Download pdf - Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation · PDF fileGenomreplikation von DNA-Viren Sommersemester 2006 Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation Elisabeth

Genomreplikation von DNA-Viren

Sommersemester 2006

Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation

Elisabeth SchwarzDKFZ

20. Juni 2006

Genexpression und DNA-Replikation

früh (early, E) spät (late, L)

Early-late switch

Replikation von DNA-Viren

Wo: Cytoplasma oder Kern?Kern > Transkription

> DNA-Replikation

G2

S

G1

MS-Phase•angewiesen auf S-Phase•Induktion von S-Phase

Wann?

DNA-Replikation

DNA-abhängige DNA-Polymerasen

semikonservative Replikation

Initiation:origin of replication = ori (Replikationsursprung)

Elongation:bidirektionale ReplikationReplikationsgabelnbidirektionale Wanderungsrichtung der ReplikationsgabelReplikationsblasen

+

DNA-Replikation• keine de-novo-Synthese! RNA-Primer

• DNA-Synthese durch Anheftung von Nucleotiden an das 3'-OH-Endeder RNA-Primer

• Template (Matrize) und Primer (Starter)

• Direktionalität: Kettenverlängerung in 5'-> 3'-Richtung

• dsDNA: Stränge komplementär und antiparallelPolymerisationsrichtung = Wanderungsrichtung der Replikationsgabel>kontinuierliche Synthese (leading strand, Leitstrang, Vorwärtsstrang)Polymerisationsrichtung gegenläufig zur Wanderungsrichtung>diskontinuierliche Synthese (lagging strand, Folgestrang, Rückwärtsstrang)

© Molecular Cell Biology, 2004

Initiation der DNA-Replikation

1.

2.

3.

4.

SV40

T-Ag

T-Ag

T-Ag

T-Ag

Zelle

ORC

Cdc6/Cdt1/ORC

MCM

Cdc6/Cdt1/ORC

• Ziel: viele neue Virusgenome

• T-Antigen

SV40• Ziel: Verdopplung!• origin „licensing“ +• origin-Aktivierung• ORC (origin recognition

complex, 6 Proteine)• CDC6, CDT1• MCM2-7• CDC7, S-CDKs, CDC45

Chromosom

DNA-Replikation

DNA-Replikationvon SV40

12

3

44

3

2

1

•ori•bidirektionaleReplikation


Fareed et al., 1972

DNA-Replikation von SV40

• Bindung von T-Antigen (doppeltes Hexamer) an ORI

• lokales Entwinden der Doppelhelix(Helicase-Aktivität von T-Antigen)

• Öffnen des Doppelstrangs (benötigt ATP + RFA als ssDBP)

• Bindung von Primase-Polymerase-alpha

• Synthese der Primer durch Primase• Bindung von RFC stimuliert dieLeitstrang-Synthese


• Bindung von PCNA> Inhibition und Verdrängung von Polα> Unterbrechung der Leitstrang-

Synthese• Bindung von Polδ an PCNA/RFC> erhöhte Prozessivität> Synthese des Leitstrangs• Bindung von Polα-Primase (+ RFC) anFolgestrang-Template

• Synthese des Folgestrangs> Okazaki-Fragmente (100-200 Nucl.)• Entfernen der RNA-Primer durch5’>3’-Exonuclease-Aktivität von Polα

• Auffüllen und Ligation der Fragmente• Wanderung der Replikationsgabel:durch T-Antigen erleichtert

• Trennung der beiden Tochtermoleküle:Topoisomerase II© Molecular Cell Biology, 1999

DNA-Replikation von SV40


Struktur des SV40 oriminimaler ori: ca. 65 bp, 3 essentielle Elemente– T-Ag-Bindungsstelle II

• inverted repeat, 23-34 bp, GC-reich• T-Bindungsstellen G-A/G-G-G-C

– AT-reiche Sequenz (15-20 bp)– early imperfect palindrome

© Principles of Virology, 1999, 2004

SV40: T-Ag und origin

Hexamer-Bildung von T-AgBindung an LT-BS IIStrukturveränderung von earlypalindrome (EP)Bindung von RFA (RpA)Entwinden der DNA-SträngeStabilisierung durch RFA

1.

2.

3.


SV40 DNA-Replikation

• Präinitiationskomplex:ori + T-Ag + RFA

• Initiationskomplex:(ori + T-Ag + RFA) + Primase-Polα

• Bildung des Initiationskomplexes bestimmt den engen Wirtsbereich von Polyomaviren


SV40 DNA-ReplikationTopoisomerasen

Decatenation

© Principles of Virology, 2004

Papillomaviruses Different modes of DNA replication

1. Establishment replicationLimited amplification:50-100 copies/cell

2. Maintenance replication(1+2: bidirectional replication)

3. Productive replication(rolling circle replication)


Rolling-circle replication


Initiation der DNA-Replikationbei Papillomviren

1. Kooperative Bindung von E1 und E2 an ori.2. ATP-abhängige Bindung von weiteren E1-Molekülen

und Verdrängung von E2

Das Enden-Replikationsproblembei linearen DNA-Genomen


Problem: Replikation der GenomendenProblemlösungen

• eukaryote Chromosomen

• Bakteriophage T7• Bakteriophage T4• Adenoviren• Herpesviren

Bakteriophage Lambda• Pockenviren• Parvoviren

Telomere / Telomerase

terminale Redundanz (tR)tR, zirkuläre PermutationProtein-PrimerZirkularisierung

self priming, hairpin loopsself priming

Bakteriophage T7

Virion:polyedrischer Kopf (Durchmesser 30 nm)kurzer, nicht kontraktiler SchwanzFamilie Podoviridae

Genom:ds-DNA, linear, ca. 40 kbSequenzwiederholungen an den Enden(160 bp): > terminale Redundanz

© Bakterienviren, 1992

Bakteriophage T7: DNA-Replikation

• origin bei ca. 15% am linken Genomende• bidirektionale Replikation (RNA-Primer)• unvollständige Replikation des Folgestrangs

> einzelsträngige 3’-Enden• wegen terminaler Repeats: überstehende 3’-Enden komplementär• Zusammenlagerung zu Dimeren• Auffüllen der Lücken durch DNA-Ligase• sequenzspezifische versetzte Spaltung durch Endonuclease gp3

> überstehende 5’-Enden• Auffüllen der Einzelstrang-Enden

> vollständige Genome mit terminalen Repeats• bei weiterer Replikation: Bildung von Konkatemeren

(bis ca. 100 Kopien) durch Stranginvasion (strand invasion)


5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘

ori

5‘-ATTCAT ATTCAT3‘-TAAGTA TAAGTA

ATTCAT-3‘TAAGTA-5‘

ba

5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA -5‘

5‘- ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘

+a

b

bid. Replikation

ZusammenlagerungLigation


a

5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘-TAAGTA TAAGTA-


a b

Spaltung durch gp3

5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘

b+5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘

5‘-ATTCAT

5‘-ATTCAT

3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘


+

aAuffüllen der Enden

b

Bakteriophage T4Virion:elongierter polyedrischer Kopf (111 nm x 78 nm)langer kontraktiler SchwanzFamilie Myoviridae, geradzahlige T-Phagen

Genom:ds-DNA, linear, ca. 166 kbGenom in Virionen ca. 171 kb, wegen:Sequenzwiederholungen an den Enden (ca 5 kb): terminale Redundanzzirkuläre Permutation

© Viren, 1993

Bakteriophage T4: DNA-Replikation• mehrere origins• frühe Replikation: bidirektionale Replikation > unvollständige Enden

• späte Replikation:Konkatemerbildung durch Rekombination(recombination-dependent DNA replication)Invasion der 3’-Enden in homologe ds-DNA (strand invasion)> komplexes Netzwerk von replizierender Virus-DNA

• Verpackung des Genoms in Phagenkopf:“head full”-MechanismusVerpackungslänge größer als Genomlänge> terminale Redundanz, zirkuläre Permutation


ABCD...........YZA

BCDE..........YZAB

CDEF.........YZABC

Terminale Redundanz und zirkuläre Permutation

A A A A AZ Z Z ZA A A A A A AZ Z Z Z Z Z Z

T4 + T7: Virale ReplikationsfaktorenT4• DNA-Polymerase

(gp43)• Helikase, Primase

(gp41 + gp61)• Einzelstrang-bindendes

Protein gp32• ca. 30 virale

Genprodukteinsgesamt

T7• DNA-Polymerase

(gp5)• Helikase, Primase

(gp4)• Endonuclease

(gp3)• DNA-Ligase

>> autonomer viraler Replikationsapparat mit allennotwendigen Komponenten

Adenoviren

Viruspartikel:• Ikosaeder (Durchmesser 80-110 nm)• 252 Capsomere(240 Hexone, 12 Pentone)

• 1953 aus Rachenmandeln (adenoids) isoliert

• Erkrankungen der Atemwege, des Gastrointestinalbereichs, der Augenbindehaut

• >100 Adenovirus-Typen bei Wirbeltieren

Adenoviren als Modellsysteme:• effiziente Vermehrung in Zellkultur• Genexpression: Splicing• DNA-Replikation• Onkogenese, Zelltransformation• Vektoren© Viren, 1993

Adenoviren: Genom

• terminales Protein TP kovalent an 5‘-Enden• Interaktion der TPs > quasizirkulärer Zustand der DNA• Strangtrennung: ITRs > Hybridisierung der komplementären Sequenzen > Pfannenstiel-Strukturen

• lineare doppelsträngige DNA, 36 – 38 kb• inverted terminal repeats (ITRs, 54-166 bp)

© Molekulare Virologie, 2003

Adenoviren: InitiationTP 80 kD TP 55 kD

• Bindung von pTP + Pol an terminalen ORI

• Bindung von NF-1 und Oct-1 an ORI• kovalente Bindung von dCMP an Serin-OH: TP-C (Protein-Primer)• TP-C komplementär zu 3‘-terminalem G• Initiation der DNA-Synthese an TP-C• Bindung von ssDBP an verdrängten Einzelstrang

©M

olek

ular

e V

irolo

gie,

200

3

Adenoviren: ElongationPhase I:• kontinuierliche Leitstrang-synthese

• Strangverdrängung(strand displacement)

Phase II:• verdrängter Strang: ITR>Pfannenstielstruktur

• Gegenstrangsynthese

Virale Replikationsproteine:• Pol, pTP, ssDBP


Herpesviren• große umhüllte Viren (Durchmesser 100-200 nm)• Envelope durch Knospung an innerer Kernmembran• lytische Infektion• Etablierung von latenten Infektionen (> Viruspersistenz)

• Reaktivierung

Genom:• lineare ds-DNA(130-240 kb)

• im Virus-Corespulenförmig um Proteinmatrix gewickelt

• Enden werden zusammengehalten• unique (ULund US) und repetitive Sequenzen


© Viren, 1993

Herpesviren beim Menschen

Herpes-simplex-Virus: Genom ca. 150 kbHSV1: Herpes labialis (Lippenbläschen)HSV2: Herpes genitalis

Varizellen-Zoster-Virus (VZV): Genom ca. 125 kbVarizellen = Windpocken: PrimärinfektionZoster = Gürtelrose: Rezidiv

Cytomegalievirus (CMV): Genom ca. 230 kbinapparente Infektionenbei Immunsupprimierten schwere Verläufe

Epstein-Barr-Virus (EBV): Genom ca. 172 kbinfektiöse Mononucleose (Pfeiffer’sches Drüsenfieber)Burkitt-Lymphom (B-Zell-Lymphom), AfrikaNasopharynx-Karzinom, Südchina

Herpesviren beim Menschen

Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6):1986 entdecktExanthema subitum (Rubeola infantum, Dreitagefieber)

Humanes Herpesvirus 71990 entdeckt, verwandt mit HHV-6

Humanes Herpesvirus 8:Genom ca. 270 kb1994 entdecktKaposi-Sarkome bei AIDS-Patienten

Herpesviren: DNA-Replikation

• Zirkularisierung der DNA

• rolling-circle-Mechanismus > head-to-tail-Konkatemere

• Spaltung der Konkatemere und Verpackung:miteinander verbundene Prozesse (virales cleavage-packaging protein)

•„head full“-Mechanismus

Rolling-circle replication


Herpesviren

HSV-kodierte Enzyme für DNA-Replikation

Proteine für virale origin-abhängige DNA-ReplikationDNA-PolymeraseHelicase-Primaseorigin-bindendes ProteinssDNA-bindendes ProteinProzessivitätsfaktoren

Enzyme für Nucleinsäuremetabolismus

Bakteriophage Lambda

• Genom: dsDNA, linear, 48502 bp• überstehende 5‘-Enden (m, m‘, cos)(12 Nucleotide, komplementär)

• Infektion: Ringschluss• ori, O-Protein, P-Protein• 1. Bidirektionale Replikation• 2. „Rolling Circle“-Replikation• Concatemere > Encapsidierung > Spaltung durch Terminase(GenA+GenNu1) an cos(m/m‘) © Molekulare Genetik, 2001

Pockenvirengroße, komplex aufgebaute Viruspartikel (350 x 270 nm)im Lichtmikroskop sichtbar

Virusreplikation:im Cytoplasma, in „factory areas“(Virusfabriken)in kernlosen Zellen möglichBeginn der DNA-Replikation: ca 1-2 h p.i.Produktion: ca. 10.000 Genom-kopien/Zelleca. 50 % werden verpackt


© Viren, 1993

PockenvirenVariolavirus

Erreger der Pocken (variola: scheckig)im 6. Jh. von Asien nach Europa eingeschlepptHöhepunkt der Pockenepidemie in Europa: 18. Jh.

Variola major:schwarze Blattern (hämorrhagische Pocken), Letalität 5-40%Variola minor:weiße Blattern, Letalität ca. 1 %

Ausrottung der Pocken 1977 durch weltweites Impfprogramm der WHO

DNA-Replikation:im Cytoplasma: keine Verwendung zellulärer Faktoren möglichalle Replikationsfaktoren vom Virusgenom codiert

Enzyme für Nucleotidmetabolismus(um genügend große Mengen an dNTPs für DNA-Replikationherzustellen):ThymidinkinaseThymidylatkinaseRibonucleotidreductasedUTPase

Pockenviren Virale Faktoren für DNA-Replikation

PockenvirenGenom:lineare ds-DNA 130-300 kbKodierungskapazität: 150-200 Genehairpin loops an den Enden + inverted terminal repeats (ITRs)

ITR-Länge: 725 bp (Variola) bis 12 kb (Vaccinia)

Vacciniavirus ITR


Pockenviren DNA-Replikation

Priming:Setzen eines Nicks: self-priming (i.e. DNA-Primer)Rückfalten der ITRskein definierter ori

Elongation:Strand displacement (i.e. keine lagging strand-Synthese)Concatemer-BildungAuflösung der Concatemere in unit-length-Moleküle(Monomere) erfordert Synthese von späten Proteinen

Pockenvirennicks>self-priming

inverted repeats>hairpin loops

concatemers

nick

©Fields Virology, 2001

Parvoviren

Helferfunktionen für AAVAdenoviren: frühe Genprodukte > Induktion von S-Phasekeine direkte Interaktion von Ad-Proteinen mit AAV-GenomHerpesviren: HSV-Replikationsproteine

Parvovirinae (Vertebraten), Densovirinae (Insekten)felines Panleukopenievirus (Katzenseuche)Minute virus of mice (MVM)Aleutian mink disease virus (Aleuten-Nerzvirus)B19: Erythema infectiosum (Ringelröteln)Dependovirus (helferabhängige Viren): AAV 1-5

kleine nicht umhüllte DNA-Viren (Durchmesser 18-26 nm)(parvus = klein)Genom: lineare ss-DNA, ca. 5000 Basen

Parvoviren DNA-ReplikationGenom:• lineare einzelsträngige DNA, ca. 5000 Basen• Palindromsequenzen am 5'- und 3'-Ende: > hairpin-Strukturen• 3'-Palindrom: ca 100 Basen, 5'-Palindrom: 200-250 Basen

DNA-Replikation:• im Kern, notwendig: S-Phase• Parvoviren können S-Phase nicht induzieren>Parvoviren sind die am stärksten von zellulären Funktionen abhängigen Viren• Primer: terminale 3'-Sequenzen der Genom-DNA• single strand displacement (model)• unidirektionale Leitstrangsynthese• „rolling hairpin“-Synthese

Virales Protein für Replikation: NS-1nukleäres Phosphoprotein, sequenz-spezifische DNA-Bindung, Helicase,an 5'-Ende von replikativer DNA (+ Virion-DNA)kovalent gebunden

ParvovirenDNA-Replikation

AAV-2

3‘-terminaler hairpin > primer-templateInitiation

Nick (Rep) > Elongation

self-priming, Rückfaltung der Terministrand displacement, „rolling hairpin“

replicationintermediate

genomicDNA



Viren Genom Replikationsproteineviral zellulär

PrimingElongation

Polyoma5 kb

T-AgPrimase

PolymeraseSSBP (RF-A)

RF-C (Bel.faktor)

PCNA (Proz.faktor)

Topo II

RNAbidirektionale

Replikation

Papillom8 kb

E1 wie PolyomaE2

RNAbid. Replikation



PrimingElongation

Adeno 35 kb pTP Initiation:Pol NFIDBP NFIII/Oct1

Elongation:NFII (Topo)

für Elongation >9000 bp

Protein (pTP)strand

displacement



PrimingElongation

Herpes 150 kb DNA-Pol. UL30ssDBP UL29ori-bind. Protein UL9Proz.faktor UL42Primase/Helicase:UL5, 8, 52

RNArolling circlehead-to-tail-

KonkatemereSpaltung in Monomere

Genomreplikation von DNA-VirenViren Genom Replikationsproteine

viral zellulärPriming

ElongationPocken 130-300 kb

DNA-Polymerase????Resolvase

Replikation im Cytoplasma!

self-primingRückfaltung der Termini

strand displacement

„rolling hairpin“

Parvo 5 kb NS1 DNA-Pol. self-primingRückf. der Termini

strand displacement„rolling hairpin“