Genregulation
Literatur
- Alberts/Lehninger- Kim Sneppen & G. Zocchi: Physics in Molecular Biology- E. Klipp et al. : Systems Biology in Practice
Vorlesung System-Biophysik 11. Dez. 2007
Physik der Transkriptionskontrolle und Expressionsanalyse
Vom genetischen zum systemischen Ansatz
Genregulation
mRNA Regulation
DNA Mutationen / Evolution
Proteinfunktionen
Raumzeitliche StrukturbildungMorphogenese
Signaltransduktion=> Themen der Systembiophysik
Biologische Musterbildung und Morphogenese30. Okt 07
!
E + Sk1" # " ES
k2" # " E + P
!
k"1# $ $
Enzymatische ReaktionenMichaelis-Menton-KinetikInhibierung, Regelung
Reaktions-Diffusions-Modell von „Morphogenen“
Biochemische Netzwerke
Modell-System E.coli
E.coli besitzt ein einziges DNA Molekül mit 4.6 106 Basenpaaren. Es kodiertfür 4226 Proteine und einige RNA Moleküle. Der Informationsgehalt desGenoms übersteigt die Strukturinformation der exprimierten Proteine.-> regulatorische Mechanismen sind auf dem Genom kodiert.
Genregulation erlaubt Anpassung an UmweltveränderungenSteuerung des Metabolischen Netzwerks (Stoffwechsel)
Inhalt
Grundlagen: Monod Modell, Lac OperonStatistische Physik DNA-bindender ProteineModellierung genregulatorischer Netzwerke(ODE & Boolsche Netze)Dynamik der Protein-DNA BindungDNA loopingAnalyse von GenexpressionsdatenSynthetische Netzwerke (Seminar)
Das Operon-Modell
operon
Operon: Genetische Funktionseinheit, die aus regulierten Genen mit verwandter Funktionbesteht und enthält:- Promotor: Bindungsstelle für RNA-Polymerase- Operator: kontrolliert Zugang der RNA-Polymerase zu Strukturgen- Strukturgene: Polypeptide codierende Gene
Francois Jacob und Jaques Monod, 1961
Der Trp Operator als Schalter:• Innerhalb des Promoters liegt eine kurz Region regulatorischer DNA,
die als Bindungsstelle eines Repressors arbeitet. Bindet der Repressor,so ist das Ankoppeln der RNA Pol sterisch unterdrückt.
Die Aussenseite von DNA kannvon Proteinen erkannt werden:
Die verschiedenen Basenpaarewerden anhand ihrer Ränder erkannt=> DNA-Bindungsmotive
Durch Bindung des Tryptophan an das Tryptophan-Repressorprotein wir die Konformation des Repressors verändert
Identifizierung von Promoter Sequenzen
Transkriptions-Aktivatorproteine schalten Gene ein
Gen-Regulation mit Feedback:lac-Operon
LacI
IPTG, TMG
Campbell, N.A., Biology
A cis-regulatory element or cis-element is a region of DNA or RNA that regulatesthe expression of genes located on that same strand. This term is constructed fromthe Latin word cis, which means "on the same side as". These cis-regulatoryelements are often binding sites of one or more trans-acting factors.
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)This compound is used as a molecular mimic of allolactose, a lactosemetabolite that triggers transcription of the lac operon. Unlike allolactose, the sulfur (S) atom creates a chemical bond which isnon-hydrolyzable by the cell, preventing the cell from "eating up" or degrading the inductant. IPTG induces activity of beta-galactosidase, an enzyme that promotes lactose utilization, by binding and inhibiting the lac repressor. In cloning experiments,the lacZ gene is replaced with the gene of interest and IPTG is then used to induce gene expression.
Non-metabolizable inducer are used to inducegene expression
Variation der Protein-Konzentration mit IPTG
Northern Blot: Bestimme die Konzentration von messenger RNA (mRNA)
Externe und interne Induktor-Konzentration gleich, sobald System im GleichgewichtDie Konzentration von mRNA nimmt bis 60% monoton mit der Induktor-Konzentrationzu, bei höheren Konzentrationen Sättigung
Operon ermöglicht Variation der Protein-Konzentration. Wasfehlt noch zum Schalter?
60
40
20
0
[mR
NA
]
0.100.00
[IPTG Induktor]Long, C et al, J.Bacteriol. 2001
Transkription und Translation in E.coliTypische Zeiten und Raten
1 Molekül / Zelle = 1nMGesamtmasse 2.5 106 Da
TRANSKRIPTIONInitierungsrate 1/s - 1/18sTranskriptionsrate: 30bps-90bps
TRANSLATION10.000-15.000 RibosomeTranslationsrate 6-22 codons/s(40 Proteine/mRNA)
The arabinose system1
Uptake
Reporter
Regulator
Break down
pBAD24 2~55 copies/cell
[1] R. Schleif. Trends in Genetics, 16(12):559–565, 2000[2] L. M. Guzman, D. Belin, M. J. Carson, and J. Beckwith. J.Bacteriol., 177(14):4121–4130, 1995[3] D. A. Siegele and J. C. Hu. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(15):8168–8172, 1997
automated data aquisition
define ROIs
measure total intensity
DICtn
N
DICt0
Fluorescencet0
t1
tn
background correction
calibration and conversion into molecular units
Time-lapse Fluorescence Microscopy and Quantitative ImageProcessing
Judith Leierseder Diplomarbeit
8x105
6
4
2
0
To
tal
Flu
ore
sce
nce
[a
.u.]
806040200
Time [min]
0.2% arabinose
Single cell expression kinetics
30min 40min 60min50min 70min
5min 15min 35min 45min25min
Saturating induction
Subsaturating induction
Image series correspond to blue curves
Fluorescence measurement• Cell outlines are determined using bright field images• The signal is integrated within the outline in each fluorescence image
8x105
6
4
2
0
To
tal
Flu
ore
sce
nce
[a
.u.]
806040200
Time [min]
0.01% arabinose
Gene expression modelDeterministic rate model with time delay d
8x105
6
4
2
0
Z(!
) [a
.u.]
806040200
! [min]
Reporter module Uptake module
Induction: t=0min
Curve Fitting
Fixed Parameters
Saturating induction
Subsaturating induction
Fit Parameters
Fit expression function
Time delay
Proteinsynthesisrate
Literature
Measured
8x105
6
4
2
0
To
tal
Flu
ore
sce
nce
[a
.u.]
806040200
Time [min]
0.01% arabinose
8x105
6
4
2
0
To
tal
Flu
ore
sce
nce
[a
.u.]
806040200
Time [min]
0.2% arabinose
Zeitskala der Suche nach der Bindungsstelle
!
D =kT
6"#R
!
P(r,t) =1
4"tDexp #
r2
4Dt
$
% &
'
( )
!
tdiffusion =d2
2D
Stokes Einstein Gleichung(z.B. DGFP=3-7µm2/s)
Wahrscheinlichkeitsverteilung
1µm
Typische Zeitskala dass ein Protein einenbeliebigen Punkt in E.coli findet : tD ≈ 0.1s
Diffusion zu einer absorbierenden Scheibe
!
J = "D4#r2dC
dr
!
dC
dt=1
r2Dd
dr4"r2
dC
dr
#
$ %
&
' (
!
C(r) =J
D4"r+ C(#)
!
C(") = N V
!
C(") = 0
!
J = 4"#DN
V
!
"on
=V
4#D$N% 20s N
Verweildauer der Transkriptionsfaktoren
!
1
" off=1
" onV # exp $G kT( ) = 4%D& M[ ] # exp $G kT( )
(mit τon=20s/N folgt, dass 1Molekül in 1µm3 einen Operator gerade halb besetzt)
für spezifische Bindungsstellen (Operator)mit 1M-1=1.6nm3 and ΔGspez=-12.6kcal/mol, ε=1folgt
!
" off # 20s
für unspezifische Bindungsstellen mit ΔGuspez=-10-4 kcal/mol,
!
" off #10$4s
Die Suche auf dem DNA Strang
!
" =L2
2D1
# 200.000s # 2Tage
Unspezifische Bindung von TFs and DNA ist ein Problem, da die Suche aufnach der Bindungsstelle auf dem Strang länger dauert. Wenn die Verweildauerunendlich wäre, würde ein ein-dimensionaler random walk
dauern (L=1.5mm und D1≈D)
Die Suche auf der DNA wird durch „Sprünge“ aufbenachbarte DNA Stränge beschleunigt
!
" #l2
D1
$
% &
'
( ) *L
l#Ll
D1
Mit L=1.5mm, l=150nm folgt
!
" # 50s
Kombinatorische Genregulation: Genetische Netze
transcriptiontranscription
translationtranslation
Genregulatorisches Genregulatorisches ProteinProtein
Ein Transkriptions-Aktivator und ein Transkriptions-Repressorkontrollieren das lac-Operon
Thermodynamisches Modell einer kombinatorischen Transkriptions Logik
ΔP : Bindungswahrscheinlichkeit
Gerland et al. PNAS, 2005
Genregulation folgt denPrinzipien von„Boltzmann-Maschinen“
Statistische Physik der Protein - DNA Bindung
!
CI +O"CIO
!
K =k+
k"
=CI[ ] O[ ]CIO[ ]
!
"
!
" =CIO[ ]Ototal[ ]
=CI[ ]
K + CI[ ]
Bindungsisotherme:
Kooperativität durch Dimer-Bildung
!
CI( )D
+O"CIO
!
KD
=CI( )
M[ ]
2
CI( )D
[ ] !
"
!
" =CIO[ ]Ototal[ ]
=CI( )
M[ ]
2
K #KD
+ CI( )M
[ ]2
Kooperative Bindung
!
CI( )M
+ CI( )M" CI( )
D
!
"
Das statistische Gewicht des „on“ Zustands
!
Pon
=Z(on)
Z
!
Pon
Poff
=Z(on)
Z(off )="
cexp #$ % G kT( ) =
CI[ ]K
Die freie Energiedifferenz DG ist auf eine freie Konzentration von 1Mfestgelegt. Die wahre Änderung der freien Energie der Bindung hängtvon der Konzentration des Transkriptionsfaktors in Lösung ab:
!
"G* = kT ln Z(on)( ) # ln Z(off )( )( ) = "G # kT ln CI[ ]( )
Modell für lac Netzwerk
GlukoseKonz.konstant
GFP: Reportermolekül, Abbildung durchFluoreszenz-Mikroskopie=> je höher das Fluoreszenz-Signal destomehr LacZ,Y wird exprimiert
Experimenteller Nachweis eines Schalters
Anfang: nicht induziert
Nach Induktion 2 Populationen:induzierte Population grün, nichtinduzierte Population weiß
Bistabiler Bereich (grau)
Pfeil zeigt den Anfangs-Zustand Zustand derBakterien hängt vom Ausgangs-Zustand ab!
=> Schalter mit Hysterese
Ozbudak et al, Nature 2004
Modellierung genregulatorischer Netzwerke
• ein Beispiel:
Modellierung auf der Ebene der mRNA
Verlauf der mRNA Konzentrationen
Problem: Die kinetischen Bindungskonstanten sindin der Regel nicht bekannt
stationärerZustand
Vereinfachung kombinatorischer Netzwerke
transcriptiontranscription
translationtranslation
Genregulatorisches Genregulatorisches ProteinProtein
Abstraktion genetischer Netze
Gen X
Gen Y
Gen Z
+
-
Boolesche Netze(Kauffman 1989)
Boolsche Netzwerkmodelle
• N Gene (Knoten)
• mit 2N unterschiedlichen Zuständen
• durch mögliche Regeln verküpft
• wobei K die Anzahl „inputs“ pro Knoten ist
!
22K
Boolsche Regeln für N=2 und K=2
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Beobachtung:wenn a=0, dann wird0101 stationär
wenn a=1, dannoszillatorisches Verhalten1000->1001->1111->1010->1000