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II. Mikrobiologische Prüfungen

II. Microbiological Testing

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II. Mikrobiologische B a sisp rüfungen

II. B asic Microbiological Tests

Mit K ra nkheitserregern konta m inierte Med iz in-

p rod ukte kö nnen d ie Q uelle v on Infektionen beim

Menschen sein. Med iz inp rod ukte und ihre H er-

stellungsv erfa hren m üssen d a her gem ä ß Med i-

z inp rod ukted irektiv e so a usgelegt sein, d a ss d a s

Infektionsrisiko für Pa tienten, A nw end er und

D ritte a usgeschlossen od er sow eit w ie m ö glich

v erringert w ird .

F ür Med iz inp rod uktehersteller bed eutet d ies,

d a ss insbesond ere Prod ukte, d ie sterilisiert w er-

d en sollen, unter a ngem essenen und m ikrobio-

logisch überw a chten U m gebungsbed ingungen

( z . B . Z onen konz ep t) hergestellt w erd en m üssen.

D a rüber hina us m üssen d ie Prod ukte und ggf.

d ie R ohstoffe sow ie d ie V erp a ckungsm a teria lien

regelm ä ß ig a uf m ikrobiologische B ela stungen

überp rüft w erd en, d enn nur so ka nn d er sp ä tere

S terilisa tionserfolg gew ä hrleistet w erd en.

D ie m ikrobiologischen B a sisp rüfungen d er ‘m d t’

geben d em H ersteller A ufschluss über d ie K eim -

bela stung ihrer Prod ukte im V erla uf d es H er-

stellungsp roz esses, helfen d en S terilisa tionserfolg

und D esinfektionsleistungen z u bew erten und

unterstütz en H ersteller bei d er Ü berw a chung d er

Prod uktionsbed ingungen.

Med ical d ev ices contam inated w ith p ath ogens

m ay be a sou rce of infection for h u m ans. Th ere-

fore, accord ing to th e Med ical D ev ice D irectiv e,

d ev ices m u st be d esigned and m anu factu red in

su ch a w ay as to elim inate or red u ce th e risk of

infection to th e p atient, u ser or th ird p arties as

far as p ossible.

C onseq u ently , m ed ical d ev ice m anu factu rers, in

p articu lar if th ey m anu factu re sterile d ev ices,

m u st p rod u ce th eir p rod u cts u nd er ad eq u ate and

m icrobiologically m onitored cond itions inv olv ing

a clear z one concep t. F u rth erm ore, th e final p ro-

d u cts, and if necessary th e starting and p ack aging

m aterials, m u st be su bjected to biobu rd en d eter-

m inations in ord er to su p p ort th e later steriliz a-

tion su ccess.

Th e m icrobiological basic tests of ‘m d t’ inform

th e m anu factu rer abou t th e m icrobiological sta-

tu s of th eir p rod u cts, d eterm ine antiinfectiv e

p rop erties of m aterials and d isinfectants and h elp

to control m anu factu ring p rocesses and steriliz a-

tion p roced u res.

31II. Mikrobiologische B a sisp rüfungen


1 . K E IM Z A H L B E S T IM M U N G

Keimzahlbestimmungen (Bioburden) werden durchge-

führt, um Kenntnis über die mikrobielle Belastung ein-

zelner Medizinprodukte nach oder während der Pro-

duktion zu erlangen.

Da die Wiederfindungsraten von Bakterien und Pilz-

sporen auf einem Medizinprodukt oder dessen Pack-

mittel stark materialabhängig sind, muss vor der eigent-

lichen Keimzahlbestimmung eine Methodenvalidierung

gemäß EN ISO 11737-1 durchgeführt werden. Die

materialabhängige Wiederfindungsrate wird dann zur

Korrektur der gefundenen Keimbelastungswerte heran-

gezogen und führt zu einer realitätsnahen Ermittlung

der zu erwartenden Keimbelastung. Bei der Validierung

der Bioburdenbestimmung können zwei unterschied-

liche Richtlinien herangezogen werden. Einerseits kann

die EN ISO 11737-1 herangezogen werden. Die Norm

schreibt den Einsatz von den folgenden drei Prüfkeimen

vor: Staphylococcus aureus, Fusarium solani und Bacil-

lus subtilis. Als Alternative kann auch die Validierung

nach den harmonisierten Pharmakopöen (Ph.Eur., USP

und JP) durchgeführt werden. Laut diesen harmonisier-

ten Pharmakopöen sind 5 Prüfkeime einzusetzen: Sta-

phylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus

subtilis, Candida albicans und Aspergillus brasiliensis.

1 .1 . V a lid ie ru n g d e r K e im z a h lb e s tim m u n g

A. Durchführung gemäß DIN EN ISO 11737-1 und

EN ISO 11137-2

– Oberflächliche Beimpfung steriler Prüfgegenstände

mit folgenden drei Keimen: Staphylococcus aureus,

Fusarium solani und Bacillus subtilis

– Ablösen der beimpften Keime in Waschlösung

– Membranfiltration, Verdünnungsreihen oder

Ausspatelmethode

– Bestimmung der Wiederfindungsrate

– Bebrütungszeit 1 – 5 Tage

1. BIOBURDEN DETERMINATIONS

The bioburden of a product is determined in order to

assess the number of viable microorganisms present on

a medical device or its packaging material during or at

the end of the manufacturing process.

As the recovery rates of bacteria and molds, which

adhere to a medical device or its package, strong-

ly depend on the respective material properties, any

bioburden determination procedure needs to be vali-

dated according to EN ISO 11737-1. The determined

recovery rate is then applied to the measured biobur-

den value in order to evaluate the real microbiological

status of a product. For the validation of the biobur-

den determination two different guidelines can be used:

First, EN ISO 11737-1 can be used. This standard

specifies the use of the following three microorganisms:

Staphylococcus aureus, Fusarium solani and Bacillus

subtilis. Alternatively, the validation can also be per-

formed using the harmonized Pharmacopeia (Ph. Eur.,

USP, and JP). According to these three harmonized

Pharmacopeia a total of five microorganisms must be

used: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerugino-

sa, Bacillus subtilis, Candida albicans and Aspergillus

brasiliensis.

1.1. V a lid a t io n o f t h e Bio b u r d e n De t e r m in a t io n

A. Procedure according to EN ISO 11737-1 and

EN ISO 11137-2

– Inoculation of sterile test items with the following

microorganisms: Staphylococcus aureus, Fusarium

solani and Bacillus subtilis

– D etachment of inoculated microorganisms using a

rinsing solution

– M embrane filtration, dilution series or spread

plates

– D etermination of recovery rates

– Incubation time up 1 – 5 days

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3232 II. Mikrobiologische B a sisp rüfungen


B. Durchführung in Anlehnung an harmonisierte

Pharmakopöen (Ph.Eur., USP und JP)

– Oberflächliche Beimpfung steriler Prüfgegenstände

mit folgenden fünf Keimen: Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida

albicans und Aspergillus brasiliensis

– Ablösen der beimpften Keime in Waschlösung


Ausspatelmethode

– Bestimmung der Wiederfindungsrate

– Bebrütungszeit 1 – 5 Tage

1 .2 . K e im z a h lb e s tim m u n g

Durchführung gemäß Ph.Eur., USP oder

EN ISO 11737-1


Ausspatelmethode

– Verwendung von 1–2 Kulturmedien

– Bebrütungszeit 7 Tage

– ggf. Untersuchung von Produkten und Verpackungen

2 . P R Ü F U N G E N A U F S T E R IL IT Ä T

Die Prüfung auf Sterilität weist nach, ob sich auf einem

geprüften Produkt vermehrungsfähige Organismen

befinden. Sie dient jedoch nicht zum Nachweis eines

Sterilitätserfolges nach Sterilisation. Dazu ist eine Vali-

dierung des jeweiligen Sterilisationsverfahrens erfor-

derlich. ‡ K A P IT E L III

2 .1 . V a lid ie ru n g d e r P rü fu n g e n a u f S te rilitä t

Durchführung gemäß Ph.Eur., USP (Nachweis der

Ab wesenheit von antimikrobiellen Eigenschaften des

Produktes)


– Vergleich des Wachstums von wenig Keimen

(< 10 0 Keime) in Anwesenheit und Abwesenheit

des Produktes

– Prüfung von bis zu 6 verschiedenen Keimen

(Ph.Eur, USP)


– anwendbar auf Produkte und Primärpackmittel

B. Procedure in analogy to harmonized Pharmacopeia

(Ph. Eur., USP and JP)

– Inoculation of sterile test items with the following

microorganisms: Staphylococcus aureus, Pseu-

domonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida

albicans and Aspergillus brasiliensis

– D etachment of inoculated microorganisms using

a rinsing solution


plates

– D etermination of recovery rates

– Incubation time 1 – 5 days

1.2 . Bio b u r d e n De t e r m in a t io n

Procedure according to Ph.Eur., USP, or

EN ISO 11737-1


plates

– Application of 1– 2 media

– Incubation time 7 days

– Applicable for products and packaging materials

2 . STERIL ITY TESTING

Sterility tests confirm that a product does not contain

any viable microorganisms. Sterility tests, however,

can not be applied to prove the success of a steriliza-

tion procedure. These procedures have to be validated

separately. ‡ C H AP TER III

2 .1. V a lid a t io n o f t h e St e r ilit y Te s t

Procedure according to Ph.Eur.and USP (confirmation

of the absence of antimicrobial activity of product)


– Comparison of growth of microorganisms (< 10 0

CFU) in the absence and presence of product

– Test of up to 6 different microorganisms





2 .2 . D ire k tb e s c h ic k u n g

Durchführung gemäß EN ISO 11737-2 oder in

Anlehnung an Ph.Eur. und USP


– Positiv-Kontrollen


– anwendbar auf Produkte und Primärpackmittel

2 .3. M e m b ra n filte rm e th o d e

Durchführung gemäß EN ISO 11737-2 oder in

Anlehnung an Ph.Eur. und USP


– Positiv-Kontrollen


– ggf. Untersuchung von Produkten und

Verpackungen

3. K E IM D IF F E R E N Z IE R U N G U N D N A C H W E IS

P A T H O G E N E R L E IT K E IM E

Durchführung nach Ph.Eur. oder USP

– Bestimmung von Bakterien und Pilzen

– mikroskopische Differenzierung, G ram-Färbung

– kulturelle G robdifferenzierung

– Feindifferenzierung mittels biochemischer Tests

Nachweis / Ausschluss von pathogenen Keimen durch

Anreicherung auf selektiven Nährböden, z. B.

– Escherichia coli

– Pseudomonas aeruginosa

– Staphylococcus aureus

– Salmonella spec.

4 . P R Ü F U N G A U F A U S R E IC H E N D E

A N T IM IK R O B IE L L E W IR K S A M K E IT

Einige Produkte werden vom Patienten mehrfach ver-

wendet oder über einen längeren Z eitraum aufge-

braucht. In diesen Fällen sind zuverlässige Desinfektion

oder Konservierung des Produktes erforderlich. Nach-

folgend sind beispielhaft Prüfungen auf ausreichende

antimikrobielle Wirkung dargestellt.

2 .2 . Dir e c t Tr a n s f e r t o C u lt u r e Me d iu m

Procedure according to EN ISO 11737-2 or in

analogy to Ph.Eur and USP


– Positive controls



2 .3 . Me m b r a n e F ilt r a t io n Me t h o d

Procedure according to EN ISO 11737-2 or in

analogy to Ph.Eur and USP

– R insing of samples in saline solution


– Positive controls



3 . DIF F ERENTIATION AND DETEC TION OF P ATH O-

G ENIC MIC ROORG ANISMS

Procedure according to Ph.Eur. or USP

– D etermination of bacteria, molds and yeasts

– M icroscopic differentiation, gram-staining

– D ifferentiation using culture techniq ues

– D ifferentiation using biochemical tests

D etection / ex clusion of pathogenic microorganisms

by amplification in selective nutrient media, e. g.

– Escherichia coli

– Pseudomonas aeruginosa

– Staphylococcus aureus

– Salmonella spec.

4 . ANTIMIC ROBIAL AC TIV ITY TESTING

Some medical devices can be applied repeatedly or can

be used up by patients over a longer period of time. For

such products effective disinfectants, respectively effec-

tive preservative agents, are req uired. In the following,

some tests are presented which are applied to investi-

gate such antimicrobial properties.

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3434 II. Mikrobiologische B a sisp rüfungen


4 .1 . S u s p e n s io n s te s t z u r B e s tim m u n g d e r B a k te riz id ie

v o n D e s in fe k tio n s m itte ln

Durchführung nach EN 10 40 ; weitere Verfahren nach

EN 1276 , EN 136 9 7 oder EN 13727

– Prüfung von fertigen Desinfektionsmitteln oder

einzelnen Wirkkomponenten

– Validierung der Inaktivierung des Konservierungs-

mittels

– Beimpfung z.B. mit Pseudomonas aeruginosa und

Staphylococcus aureus

– Bestimmung der zeitabhängigen Abtötungsraten

– Kriterium: Reduktion der lebensfähigen Keime um

10 5 nach 6 0 min bei 20 °C

4 .2 . S u s p e n s io n s te s t z u r B e s tim m u n g d e r F u n g iz id ie

v o n D e s in fe k tio n s m itte ln

Durchführung nach EN 1275; weitere Verfahren nach

EN 16 50 , EN 136 9 7 oder EN 136 24

– Prüfung von fertigen Desinfektionsmitteln oder

einzelnen Wirkkomponenten


mittels

– Beimpfung mit Candida albicans und Aspergillus

brasiliensis

– Bestimmung der zeitabhängigen Abtötungsraten

– Kriterium: Reduktion der lebensfähigen Keime um

10 4 nach 6 0 min bei 20 °C

4 .3. K o n s e rv ie ru n g s m itte lb e la s tu n g s te s t (P E T )

Durchführung nach Ph.Eur. oder USP

– frisch hergestellte Proben oder Proben nach

Anwendungssimulation


mittels

– Beimpfung mit Pseudomonas aeruginosa, Staphy-

lococcus aureus, Candida albicans und Aspergillus

brasiliensis (USP: außerdem Escherichia coli)

– Prüfung der Keimzahl zu verschiedenen Z ielzeit-

punkten

– Beurteilung der Ergebnisse (Erfüllung der Kriterien

A und B)

4 .1. Su s p e n s io n Te s t t o De t e r m in e Ba c t e r ic id a l

Ef f e c t s o f Dis in f e c t a n t s

Procedure according to EN 10 40 ; further procedures

according to EN 12 76 , EN 136 9 7 or EN 1372 7

– Test of final disinfectants or active ingredients

– V alidation of inactivation of the disinfecting agent

– Inoculation for ex ample with Pseudomonas

aeruginosa and Staphylococcus aureus

– D etermination of time-dependent killing rates

– Evaluation of success: reduction by 10 5 after

6 0 min at 2 0 °C

4 .2 . Su s p e n s io n Te s t t o De t e r m in e F u n g ic id a l Ef f e c t s

o f Dis in f e c t a n t s

Procedure according to EN 12 75; further procedures

according to EN 16 50 , EN 136 9 7 or EN 136 2 4

– Test of final disinfectants or active ingredients

– V alidation of inactivation of the disinfecting agent

– Inoculation with Candida albicans and Aspergillus

niger

– D etermination of time-dependent killing rates

– Evaluation of success: reduction by 10 4 after

6 0 min at 2 0 °C

4 .3 . P r e s e r v a t iv e Ef f ic a c y Te s t (P ET)

Procedure according to Ph.Eur. or USP

– Freshly prepared samples or samples after

simulated use

– V alidation of inactivation of the preservative agent

– Inoculation of test solution with Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida

albicans and Aspergillus brasiliensis

(USP: Escherichia coli in addition)

– D etermination of bioburden at various times

intervals

– Evaluation of results (fulfillment of criteria A and B)



4 .4 . P rü fu n g v o n M e ta lle n u n d K u n s ts to ffe n a u f

o lig o d y n a m is c h e A k tiv itä t

Durchführung als modifizierter Konservierungsmittel-

belastungstest (Ph.Eur.)

– Voreq uilibrierung der Prüfgegenstände in physiolo-

gischer Kochsalzlösung

– bei stark wirksamen Materialien: Parallelansätze in

CASO Bouillon

– Validierung der Inaktivierung der antimikrobiellen

Wirkung

– Beimpfung mit geeigneten Mikroorganismen

– Inokulationsdosis: 10 0 bis 10 0 0 KBE pro ml

– Keimzahlbestimmungen zu relevanten Z eit intervallen

– parallel geführte Wachstumskontrollen

– Beurteilung der Keimreduktion im Vergleich zu den

Kontrollen

5 . M IK R O B IO L O G IS C H E Ü B E R W A C H U N G V O N

P R O D U K T IO N S B E D IN G U N G E N

Produkte, die sterilisiert werden sollen, müssen gemäß

MDD unter angemessenen und überwachten Bedin-

gungen hergestellt sein. Die Europäische G MP-Richt-

linie gibt hierzu hilfreiche Anregungen, wie die Ü ber-

wachung des Produktionsbereiches und der darin

arbeitenden Mitarbeiter realisiert werden kann.

In Z usammenarbeit mit dem Auftraggeber erarbei-

tet die ‘mdt’ ein angemessenes Monitoringprotokoll,

welches Z eitpunkte und Positionen der Probennahme

festlegt und G renz- und Alarmwerte definiert. Auf die-

se Weise wird der mikrobiologische Status der Produk-

tionsumgebung anhand der folgenden Testsysteme fest-

gehalten und bewertet:

– Oberflächenkeime: Abklatschtests

(z. B. CASO-Agar Platten mit Enthemmern)

– Luftkeime: Sedimentationstests

(z. B. CASO-, SAB-Agar Platten)

– Wasserkeime: (z. B. CASO-, SAB-Agar Platten)

Darüber hinaus bietet ‘mdt’ Trainingskurse zur Pro-

duktions-, Betriebs- und Personalhygiene an.

4 .4 . Olig o d y n a m ic Ac t iv it y o f Me t a ls a n d P la s t ic

Ma t e r ia ls

M odified Preservative Efficacy Test according to

Ph.Eur.

– Eq uilibration of test items in physiological saline

solution

– In case of strong antimicrobial materials: parallel

testing in CASO Bouillon

– V alidation of inactivation of the preservative

materials effect

– Inoculation with suitable microorganisms

– Inoculation with 10 0 to 10 0 0 cfu per ml

– Bioburden determination at relevant time intervals

– G rowth controls in a parallel time schedule

– D etermination of reduction rates in comparison

to controls

5 . MIC ROBIOL OG IC AL MONITORING OF

P RODUC TION

According to the M D D devices which are supposed to

be sterilized must be manufactured under appropriate

and controlled conditions. In this regard the European

G M P G uideline offers helpful suggestions as how the

practical performance concerning the production area,

and the personnel working in this area, can be realized.

In cooperation with the manufacturer, ‘mdt’ develops

a suitable sampling plan which specifies the time regi-

men and sampling positions in the production area

and which determines action and alert limits for each

sampling position. Thereby the microbiological status

of the controlled environment can be documented and

evaluated for the following test systems:

– M icroorganisms on surfaces: Total colony count

(e. g., Tryptic Soy Agar with Neutralizer)

– Airborne microorganisms: Sedimentation test

(e. g., CASO-, SAB-Agar Plates)

– M icroorganisms in water supplies: Plating of

samples (e. g., CASO-, SAB-Agar Plates)

Furthermore, ‘mdt’ offers hygiene training courses for

employees working in a cleanroom environment.

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