Folie 1
Varian-Seminar Juni 2005
Einsatz der HPLC-MS(-MS) in der Pestizidanalytik
Ellen Scherbaum
Ein Praxisbericht
Folie 2
Varian-Seminar Juni 2005
Gliederung
Ziele des CVUA StuttgartGerätetechnik LC-MS(-MS)Applikationen ValidierungMatrix-EffekteErgebnisse aus der Lebensmittelüberwachung
Folie 3
Varian-Seminar Juni 2005
Ziele
So einfach wie möglich, so viel wie möglich, so gut wie nötig
Möglichst viele Stoffe mit einer einfachen Multimethode erfassenEinen Extrakt sowohl für die GC- als auch für die LC-BestimmungenMatrix-orientiertes StoffspektrumMatrixeinflüsse bei der Chromatographie berücksichtigen (Standard-Addition bei HMÜ)
Folie 4
Varian-Seminar Juni 2005
QuEChERS
Anastassiades et al.EPRW 4, Rom 2002
10 g gefrorene Probe einwiegen
Intensiv schütteln 1 minIntensiv schütteln 1 min
Schütteln, ZentrifugierenSchütteln, Zentrifugieren
Zugabe der ISTD-Lösung
Schütteln, ZentrifugierenSchütteln, Zentrifugieren
Take Aliquot and Add to MgSO 4 & SPE Sorbent
Zugabe von 10 mL Acetonitrile
Zugabe von 4 g MgSO 4 / 1 g NaCl / 1 g Na3Citrat / 0.5 g Na 2HCitrat (pH 5-5.5)
10 µL 5% HCOOH in ACN / mL Extrakt zugeben(um basenempfindliche Stoffe zu schützen)
Optional: Zugabe von “Analyte Protectants”Multimethoden
mittels GC-MS, LC-MS
Optional: Säuren mittels LC-MS
Sehr großes Stoffspektrum
Extrakt direkt für GC- und LC-MS
geeignet
Folie 5
Varian-Seminar Juni 2005
GC oder LC-MS?
API Electrospray
Molekulargew
icht
Analyt-Polarität
1000
100,000
10,000
unpolar stark polar
APCI
GC/MS
Folie 6
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS/MS - Schematischer Aufbau
Ionen-Produktion - Quelle
Fragmentierung
Ionen-Selektion – Q3
Ionen-Detektion
Ionen-Selektion – Q1
Ionen-Transport - ins MS
Folie 7
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS - Schematischer Aufbau
Ionen-Produktion - Quelle
Fragmentierung
Ionen-Selektion – Q
Ionen-Detektion
Ionen-Selektion – Q1
Ionen-Transport - ins MS
HP 1998
Nebulizer
+ + ++
+++ + + ++ +
+
QuadrupoleLensesFragmentation zone (CID)
Capillary Octopole
3 Torr 1 x 10 -5 Torr
HP 1998
Nebulizer
+ + ++
+++ + + ++ +
++ + +
+++
+ + + ++ ++
++ ++ ++++
++++++ ++ ++ ++++ ++
++
QuadrupoleLensesFragmentation zone (CID)
Capillary Octopole
3 Torr 1 x 10 -5 Torr
Folie 8
Varian-Seminar Juni 2005
API, Elektrospray-Technik, ESI
TaylorCone
Folie 9
Varian-Seminar Juni 2005
ESI
Folie 10
Varian-Seminar Juni 2005
ESI
Folie 11
Varian-Seminar Juni 2005
ESI
Rayleigh Limit erreicht
Folie 12
Varian-Seminar Juni 2005
ESI
Folie 13
Varian-Seminar Juni 2005
Solution Chemistry
PositiverModus
Negativer Modus
R1 R1| |
:N - R2 + HA +HN - R2 + A-
| |R3 R3
Base Säure Analytion
O O|| ||
R-C-OH + :B R-C-O - + H:B+
Säure Base Analytion
Elektrospray: Analytionen müssen in Lösung vorliegen!
Folie 14
Varian-Seminar Juni 2005
Solution Chemistry
� Positive IonendetektionpH-Wert erniedrigen durch Zusatz
von� Ammoniumacetat, -formiat
2-20 mmol, pH 4-5� Essigsäure, Ameisensäure
0,1-1 %, pH 2-4
� Negative IonendetektionpH-Wert erhöhen durch Zusatz
von� Ammoniak 0,1-1 %
++
++
+++
+ + + + + + + + + + + + +
+
+
-5,000 V
Folie 15
Varian-Seminar Juni 2005
ESI – Quasi Molekülionen und Addukte
Positive Ionendetektion[M+H]+
[M+Na]+, [M+K] +
[M+NH4]+
Negative Ionendetektion[M-H] -
[M+HCOO] -, [M+CH3COO]-
++
++
+++
+ + + + + + + + + + + + +
+
+
-5,000 V
Schonendste Ionisierungsart in der LC-MS
Folie 16
Varian-Seminar Juni 2005
APCI, APPI-Quellen
APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization
Corona Nadel, Ionisierung über Lösungsmittel-moleküle
Nach BfR nur für 5 % der Substanzen höhere Empfindlichkeit
APPI: Atmospheric Pressure Photo Ionization
UV-Lampe
geeignet für sehr unpolare Substanzenwie PAKs
Folie 17
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS – Detektion der Fragmente
M n [M]+
1
[M]2
+
Fragmentor-Voltage
QuadrupolKapillare
Fragmentieruns-zone 439
467
684.65Fragmentorspannung = 175 V
Folie 18
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS/MS – Multiple Reaction Monitoring
Q1 Kollisionszelle Q3
Folie 19
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS(/MS) – Wieviele Massen oder Übergänge?
Geräte sind in ihrer Leistungsfähigkeit begrenzt (z.B. 100 Übergänge)
Je nach Fragestellung gibt es 2 Ansätze:
Möglichst viele Stoffe in einem Lauf: 1 Übergang pro Stoff, Zeitfenster
Große Sicherheit, wenig Nachuntersuchungen: mind. 2-3 Übergänge pro Stoff, dafür mehrere Läufe (Methoden)
Folie 20
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS(/MS) – Wieviele Massen oder Übergänge?
M+H=318
Phosmet
160
77
M+H=318
Azinphos-methyl
160
77
Ein Übergang ist für einen Befund nicht ausreichend!!
Folie 21
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS(/MS) – Probe in Acetonitril?
Für die meisten Stoffe ist eine direkte Injektion des Acetonitril-Extraktes möglich.
Lediglich einige polare Verbindungen ergeben eine unbefriedigende Peakform. In diesen Fällen versetzen wir den Extraktim Autosampler des HPLC automatisch mit Fließmittel A und spritzen die doppelte Menge ein.
Folie 22
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS(/MS) – Welche Massen und Übergänge?
Es gibt zahllose Publikationen mit vorgeschlagenen Übergängen und Geräteparametern.
• www.bfr.bund.de/cd/5831: 304 Pestizide, jeweils mit 2 Übergängen einschließlich Geräteparameter zum download
•www.pesticides-online.comWirkstoff-Datenblätter für mehrere Hundert Pestizide einschließlich vorgeschlagener Massenund Übergänge
Folie 23
Varian-Seminar Juni 2005
LC-MS(/MS) – Welche Massen und Übergänge?
Folie 24
Varian-Seminar Juni 2005
Routine-Applikationen
N-MethylcarbamateBenzoylharnstoff-InsektizideDiacylhydrazineOrganozinn-VerbindungenPolare PhosphorsäureesterChlormequat/MepiquatBasische FungizideNeonicotinoideMacrocyclenPhenylharnstoff-HerbizideTriazineTriazolePhenoxyalkancarbonsäuren
Folie 25
Varian-Seminar Juni 2005
Säulen / mobile Phasen
Zorbax XDB C18150 x 2,1 mm 3,5 µm
0,01 % Essigsäure in Wasser/Acetonitril
LC-MS/MSESI neg.
Herbizide1Phenoxys
Zorbax XDB C18150 x 2,1 mm 3,5 µm
Zorbax XDB C8150 x 4,6 mm 3,5 µm
Zorbax XDB C18150 x 2,1 mm 3,5 µm
Zorbax XDB C18150 x 2,1 mm 3,5 µm
Aqua C18 150x2 mm; 3µ; 125 A;
5 mmol NH4Formiat in Wasser/Methanol
LC-MS/MSESI pos.
Herbizide2
5 mmol NH4Acetat in Wasser /Acetonitril
LC-MSESI neg.
Benzoyl-Harnstoffe
10 mmol NH4Formiat in Wasser /Methanol pH 4
LC-MSESI pos.
Neonics und QSM
10 mmol NH4Formiat in Wasser /Acetonitril pH 4
LC-MS/MSESI pos.
Macrocylen
5 mmol NH4Formiat in Wasser/Methanol
LC-MS/MSESI pos.
Triazole
Folie 26
Varian-Seminar Juni 2005
Säulen / mobile Phasen
LC-MS/MSESI pos.
LC-MS/MSESI pos.
LC-MSESI pos.
LC-MS/MSESI pos.
LC-MSESI pos.
Zorbax XDB C18150 x 2,1 mm 3,5 µm
5 mmol NH4Acetat in Wasser/Acetonitril
NMC
MonoChrom MS 5 µ 25 mmol NH4Acetat0,1 % Essigsäure, Acetonitril
ChlormequatMepiquat
Zorbax XDB C1850 x 2,1 mm 3,5 µ
5 mmol NH4Formiat in Wasser/Methanol, 1 % Ameisensäure
Organozinns
Gemini C18150 x 2,0 mm 5 µ
5 mmol NH4Acetat in Wasser/Methanol
Basische Fungizide
Aqua C18150 x 2 mm 3 µ
5 mmol NH4Formiat in Wasser/Methanol
Polare
Folie 27
Varian-Seminar Juni 2005
Nachweisgrenzen
BG mg/kgNG mg/kgStoffe
0,003-0,006
0,002-0,004
0,003
0,008-0,01
0,002-0,004
0,004-0,008
0,001-0,005Polare
0,005-0,01 Neonicotinoide
0,001-0,01 Basische Fungizide
0,003-0,007 Macrocyclen*
0,005 Acephat/Methamidophos
0,013-0,02 Organozinn-Verbindungen
0,003-0,007 Diacylhydrazine
0,008-0,014 Benzoylharnstoff-Insektizide
0,002-0,01 N-Methylcarbamate
*außer Milbemectin
Folie 28
Varian-Seminar Juni 2005
Beispiel-Chromatogramm
Paprika 2 g/ml Benzoyl-Harnstoff-Pestizide 0,1 ppm
min4 5 6 7 8 9
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
Flufenoxuronm/z 487
IS PCPm/z 265
Diflubenzuronm/z 309
Teflubenzuronm/z 379
Lufenuronm/z 509
Triflumuronm/z 357
Hexaflumuronm/z 459
Folie 29
Varian-Seminar Juni 2005
Validierung
EU-PT 4-6
Pestizid EU PT 4-6
Anwendung Dotiert mg/kg
CVUA S mg/kg
Median mg/kg
Carbofuran 0,14 0,15 0,13 Imazalil 0,94 0,76 0,69 Imidacloprid ja 0,15 + A 0,2 0,16 Methamidophos ja 0,11 0,09 Acephat ja 0,10 0,12 Diazinon 0,12 0,12 0,11 λ-Cyhalothrin ja 0,14 + A 0,19 0,19 Malathion ja 0,10 + A 0,07 0,07 Mevinphos 0,20 0,16 0,17 Omethoat 0,05 0,04 0,04 Oxydemeton-me 0,20 0,17 0,17 Parathion 0,26 0,26 0,22 Phosmet 0,20 0,20 0,17 Propyzamid ja 0,34 + A 0,45 0,39 Tolclofos-methyl 0,51 0,48 0,43 Azoxystrobin 0,23 0,23 Dimethoat 0,13 0,13 Imazalil 0,16 0,17 Imidacloprid 0,23 0,23 Oxydemeton-me 0,24 0,20 Thiabendazol 0,33 0,31
Folie 30
Varian-Seminar Juni 2005
Matrixeffekte
zeitlich konstantzeitlich nicht konstant
stark abhängig von chromat. Trennung
chromat. Trennung ohne Einfluss
MatrixabhängigMatrixabhängig
vom Analyt abhängigvom Analyt abhängig
in der Regel Signalsuppression
in der Regel Signalerhöhung
nach der Säulev.a. im Injektor
LC-MS (ESI)GC-MSD (Quadrupol)
Folie 31
Varian-Seminar Juni 2005
Matrixeffekte - Beispiel
0
50
100
150
200
250
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
2 g/ml
1 g/ml
0,5 g/ml
0,25 g/ml
0,125 g/ml
ohne Matrix
TPP Konzentration [µg/ml]
Fläche
Matrix
Folie 32
Varian-Seminar Juni 2005
Matrixeffekte - Abhilfe
•Verdünnen
•Injektionsvolumen reduzieren
Bedingung: empfindliche Geräte
Matrixeffekte werden nur reduziert!
Man braucht wie immergut ausgebildeteaufmerksame Mitarbeiter!
Matrix-Kalibrierung!
Folie 33
Varian-Seminar Juni 2005
Matrixeffekte - Abhilfe
Folie 34
Varian-Seminar Juni 2005
Matrixeffekte - Abhilfe
Folie 35
Varian-Seminar Juni 2005
Matrixeffekte - Abhilfe
BfR: Reduzierung der
Matrix-Effekte 50 %
Folie 36
Varian-Seminar Juni 2005
Matrixeffekte - Abhilfe
Flächenverhältnis Analyt/ISTD
zugegebene Menge an Analyt (Aufstockung)||||x ||||
||||x ||||: absolute Menge an Analyt im Probenextrakt vor der Dotierung (y=0)
y-Achsenabschnitt׀x׀ =
Steigung der Geraden
Wenn es drauf ankommt: Standardaddition
Folie 37
Varian-Seminar Juni 2005
2004 –Rückstands-Befunde
2277 (42 %)
861 (41 %)
1416 (43 %)
Befunde LC
54253148Gesamt1485 Proben
2110(3,3/Probe)
1249Gemüse641 Proben
3315(3,9/Probe)
1899Obst844 Proben
Befunde GesamtBefunde GC
Matrix
Folie 38
Varian-Seminar Juni 2005
2004 - Höchstmengenüberschreitungen
269(68 %)
150 (68 %)
119 (67 %)
HMÜs LC
397128Gesamt1485 Proben
22070Gemüse641 Proben
17758Obst844 Proben
HMÜs Gesamt
HMÜs GC
Matrix
Folie 39
Varian-Seminar Juni 2005
LC-Befunde - Entwicklung
269 (68 %)
56 (35 %)
davon LC-Substanzen
NMC, Basische, CCC, Ozinn, Ozide, BUs,
Azole, Polare, Ureas, Triazine etc.
3972004
Basische, Ozinn, BUs, Methamidophos
1582000
Erfasste LC-Stoffklassen
Stoffe über Höchstmenge
Jahr
Folie 40
Varian-Seminar Juni 2005
Befunde - 2005
> Höchst-menge
KulturenBefundeStoffgruppe
4 HMÜsSolanaceen, Kernobst
15 malBenzoyl-Harnstoffe
10 HMÜsSolanaceen, Zucchini, argent. Äpfel
22 malSpinosad
31 HMÜsSalate, Solanaceen, Tafeltrauben
146 malNeonicotinoide
670 Proben
Folie 41
Varian-Seminar Juni 2005
Befunde - 2005
> Höchst-menge
KulturenBefundeStoffgruppe
3 HMÜsviele verschiedene185 malTriazole
1 mal nicht zugelassen
Kräuter, Salate, Karotten, Sellerie
44 malPhenyl-Harnstoffe
1 HMÜSpargel, Sellerie10 malTriazine
3 HMÜs(Oxamyl)
viele verschiedene46 malCarbamate
670 Proben
www.pesticides-online.com
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Varian-Seminar Juni 2005
...herzlichen Dank
dem pestis-team am cvua stuttgart
und Ihnen für die Aufmerksamkeit.