wert mung benutzt.

blieb konstant.

Benzoyl-glycyl-N-glucosamin (VII). Hippuryl-iVglucosamin. 3 g Glucosaminchlorliydrat wurden in 15 ccm 2n-

Natronlauge gelost und bei Zimmertemp. 2 g Hippurazid unter krafiigem Schiitteln hinzugefugt. Das alsbald aus- fallende Kondensationsprodukt wurde abgesaugt, mit wenig Wasser gewaschen und getrocknet. A m dem Rohprodukt wurden geringe Meugen von Nebenprodukt,en, die durch Eintri t t mehrerer Hippurylreste entstanden sind, durch Auskochen mit wenig Athylalkohol ungelost gelassen. Hip- puryl-N-glucosamin sehied sich aus der heiBen alkoholischen Losung in kleinen kugeligen Krystallaggregaten ab. Nach

150 Bertho, Hii lder , Meiser und Hiither,

zweimaligem Umkrystallisieren aus Wasser zeigte der Korper einen Schmelzpunkt von 200° unter Zersetzung und Braunfarbung. Er reduziert F e h l i n g-Losung spielend und reagiert nicht mit Jodmethyl.

Leichtloslich in heiBem Wasser; loslich in kaltem Pyridin (1 : loo), in kaltem Alkohol (1 : 200); schwerlSslich in Aceton, Chloroform, Aceto- nitril, kaltem Wasser.

4,372 mg Subst.: 8,530 mg CO,, 2,23 mg H,O. C,,H,,,O,N, (340,18) Ber. C 52,91 H 5,93 Gef. C 53,23 H 5,70.

[a@,'= + 0,9lo- 3/0,0314 - 2 = + 43,47" in Pyridin.

Dieser Wert anderte sich auch nach mehreren Stunden nicht wesentlich.

Die nach dem Losen des Rohprodukts in Alkohol beim Abfil- trieren auf dem Filter zuruckbleibende Anteile lassen sich aus vie1 Wasser umkiystallisieren. Bliittchen. Schmelzp. 263-265 O unter Brannfarbung nnd Zersetzung. Sie wurden nicht weiter untersucht.

Als an Stelle des Hippurazids p-Bromhippuraxid I) unter analogen Bedingungen oder unter starker Kiihlung im Verlauf von 24 Stdn. zur Einwirkung auf Qlucosaminchlorhydrat gebracht wurde , lieB sich in sehr betrachtlicher Ausbeute ein Reaktionsprodukt geminnen, das alks- lische Kupferlosung sehr leicht reduzierte, gsllertige Beschaffenheit besaS und in alleii LGsungsmitteln ausgcnomnien heiEes Wasser und heiBe Alkohole, nahezu unl6slich ist. ER gelang aber auch durch wiederholtes Fraktionieren aus heiBem Waseer, khyIalkohoI oder Isobutylalkohol nicht, krystallisierte Produkte zii fassen. In der Hauptsache waren Derivate entstanden, die zwei Bromhippurylreste enthielten. Ein mehrere Male umgefilltes Produkt von amorpher Natur entsprach einer derartigen Zusammensetzung sehr gut und schmolz auch einigermaBen scharf bei 214O. Eine v a n Slyke-Be- stimmung ergab ein negatives Resultat.

C,4H,60,NsBrs (659,07) Rer. C 43,70 H 3,82 Gef. 43,92 H 3,92. 5,100 mg Subst.: 8,210 mg CO,, 1,79 mg H,O.

Benzoyl-alanyl- N-glucosamin. 3,2 g Glucosaminchlorhydrat wurden in 16 ccm 2n-

Natronlauge gelost und unter krlftigem Schiitteln bei Zimmertemp. 1,6 g frisch bereitetes BenzoylaIaninazid ein- getragen. Es ging sofort in Losung. Das Qanze blieb

l) Th. C u r t i u s , J. pr. 189 [XI], 490 (1913).

Synthese peptidahnlicher Kiirper aus Aminotuckern usw. 151

unter Eiskuhlung 3 Stdn. stehen. Ein Kondensationspro- dukt fallt nicht aus. Beim Ansauern mit starker Salzsaure wird Benzoylalanin abgeschieden. Es ist durch das fehlende Beduktionsvermogen leicht von der gesuchten Substanz zu unterscheiden. Bei weitgehendem Einengen des Filtrats i. 1.. kam das Benzoyl-alanyl-N-glucosamin zur Abscheidung, wahrend das sehr leichtlosliche Glucosaminchlorhydrat in Losung blieb. Durch Umkrystallisieren aus Wasser erhielt man die Substanz in reinem Zustand. Nadeln zu Buscheln vereinigt. Schmelzp. 232 O unter Dunkelfarbung und Zer- setzung. Die Substanz reduziert alkalische Kupferlosung spielend. Eine Trennung der beiden S tereoisomeren, die nicht im Sntipodenverhaltnis stehen, voneinander, haben wir bisher noch nicht vorgenommen. Der unten angefiihrte Drehwert entspricht daher nur dem Drehvermogen eines Gemisches der beiden, wobei durch optische Auswahl bzw. durch das wiederholte Umkrystallisieren zweifellos eine Form in einer Menge groSer als 50 Proc. vorhanden ist.

4,998 mg Subst.: 9,965 mg CO,, 2,81 mg H,O.- 3,097 mg Subst.: 0,216 ccm N (22,5O; 751 mm).

C,,H,,O,N, (354,20) Ber. C 54,21 H 6,26 N 7,91 Gef. ,, 54,39 ,, 6,29 ,, 8,15.

= + 0,18O - 2/0,0061 - 1 = + 59,OO in Wasser.

Der Wert blieb im Verlauf mehrerer Stunden konstant.

Der Deutschen Gemeinschaft zur Erhaltung und FSrderung der Forschung (Notgemeinschaft) und der Justus-Liebig-Gesellschaft zur Forderung des chemischen Unterrichts danken wir ehrerbietigst fur die eur Durchfiihrung unserer Untersuchung gewahrten Mittel.