Aus der Abteilung ffir Traumato]ogie im Klinikum der ]ohann-Wolfgang-Goethe-Universit~t Frankfurt/M. (Leiter: Prof. Dr. A. PANNIKE) .

Automatische quantitative Auswertung van Knochenbiopsien. Vergleichende Unter- suchungen verschiedener F~rbemethoden und Microradiographien

Automatic Quantitative Analysis of Bone Biopsies. Comparative Examinations of Various Staining Methods and Microradiographs

Evaluation quantitative et automatique de biopsies osseuses. Examens comparatifs de diff6rentes m6thodes de coloration et de diff6rentes microradio- graphies

van H. SIEBERT, B. LAIBLE, P. K O N O L D , A. PANNIKE und R. SCHRODER

Einleitung:

Unter dem EinfluB der Arbeiten van FROST (1962), ]OWSEY (1965), MERZ (1967) und SCHENK (1967) wird die quantitative Analyse nichtentkalkter Dfinnschnitte bei der Beurteilung mor- phologischer Knochenver~inderungen in vermehrtem MaSe eingesetzt.

Planimetrische Verfahren sind inzwi- schen weitgehend durch das Punktz~ihl- verfahren (GLAGOLEW 1933, HENNIG 1958) und durch die Methode des ,zu- f~lligen Oberschneidens" (FROST 1962, HENNIG 1958, WEIBEL 1963) abgelSst warden. Hierbei werden Oberfl~ichen und Volumina der Knochenfeinstruktu- ren mit Hilfe verschiedener Integra- tionsokulare indirekt bestimmt (PARFITT 1973).

Um den Zeitaufwand derartiger Be- sfimmungen zu verringern und die Ge- nauigkeit der Messungen zu erh6hen, wurden in den tetzten ]ahren van WIL- LIAMS (1972), MEUNIER (1975) und SAACKEL (1974) verschiedene vollauto- matische MeSmethoden vorgestellt. Hierbei wird mit Hilfe van Mikrobild- analysatoren und elektronischen Re- chenger~iten eine quantitative Struktur- analyse des histologischen Pdiparates vorgenommen.

Vergleichende Untersuchungen van Knochenschnitten mit dem Mikrobild- analysator und den histomorphometri- schen Ausz~ihlmethoden ergaben eine weitgehende Clbereinstimmung (WIL- LIAMS 1972).

Bei der Histomorphometrie des Kno- chengewebes haben sich die F~rbun- gen nach GOLDNER, nach VAN KOSSA sowie die F~rbung mit Solochrom-Cya- nin als besonders geeignet erwiesen (SCHENK 1967, WOODS "/968, MEUNIER 1975).

Durch die vorliegenden Untersuchun- gen sollte gepr/ift werden, ob und in- wieweit die angef0hrten F~rbemetho- den ebensa wie die Mikroradiographie zur quantitativen Auswertung mit einem Mikrobildanalysator geeignet sind und die Ergebnisse untereinander vergieich- bar sind.

i 56,6oo0 82,oo00 94 oooo 2 149,0OO0 94oo0o 9O. oooo 3 69.5000 103,0000 Id2, go00

F770000 56oooo [t4, oooo 5 2t ]000 35,5000 ~45o0o b 11,4o0o ~4.4ooo 49,0oo0 ? 19 oooo !l.oooo 33. oooo

8 5o, oooo 63, oooo 15~oo

9 92.0ooo llo. ooo0 58ooo

]o [7.600o 22, oooo 31.00oo l 3 42.4ooo 7 3, 700o 53 )ooo 12 26, 8oo0 25, oooo ~M. 2ooo [ ] l g, 8000 5 [, io~ 5 t. 0000 14 TS, oo0o 37, oooo 42,0000 38 82, oooo 49.3000 62, ~ooo 16 81,oooo 58.5o0o 530000 17 32,0oo0 59.500o 49.0000 18 4o, Zoo0 96,0000 41, oo0o 19 43,4000 42r~O0 ) ) , ~ 0 20 41,1000 37, 0Coo 22.5000

21 ]I,2000 4 9,3000 82, 9000 22 86. oo00 23.1ooo 36o000 23 38,[ooo H.30oo 37.50oo 24 42.9000 122,000o 60,5ooo 25 ~,7ooo )5,400o 28,2ooo

26 11, o00o 17,7ooo lifo000 27 51,8ooo 60.2o00 1o8. oooo

28 45,3000 3380000 180000 29 48. loo0 43.4ooo 42.0000 ~o 31.5ooo 31,3ooo t08. oooo 31 25,4o0o 2o, 2oo0 83, ooo0 32 48,100o 24.200o 21, oooo 33 33.70oo 45,1o0o 04, o0oo 34 22.5000 51. 6000 11, ooo0 35 16,6ooo 187, oooo 332,0ooo 36 25, gooo 57,[ooo 54, oooo 37 2o, 80oo 5o.o~o 19, o~o

Tab. 1

Die im eweils korrespondierenclen Bildausschnitt gemessenen Fl~chenanteile des Osteo dsaumes s nd in °/00 der Gesamtfl~che angegeben (Mitte]werte aus 2 getrennten Untersuchungen).

Methodik:

AIs Versuchstiere dienten englische Niederlaufhunde (Beagel). Aus dem Vorderlauf wurden Knochenproben mit einer oscillierenden S~ige entnommen und in ~,thanol-35-%igen Formalin (Vo- lumen 2 : 1) fixiert. Die Pr~parate wur- den in Methylacrylat eingebettet (BURK- HARDT 1966). Mit dem K-Mikrotom der Fa. JUNG wurden ca. 5# Knochenschnit- te angefertigt. AuSerdem wurden mit der Innenlochs~ge der Fa. METAL RE- SEARCH, London 120# dicke Knochen- schnitte hergestelit, die anschlieBend mit einer selbst entworfenen Schleif- vorrichtung auf ca. 50# herunterge- schliffen wurden. Diese Pr~iparate (:lien- ten zur Herstellung van Mikroradiogra- phien, die mit dem RSntgengenerator MIKRO 81 der Fa. PHILIPS-MOLLER, Hamburg unter Verwendung van KO- DAK H~GH RESOLUTION PLATES ange- fertigt wurden.

Die F~rbung der D~innschnitte e~olgte nach GOLDNER, VAN KOSSA und Soio- chrom-Cyanin (METRAJAT 1966).

Zusammenfassung :

Die automatische Fi~chenauswertung des Osteoid- saumes mit dem elektronischen Bildauswerter ,Mikrovideomat" bei 5 verschiedenen Ffirbungen (VAN KOSSA, GOLDNER und Solodlrom-Cyanin) ergibt keine signifikanten Unterschiede. Die Fl~dlenmessung kalkhaltiger Knochenstrukturen und die Verteilung kalkhahiger und n i ch t ka l k - h a h i g e r Substanzen (Histogramm) zeigten in naoh VAN KOSSA gef~irbten Knochenschnitten und Microradiographien keinen signifikanten Unterschied.

Summary:

No significant differences were apparent between three stained osteoid surface (GOLDNER, VAN KOSSA, Solochrome Cyanin) which were mea- sured by an automated image anatysor. There were a lso no significant differences in the measurement of total bone surface nor in the distribution of c a l c i f i e d and non-calcified tissue (histogramm) obtained from microradiographs and thin sections stained by VAN KOSSA d y e .

R6sum6:

L'6valuation automatique de la surface ost6oide effectu6e ~ I'aide du "Midrovideomat" 61ectro- n i q u e evec trois colorations differentes (VAN KOSSA, GOLDNER et solodirome-cyanine) ne rev6]e aucune distinction significative. La d6ter- mination des structures osseuses & haute teneur de calcium et ]a r6partition des substances ca lc i f i 6es et non calcifi6s (histogramme) ne montre aucune diff6rence dens les coupes os- seuses color6es selon le test VAN KOSSA et dans ]es microradiographies.

76 U n f a l l c h i r u r g i e 2, 7 6 - 7 9 (1975)

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Abb, 1 Abb. 2 Abb. 1 und 2 ldentische Bildausschnit[e eines nach GOLDNER gef~rbten Knochenschnittes. Abb. 1: Mikrofoto ohne VerlaufsfiIter Abb. 2: Mikrofoto mit VerJaufsfi]ter. Deutlich bessere Kontrastierung der HeII-Dunkelwerte dutch den Ver]aufsfilter. Vergr6Berung ca. 1 :8 .

Abb. 3 Ahl0. 3 und 4 ]dentische Bildausschnitte eines mlt Selochrom-Cyanin gef~rbten Abb. 3: Mikrofoto ohne Verlaufsfilter

Ahb. 4 Knochenschnittes~

Abb. 4: Mikrafoto rnit Verlaufsfilter aufgenommen [VergrSf]erung c a . 1:8) .

Abb. 5 Bildausschnitt aus einer Mikroradiographie eines teilweise verkalkten Pseud- arthrusenspaltes. Mikrofotevergr66erung ca_ 1:10, Dicke 60 ~.

Ahb. 6 Bildausschnitt eines nach VAN KOSSA gef~rbten Knochend0nnschnittes (5 p). Das- selbe Pr~parat wie Abb. 5: Ausschnitt aus einer teilweise verkalkten Pseud- arthrose. MikrofotovergrSfJerung ca. 1:10.

AIs Parameter der quantitativen Unter- suchungen diente das Gesamtosteoid. Die Fl~chen wurden mit dem Micro- videomat der Fa. ZEISS, Oberkochen, ausgewertet. *)

*) FLir die 0berlassung des Ger~tes sawie technische Hitfe danken wi t den Herren MOLLER, St., REME- LIUS, W., PRISOTH, KH., Fa. ZEISS, Oberkachen, Zweigniederlassung Frankfurt a. M.

Die jeweils zu analysierenden Struktu- ren werden entsprechend ihrer Hellig- keitswerte unterschieden. Bei den ge- f~irbten Pr/]paraten wurde ein mono- chromatischer Verlaufsfilter der Fa. ZEISS, Oberkochen in den Strahlen- gang des Mikroskopes gebracht, um eine optimale Kontrastierung zu erzie- fen. Die.HeII-Dunkelfarbt6ne im Pr~pa-

rat werden 0ber eine Schwarz-Wei~- Fernsehkamera in verschieden hohe elektrische Signale umgesetzt. Man legt mit elektronischen Diskriminatoren fiJr wei6, schwarz und grau die jeweilige H6he der Signale fest, die in einem an- geschlossenen ProzeBrechner ausge- wertet werden. ]e nach Programm las- sen sich Fl~chenmessungen, Teilchen-

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n VAN KOSSA (°/oo)

1 8ol, ooo

2 825, ooo

3 488,000

4 524,000

5 358,ooo

6 715, ooo

7 756,000

8 803,000

9 227,000

lo 257,000 11 36o,000

12 2o2,ooo

13 343,000

!4 335,000

Mikroradiographie (°/oo)

599 ooo

580 ooo

525 ooo

755 ooo

555 ooo

9oi ooo

600 ooo

652 ooo

380 ooo

29900o

54o, ooo

238, o00

!72,ooo 240,ooo

Tab. 2 Die im jeweifs korrespondierenden Bildausschnitt gemessenen kalksalzhaItigen Fi&chenanteife sind in °/aa zur Gesamtfl~che angegeben (Mittelwerte aus 2 getrennten Untersuchungen).

gr6Be- und Teilchenzahlbesfimmungen durchfOhren. Ober einen Mehrfachka- nalschreiber kann ein sogenanntes Hi- stogramm aufgezeichnet werden, clas die Verteilung der Helligkeitswerte Ober das gesamte Objektbild erkennen 1~6t.

Die vergleichende Fl~chenmessung zwi- schen nach VAN KOSSA gefSrbten Schnitten und Microradiographien wur- de wegen der besseren Beurteilbarkeit mit dem 2,50bjekt iv (Vergr66erung ca. 1 : 10) durchgefLihrt. Die Bildauswer- tung jeweifs entsprechender und ver- schieden gef~rbter Prgparateste[len er- folgte mit einem 6,50bjektiv (Vergr6- 6erung ca. 1 : 25).

Zur Signifikanzpr(Jfung des Vergleichs der einzelnen F~rbungen wurde der FRIEDMANN-Test for den Fall mehrerer verbundener Stichproben verwendet. FOr den Vergleich von Microradiogra-

Abb. 7 Abb. 8

Abb. 7 un4 Histogramm des in Abb. 5 und 6 da'gestellten Pseudarthrosenspaltes. Das Histogramrn in Abb. 7 zeigt die Verteilung der im nach VAN KOSSA angef~rbten Knochenschnitt schwarz gef~rbten ka]khahigen Strukturen. Abb. 8 zelgt die Verteilung karkha]tiger Substanzen in der Mikrorad;ographie (identische Pr~parateste]le).

Abb. 9 Abb. 18

Abb. 9 ~ad 18 Histogramme Liber einen teilweise verkalkten Pseudarthrosenspalt wie in Abb. 5 und 6 dargestellt. Abb. 9 zeigt das Histogramrn, das yon einem VAN KOSSA Pr~parat gewonnen wurde, Dargestel]t in die Verteilung der nic,ht kaIkhaltigen Substanzen. Abb. 10 zeigt die Verteilung nicht kalkhaltiger Substanzen in der iviikroradiagraphie,

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phien mit den nach VAN KOSSA ge- fbrbten Schnitten wurcle der nicht para- metrische WILCOXON-Test for Paar- differenzen angewandt. Bei beiden sta- tistischen Pr(Jfungen wurde als Signifi- kanzniveau p = 0,1 gesetzt.

Ergebnisse:

Der Vergleich der anteilm~13igen Fl~i- chen des Osteoidsaumes mit den nach GOLDNER, nach VAN KOSSA und mit Solochrom-Cyanin gef~rbten Knochen- schnitten (Abb. 1, 2, 3 und 4 und Ta- belle 1) ergibt keinen signifikanten Un- terschied (X 2 0,05; p ~ 0,1).

Die GegeniJberstellung yon Microra- diograp.hien und nach VAN KOSSA ge- f~rbten Knochenschnitten zeigt eben- falls keinen signifikanten Unterschied (Tab. 2 und Abb. 5, 6) in der Fi~chen- messung der verkalkten Strukturen (R -- 15; p ~ 0,1).

Die Histogramme der Microradiogra- phie und der nach VAN KOSSA gef~irb- ten Knochenschnitte lessen ein nahezu identisches Verteilungsmuster der kalk- haltigen und der nichtkalkhaltigen Strukturen erkennen (Abb. 7, 8, 9 und 10).

Diskuss~on:

Die Ergebnisse zeigen, dab sich die in der Histomorphometrie der Knochen- gewebe gebr~uchlichen F~irbemetho- den mit geeigneten Kontrastierungsver- fahren (Monochromatischer Verlaufsfil- ter) zur vollautomatischen Bildauswer- tung unter dem Mikroskop eignen. Bei unseren Untersuchungen erwiesen sich

alle angewandten FSrbeverfahren zur automatischen Fl~chenausmessung des Osteoids gleicherma13en verwertbar. MEUNIER (1975) dagegen fand in sei- nen Untersuchungen der Fl~chenmes- sung des Osteoidsaumes mit Hitfe des Punktz~ihlverfahrens zwischen der F~ir- bung nach GOLDNER auf der einen Seite und der F~rbung mit Solochrom- Cyanin und nach VAN KOSSA auf der anderen Seite einen signifikanten Un- terschied. Die Fl~chen des nach GOLD- NER angef~rbten Osteoids zeigten ge- ringere Werte, die MEUNIER auf die Unregelm~f}igkeit der Anf~irbung des Osteoidsaumes bei der F~rbung nach GOLDNER zurL~ckf~hrt.

Nach unseren Erfahrungen zeigt sich die unterschiedliche Anf~irbung des Osteoidsaumes nicht allein bei der F~r- bung nach GOLDNER. Diese Eigen- schaft findet sich ebenso bei allen an- deren F~rbemethoden, da die unter- schiedliche Anf~irbung des Osteoids yon der Art der Fixierung, der Einbet- tung, der Schnittdicke des Pr~iparates, der Zeitdauer der F~rbung sowie vom VerLinnungsverh~ltnis der einzelnen Farbstoffe und dem pH-Wert der F~r- bel6sung abh~ngt. Wir konnten mit der yon uns durchgefiJhrten Fixierung, Ein- bettung und F~rbung diese unterschied- liche Einf~rbbarkeit des Osteoidsaumes weitgehend vermeiden.

Der Vorteil der Fi~ichenmessung mit dem ,Microvideomaten" besteht darin, de6 die Untersucher-bedingten Fehler- m~glichkeiten ausschlieBlich bei der Einstellung der Helligkeitswerte ent- stehen k6nnen und die weitere Aus-

wertung unabh~ngig vom Untersucher abl~uft_ Neben der Festlegung der Hel- ligkeitswerte spielt der vonder F~r- bung und HersteHung des Schnittes ab- h~ngige Helligkeitskontrast zwischen den gemessenen Strukturen eine be- deutende Rolle. Bei unseren Untersu- chungen wurden die Pr~iparate yon 2 Untersuchern getrennt ausgewertet. Die Ergebnisse zeigten geringgradige Ab- weichungen. M6gliche Fehlerquellen bei der Einstellung der Helligkeitswerte sind somit u. E. gering.

Die vergleichende Fl~chenmessung ver- kalkter Strukturen bei Microradiogra- phien und nach VAN KOSSA gef~irbten Schnitten zeigen, dab die F~rbung nach VAN KOSSA ebenso zur Bestimmung des Mineralisationsgrades herangezo- gen werden kann. FOr die Beurteilung von Serienschnitten eignen sich u. E. die nach VAN KOSSA angefertigten D(Jnnschnitte besser ats die wesentlich dickeren Pr~parate fLir die Microradio- graphie. Dennoch zeigen die Histo- gramme, dab sich die Verteilung kalk- haitiger und nicht kalkhaltiger Substan- zen zwischen den nach VAN KOSSA angefertigten Schnitten und den Micro- radiographien nicht wesentlich unter- scheidet.

Die automatische Auswertung unter- schiedlich gef~rbter Knochenschnitte und Microradiographien mit dem Micro- videomaten ist nach unseren bisherigen Erfahruncjen eine geeignete und zeit- lich wenig aufwendige Methode zur Histomorphometrie.

Literatu rverzeichni$:

BURKHARDT, R.: Praeparative Voraussetzungen zur klinischen Histologle des menschlichen Knochenmarks I und II. Blut, Band I3, 337 (1966) u Band 14, 30 (1966) FROST, H. M.: Microscopy: Depth of focus, optical sectioning and integrating eyepiece measurement. Henry Ford Hosp. Med. Bull. Vo]_ 10, 267 (1962.} GLAGOLEW, A. A.: On the geometrical methods of quantitative mineralogic analysis of rocks. Trans. Inst. Eccon, Mineraf (Moscow.} 59, I (1933) HENNIG, A.: Kritlsche Betradltungen zur Volumen- und Oberfi~chenmessung in der Microskopie. Zeiss Werkzeitschrift 38, 78 (1958) ]OWSEY, ].: Quantitative microradiographlc studies of normal and osteo- pototic bone. ], Bone ]t Surg. 47, 785 (1965) MERZ, W. A.: Die Streckenmessung an gerichteten Strukturen im Mikroskop und ihre Anwendung zur Bestimmung yon Oberfl~chen-Volumen-Relatlonen im Knochengewebe. Mikroskopie 22, 132 (1967.} METRAJAT, H., O. HIOCO: Solochrome eyanin as an indicator dye of bone morphology, Stain Technol. 41, 97 (1966) MEUNIER, P., P. EOUARD, P. COUPRON, F. TOUSSAINT: Morphometric analysis of osteoid it, iliac trabecular bone. Methodology. Dynamical significance of

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Ansdnri{t der Verfasser: Prof. Dr. A. PANNIKE und Mitarbeiter Abt. f. Traumatologie am Klinik~m der ]ohann-Wolfga ng-Goethe-Universitat Frankiurt/M.

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