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ag. a2, Heft I5/I6 PIETRO DE NICOLa : Zur zuverlgssigen Durchfiihrung der Zweistufemnethoden. 355 15. April 1954 ZUR ZUVERLXSSIGEN DURCHFIdHRUNG DER ZWEISTUFEN-METHODEN BEI DER BLUTGERINNUNG*. Von PIETRO DE NICOLA. Aus der Medizinischen Xlinik der Vniversitgt Pavia (Direktor: Prof. PAOL0 INTROZZ1), Wghrend der letzten 20 Jahre wurden die sog. Ein- und Zweistufenmethoden in die Blutgerinmmgs- forschung eingefiihrt. Sic stiitzen sieh auf das Prinzip, in einem Gerinnungssystem alle J?aktoren konstant zu halten, bis auf denjenigen, der zu bestimmen ist. Bei den Einstu/enmethoden, wofiir die Prothrombinzeit das typischste Beispiel ist, setzt man dem Oxalatplasma ein Substrat zu, das die konstant zu haltenden Fak- toren enthglt, und bestimmt so die Gerinnnngszeit, die yon einem oder mehreren variabel gelassenen Faktoren abhgngt. Die urspriingliche Prothrombin- zeit migt einen Komplex yon Faktoren, insofern sic yon den Ver~nderungen nieht nut des Prothrombins, sondem anch des Ae-Globulins, des Faktors VII, und angerdem, in geringerem Grade, des Fibrinogens nnd der Antieoagulantien beeinflugt wird. Einige Modi- fikationen, denen die Prothrombinzeit unterworfen wurde, haben erlaubt, Methoden ffir die selektive Be- stimmung der einzelnen Faktoren (Prothrombin, Ac- Globulin, Faktor VII) zu entMekeln, ohne dag die anderen Faktoren die Bestimmung beeinflussen. Es handelt sieh um sehr praktisehe Methoden, die auch fiir wissensehaftliche Zweeke abet vor Mlem im klini- schen Gebiete niitzlieh sind ~4. Auch bei den Zweistu/enmethoden versncht man, eine einzige Variable zu erhalten, nnd zwar den zu bestimmenden Faktor, doeh wird dieser Zweck da- durch erreieht, dab man eine Elementarreaktion zum Ausgangspunkt nimmt, die Umwandlnng des Pro- thrombins in Thrombin und die quantitative Messung des Thrombins, und dab man die einzelnen Versuehs- bedingungen dieser Reaktion anpaBt. Zu diesem Zweek muB man sich der sog. gereinigten Systeme be- dienen, die uns erlauben, die einzelnen Phasen der Gerinnung mit viel gr6Berer Genauigkeit zu anMy- sieren, als vermittels der Einstufenmethoden mSglich wgre. Die Zweistn~enmethoden wurden yon verschie- denen Forschern ausgearbeitet, vor allem in den Ver- einigten Staaten, fanden aber wegen einiger techni- seher Schwierigkdten, die ihre Anwendung in grS- Berem Mal3stab verhindert haben, keine groBe Ver- breitung. Diese Schwierigkeiten liegen vor allem in den bis jetzt verfiigbaren Beschreibungen der Zwei- stufenmethoden seitens der Forscher, die sie anfang- lich vorgeschlagen haben. Aus diesem Gmmde sind in Amerika nnd in Europa einige Modifikationen der Zweistnfenmethoden angeregt worden, die gegeniiber den urspriinglichen Methoden angeblieh einige 8chwie- rigkeiten beseitigen sd°. In der Praxis bietet die Durehf/ihrung der Zwei- stufenmethoden geringere Sehwierigkeiten als ihre schon verSffentlichten Beschreibnngen vermuten las- sen. In einigen Laboratorien, wo man diese Methoden laufend a.nwendet, werden Verfahren angewendet, die sich yon den bekannten znm Teil unterscheiden, und * Aus Unters~chungen, die zum Tefl ira Department of Physiology, Wayne University, Detroit, 5fich., USA., mi~ I~ilfe eines USA.-Govern- ment-Stipendiums, durchgefiihrt wurden. die, ohne die Methoden im wesentlichen zu vergndern, die Durehfiihrung viel einfacher maehen. Zweck dieser ~beit ist es gerade, die gebr~uchlichsten Zweistufen- methoden auf Grund der in verschiedenen Laborato- rien der Vereinigten Staaten direkt gesammelten Er- fahrungen zu analysieren, und einige Verfat-~rens- weisen vorzuschlagen, die eine zuverlassige und routinemgBige Anwendung erlauben. UnertgBliche Bedingung ffir den Gebrauch der Zweistufenmethoden ist die Herstellung einiger ge- reinigten I~eagentien, und zwar des Prothrombins, des Fibrinogens mad des Thrombins. Von den 2 letzten Snbstanzen liegen Handelsprgparate vor, die jedoeh nicht immer den fiir eine zuverlgssige Forschung un- umggnglichen Anforderungen entsprechen, vor allem hinsiehtlieh des Fibrinogens, dessen Reinheit oft nut 55--60 % betr~gt, d. h. wie in Cog?cs Fraktion I. I. Die Herstellung des Prothrombins erfolgt nach der yon SSEGERS und Mitarbeitern in verschiedenen Publikationen beschriebenen Methoden, lK Hier wet- den die wesentlichen Daten der Methode ffir die Pro- thrombinreinigung gegeben, wie sie yon uns im phy- siologisehen Institut der Wayne University in Detroit, nach dem zur Zeit in diesem Laboratorium gebrguch- lichen Verfahren, laufend durchgeffihrt wurden. Die Methode erfordcrt 2 Arbeitstage, die in der synoptischen Tubelle i schematisch dargestellt wet- den. Das Ochsen- oder Menschenblut wird mit 1,85 % K2C~Oa • I-I:O d- 0,5% tt2C204. 2H20, im Verhglt- nis yon 1 Tell Anticoagulans zu 15 Teilen Blur gemischt. Man zentrifugiert nnd lgBt as eine Nacht bei 5o C im Kfihlschrank, oder man lgl?t es gefrieren und verflfissigt es im Moment der Amvendung bei Zimmertemperatur. Am 1. Tage filtriert man vor allem das Plasma durch mehrschichtige Gaze, so dab ein Tell der nieder- geschlagenen Substanzen (Fibrinogen, Fettsubstanzen usw.) entfernt werden. Dann wird in zwei 42-Liter- Gefgl3e roll Leitungswasser zerkleinertes Eis zugesetzt, his die Temperatur yon 0 ° C erreicht ist, und gleich dar~nf 3 Liter fittriertes Plasma in jedes Gefgi~ ein- gefiihrt. Man miseht und bringt es auf pg 5,1--5,2 mit l%iger Essigsgure (gew5hnlieh 150--170 ema). Man lgBt es fiir etwa 4 Std in guhe, wghrend denen sieh ein Niedersehlag bildet, und saugt dann mit einer Vakuumpumpe die iiberstehende Flfissigkeit ab. Man sammelt den Niederschlag, der zentrifugiert und be- handelt wird wie d~s Sehem~ zeigt. Die Zentrifugie- rung erfolgt in einem speziellen Zentrifugenkorb, und der Niedersehlag wird mittels einer besonderen Spatei wiedergewonnen. Man homogenisiert den Nieder- schlag mit 1000 cm 30xMat-KoehsMzlSsung (0,075 g KeC~O4.H20@0,85g NaC1 in 100em 3 It20 ) in einem Homogenisator. Man bringt das pg auf 6,4 mit 0,1 N NaOH (gew6hnlieh 40--80 cma). Die darauf- folgende Zentrifugierung erfolgt in groBen, im Eisbad vorgekfihlten Zentrifugenbechern. Man filtriert die iiberstehende Fliissigkeit dutch mehrschiehtige, mit physiologiseher KochsalzlSsung getrgnkter Gaze. Das 23*

Zur zuverlässigen Durchführung der Zweistufen-Methoden bei der Blutgerinnung

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ag. a2, Heft I5/I6 PIETRO DE NICOLa : Zur zuver lgss igen D u r c h f i i h r u n g der Zwe i s tu f emne thoden . 3 5 5 15. April 1954

ZUR ZUVERLXSSIGEN DURCHFIdHRUNG DER ZWEISTUFEN-METHODEN BEI DER BLUTGERINNUNG*.

Von

P IETRO DE NICOLA.

Aus der Medizinischen Xlinik der Vniversitgt Pavia (Direktor: Prof. PAOL0 INTROZZ1),

Wghrend der letzten 20 Jahre wurden die sog. Ein- und Zweistufenmethoden in die Blutgerinmmgs- forschung eingefiihrt. Sic stiitzen sieh auf das Prinzip, in einem Gerinnungssystem alle J?aktoren konstant zu halten, bis auf denjenigen, der zu bestimmen ist. Bei den Einstu/enmethoden, wofiir die Prothrombinzeit das typischste Beispiel ist, setzt man dem Oxalatplasma ein Substrat zu, das die konstant zu haltenden Fak- toren enthglt, und bestimmt so die Gerinnnngszeit, die yon einem oder mehreren variabel gelassenen Faktoren abhgngt. Die urspriingliche Prothrombin- zeit migt einen Komplex yon Faktoren, insofern sic yon den Ver~nderungen nieht nut des Prothrombins, sondem anch des Ae-Globulins, des Faktors VII, und angerdem, in geringerem Grade, des Fibrinogens nnd der Antieoagulantien beeinflugt wird. Einige Modi- fikationen, denen die Prothrombinzeit unterworfen wurde, haben erlaubt, Methoden ffir die selektive Be- stimmung der einzelnen Faktoren (Prothrombin, Ac- Globulin, Faktor VII) zu entMekeln, ohne dag die anderen Faktoren die Bestimmung beeinflussen. Es handelt sieh um sehr praktisehe Methoden, die auch fiir wissensehaftliche Zweeke abet vor Mlem im klini- schen Gebiete niitzlieh sind ~4.

Auch bei den Zweistu/enmethoden versncht man, eine einzige Variable zu erhalten, nnd zwar den zu bestimmenden Faktor, doeh wird dieser Zweck da- durch erreieht, dab man eine Elementarreaktion zum Ausgangspunkt nimmt, die Umwandlnng des Pro- thrombins in Thrombin und die quantitative Messung des Thrombins, und dab man die einzelnen Versuehs- bedingungen dieser Reaktion anpaBt. Zu diesem Zweek muB man sich der sog. gereinigten Systeme be- dienen, die uns erlauben, die einzelnen Phasen der Gerinnung mit viel gr6Berer Genauigkeit zu anMy- sieren, als vermittels der Einstufenmethoden mSglich wgre.

Die Zweistn~enmethoden wurden yon verschie- denen Forschern ausgearbeitet, vor allem in den Ver- einigten Staaten, fanden aber wegen einiger techni- seher Schwierigkdten, die ihre Anwendung in grS- Berem Mal3stab verhindert haben, keine groBe Ver- breitung. Diese Schwierigkeiten liegen vor allem in den bis jetzt verfiigbaren Beschreibungen der Zwei- stufenmethoden seitens der Forscher, die sie anfang- lich vorgeschlagen haben. Aus diesem Gmmde sind in Amerika nnd in Europa einige Modifikationen der Zweistnfenmethoden angeregt worden, die gegeniiber den urspriinglichen Methoden angeblieh einige 8chwie- rigkeiten beseitigen sd°.

In der Praxis bietet die Durehf/ihrung der Zwei- stufenmethoden geringere Sehwierigkeiten als ihre schon verSffentlichten Beschreibnngen vermuten las- sen. In einigen Laboratorien, wo man diese Methoden laufend a.nwendet, werden Verfahren angewendet, die sich yon den bekannten znm Teil unterscheiden, und

* Aus Unters~chungen, die zum Tefl ira Department of Physiology, Wayne University, Detroit, 5fich., USA., mi~ I~ilfe eines USA.-Govern- ment-Stipendiums, durchgefiihrt wurden.

die, ohne die Methoden im wesentlichen zu vergndern, die Durehfiihrung viel einfacher maehen. Zweck dieser ~ b e i t ist es gerade, die gebr~uchlichsten Zweistufen- methoden auf Grund der in verschiedenen Laborato- rien der Vereinigten Staaten direkt gesammelten Er- fahrungen zu analysieren, und einige Verfat-~rens- weisen vorzuschlagen, die eine zuverlassige und routinemgBige Anwendung erlauben.

UnertgBliche Bedingung ffir den Gebrauch der Zweistufenmethoden ist die Herstellung einiger ge- reinigten I~eagentien, und zwar des Prothrombins, des Fibrinogens mad des Thrombins. Von den 2 letzten Snbstanzen liegen Handelsprgparate vor, die jedoeh nicht immer den fiir eine zuverlgssige Forschung un- umggnglichen Anforderungen entsprechen, vor allem hinsiehtlieh des Fibrinogens, dessen Reinheit oft nut 55--60 % betr~gt, d. h. wie in Cog?cs Fraktion I.

I. Die Herstellung des Prothrombins erfolgt nach der yon SSEGERS und Mitarbeitern in verschiedenen Publikationen beschriebenen Methoden, lK Hier wet- den die wesentlichen Daten der Methode ffir die Pro- thrombinreinigung gegeben, wie sie yon uns im phy- siologisehen Inst i tut der Wayne University in Detroit, nach dem zur Zeit in diesem Laboratorium gebrguch- lichen Verfahren, laufend durchgeffihrt wurden.

Die Methode erfordcrt 2 Arbeitstage, die in der synoptischen Tubelle i schematisch dargestellt wet- den. Das Ochsen- oder Menschenblut wird mit 1,85 % K2C~O a • I-I:O d- 0,5% tt2C204. 2H20, im Verhglt- nis yon 1 Tell Anticoagulans zu 15 Teilen Blur gemischt. Man zentrifugiert nnd lgBt as eine Nacht bei 5 o C im Kfihlschrank, oder man lgl?t es gefrieren und verflfissigt es im Moment der Amvendung bei Zimmertemperatur.

Am 1. Tage filtriert man vor allem das Plasma durch mehrschichtige Gaze, so dab ein Tell der nieder- geschlagenen Substanzen (Fibrinogen, Fettsubstanzen usw.) entfernt werden. Dann wird in zwei 42-Liter- Gefgl3e roll Leitungswasser zerkleinertes Eis zugesetzt, his die Temperatur yon 0 ° C erreicht ist, und gleich dar~nf 3 Liter fittriertes Plasma in jedes Gefgi~ ein- gefiihrt. Man miseht und bringt es auf pg 5,1--5,2 mit l%iger Essigsgure (gew5hnlieh 150--170 ema). Man lgBt es fiir etwa 4 Std in guhe , wghrend denen sieh ein Niedersehlag bildet, und saugt dann mit einer Vakuumpumpe die iiberstehende Flfissigkeit ab. Man sammelt den Niederschlag, der zentrifugiert und be- handelt wird wie d~s Sehem~ zeigt. Die Zentrifugie- rung erfolgt in einem speziellen Zentrifugenkorb, und der Niedersehlag wird mittels einer besonderen Spatei wiedergewonnen. Man homogenisiert den Nieder- schlag mit 1000 cm 30xMat-KoehsMzlSsung (0,075 g KeC~O 4 . H 2 0 @ 0 , 8 5 g NaC1 in 100em 3 It20 ) in einem Homogenisator. Man bringt das pg auf 6,4 mit 0,1 N NaOH (gew6hnlieh 40--80 cma). Die darauf- folgende Zentrifugierung erfolgt in groBen, im Eisbad vorgekfihlten Zentrifugenbechern. Man filtriert die iiberstehende Fliissigkeit dutch mehrschiehtige, mit physiologiseher KochsalzlSsung getrgnkter Gaze. Das

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Klinische 356 PIETI¢O DE NICOL~: Zur zuverl~ssigen Durchftihrung der Zweistufenmethoden. Wochonsehrift

Tabelle 1. Schema der HersteUung des Prothrombins.

Herstellung des Prothrombins (t. Tag). Oxalat-Ochsenplasma (6 Liter)

I ©

I ©

Filtrieren durch Guze ÷

180 em ~ Mg(OH)~-0 ° C

[ Zentr. 20'--1800--0 ° C O

I ©

Verdiinnen 1 : 16 mit H~O Temperatur 0 ° C - - p~ 5,1

4 Std

Zentr. 20'--1800---00 C r ~ k--.-.t

÷ 1000 cm 3 0xalat-NaC] 0,9%

0 ° C--p~ 6,4

Zentr. 5'--5000--,0 ° C |

÷ 350 NaC1 0,9%--0°C [

Zentr. 5'---4000--00 C [ t l__.j

+ 400 NaC1 0,9%--00 C

I l~it CO~ bei 2,5 Arm. sehtittetn Zimmertemperatur --20 rain.

Herstellung des Prothrombins (2. Tag). PrSparat des ersten Tages

Ffltrieren durch Gaze ÷

(NI-I4)~S0 4 (I : I)---0 ° C

[ Zentr. 15'--4000--00 C [ 0 +

(NH4)~SO ~ (2:1)--0 ° C

20 rain

I Zo tr. ] o

+ etwa 10 em ~ H~0--0 ° C

Dialysieren unter Bewegung--0 ° C 4 Std

1000 Ohm--p~ 5,35--5A0

Zentr. 5'--4000--0°C [ I-J--1 I ©

p~ 4,6

J 0

Z e n t r . 5 ' - - 4 0 0 0 - - 0 ° C

ps 6,8--7,4 Bei - - 200 C aufbewahren

© Niederschlag. [ I ~berstehende Fliissigkeit

folgende wird wie in der Tabelle 1 ausgeffihrt, indem man darauf achtet, dab das Mg(OH)2 10% Volumen ist. Die Endphase des 1. Tages bildet die Behandlung mit in einer Flasehe mit besonderem Versch]usse, unter Bewegung durch einen meehanischen Rfihrer. Man erh~tlt eine weiBe, kremartige Flfissigkeit, die bei 40 C bis zum n/~chsten Tage aufbewahrt wird.

Am 2. Tage filtriert man das erhaltene Prapara t dutch mehrsehichtige, mi t physiologischer Koehsalz- 15sung getrankte Gaze, und halt es mittels einer Ge- friermisehung yon Eis und Salz auf 0 ° C. Man fahrt dann mit der Saturierung mit Ammoniumsulfat fort, indem man zuerst eine Saturierung yon 50% (1:1) und dann yon 67 % (2:1) erreicht. Man verf~hrt welter wie in der Tabelle 1 gezeigt und zentrifugiert schliet]- lich so, dab man den l~iederschlag in 6 Zentrifugen- bechern sammeln kann, aus denen man ihn dann mit 5 - -10 cnl s Aqua dest. wiedergewinnt. Die folgende Dialyse erfolgt kalt in Aqua dest. und unter Bewegung mittels eines angeschlossenen Motors. Man weehselt das Wasser ungefahr jede Stunde. In 3 - -4 Std erreicht man gewShnlieh einen Widerstand fiber 1000 Ohm. Andernfalls setzt man die Dialyse fort. Dann fahrt man wie das Schema zeigt fort. Die so erhaltenen Pra- parate werden lyophflisiert und zeigen eine spezifische A_ktivitat yon 1500 2000E/rag des Trockenpro- duktes bzw. 25 000--30 000 E/rag Tyrosins.

I I . Die Reinigung des Fibrinogens la erfordert einen Arbeitstag. Man bereitet das Plasma wie ffir das Pro- thrombin, laBt es gefrieren und dann bei Zimmertem- peratur aufnehmen. Dann zentrifugiert man das Plas- ma sehnell, wahrend es schmilzt, ffir hSchstens 1 rain bei 2000--2200 Touren je !~inute, in kleinen Mengen. Mit Ausnahme der Zentrifugierung mfissen die das Plasma enthaltenden Zentrifugenbecher in einem Eis- bad gehalten werden. Die fibrigbleibende Flfissigkeit wird weggegossen und in denselben Zentrifugenbeehern

wird weiteres Plasma zentrifugiert. Der endgiiltige Niederschlag wird mit physiologischer Koehsa]zlSsung bei Sehmelztemperatur aufgesehwemmt und 4real naeheinander zentrifugiert. Man erhiflt eine weifie Creme, die langsam mit 200--300 em a physiologiseher KochsalzlSsung in Wasserbad yon 40 o C verdfinnt wird, unter dauernder t%iihrung. Dann zentrifugiert man 2 Std bei 2000 Touren. Man mischt mit Imidazol- puffer bei pE 7,32 im Verhaltnis yon 1 Teil Puffer zu 9 Teilen iiberstehende Fliissigkeit. Man li~8t schnell gefrieren mit einer trockenen Eis-Alkoholmisehung. Mit dieser Methode erh&lt man bis zu 99 % gereinigte Pr~parate.

I I I . Zur HersteIlung des Thrombins miseht man eine 1,5 %ige ProthrombinlSsung mit Natr iumcitrat , bis die Konzentrat ion des letzten 25 % betragt. Man ]as t die LSsung in l~uhe. Die Thrombinakt ivi ta t wird dann mittels der Zweistufenmethode festgestellt 14. Weitere Verdfinnungen des Thrombins mfissen in 50 % Glieerol und in silikonierten R5hrehen erfolgen 15.

Die Fibrinogenpraparate sind fiir alle Zweistufen- methoden im allgemeinen unentbehrlieh. Die Pro- thrombinpraparate werden ffir die quanti tat ive Be- st immung des Ae-Globulins und fiir experimentelIe Forsehungen fiber die Plasma- und Plat tehenfaktoren des Thromboplastins verwendet. Das Thrombin wird zur Best immung des Antithrombins gebraucht.

Von allen Verfahren, in denen Fibrinogen, gerei- nigtes Prothrombin und Thrombin Verwendung fin- den, verdienen diejenigen genau analysiert zu werden, die sich auf die quanti tat ive Bestimmung des Pro- thrombins, des Ae-Globulins und des Antithrombins vermittels des Zweistufenverfahrens beziehen.

I . Die Prothrombinbestimmung. Die einzelnen Phasen der Zweistufenmethode wurden yon ~ ¥ A ~ und S~EGE~S 194916 detailliert beschrieben. Wenn diese Beschreibungen auch vollst/indig sind, gibt es

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Jg. 32, Heft 15/16 PIETRO DE N~coL~: Zur zuverlgssigen Durehfiihrung der Zweistufenmethoden. 357 15. April 1954

doch einige Einzelheiten, die zusgtzliche Erklgrungen zur praktischen Durchfiihrung verlangen. Das bezieht sich vor allem auf die Herstel]ung des Inkubations- gemisches. Die AcaeialSsung, die in dem letzteren enthalten ist, wird hergestellt, indem man 15g Acacia in Pulver in ]0O cm 3 0,9 %iger Natriumchlorid- ]Ssung auflSst. Dann zentrifugiert man bei 2000 bis 3000 Touren je Minute, und nieht bei hSherer Gesehwin- digkeit, wie in anderen VerSffent]ichungen angegeben. Da die Acacia im Handel 0,6% Calcium enthglt, sollte die Calcimnkonzentration der LSsung ungef~hr 0,023 M betragen.

Das Inkubationsgemisch wird daher folgender- maBen bereitet: 1 cm s Thromboplastin, 4 em 3 0,9 % ige NaC1-LSsung, 10 cm 3 der sog. VerdfinnungslSsung, die sich zusammensetzt wie folgt: 2 Teile CaCI~ 1% in NaC1 0,9% ; 1 Teil Imidazolpuffer (1,72 g Imidazot in 90 cm s 0,1 N ItC1; auf 100 cm ~ bringen: p~ 7,2 bis 7,4); 2 Teile Acacia]6sung; 1 Tefl 0,9%ige NaC1.

Fiir einige dieser Reagentien kaIm man sieh der Handelsprgparate bedienen: abgesehen yon dem It> kubationsgemisch, das in trockenem Zustand yon der Firma Difco, Detroit, Mich., USA, geliefert wird, empfiehlt sich als Thromboplastinquelle das Thrombo- plastin der Firma t toffmann-La Roche AG., Basel, Schweiz, das nns in den Vereinigten Staaten durch die Frenndliehkeit der Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, N . J . (Dr. LEo A. Pr~K) geliefert wurde. Es ergibt konstante und iibereinstimmende l~esul~ate und bietet Ifir die Zweistufenmethode dieselben ¥orteile, die schon fiir die Einstufenmethode bekannt waren 17, ~s

Wenn man Thromboplastin nach den Angaben yon W A ~ und S ~ R S herstellen will, kann man auch hier yon der Zentrifugierung bei hoher Gesehwindig- keit absehen und sich auf die folgenden Phasen be- schrgnken: Waschen der Lunge mit Wasser; Trennen der groben Konnektiv- und Gefggteiie; Mahlen im FMschwolf; Verdtinnen mit physio]ogischer Kochsalz- 15sung zu gleichen Teilen; in dem Ktihlschrank bei 2--5 ° C ftir 24--48 Std, unter periodischer Riihrung; Filtrieren dutch Gaze und Zentrifugieren bei 2000 Touren je Minute; Zugeben yon 0,5% Phenol.

Die einzelnen Phasen der Zweistufenmethode fiir die quantitative Bestimmung des Prothrombins kSrmen schematisch folgendermagen dargestellt wet- den (Abb. 1):

1. Plasmadefibrinierung: 0,5 cm a Oxalatplasma-~- 0,4 em a physiologische Koehsalzl6sung @ 0,1 em a Throm- binlSsung 100 E/em s.

2. Plasmaverdtinnung: 0,1 cm a defibriniertes Plas- ma q- Ac-Globulinl6sung (0,2 cm a adsorbiertes Ochsen- serum q- 15 em a physiologische KochsMzlSsung).

3. Aktivierung: 1,0 cm a defibrinierges, mit Ac- Globulin verdiinntes Plasma + 3,0 cm a Inkubations- gemisch, bei 28 C °.

4. Bestimmung der Gerinnungszeiten: 0,1 cm ~ 1%iRe FibrinogenlSsung -~ 0,4 em a (Plasma + Inku- bationsgemisch).

Einige technische Einzelheiten kSnnen speziell ver- merkt werden. Die Defibrinierung mit Thrombin er- folgt mit LSsungen, die annghernd 100 E/era a Throm- bin enthMten. Nachdem man das Fibrin ein erstes Mal entfernt hat, indem man es um ein Holzstgbchen wiekelt, ist es angezeigt eine 2. Trennung vorzunehmen, da sich olt nachtrgglich eine weitere Menge Fibrin bildet. Die Wahl der Plasmaverdiinnungen stellt eine

der sehwierigsten Phasen der Methode dar, insofern yon der Erfahrung des Forschers die sofortige Wahl

Plclsmu defib/,/'n/'ez'ung

m

:e l)/b e /m'e H e s \\\

Plo's m cr -- Adsor6ierles

Ochsensefum 0,2 er~ 3 ÷ Ph3,slolouische Eochsalzlb'sun~ 15cm 3

Plasma ve:ddnnung"

Throm&- C~C~a PhY3/°/°g/sche I~l P/as//?? lm/dazol Kochs#lz/d'sung [ ]

Ac~rc&

In/:ub~/ionsgem/sch

/ l, Ocrn: -'~ 2" 3,o - ~

De/'/b::n/e:fes ~ Znkuho't/bns- m:7 A&O'lobul/n / I "~\ Oem/sch ,,dO~n/e, Pl~ 'sma~. f f )

A k/iv/e,"ung

0.L/crn3

~:cr~ a /5,,'br/nwen 1%

Pluemcr k ,nhUem:::'ons-

Temp.: 28 °C ~ D'nh. ThPom6inJ Abb. I. Schema der Prothrombinbestimmung

vermittels der Zweistufenmethode.

der richtigen Verdiinnung abhgngt. Man wghlt im Mlgemeinen fiir ein normates menschliehes Plasma eine 25lathe Verdiinnung, so dab man schlieBlich eine

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50faehe Verdtinnung erhglt (das Plasma ist schon zu gMchen Teilen mit physiologischer KoehsalzlSsung und Thrombin verdiinnG).

Die Ac-GlobulinlSsung wird mit gut zentrifu- giertem 0ehsenserum hergestellt, das 10 min lang mit 40 rag/era 3 Bariumearbonat behandelt wurde. Man bewahrt es bei - - 200 C in kleinen R6hrehen anf. tOiir den Gebraueh verdiinnt man 0,2 cm a davon ]'nit 15 cm a 0,9%iger NaCI-LSsung und bewahrG es fiir die ganze Dauer der Versuche in Eis auf.

Die Best immung der Gerinnungszeiten erfo]gt jede Minute oder aueh jede halbe Minute, wenn die Ge-

Tabelle 2. Errechnung der Prothrombineinheiten aus den Gerinnungszeiten nach den Daten, die in verschiedenen Laboratorien erhaIten untrden.

Die verschiedene Reaktivit~t des Fibrinogens und des Inkubationsgemisches erklgrt die vorliegenden Unterschiede.

G T G T [ G [ T [ G

I0,0 10,3 10,4 10,6 10,8 11,0 11,2 11,4 11,6 11,8 12,0 12,2 12,4 12,6 12,8 13,0 13,2 13,4 13,6 13,8 14,0

13,0 13,2 13,4 13,6

2,35 2,25 2,20 2,10 2,05 1,95 1,90 1,85 1,75 1,70 1,65 1,60 1,55 1,50 1,45 1,40 1,35 1,30 1,25 1,20 1,18

1,20 1,17 1,16 1,13

14,2 14,4 14,6 14,8 15,0 15,2 15,4 15,6 15,8 16,0 16,2 16,4 16,6 16,8 17,0 17,2 17,4 17,6 17,8 18,0 18,2

13,8 14,0 14,2 14,4

1,15 1,12 1,08 1,05 1,00 0,99 0,98 0,95 0,93 0,90 0,88 0,86 0,84 0,80 0,79 0,78 0,76 0,74 0,72 0,70 0,69

1,12 1,10 1,07 1,05

Laboratvrium 119. 18,4 0,68 18,6 0,66 18,8 0,64 19,0 0,63 19,2 0,62 19,4 0,60 19,6 0,59 19,8 0,58 20,0 0,56 20,2 0,55 20,4 0,54 20,6 0,53 2O,8 O,52 21,0 0,51 21,2 0,50 21,4 0,49 21,6 0,48 21,8 0,47 22,0 0,46 22,2 0,45

Laboratorium I116. 14,6 t 1,03 14,8 1,02 15,0 1,00 15,2 0,97

22,4 22,6 22,8 23,0 23,2 23,4 23,6 23,8 24,0 24,2 24,4 24,6 24,8 25,0 25,5 26,0 26,5 27,0 27,5 28,0

15,4 15,6 15,8 16,0

nungszahlen, die bei der Verdiirmung mit Ac-Globulin verwendet wurden. Fa r Werte zwischen 13 und 17 sec wird man einen Korrekturfaktor , der aus den obigen Tabellen zu entnehmen ist, verwenden. Wenn die Gerinnungszeitwerte hSher als 17 oder geringer als 13 see sind, kann man eine Tabetle wie ALEXANDEtl.S benutzen oder eine andere Verdiimmng w/~hlen, die erlaubt, Werte zwischen 13 und 17 sec zu erhalten.

Feh]erquellen ]iegen in den Sehwankungen der Fibrinogen- und Thromboplastinaktivit~t. Wenn man das oben angegebene Thromboplastin anwendet, erh~lt man konstantere t~esulGate als mit Lungenthrombo-

plastin. Der Vortefl davon ist insofern bemerkenswert, uls die t~gliche Kontrolle der Reaktiviti~t des Inkubations- gemisehes mit, te]s eines anf

I G [ T - -20°C gehattenen Kontroll- Ochsenplasmas fiberfliissig wird. Die Bestimmungen er-

0,45 28,5 0 ,27 folgen binnen 30 rain n~ch 0,44 29,0 0,26 der Defibrinierung, sons~ 0,43 29,5 0,25 0,42 30,0 0,24 kSnnen die erhaltenen gesul- 0,42 31,0 0,225 Gate irrig sein. 0,41 32,0 0 , 2 1 BeiVerwendung des Ken- 0,40 33,0 0,20 t roll-Ochsenplasmas bezieht 0,39 34,0 0,19 0,39 35,0 0,175 man sich auf die Werte, die 0,38 36,0 0,165 man mittels t~eagentien yon 0,38 37,0 0 , 1 5 5 bekannter Aktivit~t davon 0,37 38,0 0 ,15 erhalten hat. Man kann die 0,36 39,0 0,14 0,35 40,0 0 , 1 3 5 Verhgltnisse errechnen, die 0,34 41,0 0,13 sieh ftir die zu pr/ifenden 0,33 42,0 0 ,12 geagent ien ergaben und so 0,31 43,0 0,115 die Beziehung zwischen bei- 0,30 44,0 0,1I 0,29 45,0 0,105 den Werten als Korrektur- 0,28 46,0 0 ,10 faktor fiir die weiteren Be-

st immungen benut.zen. I I . Die Bestimmung des

0,96 16,4 0 ,89 Ac-Globulins. Komplizierter 0,95 16,6 0,88 ist die Methode fiir die Be- 0,94 16,8 0 ,86 st immung des Ae- Globu- 0,92 17,0 0,85 ]ins ~°. Sie beruht darauf,

dal3, wenn man die Kon- zentration des Ae-Globulins herabsetzt, sieh bald nieht

nur die Gesehwindigkeit verringert, m i t d e r sich das Prothrombin in Thrombin umwandelt, sondern auch die Menge des in Thrombin umgewandelten Pro- thrombins. Die Zweistufenmethode ftir die Prothrom- binbestimmung wird m i t d e r Modifikation angewandt, dab man die Prothrombinkonzentrat ion konstant h~lt und die Ae-Globulinkonzentration variabel l~Bt. Bei den Ae-Globulinmessungen empfiehlt es sieh, hohe Plasmaverdiinnungen zu verwenden. Naeh den Autoren, die die besehleunigende Natur des Ae-Glo- bulins annehmen, wiirde dieses Verfahren erlauben, aueh kleine Sehwankungen dieses katalytisehen Effek- tes erkennen zu lassen. Die einze]nen Phasen der Me- rhode werden folgendermaBen durehgeffihrt.

a) Plasmaverdiinnung. W~hrend man bei der Zwei- stufenmethode fiir die Prothrombinbest immung eine Thrombinkonzentrat ion w/ihlt, die eine Gerinnungs- zeit yon 15 see gibt (die Thrombineinheit), sueht man bei der Ae-Globulinbestimmung im Endgemiseh eine Konzentrat ion yon 1,34 E/em a Thrombin zu erreiehen, die einer Gerinnungszeit yon 12 see entsprieht.

G Gerinnungszeiten in Sekunden; T Thrombin- bzw. Prothrombineh~heiten je Kubik- zentimeter.

rinnungszeiten sieh Minim~twerten ni~hern, so dab man genaue Ni~herungswerte erhalt. Als Endpunkt der Gerinnung w~thIt man den ~{oment, in dem man durch das R.5hrchen hindurehblickend die ersten KSrnchen bemerkt. Das Gerinnsel bildet sich un- mit tetbar daxauf.

Zur Erreehnung der Prothrombinkonzentrat ion kann man sioh entweder der DaGen bedienen, die yon WA~E und S ~ a ~ s 1949 Is gegeben wurden und fiir die Gerinnungszeiten zwischen 13 und 17 sec gelten, oder derjenigen, die im Laborator ium ALEXANDERS 19 zusammengestetlt wurde und die eine gnng, hernde Verwertung der Zeiten fiber 17 und unter 13 see er- laubt (s. Tabel]e 2). Wenn in der Praxis die kleinste bei den Best immungen erhaltene Zeit 15 sec betriigt, kunn man sagen, dal? sich in der letzten Verdiinnung 1 Thrombin-E/em s befindet. Da das Plasma im ggnzen 10real verdiinnt worden ist (2mal = Defibrinierung; 4ram = Inkubationsgemisch; 1,25 = Fibrinogen), mu]tipliziert mit dem Verdtinnungsfaktor, ist die An- zahl der Thrombineinheiten das 10fache der Verdtin-

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Jg. 32, Heft I5/16 P~s~O DE NICOLA: Zur zuverl~ssigen Durchfiihrung der Zweistufenmethoden. 359 15. April 195~

Naehdem man die Prothrombinkonzentrat ion mit- tels der oben besehriebenen Zweistufenmethode be- s t immt hat, sehreitet man zur Verdiinnung des nieht- defibrinierten Plasmas mit gereinigtem Prothrombin. Das letztere wird naeh der besehriebenen Nethode hergestellt. Da das Plasma 5real mit dem Inkuba- tionsgemiseh und mi t dem Fibrinogen veI'diinnt wird (s. Zweistufenmethode fiir das Prothrombin), muB man, um im Endgemiseh eine Prothrombin- bzw. Thrombinkonzentrat ion yon 1,34 E/era s zu erhMten, die Prothrombinkonzentrat ion des Plasmas auf 1,34 mal 5 E/era s, d. h. 6,7 E/em ~ bringen. Daher verdiinnt man das Plasma mit physiologiseher KoehsalzlSsung, so dab man diese Zahlen erhglt. Wenn z. B. die Prothrombinkonzentrat ion im untersnchten Plasma 300 E betrggt, werden zu 0,1 em a Plasma 4,4 em a physiologisehe Xoehsalzl6sung hinzugeffigt.

Dah er ist es nStig, das Plasma versehiedentlieh weiter zu verdiinnen, je naeh der Tierart, indem man die Prothrombinkonzentrat ion konstant h~lt. ]3eim Menschen empfiehlt es sieh eine Verdfinnung yon un- gef/~hr 250 zu erreiehen. Da das Plasma schon mit physiologiseher Kochsalzl6sung verd/innt worden war, wird man es noeh welter mit L6sungen gereinigten Prothrombins yon 6,7 E/era ~ verdiimnen, his man diesen Verdiinnnngsgrad erreicht. I m vorhergehenden Beispie], in dem das Plasma 45real mit physiologiseher KoehsalzlSsung verdiinnt worden war, fiigt man 20 em a einer L6sung in 0,9 %igem NaCI von 6,7 E/era ~ gereinigtem Prothrombin zu 0,1 em s Plasma and 4,4 em s physiologischer KoehsalzlSsung hinzu. Auf diese Weise blieb die Prothrombinkonzentrat ion kon- stant und die Ae-Globulinkonzentration verringerte sieh um das 245faehe.

b) Aktivierung des Prothrombins und Bestimm~ng der Gerinnungszeit. Man sehreitet dann zur Aktivie- rung des verdfinnten Plasmas, indem man einen Teil von diesem mit 3 Teilen Inkubationsgemisch mischt und die Stoppuhr in Bewegung setzt. Das Inkuba- tionsgemisch ist dasselbe wie bei der Prothrombin- bestimmung mit der Ausnahme, dal3 physiologisehe KochsalzlSsung ans ta t t Calcium gebraucht wird. In Abst~nden yon 2 rain erfolgt die Bestimmung der Ge- rinnungszeiten, indem man 0,4 cm a des verdiinnten Plasmas @ Inkubationsgemisehes zu 0,1 1%ige Fibri- nogenlSsung zufiig~.

c) Errechnu~g der Ac-Globulinlconzentratiort. Eine Einheit Ac-Globulin kann als jane 5{enge Ae-Globulin defibriert werden, die, 1000fach verdiimnt, eine 1,34 E je em a Prothrombinl6sung in Thrombin verwandelt, nach dem Beispiel der Linie 1 in Abb. 2. Die anderen LiNen der Abb. 2 steIten die Werte dar, die man er- hi~lt, wenn es sieh ans ta t t um eine 1000Iaeh verdiinnte Einheit, um eine grSgere oder kleinere Anzahl als eine Einheit handelt. I)iese Kurven wurden im Depart- merit o~ Physiology der Waye University hergestellt.

Wenn die bei der Prothrombinaktivierung erhM- tenen Werte eine der anderen Linien tibersehreiten, kann man die Anzahl der Ae-Globulineinheiten aus den Wer~en errechnen, die diese Linien begleiten, wetehe sieh aus den Ac-Globulinkonzentrations- best immungen in einem System yon bekannten Varia- blen ergaben. Jedoch muB man die Verdfinnung be- aehten, der das Plasma. unterworfen ist. Fiir das Ac- Globulin braucht hingegen, im Unterschied zum Prc- thrombin, die Verdiinnung nieht beaehtet zu werden,

die in der Phase der Gerinnungszeitbestimmung wegen der Fibrinogenzugabe vorkommt, sondern nut die vor- hergehenden Verdfinnungen. Die Ac-Globulinwirkung hat sich ngmtieh sehon entwickelt, wenn man das ver- diinnte Plasma mit Fibrinogen pr/ift. Daher geniigt es, die Verdiinnung mit physiologischer Xoehsalz- 15sung (variabel) mit gereinigtem Prothrombin (va- riabel) und mit Inkubationsgemisch (4lath) zu be- achten. In dem oben erwi~hnten Beispiel, bei dem die Verdtinnung 245 betrug, ~ i rd diese Zahl mit 4 multipli- ziert, and aul3erdem noch mit der entspreehenden

0 4 8 12 76' 20 2g Z8 32 36' qO Plesrnc, A C- O/obulin

Abb. 2. Stand~,rdkurven zur Erreohnung der Plasma-Ao-O, iob~inkonzen- tration. Die Z~hlen beziehen sieh auf die Ae-Globulineinheiten.

Zahl, die man bei der Linie in der Abb. 2 auf Grund tier beobaehteten Gerinnungszeiten finder, und dutch 1000 geteilt, da es sieh um eine 1/1000 E handelt. Wenn laan z. B. 16 finder, wird die Anzahl der Ae-Globulin- einheiten 245 × 4 × 1~/loo 0 = 15,7 Ae-Globulin- einheiten je Kubikzent imeter sein.

e

2t7 ~

"/00 ~ 8 72 7~ 20 2~/ 28 32 33 ~tO Set'urn ,4 C- 51o~uhH

Abb. 3. Wie Abb. 2, zur Erreehnung der Serum-Ae-Globulinkonzentra- tion. Abb. 2 un4 3 warden im Department of Physiolo~J der Wayne

University hergestelIt,

Aueh ffir das Ae-Globulin sind dieselben Korrek- turfaktoren, die fiir das Prothrombin angegeben wur- den, giiltig, d. It. der Faktor, den man bei den Be- stimmungen eines Standard-Kontrollplasmas erh~lt, und der Faktor, der sieh auf das zugefiigte Antieoagu- lans und das Hi~matokrit bezieht.

Die Methode fiir das Plasma-Ae-Globulin kann auch fiir Serum angewandt werden. Die Kurven sind in diesem Falle etwas versehieden. Sic sind in der Abb. 3 wiedergegeben.

Die Ac-Globulinbestimmungen k6nnen dem An- f/~nger einige Sehwierigkeiten bieten, da die Methode ziemlieh kompliziert seheint. Jedoeh ist es mSglich, mehrere Serienbestimmungen binnen weniger Stun- den auszufiihren. J3ei der Erreehnung der Konzentra- tion kann es gesehehen, dab die erhaltenen Linien den

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Klinische 360 PIETRO DE NICOLA : Z u r zuver l~ss igen D u r c h f i i h r u n g der Z w e i s t u f e n m e t h o d e n . Wochensehrift

Standardkurven nieht ganz entspreehen. Diese Un- bequemlichkeit kommt vor allen Dingen dann vor, wenn man es gelegentlieh mit einer Mischung yon Plasma- und Serum-Ae-Globulin zu tun hat. In diesen Fallen empfiehlt es sieh, yon den Mittelwerten, die sich ans den einzelnen Teilen der Kurven ergeben, auszugehen.

Hinsiehtlich der Reaktivit~t der Reagentien wird auf das anlaglich der Zweistufen-Prothrombinbestim- mungen Gesagte verwiesen.

Um eine ann~hernde Vorstellung yon der Ae- Globulinkonzentration im Plasma zu bekommen, kann man auf das empirisehe Verfahren, das sehon 1949 yon WA~E und S E E ~ S ~6 beschrieben wurde, zuriiekgreifen, d .h . auf die Bestimmung der Pro- thrombinkonzentrat ion vermittels der oben besehrie- benen Zweistufenmethode mit nnd ohne Ae-Globulin- zusatz.

Wenn sieh ein leichtes Ae-Globulindefizit zeigt, existiert eine Differenz zwisehen der beim Ac-Globu- linzusatz beobaehteten Anzahl der Prothrombinein- heiten, wie oben gezeigt, und der Anzahl der Einheiten, die beim Ausffihren der Verdiinnung des Plasmas mit physiologiseher KochsMzl6sung, ohne Ac-Globulin, festgestell~ wurde. Es handelt sieh um ein empirisehes Datum, das jedoeh in gewissen F~llen niitzlich sein kann.

III. Antithrombinbestimmung. Die ursprfingliehe Methode yon AsT~v~ und ])At~LING 21 wurde kiirzlieh yon S~E¢s.aS und Mitarbeitern ~e modifiziert, indem man hohe Thrombinkonzentrationen als Substrat ver- wendete. Zur laufenden Durehffihrung dieser Methode bedient man sieh des folgenden Verfahrens.

a) Man fiigt zu 7 Teilen Blut 1 Teil 1,85%iges Kaliumoxalat hinzu. Man miseht und zentrifugiert bei 3000--i000 Touren ffir 10--15 rain. Man t rennt das fiberstehende Plasma ab.

b) Man defibriniert das Plasma indem man es im Wasserbad fiir 3 - -5 rain auf 560 C erhitzt. Man l~gt abkfihlen und entfernt das prazipitierte Fibrinogen dureh Zentrifugierung.

e) Man miseht 0,5 em ~ einer Thrombinstandard- 15sung (1100 E/cm ~) mit 0,5 em ~ defibriniertem Plasma in paraffinier~en RShrehen. Man l~.Bt es 2 Std auf 280 C und bringt die RShrehen in Eis bis die quantita- tive Thrombinbestimmnng stattfindet.

d) Erreehnung der zerst6rten Thrombinmenge; an- fangliche Thrombinkonzentrat ion minus 2real die Thrombinmenge, die am Ende der Reaktion in der Mischung zurfiekgeblieben ist. Die Thrombinkon- zentration wird dutch eine Modifizierung der oben besehriebenen Zweistufenmethode zur th'othrombin- bestimmung festgestellt. Man verwendet ein Inkuba- tionsgemisch, das folgende Zusammensetzung hat: 2 Teile 15 %iges Acacia; 1 Teil Imidazolpuffer ; 1 Tell l%iges CaClz in physiologiseher KochsalzlSsung; 5 Teile 0,9%iges NaC1. Dazu ist es notwendig, die Thrombinverdfinnungen in silikonierten RShrchen vorzunehmen, damit keine Verminderung der Throm- binaktivitat wahrend der einzelnen Phasen stattfindet. Die Silikonierung wird folgendermal3en durehgeffihrt: ~ a n verdfinnt Metyl-Chloro-Sylan (Dri l~ilm 9987) mit Petrol£ther 1:5. Diese Flfissigkeit Mrd in die RShrchen, Zylinder und sonstige Glasgefage gegossen und ffir 10--15 see stehengelassen. Dann wird die Flfissigkeit ausgegossen und die Glasgefgfte naeh

einigen Minuten mit Leitungswasser und naehher mit destflliertem Wasser wiederholt ausgewaschen. Die Reinigung der silikonierten RShrehen, die nur einmal gebranch~ werden dfirfen, erfolgt durch griindliches Waschen mit heigem Wasser, worauf man sic in eine ~ s c h u n g yon 2 Liter Aceton, 2 Liter Wasser, 150 g NaOH, legt und fiber Nacht darin Iagt.

Bei der Thrombintitrierung verfiihrt man auf folgende Weise: Man mischt 0,1 Fibrinogen mit 0,3 Inkubationsgemiseh. Jedem RShrchen wird 0,1 cm 3 Thrombinl5sung zugesetzt. Der Endpunkt der Ge- rinnung wird durch die Beobachtung des ersten Fibringerinnsels festgestellt. Ffir die Erreehnung der Thrombineinheiten aus den Gerinnungszeiten ver- wendet man dieselbe Tabelle wie ffir die Prothrombin- bes~immung.

]Die angegebene Beschreibung der Zweistufen- methoden ffir die Bestimmung des Prothrombins, des Ac-Globulins und des Antithrombins stellt zum Teil eine Verbesserung der schon bekannten, aber in der tech- nischen Durchffihrung oft unpraktischen Verfahren dar. Man kann noeh nicht feststellen, ob die Zwei- stufenmethoden auch vom theoretischen Standpunkt aus, zuverl~ssiger als die Einstufenmethoden sind. Zum Beispiel weift man nicht genau bis zu welehem Punkt der Faktor VII diese Bestimmungen beeinflugt, wenn aueh zahlreiche experimentelle Untersuchungen fiber den Faktor VII vermittels der Zweistufen- methode angestellt worden sind 23-25. Wahrscheinlich bildet der :Paktor VII in den beschriebenen Verfahren ffir die Bestimmung des Prothrombins und des Ac- Globulins keine Variable und findet sich in genfigen- der Menge im System, weft seine Veranderungen im Plasma den Ausgang der Versuche nicht wesentlich beeinflussen. Da der Faktor VII nut eine ErhShung der Geschwindigkeit bei der Umwandlung des Pro- thrombins in Thrombin, nicht aber eine Zunahme der Thrombinbfldung be-~rken sollte, wfirden sich seine Vergnderungen bei den Zweistufenmethoden nur rela- t iv schwach bemerkbar machen, vor allem wegen des Uberschusses anAc-Giobulin. Neuere Untersuchungen haben n~mlich gezeigt, dag das Ac-Globulin bis zu einem bestimmten Punkt eine vikariierende Funktion hinsiehtlich des Mangels an Faktor VII ausfiben kann. Die Analogien zwisehen Serum Ac-Globulin und Faktor VII k5nnten aueh bei der Deutung der Ergeb- nisse eine Rolle spielen, die man mit Hiife der Zwei- stufenmethode ffir die Bestimmung des Ac-Globulins erhalten hat. Trotzdem iiegen noch keine defini~iven Beweise vor.

Zusammen]assend. Zur zuverlfi~ssigen Durehffih- rung der Zweistufenmethoden und der quantitativen Bestimmung des Prothrombins, des Ac-Globulins und des Antit.hrombins empfiehlt es sich, gereinigte Systeme zu verwenden. Die Beschreibung der Me- thoden, so wie sie in dieser Arbeit angegeben worden ist, enthalt aueh die Revision der technischen Ver- fahren zur Herstellung der nStigen Substanzen, wie Prothrombin, Fibrinogen und gereinigges Thrombin.

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Page 7: Zur zuverlässigen Durchführung der Zweistufen-Methoden bei der Blutgerinnung

Jg. 32, Heft 15/16 W. I'IoRsT u n d H. I-I. SOI~UMAOI~EI~: Pap ie re lek t rophore$ i sche U n t e r s u c h u n g e n . 361 15. April 1954

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PAPIERELEKTROPHORETISCHE UNTERSUCHU/~'GEN VON SCHILDDRI]'SENEXTRAKTEN UND SERUM I~ACH IN ¥ITRO-ZUSATZ YON RADIOJODID,RADIOMANGAN UND RADIOCOBALT

SOWIE NACH IN VIVO-GABE YON RADIOJODID*. Von

W. Ho~sT und H. H. SCI~VM~CI~Er~. Aus dem Strahleninstitut (Direktor: Prof. Dr. Pt~t~-¢ST) and dem Pathologischen Institut (Direktor: Prof. Dr. KltAUSPE)

des Universi~gtskrankenhauses Hamburg-Eppendori,

I n friiheren Untersuehungen kormte gezeigt werden (HoRsT und R6SL~R1), dag das Hormon jod im S t rum des Mensehen in Bindung an zwei EiweiBfraktionen zirkuliert, ngmlieh die sog. In ter-~-f rakt ion (etwa 85 %) und die Albumine (etwa 15 %). I n einigen F~lten fanden sigh daneben aueh im Bereich der/?-Globuline um 10 % des organiseh gebundenen Radiojods (Abb. 2). Weiter ergab sich, dag eiweil~freies, biosynthet iseh gewonnenes, radioakt ives H o r m o n j o d (Butanolext rakt veto S t rum athyreot iseher Kinder) in der gleiehen typisehen Verteilung gebunden wird (J-Io~sT und v. ttAI~ACK2). Demnach t r i t t das H o r m o n j o d eiweiB- frei und nicht als Thyreoglobu]in oder ats Pept id aus der Schi]ddriise ins P lasma fiber und wird dor t sekundgr an bes t immte Plasmaproteine gebunden (s. aueh Gl~oss a n d PtTT-RIV~aS3; G~oss, LEBLOI~'D, FI¢ANKLIN und QI:ASTEIA). Weiter konnte durch Unte rsuehungen mit radioakt ivem Thyrox in und Tr i jod thyronin naehgewiesen werden, dab im Serum aueh [reies, also nicht eiwei[3gebundenes Thyroxin und Tr i jod thyronin mit der In te r -g -Frak t ion und den Albuminen im Gleichgewicht stehen1% Gerade aber das freie, ungebundene H o r m o n j o d ist vermutl ieh diffusibel und diirfte dami t verantwort l ieh sein ffir die intracellulgre Hormon jodkonzen t r a t ion und -wirkung, die somit wiederum yon der Konzen t ra t ion bes t immter hormonjodbindender Serumproteine abhgngig ist la.

Es war daher von Interesse, die LokMisation des Thyreoglobulins im typisehen SerumpherogTamm zu ermitteln, u m so festzustellen, wieweit sieh das - - im SonderfM1 auch im Plasma a.uftretende - - Thyreo- globulin im Phe rog ramm von den das Hormon jod tra- genden Eiweil?fraktionen des Serums abgrenzen lgBt.

Die Schilddrtise ka lm fiir Jodide gegenfiber dem Serum einen Konzent ra t ionsgradienten yon 25:1 bis 500:1 aufrechterhal ten (VA~CDEI~LAAN und VA~D~I~- LAANS). Der Meehanismus ist bisher unbekannt . Zwei Theorien, du tch experimentel]e Untersuchungen gestiitzt, werden Itir die Jodidkonzent r ie rung der Sehilddriise diskutiert . W Y ~ G ~ D n ~ und Mitar- beiter ~ hal ten das Vorliegen eines spezifisehen, jodid- b indenden Proteins in der Schitddrfise fiir wahr- seheinlieh. Da jedoch nach TAmcoa, Ci~i~co~- und FELLEI~ 7 das naeh Propyl th iouraei lbehandlung kon- zentrierte Jod id durch Dialyse wieder aus der Schild-

* Durchgeffihrt mit Unterstfitzung der neutschen Forschungsgemein- schaf~.

drfise entfernt und durch Trichloressigsgure nieht gefgllt werden kann - - wie es WYNCAAI~DS~ und ?¢Iit- arbeiter 6 beriehten - - ist eine enzymatisehe godid- konzentr ierung (Ionenpumpe) zu diskutieren (s. bei goc t tE und 5~IcI~Ls). Die bekannte }Virkung der

Abb. 1. ttormonjodtransport dutch SerumeiweigkSrper. 9,7% ~-Olobulin- Bereich, 78% Inter-~-%'raktion, 12,3% Albumin-I#raktion. (ttoRsT, W. Aus Yerh. der Deutschen Gesellschaft ffir Verdauungs- and Stoffwechsel-

krankheiten. 17. Tagg 1953, Stuttgart.)

Thioeyanate k6nnte als eine H e m m u n g dieser Enzynle aufgefal3t werden.

Ffir die Anreieherung yon l~adiomangan (Mn 52) (Bol~ , TI~IOFliEFF-t~EssowsKY und WOLF 9) und RadioeobMt (Co 56, 57) (Co~Ial~ und DAvis 10) in der Sehilddrfise gelten ghnliche Bedingungen. Aueh bier wird ein spezifisches Protein als Wirkungst rgger dis- kutiert .

Unsere Untersuchungen sotlen ein Beitrag sein zur LokMisation des Thyreoglobuhns ira Spek t rum der Serumproteine; gleiehzeitig sollen sic klgren, ob die durch sehonende Ex t rak t ion gewonnenen Proteine der Sehilddrfise Jodidionen (J131) , Manganionen (Mn 52) nnd Cobaltionen (Co 56, 57) adsorbieren und gegebenenfalls in welehem quant i ta t iven Verhgltnis zur Adsm~ption dutch die Serumproteine.

Material. Es wurden 9 durch subtotale Thyreoidektomie gewonnene Schilddriisen des Mensehen untersueht. Zum Tei] erhielten die Patienten einige Tage vor der LTntersuehung