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Page 1: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung von

Tramadol-Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-

Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Diplom-Chemiker

Carsten Griebel

aus

Niebüll

Berichter: Universitätsprofessor Dr. H.-J. Gais

Universitätsprofessor Dr. D. Enders

Tag der mündlichen Prüfung: 13. Dezember 2002

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

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Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 am

Institut für Organische Chemie der Rheinisch Westfälischen Technischen

Hochschule Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais angefertigt.

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„Wenn wir wüßten, was wir tun,

würden wir das nicht Forschung nennen.“

(Albert Einstein)

Page 4: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

Danksagung

Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemie

der RWTH Aachen bedanken. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H.-J. Gais für die

engagierte Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit, die interessanten und anregenden

Diskussionen sowie für die Bereitstellung der ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. Allen

Arbeitskreismitgliedern danke ich für die angenehme und freundschaftliche

Arbeitsatmosphäre, die stete Diskussionsbereitschaft sowie für die gute Zusammenarbeit.

Für die hilfreichen Anregungen bei der Fertigstellung der vorliegenden Arbeit danke ich

Herrn Dipl.-Chem. Stefan Koep.

Bei Frau Ing. Cornelia Vermeeren möchte ich mich besonders für die Lösung einer Vielzahl

von Trennproblemen und für ihre stete Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gebührt

auch Frau Magdalena Grosch und Frau Ursula Ripkens für die durchgeführten HPLC-

Trennungen.

Für die Ausführung von analytischen Aufgaben möchte ich mich bei Frau Dittrich, Frau

Glensk, Frau Kuyper, Frau Müller, und Herrn Dr. Runsink bedanken und für die Abwicklung

organisatorischer Aufgaben bei Frau Bertrand, Frau Renardy, Herrn Dr. Bettray und Herrn

Dr. Geibel.

Meiner Forschungspraktikantin Frau Dipl.-Chem. Martina Mennicken danke ich für ihre

präparative Unterstützung und engagierte Mitarbeit.

Ein großer Dank gebührt auch den Mitarbeitern der Grünenthal GmbH, die mich hilfsbereit

unterstützt haben. Im besonderen möchte ich Herrn Dr. Helmut Buschmann für seine

engagierte Unterstützung dieser Arbeit danken, ebenso Herrn Heinz-Günter Döteberg, Herrn

Dr. Michael Finkam, Herrn Dr. Bernd Sundermann, Herrn Dr. Oswald Zimmer und nicht

zuletzt denjenigen Mitarbeitern, die es ermöglicht haben, daß mir die benötigten Substanzen

zur Verfügung gestellt werden konnten.

Ganz besonders möchte ich mich herzlich bei meiner Familie und meinen Freunden

bedanken, die mich während meiner Promotionszeit unterstützt haben.

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Teile dieser Arbeit wurden auszugsweise publiziert in:

Enzymatic resolution of analgesics: δ-hydroxytramadol, ε-hydroxytramadol and

O-desmethyltramadol. H.-J. Gais, C. Griebel, H. Buschmann, Tetrahedron:

Asymmetry 2000, 11, 917-928.

Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Aminomethyl-Aryl-

Cyclohexanol-Derivaten. H. Buschmann, D. Kaulartz, C. Griebel, H.-J. Gais,

DE 10004926 A1, 04.02.2000 und WO 01/57232 A1, 09.08.2001; Chem. Abstr.

2001, 135, 179820.

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Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII

1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1

1.1 Opioide Analgetika 3

1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga 7

1.3 Zielsetzung 11

2 THEORETISCHER TEIL 13

2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-Katalysator Präparation 13

2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga 16 2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen 24

2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 26 2.3.1 Kinetische Racematspaltungen 26 2.3.1.1 Der E-Wert 29 2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien 35 2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der

enzymatischen Hydrolyse 38 2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der

enzymatischen Transacylierung 39 2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 42 2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen 42 2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino-

methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) 49 2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylamino-

methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 59 2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 63 2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-

1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 73 2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl-

amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) 75 2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen 77 2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-

methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 82 2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-

1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 93 2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-

4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 104

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VERZEICHNISSE II

2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-

6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 108 2.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-

methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 113 2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethyl-

aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 120 2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-

methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 138 2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen

Maßstab 140 2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-

1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 144 2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen 154 2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-

3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 155 2.5 Zusammenfassung 158

2.6 Ausblick 163

3 EXPERIMENTELLER TEIL 164

3.1 Allgemeine Vorbemerkungen 165 3.1.1 Eingesetzte Computerprogramme 165 3.1.2 Analytische Methoden und Geräte 165 3.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien 170 3.1.4 Verwendete Proteine 170 3.1.5 Besondere Arbeitstechniken 173 3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen 174 3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE 174 3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE 174 3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung 176 3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 176 3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1) 176 3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen

(AAV 2) 176 3.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von

Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3) 177 3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den

racemischen Basen (AAV 4) 177 3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung 178 3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexanol (rac-7) 178

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III VERZEICHNISSE

3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-

phenol (rac-8) 179 3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-

phenol (rac-11) 180 3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 181 3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 183 3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 184 3.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse 185 3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-

cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 185 3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-

cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 186 3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-

1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 187 3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 189 3.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 190 3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-

cyclohexyl)-phenol (rac-20) 191 3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl-

1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 193 3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-

4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 194 3.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-

4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 195 3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-

4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 197 3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-

methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 198 3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der

enzymatischen Transacylierung 199 3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47) 199 3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46) 200

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VERZEICHNISSE IV

3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-

4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 201 3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45) 203 3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-Dimethylaminomethyl-1-

(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-nonan-3-on (rac-48) 204 3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-(trichlormethyl)-carbonat 204 3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol 205

3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 207 3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen

Substrat Ester (AAV 5) 207 3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 207 3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 207 3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23 208 3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16 208 3.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24 209

3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen 210

3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen

Medium 214 3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 214 3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen

System (AAV 6) 214 3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-organischen

Zweiphasen System (AAV 7) 214 3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen

Lösungsmitteln (AAV 8) 215 3.6.2 Berechnung des E-Werts 216 3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 217 3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter

Zusatz von Aceton als Cosolvens 217 3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 217 3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur

Darstellung von (+)-15 218 3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem 219 3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 219 3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem 220 3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 220 3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221

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V VERZEICHNISSE

3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221 3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 222 3.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit

roher CRL 222 3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen-

system mit roher CRL 223 3.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen-

system mit aufgereinigter CRL 224 3.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 224 3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir

roher CRL 224 3.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei

pH 7.0 225 3.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei

pH 8.0 225 3.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 226 3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung

verschiedener Lipasen 226 3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 227 3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 228 3.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 229 3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat 230 3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 230 3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-

1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 231 3.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem 231 3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit

roher CRL 232 3.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl-

amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung

verschiedener Lipasen 232 3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-

methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 233 3.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 233 3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 234 3.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen-

system 235 3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen-

system mit extraktiver Aufarbeitung 236

Page 11: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VERZEICHNISSE VI

3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen

Einphasensystem 237 3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasen-

system 237 3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-

1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 238 3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit

Isopropenylacetat 238 3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 238 3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 239 3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 241 3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 242 3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 243 3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-

4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 244 3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung

verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem 244 3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem 245 3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasen-

system 246 3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethyl-

aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 246 3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter

Verwendung verschiedener Lipasen 246 3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 247 3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz

von Triethylamin 248 3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-

methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 249 3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249 3.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249 3.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 250 3.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen Zweiphasen-

system 250 3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino-

methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 251 3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem 251 3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-

system 252

Page 12: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VII VERZEICHNISSE

3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-

system 252 3.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 253 3.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen Zweiphasen-

system 253 3.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 254 3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit

extraktiver Aufarbeitung 255

3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen Einphasensystem 256

3.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 256 3.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-

system unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 257 3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22

(rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem 258

3.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-

methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 261 3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasen-

system mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion 261 3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-

1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 262 3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 262 3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat 263 3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat 264 3.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat 267 3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 267 3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 268 3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 268 3.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-

3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 269 3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen

Einphasensystem 269 3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 269

3.7 Anhang zum experimentellen Teil 271 3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von

Buttersäureethylester 271

4 LITERATUR 272

Page 13: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VERZEICHNISSE VIII

Abkürzungsverzeichnis

AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift

Abb. Abbildung

AChE Acetylcholinesterase

abs. absolut

APT attached proton test

Äq. Äquivalent

BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)

BCL Burkholderia cepacia Lipase

c Umsatz (conversion)

d Duplett

d Tag

dest. Wasser vollentmineralisiertes Wasser

CAL-B Candida antarctica Lipase, Typ B

CE Cholesterolesterase

CRL Candida rugosa Lipase

CVL Chromobacterium viscosum Lipase

Da Dalton

DC Dünnschichtchromatographie

DCM Dichlormethan

DiBAl-H Diisobutylaluminiumhydrid

E-Wert Selektivitätsparameter nach Chen und Sih

(Enantiomeric Ratio)

ee Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess)

EE Essigsäureethylester

Et Ethyl

EtOH Ethanol

GC Gaschromatographie

ges. gesättigt

h Stunde

HLE Pferdeleber-Esterase (horse liver esterase)

HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie

HV Hochvakuum

J Kopplungskonstante

Page 14: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

IX VERZEICHNISSE

KOtBu Kalium-tert-butylat

log P-Wert Logarithmus des Verteilungskoeffizienten eines

Lösungsmittels zwischen Oktanol und Wasser

m Multiplett

MeOH Methanol

Min. Minuten

MPEG Polyethylenglykolmonomethylether

MPEG/PLE Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase und Poly-

ethylenglykolmonomethylether

MTBE tert-Butyl-methylether

MW Molekulargewicht

n. b. nicht bestimmt

NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear

magnetic resonance)

PLE Schweineleber-Esterase (porcine liver esterase)

PLE/BSA/MPEG Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase, Poly-

ethylenglykolmonomethylether und Rinderserum-

Albumin

PPL Schweinepankreaslipase (porcine pancreatic lipase)

ppm parts per million

Pr Propyl

PrOH Propanol

Rf Retentionsfaktor (ratio of fronts)

Rfl. Rückfluß

RT Raumtemperatur

s Singulett

Smp. Schmelzpunkt

TEA Triethylamin

TMS Tetramethylsilan

t Triplett

tR Retentionszeit

U Aktivitätseinheit (Units)

wfr. Wasserfrei

Page 15: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

1 Einleitung und Zielsetzung

Enzymatische Transformationen gehören mittlerweile zu den Grundoperationen der

präparativen organischen Chemie. Es sind bis heute zahlreiche industrielle Prozesse

mit enzymatischen Schlüsselschritten etabliert, die weit über die enzymatische

Racematspaltung von Aminosäurederivaten hinausgehen.1,2 Die Vorteile von

Biokatalysatoren liegen vor allem in den milden Reaktionsbedingungen, dem damit

verbundenen geringeren Sicherheitsrisiko3 und der geringen Neigung zur Bildung

von Nebenprodukten, da sie Prozesse mit hoher Chemo-, Regio- und

Stereoselektivität katalysieren.

Enzyme aus der Klasse der Hydrolasen (Lipasen, Proteasen u. a.) sind für

technische Anwendungen besonders interessant, da sie in großer Zahl kommerziell

erhältlich sind4, zur Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität keine teuren und eventuell

zu regenerierenden Cofaktoren benötigen und ein breites Substratspektrum

akzeptieren.5,6,7,8 Lipasen werden zur Modifizierung von Fetten, zur Synthese von

Estern und zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt.9,10,11 Hierbei ist die

Stabilisierung und effektive Immobilisierung der Enzyme zur Erhöhung der

Betriebsstabilität, zur leichten Abtrennung und zur Wiederverwendung bei der

absatzweisen Reaktionsführung von besonderer Bedeutung.9 Als aktuelle Methoden

zur Stabilisierung von Enzymen sind vor allem die von der Firma ALTUS entwickelte

Quervernetzung von Enzymkristallen (CLECs)12,13 und das von REETZ et al.

entwickelte Verfahren zum Einschluß von Enzymen in hydrophobe Sol-Gele14,15 zu

nennen. Alternativen zur Immobilisierung von Enzymen auf unlöslichen Trägern

stellen Systeme zur Enzymrückhaltung wie Enzym-Membran-Reaktoren (EMR)16,17

oder die von der Firma SEPRACORE entwickelten Hohlfasermodule18,19 dar.

Der Einsatz von nicht-wäßrigen Reaktionsmedien eröffnet der Enzymkatalyse den

Zugang zu einer Vielzahl von neuartigen Anwendungen.20,21 In Zukunft wird auch der

Einsatz von Enzymen, die durch Mutationen optimiert wurden, eine wichtige Rolle

spielen. Solche Mutationen können zufällig eingeführt werden, so daß in einem

anschließenden Selektionsverfahren dann Enzyme mit verbesserten Eigenschaften

identifiziert werden können (directed evolution).22 Mutationen können auch gezielt

vorgenommen werden, nachdem anhand der Proteinstruktur Aminosäuren

identifiziert wurden, deren Austausch verbesserte Eigenschaften erwarten läßt.23

Page 16: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Die Wirkstoffsynthese in der medizinischen Chemie ist ein ideales Einsatzgebiet für

biokatalytische Methoden.10,24 Viele Wirkstoffe sind chiral, und es muß mit

unterschiedlicher biologischer Aktivität der Enantiomeren gerechnet werden.25 Ein

Racemat wird daher als Gemisch zweier Wirkstoffe behandelt. Nur wenn beide

Enantiomere annähernd identische Wirkung aufweisen oder synergistische Effekte

zwischen den beiden Wirkstoffe bestehen, kann ein Racemat als Medikament

zugelassen werden. Ausnahmen sind Substanzen, die unter physiologischen

Bedingungen racemisieren oder Substanzen die metabolisch deracemisiert werden,

wie beispielsweise das Ibuprofen: (R)-Ibuprofen wird unter physiologischen

Bedingungen in das ungefähr viermal wirksamere (S)-Ibuprofen umgewandelt.26

422 (99 %)enantiomerenrein

4 (1 %)achiral oder racemisch

426 (28 %)Naturstoffe

52 (12 %)enantiomerenrein

370 (88 %)racemisch

422 (38 %)chiral

674 (62 %)achiral

1096 (72 %)Synthetika

1522 Wirkstoffe

Abb. 1.1: Statistik über die Aufteilung von Wirkstoffen (1982).27

KLEEMANN und ENGEL haben 1982 eine repräsentative Auswahl an Arzneistoffen

untersucht und festgestellt, daß darunter fast alle eingesetzten Naturstoffe und deren

Derivate chiral sind und in enantiomerenreiner Form vorliegen. In der Mehrheit

werden synthetisch gewonnene Arzneistoffe eingesetzt, von denen hingegen nur

38 % chiral sind. Der überwiegende Teil davon (88 %) wurde 1982 noch als Racemat

eingesetzt (s. Abb. 1.1).27 Für die Neueinführungen der letzten Jahre hat sich dieses

Verhältnis deutlich in Richtung zu enantiomerenreinen Substanzen verschoben. 1985

betrug der Anteil enantiomerenreiner Wirkstoffe am pharmazeutischen Weltmarkt

noch ca. 2 %. Dieser Anteil ist bis ins Jahr 1995 auf 20 % angestiegen und weiter auf

32 % im Jahr 2000.28,29 Für die folgenden Jahre wird auch weiterhin ein wachsender

Anteil vorhergesagt.29

Auch vor dem Hintergrund der Auflagen nationaler und internationaler

Gesundheitsbehörden30, welche die Erforschung der Wirkung jedes einzelnen

Page 17: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

3

Stereoisomers als Notwendigkeit verlangen, wird enantiomerenreinen Substanzen

(enantiomerically pure compounds, EPC)31 von der pharmazeutischen Industrie ein

vermehrtes Interesse entgegengebracht.10,32 Daneben können auch patentrechtliche

Überlegungen von Unternehmen eine Rolle spielen, da nach Ablauf einer Schutzfrist

eines Racemats anschließend das aktiviere Enantiomer geschützt werden kann

(chiral switch). So können verlängerte Schutzfristen für Wirkstoffe erzielt werden.33

Die vermehrte Bedeutung enantiomerenreiner Verbindungen erfordert die Suche

nach neuen Zugängen zu diastereo- und enantiomerenreinen Produkten bei der

Entwicklung neuer Pharmaka. In den letzten Jahren sind zur Synthese

enantiomerenreiner Wirkstoffe viele Methoden eingesetzt worden: asymmetrische

Synthese, katalytische kinetische Racematspaltung und Racematspaltungen durch

Chromatographie an chiraler stationärer Phase (CSP) oder durch stereoselektive

Kristallisation.34,35 Trotz der Fortschritte auf dem Gebiet der asymmetrischen

Synthese, basieren die Synthesen vieler chiraler Wirkstoffe noch auf der Trennung

der racemisch synthetisierten Verbindung.36 Unter den genannten Methoden spielen

biokatalytische Verfahren als Schlüsselschritt eine wichtige Rolle.35 Extracelluläre

Lipasen sind hierbei besonders attraktive Katalysatoren für synthetische

Verfahren.9,37

1.1 Opioide Analgetika

Die Behandlung von Schmerzen hat in der Medizin eine große Bedeutung. Es

besteht zur Zeit noch ein weltweiter Bedarf an gut wirksamen Schmerztherapien für

eine patientengerechte und zielorientierte Behandlung. Zentralwirksame Opioide38,

die auch als stark wirksame (morphinartige) Analgetikaa bezeichnet werden, werden

seit langem in der Schmerztherapie eingesetzt, obwohl sie ein dem Morphin

ähnliches Wirkungsprofil haben. Sie rufen eine Reihe von Nebenwirkungen wie

Sucht, Abhängigkeit, Atemdepression, gastro-intestinale Hemmwirkung und

Obstipation in unterschiedlicher Stärke hervor.39 Die moderne Analgesieforschung ist

a algos (griech.) = Schmerz

Page 18: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

4 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

daher bemüht Medikamente zu entwickeln, die eine schmerzstillende Wirkung, nicht

aber die für Opioide typischen Nebenwirkungen, zeigen.40

Die hohe Spezifität der Wirkung stark zentralwirksamer Analgetika hat ihre Erklärung

gefunden, nachdem es gelang, Opioid-Rezeptoren im Organismus nachzuweisen.41

Diese Rezeptoren werden normalerweise mit körpereigenen, morphinartig wirkenden

Peptiden, den Endorphinenb und Enkephalinen, die endogene Agonisten dieser

Rezeptoren sind, aktiviert.26,42,43,44 Das endogene schmerzhemmende System hat die

Funktion die lähmende Schmerzreaktion zu unterdrücken, so daß dem Organismus

seine Handlungsfähigkeit erhalten bleibt.

Opioid-Rezeptoren kommen in unterschiedlicher Dichte sowohl prä- als auch

postsynaptisch im Zentralnervensystem vor.44 Außerhalb des Zentralnervensystems

findet man Opioid-Rezeptoren vor allem im Dünndarm.41 Wie bei anderen

Neurotransmitter-Rezeptoren werden auch bei den Opioid-Rezeptoren verschiedene

Subtypen unterschieden, die man als µ-, κ- und δ-Rezeptoren bezeichnet45. Seit

kurzem kennt man einen weiteren neuen Rezeptor, den ORL1-Subtyp (Opioid-

Receptor-Like 1), und dessen endogenen Liganden, das Peptid Nociceptin.46 Dabei

ist je nach Rezeptorsubtyp eine bestimmte pharmakologische Wirkung möglich. Bei

der supraspinal analgesierenden Wirkung spielt beispielsweise der µ-Rezeptor eine

dominante Rolle.47 Jeder Subtyp ist jedoch auch für ganz bestimmte

Nebenwirkungen verantwortlich. µ-Rezeptoren sind vor allem für die durch Opiate

ausgelöste Atemdepression und Abhängigkeit verantwortlich.44 Durch eine

unterschiedliche Affinität zu den verschiedenen Rezeptoren kann das variable

Wirkungsprofil verschiedener Opioide erklärt werden.

Morphinc (1, s. Abb. 1.2) ist eines der wenigen Beispiele eines Naturstoffs, der auch

heute noch in seiner ursprünglichen Form in der Therapie eingesetzt wird.48

SERTÜRNER isolierte 1806 das Morphin erstmals aus Opium. Die Klärung der Struktur

des Morphins, an der viele Forscher beteiligt waren, hat über 120 Jahre gedauert.

Die 1925 von ROBINSON und GULLAND angegebene Strukturformel wurde 1952 von

GATES und TSCHUDI bestätigt, denen die Totalsynthese des Morphins und damit auch

die Klärung der Stereochemie gelang. Diese vielstufige Synthese hat allerdings keine

praktische Bedeutung erlangt, da Morphin bis heute aus Opium gewonnen wird.49

b Endo-Morphine c Morpheus = griech. Gott des Schlafs

Page 19: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

OPIOIDE ANALGETIKA 5

R2O

R1O

ON CH3

H

NMe

O

OH

OH

Morphin (1): R1 = R2 = H 1 Codein (2): R1 = Me, R2 = H Heroin (3): R1 = R2 = Acetyl

Abb. 1.2: Morphin in einer konventionellen Darstellung nach Robinson (links) und

in einer Stereoformel (rechts).

Morphin stellt den Prototyp und auch den Standard der stark wirksamen Analgetika

zur Behandlung heftiger akuter und chronischer Schmerzen dar.50 Auf der Suche

nach analgetisch wirksamen Verbindungen ist die Struktur des Morphins vielfältig

variiert worden. Dabei zeigte sich, daß auch sehr weit abgewandelte Derivate typisch

morphinartige Eigenschaften besitzen können.51 Die Forschung auf dem

Morphingebiet zeigt weiter, wie aus einem komplexen Naturstoff durch systematische

Strukturvariation leichter herzustellende, strukturell einfache Analoga mit identischer

Wirkung, zum Teil sogar mit höherer Spezifität der Wirkung, gewonnen werden.26

Erste Abwandlungsprodukte wie Codein, der Methylether von 1, oder Heroin, das

Diacetylderivat von 1, waren ebenfalls Naturstoffe. Codein ist zwar schwächer

wirksam als Morphin, weist aber auch ein geringeres Suchtpotential auf. Für Heroin

trifft das Gegenteil zu, es weist ein sehr großes Suchtpotential auf.26

N

O

O

CH3

CH3

OCH3

NH3CCH3

CH3

N O

CH3

N

Pethidin Levomethadon Fentanyl Abb. 1.3: Verschiedene opioide Wirkstoffe.

Pethidin52 (4, s. Abb. 1.3), das erste vollsynthetische Schmerzmittel vom Morphintyp,

wurde 1939 von EISLEB bei der Suche nach krampflösenden Wirkstoffen durch

4 (-)-5 6

Page 20: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

6 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Variation der Struktur des Atropins entdeckt.26,41,46 Das ebenfalls vollsynthetische

Methadon (rac-5) wurde 1941 von BOCKMÜHL und EHRHART gefunden. Als sich

herausstellte, daß nur das (−)-(R)-Enantiomer des Methadons für die analgetische

Wirkung verantwortlich ist, wurde es als Levomethadon53 ((−)-5, s. Abb. 1.2)

eingeführt. Es wird durch Racematspaltung mit (+)-(2R,3R)-Weinsäure aus

Methadon erhalten.41,47 Levomethadon wird hauptsächlich in der Schmerztherapie

eingesetzt, wohingegen racemisches Methadon, oral verabreicht, in der

Ersatztherapie bei Opioid-Abhängigkeit verwendet wird.54 Pethidin und Methadon

besitzen nur etwa ein fünftel bis ein viertel der analgetischen Wirkung des Morphins.

Zwar sind auch die Nebenwirkungen entsprechend schwächer ausgeprägt26,41,44,

jedoch ist ein entscheidender Fortschritt mit diesen Substanzen nicht erreicht

worden.

Fentanyl (6, s. Abb. 1.3), das ebenfalls synthetisch hergestellt wird, ist eines der am

stärksten wirksamen Analgetika, das etwa 100mal stärker wirksam ist als Morphin.

Es wirkt hauptsächlich über den µ-Rezeptorsubtyp.47 Fentanyl wird wegen seiner

relativ kurzen Wirkungsdauer von etwa 30 Minuten ebenfalls in der

Neuroleptanalgesie eingesetzt. Darunter versteht man ein Verfahren bei dem ein

Neuroleptikum gleichzeitig mit einem stark wirksamen Analgetikum injiziert und

dadurch ein Zustand induziert wird, bei dem der Patient sediert und angstfrei ist. So

können kleinere Eingriffe (wie beispielsweise Endoskopien) vorgenommen werden,

bei denen das Erwachen ohne Desorientierung vor sich geht und eine postoperative

Analgesie gewährleistet ist.41,44,55 Fentanyl und dessen Derivate mit einem hohen

Mißbrauchspotential („Designer Drogen“)56 zeigen die typischen Nebenwirkungen

starker µ-Opioide und führen zu einer physischen Abhängigkeit, ähnlich wie beim

Morphin.

Neben Molekülen mit einer agonistischen Wirkung gibt es auch Morphin-

Antagonisten (s. Abb. 1.6, S. 9), die eingesetzt werden, um die Wirkung von opioiden

Analgetika aufzuheben, im besonderen zur Aufhebung der Atemlähmung bei akuter

Vergiftung.41,47

Page 21: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 7

1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga

Tramadol57 (rac-7, s. Abb. 1.4) nimmt unter den stark wirksamen Analgetika eine

Sonderstellung ein, da dieser Wirkstoff eine starke Schmerzhemmung ohne die für

Opioide typischen Nebenwirkungen hervorruft.58 Das Suchtpotential ist so gering43,

das dieser Wirkstoff nicht unter Kontrollmaßnahmen von Narkotika fällt, in

Deutschland das Betäubungsmittelgesetz. Tramadol, das 1976 von der GRÜNENTHAL

GmbH in die Schmerztherapie eingeführt wurde, wird von der WORLD HEALTH

ORGANISATION (WHO) auf Stufe zwei der Schmerztherapie krebskranker Patienten

empfohlen.59 Tramadol wird weltweit vermarktet und ist eines der wichtigsten

zentralwirksamen Schmerzmittel.59

OHOCH3

NCH3

H3C

(R)OH

H3CO

NH3C

CH3

(S)

(R) (S)

(+)-(1R,2R)-Tramadol (−)-(1S,2S)-Tramadol

Abb. 1.4: Die Enantiomere des Tramadols ((+)-7, (−)-7).

Tramadol ist ein Racemat aus (+)-(1R,2R)- und (−)-(1S,2S)-2-Dimethylaminomethyl-

1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol. Das in der Therapie eingesetzte Tramadol

hydrochlorid ist ein partieller Opiat-Agonist, dessen Wirkstärke etwa 1/10 bis 1/5 der

des Morphins entspricht, jedoch mit stark reduzierter Opioidwirkung.44 Tramadol zeigt

eine µ-opioide und eine nicht-opioide Wirkung. Die nicht-opioide Wirkung ist eine

Inhibierung der spinalen Schmerzleitung durch Inhibierung der Wiederaufnahme der

Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5HT).

Dieses wird durch das (−)-(1S,2S)-Enantiomer bewirkt, wohingegen das (+)-(1R,2R)-

Enantiomer ein starker µ-Agonist ist und für die opioide Wirkung verantwortlich ist.

Die analgetische Wirksamkeit des Tramadols resultiert aus einer synergistischen

Kombination beider Enantiomere auf die die beiden Wirkmechanismen verteilt

sind.38,47,60,61,62 Zusätzlich trägt auch der in vivo durch oxidative Dealkylierung

gebildete Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol (8, M1), der eine wesentlich höhere

µ-Opioidrezeptor-Affinität besitzt, zur komplexen Gesamtwirkung bei.46,47,61,63,

Page 22: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

8 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

HONCH3

CH3

OH

NH3C

O

OH

OH

(−)-1 (+)-8

Abb. 1.5: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Morphin und (+)-O-Desmethyltramadol.

Das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des Tramadols und insbesondere das (+)-(1R,2R)-

Enantiomer des O-Desmethyltramadols lassen sich als stark vereinfachte Derivate

des physiologisch aktiven (−)-Morphins auffassen, deren Struktur durch Wegfall von

Ringanteilen flexibler wird (s. Abb. 1.5).

Sowohl für Opioide als auch für Endorphine und Enkephaline, die an diesen

Rezeptoren eine analgetische Wirkung auslösen, sind intensive Untersuchungen zur

Struktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt worden.26,57,64 Demnach ist für ein aktives

Molekül ein in 1-Stellung arylsubstituiertes Cycloalkangrundgerüst, welches in 2-

Stellung aminoalkyliert ist, essentiell. Bei systematischen Variationen des Tramadol-

grundgerüsts stellte die GRÜNENTHAL GmbH fest, daß eine meta-Hydroxyfunktion am

Phenylring zur stärksten analgetischen Wirkung führt und daß die agonistische

Wirkung an die Dimethylaminogruppe gebunden ist. Bei Variationen der Ringgröße

hat sich der Sechsring als optimal herausgestellt.57 Eine freie Hydroxyfunktion am

quarternären Zentrum erweist sich außerdem als günstig, da die analgetische

Wirkung durch Substitution mit Chlor oder Wasserstoff verringert wird, bei

Veresterung geht sie völlig verloren.57

Daß sich das Agonist/Antagonist-Verhältnis eines Moleküls über die Stickstoff-

substitution beeinflussen läßt, zeigt sich im Naloxon (9) und Naltrexon (10) (s. Abb.

1.6, S. 9). Hier ist unter anderem ein N-Methylrest gegen einen Allyl- oder einen

Methylencyclopropyl-Rest ersetzt worden: beide Verbindungen sind dadurch Opioid-

Antagonisten. Des weiteren ist die räumliche Anordnung dieser Gruppen für die

Analgesiewirkung entscheidend. Allerdings kann eine vollständige Struktur-Aktivitäts-

Beziehung immer noch nicht aufgestellt werden.38

Page 23: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 9

O

HO

ON

OH

CH2 O

HO

ON

OH

Naloxon (9) Naltrexon (10)

Abb. 1.6: Opioid-Antagonisten.

Die Synthese des racemischen Tramadol hydrochlorids erfolgt durch Grignard-

Reaktion von 2-(Dimethylaminomethyl)-cyclohexanon, welches durch Mannich-

Reaktion65 von Cyclohexanon, Formaldehyd und Dimethylamin hydrochlorid erhalten

wird, und dem Grignardreagenz des 3-Bromanisols. Aus dieser Reaktion wird eine

cis / trans (cis : trans = 85 : 15) Mischung erhalten. Das gewünschte cis-Isomer wird

durch Kristallisation des diastereomerenreinen Hydrochlorids erhalten. Das trans-

Isomer kann unter Verwendung starker Säuren epimerisiert werden.47,57,66

Präparative Verfahren zur Racematspaltung von Tramadol sind seit langem

dokumentiert. Die wichtigsten basieren auf der „klassischen“ diastereomeren

Salzbildung unter Verwendung von Weinsäure67, O,O´-Dibenzoyl-weinsäure66,68,

Mandelsäure69 und seit neustem auch O,O´-Di-para-toluoyl-weinsäure70. Die

Anwendbarkeit von chromatographischen Trennverfahren in einem präparativen

Maßstab ist ebenfalls demonstriert worden (unter Verwendung der simulated moving

bed Technologie, SMB).71 Analytisch lassen sich die Enantiomere chromato-

graphisch durch HPLC an chiraler stationärer Phase (s. Kap. 3.5, S. 210), durch

Kapillarelektrophorese (CE)72 oder spektroskopisch durch 1H-NMR-Spektroskopie in

Gegenwart von paramagnetischen Verschiebungsreagenzien73 identifizieren.

GRIGG et al. gelang die erste Festphasensynthese racemischen Tramadols mittels

eines „Linker“-Systems74, welches auf Hydroxylamin basiert.75 Das in der Mannich-

Reaktion eingesetzte Iminiumsalz wurde nach einer modifizierten Variante von

SCHROTH et al.76 aus einem N-Trimethylsilylamin mit einem Chlormethylether

hergestellt (s. Abb. 1.7).

Page 24: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

10 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

RMgBr

ONCH3

O

OTMS

ONCH3

OHH3CO

ONH

CH3

(H3C)2N

OHH3CO

1) TMSCl, TEA

2) ClCH2OEt

1) MeOTf

2) TEA

57 %

Abb. 1.7: Festphasensynthese von Tramadol nach GRIGG et al.

Einen ersten Ansatz zur asymmetrischen Festphasensynthese von Tramadol

verfolgten ENDERS et al., die einen „Linker“ auf Basis der THP-Schutzgruppe von

ELLMAN77 mit einem Derivat des Auxiliars (S)-2-Methoxy-methyl-pyrrolidin (SMP)

funktionalisierten. In dieser Syntheseroute wurde die chirale Mannich-Base vom

polymeren Träger abgespalten und dann in flüssiger Phase mit dem

Grignardreagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Das Produkt (+)-7 konnte hierbei nur

mit einem Enantiomerenüberschuß von 38 % erhalten werden (s. Abb. 1.8).78 Da

nach dieser Methodik andere Mannich-Basen mit hoher Enantioselektivität

dargestellt wurden79, ist zu vermuten, daß enantiomerenangereicherte Mannich-

Basen unter Grignardbedingungen partiell racemisieren.

OO O

N

OCH3

OO O

N

OCH3

N(CH3)2

(H3C)2N CH2I

O

OO O

NH

OCH3

N(CH3)2

OH

OCH3

+

1) THF / verd. HCl

2) Extraktion

3) 3 Äq. RMgBr

67 %

Abb. 1.8: Asymmetrische Festphasensynthese von Tramadol nach ENDERS et al.

rac-7, de = 92 %

(+)-7, 78 % de 38 % ee

Page 25: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

11

1.3 Zielsetzung

In einem Tramadol-Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH sind ca. 2000

Strukturanaloga synthetisiert worden. Ziel dieses Projekts ist es, die Opioid-Wirkung

als auch die Wiederaufnahmehemmung in einem enantiomerenreinen oder achiralen

Molekül zu vereinigen. Die vorgenommenen Strukturvariationen lassen sich wie in

Abb. 1.9 dargestellt zusammenfassen.

OHO

N

CH3

Eliminierung oder Substitutionder tertiären OH-Gruppe

offenkettige Strukturen

Aromaten-substitutionoder -variationCH3

H3C

Einführung zusätzlichersekundärer OH-Gruppen

Abb. 1.9: Zusammenfassung der relevanten Strukturvariationen im Tramadol-

Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH.

Für die pharmakologische und toxikologische Evaluierung dieser neuen Tramadol-

Analoga müssen, sowohl für die Entwicklung eines einzelnen Enantiomers als auch

für die eines Racemats, beide Enantiomere dargestellt werden.

Tramadol-Analoga sind als Racemate auf der Basis der Tramadol-Syntheseroute

sehr gut darzustellen. Eine alternative asymmetrische Synthese dieser Verbindungen

ist wegen der partiellen Racemisierung der Mannich-Basen bei ihrer Umsetzung mit

Grignard-Verbindungen noch nicht durchführbar. Dies macht eine Racematspaltung

notwendig, die gerade die Bereitstellung beider Enantiomere zu leisten vermag.

Bei der Racematspaltung von Tramadol und seinen Derivaten durch Kristallisation

diastereomerer Salze konnten bisher noch keine allgemeinen Richtlinien zur

Prädiktivität entwickelt werden, da schon geringe strukturelle Variationen häufig zu

einem nicht vorhersagbaren Verhalten in der Umsetzung mit den

Kristallisationsreagenzien führen. Präparative chromatographische HPLC an chiraler

stationärer Phase ist nur bedingt zur Bereitstellung kleiner Substanzmengen (1 bis

10 g) geeignet.

Page 26: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

12 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, in Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL

GmbH beide Enantiomere von Tramadol-Analoga durch eine Hydrolasen-katalysierte

kinetische Racematspaltung enantiomerenrein darzustellen. Mögliche

Funktionalitäten von Substraten auf Tramadol-Basis, die als Angriffspunkt für eine

Hydrolasen-katalysierte Reaktion dienen können, sind in Abb. 1.10 dargestellt.

OHO

N

CH3

tertiäre OH-FuntionZusätzliche sekundäreOH-Funktionen

offenkettige Strukturen

phenolische OH-Funktion

H3C CH3 Abb. 1.10: Mögliche Angriffspunkte für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische

Racematspaltung von Tramadol-Analoga.

Das solche Tramadol-Analoga Substrate für Hydrolasen sind, konnte bereits in

eigenen Vorarbeiten am Beispiel eines Phenylesters des O-Desmethyltramadols

(rac-15) gezeigt werden.80 Dieses Ergebnis soll als Ausgangspunkt für eine mögliche

Optimierung der Racematspaltung von Phenylestern des O-Desmethyltramadols

dienen. Es sollen ebenfalls Substrate eingesetzt werden, bei denen eine zusätzliche

Hydroxyfunktion in den Cyclohexylring eingefügt ist. Eine Vielzahl unterschiedlich

substituierter, racemischer Cyclohexanole sind bereits als Substrate in der Lipasen-

katalysierten Hydrolyse oder Acylierung untersucht worden.5-8 Diese Gruppe

cyclohexanolischer Substrate sollte somit ideal für eine Hydrolasen-katalysierte

kinetische Racematspaltung sein.

In dieser Arbeit sollen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung beide möglichen

Verfahrensweisen eingesetzt werden: die Acylierung von racemischen Alkoholen

oder Phenolen im organischen Medium und die Hydrolyse der entsprechenden Ester.

Im Hinblick auf eine Optimierung der Reaktionsführung sollte der Einfluß

verschiedener Reaktionsparameter untersucht werden. Mögliche Variablen sind:

Lösungsmittel, Acyldonoren, verschieden Additive sowie pH-Wert, Cosolventien und

die Art der Estergruppe. Im Hinblick auf eine mögliche synthetische Anwendung soll

weitergehend untersucht werden, ob sich eine solche Enzym-katalysierte Reaktion in

größeren Maßstäben realisieren läßt.

Page 27: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

2 Theoretischer Teil

2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-

Katalysator Präparation

Es ist bekannt, das native PLE im Gegensatz zu Lipasen nur eine sehr geringe

Aktivität im organischen Medium aufweist. Für einige Lipasen ist gezeigt worden, daß

durch Zusatz von Proteinen oder amphiphilen Verbindungen wie Polyethylenglycol

sie vor Änderung ihrer Konformation und somit Verminderung ihrer katalytischen

Aktivität geschützt werden können. GAIS et al. konnten dieses Konzept auf die PLE

erweitern und zeigen, daß eine Aktivierung durch Methoxypolyethylenglycol (MPEG)

möglich ist.81,82,83 Die besten Erfolge wurden hier durch Colyophilisierung von PLE

mit MPEG erzielt, wobei eine aufwendige kovalente Modifizierung des Enzyms nicht

notwendig ist.84 Durch die gemeinsame Gefriertrocknung von PLE und MPEG

werden vermutlich nicht-kovalente Komplexe zwischen Enzym und Polymer gebildet,

die, sofern sie nicht durch Lösungsmitteleinflüsse zerstört werden, zu einer

Aktivitätssteigerung führen. Das MPEG kann weiterhin geringe Mengen Wasser, die

für die katalytische Aktivität des Enzyms benötigt werden und auf der Oberfläche des

Enzyms gebunden sind, bereitstellen.

Das Colyophilisat aus MPEG/PLE wurde nach einer bekannten Methode

dargestellt.84,85 Hierzu wurde die PLE unter Eiskühlung entsalzt und die

zurückbleibende wäßrige Enzymlösung anschließend mit MPEG5000 versetzt. Nach

vollständiger Auflösung wurde die Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren und

danach gefriergetrocknet. Es entstand ein weißes, flockiges und gut handhabbares

Pulver in quantitativer Ausbeute.

Die Standardaktivität von PLE wird im Rahmen dieser Arbeit durch Hydrolyse von

0.25 M Buttersäureethylester fein emulgiert in 0.1 M Phosphatpufferlösung pH 8.0

bei Raumtemperatur bestimmt.86 Um eine direkte Vergleichbarkeit von Standard-

aktivitäten der PLE oder anderen Enzymen zu erhalten, muß gewährleistet sein, daß

diese unter einheitlichen Bedingungen gemessen werden. Häufig variieren aber die

Reaktionsbedingungen bei verschiedenen Quellen. HORGAN et al. berichten

Page 28: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

14 THEORETISCHER TEIL

beispielsweise so von einem Aktivitätstest zur Bestimmung der PLE-Aktivität, der

durch Hydrolyse von 0.0125 M Buttersäureethylester bei pH 7.5 und 38 ºC

durchgeführt wird.87

Die beobachtete spezifische Aktivität der colyophilisierten PLE/MPEG war verglichen

mit der Aktivität der PLE-Ammoniumsulfat Suspension ca. 15 % geringer. Bei der

Lyophilisierung nativer PLE wurden im Vergleich dazu Aktivitätsverluste von 30 -

50 % beobachtet.85 In dieser Arbeit wurde auch ein Colyophilisat aus

PLE/BSA/MPEG eingesetzt. Die spezifische Aktivität dieses Katalysators entsprach

der des MPEG/PLE-Colyophilisats.

Eine Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit und auch der Selektivität der

MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung vom Wassergehalt der Reaktionslösung ist

bekannt.21,81,82 Hier zeigte sich, daß ein zu großer Wassergehalt in enzymatischen

Transacylierungen zu hydrolytischen Nebenreaktionen führen kann, in denen das

Acylierungsmittel bevorzugt verseift wird.88 Dies führt zu Aktivitätsverlusten, da bei

der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters die entsprechende Carbonsäure

entsteht, die den pH-Wert in der Umgebung des Enzyms drastisch reduziert und so

zur Deaktivierung des Enzyms führt. Weiterhin kann der in der Transacylierung

gebildete Ester vom Enzym hydrolysiert werden. Da in diesem Fall das bevorzugt

gebildete Enantiomer auch bevorzugt hydrolysiert werden würde, würde dies zu einer

Selektivitätserniedrigung führen. Daher ist es notwendig eingesetzte Reagentien

unter dem Aspekt Wassergehalt zu charakterisieren, um Bedingungen, die zu

hydrolytischen Nebenreaktionen in der Transacylierung führen können, zu

vermeiden.

Der Wassergehalt von MPEG/PLE ist bereits durch zwei Methoden bestimmt

worden. Nach der ersten Methode wird MPEG/PLE bei 2.5·10-4 mbar und 120 ºC für

12 Stunden getrocknet und anschließend der Wassergehalt durch den

Gewichtsverlust ermittelt. Hiernach wurde ein Wassergehalt der MPEG/PLE

(colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) von 1 – 2 % bestimmt.84 Die zweite

Methode stellt die Karl-Fischer-Titration der MPEG/PLE dar. Bei der Karl-Fischer-

Titration besteht die Möglichkeit von Fehlern in der Wassergehaltsbestimmung

dadurch, daß fest gebundenes Wasser teilweise zu langsam abgegeben wird und

Page 29: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION 15

daß es zu Reaktionen von funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Reagenz

kommen kann.89 Nach dieser Methode wurde der Wassergehalt einer vergleichbaren

MPEG/PLE Probe (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) zu 1.2 % bestimmt.

Bei einer Verlängerung der Trocknungsdauer auf 72 h sank der Wassergehalt auf

0.6 %.85 Aufgrund der unterschiedlichen Temperaturen, die bei der Gefriertrocknung

unterschiedlicher Chargen herrschen, können die so erhaltenen Werte aber nur ein

grober Anhaltspunkt sein.90

Diese Ergebnisse zeigen, daß durch den MPEG/PLE Katalysator keine erheblichen

Wassermengen in die Reaktionslösung eingebracht werden. Der in dem Katalysator

vorhandene Wassergehalt wird wahrscheinlich sogar vom Protein benötigt.

Page 30: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

16 THEORETISCHER TEIL

2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche enzymatische

Reaktionswege untersucht: die Enzym-katalysierte Transacylierung racemischer

Alkohole (s. Tabelle 2.1) und die Hydrolyse der entsprechenden racemischen Ester

(s. Tabelle 2.2). Die eingesetzten Substrate lassen sich in zwei Gruppen einteilen.

Die Erste besteht aus Substraten mit einer phenolischen OH-Gruppe und den

entsprechenden Estern, die sich durch O-Demethylierung von Tramadol und

Analogen ableiten lassen. Die zweite Gruppe besteht aus Substraten mit einer

zusätzlichen sekundären Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst des Tramadols und

den dazugehörigen Estern. Aufgrund der unterschiedlichen Reaktivität der

phenolischen und der sekundären Hydroxylgruppe werden beide Substratgruppen in

den folgenden Abschnitten dieser Arbeit dementsprechend getrennt diskutiert.

Innerhalb der Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH wurden Vorstufen zu den

Substraten zur Verfügung gestellt, so daß alle in dieser Arbeit eingesetzten

Verbindungen durch Standardreaktionen aus den zur Verfügung stehenden

Verbindungen zugänglich waren. Auf die einzelnen bei GRÜNENTHAL durchgeführten

Syntheseschritte zur Darstellung der bereitgestellten Substanzen wird in Kapitel 2.2.1

näher eingegangen.

Die racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung wurden in der Regel

in Form ihrer Hydrochloride, die einfach zu handhaben sind, zur Verfügung gestellt.

Lediglich das Phenol rac-8 wurde in Form des Hydrochlorids der entsprechenden

O-methylierten Verbindung Tramadol (rac-7) bereitgestellt (Tabelle 2.1). Alle

bereitgestellten Hydrochloride waren über Monate bei Raumtemperatur lagerstabil.

Zur Freisetzung der racemischen Basen aus ihren Hydrochloriden werden diese in

einer Emulsion aus dest. Wasser und Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von

äquivalenten Mengen Natronlauge können die freien Basen nahezu quantitativ (97 -

98 % Ausbeute) extrahiert werden (s. AAV 1, S. 176).91

Page 31: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 17

OH

Me2N

OH

Tabelle 2.1: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen

Transacylierung

Substrat zur enzymatische Transacylierung Darstellung

(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexanol (rac-8):

1. Freisetzen der Base rac-7

aus dem Hydrochlorid.

2. O-Demethylierung von rac-7

mit DiBAl-H.

(±)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-

propyl)-phenol (rac-11): Freisetzen der Base aus

dem Hydrochlorid.

(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,3-diol (rac-12): Freisetzen der Base aus

dem Hydrochlorid.

(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,3-diol (rac-13): Freisetzen der Base aus

dem Hydrochlorid.

(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,4-diol (rac-14): Freisetzen der Base aus

dem Hydrochlorid.

Das phenolische Substrat rac-8 und das zur Synthese des Esters rac-21 benötigte

3-(6-Dimethylamino-methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20) wurden aus

rac-7 und rac-13 dargestellt, in denen die phenolische Hydroxylgruppe noch als

Methylether vorliegt. Eine bekannte Methode zur Etherspaltung bei Verbindungen

OH

Me2N

OH

OH

Me2N

OMeHO

OH

Me2N

OMeOH

OH

Me2N

OMeHO

Page 32: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

18 THEORETISCHER TEIL

OH

Me2N

O

O

Pr

OH

Me2N

O

O

Me

des Tramadoltyps, die starke Basen wie Natrium- oder Kaliumhydrid in Gegenwart

von Thiophenol und Diethylenglycol verwendet92, ergibt jedoch O-Desmethyltramadol

(rac-8) aus rac-7 nur in unbefriedigenden Ausbeuten.91 Zur Etablierung der

phenolischen Hydroxylgruppe wurden daher die Methylether rac-7 und rac-13 durch

Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in guten

bis sehr guten Ausbeuten (88 - 93 %) demethyliert.91 Eine Dealkylierung am

Stickstoff war in keinem Fall zu beobachten.

Die Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse erfolgte

durch Acylierung der entsprechenden Phenole und Alkohole unter den angegeben

Reaktionsbedingungen (Tabelle 2.2).

Tabelle 2.2: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse

Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung

(±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15): Pyridin katalysierte

Veresterung von 8 mit

Buttersäureanhydrid.

(±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16): Pyridin katalysierte

Veresterung von 8 mit

Essigsäureanhydrid.

(±)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-

1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17): Pyridin katalysierte

Veresterung von 11 mit

Buttersäureanhydrid.

OH

Me2N

O Pr

O

Page 33: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 19

Fortsetzung Tabelle 2.2:

Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung

(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18): Darstellung des Alkoholats

aus 12⋅HCl mit KOtBu und

Acylierung mit Buttersäure-

chlorid bei RT.

(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19): Darstellung des Alkoholats

aus 13 mit KOtBu und

Acylierung mit Buttersäure-

chlorid bei –10 ºC.

(±)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl-

1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21):

1. O-Demethylierung von 13

mit DiBAl-H zum Phenol 20.

2. Darstellung des Phenolats

aus 20 mit NaHCO3-Lsg.

und Veresterung mit Butter-

säureanhydrid.

(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-

4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22): Darstellung des Alkoholats

aus 14⋅HCl mit KOtBu und

Acylierung mit Buttersäure-

chlorid bei RT.

(±)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-

4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23): Darstellung des Alkoholats

aus 14⋅HCl mit KOtBu und

Acylierung mit Hexansäure-

chlorid bei RT.

OH

Me2N

OMeOPr

O

OH

Me2N

OMeO

O

Pr

OH

Me2N

OOH

Pr

O

OH

Me2N

OMeOPr

O

OH

Me2N

OMeOC5H11

O

Page 34: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

20 THEORETISCHER TEIL

Fortsetzung Tabelle 2.2:

Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung

(±)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-

4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24):

Darstellung des Alkoholats

aus 14⋅HCl mit KOtBu und

Acylierung mit Essigsäure-

chlorid bei RT.

(±)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-

methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester

(rac-25):

Pyridin katalysierte

Veresterung von 13 mit

Buttersäureanhydrid.

Allgemein verliefen die Veresterungen mit guten Ausbeuten. Als Nebenreaktion trat

in manchen Fällen in einem geringen Ausmaß eine unerwünschte Acylierung der

tertiären Hydroxylgruppe auf. Lediglich bei der Veresterung von rac-13 mit

Buttersäurechlorid in Gegenwart von Kalium-tert-butylat bei Raumtemperatur ist

diese Nebenreaktion so groß, daß als Hauptprodukt der Diester rac-25 nahezu

quantitativ (96 % Ausbeute) anfällt. Ein Absenken der Reaktionstemperatur auf

-10 ºC liefert aber neben nicht umgesetztem Edukt schon bevorzugt den Monoester

der sekundären Hydroxylgruppe, rac-19, in 58 %iger Ausbeute. Ebenfalls nicht zu

vernachlässigen war die Bildung eines Diesters bei der Darstellung von rac-24. In

diesem Fall ist nach chromatographischer Aufreinigung eine Mischung von

Monoacetat und Diacetat im Verhältnis 4 : 1 (Verhältnis der Signale der Protonen der

Methoxygruppe im 1H-NMR) erhalten worden, die sich nicht weiter auftrennen ließ

und somit in weiteren Reaktionen als Mischung eingesetzt worden ist. Bei einer

erneuten Synthese von rac-24, sollte daher versucht werden die

Reaktionstemperatur herabzusenken, um einer Bildung des Diesters entgegen-

zuwirken.

O

Me2N

OMeO

O

Pr Pr

O

OH

Me2N

OMeOMe

O

Page 35: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 21

Zur Synthese des Phenylesters rac-21, wurde eine Methode zur selektiven

Acylierung der phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit einer sekundären benötigt.

Bei einer zunächst versuchten Acylierung von rac-20 mit einem Säurechlorid unter

Phasentransferkatalyse mit Tetrabutylammoniumbromid, wie von ILLI beschrieben93,

konnte lediglich das eingesetzte Edukt zurückgewonnen werden. RICE et al. gelang

bei Untersuchungen zu substituierten 3,14-Dihydroxy-17-methyl-4,5α-epoxy-

morphinanen die selektive Acylierung einer phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit

sekundärer Hydroxylgruppen nach einer modifizierten Methode von WELSH94 et al.95

Analog zu der von RICE beschriebenen Prozedur wurde rac-20 mit 10 Äquivalenten

Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-

Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt.

Bevor die in Tabelle 2.2 vorgestellten Substrate in eine Enzym-katalysierte Hydrolyse

eingesetzt wurden, wurde ihre Hydrolyse-Stabilität unter den verwendeten

Reaktionsbedingungen ohne Zugabe des Katalysators überprüft, um eventuelle nicht

Enzym-katalysierte Reaktionen auszuschließen. Eine nicht-enzymatische

Autohydrolyse würde zu racemischen Produkten führen, die, sollten sie während der

Enzym-katalysierten Reaktion ebenfalls entstehen, einen niedrigeren ee-Wert des

Produkts und damit eine niedrigere Selektivität der enzymatischen Katalyse

vortäuschen würden. Eine Autohydrolyse-Stabilität ist daher eine wichtige

Voraussetzung der zu verwendenden Substrate. Alle in Tabelle 2.2 gezeigten Ester

der Buttersäure waren unter den Reaktionsbedingungen im Bereich von pH 7.0 bis

pH 8.0 stabil gegen eine nicht Enzym-katalysierte Hydrolyse.

Dahingegen zeigten rac-16 und rac-24, beides Ester der Essigsäure, nur eine

unbefriedigende Autohydrolysestabilität. Die Stabilität von rac-16 ist bei

verschiedenen pH-Werten überprüft worden (Tabelle 2.3).

Tabelle 2.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer-

Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol.

pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC)

7.0 2 h 0.1 % rac-8

8.0 2 h 1.2 % rac-8

8.0 16 h 15.0 % rac-8

Page 36: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

22 THEORETISCHER TEIL

Es zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerhalb von 2 Stunden noch tolerierbare Mengen an

Hydrolyseprodukt detektiert worden sind. Bei pH 8.0 wurde allerdings eine merkliche

Autohydrolyse von bereits 1 % nach 2 Stunden und 15 % nach 16 Stunden

beobachtet. Eine Enzym-katalysierte Reaktion erscheint bei diesem pH-Wert wenig

sinnvoll.

Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde in wäßriger Phosphatpufferlösung

(pH 7.5) mit Aceton (16 %Vol) als Cosolvens überprüft. Nach vier Tagen bei

Raumtemperatur konnten 2 % Hydrolyseprodukt detektiert werden. Da der ein-

gesetzte Ester rac-24 noch das Diacetat rac-14 als nicht zu entfernende

Verunreinigung enthält, wurde auf eine detaillierte Untersuchung zur Hydrolyse-

beständigkeit, wie beispielsweise bei verschiedenen pH-Werten verzichtet.

Um die Ansatzgrößen der enzymatischen Transacylierungen möglichst klein halten

zu können und um schnell zuverlässige Daten auch in der enzymatischen Hydrolyse

zu erhalten, wurde die gesamte Analytik der Reaktionsgemische auf gas- und

flüssigchromatographische Analyse aufgebaut. Zur Validierung von Analyse-

bedingungen wurden zunächst separat die reinen racemischen Substrate und

Produkte und danach dieselben als Mischung untersucht. Auf diese Art war eine

eindeutige Zuordnung der Verbindungen in den Chromatogrammen möglich (Abb.

2.1). Um ebenfalls eine zuverlässige, schnelle sowie möglichst einfache Bestimmung

der Enantiomerenverhältnisse von Edukten und Produkten bei den enzymatischen

Reaktionen zu gewährleisten, wurden Mischungen der racemischen Edukte mit den

jeweiligen racemischen Produkten durch Gas- oder Flüssigchromatographie an

chiralen stationären Phasen getrennt. Anschließend wurden unter den erhaltenen

Bedingungen zur eindeutigen Identifizierung der Verbindungen nochmals die

racemische Edukte und Produkte separat analysiert. Bis auf wenige, an

entsprechender Stelle explizit genannte Verbindungen, konnten sowohl die Signale

beider Enantiomere des Substrats als auch des Produkts in einem Chromatogramm

basisliniengetrennt erhalten werden (Abb. 2.2).

Page 37: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 23

Abb. 2.1: Gaschromatographische Trennung von (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-

methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) und (±)-Buttersäure-3-

dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester

(rac-22) an einer CP-Sil-8-Säule.

Abb. 2.2: HPLC Trennung von (−)- und (+)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-

hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester ((−)-22, (+)-22) sowie von

(+)- und (−)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-

1,4-diol ((+)-14, (−)-14) an einer OD-H-Säule mit chiraler stationärer

Phase.

Dies ermöglichte es, daß Proben direkt aus der Reaktionsmischung, nach

Abtrennung der hochmolekularen Proteine durch Filtration, ohne weitere

OH

Me2N

OMeHO

OH

Me2N

OMeOPr

O

OH

Me2N

OMeHO

OHOMe

Me2N

HO

OH

Me2N

OMeOPr

O

OHOMe

Me2N

OPr

O

(−)-22

(+)-22

(+)-14

(−)-14

rac-14

rac-22

Page 38: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

24 THEORETISCHER TEIL

Aufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sich

detaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischen

Reaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen.

2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen96

Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung der

cyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HCl

basieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß viele

Erfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werden

konnten.

N Cl

H3C

O

Cl

BrMg OMe

2) Trennung der

NaBH4

CH3

H3C

1)

OH

Me2N

OMeOH

Me2N

OMe

O O

O

O O

O

N(Me)2THF

3) H

OHO

DiastereomerenMeCN

rac-27 rac-14

Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14.

Zur Einführung der neuen sekundären Hydroxylgruppe wurde anstelle von

Cyclohexanon ein als Monoketal geschütztes 1,4- bzw. 1,3-Diketon in die Mannich-

Reaktion eingesetzt (Abb. 2.3 und Abb. 2.4). Aus der Mannich-Reaktion des

3,3-Dimethyl-1,5-dioxa-spiro[5.5]undecan-8-on (26, Abb. 2.4) wurde nur das

gewünschte 9-Alkylierungsprodukt erhalten. Das unerwünschte 7-Alkylierungs-

produkt wurde wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht gebildet. Die

erhaltenen jeweiligen Mannich-Basen wurden danach in einer Grignard-Reaktion mit

dem Grignard-Reagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Es wurden in beiden Fällen

cis / trans Mischungen erhalten, aus denen die gewünschten cis-Isomere abgetrennt

wurden und nach Abspaltung der Ketal-Schutzgruppen mit Mineralsäure die Ketone

Page 39: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 25

rac-27 und rac-28 erhalten wurden. Die Ketone rac-27 und rac-28 wurden

anschließend mit Natriumborhydrid zu den gewünschten Alkoholen reduziert. Im

Falle der Reduktion des Ketons rac-27 konnte unter optimierten Bedingungen das

gewünschte (1RS,2RS,4SR)-konfigurierte 1,4-Diol rac-14 erhalten werden. Eine

Bildung des (1RS,2RS,4RS)-konfigurierten Epimers konnte nicht beobachtet werden.

Im Falle der Reduktion des Ketons rac-28 wurde eine Epimerenmischung aus

(1RS,3SR,6RS)-konfigurierten 1,3-Diol rac-12 und dem (1RS,3RS,6RS)-

konfigurierten Diol rac-13 erhalten, die anschließend getrennt worden sind. Auf

diesem Weg war es möglich beide in dieser Arbeit eingesetzte Epimere aus einer

Reaktion zu erhalten (Abb. 2.4).

BrMg OMe2)

NaBH4 +

32 % 45 %

O

O

O

1)

OH

Me2N

OMeO

OH

Me2N

OMeOH

Me2N

OMeHO

OH

H

H2C NCH3

CH3

Cl

2)

1) Trennung derDiastereomeren

rac-12 rac-13

Abb. 2.4: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-12 und

rac-13.

rac-28 26

Page 40: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

26 THEORETISCHER TEIL

2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse

2.3.1 Kinetische Racematspaltungen

Der Reaktionsmechanismus von Lipasen und Esterasen entspricht weitgehend dem

von Serinproteasen.99 Typisch für diese Enzyme ist eine katalytische Triade im

aktiven Zentrum, die aus in dichter räumlicher Nähe stehendem Serin (Ser), Histidin

(His), Asparaginsäure (Asp) beziehungsweise Glutaminsäure (Glu) und verschieden

stabilisierenden Aminosäureresten gebildet wird. Darüberhinausgehend zeigen alle

bisher untersuchten Lipasen eine ähnliche dreidimensionale Struktur, das

α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv100,101 dessen zentrales Element acht nahezu parallele

β-Faltblätter sind, die von α-Helices an beiden Seiten umgeben werden (Abb. 2.5).102

Abb. 2.5: α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv aus

β-Faltblättern (Pfeile 1 bis 8) und α-Helices

(Zylinder A bis F) mit katalytischer Triade

und einem Bereich zur Stabilisierung von

Oxyanionen.

Im Katalysezyklus (Abb. 2.6) wird der primär gebildete Enzym-Substrat-Komplex (A)

nukleophil vom aktiven Serinrest der katalytischen Triade angegriffen. Im

entscheidenden Katalyseschritt bildet sich über einen tetraedrischen

Übergangszustand (B) eine kovalente Bindung zwischen dem Serinrest und dem

Acylrest des Substrates zum Acylenzym (C). Der negativ geladene

Übergangszustand (B) wird durch das Enzym stabilisiert (Oxyanion-Bereich in Abb.

Page 41: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 27

2.5). Die Bildung des Acylenzyms ist eine Gleichgewichtsreaktion und stellt eine

Umesterung zwischen dem Enzym und dem eingesetzten Ester dar.

(A) (B) (C)

Ser

OH

OR2R1

O

Ser

O

OR1 + R2OH

Ser

O

OR1 + R3OH

Ser

OH

OR3R1

O

R1 OR2

O O

Ser

R1 OR3

O O

Ser

(D) (E) (F)

Abb. 2.6: Katalysemechanismus bei Hydrolasen (ping-pong Mechanismus).

Entsprechend reagiert das Acylenzym in einer weiten Umesterung mit einem

Nukleophil, wie einem Alkohol (Transacylierung) oder Wasser (Hydrolyse), zu dem

freien Enzym und dem Produkt einem Ester (Transacylierung) oder Säure

(Hydrolyse) weiter (F). Kinetisch wird diese Reaktionsfolge als ping-pong

Mechanismus bezeichnet.103 In den meisten Reaktionen ist die Deacylierung des

Acylenzyms der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse.6

Die Hydrolasen-katalysierten Reaktionen lassen sich in zwei prinzipielle

Reaktionstypen unter Beteiligung chiraler Moleküle einteilen: Desymmetrisierung und

kinetische Racematspaltung (s. Abb. 2.7).

Page 42: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

28 THEORETISCHER TEIL

Kinetische Dynamische-kinetische Racematspaltung Racematspaltung Desymmetrisierung

R

S

P

Q

+ +

schnell

langsam

P

Q

+

schnell

langsam

A

R

S

P

Q

+

schnell

langsam

krac

kR

kS

kR

kS

Produkt: 50 % P + 50 % S Produkt: 100 % P Produkt: 100 % P R, S: Enantiomere des Substrats

P, Q: Enantiomere des Produkts

kR, kS: individuelle Geschwindigkeitskonstanten (kR >> kS)

krac: Geschwindigkeitskonstante der Racemisierung (krac ≥ kR)

Abb. 2.7: Prinzipien der Racematspaltung und Desymmetrisierung.

In Desymmetrisierungs-Reaktionen104 (s. Abb. 2.7) werden prochirale Substrate

eingesetzt, wie beispielsweise meso-konfigurierte Diester. Diese können entweder

zum Produkt P oder seinem Enantiomer Q umgesetzt werden. Das Verhältnis der

Produkte wird durch die Reaktionsgeschwindigkeiten beider Reaktionen bestimmt.

Es ist somit unabhängig vom Umsatz und wird nur durch den Grad der enantiotopen-

Differenzierung des Enzyms beeinflußt. Daher ist es möglich, Produkte sowohl in

hohen Ausbeuten als auch mit hohen Enantiomerenüberschüssen zu isolieren.

In kinetischen Racematspaltungen (s. Abb. 2.7) dagegen wird ein racemisches

Substrat eingesetzt und in einer Enantiomer-differenzierenden Reaktion vom Enzym

umgesetzt. In dem Idealfall einer hohen Selektivität wird das eine Enantiomer R des

Substrats vollständig umgesetzt und das andere Enantiomer S nicht. In diesem Fall

kann sowohl das nicht-reagierende Enantiomer des Substrats (S) und das

Enantiomer des Produkts (P) mit Ausbeuten bis zu 50 % isoliert werden. Der

entscheidende Nachteil einer kinetischen Racematspaltung ist, daß die theoretisch

mögliche Ausbeute jedes Enantiomers 50 % nicht überschreitet. Zudem ist eine

Trennung des Reaktionsprodukts von dem nicht umgesetzten Substrat notwendig. In

der Mehrzahl der Prozesse ist nur eines der Reaktionsprodukte gewünscht, so daß

das andere racemisiert oder in einer enantiokonvergenten Weise umgesetzt werden

muß, was einen Mehraufwand bedeutet. Wenn möglich wird daher in solchen Fällen

die kinetische Racematspaltung um einen Schritt, eine schnelle in-situ

Page 43: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 29

Racemisierung des Substrates, erweitert.105 In einer solchen dynamischen-

kinetischen Racematspaltung (s. Abb. 2.7, S. 28) kann das Produkt P ebenfalls

enantiomerenrein mit 100 % Ausbeute erhalten werden. In der Aufgabenstellung

dieser Arbeit ist aber gerade die Darstellung beider Enantiomere gewünscht, so daß

das Anfallen beider enantiomerer Reaktionsprodukte, wenn auch in Form eines

Esters und eines Alkohols, als ein Vorteil der kinetischen Racematspaltung für diese

Arbeit gewertet werden kann.

2.3.1.1 Der E-Wert

In einer kinetischen Racematspaltung ist der Grad der Enantiomerenanreicherung

von Substrat und Produkt abhängig vom Umsatz. Daher ist ein Vergleich von

kinetischen Racematspaltungen hinsichtlicht ihrer Selektivität nur bei gleichem

Umsatz sinnvoll. Um eine allgemeinere Vergleichbarkeit zu erreichen, ist von CHEN

und SIH der dimensionslose Selektivitätsparameter E eingeführt worden. 106,107 Der

E-Wert einer Reaktion entspricht dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten

der Reaktionen der beiden Enantiomere (E = kR / kS) und ist unabhängig von

Substratkonzentration und Umsatz. Auf die Voraussetzungen bei der Definition des

E-Werts und deren Gültigkeit wird auf Seite 31 näher eingegangen. Bei bekanntem

E-Wert lassen sich somit die ee-Werte von Substrat und Produkt in Abhängigkeit

vom Umsatz bestimmen und graphisch auftragen (s. Abb. 2.8).

Abb. 2.8: Abhängigkeit der ee-Werte von Substraten (S) und Produkten (P) bei drei

kinetischen Racematspaltungen mit verschieden Selektivitäten.

Page 44: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

30 THEORETISCHER TEIL

Aus Abb. 2.8 geht hervor, daß das Substrat (S) bei einer kinetischen Racemat-

spaltung prinzipiell immer bei hinreichend großen Umsätzen auf Kosten der

Ausbeute enantiomerenrein erhalten werden kann. Das Produkt (P) hingegen kann

nur bei sehr selektiven Reaktionen mit E-Werten größer als 100 nahezu

enantiomerenrein erhalten werden.

Zur Bestimmung von E müssen zwei der drei Variablen: Umsatz, ee-Wert des

Substrates und ee-Wert des Produkts bekannt sein und in eine der aufgeführten

Formeln eingesetzt werden6,107,108:

Formel 2.1: )]eec(1[1 ln)]eec(1[1 ln

EP

P

−−+−

= , für c < 50 %

Formel 2.2: )]eec)(1[(1 ln)]eec)(1[(1 ln

ES

S

+−−−

= , für c > 50 %

Formel 2.3:

+

+

+

=

)/ee(ee1ee1

ln

)/ee(ee1ee1

ln

E

PS

S

PS

S

++

+−

=

)eeee)ee(1ee

ln

)ee(ee)ee(1ee

ln

SP

SP

SP

SP

(mit: c = Umsatz, Pee = ee-Wert des Produkts, See = ee-Wert des Substrats)

KAZLAUSKAS et al. haben eine schnelle photospektroskopische Methode zur

Bestimmung des E-Werts entwickelt, die auf der Umsetzung der einzelnen

Enantiomeren basiert (“Quick E-Wert“).109 Häufig stehen gerade diese aber nicht zur

Verfügung.

E-Werte sind für sehr kleine und sehr große Umsätze mit einem großen Fehler

behaftet. Entweder läßt sich c nur mit beschränkter Genauigkeit bestimmen oder die

gefundenen ee-Werte sind sehr groß, so daß relativ kleine Fehler bei Bestimmungen

von c, eeS oder eeP einen großen Einfluß auf den berechneten E-Wert haben, da sie

logarithmisch in die Berechnung eingehen.6,21,108,110 Die Angabe von E-Werten

größer als 100 ist aus demselben Grund wenig sinnvoll, da hier ebenfalls der Einfluß

kleiner Meßfehler sehr groß ist.6,108,110,111 In einigen Fällen können sogar E-Werte um

die 50 nur mit einer Genauigkeit von ± 10 angegeben werden (Angabe als E ≈ 50).6

Häufig ist in der Praxis die Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen genauer als

die Bestimmung des Umsatzes, bei der das Verhältnis zweier verschiedener Stoffe

Page 45: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 31

wie Ester und Alkohol bestimmt werden muß, in diesen Fällen ist zur Berechnung

von E Formel 2.3 die geeignetste.6 Im Rahmen dieser Arbeit wurde generell darauf

verzichtet E-Werte basierend auf Umsatzbestimmungen zu berechnen. Vielmehr

wurden alle E-Werte mittels Enantiomerenüberschüssen des Substrats und des

Produkts nach Formel 2.3 berechnet.

Bei der Definition von E wird vorausgesetzt, daß eine Michaelis-Menten Kinetik als

Reaktionsmechanismus vorliegt, daß die Reaktion irreversibel ist, daß keine

Produktinhibierung vorliegt, daß nur eine Katalysatorspezies vorliegt und daß die

Reaktionslösung homogen ist.6,106,106,112 Auf diese Voraussetzungen soll im

folgenden näher eingegangen werden:

a) Reaktionsmechanismus nach Michaelis-Menten:

Es konnte gezeigt werden, daß Lipasen katalysierte Reaktionen nach einem ping-

pong-bi-bi-Mechanismus verlaufen.113 Kinetische Racematspaltungen nach einem bi-

bi-Mechanismus verlaufen allgemein unter Involvierung eines nicht-chiralen und

eines chiralen Substrates sowie Produktes.103 CHEN et al. setzen aber für ihre

Herleitung des E-Werts eine Michaelis-Menten Kinetik nach einem uni-uni-

Mechanismus voraus und betrachten formal nicht die Involvierung mehrerer

Substrate und Produkte. Von STRAATHOF et al. werden unter Berücksichtigung

mehrerer möglicher bi-bi-Meachanismen bis zu acht verschiedene Formeln zur

Berechung von E vorgeschlagen.103 Diese haben sich jedoch nicht durchgesetzt, da

sich vielfach die häufig nur geringen Abweichungen von einem uni-uni-Mechanismus

erst bei hohen Umsätzen beobachten lassen.103 Für Esterhydrolysen im wäßrigen

Medium ist zudem die Näherung einer Michaelis-Menten Kinetik meist gut erfüllt.114

b) Reversibilität:

Allgemein wird davon ausgegangen, daß enzymatische Hydrolysen aufgrund der

hohen Konzentration des Lösungsmittels Wasser (55.5 M) irreversibel verlaufen. Bei

enzymatischen Transacylierungen unter Einsatz von Enolestern mit hinreichend

hohem Überschuß des Acyldonors und geringen Wassergehalten spielt eine

Rückreaktion des gebildeten Esters ebenfalls keine Rolle.107 Der gebildete Ester

kann prinzipiell allerdings als Acyldondor fungieren, wodurch der zweite Teilschritt

der Transacylierung reversibel wird.115 Ebenfalls können geringe Mengen Wasser zu

Page 46: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

32 THEORETISCHER TEIL

Hydrolysereaktionen führen.116 Für Gleichgewichtsreaktionen wurde von CHEN und

SIH ebenfalls eine Methode zur Bestimmung von E unter Kenntnis der

Gleichgewichtskonstanten K entwickelt (Formel 2.4).107 Wie aus Abb. 2.9 hervorgeht,

fallen bei reversiblen, kinetischen Racematspaltungen die ee-Werte des Substrats

bei Umsätzen über 50 % deutlich ab. Nicht umgesetztes Substrat kann also im Falle

einer reversiblen Reaktion nicht mehr enantiomerenrein erhalten werden. Hohe

ee-Werte des Substrats bei großen Umsätzen deuten hingegen auf eine extreme

Gleichgewichtslage (K ≈ 0, Fall a in Abb. 2.9) hin.

Formel 2.4: )])]

P

P

S

S

ee-(1c K)(1-[1 lnee(1c K)(1-[1 ln

c))](1eeK)(c(1[1 lnc))](1eeK)(c(1[1 ln

E+

++=

−−+−−++−

=

(mit: c = Umsatz, Pee = ee-Wert des Produkts, See = ee-Wert des Substrats)

Abb. 2.9: Abhängigkeit der ee-Werte a) des Produkts und b) des Substrats bei

reversiblen kinetischen Racematspaltungen mit E = 100 für verschiedene

Gleichgewichtskonstanten K (K = a: 0, b: 0.1, c: 0.5, d: 1, e: 5).

ANTHONSEN et al. haben einen einfachen Weg zur Bestimmung E und K entwickelt,

indem sie in einem regressiven mathematischen Verfahren über eine Serie von eeS-

und eeP-Werten eine Fit E-Wert Funktion berechnen.117

c) Substrat- oder Produktinhibierung

Bei dem Vorliegen von Produktinhibierung kann sich der E-Wert über den

Reaktionsverlauf ändern.118,119 Um den E-Wert zu beeinflussen, muß allerdings eine

enantioselektive Inhibierung vorliegen118, die sogar eine Rückreaktion des Produkts

Page 47: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 33

begünstigen kann119. In verdünnten Lösungen sind diese Effekte jedoch als gering

einzuschätzen.112b)

d) Reinheit des Biokatalysators:

Besteht ein Enzym aus verschieden Isoenzymen oder enthält ein Enzym

Verunreinigungen anderer Enzyme, wie häufig in kommerziellen nur roh

aufgereinigten Präparationen, so stellt der E-Wert ein gewichtetes Mittel aller

Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar. KARNERVA et al. haben

beispielsweise unterschiedliche Selektivitäten für Isoenzyme der Candida rugosa

Lipase in Hydrolysereaktionen beobachtet.120 Auch für die Schweineleber-Esterase

werden in verschiedenen Publikationen unterschiedliche Selektivitäten der einzelnen

Isoenzyme postuliert.130,131 Im Falle der Candida antarctica Lipase sind zwei

Isoenzyme bekannt, die signifikante unterschiedliche katalytische Eigenschaften auf-

weisen. Ausgewählte physikalische Eigenschaften der Isoenzyme CAL-A und CAL-B,

welche die Unterschiedlichkeit beider Katalysatoren verdeutlichen, sind in Tabelle 2.4

aufgeführt.121

Tabelle 2.4: Charakteristika der Isoenzyme der Candida antarctica Lipase

CAL-A CAL-B

Molekulargewicht122 45 kD 33 kD

Isoelektrischer Punkt (pI)122 7.5 6.0

pH-Optimum123 7 7

spezifische Aktivität123 420 LU/mg 435 LU/mg

pH-Stabilität122 6-9 7-10

Grenzflächenaktivierung123 schwach nein

Page 48: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

34 THEORETISCHER TEIL

Ein allgemein deutliches Anzeichen für ein Abweichen der angenommenen

Voraussetzungen ist eine Änderung des E-Werts über den Verlauf der Reaktion.124

Auch liefert ein Vergleich des experimentell bestimmten Umsatzes mit dem nach

Formel 2.5 berechneten Umsatz114 Hinweise auf die Konsistenz der durchgeführten

Berechnungen.

Formel 2.5: PS

Sber eeee

eeUmsatz

+=

Im allgemeinen werden für enzymatische Reaktionen E-Werte nach CHEN und SIH

zur übergreifenden Vergleichbarkeit angegeben, ohne explizit anzugeben, ob die

kinetischen Voraussetzungen erfüllt sind. Von STRAATHOF et al. wird sogar generell

die Gültigkeit der Formel 2.1 und Formel 2.2 für Reaktionen nach einem bi-bi-

Mechanismus bestritten.103 Vor diesem Hintergrund sollen im Rahmen dieser Arbeit

verschiedene enzymatische Hydrolysen und Transacylierungen möglichst einfach

untereinander verglichen werden. Obwohl nicht alle Voraussetzung für die formale

Gültigkeit der Formeln zur Berechnung von E erfüllt sind, werden in dieser Arbeit

E-Werte nach CHEN und SIH zu einer einfachen und übersichtlichen Vergleichbarkeit

angegeben, da eine Angabe von ee-Werten über den Umsatz wenig sinnvoll

erscheint und außerdem keine Untersuchungen zur Kinetik durchgeführt werden

sollen.

Für präparative Zwecke interessant und somit das angestrebte Ziel in dieser Arbeit

sind kinetische Racematspaltungen mit einem E-Wert größer 20, denn sie können in

der Synthese genutzt werden (Abb. 2.10).6,110 Aus den Kurven für die Abhängigkeit

der ee-Werte vom Umsatz kann man bestimmen, bei welchem Umsatz eine Reaktion

abzubrechen ist, um Produkt oder Substrat mit möglichst hohem Enanantiomeren-

überschuß und möglichst großer Ausbeute zu erhalten (Abb. 2.10).

Page 49: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 35

Abb. 2.10: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (S) und Produkt (P) in einer

kinetischen Racematspaltung bei einer Selektivität von E = 21.

Eingezeichnet ist ein Umsatz von 63 %, ab dem das Substrat (S)

enantiomerenrein vorliegt.

2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien

Hydrolasen sind in großer Anzahl kommerziell erhältlich.4 Allerdings werden in der

organische Synthese davon vorwiegend nur einige wenige, empirisch ausgewählte

eingesetzt.5,6,21 Diese Enzyme sind besonders gut untersucht und über einen langen

Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell verfügbar. Im einzelnen

sind diese Enzyme in Tabelle 2.5 aufgeführt.

Page 50: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

36 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.5: Wichtige Hydrolasen mit ausgewählten Eigenschaften

Schweinepankreas-

lipase (PPL)

Molekulargewicht: 50 kDa

Substrate: sekundäre Alkohole, primäre Alkohole

Burkholderia

cepacia Lipase

(BCL)

ehemals: Pseudomonas cepacia Lipase (PCL)

Molekulargewicht: 33 kDa

Substrate: sekundäre Alkohole, primäre Amine

Protein kann rekombinant aus Pseudomonas Spezien

gewonnen werden.

Candida rugosa

Lipase (CRL)

Molekulargewicht: 63 kDa

Substrate: große cyclische, sekundäre Alkohole

Präparationen können ein bis fünf Isoenzyme120,125, die in

Reaktivität und Selektivität variieren, aber die gleiche

Enantiopräferenz120 zeigen, enthalten.

Lipase B aus

Candida antarctica

(CAL-B)

Molekulargewicht: 33 kDa

Substrate: kleine sekundäre Alkohole, primäre Amine

Protein wird rekombinant aus Aspergillus oryzae

produziert.126,127

Schweineleber-

Esterase (PLE)

Molekulargewicht: 165 kDa (Trimer)128

Substrate: Carbonsäuren, sterisch gehinderte Alkohole

PLE ist eine Mischung mehrerer Isoenzyme mit komplexer

Mikroheterogenität.128,129 Die Isoenzyme können signifikante

Unterschiede in Aktivität und Selektivität, sowie in ihrer

Enantiopräferenz zeigen.130,131 Die Gewinnung einer

rekombinanten, isoenzymeinheitlichen PLE ist seit kurzem

bekannt.131a),b)

Angabe der bevorzugten Substrate nach NAEMURA et al.132,6

Angabe des Molekulargewichts, außer für PLE, nach BORNSCHEUER und KAZLAUSKAS.6

An das Enzym eines möglichen technischen Prozesses zur Darstellung eines

Tramadol-Analogons, der einen enzymatischen Zwischenschritt beinhaltet, werden

folgende Ansprüche gestellt: es katalysiert die gegebene Reaktion mit hoher Aktivität

und Selektivität, es ist unter den Reaktionsbedingungen stabil und es ist möglichst

Page 51: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 37

lange in gleicher Qualität und Präparation zu einem annehmbaren Preis kommerziell

verfügbar. Dies trifft im besonderen auf die obengenannten Enzyme zu, die daher in

dieser Arbeit besondere Beachtung finden.

Es ist wohlbekannt, daß Lipasen sowohl in wässrigen als auch in unpolaren Medien

katalytisch aktiv sind und eine breite Palette auch nicht natürlicher Substrate

akzeptieren. Dies liegt an der Flexibilität der Proteinkette, die eine Vielzahl von

Konformationen annehmen kann, um Substrate aufzunehmen, weshalb Lipasen

auch als „induced fit“ Enzyme bezeichnet werden. Jedoch macht diese Eigenschaft

eine Vorhersage der stereochemischen Wechselwirkung von Enzym und Substrat

schwierig. Viele Enzyme zeigen im wäßrigen Ein- oder Zweiphasensystem ihre

größte katalytische Aktivität, da sie im wässerigen Medium ihrem optimalen

pH-Bereich und ihrer optimale Solvatation ausgesetzt sind.133 Aufgrund der erhöhten

Flexibilität von Enzymen im wässerigen Medium können Substrate akzeptiert

werden, die im organischen Medium nur unzureichend umgesetzt werden. Verlaufen

Hydrolysen jedoch mit schlechter Enantioselektivität, so sollte die Enzymkatalyse auf

die entsprechende Transacylierung im organischen Medium erweitert werden. Im

organischen Medium haben hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so

daß hier Substrate eingesetzt werden können, die nicht im wässerigen Milieu

umgesetzt werden können. Eine Umsetzung hydrolyselabiler Verbindungen ist ein

weiterer Vorteil.

Zusätzlich verhalten sich Hydrolyse und Transacylierung unter dem Blickpunkt der

asymmetrischen Synthese enantiokomplementär, so daß durch einen Wechsel des

Reaktionsmediums ebenfalls beide Enantiomere dargestellt werden können.

Im Rahmen dieser Arbeit sollen daher beide Möglichkeiten des Reaktionsmediums

der enzymatischen Racematspaltung untersucht werden, um eine möglichst breite

Grundlage zur Gewinnung von enantiomeren Tramadol-Analoga zu schaffen.

Page 52: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

38 THEORETISCHER TEIL

2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in

der enzymatischen Hydrolyse

Bei den in die enzymatische Hydrolyse einzusetzenden Verbindungen handelt es

sich um Tramadol-Analoga mit einer phenolischen oder sekundären Hydroxylgruppe,

die durch eine geeignete Wahl des Acylrestes in Ester überführt werden und so als

Substrate eingesetzt werden können.

Üblicherweise werden für Lipasen-katalysierte Hydrolysen langkettige Ester von

Fettsäuren bevorzugt, die dem Vorbild der Triglyceride entsprechen. Dagegen

werden Esterase-katalysierte Hydrolysen am besten mit Estern kurzkettiger

Carbonsäuren durchgeführt.6,110,101 Um bei der Wahl der Acylgruppe sowohl den

Lipasen als auch den Esterasen ein Substrat zu bieten, daß umgesetzt werden kann,

wurde die Butyratgruppe als Standard gewählt, da Buttersäureester sowohl von

Lipasen als auch Esterasen als Substrate akzeptiert werden.

So gelang COOPE et al. beispielsweise die PLE-katalysierte Hydrolyse eines tertiären

Quinclidinol Esters nur im Falle eines Butyrats als Acylgruppe mit ausreichender

Aktivität.134 In anderen Beispielen konnten KAZLAUSKAS135 et al. sowie WHITESIDES136

et al. für einige Fälle Lipasen-katalysierter Hydrolysen zeigen, daß bei einem

Wechsel der Acylgruppe vom Acetat zum Butyrat ein Anstieg der Selektivität zu

beobachten war. In der Umkehrreaktion zu Hydrolyse, der PLE-katalysierten

Transacylierung racemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und

-butyrat, konnten GAIS et al. ebenfalls beobachten, daß bei größerer Kettenlänge des

Acyldonors eine Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität auftritt.81,84

Zur Verbesserung der Löslichkeit von Substraten im wäßrigen Medium ist die

Zugabe von Cosolventien wie Aceton, Methanol, tert-Butanol oder DMSO möglich,

diese werden dabei in Konzentrationen bis zu 20 % toleriert.5,6,8,137,138 Bei

Untersuchungen zum Einfluß des Cosolvens auf die PLE-katalysierten Hydrolyse von

meso-Diestern konnten GUANTI et al. zeigten, daß die besten Ergebnisse hinsichtlich

Ausbeute und Selektivität durch einen Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens

erreicht wurden.138 Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für die im Rahmen dieser

Arbeit durchgeführten enzymatische Hydrolysen im wäßrigen Einphasensystem

standardmäßig ein Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt. Eine

mögliche Nebenreaktionen der Alkoholyse des Cosolvens, also der enzymatischen

Acylierung des Cosolvens statt des Wassers, ist aufgrund der tertiären Hydroxyl-

gruppe am tert-Butanol nicht möglich.

Page 53: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 39

2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen

in der enzymatischen Transacylierung

Lipasen katalysierte Transacylierungen mit aktivierten Acyldonoren (Abb. 2.11)

verlaufen im allgemeinen schnell und das Gleichgewicht der Transacylierung liegt auf

der Seite der Produkte.

C7H15 S

O

O

ON

O

O

O O

C3H7 O

O

CF3

O

O

O

O

O

O

O

O OEt

Enolester:

Aktivierte Ester: Anhydride:

32 33 34 35

Abb. 2.11: Beispiele für gebräuchliche Klassen von aktivierten Acyldonoren zur

irreversiblen enzymatischen Transacylierung.

Die bedeutensten aktivierten Acyldonoren sind Enolester, wie Vinylacetat (32) oder

Isopropenylacetat (34). Der aus Enolestern entstehende Alkohol tautomerisiert zur

Carbonylverbindung, wodurch das Gleichgewicht der Transacylierung auf der Seite

der Produkte liegt. Die meisten Lipasen tolerieren die Anwesenheit von Acetaldehyd.

CRL bildet hier eine bekannte Ausnahme139,140,141. Neuere Untersuchungen gehen

von einer Reaktion des Acetaldehyds mit Lysin-Resten des Proteins unter Bildung

einer Schiff´schen Base aus, wodurch eine positive Ladung von der

Proteinoberfläche entfernet wird und zur Deaktivierung des Enzyms führt (Abb.

2.12).140,142,143,144,145 Als Alternative bieten sich hier die Acylierungsmittel

Isopropenylacetat (34) und 1-Ethoxyvinylacetat142,146 (35) an, da die aus diesen

Reagentien gebildeten Alkohole zu den weniger reaktiven Verbindungen Aceton bzw.

Essigsäureethylester tautomerisieren. 1-Ethoxyvinylester sind allerdings schwer

zugänglich.

29 30 31

Page 54: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

40 THEORETISCHER TEIL

Lys NH3O

H

Lys N- H3O

Abb. 2.12: Deaktivierung von Proteinen durch Acetaldehyd.

Im Falle der Enolester und Anhydride verläuft die Transacylierung praktisch

irreversibel. Eine möglichst extreme Gleichgewichtslage ist in kinetischen

Racematspaltungen von entscheidender Bedeutung, da eine mögliche Rückreaktion

den Enantiomerenüberschuß des verbleibenden Substrats und somit den E-Wert der

Reaktion herabsetzt (s. Kap. 2.3.1.1).165 Es wurden daher in den im Rahmen dieser

Arbeit durchgeführten Transacylierungen nur Enolester als Acylierungsmittel

eingesetzt. Alle Acylierungsmittel sind vor ihrer Verwendung über Na2CO3 destilliert

worden, um die Anwesenheit von Säurespuren, die eine nicht-enzymatische

Reaktion katalysieren könnten, auszuschließen.

In einer großen Zahl an Veröffentlichungen wird beschrieben, daß

Proteineigenschaften, wie die Enantioselektivität von Enzymen, durch die Art des

Lösungsmittels, das als Reaktionsmedium eingesetzt wird, beeinflußt werden

können.147,148 Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß unpolare Lösungsmittel

besser für eine Enzymkatalyse geeignet sind, da das an das Enzym gebundene und

zur Entfaltung der Aktivität notwendige Wasser nicht entfernt wird.149 Stark

hydrophile Lösungsmittel können das aktive Zentrum dehydratisieren und sind daher

zur Enzymkatalyse nur bedingt geeignet. Neben der Aktivität wird auch die

Selektivität von Enzymen stark durch die Eigenschaften des Lösungsmittels

beeinflußt. Mehrere Hypothesen zur Erklärung dieses Phänomens wurden bereits

formuliert. So kann nach KLIBANOV et al. die Enzymkonformation durch die Polarität

des Lösungsmittels modifiziert werden und so den molekularen Erkennungsprozeß

zwischen Enzym und Substrat beeinflussen.150 Nach einer weiteren Hypothese hängt

die Selektivität von der Energetik der Substratsolvatisierung ab.151 Eine andere

Theorie beruht auf der Vorstellung, daß Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum

binden und bei der Assoziierung des Substrats interferieren.152 Allerdings sind diese

Hypothesen hinsichtlich ihres Vorhersagewertes unbefriedigend. Sie scheinen

entweder nur für das jeweils betrachtete Enzym und Substrat gültig zu sein, oder es

Page 55: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 41

ist, wie im Falle von Lösungsmittel-Enzym-Komplexen, überhaupt keine

Verallgemeinerung möglich.

Zusammenfassend scheint weiterhin gegenwärtig keine Gemeinsamkeit zwischen

den verschiedenen Hypothesen zu existieren, obgleich es wahrscheinlich ist, daß

das Lösungsmittel die enzymatische Selektivität über mehr als einen Mechanismus

beeinflußt. Eine allgemeingültige Aussage über das optimale Medium für eine

Enzymkatalyse unter bestimmten Bedingungen ist daher nicht möglich. Daraus läßt

sich folgern, daß für jede Reaktion eine Optimierung der Lösungsmitteleigenschaften

durchzuführen ist.153

Um diese Möglichkeit der Veränderung von Enzymeigenschaften durch den

Lösungsmitteleinfluß zu beschreiben, wird der Ausdruck „Medium-Engineering“

verwendet, um damit eine Alternative zum oder auch eine Vervollständigung des

„Protein-Engineering“ zu bezeichnen.147 Die bislang publizierten Ergebnisse haben

gezeigt, daß für eine Modifizierung oder Verbesserung der Enzymselektivität das

Medium-Engineering eine gute Alternative zum Protein-Engineering und zur

zeitaufwendigen Suche nach neuen Katalysatoren ist.

Page 56: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

42 THEORETISCHER TEIL

2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von

Tramadol-Analoga

2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen

Da nur ein kleiner Teil der bekannten Wirkstoffe eine sekundären Hydroxyfunktion

enthält, ist der weitaus größere Anteil kein klassisches Substrat für die bisher

etablierten enzymatischen Racematspaltungen. Viele Wirkstoffe haben zwar eine

Aminofunktion mittels derer eine Aminoacylasen-katalysierte Racematspaltung

durchgeführt werden könnte154, die Aminogruppe kann aber wie im Beispiel von

rac-7 einer solchen Reaktion unzugänglich sein. Ein neuerer Ansatz, der bereits in

eigenen Vorarbeiten verfolgt wurde80, ist die in Wirkstoffen weitaus häufigere

phenolische Hydroxylgruppe in einer Hydrolasen-katalysierten Racematspaltung zu

nutzen. Dieser Ansatz bietet neue Herausforderungen, da die Distanz zu

vorhandenen Chiralitätszentren beträchtlich erhöht ist.

Hydrolasen-katalysierte Umsetzungen von phenolischen Estern sind in der

Schutzgruppentechnik bereits etabliert.155 Enzyme ermöglichen eine gezielte

Entfernung enzymlabiler Schutzfunktionen unter milden Reaktionsbedingungen, wie

beispielhaft an der enzymatischen Hydrolyse des phenolischen Acetats an einem

4-Acetoxybenzyloxycarbonyl Urethan mit anschließender Fragmentierung gezeigt ist

(Abb. 2.13)156.

NH

OR

O

O

O NH

OR

O

O

NH2

Acetyl-esterase

pH 7.0,45 ºC

R

R = Lipoprotein

Abb. 2.13: Enzymatische Spaltung der 4-Acetoxybenzyloxycarbonyl-Schutzgruppe.

In mehreren Untersuchungen konnte bereits auch gezeigt werden, daß Hydrolasen in

der Lage sind, Reaktionen von Phenolen oder Phenylestern sowohl mit hoher

Regio-157,158 als auch Chemoselektivität157,159 zu katalysieren. Aufgrund dessen

Page 57: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 43

empfehlen sich Enzym-katalysierte Hydrolysen von Phenylestern nicht nur für

Schutzgruppenoperationen, sondern auch allgemein für die organische Synthese.

Um den Ansprüchen der modernen organischen Synthese voll gerecht zu werden,

sollte die Methodik der Enzym-katalysierten Transformation der Phenolgruppe

allerdings auch in einer enantioselektive Art möglich sein.

Für enzymatische Enantiomeren-differenzierende Racematspaltungen von Phenol-

derivaten sind jedoch bis heute nur wenige Beispiele bekannt.

Ein gut untersuchtes Substrat mit axialer Chiralität ist das 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol

(rac-36) bzw. dessen Ester. MIYANO et al. beschrieben 1987 die Schweinepankreas-

lipase katalysierte Hydrolyse eines Divaleriansäureesters (rac-37a) mit sehr guter

Selektivität (Abb. 2.14).160 Die Hydrolyse eines solchen Diesters bezieht zwei Stufen

enzymatischer Racematspaltungen ein. Solche zweistufigen Hydrolysen lassen in

der Theorie einen höheren ee-Wert der Produkte als einstufige Reaktionen

erwarten161. Der als primäres Produkt entstehende Monoester konnte nur in geringen

Mengen nachgewiesen werden, da er umgehend vom Enzym weiter umgesetzt wird.

Wird ein Monoester direkt als Substrat eingesetzt, verläuft eine Lipasen-katalysierte

Hydrolyse ebenfalls mit hoher Selektivität (E > 100).162,163 Einer Schweineleber-

Esterasen-katalysierten Hydrolyse ist das entsprechende Butyrat rac-37b nicht

zugänglich164. Des weiteren konnte von INAGAKI et al. demonstriert werden, daß das

1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol (rac-36) auch direkt als Substrat in eine Lipasen-

katalysierte Transacylierung eingesetzt werden kann, die mit guter Selektivität

verläuft (E > 60) und auf der Stufe des monoacylierten Produkts stehen bleibt.162

Allerdings zeigte die von INAGAKI et al. eingesetzte Lipase aus Pseudomonas sp. eine

zu den bisherigen eingesetzten Lipasen entgegengesetzte Enantiopräferenz. WANG

et al. war es zuvor nicht gelungen rac-36 mit verschiedenen Lipasen sowie der

Cholesterolesterase zu acylieren.165

OO

R

O

R

O

OHOH

OO

R

O

R

O

EnzymH2O

+

rac-37 a = nBu (−)-(aS)-36 (+)-(aR)-37 a b = nPr b

Abb. 2.14: Enzymatische Hydrolyse von Estern des 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols.

Page 58: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

44 THEORETISCHER TEIL

KAZLAUSKAS konnte weiterhin unter Verwendung des Enzyms Cholesterolesterase

zeigen, daß nicht nur substituierte 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diole, sondern auch

entfernte Derivate mit sehr guten Selektivitäten hydrolysiert werden und somit ein

allgemeiner Zugang zu enantiomerenreinen Verbindungen diesen Typs existiert.166

In systematischen Untersuchungen zur Lipasen-katalysierten Hydrolyse von

verschiedenen substituierten racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-

tetrahydroisoquinolinylestern konnten HOSHINO et al. zeigen, daß Ester von

Phenolen, bei denen das Chiralitätszentrum mehrere C-Atome von der Phenolgruppe

entfernt ist, Substrate für eine enzymatische kinetische Racematspaltung sind. Unter

anderem zeigte sich hierbei die Lipase aus Candida rugosa als geeigneter

Katalysator. Somit stellt die Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung von

phenolischen Substraten eine Möglichkeit zur Gewinnung von enantiomerenreinen

Verbindungen dar. Die erzielten Selektivitäten in den Lipasen-katalysierten

Reaktionen waren allerdings niedrig, es konnten E-Werte im Bereich von 2 bis

maximal 11 erreicht werden.167

NMe

MeOOMe

AcO

MeO

n

Lipase

H2O gesättigtesorganischesLösungsmittel

NMe

MeOOMe

HO

MeO

n

NMe

MeOOMe

AcO

MeO

n+H H

Abb. 2.15: Enzymatische Hydrolyse von racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxy-

phenyl)-tetrahydroisoquinolinylestern.

ACHIWA et al. stellten einen neuen Zugang zu (R)-α-Tocopherol vor, indem sie eine

am aromatischen Ring demethylierte Vorstufe in eine Lipasen-katalysierte kinetische

Racematspaltung einsetzten (Abb. 2.16). Auch hier war die Selektivität der Hydrolyse

des phenolischen Esters, wahrscheinlich ebenfalls aufgrund des entfernten

stereogenen Zentrums, gering (E ≤ 10).168 Eine enzymatische Hydrolyse der am

aromatischen Ring permethylierten Verbindung, dem α-Tocopherol, war aufgrund

von sterischen Hinderungen nicht möglich. Von ZAMMATTIO et al. wird die Lipasen-

(S) (R)

Page 59: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 45

katalysierte Hydrolyse eines ähnlich aufgebauten phenolischen Substrats, mit einem

2H-Benzopyrangerüst, ebenfalls mit geringer Selektivität beschrieben (Abb. 2.17

links).169

O

AcO

R H2O O

HOR

O

AcO

R+

CRL

R = Abb. 2.16: Lipase-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tocolacetat.

Höhere Selektivitäten mit E-Werten von 24 bis 60 beobachten HUTCHINSON et al. bei

der PLE-katalysierten Hydrolyse von phenolischen Estern bei denen das

Chiralitätszentrum im Säureanteil des Moleküls und somit näher an der vom Enzym

angegriffenen Bindung lokalisiert ist (Abb. 2.17 rechts).170 Interessanterweise wurde

hier aus Löslichkeitsgründen nicht das freie Amin sondern das Hydrochlorid der Base

als Substrat eingesetzt.

R1

O

OMe

O

O N(CH2CH2OCH3)2

R2O

AcO

n

n = 1,2 R1 = H, Me, R2 = Et, nPr Abb. 2.17: Racemische Substrate mit aromatischer Hydroxylgruppe, die in

Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltungen eingesetzt

worden sind.

Ebenfalls sehr gute Selektivitäten konnten LIU et al. in der enzymatischen Hydrolyse

eines phenolischen Esters mit dem Chiralitätszentrum im phenolischen Teil des

Moleküls erzielen. Sie erzielten E-Wert bis zu 60 bei der Cholesterolesterasen-

katalysierten Hydrolyse von Essigsäureestern des Lasofoxifene (Abb. 2.18).171

⋅HCl

(S) (R)

Page 60: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

46 THEORETISCHER TEIL

ON

AcO HO AcO

+CE

H2O

Lasofoxifene

Abb. 2.18: CE-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von

Lasofoxifene.

Zusammenfassend kann nach Kenntnisstand der Literatur zu Beginn dieser Arbeit

festgestellt werden, daß Ester von aromatischen Alkoholen von Enzymen als

Substrate akzeptiert werden. Die erzielten Selektivitäten waren zu jenem Zeitpunkt

aber sehr niedrig und präparativ nicht nutzbar. Erst in jüngster Zeit ist vermehrt in

Publikationen über Enantiomeren-differenzierende Hydrolysen von Phenylestern mit

präparativ nutzbaren Enantiomerenüberschüssen berichtet worden.

In eigenen Vorarbeiten wurde das O-Desmethyltramadol (rac-8, M1) als Substrat mit

aromatischer Hydroxylgruppe für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung

ausgewählt. Das O-Desmethyltramadol, ein Hauptmetabolit des Wirkstoffs Tramadol,

und seine einzelnen Enantiomere sind für die Pharmakokinetik des Tramadols von

Bedeutung. Zudem bieten die Enantiomere dieser Verbindung nach Methylierung

Zugang zu den Enantiomeren des Tramadols.

Daß Ester des O-Desmethyltramadols, wie der (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-

(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15), als Substrate

von dem Enzym PLE akzeptiert werden, konnte bereits in diesen Vorarbeiten

demonstriert werden (Abb. 2.19).80

(5R,6S) (5S,6R)

Page 61: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 47

OH

Me2N

O

OHOH

O

Pr

+

OH

Me2N

O

O

Pr

Me2N

PLE

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung (pH 8.0)

RT

Abb. 2.19: PLE-katalysierte Hydrolyse von (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino-

methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15).

In der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 unter Zusatz von 10 % tert-Butanol

als Cosolvens konnte der enantiomerenreine Ester (+)-15 bei hohen Umsätzen

erhalten werden (Tabelle 2.6). Die Selektivität der Reaktion war insgesamt sehr

niedrig (E = 7). Unter Verwendung von 10 % Methanol als Cosolvens konnte eine

Steigerung der Aktivität und der Selektivität des Enzyms PLE beobachtet werden

(E = 11).

Tabelle 2.6: Zusammenfassung der Ergebnisse eigener Vorarbeiten zur PLE-

katalysierten Hydrolyse von rac-15

Reaktionsbedingungen E-Wert

Umsatz (nach 1.5 h) 23 %

ee Ester (+)-15 76 % 9.0 U/ml; pH 8.0;

10 % tert-Butanol ee Phenol (−)-8 51 %

7

Umsatz (nach 0.5 h) 20 %

ee Ester (+)-15 17 % 3.9 U/ml; pH 8.0;

10 % Methanol ee Phenol (−)-8 81 %

11

Es konnte somit gezeigt werden, daß in den Enzym-katalysierten

Racematspaltungen mit Verbindungen auf Basis des Tramadols eine für erste

Laborsynthesen zur Gewinnung von Enantiomeren ausreichende Selektivität erzielt

werden kann, und dies, obwohl die Chiralitätszentren nicht direkt an der zu

(+)-15

rac-15

(−)-8

Page 62: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

48 THEORETISCHER TEIL

hydrolysierenden Estergruppe lokalisiert sind. Des weiteren konnte belegt werden,

daß das zugesetzte Cosolvens einen entscheidenden Einfluß auf die Enzym-

katalysierte Hydrolyse von Tramadol-Analoga ausübt.

Page 63: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 49

2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-

(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15)

Ausgehend von den vorgestellten eigenen Vorarbeiten wurden weitergehende

Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen

Tramadol-Analoga durchgeführt. Im Vordergrund stand hierbei die Suche nach

Reaktionsbedingungen für ein in einem präparativen Maßstab nutzbaren Verfahren

zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischer

Hydroxylgruppe.

Die Schweineleber-Esterase (PLE) benötigt, wie andere Hydrolasen auch, kein

Coenzym oder Cofaktor, ist kommerziell verfügbar und verbindet eine geringe

Substratspezifität mit hoher Enantioselektivität.5 PLE ist eine der am erfolgreichsten

eingesetzten Hydrolasen in der enantiotopos-differenzierenden Hydrolyse von

Dicarbonsäure-diestern und von Diacetaten von Diolen5, welche bereits exemplarisch

in einem 100 mol Maßstab durchgeführt worden sind172. Aus diesen Gründen

erscheint die PLE als ein zweckmäßiges Enzym und wurde zunächst als

Biokatalysator für die Hydrolyse von Tramadol-Analoga beibehalten.

Da das Cosolvens in der enzymatischen Hydrolyse einen entscheidenden Einfluß

ausüben kann, wurde neben den bisher verwendeten Lösungsmitteln tert-Butanol

und Methanol ebenfalls der Einfluß von Aceton als Cosolvens auf die PLE-

katalysierte Hydrolyse des (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-

cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) untersucht (Tabelle 2.7).

Aceton ist ein übliches Cosolvens in der PLE-katalysierten Hydrolyse von Estern.5

Häufig kann ein aktivitäts- und selektivitätssteigernder Einfluß des Acetons auf die

PLE-Katalyse beobachtet werden. So berichten beispielsweise TAMM et al. von

einem Anstieg der Selektivität in einigen Fällen der PLE-katalysierten

Desymmetrisierung, wenn sie statt keinem 10 % Aceton als Cosolvens

verwendeten.173 PIETZSCH et al. untersuchten den Einfluß der Konzentration des

Cosolvens Aceton auf die Aktivität von PLE unter Standardaktivitätstest-

bedingungen.174 Sie beobachten bei einer Konzentration von 3 – 5 % Aceton eine

Aktivitätssteigerung der PLE von 75 % im Vergleich zur Aktivität der PLE ohne

Cosolvens. Sie berichten ebenfalls von einer Steigerung der Selektivität in der PLE-

Page 64: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

50 THEORETISCHER TEIL

katalysierten kinetischen Racematspaltung von Allenen bei Zusatz von 3 % Aceton

als Cosolvens.

Tabelle 2.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von

10 % Aceton als Cosolvens (3.3 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert

5 Min 52 % 27 % 46 % 4

Aus Tabelle 2.7 geht hervor, daß Aceton als Cosolvens im Vergleich zu den

Cosolventien tert-Butanol und Methanol (Tabelle 2.6) zu einer weiteren Steigerung

der Aktivität der PLE führt, da die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich zunimmt.

Dieser Einfluß auf die Reaktionsgeschwindigkeit geht allerdings mit Einbußen in der

Selektivität der Reaktion einher. Die Selektivität ist so gering, daß keine weiteren

Versuche in der Enzym-katalysierten Hydrolyse von Substraten mit aromatischer

Hydroxylgruppe mit Aceton als Cosolvens unternommen wurden. Für andere

Substrate, bei denen die Selektivität der enzymatischen Hydrolyse hoch genug ist,

kann sich die Verwendung von Aceton als Cosolvens zu einer Steigerung der

Reaktionsgeschwindigkeit anbieten.

Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten Hydrolyse von

Substraten mit aromatischer Hydroxylgruppe zu demonstrieren, wurde die PLE-

katalysierte Hydrolyse von rac-15 in einem 3.5 mmol Maßstab durchgeführt. Es

wurden die bereits optimierten und bewährten Reaktionsbedingungen pH 8.0 und

10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt (Tabelle 2.9).

Um die einzusetzenden Lösungsmittelmengen zu reduzieren wurde für diese

Versuche in einem präparativen Maßstab eine erhöhte Substratkonzentration von ca.

0.09 mol/l statt der bisher verwendeten 0.025 mol/l gewählt. Nachdem ein Umsatz

von ca. 50 % erzielt worden war, wurde die Reaktion durch kontinuierliche Extraktion

mit Dichlormethan für mindestens 24 Stunden abgebrochen. In Vorversuchen hatte

sich die kontinuierliche Extraktion als effektivste Methode zur Aufarbeitung und

Extraktion herausgestellt, da sich das gebildete Phenol (−)-8 aufgrund seiner

amphoteren Eigenschaften63 sonst nur mit Verlusten in der Ausbeute erhalten läßt.

Page 65: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 51

LINTZ et al. erhielten ebenfalls zum Teil sehr schlechte Ausbeuten bei der Extraktion

des O-Desmethyltramadols (rac-8) bei nicht kontinuierlicher Weise (Tabelle 2.8).63

Tabelle 2.8: Extraktionsausbeuten für O-Desmethyltramadol (rac-8) beim

Ausschütteln wäßriger Lösungen mit organischen Lösungsmitteln

(Verhältnis 1 : 1) in Abhängigkeit vom pH-Wert63

pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0

Chloroform 5 % 7 % 88 % 70 %

Essigsäureethylester 6 % 28 % 72 % n. b.

Nach kontinuierlicher Extraktion lassen sich das gebildete Phenol (−)-8 und der nicht

umgesetzte Ester (+)-15 durch Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1) an

Kieselgel trennen. Das (1S,2S)-konfigurierte Phenol (−)-8 konnte so in 49 %

Ausbeute mit einem ee-Wert von 76 % und der (1R,2R)-konfigurierte, nicht

umgesetzte Ester (+)-15 in 47 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 62 % erhalten

werden (Tabelle 2.9, S. 52).

Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzes

von 52 % die maximal erreichbare Ausbeute des Phenols 52 % und die des Esters

48 % beträgt.

Die Selektivität der Reaktion läßt sich entsprechend durch einen E-Wert von 13

beschreiben. Der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt über

den Umsatz der Reaktion ist in Abb. 2.20 dargestellt. Aus ihr geht hervor, daß ab

einem Umsatz von ca. 70 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein

vorliegt. Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten kinetischen

Racematspaltung zu demonstrieren, wurde daher in einem weiteren Versuch in

einem präparativen Maßstab (+)-15 enantiomerenrein dargestellt.

Page 66: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

52 THEORETISCHER TEIL

Abb. 2.20: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P)

bei einer Selektivität von E = 13.

Dazu wurden dieselben Reaktionsbedingungen wie zuvor gewählt, nur diesmal die

Reaktion nicht bei einem Umsatz von 50 % abgebrochen, sondern erst, wie aus Abb.

2.20 bestimmt, bei einem Umsatz von ca. 80 % (Tabelle 2.9 ). Der nicht umgesetzte

Ester (+)-15 konnte nach Aufarbeitung so in einer Ausbeute von 10 %

enantiomerenrein erhalten werden. Hiermit wurden sich die prinzipielle Möglichkeit

einer kinetischen Racematspaltung zu nutze gemacht, daß das nicht umgesetzte

Substrat selbst bei einer relativ schlechten Selektivität der Reaktion bei genügend

hohem Umsatz, und somit auf kosten der Ausbeute, enantiomerenrein erhalten

werden kann.

Tabelle 2.9: PLE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-15 im 3.5 mmol Maßstab

(6.5 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions-

zeit Umsatz

ee Ester

(+)-15

Ausbeute

Ester (+)-15

ee Phenol

(−)-8

Ausbeute

Phenol (−)-8 E

2 h 52 % 62 % 47 % 76 % 49 % 13

3 h 85 % ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7

Da zu Beginn der beiden Reaktionen jeweils eine starke Trübung zu beobachten

war, die im Laufe der Reaktion verschwand, ist davon auszugehen, daß aufgrund der

Page 67: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 53

geringen Löslichkeit des Esters rac-15, bei einem pH-Wert von 8.0, die

Substratkonzentration nicht mehr wesentlich erhöht werden kann. Häufig stellen

geringe Löslichkeiten von Substraten in Prozessen, die im wäßrigen Medium

durchgeführt werden, eine Limitierung der Substratkonzentration dar, obwohl es auch

einige hervorstechende Beispiele mit sehr hohen Substratkonzentrationen in

biokatalytischen Prozessen gibt.175

Auffällig in Tabelle 2.9 ist auch, daß der ermittelte E-Wert für beide Reaktionen unter

gleichen Reaktionsbedingungen mit steigendem Umsatz fällt, da dieser nach den in

Kap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen für eine gegebene Reaktion konstant sein

sollte. Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der Reaktion stellt in der Regel eine

Abweichungen von den gemachten Voraussetzungen dar. Eine Möglichkeit zur

Erklärung dieses Verhaltens ist, daß die Vorraussetzung daß nur ein Enzym (aktives

Zentrum) an der Reaktion beteiligt ist, nicht erfüllt ist. Der E-Wert stellt in diesem Fall

ein gewichtetes Mittel aller Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar.

PLE besteht aus mehreren Isoenzymen, die alle in der Hydrolyse von rac-15 beteiligt

sein können und unterschiedliche Aktivitäten und Selektivitäten zeigen. Ähnlich

haben PIETZSCH et al. auch schon zur Erklärung von schwankenden E-Werten in der

PLE-katalysierten Hydrolysen von Allen-Derivaten argumentiert.174

Zusammenfassend konnten die präparativen Möglichkeiten einer Enzym-

katalysierten kinetischen Racematspaltung von phenolischen Tramadol-Analoga am

Beispiel der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 gezeigt werden. Das Enzym

PLE zeigt eine hinreichend gute Aktivität hinsichtlich dieses nicht natürlichen

Substrates und katalysiert dessen Hydrolyse innerhalb von Stunden. Die Selektivität

der Reaktion ist allerdings noch nicht zufriedenstellend. Bei einem E-Wert von 13

läßt sich der nicht umgesetzte Ester (+)-15 in Ausbeuten von maximal 30 %

enantiomerenrein erhalten und das enantiomere Phenol (−)-8 läßt sich gar nicht mit

ee-Wert von über 90 % erhalten. Eine entscheidende Verbesserung der Selektivität

der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 konnte auch durch Variation des

Cosolvens nicht erreicht werden.

Um eine weitere Verbesserung in der Selektivität der Enzym-katalysierten Hydrolyse

von rac-15 zu erreichen, wurde auf den Versuch verzichtet, die PLE-katalysierte

Page 68: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

54 THEORETISCHER TEIL

Reaktion zu Optimieren, da hier die Aussicht durch eine weitere Variation des

Cosolvens oder der Reaktionstemperatur zu einer gesteigerten Selektivität zu

kommen, als gering betrachtet wurde. Vielmehr wurde die Möglichkeit untersucht,

daß es eine oder sogar mehrere weitere Hydrolasen gibt, welche die Hydrolyse von

rac-15 mit einer höheren Selektivität katalysieren (Abb. 2.21).

OH

Me2N

O

OHOH

O

Pr

+

OH

Me2N

O

O

Pr

Me2N

Enzym

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung

RT

Abb. 2.21: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15.

Es wurde daher ein „Enzymscreening“ mit kommerziell verfügbaren Hydrolasen

durchgeführt. Dazu wurden 5 Lipasen und drei weitere Esterasen in die Enzym-

katalysierte Hydrolyse von rac-15 eingesetzt. Die Auswahl der Enzyme erfolgte auf

Basis eines Lipasen-Screening Grundkits. Es wurde beachtet, daß die vorwiegend in

der organischen Synthese verwendeten Enzyme (s. Kap. 2.3.2, S. 35) in dieser

Auswahl vertreten sind. Als Standardbedingungen wurde ein wäßrigen

Einphasensystem aus Phosphatpuffer, pH 7.0, mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens

verwendet (Tabelle 2.10). Somit lassen sich erzielte Ergebnisse auch mit denen der

bereits durchgeführten PLE-Katalyse vergleichen.

rac-15

(+)-15

(−)-8

Page 69: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 55

Tabelle 2.10: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Enzym Reaktions-

zeit Umsatz

ee Ester

(+)-15

ee Phenol

(−)-8 E-Wert

Acetylcholinesterase (AChE; 145 U/ml); pH 8.0 7.5 h 3 % n. b. n. b. -

Candida antarctica Lipase (CAL; 0.8 U/ml) 3.8 h 8 % 3 % 3 % 1.1

Mucor miehei Lipase (MML; 0.7 U/ml) 19.5 h 25 % 11 % 30 % 2

Horse liver esterase (HLE; 0.3 U/ml) 4.0 h 31 % 17 % 51 % 4

Cholesterolesterase (CE; 22 U/ml) 24.0 h 90 % 72 % 39 % 5

Porcine pancreatic Lipase (PPL; 21 U/ml) 2.5 h 66 % 19 % 78 % 10

Burkholderia cepacia Lipase (BCL; 15 U/ml) 22.0 h 35 % 75 % 67 % 11

Candida rugosa Lipase (CRL; 3 U/ml) 3.0 h 64 % 98 % 45 % 10

Wie aus Tabelle 2.10 hervorgeht, wird die Hydrolyse des Esters rac-15 von den

meisten eingesetzten Hydrolasen mit einer ausreichend hohen Reaktions-

geschwindigkeit katalysiert.

In diesem Enzym-Screening zeigten alle katalytisch aktiven Enzyme die gleiche

Enantiopräferenz, es wurde, wie schon zuvor in der PLE-Katalyse beobachtet,

bevorzugt das (−)-Enantiomer des Esters zum aromatischen Alkohol umgesetzt.

Die Selektivitäten, die unter den Standardbedingungen des Enzym-Screenings

erreicht werden konnten, waren allerdings gering und für eine angestrebte

Racematspaltung im präparativen Maßstab zu niedrig. Nur drei Lipasen katalysieren

die Reaktion mit einer ähnlichen Selektivität wie die zuvor getestete PLE.

Von mehreren Autoren wird beschrieben, daß in Reaktionen mit Horse liver esterase

(HLE) als Katalysator geringfügig höhere ee-Werte als in der entsprechenden

Katalyse mit PLE erreicht werden können.176 In der Katalyse der Hydrolyse des

Page 70: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

56 THEORETISCHER TEIL

Esters rac-15 konnte diese Beobachtung allerdings nicht bestätigt werden, da die in

der HLE-katalysierten Reaktion erzielte Selektivität geringer ist, als die der PLE

katalysierten Reaktion.

Eine höhere Selektivität, die eine in einem präparativ nutzbaren Rahmen

durchführbare Racematspaltung zulassen würde, war insgesamt nicht zu

beobachten. Ein weiteres Austesten von neuen Hydrolasen wurde nicht

durchgeführt, da die bisher getesteten Hydrolasen als repräsentativ betrachtet

wurden. Natürlich ist nicht auszuschließen, daß unter den kommerziell oder

andersseitig verfügbaren Enzymen welche sind, die eine höhere Selektivität zeigen,

doch sollte ein Enzym nach den in Kap. 2.3.2 (S. 35) gemachten Voraussetzungen

über einen langen Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell

verfügbar sein. Diese Voraussetzung wurde für weitere Enzyme nicht ohne weiteres

als erfüllt betrachtet.

Statt dessen wurde daraufhin versucht die Reaktionsbedingungen für eine Lipasen-

katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 zu optimieren.

Schon 1958 beschrieben SARDA und DESNUELLE das für Lipasen typische Phänomen

der „Grenzflächenaktivierung“.177 Lipasen haben im allgemeinen nur eine geringe

Aktivität gegenüber nichtassoziierten Substraten, die oberhalb der kritischen

Micellenkonzentration des Substrats steil ansteigt. Lipasen benötigen zur Aktivierung

also häufig aggregierte Moleküle, wie sie in einer Emulsion oder einer mizellaren

Lösung vorliegen. 1990 konnte durch Röntgenstrukturanalyse der beiden ersten

Lipasenstrukturen der Mechanismus aufgeklärt werden178: Die „Grenzflächen-

aktivierung“ der Lipasen beruht auf einem amphiphilen Peptidsegment, das wie ein

Deckel das aktive Zentrum des Enzyms bedeckt.179 Dieser scheint in Gegenwart

einer Grenzfläche im Zuge einer Konformationsänderung aufzuklappen und so dem

Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum zu ermöglichen.180 Außerdem entsteht

beim Öffnen des Deckels eine große hydrophobe Fläche, an die das Substrat binden

kann.181 Allerdings zeigen nicht alle Lipasen diese Grenzflächenaktivierung.

Beispielsweise weist zwar die Candida antarctica Lipase (Typ B), deren

Tertiärstruktur bekannt ist, eine amphiphilen Deckelstruktur auf, aber keine Grenz-

flächenaktivierung.182

Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde daher statt eines wäßrigen

Einphasensystems eine Emulsion aus Wasser und organischem Lösungsmittel, ein

Page 71: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 57

wäßrig-organisches Zweiphasensystem, als Reaktionsmedium für eine Lipasen-

katalysierte Reaktion ausgewählt. Ein häufig in der Literatur verwendetes wäßrig-

organisches Zweiphasensystem besteht aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-

methylether im Verhältnis 1 : 1. Die Verwendung des tert-Butyl-methylethers hat den

Vorteil, daß dieser Ether keine Peroxide bildet und somit verhältnismäßig gefahrlos

eingesetzt werden kann.

In einer feinen Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether wurde

daraufhin eine Candida rugosa Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

durchgeführt (Tabelle 2.11). Die Reaktionsgeschwindigkeit und somit die Aktivität der

Candida rugosa Lipase im wäßrig-organischen Zweiphasensystem ist ähnlich der im

wäßrigen Einphasensystem. Eine Aktivierung in Form einer erhöhten

Reaktionsgeschwindigkeit ist also nicht zu beobachten. Die Selektivität der Reaktion

ist aber wesentlich größer als im Einphasensystem. So konnte das gebildete Phenol

(−)-8 mit einem ee-Wert 85 % in 30 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester

(+)-15 mit ee-Wert 75 % in 64 %Ausbeute isoliert werden. Dies entspricht einer

Selektivität von E = 27. Dieser Wert erreicht nahezu den angestrebten Bereich eines

Wertes von E ≥ 30, welcher für eine präparativ nutzbare Reaktion Voraussetzung ist.

Diese erhöhte Selektivität kann auf eine geringe Konformationsänderung der Lipase

in der Grenzfläche zurückgeführt werden. Diese Konformationsänderung bewirkt in

erster Linie, das sich der Deckel über dem aktiven Zentrum öffnet180, sie bewirkt aber

auch eine Veränderung der Polaritäten im aktiven Zentrum und somit der potentiellen

Bindungsstellen für das Substrat.181

Der vorhergehende Versuch wurde mit einer Candida rugosa Lipase durchgeführt,

die eine spezifische Aktivität von 2.4 U/mg hatte. Dieser Wert stellt für dieses Enzym

einen niedrigen dar und bedeutet, daß in dieser Enzym-Präparation neben der CRL

auch andere Enzyme und nicht katalytisch-aktive Proteine vorliegen, die auf die

Katalyse Einfluß nehmen können. Um einen etwaigen Einfluß anderer Proteine

auszuschließen oder wenigstens zu minimieren, wurde daraufhin eine weiter

aufgereinigte Präparation der Candida rugosa Lipase mit einer spezifischen Aktivität

von 37.0 U/mg in die Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-15 im wäßrig-

organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.11). Diese aufgereinigte

Candida rugosa Lipase ist ebenfalls kommerziell verfügbar.

Page 72: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

58 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.11: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem (2.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1)

spezifische

Aktivität Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert

2.4 U/mg 3.25 h 51 % 75 % 85% 27

37.0 U/mg 5.25 h 33 % 58 % 90 % 34

Aus dieser Reaktion konnte das gebildete Phenol (−)-8 mit einem ee-Wert 90 % in

27 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester (+)-15 mit ee-Wert 58 % in 58 %

Ausbeute isoliert werden. Die Selektivität dieser Reaktion kann mit einem E-Wert von

34 beschrieben werden. Diese weitere Erhöhung der Selektivität kann durch den

Ausschluß von Nebenaktivitäten in der Enzympräparation erklärt werden. In Abb.

2.22 ist der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt für diesen

E-Wert gegen den Umsatz aufgetragen.

Abb. 2.22: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P)

bei einer Selektivität von E = 34.

Die erzielte Selektivität von E = 34 ist die höchste, die in einer Enzym-katalysierten

kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Anolga mit phenolischer Hydroxylgruppe

bisher erreicht worden ist. Sie liegt zudem in dem angestrebten Bereich von E ≥ 30.

Dies bedeutet, wie auch in Abb. 2.22 zu erkennen ist, daß ab einem Umsatz von ca.

Page 73: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 59

60 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein vorliegt und in einer

maximalen Ausbeute von ca. 40 % erhalten werden kann.

Es konnte somit gezeigt werden, daß eine Enzym-katalysierte Hydrolyse eines

Esters auf Tramadol-Basis unter Einbezug einer phenolischer Hydroxylgruppe mit

hoher Selektivität und Aktivität möglich ist. Dies, obwohl die vom Enzym

anzugreifende phenolische Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereo-

zentren der Verbindungen entfernt ist.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 8 erfolgte

durch Vergleich der Drehwerte mit bereits publizierten.91,183 Von der Grünenthal

GmbH ist für das Hydrochlorid des (+)-(R,R)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-

cyclohexyl)-phenols ein Drehwert von D20][α = + 5.4º (c = 1.0, MeOH) veröffentlicht

worden.91 Hierbei ist die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-8⋅HCl durch

Röntgenstrukuranalyse erfolgt.184

Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 15 und 16 erfolgte in Analogie

zu der des Phenols 8.

2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-

(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)

Neben den Effekten des Cosolvens auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Estern

des O-Desmethyltramadols (rac-8), ist auch der Einfluß der Acylgruppe des

Substrats auf die Aktivität oder Selektivität der enzymatischen Reaktion von

Interesse.

Im allgemeinen stellt für Lipasen die einzige Limitierung hinsichtlich des akzeptierten

Substratspektrums ihre begrenzte Eignung für die Umsetzung raumerfüllender

Acylgruppen dar: gemäß dem Vorbild der Triglyceride werden lineare aliphatische

Acylgruppen besser umgesetzt als z.B. Arene.101,110,185

Page 74: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

60 THEORETISCHER TEIL

Im Gegensatz zu Lipasen akzeptiert die PLE als Esterase keine stark hydrophoben

Substrate wie z.B. Triglyceride, sondern idealerweise wasserlösliche Ester. Daher

ergibt sich hinsichtlich der Substratstruktur für die PLE die Einschränkung kurzkettige

lineare aliphatische Acylgruppen einzusetzen. So werden Acetate von Alkoholen am

häufigsten von der PLE hydrolysiert. Längerkettige Acylgruppen werden nur in

Ausnahmefällen als Substrate akzeptiert.

Dieser Unterschied in dem Substratspektrum zeigt auch das sicherste Merkmal, um

eine Esterase als „Lipase“ zu klassifizieren: die Fähigkeit langkettige Glycerinester zu

hydrolysieren.101,185,186

Ebenfalls unter dem Aspekt der Wirtschaftlichkeit eines möglichen enzymatischen

Teilschrittes in der industriellen Synthese eines Tramadol-Analogons sollte die zu

verwendende Acylgruppe möglichst kurz sein. Denn das Substrat muß zuvor in

einem separaten Schritt verestert werden, wobei eine kürzere Acylgruppe eine

geringere einzusetzende Menge bedeutet. In der anschließenden Racematspaltung

wird der enzymatisch hydrolysierte Acylrest verworfen, dabei reduziert eine kürzere

Acylgruppe die zuverwerfende Masse.

Von diesen Voraussetzungen ausgehend wurde daher der (±)-Essigsäure-3-

(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) synthetisiert.

Wie bereits in Kap. 2.2 auf S. 21 dargestellt wurde, ist rac-16 im Vergleich zu rac-15

hydrolyselabil. Die Stabilität gegen Autohydrolyse bei pH 7.0 ist noch ausreichend

groß, hingegen bei pH 8.0 nicht mehr. Es können erhebliche Mengen an

Hydrolyseprodukt nach 16 h detektiert werden (Tabelle 2.12).

Tabelle 2.12: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer-

Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol

pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt

7.0 2 h 0.1 % rac-8

8.0 2 h 1.2 % rac-8

8.0 16 h 15.0 % rac-8

Das Substrat rac-16 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Racematspaltung

eingesetzt (Abb. 2.23). Aufgrund der mangelnden Hydrolysestabilität von rac-16

Page 75: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 61

wurde ein pH-Wert von 7.0 gewählt und zur Vergleichbarkeit mit den bisherigen

Ergebnissen als Reaktionsmedium das wäßrige Einphasensystem mit 10 % tert-

Butanol als Cosolvens. Als Enzyme wurden zunächst PLE und CRL aufgrund der

bisher mit diesen Enzymen erzielten Ergebnisse eingesetzt (Tabelle 2.13, Zeilen 1

und 2).

OH

Me2N

O

OHOH

O +

OH

Me2N

O

O

Me2N

Enzym

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung

RT

Abb. 2.23: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16.

Aus Tabelle 2.13 geht hervor, daß die CRL-katalysierte Reaktion wenig langsamer

verläuft, als die des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 (Tabelle 2.10). Die

Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse von rac-16, ausgedrückt in einem

E-Wert von 2, ist erheblich geringer als die Selektivität, die mit dem Ester rac-15 als

Substrat beobachtet wurde. Dies Ergebnis deutet darauf hin, daß langkettigere

Acylreste, wie in dem Ester rac-15 vorhanden, bevorzugt von dieser Lipase

umgesetzt werden. Auf eine Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem

als Reaktionsmedium wurde daraufhin verzichtet.

Die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 bei pH 7.0 verläuft mit ähnlicher

Reaktionsgeschwindigkeit wie die Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 bei pH 8.0

nur mit geringerer Selektivität. Die Aktivität des Enzyms PLE ist unter

standardisierten Aktivitätstestbedingungen allerdings auch bei pH 8.0 größer als bei

pH 7.0. Aus diesem Grund wurde auch eine PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16

bei pH 8.0 durchgeführt, obwohl das Substrat bei diesem pH-Wert entsprechend

hydrolyselabiler ist (Tabelle 2.13, Zeile 3).

rac-16

(+)-16

(−)-8

Page 76: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

62 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.13: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-16 (Phosphatpuffer;

10 % tert-Butanol)

Reaktionsbedingungen Reaktions

zeit Umsatz

ee Ester

(+)-16

ee Phenol

(−)-8 E-Wert

Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/ml) pH 7.0 7.25 h 45 % 4 % 26 % 2

Schweineleber-Esterase (PLE; 3.3 U/ml), pH 7.0 1.75 h 36 % 35 % 52 % 4

Schweineleber-Esterase (PLE; 2.6 U/ml), pH 8.0 0.75 h 31 % 50 % 74 % 10

Bei pH 8.0 verläuft die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 entsprechend der

höheren Aktivität des Enzyms auch schneller als bei pH 7.0. Nach einer

Reaktionszeit von 0.75 h werden ca. 30 % Umsatz erreicht, bei pH 7.0 wurde zum

Erreichen des entsprechenden Umsatzes ca. 1 h länger benötigt.

Die kurze Reaktionszeit begünstigt einen höheren Enantiomerenüberschuß des

gebildeten Phenols (−)-8, da die Autohydrolyse von rac-16 vergleichsweise langsam

ist und somit bei kurzen Reaktionszeiten wenig racemisches Phenol entsteht (<1 %

in 1 h nach Tabelle 2.12). Somit ist auch trotz der geringen Hydrolysestabilität von

rac-16 eine relativ hohe Selektivität von E = 10 in dieser Reaktion möglich. Die

beobachtete Selektivität liegt im Rahmen der Selektivität, die auch schon in der PLE-

katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 erzielt wurde

(Tabelle 2.6). Verglichen mit der Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 verläuft die

Hydrolyse des kurzkettigeren Acetats rac-16 aber mit einer höheren Aktivität. Dies

Ergebnis bestätigt die zuvor gemachte Aussage, daß Acetate aufgrund ihres kurzen

Acylrests und der damit erhöhten Polarität eine größere Ähnlichkeit mit den

natürlichen Substraten besitzen und somit die geeigneteren Substrate für die PLE-

katalysierte Hydrolyse sind.

Es wurden allerdings keine weiteren Untersuchungen zur Enzym-katalysierten

Hydrolyse des Essigsäureesters rac-16 durchgeführt. Trotz der Hydrolyselabilität

dieser Verbindung lassen sich zwar enzymatische Reaktionen mit einer Selektivität

im Rahmen von hydrolysestabilen Substraten im Labormaßstab durchführen, aber

eine Umsetzung in einen größeren Maßstab ist nicht sinnvoll. Hier würde der Enzym-

Page 77: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 63

katalysierten kinetischen Racematspaltung von stabilen Verbindungen wie rac-15,

die einen Zugang zu dem gleichen Phenol (−)-8 gestatten, der Vorzug gegeben.

Zusammenfassend stellt der Buttersäureester (C4) von O-Desmethyltramadol

(rac-15) ein Substrat dar, welches gleichermaßen von Lipasen und Esterasen

akzeptiert und umgesetzt wird. Ausgehend von diesem Substrat führen kurzkettigere

Ester wie Essigsäureester (C2) rac-16 zu Substraten, die von der Esterase PLE mit

größerer Aktivität bei ähnlicher Selektivität wie der Buttersäureester umgesetzt

werden, da es sich um einen bevorzugteren Acylrest im Substrat handelt. Von

Lipasen, wie der CRL, werden diese Substrate allerdings mit geringerer Aktivität und

auch Selektivität umgesetzt, da es sich nicht um für Lipasen typische Acylreste

handelt. Des weiteren sind diese Ester schon so aktiviert, daß sie nur eine begrenzte

Stabilität gegen Autohydrolysereaktionen aufweisen, welches gerade im Hinblick auf

eine Racematspaltung in einem präparativen Maßstab ein entscheidender Nachteil

ist.

Eine weitere Verlängerung der Acylgruppe über die C4-Säure hinaus, würde zwar zu

von Lipasen bevorzugteren Substraten führen, aber auch den Nachteil einer

ungünstigeren Bilanz für die enzymatische kinetische Racematspaltung beinhalten.

Aus anwendungsbezogener Sicht ist daher ein möglichst einfacher kurzer Acylrest zu

verwenden.

Oft haben auch aktivierte Ester wie Halogen- oder Methoxycarbonsäureester einen

günstigen aktivierenden Einfluß auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse. Die

Darstellung eines Choressigsäureesters von O-Desmethyltramadol gelang aber

nicht, da diese Verbindung so reaktiv war, daß sie unter gaschromatographischen

und flüssigchromatographischen Bedingungen nicht stabil war.

2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-

(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8)

Die Hydrolyse eines Esters von rac-8 zur Gewinnung der Enantiomeren setzt die

Darstellung dieser Verbindung voraus, was einen, wenn auch geringen, Aufwand

Page 78: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

64 THEORETISCHER TEIL

darstellt. Einfacher wäre eine direkte enzymatische Acylierung von rac-8. Dies

vermag die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen Medium zu leisten.

Zudem kann auch in diesem Medium eine Racematspaltung von Verbindungen

gelingen, deren Ester hydrolyselabil sind. Auch haben im organischen Medium

hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so daß hier Substrate eingesetzt

werden können, die sonst nicht im wässerigen Milieu umgesetzt werden können. Ein

weiterer interessanter Aspekt ist, daß in der enzymatischen Transacylierung

bevorzugt das Enantiomer acyliert wird, welches in der Umkehrreaktion der

enzymatischen Hydrolyse bevorzugt hydrolysiert wird. Somit sollte in der

enzymatischen Transacylierung von rac-8 bevorzugt das (−)-Enantiomer acyliert

werden, da in der hydrolytischen Reaktion (−)-8 gebildet worden ist (Abb. 2.21).

Neben dem (−)-Ester bleibt das nicht umgesetzte (+)-8 in der Reaktion als Produkt

zurück (Abb. 2.25). Enzym-katalysierte Transacylierung und Hydrolyse sind daher

unter dem Blickpunkt der Synthese enantiokomplementär.

Unter diesen Gesichtspunkten ist die Entwicklung einer Methodik zur enzymatischen

Transacylierung von rac-8, obwohl Bedingungen zu einer selektiven Enzym-

katalysierten Hydrolyse bekannt sind, durchaus von großem Interesse und auch

anwendungsbezogen.

Da die Hydrolyse von Estern des O-Desmethyltramadols durch verschiedene

Hydrolasen katalysiert wird, sollte die Umkehrreaktion, die Transacylierung im

organischen Medium, ebenfalls von diesen Enzymen, bei Wahl der richtigen

Reaktionsbedingungen, katalysiert werden können. In eigenen Vorarbeiten gelang es

allerdings nicht, rac-8 in einer PLE-katalysierten Reaktion mit Vinylbutyrat (4 Äquiv.)

in Toluol als Lösungsmittel zu acylieren (Abb. 2.24).80 Es wurde zwar in dieser

Reaktion eine Katalysatorspezies aus MPEG/PLE gewählt, die eine höhere Aktivität

im organischen Lösungsmittel besitzt als native PLE81,82, doch ist das Enzym PLE im

allgemeinen wesentlich weniger aktiv im organischen Medium als Lipasen.5,6 Eine

Lipasen-katalysierte Transacylierung von rac-8 sollte daher trotz dieser Ergebnisses

möglich sein.

Page 79: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 65

OH

Me2N

OH+

OHO

O

PrMe2N

OH

Me2N

OH

MPEG/PLE

VinylbutyratToluolRT

Abb. 2.24: Versuch zur PLE-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8.

INAGAKI et al. führten die bereits auf S. 43 erwähnte enzymatische Acylierung des

1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols (rac-36) mit 20 Äquiv. eines Vinylesters in Diisopropyl-

ether mit 10 % Aceton als Lösungsmittel mit guter Selektivität (E > 60) durch.162 Der

Zusatz an Aceton wurde benötigt, um das Substrat zu lösen, welches in reinem

Diisopropylether nur mäßig löslich war. Von einem Einfluß des Acetons auf die

Aktivität des Enzyms oder die Selektivität der Reaktion wird nicht berichtet.

Von diesen Reaktionsbedingungen ausgehend wurden für eine Enzym-katalysierte

Transacylierung des Substrats rac-8 2 Äquiv. Vinylpropionat als Acylierungsmittel

und das Lösungsmittel Diethylether als Reaktionsbedingungen ausgewählt (Abb.

2.25).

OH

Me2N

OH+

OHO

O

EtMe2N

OH

Me2N

OH

Lipase

VinylpropionatDiethyletherRT

Abb. 2.25: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8.

Es wurden sieben Lipasen in die enzymatische Transacylierung unter den genannten

Bedingungen eingesetzt (Tabelle 2.14). Um den Verbrauch an Substrat und

eingesetzten Reagenzien möglichst gering zu halten, wurden alle Reaktionen in

einem 0.25 mmol Maßstab in 5 ml Lösungsmittel durchgeführt.

rac-8

(+)-8

(−)-15

rac-8

(+)-8

(−)-15

Page 80: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

66 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.14: Versuche zur Transacylierung des Phenols rac-8 in Diethylether

Enzym Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

Reaktions-

zeit Umsatz

Porcine pancreatic Lipase (PPL; 335 U/ml) Vinylpropionat (2) 14 d 0 %

Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 120 U/ml) Vinylpropionat (2) 14 d 0 %

Candida rugosa Lipase (CRL; 29 U/ml) Vinylpropionat (2) 14 d 2 %

Rhizopus niveus Lipase (0.026 U/ml) Vinylpropionat (2) 14 d 0 %

Candida antarctica Lipase (CAL; 3.2 U/ml) Vinylpropionat (2) 14 d 0 %

Rhizopus arrhizus Lipase (0.02 U/ml) Vinylpropionat (2) 14 d 0 %

Aspergillus niger Lipase (1 U/ml) Vinylpropionat (2) 14 d 0 %

Keine der in Tabelle 2.14 eingesetzten Lipasen katalysiert die Transacylierung von

rac-8 unter den gewählten Reaktionsbedingungen. Da die Enzyme CRL, BCL und

PPL in der Hydrolyse von rac-15 eine hohe Aktivität und eine moderate Selektivität

zeigen, ist davon auszugehen, daß diese Enzyme auch in der Acylierung von rac-8

aktiv sein sollten. Dies deutet daraufhin, daß für das Enzymscreening in Tabelle 2.14

ungeeignet Reaktionsbedingungen gewählt wurden. Hiervon ausgehend wurde

daraufhin, um bessere Bedingungen zu finden, eine ausgewählte Lipase (PPL) mit

5 Äquiv. Vinylacetat in verschiedenen Lösungsmitteln eingesetzt (Tabelle 2.15).

Page 81: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 67

Tabelle 2.15: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8

unter verschiedenen Reaktionsbedingungen (335 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

Vinylacetat (5),

Dichlormethan (H2O ges.) 28 d 2 %

Vinylacetat (5),

Trichlormethan (H2O ges.) 28 d 1 %

Vinylacetat als Solvens 12 d 6 %

Aus Tabelle 2.15 geht hervor, daß in den polaren Lösungsmitteln Dichlormethan und

Trichlormethan ebenfalls keine nennenswerte Acylierung zu beobachten ist. In

reinem Vinylacetat als Transacylierungsmittel und Lösungsmittel, was einem

Überschuß von 252 Äquiv. entspricht, ist eine geringe Enzym-katalysierte Bildung

des Acetats 16 nach 2 Wochen zu beobachten. Aufgrund des geringen Umsatzes

wurde keine Enantiomerenüberschußbestimmung durchgeführt. Die in Vinylacetat

als Solvens erzielte enzymatische Acylierung von O-Desmethyltramadol bestätigt die

zuvor gemachte Aussage, daß eine Acylierung von rac-8 unter geeigneten

Bedingungen möglich ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist aber extrem langsam. Es

wurden daher die beiden Lipasen BCL (Tabelle 2.16) und CRL (Tabelle 2.17 und

Tabelle 2.18), die in der Hydrolyse von rac-15 die größten Selektivitäten erreichten,

ebenfalls unter diesen Reaktionsbedingungen in die Transacylierung von rac-8

eingesetzt.

Page 82: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

68 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.16: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 (120 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

Nach

28 d E-Wert

Umsatz 3 %

ee Ester (−)-16 n. b. Vinylacetat (5), Diisopropylether

ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz 18 %

ee Ester (−)-16 10 % Vinylacetat als Solvens

ee Phenol (+)-8 2 %

1.2

Wie in der PPL-katalysierten Transacylierung von rac-8 wird auch mit dem Enzym

BCL eine Transacylierung mit Vinylacetat als Lösungsmittel beobachtet.

Entsprechend dem zuvor erzielten Ergebnis verläuft auch die BCL-katalysierte

Transacylierung mit einer geringen Reaktionsgeschwindigkeit. Ein Umsatz von 18 %

ist erst nach 3 Wochen zu beobachten (Tabelle 2.16). Es wird der (1S,2S)-

konfigurierte Ester (−)-16 mit einem ee-Wert von 10 % gebildet. Die Racemat-

spaltung verläuft allerdings unselektiv (E = 1.2).

Mit dem Enzym CRL wurden in der Hydrolyse von rac-15 die besten Ergebnisse

erzielt. In der enzymatischen Transacylierung ist, wie bei allen zuvor getesteten

Enzymen, kein nennenswerter Umsatz von rac-8 in den als Lösungsmittel

eingesetzten Ethern MTBE und Diisopropylether zu beobachten (Tabelle 2.17). In

Vinylacetat als Lösungsmittel ist ein Umsatz von 36 % nach 3 Wochen zu

beobachten. Die Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz, sondern

auch als Solvens, führt somit bei allen eingesetzten Lipasen zu einer Acylierung des

Phenols rac-8, wenn auch mit relativ langsamer Reaktionsgeschwindigkeit. Die in

dieser Reaktion erzielte Selektivität ist zwar die bisher höchste, die zu beobachten

war, sie ist aber ausgedrückt in einem E-Wert von 3 als schlecht zu bewerten.

Page 83: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 69

Tabelle 2.17: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl-

acetat als Acylierungsmittel (14 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

Nach

28 d E-Wert

Umsatz 2 %

ee Ester (−)-16 n. b. Vinylacetat (5), Diisopropylether

ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz 8 %

ee Ester (−)-16 n. b. Vinylacetat (5), MTBE

ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz 36 %

ee Ester (−)-16 38 % Vinylacetat als Solvens

ee Phenol (+)-8 21 %

3.0

Umsatz 66 %

ee Ester (−)-16 33 % Vinylacetat (5), Dichlormethan

ee Phenol (+)-8 26 %

2.5

Interessanterweise kann mit dem Lösungsmittel Dichlormethan in der CRL-

katalysierten Transacylierung von rac-8 mit Vinylacetat die größte Aktivität des

Enzyms beobachtet werden. Unter diesen Bedingungen werden 66 % Umsatz nach

3 Wochen erreicht. Eine Steigerung der Selektivität der CRL-katalysierten

Transacylierung verglichen mit dem Solvens Vinylacetat ist aber nicht zu

beobachten.

Von GAIS et al. ist in Untersuchungen zur MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung

racemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und –butyrat beobachtet

worden, daß mit zunehmender Kettenlänge des Acyldonors die Geschwindigkeit und

die Selektivität der Transacylierung zunehmen.81,84 Aus diesem Grund wurde

Vinylbutyrat als Acylierungsmittel in die CRL-katalysierte Transacylierung von rac-8

unter den bisher geeigneten Bedingungen, Acylierungsmittel oder Dichlormethan als

Lösungsmittel, eingesetzt (Tabelle 2.18). Mit Dichlormethan als Solvens und

Page 84: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

70 THEORETISCHER TEIL

Vinylbutyrat als Acylierungsmittel ist allerdings nicht wie zuvor im Falle des

Vinylacetats ein Umsatz zu beobachten. Die CRL-katalysierte Reaktion mit

Vinylbutyrat als Acylierungs- und Lösungsmittel hingegen verläuft mit einer ähnlichen

geringen Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität wie die Reaktion in Vinylacetat.

Eine Steigerung wie im Falle der sekundären Alkohole in der MPEG/PLE-Katalyse ist

nicht zu beobachten.

Tabelle 2.18: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl-

butyrat als Acylierungsmittel (37 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

nach

17 d E-Wert

Umsatz 4 %

ee Ester (−)-15 n. b. Vinylbutyrat (5), Dichlormethan

ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz 15 %

ee Ester (−)-15 28 % Vinylbutyrat als Solvens

ee Phenol (+)-8 15 %

2

Mit dem Acylierungsmittel als Solvens ist eine Reaktionsbedingung gefunden

worden, in der eine Lipasen-katalysierte Transacylierung möglich ist, wenn auch mit

geringer Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität. Es lag nun nahe die PLE

ebenfalls unter diesen neuen Reaktionsbedingungen einzusetzen. Zusätzlich wurden

neben dem Acylierungsmittel noch Di- und Trichlormethan als Lösungsmittel

eingesetzt (Tabelle 2.19). Da native PLE im organischen Medium nur eine geringe

Aktivität besitzt, wurde MPEG/PLE als Katalysatorpräparation eingesetzt (vgl.

Kap. 2.1). Wie aus Tabelle 2.19 hervorgeht ist eine PLE-katalysierte Acylierung von

rac-8 in Di- oder Trichlormethan als Lösungsmittel nicht durchführbar. In

Vinylpropionat als Solvens ist eine PLE-katalysierte Transacylierung zu beobachten.

Somit ist es prinzipiell gelungen die für Lipasen gefundenen Reaktionsbedingungen

auf die PLE zu übertragen, allerdings ist die Reaktionsgeschwindigkeit wie in Fall der

Lipasen äußert gering.

Page 85: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 71

Tabelle 2.19: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols

rac-8

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

Vinylpropionat (5), Dichlormethan 21 d 0 %

Vinylpropionat (5), Trichlormethan 21 d 0 %

Vinylpropionat als Solvens 4 d 5 %

Zusammenfassend ist es gelungen, Reaktionsbedingungen zu finden, unter denen

eine Enzym-katalysierte Acylierung des Phenols rac-8 durchführbar ist. Die

Reaktionsgeschwindigkeit ist allerdings in allen Fällen sehr langsam. Die bisher

erzielten Reaktionszeiten von mehreren Wochen sind wenig ansprechend und für

eine präparative Racematspaltung nicht akzeptabel. Zudem sind keine geeigneten

Reaktionsbedingungen für eine selektive enzymatische Racematspaltung des

Phenols rac-8 gefunden worden. Die bisher erzielten Selektivitäten mit E-Werten von

1 bis 3 sind ebenfalls nicht für eine Racematspaltung des Phenols rac-8 im

präparativen Sinne verwendbar.

Die höchste Selektivität in der enzymatischen Acylierung von rac-8 wird mit der

Candida rugosa Lipase beobachtet, die somit nicht nur in der Hydrolyse des

Buttersäureesters von rac-8 das geeigneteste Enzym darstellt, sondern auch das für

die Umkehrreaktion, die Transacylierung von rac-8.

Daß die enzymatischen Hydrolysen mit hoher Selektivität katalysiert werden, die

Transacylierungen im organischen Medium jedoch nicht, kann gerade im Hinblick auf

die zusätzlich noch sehr langsame Reaktion dadurch erklärt werden, daß die

eingesetzten Enzyme im wäßrigen Medium flexibler sind. Eine Anpassung der

Struktur des aktiven Zentrums an unterschiedliche Strukturmerkmale des Substrats

bei der Bildung des Substrat-Enzym-Komplexes im Sinne eines „induced fit“ ist im

wäßrigen Milieu erleichtert, da Wassermoleküle als „molekulares Schmiermittel“

fungieren können.150,187,188 Auch kann die unterschiedliche Solvatation von

Reaktanden, hier gerade des sehr polaren Phenols, und von Übergangszuständen

Page 86: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

72 THEORETISCHER TEIL

im organischen und wäßrigen Medium ein Grund für die unterschiedlichen

Selektivitäten sein.

Die in der enzymatischen Transacylierung erzielten Ergebnisse sind auch unter dem

Blickpunkt zu sehen, daß die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Reaktionen

erst einen Anfang in der Untersuchung der enzymatischen Acylierung von Tramadol-

Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe darstellen. Umfassendere

Untersuchungen zu Reaktionsparametern wie Acylierungsreagenz (s. Kap. 2.3.2.2),

Lösungsmitteleinfluß und Wasseraktivität können Reaktionsbedingungen aufzeigen,

unter denen eine selektive Enzym-katalysierte Racematspaltung von phenolischen

Substraten wie rac-8 durchaus möglich ist.

Page 87: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 73

2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-

(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)

Ein neues Tramadol-Analoga, dessen Entwicklung in der GRÜNENTHAL GmbH mit

vielversprechenden Resultaten betrieben wird, ist das (±)-(2RS,3RS)-

4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan-2-ol (rac-38, Abb. 2.26).189 Es

unterscheidet sich vom Tramadol (rac-7) dadurch, daß es statt einem Cyclohexylring

eine offenkettige Struktur besitzt. Über die analgetische Aktivität offenkettiger

Tramadolderivate ist jüngst von BUSCHMANN, SUNDERMANN und MAUL berichtet

worden.46 Sie stellen Untersuchungen über die Aktivität der Enantiomeren des

3-(3-Dimethylamino-1-ethyl-1-hydroxy-2-methyl-propyl)-phenols vor. Diese Wirkstoffe

unterscheiden sich von rac-38 durch eine um ein C-Atom verlängerte Kette an der

tertiären OH-Gruppe. Außerdem wird direkt das Phenol untersucht, welches im Falle

des rac-38 wahrscheinlich ebenfalls in vivo als Metabolit gebildet wird.

OH

Me2N

OMe

Abb. 2.26: Racemisches 4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan-

2-ol, ein Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH mit offenkettiger

Struktur.

Die Struktur des rac-38 bietet ebenso wie das Tramadol keinen direkten Angriffs-

punkt für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung. Nach O-Demethylierung steht

aber auch hier die aromatische Hydroxylgruppe zur Verfügung. Es sollte daher

versucht werden, eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung mit diesem

offenkettigem Phenol (rac-11) durchzuführen.

Zuerst wurde die enzymatische Hydrolyse des Buttersäureesters von rac-11

untersucht, da im Falle des O-Desmethyltramadols in der Hydrolyse die besten

Ergebnisse in der Racematspaltung erzielt worden waren. Es wurde der racemische

Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)

in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.27). Als Reaktions-

rac-38

Page 88: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

74 THEORETISCHER TEIL

bedingungen wurden die bisherigen Standardreaktionsbedingungen, wäßriges

Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens bei Raumtemperatur, gewählt.

Als Enzyme wurden zunächst die bisher in der Hydrolyse von Estern des

O-Desmethyltramadols erfolgreich angewendeten Hydrolasen Schweineleber-

Esterase und Candida rugosa Lipase eingesetzt (Tabelle 2.20).

OH

Me2N

O

O

Pr

+

OHO

Me2N

OH

Me2N

OH

Pr

OEnzym

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung

RT

Abb. 2.27: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17.

Die Ergebnisse der enzymatischen Hydrolysen von rac-17 sind in Tabelle 2.20

zusammengefaßt. Rac-17 wird von beiden eingesetzten Enzymen als Substrat

akzeptiert und beide Hydrolasen zeigen eine hohe Aktivität in der Hydrolyse des

Esters. Es ist allerdings nahezu keine Enantiomer-Differenzierung der beiden

Enzyme zu beobachten. Beide Reaktionen verlaufen unselektiv.

Tabelle 2.20: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-17 (Phosphatpuffer;

10 % tert-Butanol)

Enzym Reaktions-

zeit Umsatz

ee Ester

17

ee Phenol

11 E-Wert

Schweineleber-Esterase (PLE; 1.3 U/ml), pH 8.0 25 Min. 69 % 7 % 1 % 1.1

Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/ml), pH 7.0 2.5 h 17 % 1 % 3 % 1.1

Der Grund für die mangelnde Selektivität der enzymatischen Reaktionen kann nur in

der Molekülstruktur des Substrates liegen. In Molekül rac-17 fehlt die geschlossenen

Ringstruktur des Tramadol-Moleküls, daher ist das Molekül und besonders die

Dimethylaminomethyl-Seitenkette viel flexibler. Von der angreifenden Seringruppe im

rac-17

17

11

Page 89: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 75

Enzym gesehen, liegen die Stereozentren am „anderen Ende“ der angegriffenen

Acylgruppe. Ihr Einfluß auf die Enantiomer-Differenzierbarkeit des Enzyms ist

aufgrund der erhöhten Flexibilität viel geringer als beispielsweise bei rac-15.

Den Versuch rac-17 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischem

Zweiphasensystem einzusetzen, wurde nach den bisherigen Erfahrungen wenig

Erfolg in Aussicht gestellt und daher nicht durchgeführt.

2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-

3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)

Es wurde ebenfalls in einem „Enzymscreening“ untersucht, ob eine Enzym-

katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11 möglich ist und ob diese unter

Umständen selektiver verläuft als die entsprechende enzymatische Hydrolyse.

Für diese Versuchsreihe wurde allerdings Diethylether als Lösungsmittel, nach

Reaktionsbedingungen von INAGAKI et al162, gewählt, da zu dem Zeitpunkt dieser

Untersuchungen noch nicht bekannt war, daß das Transacylierungsreagenz ein

geeignetes Reaktionsmedium für die enzymatische Acylierung von Phenolen

darstellt. Um eine eventuelle enzymatische Reaktion günstig zu beeinflussen, wurde

Vinyllaurat als Acylierungsmittel gewählt (Abb. 2.28), da dies aufgrund seiner

erhöhten Kettenlänge in eine Lipasen-katalysierte Reaktion bevorzugter als

Vinylpropionat (vgl. Tabelle 2.14) umgesetzt werden könnte.

OH

Me2N

OH

+OH

Me2N

O

OHOH

Me2N

C11H23

O

Enzym

VinyllauratDiethyletherRT

Abb. 2.28: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11.

rac-11

11

44

Page 90: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

76 THEORETISCHER TEIL

Allerdings, wie aus den Versuchen zur Transacylierung des O-Desmethyltramadols

in Diethylether zu erwarten war, ist auch bei allen in die Transacylierung von rac-11

eingesetzten Lipasen keine Reaktion zu beobachten (Tabelle 2.21).

Tabelle 2.21: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols

rac-11 in Diethylether

Enzym Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

Reaktions-

zeit Umsatz

Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 800 U/ml) Vinyllaurat (2) 14 d 0 %

Candida rugosa Lipase (CRL; 29 U/ml) Vinyllaurat (2) 14 d 0 %

Candida antarctica Lipase (CAL; 16 U/ml) Vinyllaurat (2) 14 d 0 %

Rhizopus arrhizus Lipase (0.02 U/ml) Vinyllaurat (2) 14 d 0 %

Aspergillus niger Lipase (0.001 U/ml) Vinyllaurat (2) 14 d 0 %

Eine Enzym-katalysierte Acylierung von rac-11 wäre sicherlich unter den für das

O-Desmethyltramadol (rac-8) gefundenen Bedingungen möglich, doch wird auch hier

nach den bisherigen Ergebnissen sowohl in der Acylierung von rac-8 als auch in der

Hydrolyse von rac-17 keine Enantiomer-Differenzierung der Enzyme zu beobachten

sein.

Das offenkettige, phenolische Tramadol-Analogon rac-11 ist somit kein geeignetes

Substrat für eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von

Enantiomeren. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität des

Moleküls vergleichen mit dem Tramadol-Molekül der Fall. Zur Darstellung der

Enantiomeren kann ausgehend von Verbindung 38 aber auf ein Verfahren zur

thermodynamischen oder klassischen Racematspaltung mit Weinsäurederivaten

zurückgegriffen werden.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 11 erfolgte

durch Vergleich der Drehwerte mit bereits in der Literatur publizierten Drehwerten der

Hydrochloride der Enantiomeren von 11.189

Page 91: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 77

2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen

Während es sich bei dem Substrat O-Desmethyltramadol (rac-8) noch um einen

Metaboliten des Tramadols und daher um eine Substanz mit seit längerem

bekannten pharmakologischen Profil handelt, stellt die Gruppe der Tramadol-

Analoga mit zusätzlicher sekundärer Hydroxylfunktion, eine Gruppe von

Verbindungen mit bisher noch nicht erschlossenen Potential in der Schmerztherapie

dar. Entdeckt wurde diese interessante Gruppe von Verbindungen von der

GRÜNENTHAL GmbH bei systematischen Strukturvariationen des Tramadol-Grund-

gerüsts auf der Suche nach neuen analgetisch aktiven Verbindungen.

In die, im Rahmen dieser Arbeit, untersuchten enzymatischen Racematspaltungen

wurden die in Abb. 2.29 dargestellten hydroxylsubstituierten Tramadol-Analoga

eingesetzt. Sie leiten sich vom Tramadol dadurch ab, daß in 4- bzw. 5-Position des

Tramadols eine Hydroxylgruppe in den Cyclohexylring eingefügt worden ist. Der

Syntheseweg dieser Verbindungen wurde bereits in Kap. 2.2.1 auf S. 24 dargestellt.

Das zur Verbindung rac-14 epimere (±)-(1RS,2RS,4RS)-1,4-Diol ist nicht mehr im

Rahmen dieser Arbeit bearbeitet worden, obwohl die pharmakologischen

Eigenschaften dieser Verbindung ebenfalls untersucht werden.

OH

Me2N

OMeHO

OH

Me2N

OMe

OH

Me2N

OMe

OH

HO

136

3 16

12

4

Abb. 2.29: Hydroxysubstiutierte Tramadol-Analoga, die in der Enzym-katalysierten

kinetischen Racematspaltung als Substrate untersucht werden.

Sekundäre Alkohole sind die idealen, fast klassischen Substrate für eine Hydrolasen-

katalysierte kinetische Racematspaltung. Aufgrund der Vielzahl der einsetzbaren

Enzyme und deren geringer Substratspezifität bei trotzdem hoher Selektivität hat

diese Methode eine große Anwendungsbreite erlangt. Gerade bei unterschiedlicher

(±)-(1RS,3SR,6RS)-12 (±)-(1RS,3RS,6RS)-13

(±)-(1RS,2RS,4SR)-14

1,3-Diole:

1,4-Diol:

Page 92: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

78 THEORETISCHER TEIL

Größe der Substituenten am Chiralitätszentrum werden häufig sehr hohe

Selektivitäten in der Enantiomer-Differenzierung des Enzyms beobachtet und sehr

gute Ergebnisse in der Racematspaltung erzielt. Daher gibt es in der Literatur auch

eine monatlich wachsende Zahl von Beispielen. Ebenso gibt es bis heute eine

Vielzahl von Beispielen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung von

substituierten Cyclohexanolderivaten als einen Sonderfall der sekundären

Alkohole.190,191,192

Exemplarisch seien hier die Enzym-katalysierte Racematspaltung von trans-

2-substituierten Cyclohexanolen191 (39, Abb. 2.30) und trans-2-substituierten

2-Cylohexenolen192 (40, Abb. 2.30) im organischen Medium erwähnt, welche sehr

gut untersuchte Reaktionen darstellen. Sie verlaufen im allgemeinen mit sehr guter

Selektivität und können so zur Synthese einer Vielzahl synthetisch wertvoller

Intermediate herangezogen werden.

OH

R

OHR

N

OHOMe

OMe

OH

39 40 rac-41 rac-42

R = Me, Ph, SPh R = H, Br, SPh

I, Br, Cl, CN

NHPh, NO2, N3

OTs, OMe, OAc

CH2SPh, CH2COPh, CO2Et

Abb. 2.30: Beispiele von bereits in Lipasen-katalysierte Racematspaltungen im

organischen Medium eingesetzten Substraten auf Cyclohexanolbasis.

Dargestellt ist das bevorzugt umgesetzte Enantiomer.

Es wurden ebenfalls sterisch anspruchsvollere Verbindung wie beispielsweise rac-41

und rac-42 (Abb. 2.30) in die Lipasen-katalysierte Transacylierung eingesetzt. In der

CRL-katalysierten Acylierung von rac-41 mit Vinylacetat als Acyldonor und

Diisopropylether als Solvens konnte nach 22 h bei 50 % Umsatz (+)-41 mit einem

ee-Wert von 83 % und das entstandene Acetat mit einem ee-Wert von 94 % (E = 72)

erhalten werden.193 Die Acylierung von rac-42 wird ebenfalls von der Candida rugosa

Lipase katalysiert und verläuft mit noch höherer Selektivität. Der zurückbleibende

Page 93: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 79

Alkohol kann mit 93 % ee und das erhaltene Acetat mit 94 % ee erhalten werden

(E = 110).194

In Analogie zu den Tramadol-Analoga ist in der Verbindung 42 ein tertiäres

Stickstoffatom vorhanden. Das cyclohexanolische Substrate, die wie das Tramadol

Dimethylaminomethyl-substituiert sind, ebenfalls von Hydrolasen als Substrate

akzeptiert werden, konnten KANERVA et al. zeigen.

Lipase PS+

+

OH

NMe2

OCOR

NMe2

OH

NMe2

OH

NMe2

OCOR

NMe2

OH

NMe2

CAL-B(Novozym 435)

DiethyletherVinylacetat

DiethyletherVinylacetat

Abb. 2.31: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von 2-Dimethylaminomethyl-

cyclohexanolen im organischen Medium.

KANERVA et al. gelang die Lipasen-katalysierte Acylierung von verschiedenen

2-Dialkylaminomethyl-cyclohexanolen mit hoher Selektivität. Sowohl für die cis- als

auch für die trans-konfigurierte Dimethylaminomethyl-substituierte Verbindung

wurden E-Werte größer 200 erreicht (Abb. 2.31).195 Im Falle der cis-konfigurierten

Verbindung verläuft die Novozym 435-katalysierte Acylierung äußerst langsam, die

Lipase PS-katalysierte Reaktion verläuft hingegen mit hoher Aktivität und Selektivität.

Von GOTOR et al. ist das am Stickstoffatom unsubstituierte racemische trans-

2-Aminocyclohexanol in die CAL-katalysierte Acylierung eingesetzt worden.196

Allerdings wurde bevorzugt eine Acylierung am Stickstoffatom beobachtet, die mit

mittelmäßiger bis guter Selektivität verlief. Eine Enzym-katalysierte Acylierung am

Sauerstoffatom konnte mit hoher Selektivität erreicht werden, indem die

N-Benzyloxycarbonyl geschützte Verbindung in die Pseudomonas cepacia Lipase

(BCL) katalysierte Transacylierung eingesetzt wurde (Abb. 2.32).

38 %, 99 % ee 49 %, 96 % ee

42 %, 98 % ee 34 %, 96 % ee

(−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S)

(+)-(1R,2S) (−)-(1S,2R)

Page 94: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

80 THEORETISCHER TEIL

BCL+

+

OH

OCOMe

NHCbz

OH

1,4-DioxanVinylacetat

HN

O

O Ph NHCbz

OCOMe

NHCbz

OH

OH

HN

O

O PhCAL

MTBEVinylacetat

NHCbz

Abb. 2.32: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von N-Benzyloxycarbonyl

geschützten 2-Aminocyclohexanolen im organischen Medium.

In diesem Fall ließ sich das entsprechende cis-konfigurierte Isomer in der CAL-

katalysierten Transacylierung mit hoher Aktivität und Selektivität umsetzten (Abb.

2.32).197 Racemische 2-Methylamino-cyclohexanole lassen sind ebenfalls unter

diesen Bedingungen mit sehr guten Ergebnissen in die enzymatische

Racematspaltung einsetzten, wenn die freie Valenz am Stickstoff mit einer

Butoxycarbonyl-Gruppe (Boc) geschützt wird.198

Von SEKAR et al. wurden Untersuchungen zur Umkehrreaktion im wäßrigen Medium

durchgeführt. Es wurden Acetate von N-Aryl-substituierten 2-Aminocyclohexanolen in

die PLE-katalysierten Hydrolyse eingesetzt, die ebenfalls hochselektiv verlaufen.199

NAEMURA et al. berichten von Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltungen

von cis- und trans-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol.200 Verbindungen, die dem Tramadol

ebenfalls strukturell ähnlich sind. Interessanterweise zeigen die Enzyme

Candida rugosa Lipase und Schweineleber-Esterase eine entgegengesetzte

Enantiopräferenz hinsichtlich der cis-konfigurierten Verbindung: In der Hydrolyse des

Acetats wird so von der PLE bevorzugt das (+)-Enantiomer bevorzugt zum 1R,2R-

konfigurierten (+)-Diol umgesetzt, von der CRL hingegen das (−)-Enantiomer (Abb.

2.33). Obwohl in der PLE-katalysierten Hydrolyse das (+)-Diol nur mit einem ee-Wert

31 %, 99 % ee 63 %, 49 % ee

43 %, 96 % ee 43 %, 96 % ee

(−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S)

(−)-(1R,2S) (+)-(1S,2R)

Page 95: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 81

von 84 % erhalten worden ist, konnte die enantiomerenreine Verbindung durch

anschließende Umkristallisation erhalten werden.

(±) -PLEPhosphatpuffer-

1 % EtOHLösung (pH 8.0)

+

Ph

H

OHOAc

Ph

H

OHOH

Ph

H

OHOAc

(±) -CRLPhosphatpuffer-Lösung (pH 7.5)

+

Ph

H

OHOAc

Ph

H

OHOH

Ph

H

OHOAc

Cosolvens

Abb. 2.33: Enzymatische Racematspaltungen von 1-Phenylcyclohexan-1,2-diolen.

Hinsichtlich der trans-konfigurierten Verbindung zeigen beide Enzyme die gleiche

Enantiopräferenz, beide Enzyme hydrolysieren das (−)-1S,2R-Enantiomer schneller.

46 %, 84 % ee 46 %, 85 % ee

46 %, 27 % ee 46 %, 26 % ee

(+)-(1R,2R) (−)-(1S,2S)

(−)-(1S,2S) (+)-(1R,2R)

Page 96: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

82 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-

dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-

ester (rac-18)

Ausgehend von den Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse des (±)-Buttersäure-

3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) wurde für das

Substrat rac-18 wiederum das Butyrat als Acylrest gewählt, welches nach den zuvor

gemachten Aussagen für Lipasen und Esterasen gleichermaßen ein geeignetes

Substrat darstellen sollte. Ebenfalls werden, auch zu einer besseren Vergleichbarkeit

mit den bisherigen Ergebnissen, die Standardreaktionsbedingungen beibehalten.

Auf den bisherigen Erfahrungen in der Enzym-katalysierten Racematspaltung

aufbauend wurde darauf verzichtet, eine große Anzahl von Enzymen zu

untersuchen. Vielmehr wurden die Enzyme eingesetzt, die bereits gute katalytische

Eigenschaften hinsichtlich der Tramadol-Analoga als Substrate gezeigt hatten.

Eins dieser Enzyme ist die Schweineleber-Esterase, die sich als Enzym zur

kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga bewährt hat, daher wurde

rac-18 in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.34).

OH

Me2N

OMe+

PLE

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung

RT

OPr

O

OH

Me2N

OMe

OHOMe

Me2N

HO

OPr

O

Abb. 2.34: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.

Die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 verlief mit hoher Aktivität des

Enzyms hinsichtlich der Hydrolyse des Substrates. So wurde nach 5.75 Stunden ein

Umsatz von ca. 40 % erreicht und anschließend die Reaktion durch kontinuierliche

Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach anschließender

Säulenchromatographie mit Essigsäureethylester und Methanol im Verhältnis 1 : 1

an Kieselgel konnte der 1R,3S,6R-konfigurierte Alkohol (+)-12 in 30 % Ausbeute mit

rac-18

(−)-18

(+)-12

Page 97: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 83

94 % ee isoliert werden. Der 1S,3R,6S-konfigurierte Ester (−)-18 konnte in 47 %

Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 % erhalten werden (Tabelle 2.22).

Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzes

von ca. 40 % die maximal zu erreichende Ausbeute des Alkohols bei 40 % und die

des Esters bei 60 % liegt.

Tabelle 2.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (1.6 U/ml; Phosphat-

puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-18

Ausbeute

Ester (−)-18

ee Alkohol

(+)-12

Ausbeute

Alkohol (+)-12 E

5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89

Die beobachtete Selektivität der Reaktion läßt sich durch einen E-Wert von 89

ausdrücken. Die in der Hydrolyse des Esters rac-18 erzielte Selektivität ist direkt

sehr hoch. Wie aus Abb. 2.35 hervorgeht liegt der nicht umgesetzte Ester (−)-18 ab

einem Umsatz von ca. 53 % enantiomerenrein vor und kann daher in hohen

Ausbeuten erhalten werden. Auch der gebildete Alkohol (+)-12 kann bis zu einem

Umsatz von ca. 40 % in der enzymatischen Hydrolyse mit guten ee-Werten isoliert

werden.

Es ist daher möglich beide Enantiomere in guter Ausbeute und mit guten bis sehr

guten Enantiomerenüberschüssen zu erhalten. Je nachdem, welches Enantiomer

gewünscht ist, kann die Reaktion bei einem Umsatz von ca. 40 % gestopt und der

(+)-Alkohol isoliert werden. Oder die Reaktion wird erst bei einem Umsatz von ca.

55 % aufgearbeitet und der (−)-Ester mit hohen Enantiomerenüberschüssen

erhalten, der dann noch anschließend zum (−)-Alkohol hydrolysiert werden muß.

Page 98: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

84 THEORETISCHER TEIL

Abb. 2.35: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (−)-18 (S) und Produkt (+)-12

(P) bei einer Selektivität von E = 89.

Wie zu erwarten war, ist die zu erzielende Selektivität in der Hydrolyse eines Esters

von einem sekundären Alkohol, wie rac-18, höher als die Selektivität in der

Hydrolyse eines phenolischen Esters, wie z.B. bei rac-15.

Interessanterweise wird bei der PLE-katalysierten Hydrolyse des Phenylesters

rac-15 das (−)-1S,2S-konfigurierte Enantiomer schneller hydrolysiert und im Fall der

PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 das (+)-1R,3S,6R-konfigurierte

Enantiomer. Diese Substratspezifität läßt sich durch ein Selektivitätsmodel

veranschaulichen.

Da aufgrund der mikroheterogenen Zusammensetzung der PLE keine

Röntgenstrukturanalyse dieses Enzyms existiert, wurden die Strukturen von über

hundert Substraten verglichen, um daraus Rückschlüsse auf die dreidimensionale

Struktur des aktiven Zentrums zu ziehen. Daraus wurden trotz der komplizierten

Zusammensetzung der PLE Selektivitätsmodelle zur Erklärung von Substratspezifität

und Selektivität entworfen. So wurden bereits in den 80er Jahren Modelle zur

Vorhersage der Selektivität der PLE entworfen.201,202 1990 entwickelten JONES et al.

daraus ein Würfelmodell, das schematisch den Aufbau des aktiven Zentrums der

PLE wiedergeben soll (Abb. 2.36).204 Durch weitere Untersuchungen wurde es in den

folgenden Jahren modifiziert.203,204,205 Mit Hilfe dieses deduktiven Modells gelang es,

Voraussagen über potentielle neue Substrate zu treffen. Es werden jedoch nur

Page 99: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 85

Hydrolysen von Carbonsäuremethylestern bzw. Dicarbonsäuredimethylestern

berücksichtigt.204

HLHS

PF

PB Ser

Abb. 2.36: Modell für das aktive Zentrum der PLE nach JONES et al.

Um die Substratspezifität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse der Substrate rac-15

und rac-18 erklären zu können, sind im Abb. 2.37 in der oberen Reihe die bevorzugt

umgesetzten Enantiomeren zur Vereinfachung als Alkohole nochmals dargestellt.

OHOH

Me2N OH

Me2N

OMeHO

MeONMe2OH

OH

OH

OH

NMe2

Abb. 2.37: Von der PLE bevorzugt umgesetzte Enantiomere.

In der unteren Reihe in Abb. 2.37 sind beide Moleküle so gedreht, daß die vom Serin

des Enzyms angegriffene Hydroxylgruppe in die Richtung des Serinrestes im

Kastenmodell nach JONES et al. zeigt. Die für die Selektivität der PLE notwendige

Dimethylaminomethyl-Gruppe80 beider Moleküle kann so in Wechselwirkung mit der

vorderen polaren Tasche treten. Der wenig flexible Cylohexylring mit dem Aromaten

befindet sich in der großen, hydrophoben Tasche. Die räumliche Anordnung dieser

Gruppen ist in beiden Molekülen gleich, was die Selektivität der PLE hinsichtlich

beider Moleküle zu erklären vermag.

HL: große, hydrophobe Tasche

HS: kleine, hydrophobe Tasche

PF: vordere, polare Tasche

PB: hintere, polare Tasche

Ser: Serin-Rest

(−)-8 (+)-12

Page 100: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

86 THEORETISCHER TEIL

Die Candida rugosa Lipase zeigte in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 von

allen eingesetzten Enzymen die höchste Selektivität und auch größte Aktivität

hinsichtlich des Substrats. Zudem sind große, cyclische sekundäre Alkohole

Standardsubstrate für dieses Enzym (s. Kap. 2.3.2). Daher wurde rac-18 in die CRL-

katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.38). Als erstes Reaktionsmedium wurde

zum Vergleich mit der PLE-katalysierten Reaktion das wäßrige Einphasensystem

ausgewählt.

OH

Me2N

OMe

+

CRL

Phosphatpuffer-LösungRT

OPr

O

OH

Me2N

OMeO

OHOMe

Me2N

Pr

O

HO

Abb. 2.38: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.

Die CRL zeigt, verglichen mit der PLE, eine etwas größere Aktivität hinsichtlich des

Substrats rac-18. So wurde nach 4.75 Stunden ein Umsatz von ca. 49 % erreicht.

Nach Aufarbeitung und anschließender Säulenchromatographie mit Diisopropylether

und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte

Alkohol (−)-12 in 41 % Ausbeute mit 95 % ee isoliert werden. Der 1R,3S,6R-

konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 41 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 %

erhalten werden (Tabelle 2.23).

Bei der Chromatographie der Reaktionsprodukte sind die isolierten Ausbeuten in

dem Laufmittel Diisopropylether und Methanol ein wenig besser als in dem Laufmittel

Essigsäureethylester und Methanol.

Die Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem läßt

sich zusammenfassend durch einen E-Wert von 133 ausdrücken. Sie verläuft damit

selektiver als die entsprechende PLE-katalysierte Reaktion.

rac-18

(+)-18

(−)-12

Page 101: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 87

Tabelle 2.23: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen

Einphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-

Butanol)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-18

Ausbeute

Ester (+)-18

ee Alkohol

(−)-12

Ausbeute

Alkohol (−)-12 E

4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133

Aus den Drehwerten der Produkte geht hervor, daß die CRL interessanterweise eine

zur PLE entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt. Während in der PLE-katalysierten

Hydrolyse bevorzugt das (+)-Enantiomer hydrolysiert wird, setzt das Enzym CRL

bevorzugt das (−)-Enantiomer um.

Das die Enzyme PLE und CRL hinsichtlich eines Substrats wie rac-15 die gleiche

Enantiopräferenz zeigen und bei einem strukturell verwandten Substrat wie rac-18

eine entgegengesetzte, ist in ähnlicher Form ebenfalls von NAEMURA et al.

beobachtet worden. Wie aus Abb. 2.33 auf Seite 81 hervorgeht zeigen PLE und CRL

hinsichtlich des cis-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol ebenfalls eine entgegengesetzte

Enantiopräferenz, wohingegen bei der entsprechenden trans-konfigurierten

Verbindung beide Enzyme das gleiche Enantiomer bevorzugt umsetzten (Abb.

2.39).200

OH

OH

OH

OH

cis-konfiguriertes Racemat trans-konfiguriertes Racemat

entgegengesetzte Enantiopräferenz gleiche Enantiopräferenz

Abb. 2.39: Relative Enantiopräferenzen der Enzyme PLE und CRL hinsichtlich der

beiden isomeren 1-Phenylcyclohexan-1,2-diole.

Um den Einfluß einer möglichen Grenzflächenaktivierung, wie es schon beim

Substrat rac-15 zu beobachten war, zu untersuchen, wurde das wäßrig-organische

Zweiphasensystem als Reaktionsmedium für die CRL-katalysierte Hydrolyse von

rac-18 verwendet.

Page 102: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

88 THEORETISCHER TEIL

Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde die Reaktion in einer feinen

Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether (MTBE) durchgeführt. Nach

ca. 6 Stunden wurde ein Umsatz von ca. 45 % beobachtet. Eine Verlängerung der

Reaktionszeit auf 72 Stunden führte zu keiner weiteren Hydrolyse. Die Reaktions-

lösung wurde dann aufgearbeitet und nach Chromatographie mit Diisopropylether

und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte

Alkohol (−)-12 in 39 % Ausbeute enantiomerenrein (≥98 % ee) erhalten werden. Von

dem 1R,3S,6R-konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 40 % Ausbeute auch ebenfalls die

enantiomerenreine Verbindung (≥98 % ee) erhalten werden (Tabelle 2.24). Die

Enantiomer-Differenzierung der Candida rugosa Lipase unter diesen Reaktions-

bedingungen ist also so hoch, daß das nicht favorisierte Enantiomer praktisch nicht

umgesetzt wird, selbst bei einer Verlängerung der Reaktionszeit auf 72 Stunden. Es

kann also eine nahezu perfekte kinetische Racematspaltung beobachtet werden,

was sich durch einen E-Wert von größer 200 ausdrückt. Ein Wechsel bei der

Katalyse mit CRL vom Ein- zum Zweiphasensystem führte wie schon beim

Phenylester rac-15 zu einer Steigerung der Selektivität in der enzymatischen

Hydrolyse.

Tabelle 2.24: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem (4.4 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.5; MTBE; 1 : 1)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-18

Ausbeute

Ester (+)-18

ee Alkohol

(−)-12

Ausbeute

Alkohol (−)-12 E

72 h ≥98 % 40 % ≥98 % 39 % >200

Zusammenfassend sind somit Reaktionsbedingungen gefunden worden, die optimale

Voraussetzungen für eine Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im präparativen

Maßstab bieten. Die Selektivität der Reaktion ist so hoch, daß neben einer

Reaktionsführung in einem satzweisen Verfahren (batch) auch eine kontinuierliche

Reaktionsführung (CSTR) möglich ist.

Eine kontinuierliche Reaktionsführung zeichnet sich allgemein gegenüber dem Satz-

oder Chargen-Betrieb durch höhere Raum-Zeit-Ausbeuten und besser kontrollierbare

Reaktionsbedingungen aus. Ebenso reduzieren sich die produktspezifischen

Page 103: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 89

Enzymkosten.206 Nachteil eines kontinuierlichen Verfahrens ist, daß der ee-Wert des

isolierten nicht umgesetzten Substrates bei gleichem Umsatz nicht so hoch ist, wie in

einem satzweisen Verfahren. Dies ist der Fall, da ein Teil des kontinuierlich

zugeführten racemischen Substrates wieder direkt den Reaktor verläßt und so den

ee-Wert der erhaltenen Produkte herabsenkt.207 Von RAKELS et al. ist der Verlauf des

ee-Wertes des nicht umgesetzten Substrates in einem satzweisen und einem

kontinuierlichen Reaktor über den Verlauf des Umsatzes für verschiedene E-Werte

theoretisch berechnet und aufgetragen worden (Abb. 2.40). Hierbei fällt auch auf,

daß in einem kontinuierlichen Verfahren selbst bei einer hohen Selektivität von

E = 100 gegen Ende der Reaktion der zurückbleibende Ester nicht enantiomerenrein

anfällt.

(A) satzweiser Reaktor (B) kontinuierlicher Reaktor

Abb. 2.40: Verlauf des Enantiomerenüberschusses des zurückbleibenden Substrats

als Funktion des Umsatzes in einer kinetischen Racematspaltung für

verschiedene E-Werte (E = 5, 10, 25, 100).

Diese reaktionstechnischen Voraussetzungen erfordern eine hohe Selektivität in der

Enzym-katalysierten Reaktion, damit eine kontinuierlichen Reaktionsführung als

Verfahren einsetzbar ist. Die CRL-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im wäßrig-

organischen Zweiphasensystem wird diesen erhöhten Ansprüchen gegenüber einem

satzweisen Verfahren gerecht.

Page 104: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

90 THEORETISCHER TEIL

Für ein mögliches Verfahren zur Darstellung von Tramadol-Analoga in einem

präparativen Maßstab stellt die Art der Aufarbeitung der Reaktionsmischung von

Alkohol und Ester in den bisher vorgestellten Reaktionen einen entscheidenden

Nachteil dar. Kontinuierliche Extraktion und Chromatographie stellen für eine

Synthese im Labormaßstab die üblichen Methoden zur Trennung dar, doch in einem

größeren Maßstab sind sie nicht kosteneffizient durchführbar und somit nur schwer

umzusetzen. Daher wird eine effiziente Methode zur Aufarbeitung benötigt, die auch

in einen größeren Maßstab übertragbar ist.

Bei Untersuchungen zu dem racemischen Substrat Buttersäure-3-dimethyl-

aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22), die in

Kap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 vorgestellt werden, ist in Kooperation mit der

GRÜNENTHAL GmbH eine solche Methode gefunden worden. Bei dieser Methode

gelingt die Trennung, indem direkt am Ende der Reaktion selektiv der Ester aufgrund

seiner Polarität bei pH 7.0 aus der wäßrigen Reaktionslösung mit Diethylether oder

auch MTBE extrahiert wird. Der Alkohol läßt sich noch nicht bei diesem pH-Wert

extrahieren. Erst nachdem mit Na2CO3 ein pH-Wert von ca. 10 eingestellt worden ist,

ist auch die Löslichkeit des Alkohols soweit herabgesetzt, daß er mit Dichlormethan

aus der Reaktionslösung extrahiert werden kann. Der Unterschied in der Polarität

von Ester und Alkohol läßt sich durch genügend große Unterschiede im log P-Wert208

von Alkohol und Ester zeigen. Messungen zum log P-Wert sind für das Substrat

(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-

ester (rac-22) und den korrespondierenden Alkohol durchgeführt worden und werden

in Kap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 näher diskutiert. Insgesamt stellt diese

Aufarbeitung eine einfache und effiziente Methode dar mittels der auf ein

chromatographisches Trennverfahren verzichtet werden kann.

Um die Effizienz der Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung mit

Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu demonstrieren,

wurde der Ester rac-18 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem eingesetzt. Anschließend wurde die Aufarbeitung durch

Extraktion bei verschiedenen pH-Werten auf das Zweiphasensystem übertragen.

Nachdem ein Umsatz von ca. 50 % in der enzymatischen Hydrolyse des Esters

rac-18 erreicht war, wurde die Reaktionslösung mit MTBE und Diethylether

extrahiert. Der nicht umgesetzte Ester (+)-18 konnte so in 51 % Ausbeute mit einem

Page 105: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 91

ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Anschließend wurde die verbliebene

Reaktionslösung von Lösungsmittelresten befreit und auf pH 10 eingestellt. Der

Alkohohl (−)-12 konnte daraufhin mit Dichlormethan in 46 % Ausbeute mit 97 % ee

extrahiert werden (Tabelle 2.25). Somit konnten mittels dieser Methode sowohl Ester

als auch Alkohol in sehr guten Ausbeuten und Reinheiten extrahiert werden. Die

ebenfalls hohen Enantiomerenüberschüsse in Alkohol und Ester zeigen, daß eine

partielle Racemisierung während der Aufarbeitung nicht beobachtet werden kann.

Tabelle 2.25: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen

Zweiphasensystem im 1.5 mmol Maßstab mit extraktiver Aufarbeitung

(6.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.2; MTBE; 1 : 1)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-18

Ausbeute

Ester (+)-18

ee Alkohol

(−)-12

Ausbeute

Alkohol (−)-12 E

48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200

Insgesamt konnte somit eine effiziente Enzym-katalysierte kinetische Racemat-

spaltung von rac-18 durchgeführt werden. Die CRL-katalysierte Hydrolyse dieses

Esters verläuft mit einer nahezu perfekten Selektivität und ermöglicht so den

einfachen Zugang zu beiden Enantiomeren des Alkohols 12. Für eine Darstellung

des Alkohols (+)-12 ist die Hydrolyse des nicht umgesetzten Esters notwendig. Dies

bedeutet einen zusätzlichen Reaktionsschritt, der dadurch umgangen werden kann,

daß zur Darstellung von (+)-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18

durchgeführt wird. Da die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte Enantio-

präferenz hinsichtlich dieses Substrates zeigen, wird von der PLE bevorzugt das

(+)-Enantiomer zum Alkohol (+)-12 hydrolysiert. Somit ermöglicht eine geeignete

Wahl des Enzym die Darstellung beider enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten.

Neben einem chromatographischen Trennverfahren steht auch die Methode der

Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zur einfachen Aufarbeitung der

Reaktionsmischung aus Alkohol und Ester zur Verfügung. Diese Methode hat den

Vorteil einfach, effizient und leicht in einen größeren Maßstab, wie einen späteren

Produktionsprozeß, übertragbar zu sein.

Page 106: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

92 THEORETISCHER TEIL

In der Enzym-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 zeigte die Candida

antarctica Lipase Typ B bemerkenswerte katalytische Eigenschaften. Diese

Ergebnisse werden in Kap. 2.4.2.9 beginnend aus Seite 144 diskutiert. Aufgrund der

in der Novozym 435-katalysierten Transacylierung von rac-14 beobachteten Aktivität

und Selektivität dieses Enzyms, wurde diese Katalysatorpräparation auch in die

enzymatische Hydrolyse von rac-18 eingesetzt. Allerdings konnte nach einer

Reaktionszeit von 45 Stunden kein Umsatz in dem Versuch zur Novozym 435-

katalysierten Hydrolyse von rac-18 beobachtet werden (Tabelle 2.26). Die gesamte

Reaktionszeit über war das immobilisierte Enzym im wäßrigen Medium unlöslich.

Eine mögliche Erklärung für die hohe Aktivität dieser Enzympräparation im

organischen Medium und die im Gegensatz dazu niedrige Aktivität im wäßrigen

Medium, liegt darin, daß diese auf einem makroporösen Acrylharz immobilisierte

Präparation speziell für die Synthese von Estern konzipiert ist.126 Zusätzlich können

Stofftransportprobleme am heterogenen Katalysator nicht ausgeschlossen werden.

Tabelle 2.26: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18

(CAL-B; Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester 18 ee Alkohol 12 E

45 h 0 % - - -

Daraufhin wurde eine lyophilisierte Form der CAL-B, mit dem Handelsnamen

Chirazyme L2, in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-18 eingesetzt. Aber

auch diese Enzympräparation zeigte eine relativ niedrige Aktivität in der

enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-18. So konnte in der Chirazyme L2-

katalysierten Reaktion lediglich ein Umsatz von 7 % zum Alkohol (−)-12 nach 46 %

Stunden beobachtet werden (Tabelle 2.27). Aufgrund der niedrigen Aktivität dieser

Lipasen im wäßrigen Medium wurden keine weiteren Versuche zu einer CAL-B-

katalysierten Hydrolyse von rac-18 unternommen.

Page 107: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 93

Tabelle 2.27: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (CAL-B;

Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E

46 h 7 % 8 % n. b. -

Die Enantiomeren des Alkohols 12 sind bisher nicht in der Literatur beschrieben, so

daß zur Bestimmung der Absolutkonfiguration kein Drehwert zum Vergleich zur

Verfügung steht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Absolutkonfiguration der

Enantiomere des Alkohols 12 daher auf der Basis zugeordnet, daß alle bisher

hergestellten (αR,βR)-Tramadol-Analoga mit tertiärer Hydroxylgruppe eine positiven

Drehsinn des Drehwerts zeigen.184

Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 18, 46 und 47 erfolgte in

Analogie zu der des Alkohols 12.

2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-

Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol

(rac-12)

Nachdem in der enzymatischen Hydrolyse von rac-18 sehr gute Ergebnisse erzielt

worden sind, wurde die Umkehrreaktion, die Enzym-katalysierte Transacylierung von

rac-12 im organischen Medium, ebenfalls untersucht.

Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im organischen Medium neben dem

hydrolytischen Verfahren würde weiterhin den Vorteil bieten, hydrolyselabile oder

hydrophobe und daher im wäßrigen Milieu unlösliche Verbindungen einsetzten zu

können. Dieser Gesichtspunkt ist vor allem für zukünftige Tramadol-Analoga von

Bedeutung. Daher ist neben der enzymatischen Hydrolyse ebenfalls ein Verfahren

zur Enzym-katalysierten Acylierung von rac-12 untersucht worden (Abb. 2.41).

Begonnen wurden diese Untersuchungen mit der Burkholderia cepacia Lipase (BCL),

welche auch nach den in Kap. 2.3.2 gemachten Vorbemerkungen eine geeignete

Lipase zur Umsetzung sekundärer Alkohole sein sollte. So ist beispielsweise von

Page 108: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

94 THEORETISCHER TEIL

KANERVA et al. das cis-2-Dimethylaminomethyl-cyclohexanol mit sehr guten

Resultaten in die Lipase PS-katalysierte Transacylierung eingesetzt worden.195

OH

Me2N

OMe+

LipaseHO

Me2N

OMe

OHOMe

Me2N

HO

Vinylester

Lösungsmittelorganisches

RT

OH

OR

O

Abb. 2.41: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12.

Als erste Reaktionsbedingungen zur BCL-katalysierten Acylierung von rac-12 wurde

Isopropenylacetat als Acylierungsmittel und Toluol und Acylierungsreagenz als

Lösungsmittel ausgewählt (Tabelle 2.28). In beiden Versuchen konnte allerdings

nach nahezu 3 Wochen keine Ester detektiert werden. Da diese Lipase eigentlich in

der Acylierung von rac-12 aktiv sein sollte, deuten diese Ergebnisse vielmehr auf

ungeeignete Reaktionsbedingungen hin.

Tabelle 2.28: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12

mit Isopropenylacetat (40 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

Isopropenylacetat (6) Toluol 20 d 3 %

Isopropenylacetat als Solvens 20 d 3 %

Daher wurde Vinylpropionat als Acyldonor gewählt, das eine etwas längere Alkylkette

trägt und somit für eine Lipase ein geeigneteres Acylierungsmittel darstellen sollte.

Des weiteren wurde die Enzymkonzentration in der Reaktionsmischung verdreifacht.

Die Lösungsmittel Toluol und Acylierungsreagenz wurden beibehalten. Unter diesen

rac-12

(+)-12

(−)-Ester

Page 109: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 95

leicht veränderten Bedingungen konnte anschließend in beiden Lösungsmitteln eine

BCL-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12 beobachtet werden (Tabelle

2.29). Allerdings ist die beobachtete Aktivität der BCL hinsichtlich des Substrats

rac-12 gering. So konnte nach 8 Tagen lediglich ein Umsatz von 11 % bzw. 5 %

erzielt werden. Die Reaktion im Lösungsmittel Vinylpropionat wurde daraufhin

abgebrochen, da keine wesentliche Steigerung des Umsatzes zu erwarten war. Mit

einer Selektivität von E = 22 ist zudem für einen sekundären Alkohol eine relativ

niedrige Selektivität beobachtet worden. Nach den in der CRL-katalysierten

Hydrolyse erzielten Ergebnissen, wurde eine wesentliche höhere Selektivität in der

Acylierung von rac-12 erwartet. Im Lösungsmittel Toluol war eine etwas größere

Reaktionsgeschwindigkeit zu beobachten und daher wurde sie erst nach insgesamt

13 Tagen bei einem Umsatz von 12 % abgebrochen. Die in dieser Reaktion erzielte

Selektivität von E = 38 ist größer als in Vinylpropionat als Solvens und im

angestrebten Bereich von E ≥ 30. Insgesamt ist die Aktivität des Enzym BCL unter

den verwendeten Reaktionsbedingungen aber sehr niedrig.

Tabelle 2.29: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Vinylpropionat (120 U/ml)

Reaktions-

bedingungen

(Äquiv.)

8 d E-Wert 13 d E-Wert

Mittel

E-Wert

Umsatz 11 % 12 %

ee Ester (−)-46 94 % 95 % Vinylpropionat (5),

Toluol ee Alkohol (+)-12 8 %

34

12 %

43 38

Umsatz 5 % n. b.

ee Ester (−)-46 91 % n. b. Vinylpropionat

als Solvens ee Alkohol (+)-12 4 %

22

n. b.

- 22

Nach den guten Ergebnissen in der Hydrolyse des korrespondierenden Esters wurde

daraufhin die Candida rugosa Lipasen-katalysierte Acylierung von rac-12 untersucht.

In drei verschiedenen parallelen Ansätzen wurde der Alkohol rac-12 in die CRL-

katalysierte Acylierung mit Vinylpropionat in den Lösungsmitteln Diisopropylether,

Page 110: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

96 THEORETISCHER TEIL

Toluol und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.30). Diisopropylether und Toluol

sind Standardlösungsmittel für die Enzym-katalysierte Transacylierung. Die

Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz sondern auch als Solvens

erbrachte in der enzymatischen Acylierung der Tramadol-Analoga mit aromatischer

Hydroxylgruppe sehr gute Ergebnisse. Daher wurden diese drei Lösungsmittel zum

Vergleich ausgewählt.

Tabelle 2.30: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Vinylpropionat (37 U/ml)

Reaktionsbedingung

(Äquiv.)

3 d

(%)

6 d

(%)

8 d

(%)

11 d

(%)

16 d

(%)

Umsatz 0 2 2 3 -

ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 - Vinylpropionat (5),

Diisopropylether ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 -

Umsatz 37 57 58 58 -

ee Ester (−)-46 94 91 96 89 - Vinylpropionat (5),

Toluol ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 -

Umsatz 23 41 48 53 58

ee Ester (−)-46 88 84 86 82 79 Vinylpropionat

als Solvens ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90

In dem Solvens Diisopropylether ist die geringste Aktivität des Enzyms CRL

hinsichtlich des Substrats rac-12 zu erkennen. Entsprechend der Aktivität des

Enzyms im Lösungsmittel Diethylether ist auch die Selektivität mit E = 19 sehr gering

(Tabelle 2.31). Ether, wie auch der Diethylether im Falle der phenolischen Substrate

rac-8 und rac-11, sind damit nach den bisherigen Ergebnissen keine geeigneten

Lösungsmittel für eine Lipasen-katalysierte Transacylierung von Tramadol-Analoga.

Dies Ergebnis steht in Einklang mit den von JUNGEN gemachten Untersuchungen zur

MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung racemischer Alkohole in verschiedenen

Lösungsmitteln. Im Lösungsmittel MTBE wurden durchweg niedrige Aktivitäten und

Selektivitäten erhalten.85

Page 111: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 97

Im Falle der Lösungsmittel Toluol und Vinylpropionat ist die Aktivität der CRL viel

größer. So werden nach 6 Tagen Umsätze von 57 % bzw. 41 % erreicht. Das die

Reaktion im Lösungsmittel Toluol nach diesen 6 Tagen kaum noch voranschreitet,

kann durch die hohe Selektivität der Reaktion erklärt werden, da ab einem Umsatz

von 50 % die größte Menge des schneller reagierenden Enantiomers verbraucht ist

und sich die Reaktionsgeschwindigkeit dann nur noch nach dem langsamer

reagierenden Enantiomer richtet. Die hohe Selektivität der Reaktion wird durch einen

mittleren E-Wert von 109 belegt (Tabelle 2.31). Die Schwankungen des E-Werts, der

eigentlich über den gesamten Reaktionsverlauf konstant bleiben sollte, läßt sich

durch die Meßgenauigkeit der Bestimmung der ee-Werte erklären. Bei hohen

E-Werten führen schon sehr kleine Änderungen des ee-Werts zu Schwankungen im

E-Wert. Dies läßt sich auch am Verlauf der E-Werte in dem Lösungsmittel

Vinylpropionat erkennen. Da hier der E-Wert der Reaktion geringer ist, fallen die

Schwankungen innerhalb der Reaktionsdauer auch viel geringer aus. Insgesamt ist

die Selektivität der CRL-katalysierten Acylierung im Solvens Vinylpropionat mit einem

E-Wert von 23, trotz der akzeptablen Reaktionsgeschwindigkeit zu niedrig, um sie

präparativ interessant erscheinen zu lassen (Tabelle 2.31).

Tabelle 2.31: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12

mit Vinylpropionat

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) 3 d 6 d 8 d 11 d 16 d Mittel

Vinylpropionat (5),

Diisopropylether - - - 19 - 19

Vinylpropionat (5),

Toluol 56 89 >200 89 - 109

Vinylpropionat

als Solvens 19 19 26 27 25 23

Ein Nebenprodukt der enzymatischen Transacylierung ist der bereits erwähnte

Acetaldehyd, der aus dem primär entstehenden Vinylalkohol gebildet wird (vgl.

Kap 2.3.2.2 beginnend ab Seite 39). Gerade von der Lipase aus Candida rugosa ist

bekannt, daß sie durch Acetaldehyd deaktiviert werden kann.139,140,141 Von mehreren

Page 112: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

98 THEORETISCHER TEIL

Autoren wird in diesem Fall eine Steigerung der Aktivität und Selektivität der CRL

berichtet, wenn statt Vinylacetat Isopropenylacetat verwendet wird.139,141b),142,209

Dieser Argumentation folgend wurde Isopropenylacetat als Acylierungsreagenz in die

CRL-katalysierte Transacylierung von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurden

Toluol, das zu der höchsten Selektivität mit Vinylpropionat geführt hat, und

Isopropenylacetat verwendet (Tabelle 2.32).

Tabelle 2.32: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Isopropenylacetat (37 U/ml)

Reaktionsbedingung

(Äquiv.) 2 d 5 d 14 d 20 d

Umsatz 19 % 34 % 47 % 58 %

ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 % Isopropenylacetat (6),

Toluol ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 %

Umsatz 3 % 5 % 13 % 16 %

ee Ester (−)-47 n. b. 10 % 24 % 24 % Isopropenylacetat

als Solvens ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4 % 6 %

Im Lösungsmittel Toluol zeigt die CRL eine wesentlich höhere Aktivität als im

Acylierungsmittel als Solvens. Qualitativ deckt sich diese Beobachtung mit den

Ergebnissen, die mit dem Acylierungsreagenz Vinylpropionat erzielt wurden.

Allerdings ist die Reaktion in Isopropenylacetat sehr langsam, da nach fast

3 Wochen lediglich ein Umsatz von 16 % erreicht wurde. Die Reaktion verläuft mit

einem E-Wert von 2 außerdem nahezu unselektiv (Tabelle 2.33).

Die Selektivität der CRL-katalysierten Transacylierung mit Isopropenylacetat verläuft

in den ersten 5Tagen bis zu einem Umsatz von ca. 45% mit nahezu perfekter

Selektivität (E >200) und fällt danach ab. Die Reaktion im Lösungsmittel Toluol

verläuft mit Isopropenylacetat als Acylierungsmittel langsamer als mit Vinylpropionat.

Die in beiden Reaktionen im Mittel erzielten Selektivitäten sind im gleichen Rahmen

sehr gut. Dies deutet daraufhin, daß unter diesen Reaktionsbedingungen (Toluol,

Reaktionszeiten von 3 bis 5 Tagen) mit Vinylpropionat und Isopropenylacetat keine

Deaktivierung der CRL durch Acetaldehyd vorliegt.

Page 113: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 99

Tabelle 2.33: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12

mit Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) 2 d 5 d 14 d 20 d Mittel

Isopropenylacetat (6),

Toluol

n. b. >200 67 94 120

Isopropenylacetat

als Solvens n. b. n. b. 2 2 2

Aufgrund der erzielten Ergebnisse in der CRL-katalysierten Transacylierung wurde

ebenfalls versucht eine PLE-katalysierte Transacylierung von rac-12 zu erreichen

(Abb. 2.42). Beim Alkohol rac-12 handelt es sich um einen sekundären Alkohol, der

im Vergleich zum Phenol rac-8 ein geeigneteres Substrat für Schweineleber-

Esterase darstellen sollte.

OH

Me2N

OMe+

PLE

HO

OH

Me2N

OMeO

OHOMe

Me2N

HO

R

O

Vinylester

Lösungsmittelorganisches

RT

Abb. 2.42: PLE-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12.

Native PLE zeigt im Gegensatz zu Lipasen allerdings praktisch keine Aktivität in der

Transacylierung von Alkoholen mit Vinylestern im organischen Medium. Es wurde

daher MPEG/PLE (vgl. Kap. 2.1) als Katalysatorpräparation in die Transacylierung

von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde Toluol verwendet, da in diesem

Lösungsmittel die CRL eine hohe Aktivität zeigte, als Acylierungsmittel wurden

sowohl Vinylacetat als auch Isopropenylacetat eingesetzt (Tabelle 2.34).

rac-12

(−)-12

(+)-Ester

Page 114: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

100 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.34: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-12 (6.4 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

Vinylpropionat (5),

Toluol 20 d 3 %

Isopropenylacetat (5),

Toluol 20 d 0 %

Unter diesen Reaktionsbedingungen fand, wie schon zuvor beim Phenol rac-8, keine

PLE-katalysierte Reaktion in einem nennenswerten Umfang statt.

Um weitere Reaktionsmedien im Hinblick auf mögliche günstige Eigenschaften für

eine PLE/MPEG-katalysierte Reaktion von rac-12 zu testen, wurden drei weitere

Lösungsmittel untersucht. Mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel wurde

Dichlormethan, MTBE und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Solventien in die

PLE/MPEG-katalysierte Acylierung von rac-12 eingesetzt (Tabelle 2.35). Außerdem

wurde in diesen Reaktionen die sechsfache Menge an Katalysator im Vergleich zu

den vorherigen Reaktionen eingesetzt.

Tabelle 2.35: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-12 mit Vinylpropionat (41.3 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

Vinylpropionat (5),

Dichlormethan 21 d 2 %

Vinylpropionat (5),

MTBE 4 d 1 %

Vinylpropionat (200) 21 d 3 %

Page 115: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 101

Trotz dieser wesentlich gesteigerten Katalysatormenge konnte wiederum nur eine

minimale Menge an Acylierungsprodukt detektiert werden. Interessanterweise wurde

im Acylierungsmittel als Solvens die größte Menge an gebildeten Ester 46

beobachtet.

Um eine Deaktivierung des Enzyms durch Nebenprodukte ausschließen zu können,

wurde eine neue Katalysatorspezies aus PLE und Rinderserumalbumin (BSA) für die

Acylierung von Tramadol-Analoga eingesetzt.

Von GAIS et al. konnte nämlich gezeigt werden, daß die Aktivität der PLE von

verschiedenen Carbonyl-Nebenprodukten (Acetaldehyd, Aceton, Carbonsäuren aus

der Hydrolyse des Acyldonors) beträchtlich beeinflußt wird.84,85 Um einer Reaktion

dieser Carbonyl-Verbindungen mit Lysin-Resten des Enzyms entgegenzuwirken,

wurden Rinderserumalbumin und verschiedene aminhaltige Harze in der

Colyophilisierung mit PLE benutzt.83 Diese Verbindungen sollten statt des Enzyms

mit den Carbonyl-Nebenprodukten reagieren und so die Aktivität der PLE erhöhen.

Außerdem sollte die Nebenreaktion der PLE-katalysierte Hydrolyse des Acyldonors

durch geringe, zugesetzte Mengen an Wasser eingeschränkt werden

Für eine Acylierung von rac-12 wurde ein Colyophilisat aus PLE, BSA und MPEG

(PLE/BSA/MPEG) gewählt und eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine

hohe Aktivität im organischen Medium zeigt.83 Als Acylierungsmittel wurde

Vinylpropionat für die Reaktionen gewählt und diesmal das Lösungsmittel variiert. Es

wurden Dichlormethan und Toluol verwendet. Zum Lösungsmittel Toluol wurde

hierbei ein Wasserzusatz von 0.25 % gegeben (Tabelle 2.36).

Der Wasserzusatz wurde gemacht, da Wasser auch für die Enzymkatalyse in

organischen Lösungsmitteln von entscheidender Bedeutung ist. Es dient als

"Schmiermittel"150 zur Einstellung verschiedener Proteinkonformationen.85 In völlig

wasserfreien Systemen können Enzyme ihre Aktivität daher nicht entfalten. Vielfach

reicht allerdings schon eine sehr geringe Wassermenge (<1 %) zur Enzymkatalyse in

organischen Medien aus. Beeinflußt wird das System auch durch das Additiv MPEG,

daß die effektive Wasserkonzentration in der Enzymumgebung verringert210,211 und

so als "Puffer" für den Wassergehalt des Enzyms dient.212 Von JUNGEN ist in der

Katalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchste Reaktions-

Page 116: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

102 THEORETISCHER TEIL

geschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet worden.85 Daher

wurde für diesen Versuch mit dem Katalysator PLE/BSA/MPEG ein Wasserzusatz

von 0.25 % gewählt.

Tabelle 2.36: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-12

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

PLE/BSA/MPEG (24.4 U/ml),

Vinylpropionat (5), Dichlormethan 11 d 0 %

PLE/BSA/MPEG (20.0 U/ml), H2O (0.25 %),

Vinylpropionat (5), Toluol 11 d 0 %

Im Laufe der Reaktionszeit änderte sich die Farbe des PLE/BSA-Katalysators von

weiß in ein dunkles rot-braun. Dies ist ein typisches Merkmal dafür, daß der Zusatz

BSA mit Carbonyl-Nebenprodukten reagiert. Diese Nebenprodukte können nur aus

der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters stammen. Eine derartige

Nebenreaktion in größerem Umfang ist ebenfalls von Ruppert84 wie auch anderen213

beobachtet worden.

R1 O

O + E O+ [R1-CO-E]

+ H2O

R1 OH

O+ E

A

+ R2-OH

R1 O

OR2 + E

B

+ H2O

R1 OH

O+ R2-OH

C Abb. 2.43: Hydrolyse des Acyldonors als Nebenreaktion der Transacylierung.

Page 117: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 103

In Abb. 2.43 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörige Reaktionsschema

wiedergegeben. Nach der irreversiblen Bildung des Acyl/Enzym-Komplexes, kann

dieser die Nebenreaktion mit Wasser eingehen (A) oder den gewünschten

Reaktionsweg, die Reaktion mit dem racemischen Alkohol, beschreiten (B). Je nach

Wassermenge kann die unerwünschte Nebenreaktion sogar dominieren. Des

weiteren kann der gebildete Ester enzymatisch hydrolysiert werden (C) was die

enzymatische Transacylierung quasi-reversibel macht.

In beiden Reaktionsansätzen konnte aber kein Umsatz in der Acylierung von rac-12

detektiert werden. Insgesamt deuten somit die erzielten Ergebnisse in den

Versuchen zur PLE-katalysierten Transacylierung darauf hin, daß Tramadol-Analoga,

sowohl mit aromatischer als auch mit sekundärer Hydroxylfunktion, keine geeigneten

Substrate für eine PLE-katalysierte Reaktion im organischen Medium darstellen.

Page 118: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

104 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-

Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexylester (rac-19)

Der racemische Alkohol rac-13 ist eine pharmakologisch wirksame Verbindung, die

eine dem Tramadol ähnliche analgetische Aktivität besitzt. Das Hydrochlorid des

(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols (rac-13⋅HCl)

befindet sich in einem fortgeschrittenem Stadium der klinischen Entwicklung von der

GRÜNENTHAL GmbH. Die Verbindung zeigt ein solch gutes pharmakologisches Profil,

das eine direkte Vermarktung des Racemats ohne eine weitere Derivatisierung

erhofft werden kann (Abb. 2.44).184

OH

Me2N

OMeOH

Abb. 2.44: Hydrochlorid von rac-13, dessen Vermarktung von der GRÜNENTHAL

GmbH angestrebt wird.

Die Substanz zeigte eine mittlere analgetische Aktivität in der Wirkstärke des

O-Desmethyltramadols (rac-8) bei außerordentlich hoher Bioverfügbarkeit. Dies stellt

einen Fortschritt gegenüber der bisherigen Therapie dar. Dazu ist die Halbwertszeit

im Körper dieser Substanz sowie die des O-Desmethyl-Metaboliten gegenüber

vergleichbaren Substanzen, wie dem Tramadol, verlängert.184

Der Wirkstoff rac-13⋅HCl zeigt, ähnlich wie das Tramadol, eine dreifaches Wirkprofil.

So existiert neben der µ-opioiden Wirkung auch Inhibierung der Wiederaufnahme der

Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT), was zu einer Inhibierung

der spinalen Schmerzleitung führt.184

Interessanterweise zeigen die Enantiomeren eine synergistische Wirkung, ähnlich

wie auch beim Tramadol, dies kann die weitere Entwicklung und später geplante

Vermarktung des Racemats ermöglichen. Trotzdem werden natürlich die einzelnen

Enantiomeren für eine pharmakologische Begutachtung benötigt.

⋅HCl

Page 119: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 105

Obwohl es sich bei dieser Verbindung um ein 1,3-diaxial substituiertes Molekül

handelt, sollte versucht werden, die sehr guten Resultate in der Enzymkatalyse des

(1SR,3RS,4RS)-konfigurierten Epimers auf diese neue Verbindung zu übertragen

(Abb. 2.45).

OH

Me2N

OMe+

Hydrolase

Phosphatpuffer-LösungRT

OH

Me2N

OMe

OHOMe

O

O

Pr

O

O

Pr

HOMe2N

Abb. 2.45: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-19.

Um ein Enzym zu identifizieren, daß die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19

mit hoher Aktivität und Selektivität zu finden, wurden acht Hydrolasen unter den

bisherigen Standardbedingungen, wäßriges Einphasensystem (pH 7.0, pH 8.0 im

Falle der PLE) mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische Hydrolyse

des Esters rac-19 eingesetzt. Es konnte nach ein bis drei Tagen Reaktionszeit in

keinem Fall eine Hydrolyse des Substrates in einem nennenswerten Umfang

festgestellt werden (Tabelle 2.37). In allen Fällen konnte das eingesetzte Edukt

nahezu vollständig zurückerhalten werden (91 – 100 % Ausbeute).

rac-19

19

13

Page 120: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

106 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.37: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen

Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Enzym Reaktionszeit Umsatz

Cholesterolesterase (CE; 11.0 U/ml) 24 h 1 %

Candida rugosa Lipase (CRL; 4.6 U/ml) 29 h 0 %

Chirazyme L-2 (CAL-B; 38.8 U/ml) 45 h 0 %

Burkholderia cepacia Lipase (BCL; 0.05 U/ml) 45 h 0 %

Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 30 U/ml) 46 h 0 %

Porcine pancreatic Lipase (PPL; 16.8 U/ml) 23 h 1 %

Chromobacterium viscosum Lipase (CVL, 0.18 U/mg) 69 h 0 %

Schweineleber-Esterase (PLE, 6.5 U/ml), pH 8.0 41 h 0 %

Da sich in der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga neben dem

wäßrigen Einphasensystem das wäßrig-organische Zweiphasensystem als ein

geeignetes Reaktionsmedium herausgestellt hat, wurde rac-19 ebenfalls unter den

Reaktionsbedingungen eines Zweiphasensystems eingesetzt (Tabelle 2.38). Es

konnte allerdings auch in diesem Fall keine nennenswerte enzymatische Aktivität

beobachtet werden.

Tabelle 2.38: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im

wäßrig-organischen Zweiphasensystem (9.2 U/ml; Phosphatpuffer,

pH 7.0; MTBE; 1 : 1)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

69 h 1 % n. b. n. b. -

Page 121: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 107

Insgesamt stellen die hier eingesetzten Enzyme eine repräsentative Auswahl der

standardmäßig in der organischen Synthese eingesetzten Hydrolasen dar. Die in

Kap. 2.3.2 hervorgehobenen Enzyme sind ebenfalls in dieser Auswahl vertreten.

Daher ist es nicht wahrscheinlich, daß bei dem Versuch weitere Enzyme in die

Hydrolyse von rac-19 einzusetzen ein Enzym gefunden wird, daß diese Reaktion

katalysiert und zudem noch die in Kap. 2.3.2 gemachten Voraussetzungen erfüllt.

Da unter den zur Hydrolyse von rac-19 verwendeten Enzymen und Reaktions-

bedingungen die zuvor eingesetzten Tramadol-Analoga als Substrate akzeptiert

wurden, ist die Konsequenz, daß rac-19 kein geeignetes Substrat für eine

enzymatische Hydrolyse darstellt. Ein naheliegender Grund warum dieser 1,3-diaxial

substituierte Ester nicht von den getesteten Enzymen als Substrat akzeptiert wird,

kann der sterischen Anspruch der tertiären Hydroxylgruppe, die sich in direkter Nähe

zu der vom Enzym anzugreifenden Estergruppe befindet, sein.

Um dennoch eine Enzym-katalysierte Racematspaltung erzielen zu können, wurde

daher zunächst versucht eine enzymatische Transacylierung des

korrespondierenden Alkohols rac-13 zu erreichen.

Page 122: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

108 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von

(±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,3-diol (rac-13)

Nachdem sich der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19 als kein geeignetes Substrat

für eine enzymatische Hydrolyse herausgestellt hatte, wurde die enzymatische

Transacylierung des Alkohols rac-13 auch in der Hoffnung untersucht, daß

zumindest der Alkohol aufgrund seines geringeren Raumbedarfs als Substrat

akzeptiert werden würde und einer enzymatischen Reaktion zugänglich ist (Abb.

2.46).

OH

Me2N

OMe+

Lipase

Vinylester

Lösungsmittelorganisches

RT

Me2N

OMeOHOH

OH

OHOMeO

NMe2O

R

Abb. 2.46: Enzymatische Transacylierung des Alkohols rac-13.

Obwohl es sich bei dem Grundkörper des Alkohols rac-13, ein substituiertes

Cyclohexan-1,3-diol, um eine für chirale Auxiliare interessante Zwischenstufe

handelt, sind bis heute nur wenige Publikationen zu einer enzymatischen

Racematspaltung erschienen.

Daß eine Acylierung von Cylohexan-1,3-diol selbst möglich ist, wurde bereits 1992

von BHATTACHARYA et al.214 sowie später 1996 MATTSON et al.215 gezeigt. Von beiden

ist jeweils die cis / trans-Mischung der Epimeren in die Hydrolasen katalysierte

Acylierung im organischen Medium eingesetzt worden. Von BHATTACHARYA et al.

wurde eine Mischung verschiedener Proteasen aus Streptomyces griseus (Pronase)

mit äquimolaren Mengen p-Nitrophenylacetat in Pyridin zur Acylierung verwendet. Es

wurde eine 1 : 1 Mischung der cis- und trans-kofigurierten Monoacetate in 42 %

Ausbeute erhalten. MATTSON et al. verwendeten immobilisierte Candida antarctica

Lipase Typ B (Novozym 435) mit S-Ethylthiooctanoat216 als Acylierungsmittel. Unter

diesen Reaktionsbedingungen konnte sogar eine Diacylierung beobachtet werden.

rac-13

13

19

Page 123: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 109

Die Absolutkonfiguration des am langsamten reagierenden Isomers wurde zu

(1S,3S) bestimmt.214

Beim Cyclohexan-1,3-diol sind die Hydroxylgruppen allerdings nicht wie beim

Alkohols rac-13 in axialer Position fixiert, so daß bei diesem Substrat die Acylierung

einer 1,3-diaxialen Spezies als unwahrscheinlich anzunehmen ist.

Von GOTOR et al. ist ein Beispiel einer enzymatischen Acylierung eines höher

substituierten Cyclohexan-1,3-diol-Derivats veröffentlicht worden.217 Die von einer

Lipase aus Chromobacterium viscosum katalysierte Acylierung des (3S,5S)-

5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols in Vinylacetat als Solvens verläuft mit

einer hohen Aktivität und führt mit 100 %Umsatz zu dem an 5 Position acylierten

Monoacetat (Abb. 2.47). Somit wird die am wenigsten sterisch gehinderte

Hydroxylgruppe acyliert.

OHHOVinylacetat

CVL

OHO

O

100 % Umsatz

Abb. 2.47: Enzymatische Transacylierung von cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-

ene-1,3-diol mit Vinylacetat.

Um eine enzymatische Acylierung des Alkohols rac-13 zu erreichen, wurde dieses

Substrat zunächst unter für Transacylierungen im allgemeinen geeigneten

Bedingungen mit Vinylpropionat in Toluol eingesetzt. Als Katalysatoren wurden vier

verschiedene Lipasen verwendet (Tabelle 2.39). In keinem Fall konnte eine Enzym-

katalysierte Reaktion beobachtet werden. Im Fall des epimeren Alkohols rac-12

konnte unter diesen Reaktionsbedingungen ein E-Wert von 109 in der CRL-

katalysierten Transacylierung erreicht werden.

Page 124: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

110 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.39: Enzymscreening zur enzymatischen Transacylierung des Alkohols

rac-13 in Toluol

Enzym Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

Reaktions-

zeit

Umsatz

Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/ml) Vinylpropionat (5) 72 h 0 %

Porcine pancreatic Lipase (PPL; 67 U/ml) Vinylpropionat (5) 72 h 0 %

Cholesterolesterase (CE; 35 U/ml) Vinylpropionat (5) 72 h 0 %

Novozym 435 (CAL-B) Vinylpropionat (5) 72 h 1 %

Im Fall des Novozym 435 konnten Spuren des gewünschten Propionsäureesters von

13 detektiert werden. Daher wurde dies Enzym unter verschiedenen Reaktions-

bedingungen in die Transacylierung des Alkohols rac-13 eingesetzt. Es wurden

Dichlormethan und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Lösungsmittel verwendet

(Tabelle 2.40). Eine Enzym-katalysierte Reaktion war aber auch unter diesen

Bedingungen nicht zu beobachten.

Tabelle 2.40: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von

Alkohol rac-13 (CAL-B)

Reaktionsbedingungen Umsatz nach

2.75 d

Umsatz nach

6 d

Vinylpropionat (5), Toluol 1 % 1 %

Vinylpropionat (5), Dichlormethan 0 % 0 %

Vinylpropionat als Solvens 1 % 1 %

Isopropenylacetat (5), Toluol

1 % 1 %

Page 125: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 111

In Anlehnung an die von GOTOR et al. publizierten Bedingungen zur enzymatischen

Acylierung des cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols,217 wurde daraufhin

die Chromobacterium viscosum Lipase in Vinylpropionat als Solvens in die

Acylierung von rac-13 eingesetzt. Zusätzlich wurde noch Triethylamin als Additiv

zugesetzt (Tabelle 2.41).

In verschiedenen Fällen wurde bei der Verwendung von Triethylamin von einem

positiver Effekt dieses Additivs auf das Ergebnis der enzymatischen Acylierung

berichtet.213,218 Durch die Zugabe einer organische Base werden Säurespuren in der

Reaktionsmischung neutralisiert, wodurch eine Aktivierung des Enzyms erreicht wird.

Tabelle 2.41: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol

rac-13 unter Zusatz von Triethylamin

Enzym Reaktionsbedingungen

(Äquiv)

Umsatz

nach 5 d

Umsatz

nach 12 d

Novozym 435 (CAL-B)

Vinylpropionat als Solvens

Triethylamin (1.4) 2 % 4 %

Chromobacterium viscosum Lipase (CVL, 0.7 U/ml)

Vinylpropionat als Solvens

Triethylamin (1.4) 0 % 1 %

Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 80 U/ml)

Vinylpropionat als Solvens

Triethylamin (1.4) 0 % 0 %

Aus Tabelle 2.41 geht hervor, das eine Acylierung des Alkohols rac-13 nicht erreicht

werden kann. Weder das von GOTOR et al. beschriebene Enzym CVL katalysiert

diese Reaktion, noch führt der Zusatz Triethylamin zu einer Aktivierung der Enzyme

in einem zu wünschenden Umfang.

Entsprechend den Ergebnissen in den Versuchen zur enzymatischen Hydrolyse

wurde das 1,3-diaxiale Diol rac-13 auch unter den Reaktionsbedingungen einer

Transacylierung im organischen Medium nicht von den getesteten Hydrolasen als

Substrat akzeptiert. Das Ziel eine Enzym-katalysierte Racematspaltung mit diesem

Substrat durchzuführen scheint daher nicht erreichbar zu sein.

Eine mögliche Erklärung sind die sterischen Wechselwirkungen der beiden

1,3-diaxial angeordneten Hydroxylgruppen.

Page 126: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

112 THEORETISCHER TEIL

Allerdings kann auch im allgemeinen eine enzymatische Reaktion an einer axial

konfigurierten Hydroxylgruppe erschwert sein. So konnten nämlich TANIKAGA et al. im

Falle verschiedener 3-substituierter Cyclohexanole keine enzymatische Acylierung

beobachten, wenn sich die Hydroxylgruppe in axialer Position im Cyclohexylring

befand, wohingegen bei den gleichen Substraten mit equatorialer Hydroxylgruppe

eine enzymatische Racematspaltung möglich war (Abb. 2.48).219

OH

R

OH

R

R

R

OH OH R OAc

Benzol, 30 °C

+Lipase PS

Vinylacetat

+Lipase PS

Vinylacetat

R = Ph, SPh, Bn, SO2Ph

Abb. 2.48: Unterschiedliche Reaktivitäten der Lipase PS hinsichtlich equatorialen

und axialen Hydroxylgruppen.

Im Falle der von MATTSON et al. beschrieben Racematspaltung einer Mischung von

cis- und trans-Cyclohexan-1,3-diol, war das zurückbleibende, am langsamsten

reagierende Isomer ebenfalls (+)-(1S,3S)-konfiguriert.215

Im Falle der enzymatischen Racematspaltung von N-substituierten cis-

2-Aminocylhexanolen, konnte von GOTOR et al. ebenfalls keine CAL-B-katalysierte

Acylierung beobachtet werden, wenn die Hydroxylgruppe axial fixiert war.197 Eine

entsprechende Acylierung des trans-konfigurierten Epimers verlief hochselektiv.196

Der Unterschied in der Reaktivität beider Substrate wurde von den Autoren ebenfalls

durch die geometrische Anordnung der axialen Hydroxylgruppe erklärt.

Da demzufolge der Alkohol rac-13 aufgrund seiner geometrischen Anordnung keiner

enzymatischen Reaktion zugänglich ist, bietet sich die Möglichkeit an, die

Verbindung so zu Modifizieren, daß sie als Substrat akzeptiert werden kann.

(−)-(1R,3S) (1R,3S) (1S,3R)

(1S,3S) (1R,3R)

Page 127: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 113

2.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-

(6-dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester

(rac-21)

Nachdem sich gezeigt hatte, daß weder der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19

noch der korespondierende Alkohol rac-13 aufgrund der geometrischen Anordnung

der Hydroxylgruppe als Substrat in eine Enzym-katalysierte Racematspaltung

eingesetzt werden können, wurde nach einer geeigneten Modifizierung des Alkohols

rac-13 gesucht, um ihn einer enzymatischen Reaktion zugänglich zu machen.

OH

Me2N

OMeHydrolase

Phosphatpuffer-Lösung

O

O

Pr OH

Me2N

OMeOH

Abb. 2.49: Versuch zur enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19.

Eine erste Alternative zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-19 ist die

Möglichkeit den Alkohol rac-13 in ein cyclisches Carbonat (rac-48) unter Einbindung

der tertiären Hydroxylgruppe zu überführen und anschließend eine enzymatische

Racematspaltung dieser Verbindung durchzuführen (Abb. 2.50). Das solche

cyclischen Carbonate als Substrate in eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion

eingesetzt werden können, ist bereits von MATSUMOTO et al. sowie GUIBE-JAMPEL et

al. demonstriert worden.220

OH

Me2N

OMeOH O

Me2N

OMeO

O

Hydrolase

Phosphatpuffer-Lösung

Abb. 2.50: Enzym-katalysierte Racematspaltung des Carbonats rac-48 als

alternative Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13.

Von BURK et al. wird eine effiziente Methode zur Überführung von 1,3-Diolen in

cyclische Carbonate beschrieben. Nachdem es ihnen nicht gelang ein 1,3-Diol mit

rac-19 13

rac-13 rac-48

Page 128: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

114 THEORETISCHER TEIL

verschiedenen bekannten Methoden unter Verwendung von Kohlenstoffmonoxid,

Phosgen, Trichloracetylchlorid und 1-1´-Carbonyldiimidazol die gewünschte

Verbindung zu erhalten, ist ihnen diese Reaktion schließlich erfolgreich unter

Verwendung von Bis-(trichlormethyl)-carbonat (Triphosgen221) gelungen.222 Es wurde

daher versucht rac-13 unter den von BURK et al. beschriebenen Reaktions-

bedingungen in das Carbonat rac-48 zu überführen (Abb. 2.51).

OH

Me2N

OMeOH O

Me2N

OMeO

OTriphosgen10 Äquiv. Pyridin

Dichlormethan− 76 °C

0.5 Äquiv.

Abb. 2.51: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit

Triphosgen.

Rac-13 wurde sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base in diese Reaktion

eingesetzt. Aufgrund der Giftigkeit des während der Reaktion freigesetzten Phosgens

wurde keine Reaktionskontrolle durchgeführt. Nach Chromatographie der erhaltenen

Reaktionsmischungen konnten neben dem zurückgewonnenen Edukt nur jeweils

nicht näher charakterisierte Zersetzungsprodukte erhalten werden. Dies ist wahr-

scheinlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen Reaktivität des

Triphosgens bzw. Phosgens eine Acylierung am Stickstoff als Nebenreaktion auftritt.

Die am Stickstoff acylierte Spezies kann anschließend eine N-Dealkylierung

eingehen. Diese Nebenreaktion wurde versucht zu unterdrücken, indem rac-13 als

Hydrochlorid eingesetzt wurde.

Eine Prozedur zur Überführung von rac-13 in das cyclische Carbonat unter milderen

Reaktionsbedingungen wurde von KUTNEY et al. beschrieben. Sie beschreiben die

Überführung eines cyclischen 1,2-diols in das entsprechende Carbonat unter

Verwendung von 1-1´-Carbonyldiimidazol in Toluol.223 Daraufhin wurde versucht

rac-13 mittels dieses Reagenzes unter den von KUTNEY et al. publizierten

Bedingungen in rac-48 zu überführen (Abb. 2.52).

rac-48 rac-13 (⋅HCl)

(⋅HCl)

Page 129: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 115

OH

Me2N

OMeOH O

Me2N

OMeO

O

1,1´-Carbonyldiimidazol

Toluol, Rückfluß

4 Äquiv.

5 h

Abb. 2.52: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit

1,1´-Carbonyldiimidazol.

Rac-13 wurde wieder sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base eingesetzt. Die

Reaktion wurde abgebrochen nachdem jeweils kein Edukt mehr detektiert werden

konnte. Die rohen Produktmischungen wurden mittels Massenspektroskopie

untersucht und es konnte ein Fragment mit einer Masse von 305 detektiert werden,

dem M+ von rac-48 zugeordnet wurde. Nach Chromatographie (EE : MeOH = 2 : 1

über Kieselgel) konnte allerdings keine gewünschtes Produkt erhalten werden. Da

das Vorhandensein von 48 in der rohen Produktmischung nachgewiesen wurde, ist

zu vermuten, daß das Carbonat 48 unter den Bedingungen der Chromatographie

nicht stabil ist. Es wird daher angenommen, daß selbst wenn rac-48 ohne

Chromatographie dargestellt werden könnte, es aufgrund seiner mangelnden

Stabilität kein geeignetes Substrat für eine enzymatische Hydrolyse darstellt.

Diese Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13 mittels eines

cyclischen Carbonats (rac-48) als Substrat für eine enzymatische Racematspaltung,

wurde daraufhin nicht weiter verfolgt.

Um trotzdem eine Möglichkeit zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von rac-13

aufzuzeigen, wurde auf die bereits vorgestellte Methode der Enzym-katalysierten

Racematspaltung von Phenylestern zurückgegriffen (siehe Abb. 2.55, S. 116). Dazu

ist es notwendig rac-13 durch O-Demethylierung in das entsprechende Phenol zu

überführen und dies dann selektiv an der aromatischen Hydroxylgruppe zu verestern.

Die Etablierung der phenolischen Hydroxylgruppe erfolgte analog zur Darstellung

des Phenols rac-8 durch Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol

unter Rückfluß in guter Ausbeute (88 %).91 Eine Dealkylierung am Stickstoff war nicht

zu beobachten (Abb. 2.53).

rac-48 rac-13

Page 130: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

116 THEORETISCHER TEIL

OH

Me2N

OMeOH OH

Me2N

OHOH

Toluol

DiBAl-H

Rückfluß

Abb. 2.53: Darstellung des Phenols rac-20 durch O-Demethylierung mit DiBAl-H.

Zur selektiven Darstellung des Phenylesters rac-21 erfolgte nach einer Methode von

RICE et al (s. Kap. 2.2, S. 16).95 Dazu wurde das Phenol rac-20 mit 10 Äquivalenten

Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-

Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt (Abb. 2.54).

OH

Me2N

OHOH OH

Me2N

OOH

Pr

O

NaHCO3-Lösung

10 Äquiv. Buttersäure-anhydrid

Abb. 2.54: Selektive Darstellung des Esters rac-21.

Mit rac-21 steht nun ein Substrat zur Verfügung, das nach den Untersuchungen zur

enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischer

Hydroxylgruppe als Substrat akzeptiert werden sollte. Der Ester rac-21 wurde

daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.55).

OH

Me2N

O

O

Pr

+

OH

Me2N

O

O

Pr

Enzym

Phosphatpuffer-LösungRT

OH

OH

OHOHHO

Me2N

Abb. 2.55: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21.

Im Rahmen der Untersuchungen zur enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters

rac-15 hatte sich gezeigt, das in der Schweineleber-Esterase-katalysierten Reaktion

rac-13 rac-20, 88 %

rac-20 rac-21, 93 %

rac-21

(+)-21

(−)-20

RT, 30 Min.

Page 131: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 117

und in der Candida rugosa Lipase-katalysierten Reaktion gute Ergebnisse erzielt

worden sind. Daher wurde rac-21 in die von diesen Enzymen katalysierte Hydrolyse

zunächst unter Standardbedingungen, wäßrige Phosphatpufferlösung mit 10 % tert-

Butanol als Cosolvens, eingesetzt (Tabelle 2.42). Es wurde ebenfalls das Enzym

Cholesterolesterase, welches aus Candida rugosa erhalten wird, in die Hydrolyse

von rac-21 unter den genannten Bedingungen eingesetzt.

Tabelle 2.42: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-21 im wäßrigen

Einphasensystem (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol)

Reaktionsbedingungen Reaktions-

zeit Umsatz

ee Ester

(+)-21

ee Phenol

(−)-20 E-Wert

Cholesterolesterase (CE; 3.3 U/ml) pH 7.0 16.8 h 64 % 71 % 11 % 2

Schweineleber-Esterase (PLE; 4.9 U/ml), pH 8.0 3.3 h 82 % 20 % 6 % 1.3

Candida rugosa Lipase (CRL; 4.6 U/ml), pH 7.0 18.5 h 40 % 31 % 17 % 2

Aus Tabelle 2.42 geht hervor, daß der Phenylester rac-21 im Gegensatz zu dem

Ester der sekundären Hydroxylgruppe (rac-19) ein Substrat für eine enzymatische

Racematspaltung ist. Alle drei eingesetzten Enzyme zeigen eine hohe Aktivität in der

Hydrolyse dieses Esters. Die Aktivität der getesteten Enzyme ist im Bereich der

Aktivität hinsichtlich des Esters rac-15. Die unter diesen Standardbedingungen eines

Enzymscreenings erzielte Selektivitäten sind allerdings für alle Enzym sehr schlecht.

Im Rahmen der Untersuchungen zum Phenylesters rac-15 wurden unter gleichen

Bedingungen höhere Selektivitäten in der CRL- und PLE-katalysierten Hydrolyse

erzielt. Die höchste Selektivität in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 wurde in

der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem

beobachtet. Daher wurde der Phenylester rac-21 ebenfalls in die CRL-katalysierte

Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.43).

Page 132: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

118 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.43: CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-

organischen Zweiphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0;

MTBE; 1 : 1)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

46 h 57 % 89 % 28 % 5

Die unter diesen Bedingungen erzielte Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von

5, ist zwar höher als die, die im wäßrigen Einphasensystem beobachtet wurde, sie ist

allerdings für eine kinetische Racematspaltung dieses Esters zu gering.

Somit ist wie im Falle des Esters rac-15 auch mit dem Esters rac-21 in der CRL-

katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem die höchste

Selektivität beobachtet worden. Insgesamt konnte die prinzipielle Möglichkeit zu

einer Enzym-katalysierten Racematspaltung des 1,3-diaxial substituierten Alkohols

rac-13 aufgezeigt werden und so wiederum die Anwendbarkeit der Methode einer

Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen Estern demonstriert

werden.

Die bisher in der enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters rac-21 erzielte

Selektivität ist mit einem E-Wert von 5 sehr gering. Allerdings wurden in den ersten

Versuchen zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-15 auch ähnlich niedrige

Selektivitäten beobachtet, die dann optimiert werden konnten. Daher kann eine

Optimierung der Reaktionsbedingungen (Enzym, Cosolvens, Kettenlänge des Esters

u.a.) hier möglicherweise auch zu einer Steigerung der Selektivität führen.

Außerdem stehen zur Steigerung des Enantiomerenüberschusses der Produkte

einer enzymatischen Racematspaltung noch anwendungstechnische Möglichkeiten

offen. So kann das gewünschte enantiomerenangereicherte Produkt wieder in eine

enzymatische Reaktion eingesetzt werden.5,6 Diese Strategie ist bereits von vielen

Autoren untersucht worden224, so daß hier bereits Wege zur Vereinfachung und zur

Optimierung aufgezeigt worden sind.225 Beispielsweise sind hierzu von CHEN et al.

Untersuchungen zur Vorhersage des günstigsten Umsatzes gemacht worden.106

In der konkurrierenden klassischen oder thermodynamischen Racematspaltung von

rac-13 mit Weinsäurederivaten können sehr gute Ergebnisse erzielt werden.184 Diese

Page 133: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 119

Methode ist zur Trennung der Enantiomeren in einem präparativen Maßstab

geeignet.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 20 erfolgte

durch Vergleich der Drehwerte mit denen, die bereits für die Enantiomeren der

Hydrochloride des O-methylierten Alkohols 13 publiziert sind.98

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration des Esters 21 erfolgte in Analogie zu der

des Phenols 20.

Page 134: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

120 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-

dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-

ester (rac-22)

Der racemische Alkohol 2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-

1,4-diol (rac-14) ist die interessanteste Verbindung, der Rahmen dieser Arbeit

diskutierten Substrate, da das (+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer eine wichtige Vorstufe des

Wirkstoffs (+)-50, dem para-Fluorbenzylether von (+)-14, ist. Dieser Wirkstoff ist ein

vielversprechender Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH97, der in der

präklinischen Entwicklung weit vorangeschritten ist. Aufgrund des stark

unterschiedlichen pharmakologischen Profils der einzelnen Enantiomeren ist eine

Vermarktung der enantiomerenreinen Verbindung (+)-50 geplant (Abb. 2.56).184

OH

Me2N

OMeO

F

Abb. 2.56: (+)-(1S,2R,4R)-2-Dimethylaminomethyl-4-(4-fluoro-benzyloxy)-1-

(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol hydrochlorid ein vielversprechender

Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH.

Diese Substanz zeigt eine sehr starke analgetische Aktivität, die über die von

Morphin hinausgeht. Somit könnte ein Einsatz in der Therapie gegen sehr starke

Schmerzen erfolgen. Aufgrund einer sehr hohen Wirkstärke von (+)-50 ist hierzu nur

die Verabreichung geringster Mengen nötig. Dabei ist auch eine orale Einnahme

möglich, was einen Fortschritt zu der bisherigen Therapie darstellt. Eine weitere

Verbesserung ist, daß die häufig als Nebenwirkung auftretende Atemdepression

gegenüber vergleichbaren Wirkstoffen, wie dem Morphin, vermindert ist.184

Interessanterweise zeigt dieser Wirkstoff, wie das Tramadol, eine µ-opioide und eine

nicht-opioide Wirkung. Doch während beim Tramadol die Inhibierung der

Wiederaufnahme der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT)

hauptsächlich über das (−)-Enantiomer erfolgt, zeigt in diesem Falle das (+)-50

neben der µ-opioiden Wirkung auch die Wirkung der Wiederaufnahmehemmung.

(+)-50⋅HCl

⋅HCl

Page 135: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 121

Das Wirkprofil des Racemats Tramadol konnte somit in einem Enantiomer eines

neuen Wirkstoffs vereint werden.184

Das entsprechende (−)-Enantiomer zeigt ebenfalls eine analgetische Aktivität, die

aber nicht an die Wirkstärke von (+)-50 heranreicht. Zudem verursacht es starke

Nebenwirkungen (Herz-Kreislauf-Beschwerden), die im Falle des (+)-50 weniger

stark ausgeprägt sind. Durch die Fluor-Substitution am Aromaten wird eine

verlangsamte Metabolisierung im Körper erreicht.184 Erst kürzlich ist über das nicht

fluorsubstituierte (+)-4-Benzyloxytramadol ist mit ausgewählten pharmakologischen

Daten berichtet worden.46i) Diese zeigen ebenfalls eine im Vergleich zum Tramadol

gesteigerte Affinität zum µ–Opioidrezeptor.

Obwohl in diesem Fall die Verwendung eines einzelnen Enantiomers geplant ist,

werden natürlich beide einzelnen Enantiomeren für eine pharmakologische

Begutachtung benötigt.

Wie der isomere Alkohol rac-12 ist auch rac-14 aufgrund der equatorial

angeordneten sekundären Hydroxylgruppe ein Substrat, daß sich für eine

Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung anbietet. Ausgehend von den bisherigen

Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse von Tramadol-Analoga wurde wiederum

das Butyrat als Acylrest gewählt und unter den bisherigen Standardbedingungen,

wäßriges Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische

Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.57).

OH

Me2N

OMe

OHOMe

+

OH

Me2N

OMe

Me2N

OPr

O

OPr

O

HO

Enzym

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung

RT

Abb. 2.57: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.

rac-22

(+)-22

(−)-14

Page 136: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

122 THEORETISCHER TEIL

Als erstes Enzym wurde die Lipase aus Burkholderia cepacia als Katalysator in die

enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.44). Nach

22 Stunden Reaktionszeit konnte kein Produkt mittels DC-Reaktionskontrolle

detektiert werden, daraufhin wurde die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die

restliche Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit konnte

immer noch kein Umsatz beobachtet werden, daraufhin wurde die Reaktion

abgebrochen. In der BCL-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Vinylpropionat wurde ebenfalls eine nur geringe Aktivität dieses Enzyms festgestellt

(Tabelle 2.29). Eine Erklärung könnte sich aus dem aktiven Zentrum dieser Lipase

ergeben: von KAZLAUSKAS et al. wurden die aktiven Zentren verschiedener Lipasen

untersucht, hierbei zeigte sich, daß die BCL226 verglichen mit der CRL227 über eine

viel schmalere Tasche zur Bindung des Alkohols verfügt.228 Dies mag der Grund

dafür sein, daß dies Enzym die relativ großen Moleküle der Tramadol-Analoga nur

mit geringer Aktivität akzeptiert.

Tabelle 2.44: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 (20 U/ml;

Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol)

Enzym Reaktions-

zeit Umsatz

ee Ester

22

ee Alkohol

14 E-Wert

Burkholderia cepacia Lipase 48 h 0 % n. b. n. b. -

In der Transacylierung des korrespondierenden Alkohols rac-14 zeigte die

Enzympräparation Novozym 435 (CAL-B) sehr gute Aktivität und auch Selektivität

(s. Kap. 2.4.2.9 beginnend ab S. 144). Daraufhin wurde das Novozym 435 auch in

die Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.45). Wie schon bei der

Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 zuvor ist die Aktivität dieser

immobilisierten Candida antarctica Lipase auch in der Hydrolyse des Esters rac-22

gering. Erst nach einer Reaktionszeit von 10 Tagen ist ein Umsatz von 35 % bei

einer moderaten Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von 24, erzielt worden.

Die CAL-B hydrolysiert bevorzugt den (−)-Ester zum Alkohol (−)-14. Damit zeigt sie

die gleiche Enantiopräferenz wie zuvor beim Substrat rac-18, bei dessen Lipasen-

katalysierter Hydrolyse bevorzugt der Alkohol (−)-12 gebildet wird.

Page 137: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 123

Tabelle 2.45: CAL-B-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 mit verschiedenen

Enzympräparationen (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Enzym Reaktions-

zeit Umsatz

ee Ester

(+)-22

ee Alkohol

(−)-14 E-Wert

Novozym 435 (CAL-B) 10 d 35 % 67 % 85 % 24

Chirazyme L2 (CAL-B, 58 U/ml) 45 h 7 % 9 % ≥98 % >200

Eine höhere Aktivität in der Candida antarctica Lipase des Esters rac-22 wurde von

einer lyophilisierten Form unter dem Namen Chirazyme L2 erwartet (Tabelle 2.45).

Allerdings konnte nach 45 Stunden lediglich ein Umsatz von 7 % erzielt werden. Ein

Umsatz, der in der gleichen Zeit auch in der Novozym 435-katalysierten Hydrolyse

des Esters rac-18 erreicht worden war. Eine Verlängerung der Reaktionszeit würde

sicherlich zu höheren Umsätzen führen, aber eine Reaktionszeit von bis zu 10 Tagen

erscheint für einen möglichen zukünftigen Produktionsprozeß nicht zweckmäßig.

Interessanterweise ist die Selektivität dieser Reaktion bis zum erreichten Umsatz

außerordentlich hoch. Es wurde praktisch nur der (−)-Ester hydrolysiert. Diese hohe

Selektivität wird als E > 200 ausgedrückt. Bei einem höheren Umsatz wäre dieser

E-Wert aussagekräftiger, da bei niedrigen Umsätzen kleine Schwankungen in der

Bestimmung des ee-Werts des Alkohols zu hohen Schwankungen im E-Wert führen

können, außerdem kann es bei Abweichungen von den Voraussetzungen zum E-

Wert zu einem Abfall der Selektivität mit Fortschreiten der Reaktion kommen.

Die Candida rugosa Lipase hat in der Hydrolyse von rac-18 und Transacylierung von

rac-12 sehr gute Aktivitäten und Selektivitäten gezeigt. Zunächst wurde die CRL in

die Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-

Butanol als Cosolvens eingesetzt (Tabelle 2.46). Nach 24 Stunden konnte bei einem

Umsatz von 27 % ein ee-Wert von 92 % im Alkohol (−)-14 bei einem ee-Wert im

Ester von 38 % erzielt werden. Dies entspricht einem E-Wert von 34. Wie schon bei

der Hydrolyse des Esters rac-18 wird von dem Enzym CRL, wie zuvor auch von der

CAL-B, das (−)-Enantiomer des Substrats bevorzugt umgesetzt. Die erzielte

Selektivität ist niedriger als die, die in der Hydrolyse der isomeren Verbindung rac-18

Page 138: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

124 THEORETISCHER TEIL

erzielt wurde. Für eine Hydrolyse in einem größeren präparativen Maßstab wäre die

Selektivität aber hoch genug. In Abb. 2.22 auf S. 58 ist die Abhängigkeit der ee-

Werte von Substrat (+)-22 und Produkt (−)-14 bei einer Selektivität von E = 34

dargestellt. Aus dieser Abbildung geht hervor, daß ab einem Umsatz von ca. 60 %

der nicht umgesetzte Ester enantiomerenrein vorliegt.

Tabelle 2.46: CRL-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 in verschiedenen

Reaktionssystemen (Candida rugosa Lipase; 4.5 U/ml)

Reaktionsbedingungen Reaktions-

zeit Umsatz

ee Ester

(+)-22

ee Alkohol

(−)-14 E-Wert

Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

24 h 27 % 38 % 92 % 34

Zweiphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.5; MTBE; 1 : 1)

5 d 34 % 37 % 69 % 8

Nach der Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem, wurde die CRL-katalysierte

Hydrolyse im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium

durchgeführt (Tabelle 2.46). Bisher zeigte die CRL im Zweiphasensystem bei meist

ähnlicher Aktivität eine höhere Selektivität. Im Fall des Substrates rac-22 ist die

Reaktionsgeschwindigkeit im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem erheblich

niedriger als im Einphasensystem. Zum Erreichen eines Umsatzes von 34 % werden

5 Tage benötigt. Diese Verlängerung der Reaktionszeit kann durch eine für das

Substrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzyms, welche die Diffusion

des Esters in das aktive Zentrum und die anschließende Bildung des Acyl-Enzyms

erschwert, hervorgerufen werden. Die Selektivität der Hydrolyse im Zweiphasen-

system ist ebenfalls erheblich niedriger als die im Einphasensystem. Dies würde sich

durch eine für das Substrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzyms

ebenfalls erklären lassen.

Zur Vorhersagbarkeit der Selektivität in Lipasen-katalysierten Reaktionen

entwickelten KAZLAUSKAS et al. einfache empirische Modelle (Abb. 2.58). Mit diesen

Modellen läßt sich die Selektivität hinsichtlich des bevorzugt reagierenden

Enantiomers für sekundäre229 und primäre230 Alkohole vorhersagen, wobei die

Page 139: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 125

Substituenten am Stereozentrum nur aufgrund ihrer Größe unterschieden werden.231

Durch gezielte Veränderung von Substraten konnte gezeigt werden, daß die

Selektivität durch Erhöhung des Größenunterschieds der Substituenten gesteigert

wird. Die Anwendung dieses Models auf große, höher substituierte Verbindungen

muß aber nicht immer gelingen, da es nicht für solche Verbindungen im Detail belegt

worden ist.

L

HO H

L

HHO

M M

sekundäre Alkohole primäre Alkohole

Abb. 2.58: Empirische Selektivitätsmodelle nach KAZLAUSKAS et al. Das jeweils

gezeigte Enantiomer wird schneller in einer Lipasen-katalysierten

Reaktionen umgesetzt (L = großer Substituent, M = kleiner Substituent).

Im Fall des Esters 22 wird von der CRL bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierte

Enantiomer umgesetzt. Dies läßt sich mit dem KAZLAUSKAS Modell in Einklang

bringen (Abb. 2.59). Zum Vergleich sind in Abb. 2.59 neben dem Alkohol (−)-14 die

von der CRL bevorzugten Enantiomere (−)-41193 und (+)-42194 abgebildet. Auf alle

drei Enantiomere läßt sich das Selektivitätsmodell nach KAZLAUSKAS et al. anwenden.

OHOMe

Me2N

HO

OH

OH

NMe2

MeO

N

OHOMe

OMe

OH

Abb. 2.59: Von der CRL entsprechend dem von KAZLAUSKAS et al. entwickelten

Modell bevorzugt umgesetzte Enantiomere.

(+)-42 (−)-41 (−)-14

(−)-14

Page 140: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

126 THEORETISCHER TEIL

In weiteren Untersuchungen zur Candida rugosa Lipase wurde das aktive Zentrum

dieses Enzyms von KAZLAUSKAS et al. mit dem anderer verglichen.228 Das aktive

Zentrum der CRL wird durch eine weite Öffnung beschrieben, die es ermöglicht auch

große sekundäre Alkohole als Substrate zu akzeptieren.227 Des weiteren ist eine

tunnelartige Tasche in direkter Nähe zum aktiven Zentrum, die den Acylrest

aufnehmen kann. Im Vergleich zu dem aktiven Zentrum der CRL verfügt die CE über

eine ähnliche weite Öffnung, die es diesem Enzym ermöglicht ebenfalls große

sekundäre Alkohole umzusetzen.232

Diese Betrachtungen führten zu der Überlegung die Cholesterolesterase in die

enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 einzusetzen (Abb. 2.60).

OH

Me2N

OMe

OHOMe

+

OH

Me2N

OMe

Me2N

OPr

O

OPr

O

HO

CE

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung (pH 7.0)

RT

Abb. 2.60: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.

Die CE-katalysierte Hydrolyse wurde unter den Reaktionsbedingungen des wäßrigen

Einphasensystems bei pH 7 mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens durchgeführt. Das

Enzym zeigte eine gute Aktivität in der Hydrolyse, daher wurde die Reaktion bereits

nach 2.5 Stunden abgebrochen und aufgearbeitet (Tabelle 2.47). Nach dieser

Reaktionszeit lag der gebildete Alkohol (−)-14 bei einem Umsatz von 21 %

enantiomerenrein vor, der noch nicht umgesetzte Ester hatte 30 % ee. Die

Cholesterolesterase hydrolysiert bevorzugt das (−)-Enantiomer und zeigt somit die

gleiche Enantiopräferenz wie die CRL. Die in der CE-katalysierten Hydrolyse des

Esters rac-22 erreichte Selektivität von E größer 200 ist wesentlich höher als die

zuvor beobachteten Selektivitäten. Für ein repräsentatives Beispiel ist der erreichte

Umsatz allerdings zu niedrig. Die Reaktion wurde daher wiederholt und nach

19.5 Stunden bei einem Umsatz von 38 % abgebrochen. Bei diesem Umsatz lag der

gebildete Alkohol (−)-14 nur noch mit einem ee-Wert von 93 % vor (Tabelle 2.47).

rac-22

(+)-22

(−)-14

Page 141: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 127

Tabelle 2.47: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 (9 U/ml; Phosphat-

puffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200

19.5 h 38 % 67 % 93 % 55

Für eine Selektivität von E > 200 hätte er enantiomerenrein vorliegen müssen. Die

Selektivität der Reaktion bei einem Umsatz von 38 % läßt sich daher auch nur mit

einem E-Wert von 55 beschreiben. Ein geringer Abfall der Selektivität der Reaktion

bei höheren Umsätzen wurde auch schon in der PLE-katalysierten Hydrolyse von

rac-15 beobachtet (Tabelle 2.9, S 52). Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der

Reaktion stellt in der Regel eine Abweichungen von den gemachten

Voraussetzungen zum E-Wert dar. Bei sehr hohen Selektivitäten ist außerdem zu

beachten, daß geringe Schwankungen im gemessenen ee-Wert zu einen großen

Differenz im E-Wert führt.

Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 wurde daraufhin wiederholt und mit

dem bereits vorgestellten Verfahren zur Gewinnung der Produkte durch Extraktion

bei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet. Zum Aufarbeitung der Reaktion nach

22.5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit Diethylether bei pH 7 extrahiert. Es

konnte (+)-22 in 53 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden.

Nachdem die verbliebene wäßrige Phase durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10

eingestellt wurde, konnte (−)-14 in 45 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % durch

Extraktion mit Dichlormethan erhalten werden (Tabelle 2.48).

Page 142: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

128 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.48: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver

Aufarbeitung (6.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-22

Ausbeute

Ester (+)-22

ee Alkohol

(−)-14

Ausbeute

Alkohol (−)-14 E

22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67

Es konnte eine Selektivität von 67 bei einem Umsatz von ca. 46 % beobachtet

werden. Sowohl der nicht umgesetzte Ester (+)-22 als auch der Alkohol (−)-14 liegen

mit einem ee-Wert von 91 % vor. Dies Ergebnis stellt eine gute Ausgangsbasis zur

Gewinnung der einzelnen Enantiomeren von 14 dar. Würde die Reaktion früher

abgebrochen, kann der Alkohol (−)-14 mit hohen ee-Werten erhalten werden (vgl.

Tabelle 2.47). Würde man die Reaktion später bei einem Umsatz größer 50 %

abbrechen, könnte der enantiomerenreine Ester (+)-22 erhalten werden.

Mit dieser präparativen Reaktion konnte demonstriert werden, daß die CE-

katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 ein geeignetes Verfahren zur Darstellung

der Enantiomeren von 14 darstellt. In der Katalyse mit dem Enzym wurde die

höchste Selektivität in der Hydrolyse des Esters rac-22 beobachtet. Somit stellt

dieses Enzym einen interessanten Katalysator nicht nur in der Racematspaltung von

Tramadol-Analoga dar.

Für eine enzymatische Hydrolyse von Tramadol-Analoga in einem präparativen

Maßstab kann die geringe Löslichkeiten der entsprechenden Ester unvorteilhaft sein,

da dadurch nur geringe Konzentrationen verwendet werden können, die ein erhöhtes

Lösungsmittelaufkommen mit den sich daraus ergebenen Konsequenzen notwendig

macht. Günstiger für einen Prozeß sind hohe Substratkonzentrationen.

Es wurde daher erwogen, das Hydrochlorid des Esters rac-22 in die CE-katalysierte

Hydrolyse einzusetzen, da die Hydrochloride von Tramadol-Analoga im allgemeinen

sehr gut wasserlöslich sind.

Die Verwendung von basischen Verbindungen in Form ihrer Hydrochloride in der

Enzym Katalyse ist bisher selten. Eines der wenigen Beispiele hierzu stammt von

HUTCHINSON et al., die einen phenolischen Ester mit einem tertiären Amin auch als

Hydrochlorid in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt haben (Abb. 2.17 rechts,

S. 45)170.

Page 143: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 129

Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 in Form seines Hydrochlorids wurde

mit der gleichen Substratkonzentration (0.014 mol/l) durchgeführt, die auch bei der

Verwendung der freien Base als Substrat gewählt wurde (Tabelle 2.49). Das

Hydrochlorid des Esters zeigte keinerlei Schwierigkeiten bei der Löslichkeit im

wäßrigen Milieu. Ein Cosolvens wäre zur Löslichkeitsvermittlung nicht notwendig,

wurde aber zur besseren Vergleichbarkeit mit den zuvor durchgeführten Katalysen

mit dem Enzym beibehalten. Eine um ein vielfaches höhere Substratkonzentration

wäre wahrscheinlich durch die Verwendung des Hydrochlorids des Substrats

möglich. Dies wurde aber zunächst nicht untersucht.

Tabelle 2.49: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl (9 U/ml;

Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

19.5 h 43 % 86 % 94 % 89

In Tabelle 2.49 ist das Ergebnis der CE-katalysierten Reaktion zusammengefaßt.

Verglichen mit dem zuvor erzielten Ergebnis in der Hydrolyse der freien Base

(Tabelle 2.48) ist kein signifikanter Unterschied zu erkennen. Mit einer Selektivität

von E = 89 verläuft die Reaktion weiterhin mit hoher Aktivität und Selektivität des

Katalysators. Dies ist ein sehr wichtiges Resultat, denn der Einsatz der Substrate in

Form ihrer Hydrochloride bringt einige Vorteile: Hydrochloride sind einfach zu

handhaben, sie sind lagerstabil, sie sind im wäßrigen Medium sehr gut löslich, und

die Hydrochloridfällung stellt eine weitere Möglichkeit zur Aufreinigung des Substrats

dar.

Eine Darstellung von (+)-14 zur Synthese des gewünschten Produkts (+)-50 durch

eine CE-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids des Esters rac-22 stellt zwar eine

technisch durchführbare Reaktion dar, ist allerdings umständlich, da der nicht

umgesetzte Ester (+)-22 erst noch in einem zusätzlichen Reaktionsschritt hydrolysiert

werden müßte. Einfacher wäre eine enzymatische Hydrolyse die direkt zu (+)-14 als

Produkt führen würde.

Da im Falle des Substrats rac-18 die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte

Enantiopräferenz zeigten, wurde diese Eigenschaft der Katalysatoren ebenfalls für

Page 144: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

130 THEORETISCHER TEIL

das Substrat rac-22 erhofft, denn dies würde zu dem Ziel eines Hydrolyseproduktes

(+)-14 in der PLE-katalysierten Hydrolyse führen.

Daher wurde der Ester rac-22 anschließend als Substrat in die PLE-katalysierte

Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens

eingesetzt (Abb. 2.61). Das Ergebnis dieser Reaktion ist in Tabelle 2.50 zusammen-

gefaßt.

OH

Me2N

OMe+

OH

Me2N

OMe

OPr

O

HO

OHOMe

Me2N

OPr

O

PLE

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung (pH 8.0)

RT

Abb. 2.61: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.

Die Aktivität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse des Substrats rac-22 ist niedriger als

in der Hydrolyse des isomeren Esters rac-18. Die gleiche Verschiebung in der

Aktivität hinsichtlich dieser beiden Substrate konnte zuvor schon in der Katalyse der

CRL beobachtet werden. Interessanterweise erfolgt die PLE-katalysierte Hydrolyse

des Esters rac-22 mit einem E-Wert von 34. Die gleiche Selektivität wurde zuvor

auch in der CRL-katalysierten Hydrolyse beobachtet. Somit ist die Selektivität dieser

Reaktion zwar gut, bleibt aber hinter der Selektivität der Katalyse der CE zurück.

Tabelle 2.50: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 (3 U/ml; Phosphat-

puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E

16.5 h 18 % 22 % 93 % 34

rac-22

(−)-22

(+)-14

Page 145: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 131

In der CRL-katalysierten Hydrolyse wurde bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierte

Enantiomer umgesetzt. In der PLE-katalysierten Hydrolyse wird hingegen das

(+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer bevorzugt hydrolysiert. Damit zeigt die Schweineleber-

Esterase eine zu den anderen getesteten Enzymen entgegengesetzte

Enantiopräferenz. Dieses konnte zuvor auch an dem isomeren Substrat rac-18

beobachtet werden. Somit kann, wie erhofft, der enantiomerenangereicherte Alkohol

(+)-14 als direktes Reaktionsprodukt in einer enzymatischen Racematspaltung

erhalten werden. Im Hinblick auf eine Synthese des gewünschten Produkts (+)-50

stellt dies eine Vereinfachung dar.

Zur Visualisierung der Enantiopräferenz der PLE wurden in Abb. 2.62 die bevorzugt

umgesetzten Enantiomere (+)-12 und (+)-14 dem Kastenmodell nach JONES et al.

angepaßt dargestellt.

HLHS

PF

PB Ser

OH

Me2N

OMeHO

MeONMe2OH

OH

OH

Me2N

OMe

MeONMe2OH

OH

HO

Abb. 2.62: Von der PLE entsprechend dem Kastenmodell nach JONES et al.

bevorzugt umgesetzte Enantiomere.

Wie aus Abb. 2.62 hervorgeht, zeigt die Hydroxylgruppe des Moleküls (+)-12 genau

in Richtung der Hydroxylgruppe am Serin-Rest, dagegen zeigt die Hydroxylgruppe

von (+)-14 ein wenig von dem Serin-Rest weg in eine andere Richtung. Dies kann die

HL: große, hydrophobe Tasche

HS: kleine, hydrophobe Tasche

PF: vordere, polare Tasche

PB: hintere, polare Tasche

Ser: Serin-Rest

(+)-14 (+)-12

Page 146: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

132 THEORETISCHER TEIL

Ursache für die Unterschiedliche Aktivität des Enzym hinsichtlich der beiden

Substrate sein und erklären, warum rac-18 schneller als rac-22 umgesetzt wird. In

beiden Molekülen zeigen die Dimethylaminomethylgruppen in Richtung der vorderen,

polaren Tasche.

Kommerziell verfügbare PLE ist in der Regel eine Mischung verschiedener

Isoenzyme. Analytisch können diese Isoenzyme durch isoelektrische Fokussierung

aufgetrennt werden.128a),129 Obwohl 1988 von JONES et al. noch keine wesentlichen

Unterschiede in Selektivität und Substratspezifität in der Katalyse der Isoenzyme

erkannt werden konnten233, wurde hingegen in neueren Arbeiten von MATTSON et al.

signifikante Unterschiede in den katalytischen Eigenschaften der einzelnen

Isoenzyme aufgezeigt.130 Da Isoenzym-angereicherte Fraktionen der PLE

kommerziell verfügbar sind (z.B. bei ROCHE DIAGNOSTICS als Chirazyme E1 und

Chirazyme E2), wurde ebenfalls ein möglicher Einfluß der Isoenzymzusammen-

setzung der PLE untersucht. Hierzu wurde das Isoenzym-angereicherte

Chirazyme E1 in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt. Mit

diesem Enzym wurden zuvor in der GRÜNENTHAL GmbH enzymatische Hydrolysen

durchgeführt. Hierbei konnte in systematischen Untersuchungen ein günstiger

Einfluß von 16 % Aceton als Cosolvens auf die Hydrolyse von Tramadol-Analoga

gefunden werden.184 Auf diese Ergebnisse zurückgreifend wurde ebenfalls ein

Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens für die Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse

des Esters rac-22 gewählt (Tabelle 2.51).

Tabelle 2.51: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz

von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung

(1.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.014 M Substrat)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-22

Ausbeute

Ester (−)-22

ee Alkohol

(+)-14

Ausbeute

Alkohol (+)-14 E

42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85

Die Reaktion wurde nach einer Reaktionszeit von 42 Stunden bei einem Umsatz von

ca. 24 % abgebrochen und nach der Methode der Extraktion bei verschiedenen

pH-Werten aufgearbeitet. Wie zuvor sind die isolierten Ausbeuten sehr gut, da die

Page 147: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 133

Gesamtausbeute 97 % beträgt. Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen

Hydrophobizität der Verbindungen. Ausgedrückt werden kann dies anhand von

ausreichend großen Unterschiede im log P-Wert (Tabelle 2.52). Dabei handelt es

sich in diesem Fall um den Logarithmus des Verteilungskoeffizienten zwischen

Wasser und Cyclohexan.

Tabelle 2.52: Log P-Werte (Wasser / Cyclohexan) für rac-14 und rac-22 bei

verschiedenen pH-Werten

pH rac-14 rac-22

7.0 -2.691 0.557

7.4 -2.297 0.946

8.0 -1.724 1.498

10.0 -0.680 2.333

12.0 0.633 2.360

Die Selektivität der Chirazyme E1 Präparation in der Hydrolyse des Esters rac-22 ist

sehr hoch. Der Alkohol (+)-14 konnte mit einem ee-Wert von 97 % und der Ester

(−)-22 mit einem ee-Wert von 27 erhalten werden. Insgesamt ist also die Selektivität

mit einem E-Wert von 85 größer als die der PLE-katalysierten Reaktion.

Damit stellt das Isoenzym-angreicherte Chirazyme E1 einen geeigneteren

Katalysator als die gesamte Isoenzym-Mischung PLE dar. Zudem scheint dieses

Ergebnis die von MATTSON et al. gemachte Aussage, daß die einzelnen Isoenzyme

signifikante Unterschiede hinsichtlich der Selektivität zeigen, zu belegen. Da

allerdings im Rahmen dieser Arbeit keine Untersuchungen zur Zusammensetzung

der einzelnen Enzym-Katalysatoren und ihrer Selektivität gemacht wurden, konnte

dieser Gesichtspunkt nicht weiter vertieft werden.

Im Hinblick auf eine mögliche Anwendung dieses Verfahrens wurde der Esters

rac-22 auch in Form des Hydrochlorids dieser Verbindung in die Chirazyme E1-

katalysierte Hydrolyse unter Verwendung von 16 % Aceton als Cosolvens eingesetzt.

Der Verlauf des Umsatzes sowie der ee-Werte von Substrat und Produkt ist durch

Entnahme einzelner Proben über einen Zeitraum von 23 Stunden verfolgt worden

(Abb. 2.63). Es ist zu erkennen, daß bis zu einem Umsatz von 12 % der Alkohol

Page 148: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

134 THEORETISCHER TEIL

(+)-14 nahezu enantiomerenrein vorliegt (E > 200) und daß danach der ee-Wert fällt.

Entsprechend dem Gegebenheiten einer kinetischen Racematspaltung steigt der

ee-Wert des Esters (−)-22 mit dem Umsatz. Nach 22.5 Stunden liegt der Alkohol mit

einem ee-Wert von 95 % und der Ester mit einem ee-Wert von 28 % vor, dies

entspricht einem E-Wert von 50 (Tabelle 3.50, obere Zeile). Danach wurde die

Reaktionsmischung mit der Methode der Extraktion bei unterschiedlichen pH-Werten

aufgearbeitet (Tabelle 3.50, untere Zeile).

0 5 10 15 200

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

E = 50

E = 50

ee-Wert Ester ee-Wert Alkohol

ee-W

ert (

%)

Umsatz (%)

Abb. 2.63: Verlauf der ee-Werte von Alkohol (+)-14 und Ester (−)-22 in der

Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl.

Wie aus Tabelle 2.53 hervorgeht, konnte der Alkhohl nur mit einem ee-Wert von

91 % erhalten werden und somit ergibt sich ein E-Wert von 27. Da der ee-Wert des

Alkohols nach 22.5 Stunden in der Reaktionslösung noch bei 95 % lag und bei der

Extraktion des Alkohols (+)-14 noch Reste des zuvor nur unvollständig extrahierten

Esters (−)-22 erhalten wurden, ist anzunehmen, daß der Abfall in dem ee-Wert des

Alkohols während der Aufarbeitung erniedrigt worden ist. Während der Extraktion bei

pH 10 sind vermutlich Teile des (−)-Ester zum (−)-Alkohol hydrolysiert, was einen

Page 149: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 135

Abfall des ee-Wertes von (+)-14 zur Folge hat. Somit beschreibt der aus der

Reaktionslösung bestimmte E-Wert von 50 die Selektivität der kinetischen

Racematspaltung zutreffender. Die im Vergleich zur Hydrolyse der freien Base des

Esters rac-22 geringere Selektivität läßt sich durch die geänderten Reaktions-

bedingungen erklären. In der Hydrolyse des Hydrochlorids wurde eine

Substratkonzentration von 0.200 mol/l gewählt, die um ein vielfaches höher ist, als

die in der Hydrolyse der freien Base mit 0.014 mol/l. Um eine vergleichbare

Reaktionsgeschwindigkeit in der Hydrolyse des Hydrochlorids zu erreichen, ist die

Enzymmenge um etwa den gleichen Faktor von 1.6 U/ml auf 22.8 U/ml erhöht

worden. Aus Tabelle 2.51 und Tabelle 2.53 läßt sich abschätzen, daß die

Reaktionsgeschwindigkeit tatsächlich in etwa gleich groß ist. Insgesamt hat die

Erhöhung der Substrat- und Enzymkonzentration zu einer kleinen Verringerung der

Selektivität in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse geführt.

Tabelle 2.53: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter

Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung

(22.8 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M Substrat)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-22

Ausbeute

Ester (−)-22

ee Alkohol

(+)-14

Ausbeute

Alkohol (+)-14 E

(22.5 h) (26 %) (95 %) (50)

24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27

Da das Hydrochlorid des Esters rac-22 auch in der Konzentration von 0.231 mol/l

ohne den Zusatz von Aceton als Cosolvens gut löslich ist, entsteht die Frage, ob

überhaupt ein Cosolvens in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von

rac-22⋅HCl notwendig ist. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden zwei

parallele Reaktionen durchgeführt. In einer Reaktion wurde unter sonst identischen

Bedingungen (22.8 U/ml Chirazyme E1; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M

rac-22⋅HCl) 16 % Aceton als Cosolvens verwendet, in der anderen kein Cosolvens.

Aus beiden Reaktionen wurden Proben entnommen, die dann extrahiert und

analysiert wurden. Die Reaktionsgeschwindigkeiten der Reaktionen lassen sich in

Abb. 2.64 erkennen, in welcher der Verlauf des Umsatzes über die Zeit dargestellt

Page 150: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

136 THEORETISCHER TEIL

ist. Beide Zeit-Umsatz Kurven zeigen nach ca. 50 Stunden Reaktionszeit einen

Rückgang im Umsatz. Dies wurde durch einen systematischen Fehler,

wahrscheinlich bei der Extraktion der Probe oder durch eine weitere Temperatur-

schwankung, verursacht. Es ist deutlich zu erkennen, daß die Reaktion ohne Zusatz

von Aceton als Cosolvens mit höherer Reaktionsgeschwindigkeit verläuft.

Beispielsweise wird in der Katalyse ohne Cosolvens bereits nach 7.5 Stunden ein

Umsatz von 21 % erreicht. Zum Vergleich wird dieser Umsatz in der Katalyse mit

Aceton als Cosolvens erst nach 175 Stunden (1 Woche) beobachtet. Dieser

Unterschied in der Aktivität des Enzyms wird wahrscheinlich durch eine Inhibition des

Enzyms durch das Cosolvens Aceton verursacht.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Umsatz = 41 %

Umsatz = 21 %E > 200

E > 200

E > 200

E =157

E = 31

E = 30

E = 27 E = 27

mit 16 % Aceton als Cosolvens ohne Cosolvens

Um

satz

(%

)

Reaktionszeit (h)

Abb. 2.64: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne

Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens.

Im Vergleich zu den zuvor vorgestellten Reaktionen verlaufen beide Reaktionen mit

eine niedrigeren Reaktionsgeschwindigkeit. Dies ist auf einen technischen Defekt

zurückzuführen, der die Reaktionstemperatur im Vergleich zu den vorherigen

Versuchen herabsetzte. Neben dem Einfluß des Acetons auf die Aktivität der

Enzymkatalyse ist auch ein Einfluß des Cosolvens auf die Selektivität der

Page 151: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 137

Chirazyme E1-katalysierten Reaktionen zu beobachten. Ein direkter Vergleich der

Selektivitäten beider Reaktionen in Abb. 2.64 ist aber aufgrund des niedrigen

Umsatzes in der Reaktion mit Cosolvens kaum möglich, da ein Vergleich der

E-Werte nur bei gleichem Umsatz aussagekräftig ist. Bei Erfüllung aller in

Kap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen ist der E-Wert über den Verlauf der

Reaktion konstant. Im Verlauf der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten

enzymatischen Hydrolysen von Tramadol-Analoga konnte allerdings häufiger ein

langsames Abfallen des E-Wertes mit dem Fortschreiten einer Reaktion beobachtet

werden. Aus Abb. 2.64 geht hervor, daß in der Reaktion mit dem Cosolvens Aceton

nach 175 Stunden ein E-Wert größer 200 bei einem Umsatz von 21 % beobachtet

wird. In der Reaktion ohne Cosolvens ist bei dem gleichen Umsatz von 21 % der

E-Wert allerdings auch größer 200, dieser Umsatz wird nur schon viel früher nach

7.5 Stunden erreicht. Somit verlaufen beide Reaktionen in ihrem Anfang

hochselektiv. In der Reaktion ohne Cosolvens ist danach allerdings ein starker Abfall

in der Selektivität mit dem Umsatz der Reaktion zu beobachten. Bei 40 % Umsatz

läßt sich die Selektivität nur noch durch einen E-Wert von 27 beschreiben. Hier ist

ein direkter Vergleich mit der Reaktion mit einem Zusatz von Aceton als Cosolvens

nicht mehr möglich.

Eine von der GRÜNENTHAL GmbH beobachtete Abhängigkeit der Chirazyme E1-

katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz ist in Tabelle 2.55

auf S. 142 dargestellt.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Alkohols 14 erfolgte

durch Vergleich des Drehwerts, der bereits für die Verbindung (+)-50⋅HCl, das

Hydrochlorid des para-Fluorbenzylethers zum Alkohol (+)-14, publiziert ist.97 Hierbei

erfolgte die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-50⋅HCl durch Röntgen-

strukuranalyse.184

Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 22, 23, 24 und 45 erfolgte in

Analogie zu der des Alkohols 14.

Page 152: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

138 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-

dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-

ester (rac-23)

Da bisher keine Racematspaltung über diastereomere Salzbildung mit dem Alkohol

rac-14 gelungen ist, stellt die Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung bisher

das einzige Verfahren zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 in einem

präparativen Maßstab dar.

Somit ist die GRÜNENTHAL GmbH bei diesem Substrat auf eine enzymatische

Methode zur Gewinnung der einzelnen Enantiomeren angewiesen. Zugleich ist die

Verbindung (+)-50 auch eine in der präklinischen Forschung weit vorangeschrittene

Verbindung. Dies macht die Entwicklung einer enzymatischen Methode zur Synthese

von (+)-14 notwendig, welche die Bereitstellung von Kilogrammmengen in einem

Technikumsmaßstab zu leisten vermag. Ein endgültiger Produktionsprozeß für die

Verbindung (+)-50 sollte zur dritten klinischen Testphase bekannt sein.

Im Hinblick auf einen technisch durchführbaren enzymatischen Prozeß stellt sich die

Frage, ob eine Veresterung von rac-14 mit der Buttersäurechlorid zur Darstellung

von rac-22 unter dem Aspekt einer möglichen Geruchsbelästigung realisierbar ist.

Die technische Durchführbarkeit dieser Reaktion und der anschließenden

enzymatischen Hydrolyse ist in jedem Fall gegeben.184

Aufgrund dieser Vorbehalte wurde die Möglichkeit einer Variation des Acylrestes des

Substrats in Erwägung gezogen. In Vorversuchen zeigte sich, daß Valerian-

säurechlorid ebenfalls sehr penetrant unangenehm riecht und somit auch nicht in

Frage kommt. Aus wirtschaftlicher Sicht läßt sich eine Verlängerung des Acylrestes

bis zur Hexansäure (C6) vertreten. Eine Verkürzung des Acylrestes ist ebenfalls eine

weitere Möglichkeit. Aufgrund der schlechten Erfahrungen in der Synthese des

Acetats rac-24 wurde dieser Ansatz zunächst aber nicht verfolgt, sondern vielmehr

das Capronat von rac-14 dargestellt und dessen Eigenschaften als Substrat in der

PLE-katalysierten Hydrolyse untersucht (Abb. 2.65).

Page 153: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 139

OH

Me2N

OMe+

OH

Me2N

OMe

OC5H11

O

HO

OHOMe

Me2N

OC5H11

O

Chirazyme E1

Phosphatpuffer-

16 % CosolvensLösung (pH 7.0)

RT

Abb. 2.65: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23.

Die Reaktionsbedingungen der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters

rac-23 wurden entsprechend den zuvor durchgeführten Hydrolysen gewählt. Es

wurde die freie Base als Substrat eingesetzt. Durch den längeren Acylrest ist das

Substrat rac-23 hydrophober als beispielsweise das Butyrat rac-22. Als eine

Konsequenz war eine herabgesetzte Löslichkeit des Substrats zu beobachten. Zu

Beginn der Reaktion war die Reaktionslösung stark getrübt und klärte sich dann

langsam mit Voranschreiten des Umsatzes. Die Aktivität des Katalysators und damit

auch die Reaktionsgeschwindigkeit war moderat. Nach 24 Stunden, bei einem

Umsatz von ca. 46 %, wurde mit der Methode der Extraktion bei verschiedenen pH-

Werten aufgearbeitet. Bei einem pH-Wert von 7.0 konnte durch Spuren von Hexan-

säure (Capronsäured) verunreinigter und daher penetrant ziegenähnlich riechender

Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % in 54 % Ausbeute isoliert werden.

Anschließend wurde bei pH 10 der Alkohol (+)-14 einem ee-Wert von 77 % in 46 %

Ausbeute erhalten (Tabelle 2.54). Die Selektivität der Reaktion läßt sich durch E = 24

beschreiben und verläuft somit mit geringerer Selektivität als die Hydrolyse des

Butyrats rac-22.

d capra (lat.) = Ziege.

rac-23

(−)-23

(+)-14

Page 154: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

140 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.54: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz

von 16 % Aceton als Cosolvens (3.1 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0)

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-22

Ausbeute

Ester (−)-22

ee Alkohol

(+)-14

Ausbeute

Alkohol (+)-14 E

24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24

Unter anwendungstechnischen Aspekten ist der ziegenähnliche Geruch der

Hexansäure ein ausschlaggebender Nachteil, da keine Verbesserung gegenüber

dem Geruch der Buttersäure erzielt worden ist. Hier könnte die Verwendung des

Propionats als Acylrest den Mittelweg zwischen mangelnder Stabilität des Substrats

(Acetat) und Geruchsbelästigung (Butyrat und höhere Ester) darstellen.

Der zu beobachtende Einfluß des Acylrests auf die Selektivität der Enzym-

katalysierte Hydrolyse ist ebenfalls eine Nachteil der Verwendung des Substrats

rac-23. Da das Enzym Schweineleber-Esterase bevorzugt kurzkettige wasserlösliche

Ester wie Acetate hydrolysiert, stellt das Substrat rac-23 durch seinen großen

Acylrest ein eher ungeeignetes Substrat dar.

2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im

präparativen Maßstab

Zur Bereitstellung erster größerer Mengen an (+)-14 im Halbkilogramm-Maßstab für

die präklinische Entwicklung des Wirkstoffs (+)-50 in der GRÜNENTHAL GmbH wurde

dort eine optimierte Laborsynthese entwickelt und eingesetzt. Ein solches Verfahren

stellt eine besondere Herausforderung an die Effizienz der Enzym-katalysierten

Racematspaltung und die Aufarbeitungsmethode dar.

Aufgrund der Robustheit der enzymatischen Hydrolyse als Methode zur Darstellung

enantiomerenangereicherter Verbindungen wurde daher von der GRÜNENTHAL GmbH

eine PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 durchgeführt (Abb. 2.66). Es

wurden 200 g Hydrochlorid des Esters rac-22 mit 1.5 g Chirazyme E1 im wäßrigen

Einphasensystem aus Phosphatpuffer (pH 7.0) und 16 % Aceton als Cosolvens

umgesetzt.184 Bei einem Umsatz von ca. 52 % wurde zur Aufarbeitung die auch in

Page 155: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 141

einem Kilogramm-Maßstab einfach und effizient durchzuführenden Methode der

Extraktion von Ester und Alkohol bei jeweils unterschiedlichen pH-Werten verwendet.

Diese Methode hat den Vorteil auf chromatographische Trennverfahren verzichten zu

können, da solche Verfahren in einem späteren Produktionsprozess nur schwer

umzusetzen ist. Weiterhin wurde während der Durchführung darauf verzichtet den

pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge konstant zu halten. Dies führte während der

Reaktion zu einer Schwankung des pH-Werts im Phosphatpuffers um 0.5.

OH

Me2N

OMe

+

OH

Me2N

OMe

OPr

O

HO

OHOMe

Me2N

OPr

OChirazyme E1

Phosphatpuffer-

16 % AcetonLösung (pH 7.0)

RT

Abb. 2.66: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl.

Des weiteren wurde als Substrat in der enzymatischen Hydrolyse nicht mehr die freie

Base des Esters rac-22 eingesetzt, da diese in höheren Konzentrationen nicht mehr

im wässrigen Medium löslich ist. Stattdessen wurde das Hydrochlorid der Verbindung

eingesetzt, welches eine sehr viel größere Löslichkeit hat. Die Isoenzym-

angereicherte PLE-Präparation Chirazyme E1 wurde als Katalysator wegen der

Enantiopräferenz für das (+)-Enantiomer eingesetzt, so daß der benötigte (+)-Alkohol

direkt als Reaktionsprodukt erhalten wird. Weiterhin verfügt das Chirazyme E1

gegenüber der PLE über eine höhere Selektivität hinsichtlich des Substrates rac-22.

Auch stellt allgemein eine lyophilisierte Form des Enzyms, wie beim Chirazyme E1,

einen einfach zu handhabenden Katalysator dar.

Ebenfalls wurde Aceton als Cosolvens verwendet. In der GRÜNENTHAL GmbH konnte

eine deutliche Abhängigkeit des ee-Wertes des gebildeten Alkohols (+)-14 von der

zugesetzten Menge an Aceton beobachtet werden (Tabelle 2.55).184

rac-22⋅HCl

(−)-22

(+)-14

⋅HCl

Page 156: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

142 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.55: Abhängigkeit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters

rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz bei einer Reaktionszeit von 48 Stunden

(Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.5 g Substrat)

Aceton-

zusatz

ee Ester

(−)-22

Gehalt

Ester (−)-22

ee Alkohol

(+)-14

Gehalt

Alkohol (+)-14 E

16 % 94 % 56 % 96 % 44 % 174

9 % 98 % 51 % 90 % 49 % 86

0 % 98 % 50 % 73 % 50 % 28

Insgesamt konnte in diesem Versuch der nicht umgesetzte Ester (−)-22 in 99 %

Ausbeute mit einem ee-Wert von 72 % und der gebildete Alkohol (+)-14 in 96 %

Ausbeute mit einem ee-Wert von 93 % isoliert werden (Tabelle 2.56). Durch

anschließende Kristallisation des Alkohols konnte dessen ee-Wert auf >99 %

gesteigert werden.184,234

Tabelle 2.56: Von der GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte Chirazyme E1-katalysierte

Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von 16 % Aceton als

Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (Phosphatpuffer, pH 7.0;

200 mM Substrat)

Enzym Reaktions- Umsatz Ester (−)-22 Alkohol (+)-14 E

zeit Ausbeute ee Ausbeute ee

Chirazyme E1

(22.4 U/ml) 15 h 52 % 99 % 72 % 96 % 93 % 59

Eine geringe Steigerung der Selektivität der Reaktion läßt sich beobachten, wenn

man nach der Hälfte der Reaktionszeit nochmals Enzym zugibt.

Hiermit konnte gezeigt werden, daß eine enzymatische Laborsynthese, wie sie im

Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, in eine Multigramm-Maßstab zur Darstellung

erster Kilogramm-Mengen übertragen werden kann. Als besonders wirkungsvoll ist

dabei die Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu betrachten.

Page 157: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 143

Sie stellt einen Schlüsselschritt für die Aufarbeitung der enzymatische Hydrolyse dar.

Diese Methode hat sich im Halbkilogramm-Maßstab in der GRÜNENTHAL GmbH

etabliert und würde sich auch in einen späteren Produktionsprozeß einsetzten

lassen.

Eine alternative Möglichkeit zu einer effizienten Trennung von Ester und Alkohohl bei

einer enzymatischen Racematspaltung stellt die von THEIL et al. vorgestellte

Extraktion nach Lipasen-katalysierter Fluoracylierung dar.235 Dies Verfahren basiert

auf der Verteilung zwischen organischer und fluoriger Phase und erlaubt eine

Isolierung der Produkte aus dem Reaktionsgemisch, die auch in einem industriellen

Großmaßstab angewendet werden kann.

OH

Ph

O

Ph

O

(CF2)7CF3 OH

Ph

CF3(CF2)7(CH2)2CO2CH2CF3

MeCN, Rt+

Extraktion mit n-C6F14

O

Ph

O

(CF2)7CF3 OH

Ph

CAL-B

Abb. 2.67: Lipasen-katalysierte kinetische Racematspaltung von Phenylethanol und

anschließender extraktiver Trennung mit Hilfe eines fluorig-organischen

Zweiphasensystems.

In einer CAL-B-katalysierten Transacylierung wird hierzu das schneller reagierende

(R)-Enantiomer des Phenylethanols mit einem hochfluorierten Acylrest acyliert (Abb.

2.67). Der mit diesem „Teflon-Schwanz“236 ausgestatte Ester kann anschließend

selektiv n-Perfluorhexan extrahiert werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß

sich in der fluorigen Phase auch noch der Überschuß an fluorierten Acylierungsmittel

befindet, dessen Abtrennung noch nötig sein kann.

47 %, 98 % ee

fluorige Phase (n-C6F14)

48 %, > 98 % ee

org. Phase (MeOH)

Page 158: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

144 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-

Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol

(rac-14)

Nachdem mit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 bereits

ein Verfahren zur Darstellung des Alkohols (+)-14 und damit zur Synthese des

gewünschten Produkts (+)-50 zur Verfügung steht, wurde die Enzym-katalysierte

Transacylierung von rac-14 unter dem Aspekt untersucht, eine Möglichkeit zur

Racematspaltung neuer hydrophober und daher im wäßrigen Milieu unlöslicher

Tramadol-Analoga zu schaffen. Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im

organischen Medium bietet neben dem bereits etablierten hydrolytischen Verfahren

den Vorteil alternativer Reaktionsbedingungen. Da in der Lipasen-katalysierten

Hydrolyse bevorzugt (−)-14 gebildet wurde, wird in der Umkehrrektion, der Enzym-

katalysierte Transacylierung von rac-14 im organischen Medium, ebenfalls (−)-14

bevorzugt acyliert und es kann wie in der PLE-katalysierten Hydrolyse das

gewünschte (+)-Enantiomer des Alkohols als Produkt isoliert werden (Abb. 2.68).

OH

Me2N

OMe

+

Lipase

Me2N

OMe

OHOMe

Me2N

Vinylester

Lösungsmittelorganisches

RTOH

HO

OR

O

HO

Abb. 2.68: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14.

Zunächst wurde die Candida rugosa Lipase als Katalysator in die Transacylierung

des Alkohols rac-14 eingesetzt. Als Acyldonoren wurden Vinylacetat und

Isopropenylacetat in Toluol und Acyldonor als Lösungsmittel verwendet. Die

Ergebnisse dieser Reaktionen sind in Tabelle 2.57 zusammengefaßt. Wie schon

zuvor in der CRL-katalysierten Hydrolyse der korrespondierenden Ester rac-22 und

rac-18 zu beobachten war, ist die Aktivität der CRL hinsichtlich des Alkohols rac-12

(+)-14

rac-14

(−)-Ester

Page 159: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 145

höher als hinsichtlich des Alkohols rac-14. Die in den CRL-katalysierten

Transacylierungen des Alkohols rac-14 beobachteten Reaktionsgeschwindigkeiten

sind gering, ebenso die beobachteten Selektivitäten. Die CRL empfiehlt sich daher

eher als Katalysator für die Substrate 12 und 18. Interessanterweise wird in CRL-

katalysierten Acylierung mit Isopropenylacetat in Toluol der höchste Umsatz bei

höchster Selektivität erzielt. Dies Ergebnis unterstützt die These, daß während der

Reaktion gebildetes Acetaldehyd das Enzym deaktiviert. In einem solchen Fall bietet

sich die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel an.

Tabelle 2.57: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylacetat und Isopropenylacetat (37 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

nach

16 d E-Wert

Umsatz 18 %

ee Ester (−)-24 44 % Vinylacetat (6),

Toluol ee Alkohol (+)-14 72 %

5

Umsatz 11 %

ee Ester (−)-24 47 % Vinylacetat

als Solvens ee Alkohol (+)-14 48 %

4

Umsatz 25 %

ee Ester (−)-24 68 % Isopropenylacetat (6),

Toluol ee Alkohol (+)-14 87 %

14

Umsatz 12 %

ee Ester (−)-24 77 % Isopropenylacetat

als Solvens ee Alkohol (+)-14 35 %

10

Eine in der jüngeren Literatur häufig mit großem Erfolg zur Acylierung sekundärer

Alkohole verwendete Enzympräparation ist das Novozym 435, welches eine auf

einem makroporösen Acrylharz immobilisierte Candida antarctica Lipase Typ B ist.126

Daraufhin wurde das Novozym 435 in die Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylacetat in den Lösungsmitteln Toluol und Dichlormethan eingesetzt (Tabelle

Page 160: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

146 THEORETISCHER TEIL

2.58). Die Aktivität dieses Enzyms hinsichtlich des Substrats rac-14 ist verglichen mit

den zuvor durchgeführten enzymatischen Transacylierung außerordentlich hoch.

Bereits nach 48 Stunden werden Umsätze von 70 % bzw. 79 % erreicht. Die

Selektivität in beiden Reaktionen ist auch sehr hoch. In dem polaren Lösungsmittel

Dichlormethan wird ein E-Wert von 99 erzielt.

Tabelle 2.58: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

nach

48 h E-Wert

Umsatz 70 %

ee Ester (−)-24 90 % Vinylacetat (6),

Toluol ee Alkohol (+)-14 67 %

38

Umsatz 79 %

ee Ester (−)-24 90 % Vinylacetat (6),

Dichlormethan

ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

99

Auf Basis dieser guten Ergebnisse, wurde daraufhin Vinylpropionat als

Acylierungsmittel in die Novozym 435-katalysierte Transacylierung eingesetzt. Um

den Einfluß des Lösungsmittels auf das Ergebnis der Transacylierung zu

untersuchen, wurden als Lösungsmittel Toluol, Toluol mit einem Zusatz von 0.2 %

Wasser, Dichlormethan und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.59). Von JUNGEN

ist zuvor in der Katalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchste

Reaktionsgeschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet

worden.85 Diesem Ergebnis zufolge wurde die Verwendung des Zusatzes an Wasser

zum Lösungsmittel in der CAL-B Katalyse untersucht. Alle Reaktionslösungen waren

zu Beginn der Reaktion klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten alle Reaktionen

eine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz war zusätzlich noch ein

weißer Niederschlag zu erkennen. Nach 24 Stunden wurden alle Reaktionen bei

einem Umsatz von 50 % abgebrochen. In Toluol als Lösungsmittel wurde eine hohe

Selektivität von E = 90 beobachtet. Verglichen mit dem Acylierungsmittel Vinylacetat

ist hier eine Steigerung in der Selektivität der Novozym 435-katalysierten Acylierung

erreicht worden. Ein Zusatz von 0.2 % Wasser zum Lösungsmittel Toluol führt

Page 161: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 147

sowohl zu einer Erniedrigung der Aktivität des Enzyms hinsichtlich des Substrats

rac-14 als auch zu einer Erniedrigung der Selektivität der Reaktion. Von RUPPERT84

und JUNGEN85 wurde zuvor eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und der

Selektivität der PLE-katalysierten Transacylierung geschildert. Dieses konnte nicht

auf die CAL-B katalysierte Transacylierung übertragen werden. Ein anzunehmender

Grund hierfür ist eine aufgrund der hohen Aktivität des Enzym verstärkte Hydrolyse

des Acyldonors als Nebenreaktion. Diese „Nebenaktivität“ des Enzyms führt zu dem

scheinbar geringeren Umsatz hinsichtlich des umgesetzten Substrats rac-14.

Tabelle 2.59: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylpropionat (10 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

nach

24 h E-Wert

Umsatz 51 %

ee Ester (−)-45 92 % Vinylpropionat (5),

Toluol ee Alkohol (+)-14 95 %

89

Umsatz 35 %

ee Ester (−)-45 89 % Vinylpropionat (5),

Toluol mit Zusatz von H2O (0.2 %) ee Alkohol (+)-14 56 %

30

Umsatz 50 %

ee Ester (−)-45 98 % Vinylpropionat (5),

Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 86 %

>200

Umsatz 52 %

ee Ester (−)-45 97 % Vinylpropionat

als Solvens ee Alkohol (+)-14 88 %

192

In den Lösungsmitteln Dichlormethan und Acylierungsmittel werden außerordentlich

hohe Selektivitäten in der enzymatischen Acylierung von rac-14 erzielt. In dem

Lösungsmittel Dichlormethan werden mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel höhere

Selektivitäten als mit Vinylacetat erzielt, dies wurde zuvor auch in Toluol beobachtet.

Page 162: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

148 THEORETISCHER TEIL

In der Reaktion des achiralen Acylierungsreagenzes mit dem Enzym wird der

Acyl/Enzym-Komplex gebildet. Da sich im diesem Komplex die Acylgruppe direkt im

aktiven Zentrum befindet, beeinflußt die Struktur des Carbonsäureteils des

Enolesters die Steuerung der Enantiomeren-Diskriminierung beim Angriff des

chiralen Nucleophils (Abb. 2.69).237 Untersuchungen zum Einfluß der Kettenlänge

von Enolestern auf das Ergebnis von Transacylierungen lassen den Schluß zu, daß

die optimale Kettenlänge sowohl vom verwendeten Enzym als auch von der Struktur

des Substratalkohols abhängt. Dies macht eine individuelle Optimierung der

enzymatischen Transacylierung für jedes Substrat notwendig.

Abb. 2.69: Einfluß des Acyldonors auf die Steuerung der Enantiomeren-

Diskriminierung eines Enzyms.237a)

Insgesamt stellt die Novozym 435 katalysierte Transacylierung von rac-14 eine

interessante Alternative zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 dar. Aktivität und

Selektivität des Enzyms sind hervorragend. Um das vorhandene Potential dieses

Katalysators zu erschließen, wurde die Katalysatormenge halbiert und der Einfluß

auf die Transacylierung in den Lösungsmitteln Toluol und Vinylpropionat untersucht

(Tabelle 2.60). Zusätzlich wurde in einer weiteren Reaktion ein Zusatz von

Triethylamin zum Lösungsmittel Toluol gemacht. Interessanterweise zeigten alle

Reaktion, mit Ausnahme der Reaktion unter Zusatz von Triethylamin, nach ca.

48 Stunden eine milchige Trübung. Wie aus Tabelle 2.60 hervorgeht, erreichen alle

drei Reaktionen nach 7.6 Stunden einen Umsatz von ca. 50 % und bleiben nahezu

bei diesem Umsatz bis zum Reaktionsende nach 47.75 Stunden stehen. Da die

Reaktionsgeschwindigkeit des langsamer reagierenden Enantiomers im Vergleich zu

dem des schneller reagierenden vernachlässigbar gering ist, spricht dies für eine

hohe Enantiomeren-Diskriminierung des Enzyms. Entsprechend sind die E-Werte

aller drei Reaktionen auch hoch (Tabelle 2.61).

Page 163: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 149

Tabelle 2.60: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) 7.6 h 23.3 h 47.75 h

Umsatz 51 % 53 % 53 %

ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 % Vinylpropionat (5),

Toluol ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % ≥98 %

Umsatz 50 % 53 % 52 %

ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 % Vinylpropionat

als Solvens ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 %

Umsatz 54 % 55 % 56 %

ee Ester (−)-45 92 % 93 % 91 % Vinylpropionat (5),

Triethylamin (0.25),

Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 %

Der erzielte E-Wert im Lösungsmittel mit nur 5 mg Katalysator entspricht dem der mit

10 mg erhalten wurde. Somit ist hier eine Reduzierung der Katalysatormenge

problemlos möglich. In Vinylpropionat als Solvens ist der erzielte E-Wert zwar ein

wenig geringer als mit der doppelten Katalysatormenge, aber noch in der zuvor

erzielten Größenordnung, so daß hier eine Reduzierung der Enzymmenge noch

vertretbar ist.

Page 164: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

150 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.61: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des

Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) 7.6 h 23.3 h 47.75 h Mittel

Vinylpropionat (5),

Toluol 49 97 111 84

Vinylpropionat

als Solvens 81 144 125 119

Vinylpropionat (5),

Triethylamin (0.25), Toluol 125 144 111 131

Interessanterweise wird im Lösungsmittel Toluol unter Zusatz von Triethylamin eine

höhere Selektivität als in reinem Toluol erzielt. Durch einen Zusatz von Triethylamin

kann eine Steigerung der Selektivität erreicht werden. Diese Beobachtung ist auch

bereits von verschiedenen Autoren publiziert worden.218a),213 Das Triethylamin dient

im organischen Medium zur Pufferung der als Nebenprodukt entstandenen

Carbonsäure. In Abb. 2.43 auf Seite 102 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörige

Reaktionsschema wiedergegeben. Die Carbonsäure entsteht durch die Neben-

reaktion des Acyl/Enzym-Komplexes mit in Spuren im Reaktionsmedium vor-

handenem Wasser und führt so zu einer Hydrolyse des Acylierungsreagenzes. In

Abwesenheit des Triethylamins als Base kann die gebildete Carbonsäure an der

Enzym-Oberfläche gebunden werden und kann durch ionische Wechselwirkungen

die elektrostatische Umgebung beeinflussen, wodurch wiederum kleine

Konformationsänderungen im Protein möglich sind, welche die Aktivität und

Selektivität des Enzyms verändern.218a)

In der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 wurde ein günstiger

Einfluß des Acyldonors Isopropenylacetat auf die Enzymkatalyse beobachtet, da

während der Reaktion kein Acetaldehyd freigesetzt wird. In der Novozym 435-

katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat wird

ebenfalls nach 24 Stunden ein Umsatz von ca. 50 % beobachtet (Tabelle 2.62).

Erreicht wurde dieser Umsatz, wie nach Tabelle 2.60 anzunehmen ist, schon nach

8 Stunden. Die mit diesem Acylierungsreagenz in dem Lösungsmittel Toluol erzielte

Page 165: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 151

Selektivität ist höher als die, die mit Vinylacetat und Vinylpropionat in Toluol

beobachtet wurde. Es empfiehlt sich auch in der Novozym 435-katalysierten

Transacylierung die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel.

Tabelle 2.62: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit

Isopropenylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.)

Nach

24 h E-Wert

Umsatz 51 %

ee Ester (−)-24 94 % Isopropenylacetat (5),

Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

170

Es wurde der Versuch durchgeführt eine PLE-katalysierte Transacylierung des

Alkohols rac-14 zu erreichen. Nach den Ergebnissen in der PLE/MPEG- und

PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 ist allerdings

kein Erfolg zu erwarten, zumal die PLE wie die CRL rac-18 in der Hydrolyse als

Substrat gegenüber rac-22 bevorzugt. So konnte in der PLE/MPEG-katalysierten

Transacylierung des Alkohols rac-14 auch kein nennenswerter Umsatz unter

verschiedenen Reaktionsbedingungen beobachtet werden (Tabelle 2.63).

Tabelle 2.63: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-14 (6.4 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

Vinylpropionat (5),

Toluol 20 d 2 %

Isopropenylacetat (5),

Toluol 20 d 0 %

Für eine Acylierung von rac-14 wurde auch das Colyophilisat aus PLE, BSA und

MPEG (PLE/BSA/MPEG) eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine hohe

Aktivität im organischen Medium zeigt.83 In der PLE/BSA/MPEG-katalysierten

Page 166: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

152 THEORETISCHER TEIL

Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat in Toluol wurde eine stark

erhöhte Katalysatorkonzentration verwendet (Tabelle 2.64). Die Farbe des PLE/BSA-

Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-

braun. Dies belegt die enzymatische Hydrolyse des Acylierungsmittels zu Carbonyl-

Nebenprodukten wie Essigsäure. Eine enzymatische Acylierung des Substrates

rac-14 war allerdings auch mit dieser stark erhöhten Katalysatormenge nicht

möglich.

Tabelle 2.64: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-14 (2000 U/ml)

Reaktionsbedingungen

(Äquiv.) Reaktionszeit Umsatz

Vinylacetat (5),

Toluol 11 d 0 %

In der PLE-katalysierten Hydrolyse des korrespondierenden Esters rac-23 wurde

eine isoenzymangereicherte Fraktion der Schweineleber-Esterase (Chirazyme E1)

mit großem Erfolg eingesetzt. Dies Enzympräparation führte zu einer Erhöhung der

Aktivität und Selektivität im Vergleich zu der kompletten Isoenzymmischung (PLE).

Daraufhin wurde rac-14 auch in die Chirazyme E1-katalysierte Transacylierung mit

Vinylpropionat in Toluol eingesetzt (Tabelle 2.65). Nach 48 Stunden konnte ein

minimaler Umsatz beobachtet werden, der allerdings hochselektiv verlief.

Tabelle 2.65: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-14 (33 U/ml; 5 Äquiv. Vinylpropionat in Toluol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E

47.75 h 2 % ≥98 % 3 % -

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß die Enzym-katalysierte

Transacylierung des Alkohols rac-14 eine effiziente Methode zur Darstellung der

einzelnen Enantiomere darstellt. In Novozym 435 katalysierten Reaktionen wird in

Page 167: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 153

der Regel eine hohe Aktivität des Enzyms CAL-B beobachtet, so daß die

Reaktionszeiten denen der Hydrolyse im wäßrigen Milieu entsprechen. Die mit dieser

Enzympräparation erzielten Selektivitäten sind sehr hoch. Somit ist die enzymatische

Transacylierung durchaus geeignet, die Bereitstellung enantiomerenreiner

Verbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate,

die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym-

katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen.

So konnte beispielsweise die GRÜNENTHAL GmbH eine kinetische Racematspaltung

eines neuen Tramadol-Analogons (rac-52 in Abb. 2.70) aufbauend auf den im

Rahmen dieser Arbeit erreichten Ergebnissen erzielen. Das in Abb. 2.70 dargestellte

Naphtyl-Derivat zu rac-14 ist im wäßrigen Milieu in Form eines Buttersäureesters

unlöslich und es konnte keine PLE-katalysierte Hydrolyse beobachtet werden. Im

organischen Medium konnte allerdings unter den vorgestellten

Reaktionsbedingungen eine effiziente CAL-B-katalysierte Racematspaltung zur

Darstellung des gewünschten (+)-Enantiomers erreicht werden.184

OH

Me2N

CAL-B

Vinylester

Lösungsmittelorganisches

RT

HOOMe

OH

Me2NHO

OMe

+

OHMe2N

OR

O

OMe

Abb. 2.70: Durch die GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte CAL-B-katalysierte Trans-

acylierung von rac-52, eines Naphtyl-Derivats zu rac-14.

(+)-52

rac-52

(−)-Ester

Page 168: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

154 THEORETISCHER TEIL

2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen

Tertiäre Alkohole und deren Ester sind wahrscheinlich aufgrund von sterischen

Hinderungen im allgemeinen keine Substrate für Hydrolasen-katalysierte

Racematspaltungen. Bis heute sind nur einige wenige Beispiele für Hydrolasen-

katalysierte Umsetzungen dieser Substrate bekannt.134,238,239,240

O´HAGEN et al. konnten 1992 zeigen, daß aktivierte Ester tertiärer Alkohole, die eine

Acetylengruppe am stereogenen Zentrum enthalten, von der Candida rugosa Lipase

akzeptiert und mit mittleren Selektivitäten hydrolysiert werden. Erklärt wurde dies

dadurch, daß die Acetylengruppe in der Lage ist die Bindungsstelle des

Wasserstoffs, im Falle von sekundären Alkoholen, zu belegen.238 Daß die

Schweineleber-Esterase ebenfalls Ester tertiärer Alkohole, die eine Acetylengruppe

am stereogenen Zentrum tragen, mit hoher Selektivität hydrolysiert, zeigten COOPE et

al. am Beispiel eines tertiären Buttersäureesters des Quinuclidinols unter Zusatz von

Methanol als Cosolvens.134 KONIGSBERGER et al. erweiterten diese Substratgruppe

um aktivierte Ester von Trifluormetlyl-substituierten Cyanhydrinen, die mit sehr guten

Selektivitäten von der CRL umgesetzt wurden.239

Um die vom Enzym anzugreifende Estergruppe möglichst nah an den

Chiralitätszentren zu lokalisieren und so eine möglichst große Enantiomer-

Differenzierung des Enzyms zu erhalten, wurde in eigenen Vorarbeiten Ester rac-43

unter Einbezug der tertiären Hydroxylgruppe synthetisiert. Der Ester rac-43 wurde

anschließend zwei PLE-katalysierten Hydrolysen mit tert-Butanol und Methanol als

Cosolvens unterworfen, die aber nur jeweils 3 % Hydrolyseprodukt nach 100 h bzw.

26 h ergaben (Abb. 2.71).80

Page 169: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 155

O

Me2N

OMe

O

Pr

OH

Me2N

OMe

O

Me2N

OMe

O

Pr

+

PLE

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung (pH 8.0)

RT

7

Abb. 2.71: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-43.

Diese Ergebnisse legen nahe, daß Ester der tertiären Hydroxylgruppe vom Tramadol

keine Substrate für das Enzym PLE sind, da sie sterisch sehr anspruchsvoll und

elektronisch nicht aktiviert sind.

2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-

Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-

phenyl)-cyclohexylester (rac-25)

In Vorversuchen zur Darstellung des (±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-

3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) zeigte sich, daß die

Reaktivität der tertiären Hydroxylgruppe ausgesprochen hoch ist. Eine Veresterung

der tertiären Hydroxylgruppe gelang durch Reaktion von Buttersäureanhydrid mit

Pyridin in Dichlormethan bei Raumtemperatur in quantitativer Ausbeute. Da unter

diesen Reaktionsbedingungen auch die sekundäre Hydroxylgruppe acyliert wird,

kann nach Aufarbeitung der Diester rac-25 erhalten werden. Aufgrund des einfachen

Zugangs zu dieser Verbindung, wurde untersucht, ob sie gegebenenfalls ein Substrat

für eine enzymatische Hydrolyse darstellt. Da sich anhand des Esters rac-19 gezeigt

hatte, daß keine enzymatische Hydrolyse der sekundären Estergruppe möglich ist,

bietet der Diester rac-25 die Möglichkeit einer enzymatischen Hydrolyse der tertiären

Estergruppe (Abb. 2.72).

rac-43

43

Page 170: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

156 THEORETISCHER TEIL

O

Me2N

OMe

OH

Me2N

OMe

+

Enzym

Phosphatpuffer-

10 % CosolvensLösung

RT

O

O

Pr

O

Pr

O

Me2N

OMeO

O

Pr

O

Pr

O

O

Pr

Abb. 2.72: Versuch zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-25.

Der Diester rac-25 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse im wäßrigen

Einphasensystem eingesetzt. Als Enzym wurden die CE und die CRL unter

Verwendung von 10 % tert-Butanol als Cosolvens und die PLE unter Verwendung

von 16 % Aceton eingesetzt (Tabelle 2.66). Die Enzyme CE und CRL wurden

aufgrund ihrer großen hydrophoben Taschen im aktiven Zentrum ausgewählt, die

PLE wegen der von COOPE et al. erzielten Ergebnisse in der Hydrolyse eines

tertiären Buttersäureesters.

Tabelle 2.66: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Enzym Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz

Cholesterolesterase (CE; 13.1 U/ml)

Phosphatpufferlösung,

pH 7.0; 10 % tert-Butanol 25 h 0 %

Candida rugosa Lipase (CRL; 9.3 U/ml)

Phosphatpufferlösung,

pH 7.0; 10 % tert-Butanol 44 h 0 %

Schweineleber-Esterase (PLE; 4.9 U/ml)

Phosphatpufferlösung,

pH 7.0; 16 % Aceton 42 h 1 %

rac-25

25

19

Page 171: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 157

Wie aber in Tabelle 2.66 zu ersehen ist, konnte mit allen drei Enzymen, unter den

jeweiligen Bedingungen, keine Hydrolyse des Diesters rac-25 beobachtet werden. In

allen Reaktionen wurde die eingesetzte Menge Esters rac-25 nach Extraktion

nahezu vollständig zurückerhalten werden. Ein Ergebnis, das nach den Resultaten in

der Hydrolyse des Esters rac-43 und dem Kenntnisstand der Literatur erwartet

werden konnte.

Der Diester rac-25 ist somit aufgrund von sterischen Hinderungen keine Substrat für

eine Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung. Im Umkehrschluß bedeutet dies aber

auch, daß keine Enzym-katalysierte Acylierung der tertiären Hydroxylgruppe zu

erwarten ist. Daß die tertiäre Hydroxylgruppe in der Transacylierung nicht interferiert,

ist eine wichtige Voraussetzung dafür, daß die hydroxysubstituierten Tramadol-

Analoga direkt in Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt werden können.

Von FANG et al. ist, um der sterischen Hinderung von tertiären Alkoholen zu

begegnen und sie so einer Enzym-katalysierten Reaktion leichter zugänglich zu

machen, eine einfache Modifikation durchgeführt worden. Die tertiären Alkohole

wurden zunächst in die entsprechenden ß-Alkoxy Alkohole überführt und

anschließend deren primäre Alkoholfunktionalität von Lipasen mit zufriedenstellender

Aktivität und mäßiger Selektivität acyliert (Abb. 2.73).241 Diese Modifikation könnte

zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga eingesetzt werden, bei

denen nur eine tertiäre Hydroxylgruppe für eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion zur

Verfügung steht.

OH OOH O

O

O

BSL oderCRL oderPPL

33-78 % eeE = 2.5 - 9.4

Isopropenyl-acetatMTBE

Abb. 2.73: Enzymatische Racematspaltung von modifizierten tertiären Alkoholen.

Page 172: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

158 THEORETISCHER TEIL

2.5 Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden zur Enzym-katalysierten

kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga. Unter Nutzung dieser

Methoden sollten beide Enantiomere von neuen Molekülen auf Tramadol-Basis

dargestellt werden.

In Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von Tramadol (rac-7),

konnte, den Erwartungen entsprechend, gezeigt werden, daß Verbindungen mit

lediglich einer tertiären Hydroxylgruppe im allgemeinen keine Substrate für Enzym-

katalysierte Reaktionen sind. Dies ist Voraussetzung dafür, daß Tramadol-Analoga

mit weiteren reaktiven Hydroxylgruppen im Molekül direkt in Enzym-katalysierte

Racematspaltung eingesetzt werden können, ohne daß Nebenreaktionen an der

tertiären Hydroxylgruppe zu erwarten sind.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Enzym-katalysierten

Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe durch-

geführt. In dieser Gruppe von Substraten konnte am Beispiel des O-Desmethyl-

tramadols (rac-8) gezeigt werden, daß sich gute Ergebnisse in der Lipasen-

katalysierten Hydrolyse erzielen lassen, die dazu geeignet sind die Enantiomere

dieser Verbindung in einem präparativen Maßstab darzustellen. So konnte in der

CRL-katalysierte Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-15) im

wäßrig-organischen Zweiphasensystem das gebildete Phenol (−)-8 mit einem

ee-Wert von 90 % in 27 % Ausbeute isoliert werden (E = 34). Dies ist innerhalb der

durchgeführten Untersuchungen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racemat-

spaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe die höchste

erzielte Selektivität. Offenkettige, phenolische Tramadol-Analoga, wie das

untersuchte 3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11),

werden zwar als Substrate in der Enzym-katalysierten Hydrolyse akzeptiert, jedoch

sind die zu beobachtenden Selektivitäten so gering, daß keine geeignete Methode

zur Trennung der Enantiomeren gefunden werden konnte. Die zu geringe

Enantiomeren-Differenzierung tritt wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität

dieser Moleküle gegenüber den cyclischen Verbindungen auf.

Page 173: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ZUSAMMENFASSUNG 159

Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen zu Substraten auf

Tramadol-Basis mit phenolischer Hydroxylgruppe, daß die Enzym-katalysierte

Racematspaltung hier prinzipiell einen Zugang zu den einzelnen Enantiomeren dar

zu stellen vermag. Dies ist insbesondere beachtlich, da viele analgetisch aktive

Moleküle über eine aromatische Hydroxylgruppe verfügen, sonst aber über keine

funktionelle Gruppe, die für eine Racematspaltung genutzt werden könnte.

Als zweite Gruppe von Verbindungen wurden Tramadol-Analoga untersucht, die eine

zusätzliche sekundäre Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst tragen. Zu diesen

Verbindungen gehören aktuelle, analgetisch aktive Entwicklungskandidaten der

GRÜNENTHAL GmbH, wie z.B. das Hydrochlorid des enantiomerenreinen para-

Fluorbenzylethers (+)-50.

In Untersuchungen zu dem Cyclohexanol-Tramadol-Analogon (1RS,3SR,6RS)-

6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) konnte

gezeigt werden, daß dieses Substrat sowohl in der Hydrolyse als auch in der

Transacylierung mit sehr hohen Selektivitäten in Enzym-katalysierten kinetischen

Racematspaltungen umgesetzt werden kann. So konnte anhand der Enzym-

katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-18) eine äußerst

effiziente kinetische Racematspaltung demonstriert werden. Die CRL-katalysierte

kinetische Racematspaltung dieses Esters verläuft mit einer nahezu perfekten

Selektivität (E > 200) und mittels extraktiver Aufarbeitung können der Alkohol (−)-12

und der nicht umgesetzte Ester (+)-18 in sehr hohen Ausbeuten erhalten werden.

OHOMe

Me2N

CRLOPr

OPLE

OH

Me2N

OMeOPr

OOHOMe

Me2N

OPr

O

+ +

OHOMe

Me2N

HO

OH

Me2N

OMeHO

Abb. 2.74: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-18 zur Darstellung beider

Enantiomere.

(−)-12

rac-18

(+)-12

(−)-18 (+)-18

Page 174: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

160 THEORETISCHER TEIL

Einen einfachen Zugang zu dem enantiomeren Alkohol (+)-12 ermöglicht die PLE-

katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (E = 89). Da das Enzym PLE eine zur CRL

entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt, wird der Alkohol (+)-12 erhalten werden

(Abb. 2.74). Somit ermöglicht eine geeignete Wahl des Enzym die Darstellung beider

enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten.

Auch in der alternativen enzymatischen Reaktionsführung im organischen Medium,

der Lipasen-katalysierten Acylierung, verläuft die CRL-katalysierten Transacylierung

des Alkohols rac-12 mit überaus hoher Selektivität (E = 120). Die erzielten

Ergebnisse zeigen, daß die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen

Medium des Alkohols rac-12 eine interessante Alternative, auch in einem präparative

Maßstab, zur Hydrolyse im wäßrigen Medium darzustellen in der Lage ist.

OHOMe

Me2N

OH

Me2N

CRL

OH

Me2N

PLEOPr

O

OPr

O

CE

HO

OHOMe

Me2N

HO

OHOMe

Me2N

OPr

O

OMe

OMe

++

Abb. 2.75: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-22 zur Darstellung beider

Enantiomere.

Auch im Fall der zum rac-12 epimeren Verbindung (1RS,2RS,4SR)-2-Dimethyl-

aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) konnte gezeigt

werden, daß dieses Cyclohexanol-Tramadol-Analoga hochselektiven enzymatischen

Racematspaltungen zugänglich ist. Es konnte demonstriert werden, daß wie im Falle

der Verbindung rac-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse (Chirazyme E1, E = 85) mit

einer zur CRL (E = 34) und CE (E = 89) entgegengesetzten Enantiopräferenz verläuft

(Abb. 2.75). Die gezielte Darstellung beider Enantiomere durch eine geeignete Wahl

des Enzym ist ebenfalls bei diesem Substrat möglich.

In der enzymatischen Transacylierung des Alkohols rac-14 konnte gezeigt werden,

daß mit einer immobilisierten CAL-B als Katalysator außerordentlich gute

Ergebnisse erzielt werden (E > 200). Die CAL-B zeigt in der Regel bei

rac-22

(−)-22 (+)-22

(+)-14 (−)-14

Page 175: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ZUSAMMENFASSUNG 161

ausgezeichneter Selektivität eine so hohe Aktivität, daß Reaktionszeiten im Bereich

von enzymatischen Hydrolysen erreicht werden. Somit ist die Enzym-katalysierte

Transacylierung von rac-14 dazu geeignet ist, die Bereitstellung enantiomerenreiner

Verbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate,

die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym-

katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen.

Insgesamt konnte gezeigt werden, daß sich mit Ausnahme des 1,3-diaxial

substituierten 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols

(rac-13) Cyclohexanol-Tramadol-Analoga nahezu ideal in der Enzym-katalysierten

Racematspaltung verhalten. Bei der Verbindung 13 sind wahrscheinlich sterische

Hinderungen des Moleküls für die nicht Reaktivität verantwortlich, die aber als

spezielle Ausnahme dieser Verbindung zu betrachten sind. Die Enzym-katalysierte

Hydrolyse von Cyclohexanol-Tramadol-Analoga stellt ein effizientes Verfahren zur

Synthese enantiomerenreiner Verbindungen dar. Bei diesem Verfahren konnte eine

einfache und effiziente Aufarbeitung durch Extraktion von Ester und Alkohol bei

verschiedenen pH-Werten etabliert werden. Es wurde aufgezeigt, daß beide

Enantiomere der gewünschten Verbindung je nach Wahl des geeigneten Enzyms

durch Enzym-katalysierte Racematspaltung dargestellt werden können.

Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen konnten verschiedene

Möglichkeiten zu der Optimierung Enzym-katalysierter Racematspaltungen von

Tramadol-Analoga aufgezeigt werden:

• Zur Steigerung der Substratkonzentration von Tramadol-Analoga im wässrigen

Medium ist es gelungen statt der freien Basen deren Hydrochloride, die eine

wesentlich höhere Löslichkeit haben, als Substrate einzusetzen.

• Durch die Wahl der Butyratgruppe als Acylrest kann in enzymatischen Hydrolysen

ein geeignetes Substrat geschaffen werden, welches sowohl von Lipasen als auch

Esterasen mit guter Selektivität umgesetzt wird.

• Anhand der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga konnte gezeigt

werden, daß bei in einem Wechsel vom wässrigen Einphasensystem zum wässrig-

organischen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium eine Steigerung der

Selektivität von Lipasen-katalysierten Reaktionen möglich ist.

Page 176: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

162 THEORETISCHER TEIL

• Als eine einfache, effiziente und ökonomische Methode zur Aufarbeitung von

enzymatischen Hydrolysen konnte die Extraktion von Ester und Alkohol bei

verschiedenen pH-Werten etabliert werden, wodurch auf aufwendige

chromatographische Trennverfahren verzichtet werden kann.

• In der Enzym-katalysierten Transacylierung konnte durch die Verwendung von

Isopropenylacetat als Acylierungsmittel, welches kein Acetaldehyd bildet, eine

Steigerung der Aktivität und Selektivität gegenüber konventionellen Vinylestern

beobachtet werden.

• Es konnte gezeigt werden, daß im besonderen die Enzyme PLE, CRL und CAL-B

zu einer kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga geeignet sind. Sie

zeigen eine hohe Aktivität und Selektivität. Zudem sind diese Enzyme gut

untersucht und über einen größeren Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität

kommerziell verfügbar.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß sich verschiedene

Tramadol-Analoga als gute Substrate für Enzym-katalysierte kinetische Racemat-

spaltungen eignen. Im allgemeinen können sowohl in der Hydrolyse als auch in der

Transacylierung gute Aktivitäten der Enzyme bei genügender Selektivität beobachtet

werden. Es konnte daher in dieser Arbeit gelingen, die Enzym-katalysierten

kinetischen Racematspaltungen als Methode zur Darstellung einzelner Enantiomere

von verschiedenartigen neuen Tramadol-Analoga in einem präparativen Maßstab zu

etablieren. Beachtenswert ist hierbei, daß die vom Enzym anzugreifende

Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereozentren der Verbindungen entfernt

lokalisiert ist.

Page 177: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

AUSBLICK 163

2.6 Ausblick

Aufbauend auf den zur Hydrolyse und Transacylierung von Tramadol-Analoga

entwickelten Verfahren und gesammelten Erfahrungen, sollten weitere synthetisch

wertvolle Substrate gesucht werden, die mit anderen Methoden nur schwer

enantiomerenrein zugänglich sind. Hier bieten sich biologisch aktive Moleküle an, die

neben einer aromatischen Hydroxylgruppe über keine weiteren funktionellen

Gruppen verfügen, die für eine Racematspaltung genutzt werden können.

Im besonderen bieten sich hier weitere Tramadol-Analoga an, die statt über eine

sekundäre Hydroxylgruppe über eine Aminogruppe im Cyclohexylring verfügen.

Hinweise auf eine analgetische Aktivität dieser Gruppe von Verbindungen sind

ebenfalls vorhanden (Abb. 2.76).184

OH

Me2NH2N

OMe

OH

Me2N

OMeH2N

Abb. 2.76: Neue interessante Tramadol-Analoga mit zusätzlicher Aminogruppe.

Aus Arbeiten von GOTOR et al. geht hierzu hervor, daß es allgemein möglich ist,

Amine als Substrate in CAL-B-katalysierten Transacylierungen hochselektiv zu

acylieren.242 Auch N-selektive Lipasen-katalysierte Acylierungen von cyclischen

Aminoalkoholen sind ebenfalls von GOTOR et al. beschrieben worden.243

Unter dem Gesichtspunkt der Etablierung eines präparativen Verfahrens zur Enzym-

katalysierten Transacylierung im organischen Medium, nicht nur von Tramadol-

Analoga, wäre die Entwicklung einer Methode zur Aufarbeitung der Reaktion, welche

auf chromatographische oder destillative Trennschritte verzichtet, von großem

Vorteil.

Page 178: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

3 Experimenteller Teil

Page 179: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 165

3.1 Allgemeine Vorbemerkungen

3.1.1 Eingesetzte Computerprogramme

Visualisierung von E-Werten

„Enantiomeric Ratio“ Copyright © 1994, 1995: K. Faber, H. Hönig, Technical

University of Graz.

Konvertierung in das Portable Document Format (PDF)

„Adobe Acrobat“ Copyright © 1987 - 1999: Adobe Systems Inc.

Chemische Strukturen

„ChemDraw“ Copyright © 1985 - 2000: CambridgeSoft, Cambridge.

3.1.2 Analytische Methoden und Geräte

Gaschromatographie (GC)

Umsatz- und Reinheitsbestimmungen wurden mit Kapillar-GC-Geräten von VARIAN

(Varian 3800 mit 2 Split/Splitness-Injektionssystem), CHROMPACK (CP 9000) und

CARLO ERBA (Mega 5360) durchgeführt. Die Peakdetektion erfolgte über einen

Flammenionisationsdetektor (FID) bei einer Detektionstemperatur von 330 ºC. Es

wurden folgende Bedingungen gewählt:

CP-Sil-8

Säulenspezifikation: 95 % Methylpolysiloxan, 5 % Phenylpolysiloxan

Säulenlänge: 30 m

Innerer Säulendurchmesser: 0.32 mm

Filmdicke: 0.25 µm

Trägergas und -druck: H2, 75 kPa (Varian 3800) bzw. 100 kPa (Mega 5360)

Page 180: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

166 EXPERIMENTELLER TEIL

Es wurden dabei folgende Standardprogramme bei einer Injektionstemperatur von

250 ºC verwendet:

S1 100 ºC (5 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.; 5 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.;

15 Min.)

S2 50 ºC (5 Min.) → 150 ºC (30 ºC/Min.; 2 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.;

2 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.; 15 Min.)

Die in der vorliegenden Arbeit angegebenen Werte wurden unter Annahme eines

Fehlerbereichs von 0.5 % auf ganze Zahlen gerundet. Abgeleitete Größen wurden

mit den Originaldaten berechnet.

Gaschromatographische Bestimmungen der Enantiomerenüberschüsse erfolgte

durch vorherige Trennung an folgenden chiralen stationären Phasen:

CP-Chirasil-Dex-CB (CHROMPACK)

Säulenspezifikation: Permethyl-β-Cyclodextrin

Säulenlänge: 25 m

Innendurchmesser: 0.25 mm

Filmdicke: 0.25 µm

Trägergas und -druck: H2, 100 kPa

Lipodex-γ-6-Me (MACHEREY-NAGEL)

Säulenspezifikation: 2,3-O-Dipentyl-6-O-methyl-γ-Cyclodextrin

Säulenlänge: 25 m

Innendurchmesser: 0.25 mm

Filmdicke: 0.15 µm

Trägergas und -druck: H2, 100 kPa

Page 181: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 167

Lipodex-E (MACHEREY-NAGEL)

Säulenspezifikation: Octakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-butyryl)-γ-

Cyclodextrin

Säulenlänge: 25 m

Innendurchmesser: 0.25 mm

Filmdicke: 0.15 µm

Trägergas und -druck: H2, 100 kPa

Massenspektroskopie (MS)

Gerät: Varian MAT 212 S, Erfassung mit Varian MAT SS 200. Falls nicht anders

vermerkt, wurde als Standardbedingung Elektronenionisation (EI, 70 eV) oder

chemische Ionisation (CI, Methan, 100 eV) verwendet. Die Angabe von Massen der

Fragmentionen (m/z) erfolgte als dimensionslose Zahl. Es wurden nur Signale mit

hoher Intensität oder besonders charakteristische Signale aufgeführt.

GC-MS-Analysen

Geräte: Gaschromatograph: Varian Modell 3700, Massenspektrometer: Varian MAT

112 S. Ionisation: 70 eV (EI) oder MeOH, 40 eV (CI).

Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Geräte zur analytischen HPLC: Millipore Waters 600E Systemcontroller; UV/VIS-

Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996 Photodiode Array Detektor; RI-

Detektion mit einem Waters 410 Differential Refraktometer; Waters 510 Pumpen;

RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm).

Geräte zur präparativen HPLC: Merck Novaprep 200; UV-Detektion (λ = 273 nm);

RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,

Filmdicke 10 µm) und eine VARIAN Anlage mit UV-Detektion (λ = 273 nm); RP-

Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,

Filmdicke 10 µm) oder RP-Select B-LiChrosor b® der Firma MERCK (Säulenlänge

250 mm, Innendurchmesser 25 mm, Filmdicke 7 µm).

Geräte zur analytischen HPLC an chiraler stationärer Phase: Millipore Waters 600 E

Systemcontroller; UV/VIS-Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996

Photodiode Array Detektor; Waters 510 Pumpen; Chiralcel OD-Vorsäule; Chiralcel

Page 182: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

168 EXPERIMENTELLER TEIL

OD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser

46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel) und Millipore Waters 600 E

Systemcontroller; UV-Detektion (λ = 273 und 254 nm) mit einem Waters Lamda-Max

481; Chiralcel OD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm,

Innendurchmesser 46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel).

NMR-Spektroskopie

Geräte: Varian VXR 300 (300 MHz, 75 MHz), Varian Gemini 300 (300 MHz,

75. MHz), Varian Inova 400 (400 MHz, 100 MHz), Varian Unity (500 MHz, 125. MHz).

Alle Spektren wurden bei 20 ºC aufgenommen. Als interner Standard diente

Tetramethylsilan (TMS). Chemische Verschiebungen δ wurden in ppm bezogen auf

TMS (δ = 0.00 ppm) und Kopplungskonstanten J in Hz angegeben. Die Aufspaltungs-

muster wurden generell nach erster Ordnung interpretiert, wobei folgende

Abkürzungen zur Beschreibung benutzt wurden: s = Singulett; d = Dublett; t =

Triplett; q = Quartett; m = Multiplett; dm = Multiplett eines Dubletts; tm = Multiplett

eines Tripletts; br = breit.

Die 13C-NMR-Spektren sind 1H-breitband-entkoppelt. Die Substitutionsmuster der 13C-NMR-Signale wurden den J-modulierten Spinecho-Spektren (APT) und mit u = C,

CH2 und d = CH, CH3 angegeben. Zur genauen Zuordnung wurden HETCOR-

Spektren gemessen.

FT-Infrarotspektroskopie (IR)

Gerät: Perkin-Elmer FTIR 1760 S.

Die Proben wurden als KBr-Presslinge (KBr) oder als kapillare Filme (kapillar)

präpariert. Die Spektren wurden im Bereich von 4000 – 700 cm-1 aufgenommen. Die

Lage der Absorptionsbanden (∼ν) wurde in cm-1 angegeben; bei der Charakterisierung

wurden nur Banden mit Intensität >40 % aufgelistet, wobei die Abkürzungen s (stark,

Absorption >80 %), m (mittelstark, Absorption 60 – 80 %) und w (schwach,

Absorption 40 – 60 %) verwendet wurden.

Elementaranalyse

Gerät: Heraeus CHNO-Rapid. Eine Substanzprobe wurde für ∆C,H,N <0.4 % als

authentisch betrachtet.

Page 183: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 169

Polarimetrie

Gerät: Perkin-Elmer-Polarimeter PE 241. Die Messung der Drehwerte erfolgte bei

20 ºC in einer Mikroküvette (Länge 10 cm) mit der Natriumdoppellinie (λ = 589.0 und

589.6 nm). Die Angabe der spezifischen Drehung D20][α erfolgte in (grd⋅dm3)/(dm⋅g),

die Angabe der Konzentration c in (g/dm3).

Autotitrator

Gerät: STAT-Titrino 718 der Firma METROHM. Das Gerät wurde im pH-STAT Modus

mit NaOH-Maßlösungen (1 N und 0.1 N) der Firma MERCK betrieben.

Ultrafiltration

Gerät: Ultrafiltrationszelle Amicon Modell 2800 mit einer Membran PM 30

(Ausschlußgrenze: >30 kDa) von MILLIPORE.

Gefriertrocknung

Gerät: Christ Alpha 2-4.

Schmelzpunkte

Gerät: Büchi-Schmelzpunktapparatur SMP-20.

Die Schmelzpunkte wurden unkorrigiert angegeben.

Siedepunkte

Die Siedepunkte wurden unkorrigiert angegeben.

Dünnschichtchromatographie

Es wurden DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der Firma MERCK mit einer Schichtdicke

von 0.25 mm verwendet. Die Detektion erfolgte durch UV-Fluoreszenzlöschung bei

λ = 254 nm sowie durch Anfärben mit einer Lösung aus Eisessig / dest. H2O / konz.

H2SO4 / p-Anisaldehyd (in einem Volumenverhältnis von 75 : 2 : 1.5 : 1) und an-

schließendem Erhitzen.

Präparative Säulenchromatographie

Es wurde Kieselgel 60, 0.062 - 0.100 mm, der Firma MERCK verwendet.

Page 184: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

170 EXPERIMENTELLER TEIL

3.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien

Die verwendeten Lösungsmittel wurden mit den laborüblichen Methoden getrocknet

und absolutiert. Die Reagenzien wurden, wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt, in

handelsüblicher Qualität ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Diisobutyl-

aluminiumhydrid wurde von der SCHERING AG zur Verfügung gestellt, der ich an

dieser Stelle ebenfalls für die Unterstützung dieser Arbeit danken möchte.

Methanol

Die Trocknung erfolgte, indem Methanol mit Magnesium-Spänen zur Reaktion

gebracht und anschließend destilliert wurde.

Diisopropylether

Die Entfernung von Peroxiden aus Diisopropylether sowie dessen Vortrocknung

wurde durch Säulenfiltration über basischem Aluminiumoxid erreicht. Dies erfolgte

vor jedem Gebrauch, zusätzlich wurde vor jedem Gebrauch und insbesondere vor

jedem Einengen mit essigsaurer Kaliumiodidlösung auf Peroxide getestet.e

Transacylierungsreagenzien

Essigsäure-vinylester (Vinylacetat), Essigsäure-isopropenylester (Isopropenylacetat)

und Propionsäure-vinylester (Vinylpropionat) wurden über NaCO3 destilliert, um

Spuren von Säure zu entfernen, bevor sie in die Enzym-katalysierte Transacylierung

eingesetzt wurden.

3.1.4 Verwendete Proteine

Pferdeleber-Esterase (HLE, EC 3.1.1.1)

SIGMA; Aktivität: 0.74 U/mg Lyophilisat (Buttersäureethylester, pH 8.0, 25 ºC).

Schweineleber-Esterase (PLE, EC 3.1.1.1)

a) BOEHRINGER MANNHEIM; 30 mg Enzym in 3 ml 3 M (NH4)2SO4, pH 6.

Aktivität >120 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).

e Autorenkollektiv, Organikum, 17. Aufl., VEB-Verlag Berlin 1988.

Page 185: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 171

b) ROCHE DIAGNOSTICS; 306 mg Enzym in 30.6 ml3 M (NH4)2SO4, pH 6.

Aktivität 130 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).

c) ROCHE DIAGNOSTICS; Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE, Fraktion 1).

Aktivität: 33.0 U/m g Lyophilisat (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).

Burkholderia cepacia Lipase (BCL, EC 3.1.1.3)

wurde bezogen als Pseudomonas cepacia Lipase (PCL):

a) FLUKA; Aktivität: 40 U/mg (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC).

b) SIGMA; Aktivität: 0.09 U/mg (Glycerin-triester, pH 7.0; 37 ºC).

Candida antarctica Lipase (CAL-B, EC 3.1.1.3)

a) BOERINGER MANNHEIM; Chirazyme L-2 (lyophilisierte CAL, Typ B, CAL-B).

Aktivität: 1.0 MU/6.452 g Lyophilisat (100 mM Glycerin-tributyrat, pH 7.0, 25 ºC).

b) NOVO NORDISK; Novozym 435 (immobilisierte CAL, Typ B, CAL-B).

Aktivität: ca. 7 U/mg (Veresterung 1-Propanol mit n-Dodecansäure, 60 ºC)

Diese Lipase wurde mittels rekombinater DNA-Technik in dem Wirt-Organismus

Aspergillus oryzae produziert und anschließend auf einem makroporösen

Acrylharz immobilisiert.126 Novozym 435 wurde freundlicherweise von NOVO

NORDISK zur Verfügung gestellt.

c) FLUKA; Aktivität: 3.2 U/mg (CAL) Lyophilisat; bezogen als Bestandteil eines

Lipasen-Screening Grundkits.

Candida rugosa Lipase (CRL, EC 3.1.1.3)

wurde bezogen als Candida cylindracea Lipase (CCL):

FLUKA; Aktivität: 37 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC).

FLUKA; Aktivität: 25.9 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC).

FLUKA; Aktivität: 2.4 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC); bezogen

als Bestandteil eines Lipasen-Screening Grundkits.

Cholesterolesterase (CE, EC 3.1.1.13)

BOERINGER MANNHEIM; aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea).

Aktivität: 52 KU/2.96 g Lyophilisat (Cholesterol oleate, 25 ºC).

Chromobacterium viscosum Lipase (CVL, EC 3.1.1.3)

SIGMA; Aktivität: 3.58 U/mg Lyophilisat (Olivenöl, pH 7.7; 37 ºC).

Porcine pancreatic Lipase (PPL, EC 3.1.1.3)

wurde bezogen als Lipase aus hog pancreas:

FLUKA; Aktivität: 16.8 U/mg (Olivenöl, pH 8.0; 37 ºC).

Page 186: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

172 EXPERIMENTELLER TEIL

Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7)

SIGMA; Typ V-S aus Electrophorus electricus (electric eel);

Aktivität: 970 U/mg (Acetylchlolin, pH 8, 37 ºC).

Aus einem Lipasen-Screening Grundkit (FLUKA) wurden eingesetzt:

- Rhizomucor miehei bezogen als Mucor miehei Lipase (EC 3.1.1.3; 1.3 U/mg)

- Rhizopus arrhizus Lipase (EC 3.1.1.3; 2 U/g)

- Rhizopus niveus Lipase (EC 3.1.1.3; 2.6 U/g)

- Aspergillus niger Lipase (EC 3.1.1.3; 1 U/mg)

Das Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (1.5 % Proteingehalt) wurde

freundlicherweise von Herrn Dr. V. Jadhav zur Verfügung gestellt. Dieser Katalysator

wurde wie in Kap. 3.2.1 auf S. 174 beschrieben aus 6 ml (60 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 180 U/mg), 2 g MPEG5000 und 2 g BSA durch Gefriertrocknung

hergestellt.83 Die spezifische Aktivität dieses Colyophilisats betrug

2.22 U/mg Colyophilisat oder 148 U/mg PLE (Aktivitätsbestimmung nach Kap. 3.2.2,

S. 174).

Bei der Einordnung der Lipasen ergeben sich einige taxonomische Besonderheiten.

Mehrere Lipasen wurden nach Klonierung und Sequenzierung neu identifiziert und

klassifiziert. So wurde 1992 die Candida cylindracea Lipase neu zur Candida rugosa

Lipase, 1995 die Pseudomonas cepacia Lipase neu zur Burkholderia cepacia Lipase

und die Mucor miehei Lipase neu zur Rhizomucor miehei Lipase klassifiziert.6,101

Zudem ergab die Klonierung und Sequenzierung der Lipasen aus Rhizopus arrhizus

und Rhizopus niveus eine nahezu 100% Identität dieser Enzyme.101 Ein

unterschiedliches Substratspektrum dieser Enzyme ist somit nicht zu erwarten.

Um eine einheitliche Nomenklatur zu Verwenden, werden die Enzyme

dementsprechend in dieser Arbeit durchgehend nach ihrer aktuellen Klassifizierung

benannt und nicht ungedingt so, wie sie bezogen wurden.

Des weiteren werden in dieser Arbeit auch einige von Herstellern eingeführte

Eigennamen von Proteinen verwendet, um bestimmte Eigenschaften dieser

Enzympräparationen zu verdeutlichen. So wird im folgenden der Begriff

Chirazyme E1 statt PLE verwendet, um zu zeigen, daß es sich um lyophilisierte PLE

der Fraktion 1 handelt. Ebenso soll der verwendete Begriff Novozym 435

Page 187: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 173

verdeutlichen, daß es sich um eine immobilisierte Candida antarctica Lipase des

Typs B handelt.

Aktivitätsangaben verschiedener Proteine in dieser Arbeit beziehen sich auf die vom

Hersteller angegebenen Methode der Aktivitätsbestimmung. Aktivitätsbestimmungen

mit Tramadolderivaten als Substrat wurden nicht durchgeführt.

Alle Proteine wurden für nicht länger als 6 Monate bei 2 ºC gelagert.

3.1.5 Besondere Arbeitstechniken

Alle Reaktionen mit feuchtigkeits- oder luftempfindlichen Reagenzien wurden in

ausgeheizten Schlenkkolben unter Argon-Schutzgasatmosphäre mittels Spritzen-

technik durchgeführt.

Ester von Tramadol-Analoga sind im allgemeinen nicht im wäßrigen

Einphasensystemen löslich und neigen dazu an Glasflächen Kolloide zu bilden. Alle

Substrate der Enzym-katalysierten Hydrolysen wurden daher vorher in dem

jeweiligen Cosolvens gelöst und dann langsam zur Phosphatpuffer-Lösung gegeben.

Nach anfänglicher Trübung während der Zugabe entstanden klare, homogene

Lösungen. Aufgrund der Dimethylaminomethyl-Seitenkette reagieren alle

eingesetzten Substrate schwach basisch, so daß sich während der Zugabe des

Substrats zur Phosphatpuffer-Lösung der pH-Wert änderte. Es wurde daher vor

Zugabe des Enzyms der pH-Wert der Lösung mit verdünnter Salzsäure wieder auf

den gewünschten Wert eingestellt.

Enzym-katalysierte Transacylierungen wurden in unbehandelten Schnapp-

deckelgläschen durchgeführt, da diese durch ihre günstigen

Oberflächeneigenschaften nicht zu einem Festkleben des Enzyms an der

Glasoberfläche führten. Mit Wasser gesättigte Lösungsmittel wurden bei 20 ºC mit

dest. Wasser gesättigt. Proben zur Reaktionskontrolle wurden zur Trocknung und zur

Abtrennung von Proteinen über eine mit NaSO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette

filtriert.

Page 188: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

174 EXPERIMENTELLER TEIL

3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen

3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE84,85

3 ml PLE/(NH4)2SO4-Suspension (entspricht 30 mg natives Protein) wurden durch

Ultrafiltration unter Eiskühlung durch eine PM 30-Membran (Ausschlußgrenze:

>30 kDa) mit 1 L dest. Wasser unter 1.0 bar N2-Überdruck entsalzt. Der Rückstand

wurde mit ca. 250 ml dest. Wasser aufgenommen. Die leicht getrübte Suspension

wurde unter Rühren mit 1000 mg MPEG5000 versetzt, für 3 h gerührt, in flüssigem

Stickstoff gefroren und für 60 h bei Raumtemperatur im Hochvakuum (0.01 mbar,

RT) lyophilisiert. Das so gefriergetrocknete Colyophilisat aus MPEG/PLE (3 %

Proteingehalt) wurde als weißer, flockiger Feststoff mit einer Ausbeute von 100 %

erhalten.

3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE86

O

O

OH

O

OH+

PLERt, pH 8

Abb. 3.1: Enzymatische Verseifung von Buttersäureethylester.

90 ml Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 8.00) wurden mit 3 ml Buttersäureethylester

(22.7 mmol) versetzt und heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion entstand. Die

Mischung wurde auf pH 8.00 eingestellt. Nach Zugabe von ca. 1 mg Enzym

(entspricht 100 µl PLE/(NH4)2SO4-Suspension oder 34 mg MPEG/PLE; ca. 100 -

200 U) wurde der pH-Wert durch einen Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant

gehalten und der Verbrauch an NaOH-Lösung über 2 Stunden verfolgt. Anhand des

Verbrauchs an 1 N NaOH-Lösung ließ sich die Enzymaktivität bestimmen (Zur

Programmierung des Autotitrators siehe Kap. 3.7.1, S. 271). Hierzu wurde der

Verbrauch an NaOH-Lösung gegen die Zeit aufgetragen und der Verbrauch pro

Minute anhand von zwei Meßpunkten im linearen Bereich des Diagramms bestimmt.

Page 189: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG UND ANALYTIK DER MPEG/PLE PRÄPARATIONEN 175

Die Enzymaktivität ist definiert als:

Formel 3.1: 1 U = 1 µmol hydrolysierter Buttersäureethylester/(Min⋅mg Protein)

Die Proteinmenge wurde im Falle der MPEG/PLE direkt eingewogen, im Falle der

PLE/(NH4)2SO4-Suspension mit einer Eppendorf-Pipette (Genauigkeit: 100 µl

±0.8 %) abgemessen.

Tabelle 3.1: Standardaktivität verschiedener Enzympräparationen

Enzympräparation Standardaktivität

PLE/(NH4)2SO4-Suspension 120 – 180 U

Colyophilisat MPEG/PLE 110 – 150 U/mg PLE

Colyophilisat PLE/BSA/MPEG 148 U/mg PLE

Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE) 26 – 30 U

Page 190: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

176 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen

Racematspaltung

3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen

(AAV 1)91

Zur Freisetzung der Base aus ihrem Hydrochlorid wurde dieses in einer Emulsion

aus Wasser (0.5 ml/mmol) und Dichlormethan (0.4 ml/mmol) suspendiert. Unter

Rühren wurde langsam 40 %ige Natronlauge (0.13 bis 0.20 ml/mmol) zugetropft und

für ca. 30 Min. nachgerührt bis der gesamte Feststoff reagiert hatte. Nach

Phasentrennung wurde dreimal mit Dichlormethan (jeweils 1 ml/mmol)

nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat

getrocknet. Nach Einengen im Rotationsverdampfer wurde die freie Base in der

Regel als farbloses, Sirup ähnliches Öl erhalten, das vorsichtig im Hochvakuum von

Lösungsmittelresten befreit wurde. Alle freien Basen haben die Eigenschaft bei der

Entfernung von Lösungsmittelresten unter vermindertem Druck stark zu schäumen,

daher ist diese Operation mit besonderer Sorgfalt und gegebenenfalls unter gelindem

Erwärmen zur Erhöhung der Viskosität der Lösung durchzuführen.

3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester

von Phenolen244 (AAV 2)

Zu einer Mischung von 1.2 Äq. Säureanhydrid und 0.1 Äq. Pyridin in Dichlormethan

wurde unter Rühren das Phenol gegeben. Die Reaktionslösung wurde für 2 - 3 Tage

bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr

detektiert werden konnte, wurde die Reaktionsmischung über Nacht mit

ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um überschüssiges Säureanhydrid zu hydrolysieren.

Nach Phasentrennung wurde dreimal mit Diethylether (2 ml/mmol) nachextrahiert.

Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet, im

Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum von Lösungsmittelresten

befreit.

Page 191: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 177

3.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester

von Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3)

Das Hydrochlorid oder die freie Base des sekundären Alkohols wurde in abs.

Tetrahydrofuran oder Diethylether (3.15 ml/mmol) suspendiert. Anschließend wurden

bei der angegebenen Temperatur vorsichtig 2.5 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle des

Hydrochlorids oder 1.0 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle der freien Base zugegeben

(exotherme Reaktion, gegebenenfalls Kühlen). Es entstand in allen Fällen eine klare,

schwach gelbe bis dunkelgelbe Lösung. Danach wurde noch eine halbe Stunde

nachgerührt und anschließend unter Eiskühlung bei 5 ºC über einen Zeitraum von

10 Min. 1.0 - 1.5 Äq. Säurechlorid in Tetrahydrofuran oder Diethylether

(0.47 ml/mmol) zugetropft. Zur Vervollständigung der Reaktion wurde die Lösung

noch eine Stunde bei der angegeben Reaktionstemperatur gerührt und danach über

Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die hellgelbe Reaktionslösung mit

einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt, um

überschüssiges Säurechlorid zu hydrolysieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal

mit Dichlormethan (1.25 ml/mmol) nachextrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer

wurde der Ester als farbloses bis gelbliches, sirupöses Öl erhalten, das im

Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit wurde.

3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus

den racemischen Basen (AAV 4)

Die Base wird in einer Mischung aus trockenem Aceton (1.40 ml/mmol) und Ethanol

(0.28 ml/mmol) gelöst. Anschließend wird zur Vermeidung von Nebenreaktionen, wie

Eliminierungen, schonend durch Zugabe von 1 Äq. Wasser und 1 Äq.

Trimethylchlorsilan das Hydrochlorid ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum

getrocknet.

Page 192: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

178 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen

Transacylierung

3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-

phenyl)-cyclohexanol (rac-7)

Die Base rac-7 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

10 g (33.3 mmol) rac-7⋅HCl in 16 ml dest. Wasser und 12 ml Dichlormethan

suspendiert und mit 4.4 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung

wurden 8.70 g (33.0 mmol, 99 %) rac-7 als farbloser Sirup erhalten.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415

rac-7: MW = 263.4 g⋅mol-1 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.2 ppm (dd, 1 H, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H),

7.2 (s, 1 H, 10-H), 7.0 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 12-H), 6.8 (dm, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 3.8 (s,

3 H, 15-H), 2.4 (dd, 3J=4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 7´-H), 2.1 - 2.0 (m, 7 H, 8-H, 7-H), 1.9 -

1.5 (m, 8 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).

13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 159.5 ppm [u] (C-11), 152.0 [u] (C-9), 128.9 [d]

(C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.2 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.9 [u] (C-1), 61.6 [u]

(C-7), 55.2 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 44.8 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.9

[u] (C-4), 22.3 [u] (C-5).

Die Zuordnung der 13C-NMR-Signale war durch einen Vergleich mit Literaturdaten

eindeutig möglich.245

Page 193: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 179

3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-

cyclohexyl)-phenol (rac-8)91

Zu 5.2 g (19.8 mmol) rac-7, gelöst in 9 ml abs. Toluol, wurden bei Raumtemperatur

40 ml 20 %ige Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (39.6 mmol) in abs. Toluol

zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer Gasentwicklung

kam. Anschließend wurde für 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung auf

Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 11.3 ml Ethanol so zugetropft, daß eine

Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach wurde 15 Min.

nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden daraufhin 11.3 ml eines

Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine Innentemperatur

von 15 ºC nicht überschritten wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit

ca. 20 ml Toluol verdünnt und danach noch eine Stunde bei Raumtemperatur

nachgerührt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und mit fünf Volumenteilen

Essigsäureethylester bei 60°ºC für 30 Min. nachextrahiert. Nach Filtration wurden die

vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und am

Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 4.592 g

(18.4 mmol, 93 %) eines farblosen Öls erhalten, welches farblose Kristalle mit einem

Schmelzpunkt von 139 ºC bildete.

OH

N

OH1

234

5 67

8

910

11

1213

14

rac-8: MW = 249.4 g⋅mol-1 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.5 ppm (s, 1 H, 10-H), 7.2 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz,

1 H, 13-H), 6.8 (m, 2 H, 12-H, 14-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H, 7´-H), 2.2 -

1.4 (m, 15 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).

13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.4 [d]

(C-13), 116.0 [d] (C-14), 113.3 [d] (C-12), 113.0 [d] (C-10), 78.3 [u] (C-1), 61.7 [u]

(C-7), 47.6 [d] (C-8), 44.4 [u] (C-2), 41.0 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.7 [u] (C-4), 22.2

[u] (C-5).

Page 194: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

180 EXPERIMENTELLER TEIL

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 249 (M+, 18), 121 (3), 58 (100), 45 (6).

MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%):306 ([M + C4H9]+, 4), 250 ([M + H]+, 100), 249 (M+,

10).

IR (KBr): ∼ν = 3201 (s), 2985 (s), 2863 (s), 2834 (s), 2789 (s), 2425 (w), 1280 (s),

1252 (m), 1215 (s), 1166 (m), 1118 (m), 1098 (m), 1079 (m), 1033 (w), 10006 (w),

988 (s), 963 (m), 905 (w), 865 (m), 846 (m), 763 (m), 707 (m) cm-1.

C15H23NO2 (249.2 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 72.25 71.98

H 9.30 9.10

N 5.62 5.56

3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-

dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)

Die Base rac-11 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

5.0 g (19.3 mmol) rac-11⋅HCl in 19 ml dest. Wasser und 2 ml Dichlormethan

suspendiert und mit 10 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung

wurden 4.188 g (18.8 mmol, 97 %) rac-11 als farbloser Sirup erhalten, welcher

farblose, weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 98 ºC bildete.

OH

N

OH1

23

45

6

78

9

1011

12

rac-11: MW = 223.3 g⋅mol-1 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.3 – 8.1 (br s, 1 H, 9-OH), 7.21 (s, 1 H, 8-H), 7.06 (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 11-H), 6.82 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 6.61 (dd, 3J = 8 Hz, 4J =

2 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 2.67 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.31 (s, 6 H, 6-H),

Page 195: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 181

2.23 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 2.06 (m, 1 H, 2-H), 1.49 (s, 3 H, 4-H), 0.65

(d, 3J = 7 Hz, 3 H, 3-H).

13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 156.5 ppm [u] (C-9), 149.4 [u] (C-7), 128.5 [d]

(C-11), 117.2 [d] (C-12), 113.9 [d] (C-10), 113.7 [d] (C-8), 78.4 [u] (C-1), 64.1 [u]

(C-5), 45.6 [d] (C-6), 40.1 [d] (C-2), 21.8 [d] (C-4), 14.8 [d] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 223 (M+, 10), 181 (3), 138 (3), 121 (11), 107 (6), 95 (4), 93

(10), 91 (5), 86 (69), 77 (9), 71 (18), 65 (14), 58 (100), 45 (62).

IR (KBr): ∼ν = 3225 (s), 2981 (s), 2955 (s), 2884 (s), 2838 (s), 2802 (s), 2653 (s),

2567 (m), 1615 (m), 1585 (s), 1507 (s), 1485 (s), 1467 (s), 1282 (s), 1255 (s), 1240

(s), 1260 (s), 1176 (m), 1162 (w), 1123 (s), 1103 (w), 1077 (w), 876 (s), 841 (s), 793

(s), 743 (m), 707 (s), 688 (w), 545 (w), 531 (w), 487 (w) cm-1.

C13H21NO2 (223.3 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 69.92 69.73

H 9.48 9.56

N 6.27 6.23

3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-

(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)

Die Base rac-12 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

3.293 g (10.4 mmol) rac-12⋅HCl in 5 ml dest. Wasser und 20 ml Dichlormethan

suspendiert und mit ca. 3.0 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung

wurden 2.883 g (10.3 mmol, 99 %) rac-12 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der

unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort

anschließend erstarrte. 2.273 g (8.1 mmol, 79 %) wurden so als farblose Kristalle mit

einem Schmelzpunkt von 49 ºC gewonnen und 0.552 g (2.0 mmol, 19 %) als

farbloser Sirup zurückbehalten.

Page 196: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

182 EXPERIMENTELLER TEIL

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415

HO

rac-12: MW = 279.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H, 10-H), 7.01 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.75 (ddd, 3J = 9 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.12 (m,

1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 2.75 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 – 1.20 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 [u] (C-11), 150.7 [u] (C-9), 129.1 [d] (C-13),

117.2 [d] (C-14), 111.6 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 78.6 [u] (C-1), 67.5 [d] (C-5), 60.7

[u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 50.0 [u] (C-6), 47.8 [d] (C-8), 44.3 [d] (C-2), 35.7 [u] (C-4),

26.3 [u] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 64), 234 (5), 135 (11), 107 (4), 84 (3) 58 (100).

IR (in CHCl3): ∼ν = 3371 (s), 3079 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2831 (s), 2784 (s), 1600 (s),

1583 (s), 1484 (s), 1463 (s), 1432 (s), 1365 (m), 1315 (m), 1287 (s), 1255 (s), 1206

(m), 1158 (s), 1096 (s), 1074 (s), 1048 (s), 1012 (m), 979 (m), 959 (m), 861 (m), 844

(m), 829 (w), 782 (s), 756 (s), 730 (m), 704 (s), 666 (m), 569 (w) cm-1.

C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.79 68.44

H 9.02 9.38

N 5.01 4.93

Page 197: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 183

3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-

(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13)

Die Base rac-13 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

2.422 g (7.7 mmol) rac-13⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan

suspendiert und mit ca. 1.5 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung

wurden 2.092 g (7.5 mmol, 98 %) rac-13 als weißer Feststoff mit einem

Schmelzpunkt von 106 ºC erhalten.

OH

N

OOH

1

234

5 67

8

910

11

1213

1415

rac-13: MW = 279.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.99 ppm (s, 1 H, 1-OH), 7.26 (t, 3J = 8 Hz, 1 H,

13-H), 7.09 (s, 1 H, 10-H), 6.99 (s, 1 H, 14-H), 6.75 (m, 1 H, 12-H), 5.15 (s, 1 H,

5-OH), 4.06 (s, 1 H, 5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.47 (m, 2 H, 7-H, 3-H), 2.15 (d, 1 H,

7-H´), 2.12 (s, 6 H, 8-H), 2.05 (m, 1 H, 4-H), 1.97 (ddd, 4J = 2.75 Hz, 3J = 2.75 Hz, 2J = 14.6 Hz, 1 H, 6-H), 1.92 (m, 1 H, 2-H), 1.75 (dd, 1 H, 2J = 14.6 Hz, 3J = 3.05 Hz,

6-H´), 1.60 – 1.65 (m, 2 H, 4-H´, 3-H´).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 ppm [u] (C-11), 150.2 [u] (C-9), 129.1 [d]

(C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 79.0 [u] (C-1), 67.0 [d]

(C-5), 61.3 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.8 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 33.6

[u] (C-4), 21.8 [u] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 17), 135 (5), 58 (100), 45 (4).

IR (KBr): ∼ν = 3375 (s), 3046 (m), 2969 (s), 2942 (s), 2874 (s), 2826 (s), 1598 (s),

1488 (s), 1461 (s), 1438 (s), 1406 (w), 1377 (w), 1326 (m), 1285 (s), 1263 (s), 1246

(s), 1206 (m), 1177 (m), 1158 (s), 1113 (m), 1083 (w), 1044 (s), 1011 (m), 986 (m),

971 (m), 956 (m), 926 (w), 883 (s), 852 (s), 835 (m) 789 (s), 706 (s), 597 (m) cm-1.

Page 198: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

184 EXPERIMENTELLER TEIL

C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.79 68.65

H 9.02 9.25

N 5.01 4.93

3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-

(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14)

Die Base rac-14 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

1.802 g (5.7 mmol) rac-14⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan

suspendiert und mit ca. 0.9 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung

wurden 1.578 g (5.5 mmol, 99 %) rac-14 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der

unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort

anschließend erstarrte. 1.300 g (4.7 mmol, 82 %) wurden so als farblose Kristalle mit

einem Schmelzpunkt von 44 ºC gewonnen und 0.278 g (1 mmol, 17 %) als farbloses

sirupöses Öl zurückbehalten.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415HO

rac-14: MW = 279.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.25 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.13 (s, 1 H,

10-H), 7.01 (s, 1 H, 12-H), 6.78 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 3.81

(s, 3 H, 15-H), 3.75 (m, 1 H, 4-H), 2.7 - 2.9 (br s, OH), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4.5 Hz, 1 H, 7-H´), 2.22 – 1.60 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.7 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.3 [d]

(C-13), 117.5 [d] (C-14), 111.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10), 76.2 [u] (C-1), 71.2 [d]

(C-4), 61.5 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.5 [d] (C-2), 39.7 [u] (C-6), 37.2

[u] (C-3), 31.9 [u] (C-5).

Page 199: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 185

IR (KBr): ∼ν = 3391 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2829 (s), 2781 (s), 1604 (s), 1584 (s),

1483 (s), 1464 (s), 1431 8s), 1369 (w), 1287 (s), 1253 (s), 1167 (m), 1135 8w), 1074

(m), 1041 (s), 990 (s), 960 (m), 853 (w), 828 (w), 782 (m), 703 (m) cm-1.

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 11), 234 (2), 135 (2), 58 (100), 45 (2).

C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.79 68.82

H 9.02 8.81

N 5.01 4.99

3.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse

3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.00 g (8.0 mmol) rac-8 mit einer

Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol) Pyridin

in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie

(EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-15)= 0.31; Rf (rac-8) = 0.10) wurden

2.401 g (7.5 mmol, 94 %) eines weiß-grauen kristallinen Feststoffs mit einem

Schmelzpunkt von 54 ºC erhalten.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

14O

1516

17

18

rac-15: MW = 319.4 g⋅mol-1 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 1 H, 13-H), 7.2 (s, 1 H, 10-H), 6.9 (m,

2 H, 12-H, 14-H), 2.5 (t, 3J = 5 Hz, 2 H, 16-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H,

Page 200: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

186 EXPERIMENTELLER TEIL

7´-H), 2.1 - 1.4 (m, 17 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H),

1.0 (t, 3J = 5 Hz, 3 H, 18-H).

13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 172.1 ppm [u] (C-15), 152.2 [u] (C-11), 150.8 [u]

(C-9), 128.8 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.0 [d] (C-12), 118.6 [d] (C-10), 76.9 [u]

(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 36.2 [u] (C-16), 27.9

[u] (C-3), 26.8 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 18.4 [u] (C-17), 13.7 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 319 (M+, 9), 58 (100).

IR (KBr): ∼ν = 3400 (w), 3091 (m), 2975 (s) 2945, 2856 (s), 2829 (s), 1755 (s), 1608

(m), 1588 (m), 1461 (m), 1445 (m), 1434 (s), 1417 (s), 1383 (m), 1156 (s), 1156 (s),

1096 (s), 808 (m), 708 (m) cm-1.

C19H29NO3 (319.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 71.44 71.03

H 9.15 9.19

N 4.38 4.35

3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-

1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.490 g (10.0 mmol) rac-8 mit

einer Mischung aus 1.318 g (12.9 mmol) Essigsäureanhydrid und 0.08 g (1.0 mmol)

Pyridin in 40 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und

Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-16)= 0.26;

Rf (rac-8) = 0.10) wurden 2.881 g (9.9 mmol, 99 %) eines weißen kristallinen

Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 84 ºC erhalten.

Page 201: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 187

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

14O

15 16

rac-16: MW = 291.4 g⋅mol-1 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 3 H, 13-H, 10-H, 12-H/14-H), 6.93 (m,

1 H, 12-H/14-H), 5.8 – 6.4 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H,

7´-H), 2.29 (s, 3 H, 16-H), 2.25 – 1.25 (m, 16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 169.3 ppm [u] (C-15), 152.0 [u] (C-11), 150.5 [u]

(C-9), 128.7 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 118.9 [d] (C-12), 118.4 [d] (C-10), 77.3 [u]

(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.8

[u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 21.1 [d] (C-16).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 291 (M+, 31), 121 (3), 58 (100) 45 (8).

IR (KBr): ∼ν = 3076 (w), 3007 (w), 2981 (w), 2947 (s), 2924 (s), 2856 (m), 2828 (m),

2786 (m), 1755 (s), 1609 (w), 1588 (w), 1482 (w), 1459 (m), 1436 (m), 1377 (m),

1293 (w), 1268 (w), 1213 (s), 1154 (m), 1140 (w), 1094 (w), 1085 (w), 1022 (m), 991

(m), 965 (m), 938 (w), 889 (w), 839 (w), 806 (w), 784 (w), 710 (w) cm-1.

C17H25NO3 (291.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 70.07 69.91

H 8.65 8.13

N 4.81 4.71

3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-

hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 1.786 g (8.0 mmol) rac-11 mit

einer Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol)

Pyridin in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und

Page 202: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

188 EXPERIMENTELLER TEIL

Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1, 1 % Triethylamin über Kieselgel,

Rf (rac-17)= 0.58) wurden 1.995 g (6.8 mmol, 85 %) eines farblosen Öls erhalten.

OH

N

O1

23

45

6

78

9

1011

12

1314

O15

16

rac-17: MW = 293.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 (s, 1 H, Ar), 7.22 (s, 1 H, Ar), 7.15 (s, 1 H, Ar),

6.87 (m, 1 H, 11-H), 2.57 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.44 (t, 3J = 7 Hz,

2 H, 14-H), 2.22 (s, 6 H, 6-H), 2.14 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 1.94 (m, 1 H,

2-H), 1.69 (m, 2 H, 15-H), 1.40 (s, 3 H, 4-H), 0.96 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 16-H), 0.70 (d, 3J

= 7 Hz, 3 H, 3-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.8 ppm [u] (C-13), 149.5 [u] (C-9), 149.3 [u] (C-

7), 127.3 [d] (C-11), 122.0 [d] (C-12), 118.3 [d] (C-10), 118.1 [d] (C-8), 76.2 [u] (C-1),

63.0 [u] (C-5), 44.7 [d] (C-6), 39.3 [d] (C-2), 35.2 [u] (C-14), 20.9 [d] (C-4), 17.4 [u]

(C-15), 14.8 [d] (C-3), 12.6 [d] (C-16).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 293 (M+, 4), 86 (7), 84 (12), 71 (4), 58 (100), 45 (7).

IR (kapillar): ∼ν = 2971 (s), 2877 (m), 2827 (m), 2784 (m), 1759 (s), 1608 (m), 1586

(m), 1466 (s), 1370 (m), 1236 (m), 1153 (s), 1098 (w), 1080 (w), 1029 (m), 947 (m),

838 (w), 704 (m) cm-1.

C17H27NO3 (293.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 69.59 69.52

H 9.28 8.93

N 4.77 4.67

Page 203: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 189

3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-

methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 3.265 g

(10.3 mmol) rac-12⋅HCl, gelöst in 33 ml abs. THF, mit 2.950 g (26.3 mmol) Kalium-

tert-butylat über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.66 ml (1.703 g, 16.0 mmol)

Buttersäurechlorid, gelöst in 3 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und

Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,

Rf (rac-18) = 0.41; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 2.915 g (8.3 mmol, 81 %) eines klaren

sirupösen Öls erhalten.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415

O

O

1617

18

19

rac-18: MW = 349.5 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.26 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.14 (s, 1 H,

10-H), 7.03 (s, 1 H, 12-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.21 (m, 1 H,

5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.40 (m,

18 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.91 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.8 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]

(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 78.4 [u]

(C-1), 71.1 [d] (C-5), 60.5 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 46.0 [u] (C-6), 44.1

[d] (C-2), 36.4 [u] (C-17), 32.2 [u] (C-4), 25.9 [u] (C-3), 18.5 [u] (C-18), 13.6 [d]

(C-19).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 350 ([M+H]+, 9), 349 (M+, 38), 262 (7), 135 (8), 58 (100), 45

(3).

IR (kapillar): ∼ν = 2947 (s), 2864 (m), 2831 (s), 2784 (m), 1730 (s), 1600 (m), 1583

(m), 1484 (s), 1462 (s), 1432 (m), 1383 (m), 1358 (m), 1306 (m), 1288 (s), 1256 (s),

Page 204: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

190 EXPERIMENTELLER TEIL

1186 (s), 1093 (m), 1048 (s), 1018 (m), 978 (m), 963 (m), 864 (w), 847 (w), 784 (m),

756 (m) 704 (w) cm-1.

C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.74 68.44

H 8.94 8.77

N 4.01 4.30

3.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-

methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei –10 ºC, dazu wurden 3.50 g (12.5 mmol)

rac-13, gelöst in 102 ml abs. Diethylether und auf –10 ºC gekühlt, mit 1.408 g

(12.5 mmol) Kalium-tert-butylat und 1.203 g (11.3 mmol) Buttersäurechlorid, gelöst in

8 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 4.235 g eines gelben,

öligen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropyl-

ether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.29) wurden 1.904 g (5.4 mmol, 44 %)

rac-19 als sirupöses Öl und 1.787 g einer Mischfraktion aus rac-13 (Rf = 0.16) und

rac-19 erhalten. Nach erneuter Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =

1 : 1 über Kieselgel) wurden weitere 0.593 g (1.7 mmol, 14 %) rac-19 und 0.582 g

Mischfraktion erhalten.

OH

N

OO

1

234

5 67

8

910

11

1213

1415

O

1617

18

19

rac-19: MW = 349.5 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.12 (s,

1 H,.10-H), 7.02 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 3 Hz, 1 H, 12-H),

5.17 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.29 – 3.36 (m, 2 H, 17-H), 2.11 (s, 6 H, 8-H),

2.08 – 1.63 (m, 11 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 18-H), 0.96 (t, 3J = 7.5 Hz, 3 H, 19-H).

Page 205: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 191

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 149.0 [u]

(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.7 [d] (C-14), 112.0 [d] (C-12), 111.6 [d] (C-10), 76.1 [u]

(C-1), 70.5 [d] (C-5), 61.1 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 46.6 [d] (C-8), 43.4 [u] (C-6), 43.0

[d] (C-2), 37.0 [u] (C-17), 29.6 [u] (C-4), 22.4 [u] (C-3), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]

(C-19).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).

IR (kapillar): ∼ν = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601

(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),

1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),

782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.

C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.74 68.35

H 8.94 9.08

N 4.01 4.30

3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-

dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20)91

Zu 1.790 g (6.4 mmol) rac-13, gelöst in 8 ml abs. Toluol, wurden bei

Raumtemperatur 42 ml Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (1 M, 42.0 mmol) in abs.

Toluol zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer starken

Gasentwicklung kam. Anschließend wurde die Reaktionslösung für 1 Stunde bei

Raumtemperatur und danach für weitere 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach

Abkühlung auf Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 5.0 ml Ethanol so

zugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach

wurde 15 Min. nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden anschließend 10.0 ml

eines Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine

Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Nach Filtration wurde die

Page 206: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

192 EXPERIMENTELLER TEIL

organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer unter

vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 1.653 g (5.6 mmol, 88 %) eines farblosen

Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 74 ºC erhalten, welcher noch Spuren rac-13

enthielt. Eine chromatographische Abtrennung dieser Verunreinigung war nicht

möglich, daher wurde im folgenden die in Spuren verunreinigte Substanz eingesetzt.

OH

N

OHOH

1

234

5 67

8

910

11

1213

14

rac-20: MW = 265.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (mt, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.1 – 6.8 (br s,

1 H, 11-OH), 6.98 (s, 1 H, 10-H), 6.80 (s, 1 H, 14-H), 6.64 (dd, 1 H, 3J = 8 Hz, 4J = 2 Hz, 12-H), 6.0 – 6.1 (br s, 2 H, 1-OH, 5-OH), 4.05 (m, 1 H, 5-H), 2.50 – 1.45

(m, 15 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 150.0 [u] (C-9), 129.6 [d]

(C-13), 116.3 [d] (C-14), 113.9 [d] (C-10), 112.5 [d] (C-12), 79.4 [u] (C-1), 67.8 [d]

(C-5), 61.6 [u] (C-7), 48.1 [d] (C-8), 45.1 [u] (C-6), 44.1 [d] (C-2), 33.6 [u] (C-4), 22.3

[u] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).

IR (kapillar): ∼ν = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601

(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),

1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),

782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.

Page 207: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 193

3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-

methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)95

1.190 g (4.5 mmol) rac-20 wurde zu einer Lösung aus 50 ml dest. Wasser und 6.42 g

NaHCO3 (76.4 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einer Stunde hatte sich

eine klare Lösung gebildet, zu der innerhalb von 15 Minuten tropfenweise 6.65 ml

(6.40 g, 40.5 mmol) Buttersäureanhydrid unter starker Gasentwicklung gegeben

wurden. Anschließend wurde noch 15 Min. bei Raumtemperatur zur

Vervollständigung der Reaktion gerührt und danach dreimal mit jeweils 15 ml

Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4

getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 1.446 g braunes,

sirupöses Rohprodukt erhalten. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1

über Kieselgel, Rf = 0.33; Rf (rac-13) = 0.26) konnten 1.417 g (4.2 mmol, 93 %)

rac-21 als schwach hellbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 79 ºC erhalten

werden.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

14O

1516

17

18

OH

rac-21: MW = 335.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.27 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.20 ( br s, 1 H, -

H), 7.09 (m, 1 H, -H), 6.88 (dd, 3J = 9 Hz, 4J = 2 Hz, 1 H, -H), 4.01 (mt, 3J = 3 Hz,

1 H, 5-H), 2.5 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 16-H, 17-H), 0.97 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 18-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.2 ppm [u] (C-15), 151.0 [u] (C-11), 150.3 [u]

(C-9), 129.3 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.7 [d] (C-12), 118.7 [d] (C-10), 78.7 [u]

(C-1), 67.2 [d] (C-5), 61.4 [u] (C-7), 47.5 [d] (C-8), 46.1 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 36.5

[u] (C-16), 33.6 [u] (C-4), 22.1 [u] (C-3), 18.8 [u] (C-17), 14.0 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 265 (M+, 14), 121 (3), 58 (100) 45 (6).

Page 208: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

194 EXPERIMENTELLER TEIL

IR (KBr): ∼ν = 3371 (m), 3169 (s9, 2946 (s), 2830 (s), 2786 (m), 1615 (m) 1585 (m),

1481 (s), 1424 (s), 1369 (w), 1352 (m), 1305 (m), 1293 (s), 1278 (s) 1251 (s), 1221

(m), 1165 (m), 1108 (s), 1075 (s), 1033 (m), 1007 (m), 984 (s), 952 (s), 904 (m), 874

(m), 863 (m), 841 (s), 782 (s), 734 (m), 703 (s), 579 (w), 469 (w) cm-1.

3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino-

methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 2.761 g

(8.7 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 28 ml abs. THF, mit 1.500 g (13.4 mmol) Kalium-

tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.410 ml (1.447 g, 13.6 mmol)

Buttersäurechlorid, gelöst in 2 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und

Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.39;

Rf (rac-14) = 0.14) wurden 2.396 g (6.9 mmol, 79 %) eines klaren sirupösen Öls

erhalten.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415O

O

1617

18

19

rac-22: MW = 349.5 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,

10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.78

(m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.35 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 –

1.50 (m, 18 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.89 (t, 3J = 7 Hz, 3 H,

19-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.5 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]

(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.1 [u]

(C-1), 73.3 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.4 [d] (C-2), 39.4

[u] (C-6), 36.9 [u] (C-17), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]

(C-19).

Page 209: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 195

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 8), 135 (2), 58 (100), 45 (3).

IR (kapillar): ∼ν = 3077 (w), 2960 (s), 2873 (m), 2831 (m), 2783 (m) 1728 (s), 1601

(m), 1583 (m), 1483 (s), 1462 (s), 1432 8s), 1384 (m), 1356 (w), 1287 (s), 1254 (s),

1184 (s), 1093 (m), 1047 (s), 1013 (s), 997 (s), 964 (w), 784 (m), 703 (m) cm-1.

C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.74 68.68

H 8.94 9.01

N 4.01 4.43

3.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-

methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)

rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml abs. Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g

(13.45 mmol) Kalium-tert-butylat und mit 1.090 g (8.1 mmol) Hexansäurechlorid,

gelöst in 2.6 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 2.370 g eines

gelben, zähflüssigen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie

(Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.57; Rf (rac-14) = 0.19) und

anschließender präparativer HPLC (EE : MeOH = 1 : 1 über RP-Säule 18) konnten

1.562 g (4.1 mmol, 77 %) rac-23 als trübes, sirupöses Öl erhalten werden, welches

nach NMR- und GC-Analytik noch Spuren des Diesters der Hexansäure und rac-14

enthielt.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415O

O

2116

17

18

19

20

rac-23: MW = 377.5 g⋅mol-1

Page 210: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

196 EXPERIMENTELLER TEIL

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.19 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,

10-H), 6.93 (s, 1 H, 14-H), 6.70 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 2.5 Hz, 1 H, 12-H), 6.08 (br s,

1 H, 1-OH), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.4 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 5-H,

6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 1.25 (m, 4 H, 19-H, 20-H), 0.83 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 21-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.7 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]

(C-9), 129.4 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.2 [d] (C-10), 76.0 [u]

(C-1), 73.2 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 47.9 [d] (C-8), 43.2 [d] (C-2), 39.4

[u] (C-6), 34.9 [u] (C-17) 33.3 [u] (C-3), 31.6 [u] (C-19), 27.9 [u] (C-5), 25.1 [u] (C-18),

22.7 [u] (C-20), 14.3 [d] (C-21).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 377 (M+, 10), 135 (3), 58 (100).

MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%): 434 ([M + C4H9]+, 3), 378 ([M + H]+, 100), 262 (4).

IR (kapillar): ∼ν = 2955 (s), 2861 (s), 2832 (m), 2783 (m), 1729 (s), 1601 (m),1583

(m), 1484 (s), 1464 (s), 1432 (s), 1380 (m), 1355 (m), 1317 (m), 1288 (s), 1251 (s),

1176 (s), 1137 (m), 1097 (m), 1049 (m), 1034 (s), 1014 (s), 783 (m), 736 (w), 703 (m)

cm-1.

C22H35NO4 (377.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 69.99 70.15

H 9.34 9.49

N 3.71 3.61

Page 211: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 197

3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino-

methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)

rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g (13.45 mmol)

Kalium-tert-butylat und mit 0.630 g (8.0 mmol) Essigsäurechlorid, gelöst in 2.6 ml

Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 1.816 g eines gelben, öligen

Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =

1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.46; Rf (rac-14) = 0.19) wurden 1.292 g einer gelblich

öligen Mischung aus rac-24 und eines Diesters (Rf = 0.51) aus rac-14 und

Essigsäure (Verhältnis nach den Signalen der Protonen der Methoxygruppe (15-H)

im 1H-NMR: 4 : 1) erhalten. Ein Versuch zur weiteren Aufreinigung durch präparative

HPLC (Acetonitril : Wasser = 3 : 1 über RP-Select B-LiChrosor b-Säule) führte zur

Zersetzung von rac-24. Eine weitere Aufreinigung von rac-24 war somit nicht

möglich. Im folgenden wurde daher die nach Säulenchromatographie erhaltene

Mischung eingesetzt.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415O

O

1617

rac-24: MW = 263.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H,

10-H), 6.90 (s, 1 H, 12-H), 6.70 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-H), 3.75

(s, 3 H, 15-H), 2.34 (md, 2J = 14 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.45 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H,

6-H, 7-H, 8-H, 17-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.9 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]

(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.0 [u]

(C-1), 73.7 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4

[u] (C-6), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 21.8 [d] (C-17).

Page 212: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

198 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-

dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25)

Zu einer Mischung von 1.750 g (6.3 mmol) rac-13 und 0.250 g (0.5 mmol) Pyridin in

5 ml Dichlormethan wurden unter Rühren 1.090 g (6.9 mmol) Buttersäureanhydrid

gegeben. In einer schwach exothermen Reaktion verfärbte sich die Reaktionslösung

hierbei schwach gelb. Die Reaktionslösung wurde für 26 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt, bis durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr detektiert werden

konnte. Anschließend wurde die schwach gelbe Reaktionslösung mit einem

Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt. Nach

Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden mit dest. Wasser gewaschen und über

NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurde ein gelbliches,

Sirup ähnliches Öl erhalten, das im Hochvakuum von Pyridinresten befreit wurde.

Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,

Rf = 0.48) wurden 1.916 g (4.6 mmol, 67 %) rac-25 erhalten.

O

N

OO

1

234

5 67

8

910 11

1213

1415

O

1617

18

19

O

23

2221

20

rac-25: MW = 419.6 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 6.76 (m, 3 H,

10-H, 12-H, 14-H), 5.18 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H), 15-H), 3.09 (dd, 2J = 15 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 6-H´), 2.46 – 2.30 (m, 4 H, 6-H, 7-H´,17-H/21-H), 2.22 (t, 3J = 7 Hz,

2 H, 17-H/21-H), 2.09 (s, 6 H, 8-H), 1.95 – 1.60 (m, H, 2-H, 3-H, 4-H, 7-H, 18-H,

22-H), 1.01 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H), 0.95 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.6 ppm [u] (C-16), 171.9 [u] (C-20), 159.1 [u]

(C-11), 143.0 [u] (C-9), 128.8 [d] (C-13), 117.9 [d] (C-14), 112.4 [d] (C-12), 111.4 [d]

(C-10), 84.0 [u] (C-1), 69.0 [d] (C-5), 59.0 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 45.8 [d] (C-8),

Page 213: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 199

44.8 [d] (C-2), 37.5 [u] (C-17), 36.4 [u] (C-21), 28.8 [u] (C-4), 18.5 [u] (C-18), 18.2 [u]

(C-22), 13.9 [d] (C-19), 13.7 [d] (C-23).

MS (CI, Isobutan, DEP, 100 eV) m/z (%): 477 ([M + C4H9]+, 2), 420 ([M + H]+, 100),

375 (11), 355 (13), 332 (63), 287 (73), 275 (15), 199 (44), 187 (23), 113 (13), 97 (10),

85 (24), 83 (21), 81 (30), 79 (14), 71 (31).

IR (kapillar): ∼ν = 2963 (s), 2943 (s), 2874 (m), 2819 (m), 2765 (m), 1733 (s), 1605

(m), 1585 (m), 1490 (m), 1461 (s), 1433 (s), 1382 (m), 1362 (m), 1292 (s), 1256 (s),

1191 (s), 1154 (s), 1097 (s), 1049 (m). 1029 (m), 991 (m), 973 (m),849 (w), 803 (w),

778 (w), 700 (w) cm-1.

Die Synthese von rac-25 erfolgte ebenfalls gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur in

THF mit einer Ausbeute von 96 %.

3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in

der enzymatischen Transacylierung

3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylamino-

methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g

(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-

butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.031 g (0.39 mmol)

Essigsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und

Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.30;

Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.054 g (0.17 mmol, 68 %) eines klaren, gelblichen Öls

erhalten.

Page 214: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

200 EXPERIMENTELLER TEIL

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415

O

O

1617

rac-47: MW = 321.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.06 (s, 1 H,

10-H), 6.95 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.12

(m, 1 H, 5-H), 3.73 (s, 3 H, 15-H), 2.32 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 –

1.10 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.0 ppm [u] (C-16), 158.4 [u] (C-11), 149.1 [u]

(C-9), 127.9 [d] (C-13), 115.9 [d] (C-14), 110.3 [d] (C-12), 109.6 [d] (C-10), 77.0 [u]

(C-1), 69.9 [d] (C-5), 59.4 [u] (C-7), 54.1 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 43.1

[d] (C-2), 31.2 [u] (C-4), 24.8 [u] (C-3), 20.3 [d] (C-17).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 321 (M+, 8), 135 (4), 86 (11), 84 (18), 58 (100), 47 (4).

IR (kapillar): ∼ν = 2946 (m), 2830 (w),1730 (s),1601 (w), 1584 (w), 1483 (w), 1462

(m), 1431 (w), 1287 (m), 1250 (s), 1157 (w), 1034 (m), 785 (w), 733 (m) cm-1.

3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino-

methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g

(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-

butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)

Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und

Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.36;

Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.060 g (0.18 mmol, 71 %) eines klaren, schwach

gelblichen sirupösen Öls erhalten.

Page 215: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 201

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415

O

O

1617

18

rac-46: MW = 335.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.07 (s, 1 H,

10-H), 6.96 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 5.13 (m, 1 H,

5-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 – 1.30 (m,

16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.01 (t, 3J = 8 Hz, 3 H, 18-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.4 [u] (C-11), 150.1 [u]

(C-9), 129.0 [d] (C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.7 [d] (C-10), 78.0 [u]

(C-1), 70.6 [d] (C-5), 60.9 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 46.3 [u] (C-6), 44.5

[d] (C-2), 32.6 [u] (C-4), 38.3 [u] (C-17), 26.3 [u] (C-3), 9.6 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 12), 279 (3), 135 (5), 84 (11), 58 (100).

IR (kapillar): ∼ν = 2944 (s), 2862 (m), 2831 (m), 2783 (m), 1732 (s), 1601 (m), 1584

(m), 1483 (m), 1462 (s), 1429 (m), 1351 (w), 1286 (m), 1255 (s), 1193 (s), 1158 (m),

1083 (m), 1048 (m), 1023 (m), 785 (m), 732 (w), 702 (w) cm-1.

3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino-

methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)

Die Synthese erfolgte, indem 0.070 g (0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml

Dichlormethan, mit 2.3 ml (25 mmol) Vinylacetat und 500 mg Novozym 435 versetzt

und bei Raumtemperatur gerührt wurden. Die Rührgeschwindigkeit wurde dabei nicht

zu hoch gewählt, um den immobilisierten Katalysator nicht zu beeinträchtigen. Nach

96 h konnte kein Edukt 14 mehr detektiert werden. Die Reaktionslösung wurde vom

Katalysator abfiltriert, mit 2 ml Dichlormethan versetzt und für weitere 15 h mit 5 ml

ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um während der Reaktion entstandene Essigsäure zu

neutralisieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit je 5 ml Dichlormethan

Page 216: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

202 EXPERIMENTELLER TEIL

nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet.

Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.080 g (0.25 mmol, 99 %)

gelbliches Öl erhalten.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415O1617

O

rac-24: MW = 321.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.16 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.03 (s, 1 H,

10-H), 6.91 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.78 (m, 1 H, 4-

H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.20 – 1.55 (m,

17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.4 ppm [u] (C-16), 158.3 [u] (C-11), 149.3 [u]

(C-9), 127.9 [d] (C-13), 116.0 [d] (C-14), 110.5 [d] (C-12), 109.7 [d] (C-10), 74.6 [u]

(C-1), 72.2 [d] (C-4), 59.9 [u] (C-7), 54.0 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 41.9 [d] (C-2), 38.0

[u] (C-6), 31.9 [u] (C-3), 26.5 [u] (C-5), 20.4 [d] (C-17).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 322 (3), 321 (M+, 11), 135 (3), 118 (3), 86 (57), 84 (91), 58

(100), 49 (16), 47 (16).

IR (kapillar): ∼ν = 2951 (s), 2862 (w), 2831 (m), 2781 (w), 1730 (s), 1602 (s), 1584

(s), 1483 (s), 1463 (s), 1431 (m), 1366 (m), 1317 (w), 1286 (s), 1252 (s), 1171 (m),

1094 (w), 1034 (s), 998 (m), 962 (w), 913 (m), 786 (m), 733 (s), 704 (m) cm-1.

Page 217: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 203

3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino-

methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g

(0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-

butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)

Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und

Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.33;

Rf (rac-14) = 0.14) wurden 0.055 g (0.16 mmol, 66 %) eines klaren, schwach

gelblichen sirupösen Öls erhalten.

OH

N

O1

234

5 67

8

910

11

1213

1415O16

17

18O

rac-45: MW = 335.4 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,

10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-

H), 3.72 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 1.55 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 7-H´, 8-H, 17-

H), 1.07 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 18-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 174.2 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 150.7 [u]

(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.0 [u]

(C-1), 73.4 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.4 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4

[u] (C-6), 33.2 [u] (C-3), 28.2 [u] (C-17), 27.8 [u] (C-5), 9.5 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 10), 135 (3), 86 (37), 84 (57), 58 (100), 49 (7).

IR (kapillar): ∼ν = 2947 (s), 2861 (w), 2831 (m), 2782 (w), 1728 (s), 1602 (s), 1584

(s), 1483 (s), 1728 (s), 1602 (s), 1584 (s), 1483 (s), 1463 (s), 1430 (s), 1352 (w),

1287 (m), 1255 (m), 1193 (s), 1084 (s), 1047 (s), 1020 (s), 997 (m), 962 (w), 911 (w),

785 (m), 734 (s), 704 (m) cm-1.

Page 218: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

204 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-

Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-

nonan-3-on (rac-48)

3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-

(trichlormethyl)-carbonat222,246

1.150 g (3.6 mmol) rac-13⋅HCl und 2.888 g (36.5 mmol) Pyridin wurden in 20 ml abs.

Dichlormethan gelöst und auf −76 ºC gekühlt. Zu der klaren Lösung wurde über

einen Zeitraum von 10 Min. bei −76 ºC eine Lösung von 0.520 g (1.75 mmol) Bis-

(trichlormethyl)-carbonatf (Triphosgen) in 8 ml abs. Dichlormethan mittels Spritzen-

technik gegeben. Anschließend wurde noch 1.5 Stunden bei −76 ºC gerührt, dabei

verfärbte sich die Lösung schwach gelb und es bildete sich ein weißer Feststoff.

Nachdem die Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde auf Raumtemperatur

erwärmt wurde, wurde ein Überschuß an ges. NaHCO3-Lösung zugegeben und für

weitere 10 Stunden gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml

Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4

getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Es

konnten 1.284 g einer Rohmischung erhalten werden, welche noch Pyridin enthielt.

Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,

Rohmischung: Rf (Pyridin) = 0.68, Rf (1) = 0.34, Rf (2) = 0.28, Rf (rac-13) = 0.10)

konnte allerdings nur eine Mischung von nicht näher charakterisierten

Zersetzungsprodukten und 0.334 g rac-13 erhalten werden.

Ein analoger Versuch mit rac-13 als Edukt führte zum gleichen Ergebnis.

f S. B. Damle, Safe handling of diphosgene and triphosgene, Chem. & Eng. News 1993, 71, 4.

Page 219: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 205

3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit

1,1´-Carbonyldiimidazol223,247

500 mg (1.8 mmol) rac-13 wurden in 15 ml abs. Toluol gelöst und mit 1.162 g

(7.2 mmol) 1,1´-Carbonyldiimidazol versetzt. Die Reaktionslösung wurde

anschließend für 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt und danach für weitere

15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung

mit einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 10 Stunden kräftig gerührt.

Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet und das

Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Nach

Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1 über Kieselgel) konnten drei nicht näher

charakterisierte Fraktionen (66 mg (Rf = 0.75); 15 mg (Rf = 0.75 und Rf = 0.47);

0.47 mg (Rf = 0.47)) erhalten werden und 138 mg einer Hauptfraktion (Rf = 0.30). Die

spektroskopischen Daten dieser Fraktion lassen folgende Struktur vermuten:

OO

1

234

5 6 910

11

1213

14

15

O

NN 16

17

1819

49: MW = 298.3 g⋅mol-1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.05 ppm (s, 1 H, 17-H), 7.33 (t, J = 2 Hz, 1 H,

Ar/Im), 7.15 (t, J = 8 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.97 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.87 (dd, J = 8 Hz,

J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.82 (t, J = 2 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.71 (dd, J = 8 Hz J = 3 Hz, 1 H,

Ar/Im), 6.08 (m, 1 H, 2-H), 5.32 (m, 1 H, 5-H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.82 (dm,

J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.58 (dm, J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.33 (m, 2 H, Cy), 1.96 (m, 2 H,

Cy).

(Ar: Proton am Arylring, Im: Proton am Imidazolring, Cy: Proton am Cyclohexylring)

Page 220: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

206 EXPERIMENTELLER TEIL

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.8 ppm [u] (C-11), 148.4 [u] (C-9), 142.5 [u]

(C-1), 137.3 [n. b.] (C-2), 133.1 [u] (C-16), 130.8 [d] (C-17), 129.6 [d] (C-13), 124.1

[d] (C-17/19), 117.8 [d] (C-14), 117.3 [d] (C-17/19), 112.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10),

75.2 [d] (C-5), 55.5 [d] (C-15), 33.0 [u] (C-6), 26.9 [u] (C-4), 23.5 [u] (C-3).

Vor Säulenchromatographie: MS (EI, 70 eV) m/z (%): 305 (M+[rac-48], 22), 298

(M+[rac-49], 20), 186 (83), 121 (17), 58 (100).

Ein analoger Versuch mit rac-13⋅HCl als Edukt führte zum gleichen Ergebnis, hier

konnte allerdings neben rac-49 auch rac-13 in geringen Mengen isoliert werden.

Page 221: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 207

3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate

3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität

der racemischen Substrat Ester (AAV 5)

Der racemische Ester (ca. 0.1 bis 0.2 mmol) wurde in 1 ml (10 Vol%) des

organischen Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 9 ml wäßriger

Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Die Mischung wurde anschließend auf den

gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für

mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne Enzym gerührt. Im Anschluß

wurde die Reaktionslösung mit Dichlormethan extrahiert, getrocknet, am

Rotationsverdampfer eingeengt und dünnschicht- und gaschromatographisch

untersucht.

3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15

Die Stabilität des Esters rac-15 gegen Autohydrolyse wurde bereits in eigenen

Vorarbeiten untersucht80.

3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und

rac-25

Die Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25

wurde in unabhängigen Versuchen nach AAV 5 überprüft. Dazu wurde die in Tabelle

3.1 angegebene Menge Substrat in 1 ml tert-Butanol und 9 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und über die in Tabelle 3.1 angegebene Zeit

bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnte nur der jeweilige Ester nach

GC-Analytik nachgewiesen werden.

Page 222: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

208 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.2: Überprüfung der Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19,

rac-21, rac-22 und rac-25

Substrat Substratmenge Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC)

rac-17 50 mg 24 h nein

rac-18 50 mg 46 h nein

rac-19 50 mg 65 h nein

rac-22 50 mg 46 h nein

rac-21 50 mg 24 h nein

rac-25 50 mg 95 h nein

3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23

Die Hydrolysestabilität des Esters rac-23 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden

50 mg (0.16 mmol) rac-23 in 1.48 ml Aceton (16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier Tage bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Aufarbeitung konnte keine Hydrolyse durch GC-Analytik nachgewiesen

werden.

3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16

Die Hydrolysestabilität des Esters rac-16 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden

in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen jeweils 50 mg (0.17 mmol) rac-16 in 1 ml

tert-Butanol und 9 ml wäßriger Phosphatpufferlösung bei dem in Tabelle 3.3

angegeben pH-Wert gelöst und über die in Tabelle 3.3 angegebene Zeit bei

Raumtemperatur gerührt.

Page 223: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 209

Tabelle 3.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität des Esters rac-16 bei

verschiedenen pH-Werten

pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC)

7.0 2 h 0.1 % rac-8

8.0 2 h 1.2 % rac-8

8.0 16 h 15.0 % rac-8

3.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24

Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden

50 mg (0.16 mmol) rac-24 (enthält Diessigsäurester von rac-24) in 1.48 ml Aceton

(16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier

Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnten 40 mg einer

Mischung aus drei Komponenten erhalten werden: rac-14, rac-24 und

Diessigsäurester von rac-24. Nach GC-Analytik wies die Mischung 2 % rac-14 auf.

Page 224: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

210 EXPERIMENTELLER TEIL

3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen

Die Umsätze der enzymkatalysierten Reaktionen wurden gaschromatographisch

(GC) oder flüssigchromatographisch an chiraler stationärer Phase (HPLC) ermittelt.

Die ermittelten Umsätze werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. Die

Retentionszeiten der Verbindungen sind in Tabelle 3.4 und Tabelle 3.6 aufgeführt.

Tabelle 3.4: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Analyse der

Reaktionsmischung zur Umsatzbestimmung an achiraler Phase

Reaktionsmischung Temperatur-

programm

Retentionszeiten

(Min.)

rac-8, rac-15 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (15) = 11.8

rac-8, rac-16 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (16) = 10.9

rac-11, rac-17 S1 (CP9000) tR (11) = 9.4 tR (17) = 10.6

rac-12, rac-18 S1 (CP9000) tR (12) = 11.4 tR (18) = 12.8

rac-12, rac-18 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (18) = 14.6

rac-12, rac-47 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (47) = 13.1

rac-12, rac-46 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (46) = 13.8

rac-13, rac-19 S1 (Varian 3800) tR (13) = 12.3 tR (19) = 13.6

rac-20, rac-21 S1 (Varian 3800) tR (20) = 12.0 tR (21) = 13.0

rac-14, rac-22 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (22) = 14.5

rac-14, rac-23 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (23) = 16.2

rac-14, rac-24 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.4 tR (24) = 13.0

rac-14, rac-45 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.5 tR (45) = 13.8

Die Enantiomerenverhältnisse wurden entweder gaschromatographisch oder

flüssigchromatographisch an chiralen stationären Phasen ermittelt. Die ermittelten

ee-Werte werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. Die Retentionszeiten der

Page 225: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

BESTIMMUNG VON UMSÄTZEN UND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 211

einzelnen Enantiomere unter den jeweiligen Trennbedingungen sind in Tabelle 3.5

und Tabelle 3.6 angegeben.

Tabelle 3.5: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Bestimmung von

Enantiomerenverhältnissen

Ver-

bindung

Chirale

Phase Temperatur-Programma)

Retentionszeit

(Min.)

rac-8 CP-Chirasil-

Dex-CB

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;

15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)

→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-8) = 72.9

tR ((−)-8) = 73.5

rac-15 CP-Chirasil-

Dex-CB

110 ºC (5 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;

5 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) →

200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-15) = 59.1

tR ((−)-15) = 59.6

rac-16 CP-Chirasil-

Dex-CB

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;

15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)

→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-16) = 67.7

tR ((−)-16) = 68.1

rac-12 CP-Chirasil-

Dex-CB

140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.;

2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) →

200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-12) = 21.6

tR ((−)-12) = 22.1

rac-18 Lipodex γ-

6-Me

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;

15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)

→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-18) = 192.0

tR ((−)-18) = 194.0

rac-47 Lipodex γ-

6-Me

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;

15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)

→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-47) = 116.4

tR ((−)-47) = 117.6

rac-46 Lipodex γ-

6-Me

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;

15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)

→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-46) = 171.6

tR ((−)-46) = 175.4

Page 226: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

212 EXPERIMENTELLER TEIL

Fortsetzung Tabelle 3.5:

rac-14 CP-Chirasil-

Dex-CB

140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.;

2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) →

200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((+)-14) = 22.8

tR ((−)-14) = 23.5

rac-22 Lipodex γ-

6-Me

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;

15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)

→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

tR ((−)-22) = 71.8

tR ((+)-22) = 76.3

rac-24 Lipodex γ-

6-Me

140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.;

2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min)

tR ((−)-24) = 70.3

tR ((+)-24) = 74.5

rac-45 Lipodex γ-

6-Me

140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.;

2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min)

tR ((−)-45) = 71.8

tR ((+)-45) = 76.3

a) Trägergas H2 mit 100 kPa Vordruck; Split 1:40.

Tabelle 3.6: Trennbedingungen zur Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen

durch HPLC Analyse an Chiralcel OD-H Phase

Verbindung Flow

(mL / Min.) Laufmittel-Verhältnis

Retentionszeitena)

(Min.)

rac-8 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

970 : 30 : 1

tR ((+)-8) = 19.1

tR ((−)-8) = 20.3

rac-15 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

970 : 30 : 1

tR ((+)-15) = 9.9

tR ((−)-15) = 11.0

rac-16 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

970 : 30 : 1

tR ((+)-16) = 10.1

tR ((−)-16) = 12.1

rac-11 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

990 : 10 : 1

tR ((+)-11) = 36.2

tR ((−)-11) = 46.0

rac-17 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

990 : 10 : 1

tR ((+)-17) = 13.7

tR ((−)-17) = 16.5

Page 227: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

BESTIMMUNG VON UMSÄTZEN UND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 213

Fortsetzung Tabelle 3.6:

rac-12 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

970 : 30 : 1

tR ((+)-12) = 21.0

tR ((−)-12) = 29.5

rac-18 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

970 : 30 : 1

tR ((+)-18) = 11.8

tR ((−)-18) = 17.7

rac-13 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-13) = 20.7

tR ((−)-13) = 24.0

rac-19 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-19) = 16.1

tR ((−)-19) = 22.9

rac-20 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-20) = 26.5

tR ((−)-20) = 29.3

rac-21 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-21) = 13.9

tR ((−)-21) = 15.2

rac-14 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-14) = 26.8

tR ((−)-14) = 39.9

rac-22 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-22) = 13.5

tR ((−)-22) = 19.4

rac-23 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-23) = 13.2

tR ((−)-23) = 18.3

rac-24 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-24) = 21.1

tR ((−)-24) = 26.3

rac-45 0.75 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH

950 : 50 : 1

tR ((+)-45) = 16.3

tR ((−)-45) = 20.0

a) Die Detektion erfolgte bei λ = 273 und 254 nm.

Page 228: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

214 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und

organischen Medium

3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im

wäßrigen Einphasen System (AAV 6)

Der racemische Ester (0.5 bis 2 mmol) wurde in 4 ml (10 Vol%) des organischen

Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 36 ml wäßriger

Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Dabei entstand häufig zuerst eine Trübung

durch Emulsionsbildung, die aber rasch verschwand und eine klare Lösung

hinterließ. Aufgrund der Basizität der Substrate wurde die Mischung anschließend

auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für

24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle

überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,

wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über

den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung

wurde durch einen pH-STAT Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten.

Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt.

Zur GC-Reaktionskontrolle wurden 0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden

mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt und zweimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan

extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit

Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur

Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für

ein bis zwei Tage kontinuierlich extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen

wurden anschließend mit Na2SO4 getrocknet, im Rotationsverdampfer eingeengt und

unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit.

3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-

organischen Zweiphasen System (AAV 7)

Der racemische Ester (0.5 bis 1 mmol) wurde in 5 ml MTBE gelöst und unter

kräftigem Rühren langsam zu einer Emulsion aus 20 ml wäßriger Phosphatpuffer-

Lösung (0.1 M) und 15 ml MTBE gegeben. Es entstand in allen Fällen eine klare

Page 229: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 215

Emulsion, die anschließend aufgrund der Basizität der Substrate auf den

gewünschten pH-Wert eingestellt wurde. Danach wurde die Reaktionslösung für

24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle

überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,

wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über

den gesamten Reaktionszeitraum heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion

entstand. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator

mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde

über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur GC-Reaktionskontrolle wurden

0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt

und dreimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde

abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette

gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung wurde die

Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für 48 Stunden kontinuierlich

extrahiert. Anschließend wurde die organische Phase mit Na2SO4 getrocknet, im

Rotationsverdampfer eingeengt und unter vermindertem Druck von

Lösungsmittelresten befreit.

3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in

organischen Lösungsmitteln (AAV 8)

Das racemische Substrat (0.25 mmol) und das Acylierungsmittel wurden in 5 ml des

organischen Lösungsmittels gelöst. Die Reaktionslösung wurde für 24 Stunden ohne

Enzym bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC- und GC-

Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion

stattgefunden hatte, wurde das Enzym zugegeben und die Mischung für einige

Minuten kräftig gerührt, um das Enzym möglichst fein zu verteilen. Danach wurde der

Ansatz über den restlichen Reaktionszeitraum langsam gerührt. Zur GC-

Reaktionskontrolle wurden 500 µl-Proben entnommen und zur Abtrennung von

Proteinen und eventuell vorhandenem MPEG mit 1.5 ml Dichlormethan über eine mit

Na2SO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette filtriert.

Page 230: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

216 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.2 Berechnung des E-Werts

Folgende Formeln wurden zur Berechnung der E-Werte benutzt6,106,108:

Formel 3.2: )]eec(1[1 ln)]eec(1[1 ln

EP

P

−−+−

= , für c < 50 %

Formel 3.3: )]eec)(1[(1 ln)]eec)(1[(1 ln

ES

S

+−−−

= , für c > 50 %

Formel 3.4: PS

Sber eeee

eeUmsatz

+=

Formel 3.5:

+

+

+

=

)/ee(ee1ee1

ln

)/ee(ee1ee1

ln

E

PS

S

PS

S

++

+−

=

)eeee)ee(1ee

ln

)ee(ee)ee(1ee

ln

SP

SP

SP

SP

(mit: c = Umsatz, Pee = ee-Wert des Produkts, See = ee-Wert des Substrats)

Alle E-Werte in dieser Arbeit wurden aus dem ee-Wert des Substrats und dem

ee-Wert des Produkts berechnet. Dazu wurde Formel 3.5, die sich aus Formel 3.4

eingesetzt in Formel 3.2 oder Formel 3.3 ergibt, verwendet.6 Von einer Berechnung

des E-Werts aus dem gemessenen Umsatz und nur einem ee-Wert wurde

abgesehen.

Page 231: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 217

3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-

dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15)

3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml Aceton und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die

Reaktion wurde nach 5 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.248 g einer Mischung aus Ester (+)-15

und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von

Aceton als Cosolvens

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

5 Min 52 % 27 % 46 % 4

3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

1.135 g (3.6 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die

Reaktion wurde nach 2 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 52 % durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach

Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;

Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.532 g (1.67 mmol, 47 %) (+)-15 und 0.428 g (1.72 mmol,

49 %) (−)-8 isoliert werden.

Page 232: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

218 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.8: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-15

Ausbeute

Ester (+)-15

ee Phenol

(−)-8

Ausbeute

Phenol (−)-8 E

2 h 62 % 47 % 47 % 49 % 13

3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

1.120 g (3.5 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die

Reaktion wurde nach 3 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 85 % durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach

Säulenchromatographie (CHCl3 : i-Propanol = 2 : 1 über Kieselgel, Rf ((−)-8) = 0.22;

Rf ((+)-15) = 0.01) konnten 0.560 g (2.25 mmol, 64 %) (−)-8 und 0.113 g (0.35 mmol,

10 %) (+)-15 isoliert werden.

(+)-15: D20][α = + 10.74º (c = 0.7, MeOH)

(−)-8: D20][α = − 3.43º (c = 1.5, MeOH)

Tabelle 3.9: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-15

Ausbeute

Ester (+)-15

ee Phenol

(−)-8

Ausbeute

Phenol (−)-8 E

3 h ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7

Page 233: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 219

3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im

wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 0.6 mg Acetylcholinesterase (AChE;

970 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 7.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.297 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol

(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.10: Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

7.5 h 3 % n. .b. n. .b. -

3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida antarctica Lipase

(CAL; 3.2 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion

wurde nach 3.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.310 g einer Mischung aus Ester (+)-15

und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.11: CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

3.75 h 8 % 3 % 3 % 1.1

Page 234: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

220 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im

wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Lipase aus Mucor miehei

(1.3 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.245 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol

(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.12: Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

19.5 h 25 % 11 % 30 % 2.1

3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Horse liver esterase (HLE;

0.74 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 4 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und

aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8

erhalten werden.

Tabelle 3.13: HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

4 h 31 % 17 % 51 % 4

Page 235: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 221

3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Cholesterolesterase (CE;

17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.231 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol

(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.14: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

24 h 90 % 72 % 39 % 5

3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL;

16.8 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.259 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol

(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.15: PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

2.5 h 66 % 19 % 78 % 10

Page 236: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

222 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Burkholderia cepacia Lipase

(BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion

wurde nach 22 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.318 g einer Mischung aus Ester (+)-15

und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.16: BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

22 h 35 % 75 % 67 % 11

3.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem mit roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 3 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und

aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8

erhalten werden.

Page 237: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 223

Tabelle 3.17: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen

Einphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

3 h 64 % 98 % 45 % 10

3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem mit roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden

0.316 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 45 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 3.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 51 % durch kontinuierliche

Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach

Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;

Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.203 g (0.64 mmol, 64 %) (+)-15 und 0.076 g (0.30 mmol,

30 %) (−)-8 isoliert werden.

(+)-15: D20][α = + 17.90º (c = 1.3, MeOH)

(−)-8: D20][α = − 11.45º (c = 2.0, MeOH)

Tabelle 3.18: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem mit roher CRL

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-15

Ausbeute

Ester (+)-15

ee Phenol

(−)-8

Ausbeute

Alkohol (−)-8 E

3.25 h 75 % 64 % 85 % 30 % 27

Page 238: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

224 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden

0.319 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 5.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 33 % durch kontinuierliche

Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach

Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;

Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.186 g (0.58 mmol, 58 %) (+)-15 und 0.068 g (0.27 mmol,

27 %) (−)-8 isoliert werden.

Tabelle 3.19: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRL

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-15

Ausbeute

Ester (+)-15

ee Phenol

(−)-8

Ausbeute

Alkohol (−)-8 E

5.25 h 58 % 58 % 90 % 27 % 34

3.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-

3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)

3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen

Einphasensystem mir roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 7.25 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

Page 239: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 225

und aufgearbeitet. Es konnten 0.286 g einer Mischung aus Ester (+)-16 und Phenol

(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.20: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E

7.25 h 45 % 4 % 26 % 2

3.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen

Einphasensystem bei pH 7.0

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die

Reaktion wurde nach 1.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit

Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung

aus Ester (+)-16 und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.21: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 7.0

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E

1.75 h 36 % 35 % 52 % 4

3.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen

Einphasensystem bei pH 8.0

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 80 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die

Reaktion wurde nach 45 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

Page 240: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

226 EXPERIMENTELLER TEIL

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.229 g einer Mischung aus Ester (+)-16

und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 8.0

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E

0.75 h 31 % 50 % 74 % 10

3.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethyl-

aminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8)

3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8

unter Verwendung verschiedener Lipasen

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in sieben

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) des

Phenols rac-8 mit 50 mg (0.50 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.23

aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.

Page 241: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 227

Tabelle 3.23: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols

rac-8

Enzym Enzymmenge Umsatz nach

14 d (GC)

Porcine pancreatic Lipase

(PPL; 16.8 U/mg) 100 mg 0 %

Burkholderia cepacia Lipase

(BCL, 40 U/mg) 15 mg 0 %

Candida rugosa Lipase

(CRL; 2.4 U/mg) 60 mg 2 %

Rhizopus niveus Lipase

(2.6 U/g) 50 mg 0 %

Candida antarctica Lipase

(CAL; 3.2 U/mg) 5 mg 0 %

Rhizopus arrhizus Lipase

(2 U/g) 50 mg 0 %

Aspergillus niger Lipase

(1 U/mg) 5 mg 0 %

3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8

mit Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des

Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.24 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 100 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL; 16.8 U/mg) umgesetzt. In allen

Reaktionen entstand vor Enzymzugabe eine klare Lösung. Die PPL bildete eine

Suspension, da das Enzym nicht löslich war. Nach 24 Stunden Reaktionszeit hatten

sich alle Reaktionen aufgrund einer Braunfärbung des Enzyms dunkel verfärbt.

Page 242: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

228 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.24: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8

mit Vinylacetat

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat

5 ml Dichlormethan (H2O ges.) 28 d 2 %

112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat

5 ml Trichlormethan (H2O ges.) 28 d 1 %

5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat 12 d 6 %

3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des

Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.25 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) umgesetzt. In allen

Reaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klaren

Reaktionslösung gegeben wurde.

Tabelle 3.25: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 mit Vinylacetat

Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert

Umsatz (GC) 3 %

ee Ester (−)-16 n. b. 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat

5 ml Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz (GC) 18 %

ee Ester (−)-16 10 % 5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat

ee Phenol (+)-8 2 %

1.2

Page 243: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 229

3.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des

Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.26 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 30 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) umgesetzt. In allen

Reaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klaren

Reaktionslösung gegeben wurde.

Tabelle 3.26: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit

Vinylacetat

Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert

Umsatz (GC) 2 %

ee Ester (−)-16 n. b. 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat

5 ml Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz (GC) 8 %

ee Ester (−)-16 n. b. 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat

5 ml MTBE ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz (GC) 36 %

ee Ester (−)-16 38 % 5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat

ee Phenol (+)-8 21 %

3

Umsatz (GC) 66 %

ee Ester (−)-16 33 % 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat

5 ml Dichlormethan ee Phenol (+)-8 26 %

2.5

Page 244: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

230 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit

Vinylbutyrat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des

Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.27 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In beiden

Reaktionen entstand eine weiße Suspension, da sowohl das Enzym unlöslich war,

als auch Anteile des Substrat sich nicht vollständig lösten.

Tabelle 3.27: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit

Vinylbutyrat

Reaktionsbedingungen 17 d E-Wert

Umsatz (GC) 4 %

ee Ester (−)-15 n. b.

143 mg (1.25 mmol)

Vinylbutyrat

5 ml Dichlormethan ee Phenol (+)-8 n. b.

-

Umsatz (GC) 15 %

ee Ester (−)-15 28 % 5 ml (39 mmol)

Vinylbutyrat ee Phenol (+)-8 15 %

2

3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols

rac-8

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.063 g (0.25 mmol) des

Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.28 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 45 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.

Page 245: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 231

Tabelle 3.28: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols

rac-8

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat

5 ml Dichlormethan 21 d 0 %

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat

5 ml Trichlormethan 21 d 0 %

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 4 d 5 %

3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-

(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)

3.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 40 µl (0.4 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die

Reaktion wurde nach 25 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.104 g einer Mischung aus Ester 17

und Phenol 11 erhalten werden.

Tabelle 3.29: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E

25 Min. 69 % 7 % 1 % 1.1

Page 246: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

232 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen

Einphasensystem mit roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.128 g einer Mischung aus Ester 17 und Phenol 11

erhalten werden.

Tabelle 3.30: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E

2.5 h 17 % 1 % 3 % 1.1

3.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-

(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)

unter Verwendung verschiedener Lipasen

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in fünf

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) des

Phenols rac-11 mit 125 mg (0.50 mmol) Vinyllaurat und der in Tabelle 3.31

aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.

Page 247: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 233

Tabelle 3.31: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols

rac-11

Enzym Enzymmenge Umsatz nach

14 d (GC)

Burkholderia cepacia Lipase

(BCL, 40 U/mg) 100 mg 0 %

Candida rugosa Lipase

(CRL; 2.4 U/mg) 60 mg 0 %

Candida antarctica Lipase

(CAL; 3.2 U/mg) 10 mg 0 %

Rhizopus arrhizus Lipase

(2 U/g) 50 mg 0 %

Aspergillus niger Lipase

(1 U/mg) 5 mg 0 %

3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-

dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-

ester (rac-18)

3.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.174 g (0.50 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 50 µl (0.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die

Reaktion wurde nach 5.75 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 40 % durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach

Säulenchromatographie (EE : MeOH : TEA = 50 : 50 : 1 an Kieselgel,

Page 248: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

234 EXPERIMENTELLER TEIL

Rf ((−)-18) = 0.32; Rf ((+)-12) = 0.15) konnten 0.082 g (0.23 mmol, 47 %) (−)-18 und

0.042 g (0.15 mmol, 30 %) (+)-12 isoliert werden.

(−)-18: D20][α = − 6.01º (c = 1.50, MeOH)

(+)-12: D20][α = + 21.70º (c = 0.80, MeOH)

Tabelle 3.32: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-18

Ausbeute

Ester (−)-18

ee Alkohol

(+)-12

Ausbeute

Alkohol (+)-12 E

5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89

3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war zu Beginn stark getrübt, am Ende der

Reaktionszeit klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 4.75 Stunden bei Umsatz

(GC) von ca. 49 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 an

Kieselgel, Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.216 g (0.62 mmol, 43 %)

(+)-18 und 0.162 g (0.58 mmol, 41 %) (−)-12 isoliert werden.

(+)-18: D20][α = + 7.03º (c = 0.72, MeOH)

(−)-12: D20][α = − 28.30º (c = 1.00, MeOH)

Page 249: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 235

Tabelle 3.33: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen

Einphasensystem

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-18

Ausbeute

Ester (+)-18

ee Alkohol

(−)-12

Ausbeute

Alkohol (−)-12 E

4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133

3.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.5, dazu wurden

0.349 g (1.0 mmol) des Esters rac-18 in 26 ml MTBE und 26 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 6 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 72 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 45 % durch kontinuierliche

Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach

Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 an Kieselgel,

Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.140 g (0.40 mmol, 40 %) (+)-18 und

0.110 g (0.39 mmol, 39 %) (−)-12 isoliert werden.

(+)-18: D20][α = + 7.03º (c = 0.72, MeOH)

(−)-12: D20][α = − 28.30º (c = 1.00, MeOH)

Tabelle 3.34: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-18

Ausbeute

Ester (+)-18

ee Alkohol

(−)-12

Ausbeute

Alkohol (−)-12 E

72 h ≥98 % 40% ≥98 % 39 % >200

Page 250: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

236 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.2, dazu wurden

0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 25 ml MTBE und 25 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.2) gelöst und mit 13 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

25.9 U/mg) versetzt. Nach 48 Stunden bei einem Umsatz von ca. 50 % wurde zum

Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst einmal mit

40 ml MTBE extrahiert und anschließend dreimal mit je 30 ml Diethylether. Die

vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im

Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.254 g (0.73 mmol, 50.8 %) farbloser,

öliger Ester (+)-18 mit einem ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Die verbliebene

wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von

Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.

Anschließend wurde viermal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die

vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am

Rotationsverdampfer wurden 0.184 g (0.66 mmol, 46.1 %) Alkohol (−)-12 mit einem

ee-Wert von 97 % erhalten.

(+)-18: D20][α = + 7.9º (c = 0.69, MeOH)

(−)-12: D20][α = − 28.60º (c = 0.93, MeOH)

Tabelle 3.35: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen

Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-18

Ausbeute

Ester (+)-18

ee Alkohol

(−)-12

Ausbeute

Alkohol (−)-12 E

48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200

Page 251: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 237

3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18

im wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.5, dazu wurden

0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 60 mg Novozym 435 (immobilisierte

CAL-B) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos, das immobilisierte

Enzym unlöslich. Die Reaktion wurde nach 45 Stunden durch kontinuierliche

Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g

Ester rac-18 erhalten werden.

Tabelle 3.36: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester 18 ee Alkohol 12 E

45 h 0 % - - -

3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.245 g (0.70 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-B;

154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 46 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.240 g einer Mischung aus Ester (+)-18 und Alkohol

(−)-12 erhalten werden.

Tabelle 3.37: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E

46 h 7 % 8 % n. b. -

Page 252: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

238 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethyl-

aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)

3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12

mit Isopropenylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-12 mit jeweils 5 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unter

den in Tabelle 3.38 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt. Zu Beginn der

Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständig

löslich war. Nach 24 Stunden waren die Reaktionen, die in Toluol durchgeführt

wurden, klar.

Tabelle 3.38: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12

mit Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

145 mg (1.45 mmol) Isopropenylacetat,

5 ml Toluol 20 d 3 %

5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat 20 d 3 %

3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Vinylpropionat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-12 mit jeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unter

den in Tabelle 3.39 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt.

Tabelle 3.39: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Vinylpropionat

Page 253: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 239

Reaktions-

bedingung 8 d E-Wert 13 d E-Wert

Mittel

E-Wert

Umsatz (GC) 11 % 12 %

ee Ester (−)-46 94 % 95 %

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 8 %

34

12 %

43 38

Umsatz (GC) 5 % n. b.

ee Ester (−)-46 91 % n. b. 5 ml (49.95 mmol)

Vinylpropionat ee Alkohol (+)-12 4 %

22

n. b.

- 22

3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Vinylpropionat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.40 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn der

Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da Substrat und Enzym nicht

vollständig löslich waren. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluol

durchgeführt wurde, klar.

Page 254: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

240 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.40: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Vinylpropionat

Reaktionsbedingung 3 d

(%)

6 d

(%)

8 d

(%)

11 d

(%)

16 d

(%)

Umsatz (GC) 0 2 2 3 -

ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 -

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

5 ml Diisopropylether ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 -

Umsatz (GC) 37 57 58 58 -

ee Ester (−)-46 94 91 96 89 -

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 -

Umsatz (GC) 23 41 48 53 58

ee Ester (−)-46 88 84 86 82 79 5 ml (49.95 mmol)

Vinylpropionat ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90

Tabelle 3.41: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12

mit Vinylpropionat

Reaktionsbedingungen 3 d 6 d 8 d 11 d 16 d Mittel

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,

5 ml Diisopropylether - - - 19 - 19

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,

5 ml Toluol

56 89 >200 89 - 109

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 19 19 26 27 25 23

Page 255: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 241

3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Isopropenylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.42 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn der

Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständig

löslich war. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluol durchgeführt wurde,

klar.

Tabelle 3.42: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit

Isopropenylacetat

Reaktionsbedingung 2 d 5 d 14 d 20 d

Umsatz (GC) 19 % 34 % 47 % 58 %

ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 %

145 mg (1.45 mmol)

Isopropenylacetat,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 %

Umsatz (GC) 3 % 5 % 13 % 16 %

ee Ester (−)-47 n. b. 10 % 24 % 24 % 5 ml (70 mmol)

Isopropenylacetat ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4 % 6 %

Tabelle 3.43: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12

mit Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen 2 d 5 d 14 d 20 d Mittel

145 mg (1.45 mmol)

Isopropenylacetat, 5 ml Toluol

n. b. >200 67 94 120

5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat n. b. n. b. 2 2 2

Page 256: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

242 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-12

a) mit 7 mg MPEG/PLE

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.44 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 7 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) in 5 ml Toluol

umgesetzt.

Tabelle 3.44: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-12

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 3 %

125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0 %

b) mit 45 mg PLE/MPEG

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.45 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 45 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.

Page 257: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 243

Tabelle 3.45: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-12

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat

5 ml Dichlormethan 21 d 2 %

125 mg (1.25 mmol Vinylpropionat

5 ml MTBE 4 d 1 %

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 21 d 3 %

3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-12

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols

rac-12 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat unter den in Tabelle 3.46

aufgeführten Reaktionsbedingungen und mit der dort angegebenen Menge an

Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE, 1.5 % Proteingehalt) umgesetzt.

In beiden Reaktionen entstanden klare Lösungen. Die Farbe des PLE/BSA-

Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-

braun.

Tabelle 3.46: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-12

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

55 mg PLE/BSA/MPEG in 5 ml Dichlormethan 11 d 0 %

45 mg PLE/BSA/MPEG, 12 µl H2O in 6 ml Toluol 11 d 0 %

Page 258: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

244 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-

Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexylester (rac-19)

3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter

Verwendung verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in sieben verschiedenen

Ansätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in

4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit

der in Tabelle 3.47 angegebenen Menge der jeweiligen Lipase versetzt. Die

Reaktionen wurden nach der in Tabelle 3.47 angegebenen Reaktionszeit durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Die

erhaltenen Ausbeuten sind in Tabelle 3.47 angegeben.

Page 259: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 245

Tabelle 3.47: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter

Verwendung verschiedener Lipasen

Enzym Enzym-

menge

Reaktions-

zeit

Ausbeute

Ester 19

Umsatz

(GC)

Cholesterolesterase

(CE; 17.5 U/mg)

25 mg 24 h 181 mg 1 %

Candida rugosa Lipase

(CRL; 37 U/mg)

5 mg 29 h 190 mg 0 %

Chirazyme L-2

(CAL-B; 155 U/mg)

10 mg 45 h 195 mg 0 %

Burkholderia cepacia Lipase

(BCL; 0.09 U/mg)

20 mg 45 h 200 mg 0 %

Burkholderia cepacia Lipase

(BCL, 40 U/mg)

30 mg 46 h 194 mg 0 %

Porcine pancreatic Lipase

(PPL; 16.8 U/mg)

40 mg 23 h 195 mg 1 %

Chromobacterium viscosum

Lipase (CVL, 3.58 U/mg)

2 mg 69 h 200 mg 0 %

3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im

wäßrig-organischen Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu

wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 69 Stunden durch kontinuierliche

Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.184 g

Ester 19 erhalten werden.

Page 260: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

246 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.48: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im

wäßrig-organischen Zweiphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

69 h 1 % n. b. n. b. -

3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im

wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 200 µl (2.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die

Reaktion wurde nach 41 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.191 g Ester 19 erhalten werden.

Tabelle 3.49: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

41 h 0 % - - -

3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von

(±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-

cyclohexan-1,3-diol (rac-13)

3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol

rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Page 261: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 247

Alkohols rac-13 mit 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.50

aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Toluol versetzt.

Tabelle 3.50: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol

rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen

Enzym Enzymmenge Umsatz nach

3 h (GC)

Umsatz nach

72 h (GC)

Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) 5 mg 0 % 0 %

Porcine pancreatic Lipase (PPL; 16.8 U/mg) 20 mg 0 % 0 %

Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) 10 mg 0 % 0 %

Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) 10 mg 0 % 1 %

3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von

Alkohol rac-13

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-13 unter den in Tabelle 3.51 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 20 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt.

Page 262: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

248 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.51: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von

Alkohol rac-13

Reaktionsbedingungen Umsatz nach

66 h (GC)

Umsatz nach

6 d (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,

5 ml Toluol 1 % 1 %

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,

5 ml Dichlormethan 0 % 0 %

125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat

5 ml Toluol 1 % 1 %

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 1 % 1 %

3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol

rac-13 unter Zusatz von Triethylamin

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-13 mit 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat und 50 mg (0.36 mmol)

Triethylamin sowie der in Tabelle 3.52 aufgeführten Menge Lipase versetzt.

Tabelle 3.52: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol

rac-13 unter Zusatz von Triethylamin

Enzym Enzym-

menge

Umsatz nach

5 d (GC)

Umsatz nach

12 d (GC)

Novozym 435

(immobilisierte CAL-B) 30 mg 2 % 4 %

Chromobacterium viscosum Lipase

(CVL, 3.58 U/mg) 1 mg 0 % 1 %

Burkholderia cepacia Lipase

(BCL, 40 U/mg) 10 mg 0 % 0 %

Page 263: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 249

3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-

dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)

3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 7.5 mg Cholesterolesterase (CE;

17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.107 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol

(−)-20 erhalten werden.

Tabelle 3.53: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

16.75 h 64 % 71 % 11 % 2

3.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.184 g (0.55 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die

Reaktion wurde nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit

Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.116 g einer Mischung

aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.

Page 264: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

250 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.54: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

3.25 h 82 % 20 % 6 % 1.3

3.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 18.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.141 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol

(−)-20 erhalten werden.

Tabelle 3.55: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im Einphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

18.5 h 40 % 31 % 17 % 2

3.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu

wurden 0.162 g (0.48 mmol) des Esters rac-21 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 46 Stunden durch kontinuierliche

Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.138 g

einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.

Page 265: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 251

Tabelle 3.56: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im Zweiphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

46 h 57 % 89 % 28 % 5

3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-

dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-

ester (rac-22)

3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im

wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.5, dazu

wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 20 mg Burkholderia cepacia

Lipase (BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Da nach

22 Stunden Reaktionszeit noch kein Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert

werden konnte, wurden die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die restliche

Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit wurde durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es

konnten 0.187 g Ester rac-22 erhalten werden.

Tabelle 3.57: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

48 h 0 % - - -

Page 266: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

252 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu

wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Novozym 435

(immobilisierte CAL-B) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos; das

immobilisierte Enzym unlöslich. Da nach 19 Stunden Reaktionszeit noch kein

Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert werden konnte, wurden weitere 40 mg

Novozym 435 zur Reaktionslösung gegeben. Nach insgesamt 10 Tagen

Reaktionszeit wurde durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g Ester rac-22 erhalten werden.

Tabelle 3.58: Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

10 d 35 % 67 % 85 % 24

3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu

wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-

B; 154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde

nach 45 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

und aufgearbeitet. Es konnten 0.181 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol

(−)-14 erhalten werden.

Page 267: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 253

Tabelle 3.59: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

45 h 7 % 9 % ≥98 % >200

3.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu

wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase

(CRL; 25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion

wurde nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.180 g einer Mischung aus Ester (+)-22

und Alkohol (−)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.60: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

24 h 27 % 38 % 92 % 34

3.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.5, dazu

wurden 0.350 g (1.0 mmol) des Esters rac-22 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase (CRL;

25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion

wurde nach 5 Tagen durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

Page 268: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

254 EXPERIMENTELLER TEIL

und aufgearbeitet. Es konnten 0.226 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol

(−)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.61: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen

Zweiphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

5 d 34 % 37 % 69 % 8

3.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß in zwei Reaktionen nach AAV 6

bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-

Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit jeweils

20 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar

und farblos. Die Reaktionen wurden nach 2.5 Stunden und 18.5 Stunden durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es

konnten 0.189 g und 0.185 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14

erhalten werden.

Tabelle 3.62: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200

19.5 h 38 % 67 % 93 % 55

Page 269: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 255

3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu

wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Cholesterolesterase

(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch

der Reaktion nach 22.5 Stunden und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung

dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen

wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten

0.105 g (0.30 mmol, 53 %) (+)-22 mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden. Die

verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem

Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10

eingestellt. Anschließend wurde dreimal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und

die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am

Rotationsverdampfer wurden 0.071 g (0.25 mmol, 45 %) (−)-14 mit einem ee-Wert

von 91 % erhalten.

(+)-22: D20][α = + 14.14º (c = 1.02, MeOH)

(−)-14: D20][α = − 34.75º (c = 1.05, MeOH)

Tabelle 3.63: CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver

Aufarbeitung

Reaktions-

zeit

ee Ester

(+)-22

Ausbeute

Ester (+)-22

ee Alkohol

(−)-14

Ausbeute

Alkohol (−)-14 E

22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67

Page 270: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

256 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu

wurden 0.221 g (0.57 mmol) des Esters rac-22⋅HCl in 4 ml tert-Butanol und 36 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 20 mg Cholesterolesterase

(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion

wurde nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.166 g einer Mischung aus Ester (+)-22

und Alkohol (−)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.64: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

19.5 h 43 % 86 % 94 % 89

3.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden

0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 75 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die

Reaktion wurde nach 16.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit

Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung

aus Ester (−)-22 und Alkohol (+)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.65: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E

16.5 h 18 % 22 % 93 % 34

Page 271: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 257

3.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen

Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 1.9 mg Chirazyme E1 (PLE,

Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch der

Reaktion nach 42 Stunden, bei einem Umsatz von ca. 22 %, und zur Aufarbeitung

wurde die Reaktionslösung zunächst zweimal mit je 30-40 ml MTBE und

anschließend mit dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer

eingeengt. Es konnten 0.147 g (0.42 mmol, 74 %) (−)-22 mit einem ee-Wert von

27 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer

unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von

Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml

Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4

getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.037 g (0.13 mmol,

23 %) (+)-14 mit einem ee-Wert von 97 % erhalten.

Tabelle 3.66: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz

von Aceton als Cosolvens

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-22

Ausbeute

Ester (−)-22

ee Alkohol

(+)-14

Ausbeute

Alkohol (+)-14 E

42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85

Page 272: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

258 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester

rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem

Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22

(rac-22⋅HCl) unter Zusatz von Aceton als Cosolvens

1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl wurden zu einer Mischung aus 2 ml (16 Vol%) Aceton

und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 7.0) gegeben. Die Lösung

wurde anschließend auf pH 7.0 eingestellt. Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle

überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,

wurden 9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurde

der Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig

gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator

mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde

über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden

analog zur AAV 6 zehn 100 µl Proben entnommen. Nach 24 Stunden wurde zum

Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst viermal

mit je 30-40 ml MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit

Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.591 g

(1.69 mmol, 65 %) farbloser, öliger Ester (−)-22 mit einem ee-Wert von 28 % isoliert

werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter

vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3

auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan

extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach

Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.165 g einer Mischung aus 82 %

(0.46 mmol, 18 %) Alkohol (+)-14 mit einem ee-Wert von 91 % und 18 % (0.10 mmol,

4 %) Ester (−)-22 (mit einem ee-Wert von 28 %) erhalten.

(−)-22: D20][α = − 4.62º (c = 0.96, MeOH)

(+)-14: D20][α = + 26.40º (c = 0.32, MeOH)

Page 273: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 259

Tabelle 3.67: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter

Zusatz von Aceton als Cosolvens

Reaktions-

zeit

Umsatz (HPLC)

(%)

ee Ester (−)-22

(%)

ee Alkohol (+)-14

(%)

E

1 h 2 2 ≥98 -

1.5 h 3 3 ≥98 -

3 h 4 5 ≥98 -

4.25 h 7 7 ≥98 -

5.25 h 8 9 ≥98 -

7.25 h 10 11 ≥98 -

22.5 h 20 26 95 50

Tabelle 3.68: Ergebnis nach Aufarbeitung der Chirazyme E1-katalysierten

Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-22

Ausbeute

Ester (−)-22

ee Alkohol

(+)-14

Ausbeute

Alkohol (+)-14 E

24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27

Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22⋅HCl

mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens

In zwei parallelen Versuchen wurde 1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl einmal zu einer

Mischung aus 2 ml Aceton (16 Vol%) und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung

(0.1 M, pH 7.25) und ein zweitesmal zu 12.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung

(0.1 M) gegeben. Die Lösungen wurden anschließend auf pH 7.25 eingestellt.

Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-

enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde zu beiden Versuchen jeweils

9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurden die

Ansätze über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Aufgrund eines

technischen Defekts fiel die Temperatur nach 8 Stunden für die restliche

Page 274: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

260 EXPERIMENTELLER TEIL

Reaktionszeit drastisch ab. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden analog zur AAV 6

100 µl Proben entnommen.

Tabelle 3.69: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne

Zusatz von Aceton als Cosolvens

mit Zusatz von Aceton ohne Zusatz von Aceton

Zeit

(h)

Umsatz

(HPLC)

(%)

ee Ester

(−)-22

(%)

ee Alkohol

(+)-14

(%)

Umsatz

(HPLC)

(%)

ee Ester

(−)-22

(%)

ee Alkohol

(+)-14

(%)

2.5 6 n. b. ≥98 8 n. b. ≥98

5 7 9 ≥98 18 21 ≥98

7.5 8 13 ≥98 21 31 98

22 16 20 ≥98 36 47 98

27 13 22 ≥98 38 59 90

30 17 23 ≥98 38 61 89

48 15 27 ≥98 36 65 88

103 17 30 ≥98 43 74 85

175 21 29 ≥98 42 75 85

Page 275: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 261

Tabelle 3.70: E-Werte der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl

mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens

Reaktionszeit

(h)

mit Zusatz von Aceton

E-Wert

ohne Zusatz von Aceton

E-Wert

2.5 >200 >200

5 >200 >200

7.5 >200 134

22 >200 157

27 >200 34

30 >200 31

48 >200 30

103 >200 27

175 >200 27

3.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-

dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-

ester (rac-23)

3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen

Einphasensystem mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.432 g (1.14 mmol) des Esters rac-23 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml

wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3.8 mg Chirazyme E1 (PLE,

Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war während der ersten Stunden der

Reaktion stark getrübt, in Laufe der Reaktion verschwand diese Trübung. Nach

24 Stunden wurde zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die

Reaktionslösung zunächst dreimal mit je 30-40 ml MTBE und dann dreimal mit je

25 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit

Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.234 g

Page 276: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

262 EXPERIMENTELLER TEIL

(0.62 mmol, 54 %) durch Spuren von Hexansäure penetrant ziegenähnlich

riechender Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % isoliert werden. Die verbliebene

wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von

Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.

Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die

vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am

Rotationsverdampfer wurden 0.146 g (0.52 mmol, 46 %) (+)-14 als Öl mit einem ee-

Wert von 77 % erhalten.

(−)-23: D20][α = − 6.70º (c = 1.93, MeOH)

(+)-14: D20][α = + 25.83º (c = 0.9, MeOH)

Tabelle 3.71: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz

von Aceton als Cosolvens

Reaktions-

zeit

ee Ester

(−)-22

Ausbeute

Ester (−)-22

ee Alkohol

(+)-14

Ausbeute

Alkohol (+)-14 E

24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24

3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-

Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol

(rac-14)

3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.72 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionen

entstand eine klare Lösung in der das unlösliche Enzym suspendiert war.

Page 277: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 263

Tabelle 3.72: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14

Reaktionsbedingungen 16 d E-Wert

Umsatz (GC) 18 %

ee Ester (−)-24 44 %

108 mg (1.5 mmol)

Vinylacetat

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 72 %

5

Umsatz (GC) 11 %

ee Ester (−)-24 47 % 5 ml (54 mmol)

Vinylacetat ee Alkohol (+)-14 48 %

4

Umsatz (GC) 25 %

ee Ester (−)-24 68 %

125 mg (1.5 mmol)

Isopropenylacetat

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 87 %

14

Umsatz (GC) 12 %

ee Ester (−)-24 77 % 5 ml (70 mmol)

Isopropenylacetat

ee Alkohol (+)-14 35 %

10

3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.73 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der

Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten

alle Reaktionen eine milchige Trübung.

Page 278: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

264 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.73: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylacetat

Reaktionsbedingungen 48 h E-Wert

Umsatz (HPLC) 70 %

ee Ester (−)-24 90 %

129 mg (1.5 mmol)

Vinylacetat,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 67 %

38

Umsatz (HPLC) 79 %

ee Ester (−)-24 90 %

125 mg (1.25 mmol)

Vinylacetat,

5 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

99

3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit

Vinylpropionat

a) mit 10 mg Novozym 435

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.74 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der

Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten

alle Reaktionen eine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz war

zusätzlich noch ein weißer Niederschlag zu erkennen.

Page 279: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 265

Tabelle 3.74: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert

durch 10 mg Novozym 435

Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert

Umsatz (HPLC) 51 %

ee Ester (−)-45 92 %

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 95 %

89

Umsatz (HPLC) 35 %

ee Ester (−)-45 89 %

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

10 µl H2O, 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 56 %

30

Umsatz (HPLC) 50 %

ee Ester (−)-45 98 %

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

5 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 86 %

>200

Umsatz (HPLC) 52 %

ee Ester (−)-45 97 % 5 ml (49.95 mmol)

Vinylpropionat ee Alkohol (+)-14 88 %

192

b) mit 5 mg Novozym 435

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.75 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 5 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der

Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Bis auf die Reaktion unter

Zusatz von Triethylamin zeigten die anderen Reaktion nach ca. 48 Stunden eine

milchige Trübung.

Page 280: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

266 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.75: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert

durch 5 mg Novozym 435

Reaktionsbedingung 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h

Umsatz (HPLC) 51 % 53 % 52 % 53 %

ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 % 91 %

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % 95 % ≥98 %

Umsatz (HPLC) 50 % 53 % 52 % 52 %

ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 % 92 % 5 ml (49.95 mmol)

Vinylpropionat ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 % ≥98 %

Umsatz (HPLC) 54 % 55 % 56 % 56 %

ee Ester (−)-45 92 % 93 % 93 % 91 %

125 mg (1.25 mmol)

Vinylpropionat,

6 mg Triethylamin,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 % ≥98 %

Tabelle 3.76: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des

Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat

Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h Mittel

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,

5 ml Toluol

49 97 78 111 84

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 81 144 125 125 119

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,

6 mg Triethylamin, 5 ml Toluol 125 144 144 111 131

Page 281: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 267

3.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit

Isopropenylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8. Dazu wurde

0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.77 aufgeführten

Reaktionsbedingungen mit 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt.

Die Reaktionslösungen war über die gesamten Reaktionszeit klar und farblos.

Tabelle 3.77: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit

Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert

Umsatz (HPLC) 51 %

ee Ester (−)-24 94 %

125 mg (1.25 mmol)

Isopropenylacetat,

5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

170

3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-14

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei

verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.78 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit

jeweils 7 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE) in 5 ml Toluol umgesetzt.

Tabelle 3.78: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols

rac-14 in Toluol

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 2 %

125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0 %

Page 282: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

268 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-14

Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g

(0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 108 mg (1.25 mmol) Vinylacetat mit 60 mg

PLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE) in 6 ml Toluol umgesetzt. Es entstand eine klare

Lösung. Die Farbe des PLE/BSA-Katalysators änderte sich im Laufe der

Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-braun.

Tabelle 3.79: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-14

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E

11 d 0 % - - -

3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des

Alkohols rac-14

Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g

(0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat mit 5 mg

Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) in 5 ml Toluol umgesetzt.

Tabelle 3.80: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des

Alkohols rac-14

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E

47.75 h 2 % ≥98 % 3 % -

Page 283: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 269

3.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-

Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-

phenyl)-cyclohexylester (rac-25)

3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im

wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in zwei verschiedenen

Ansätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in

4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit

der in Tabelle 3.81 angegebenen Mengen des jeweiligen Enzyms umgesetzt. Nach

der in Tabelle 3.81 angegebenen Reaktionszeit wurden die Reaktionen durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet.

Tabelle 3.81: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Enzym Enzym-

menge

Reaktions-

zeit

Ausbeute

Ester 25

Umsatz

(GC)

Cholesterolesterase

(CE; 17.5 U/mg)

30 mg 25 h 165 mg 0 %

Candida rugosa Lipase

(CRL; 37 U/mg)

10 mg 44 h 195 mg 0 %

3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden

0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in 6 ml Aceton und 34 ml wäßriger

Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-

Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Nach 42 Stunden wurde die Reaktion durch

kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es

konnten 0.199 g Ester 25 erhalten werden.

Page 284: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

270 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.82: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

42 h 1 % - - -

Page 285: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

ANHANG ZUM EXPERIMENTELLEN TEIL 271

3.7 Anhang zum experimentellen Teil

3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch

Verseifung von Buttersäureethylester

Mode STAT

Regelparameter Endpunkt pH 8.00

Regelbereich 0.5

Max. Rate 10.0 ml/Min.

Min. Rate 25.0 µl/Min.

Titrationsparameter Start V aus

Start 0 s

Start pH aus

Startrate aus

Zeitintervall 60 s

Titrationsrichtung +

Meßeingang 1

Abbruchbedingungen Stoppzeit abs. 7000 s

Stoppvolumen abs. 99.99 ml

Stopprate aus

Füllgeschwindigkeit max

Statistik Status aus

Auswertung U. Grenze 1 aus

Fix-V1 bis Fix-V9 alle 600 s (→ C51 bis C59)

Fix-Zeit 1 aus

Überwachung Alle Unterpunkte aus

Vorwahl Ident. abfragen aus

Einmass abfragen alle (→ C00)

Rate anzeigen aus

Pa

ram

ete

r

Aktivierpuls aus

c-fml C01=0.01

Formel RS1 = (C52 − C51) / (C00 ∗ C01) = 10 – 20 Min. [U]

Report Kurve, voll, Liste

Page 286: Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

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287

5 Lebenslauf

Name: Carsten Griebel

Geburtstag: 12.11.1971

Geburtsort: Niebüll

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulausbildung:

08/1978 – 06/1982 Grundschule Emmelsbüll-Horsbüll

08/1982 – 07/1989 Friedrich-Paulsen-Schule Niebüll, Gymnasium des Kreises Nordfriesland

08/1989 – 06/1991 Städtisches Mathematisch-Naturwissenschaftliches Gymnasium Mönchengladbach

06/1991 Allgemeine Hochschulreife (Abitur)

Studium:

10/1991 – 03/1998 Diplomstudiengang Chemie an der Rheinisch- Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

06/1994 Vordiplom

10/1997 – 03/1998 Diplomarbeit am Institut für Organische Chemie der RWTH-Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais mit dem Titel: „Enzymatische Racematspaltungen von phenolischen Analgetika“

03/1998 Abschluß: Diplom-Chemiker

Promotion:

04/1998 – 02/2002 Dissertation bei Prof. Dr. H.-J. Gais am Institut für Organische Chemie der RWTH-Aachen mit Thema: „Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol–Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit“

13.12.2002 Tag der mündlichen Prüfung


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