Aus der Abteilung Innere Medizin I, Hämatologie und Onkologie,
der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg im Breisgau
Neuronale in-vitro Differenzierung von murinen homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen
Stammzellen:
Ein System zum Studium der Funktion und zur Identifikation
potentieller Zielgene des Pbx1-Homeoboxproteins während der
zellulären Differenzierung
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt im Jahr 2005
von Anne Siobhain Jürgens
geboren in Neuss
Dekan: Prof. Dr. med. J. Zentner 1.Gutachter: Prof. Dr. med. R. Mertelsmann 2.Gutachter: Prof. Dr. med. M. Reincke Jahr der Promotion: 2005
Meinen Eltern und Michael
Literaturverzeichnis
LITERATURVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ____________________________________________________ 1
1.1 Grundsätzliches zur Genfunktionsanalyse in Stammzellen ____________ 1
1.2 Definition der embryonalen Stammzellen___________________________ 2
1.3 In Vitro-Differenzierung embryonaler Stammzellen___________________ 3
1.4 PBX1_________________________________________________________ 4
1.5 Klinische Relevanz von PBX1 ____________________________________ 8
1.6 HOX-Gene ____________________________________________________ 9
2 ZIELSETZUNG __________________________________________________ 11
3 MATERIAL UND METHODEN ______________________________________ 12
3.1 Material______________________________________________________ 12 3.1.1 Geräte ___________________________________________________ 12 3.1.2 Verbrauchsmaterialien_______________________________________ 13 3.1.3 Chemikalien_______________________________________________ 14 3.1.4 Enzyme __________________________________________________ 15 3.1.5 Antibiotika ________________________________________________ 15 3.1.6 Standards ________________________________________________ 16 3.1.7 Kits zur Bearbeitung von DNA und Protein _______________________ 16 3.1.8 Radioaktive Substanzen _____________________________________ 16 3.1.9 Antikörper ________________________________________________ 16 3.1.10 Medien, Medienzusätze und gepufferte Salzlösungen ______________ 16 3.1.11 Medien für das Arbeiten mit embryonalen Stammzellen_____________ 17
3.1.11.1 Medium zur Kultivierung embryonaler Stammzellen _________________ 17 3.1.11.2 Medium zur Differenzierung embryonaler Stammzellen ______________ 17 3.1.11.3 Medium zum Einfrieren embryonaler Stammzellen __________________ 17
3.1.12 Stamm-und Standardlösungen ________________________________ 18 3.1.13 Bakterien _________________________________________________ 19 3.1.14 Medien zur Anzucht von Bakterien _____________________________ 19 3.1.15 Oligonukleotide ____________________________________________ 20
3.1.15.1 RT-PCR Primer _____________________________________________ 20 3.1.16 Primer für die Northern Blot Analyse____________________________ 20
3.2 Methoden ____________________________________________________ 21 3.2.1 Methoden zur Arbeit mit eukaryoten Zellen_______________________ 21
3.2.1.1 Kultivierung embryonaler Stammzellen ___________________________ 21 3.2.1.2 Gelatinisieren von Zellkulturflaschen bzw. -platten __________________ 22 3.2.1.3 Trypsinieren von Zellen _______________________________________ 22 3.2.1.4 Einfrieren von Zellen _________________________________________ 22 3.2.1.5 Auftauen und Revitalisieren von Zellen ___________________________ 23 3.2.1.6 ES-Zelldifferenzierung ________________________________________ 23
3.2.2 Molekularbiologische Methoden _______________________________ 24 3.2.2.1 RNA-Isolierung aus kultivierten Zellen____________________________ 24 3.2.2.2 Konzentrationsbestimmung von cDNA- bzw. RNA-Lösung ____________ 25
Literaturverzeichnis
3.2.2.3 Aufreinigung der präparierten gesamt RNA mittels RNAeasy __________ 25 3.2.2.4 cDNA-Synthese _____________________________________________ 26 3.2.2.5 In-vitro-Transkription _________________________________________ 26 3.2.2.6 RT-PCR ___________________________________________________ 27 3.2.2.7 Verdauung von DNA mit Restriktionsendonukleasen ________________ 29 3.2.2.8 Transformation von E. coli mit Plasmid- DNA ______________________ 29 3.2.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA (Qiagen-Methoden) ___________________ 30 3.2.2.10 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA und RNA–Fragmenten____ 31 3.2.2.11 Isolierung von DNA–Fragmenten aus Agarosegelen_________________ 32 3.2.2.12 Northern-Blot _______________________________________________ 32 3.2.2.13 Genexpressionsanalyse_______________________________________ 34
3.2.3 Proteinchemische Methoden__________________________________ 37 3.2.3.1 Immunzytochemie für Zellkulturen (Fluoreszenz-Methode)____________ 37
4 ERGEBNISSE___________________________________________________ 39
4.1 Etablierung eines neuronalen Differenzierungsprotokolls ____________ 39 4.1.1 ES-Zellkultur ______________________________________________ 39 4.1.2 In-vitro-ES-Zelldifferenzierung_________________________________ 41
4.2 Vergleichende Charakterisierung der Genexpression in Wildtyp, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien _________________________________________ 46
4.2.1 Vergleichende semiquantitative RT-PCR Analyse _________________ 46 4.2.1.1 Expression von PBX1 während der zellulären Differenzierung _________ 46 4.2.1.2 Expression von neuronalen Genen während der zellulären Differenzierung47 4.2.1.3 Expression von FGF15, WNT1 und BMP4 ________________________ 49
4.2.2 Vergleichende immunzytochemische Analyse der Embryoidkörperchen 51 4.2.3 Vergleichende Genexpressionsanalyse _________________________ 53
4.2.3.1 Vergleich der undifferenzierten und der differenzierten WT-ES-Zellen ___ 54 4.2.3.2 Vergleich Wildtyp und Kock-out –ES-Zellen im differenzierten Stadium __ 64
4.2.4 Northern Blot Analyse _______________________________________ 74
5 DISKUSSION ___________________________________________________ 76
5.1 Neuronale Differenzierung der embryonalen Stammzellen in vitro _____ 76 5.1.1 Etablierung des neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems ________ 77 5.1.2 Bestätigung der neuronalen in-vitro-Differenzierung________________ 78 5.1.3 Vergleich der Differenzierung in vitro mit der Entwicklung in vivo______ 80
5.2 Auswirkung der Inaktivierung von PBX1 in embryonalen Stammzellen auf die in-vitro-Differenzierung _____________________________________ 82
5.3 Vergleichende Charakterisierung der Genexpressionsmuster in WT und PBX1-K.O.-Zellen zur Identifikation von potentiellen Zielgenen________ 84
5.3.1 WNT1 und BMP4___________________________________________ 85 5.3.2 FGF15 ___________________________________________________ 87 5.3.3 IGF-Familie _______________________________________________ 87
5.3.3.1 IGF1______________________________________________________ 89 5.3.3.2 IGF1R ____________________________________________________ 90 5.3.3.3 IGF2______________________________________________________ 90 5.3.3.4 IGF2R ____________________________________________________ 91 5.3.3.5 H19 ______________________________________________________ 92
5.3.4 Colipase _________________________________________________ 93 5.3.5 Zusammenfassende Darstellung potentieller Zielgene von PBX1 _____ 94
Literaturverzeichnis
5.4 Korrelation des zuvor beschriebenen in-vitro-Differenzierungssystems mit einem in vivo PBX1-K.O.-Maus-Modell ____________________________ 95
5.4.1 Rolle von PBX1 in der Entwicklung des Pankreas und in der Pathogenese des Diabetes ______________________________________________ 95
5.4.2 Rolle von PBX1 in der Hämatopoese ___________________________ 98
5.5 Schlussfolgerung und Perspektiven_____________________________ 100
6 ZUSAMMENFASSUNG __________________________________________ 102
7 LITERATURVERZEICHNIS _______________________________________ 103
8 ANHANG _____________________________________________________ 113
8.1 Herstellung der Embryonalen Stammzellen mit einem PBX1-Knock-out 113 8.1.1 Konstrukt des Vektors ______________________________________ 113 8.1.2 Homologe Rekombination ___________________________________ 114
9 ABKÜRZUNGEN _______________________________________________ 117
10 DANKSAGUNG ______________________________________________ 120
11 VERÖFFENTLICHUNGEN ______________________________________ 121
11.1 Abstracta ___________________________________________________ 121
11.2 Tagungsbeiträge _____________________________________________ 121
11.3 Seminarvorträge _____________________________________________ 122
12 LEBENSLAUF _______________________________________________ 123
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Grundsätzliches zur Genfunktionsanalyse in Stammzellen
Alle Entwicklungsprozesse individueller Lebewesen werden durch Gene
gesteuert: frühe Organogenese, kontrollierte Zellteilung, Zellwanderung und
Differenzierung. Eine Möglichkeit, die Entwicklung eines Organismus auf
molekularer Ebene zu verstehen, ist die Identifikation beteiligter Gene und die
Analyse der Funktion ihrer Genprodukte. Die Entwicklung der embryonalen
Stammzell-Technologie der Maus hat es ermöglicht, durch homologe
Rekombination gezielte Mutationen in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)
zu erzeugen, um so die Funktion bereits identifizierter Gene zu untersuchen.
Die Übertragung genetisch modifizierter embryonaler Stammzellen auf
Mausembryos ermöglicht die Übertragung der Mutation in die Keimbahn. So
können sogenannte transgene „Knock-out“-Mäuse erzeugt werden, denen ein
spezifisches Genprodukt fehlt. Der Phänotyp solcher Mäuse kann auf die
Funktion des fehlenden Gens hindeuten (Capecchi, 1989; Joyner et al., 1989;
Koller and Smithies, 1992; Mansour et al., 1988).
Das betroffene Gen ist allerdings in allen Zellen des Organismus schon
während der prä- und postnatalen Entwicklung deletiert. Handelt es sich um ein
lebenswichtiges Gen, so ist seine Funktion in diesem Modell nur bedingt
aufklärbar, da die Knock-out(K.O.)-Maus schon früh während der embryonalen
Entwicklung stirbt. Als Weiterentwicklung dieser klassischen Methode wurde
deshalb die konditionale Geninaktivierung und verschiedene in-vitro-
Differenzierungsprotokolle entwickelt. Der konditionale Ansatz bietet die
Möglichkeit, das Zielgen topisch und zeitlich kontrolliert zu inaktivieren (Galli-
Taliadoros et al., 1995). Die in-vitro-Differenzierung von embryonalen
Stammzellen kann als Modellsystem dienen, um frühe Entwicklungsvorgänge
zu untersuchen. Einer der Vorzüge dieses in-vitro-Systems ist es, dass eine
hohe Anzahl an Zellen in verschiedenen Phasen der Differenzierung gewonnen
werden kann, und erlaubt dadurch eine umfassende molekularbiologische
Analyse (Czyz and Wobus, 2001). Der Vergleich der Expressionsmuster
während der Differenzierung zwischen WT- und K.O.-ES-Zellen verbessert die
Einleitung 2
Möglichkeit, die biologischen Funktionen für wichtige Gene in der
Differenzierung zu charakterisieren.
Auch in der klinischen Medizin sind Stammzellen in den Mittelpunkt des
Interesses gerückt. Die Medizin sucht nach Möglichkeiten, defekte Gewebe und
Organe zu ersetzen. Die Frage, ob Stammzellen für eine solche
Zellersatztherapie genutzt werden können, und welche Stammzellen hierfür am
besten geeignet sind, lässt sich zur Zeit noch nicht beantworten. ES-Zellen
haben den Vorteil, dass sie relativ gut charakterisiert und pluripotent sind. Ein
großer Nachteil ist die Immunreaktion bei der Transplantation. Auch bedürfen
die mit der Forschung an humanen embryonalen Stammzellen verknüpften
ethischen Probleme weiterer Klärung. Diese Diskussion wird derzeit sehr
kontrovers auf vielen Ebenen unserer Gesellschaft geführt (Rohwedel, 2001).
Eine weitere Möglichkeit zur Zellersatztherapie ergibt sich möglicherweise aus
der Verwendung adulter Stammzellen, die aus Geweben und Organen eines
Fötus oder eines adulten Organismus gewonnen werden. Ihr
Differenzierungspotential ist nach heutigen Erkenntnissen im Vergleich zu
embryonalen Stammzellen stärker eingeschränkt. Sie sind allerdings bisher
noch unzureichend charakterisiert. Da diese aus dem Gewebe des
Transplantationsempfängers isoliert werden können, ist die autologe
Transplantation hier einfacher zu verwirklichen. Intensive Forschungsarbeit ist
auf diesem Gebiet noch notwendig (Rohwedel, 2001).
1.2 Definition der embryonalen Stammzellen
ES der Maus wurden erstmals vor ca. 20 Jahren isoliert (Evans and Kaufman,
1981; Martin, 1981). Sie werden aus der inneren Zellmasse der
Mausblastozyste gewonnen und sind pluripotent, d.h. nach Injektion in die
Mausblastozyste können sie sich noch an der Ausbildung aller Gewebe und
Zelltypen beteiligen. Später verlieren sie diese Eigenschaft zunehmend. Sie
werden determiniert und verlieren nach jeder Zellteilung etwas von ihrem
Differenzierungspotential.
Unter bestimmten Bedingungen z.B. Zusatz von leukemia inhibitory factor (LIF)
bleiben ES-Zellen in vitro pluripotent. ES-Zellen können praktisch unbegrenzt
vermehrt werden. LIF ist ein Zytokin, das zu der IL6-Familie gehört. Es wurde
im Zusammenhang mit der Differenzierungsinduktion von M1 Leukämiezellen
Einleitung 3
identifiziert (Tomida et al., 1984). Später wurde es als Inhibitor der
Differenzierung von Maus ES-Zellen eingesetzt (Niwa, 2001; Smith et al., 1988;
Williams et al., 1988).
Es gibt nur wenige identifizierte Gene, die essentiell sind für die Pluripotenz von
ES-Zellpopulationen. Bisher bestätigt ist diese Funktion für den
Transkriptionsfaktor OCT3/4 der POU-Familie (OCT3 oder OCT4 oder Pou5f1).
Die OCT3/4-Expression ist beschränkt auf totipotente und pluripotente Zellen im
murinen Lebenszyklus (Pesce et al., 1998). Die Expression lässt sich in
Oozyten, in befruchteten Eizellen, in der inneren Zellmasse der Blastozyste, im
primitiven Ektoderm, im Eizylinder, in primordalen Keimzellen, im späteren
Stadium des Embryos und in Keimzellen von Erwachsenen nachweisen
(Palmieri et al., 1994; Scholer et al., 1990). Die Expression wird im
Trophoektoderm und im primitiven Endoderm herunterreguliert (Pesce and
Scholer, 2000). Die Rolle von OCT3/4 in der Mausentwicklung wurde durch
gezielte Gendeletion untersucht. OCT3/4 defiziente Embryos sterben während
der Implantation, da sie unfähig sind, die innere Zellmasse zu bilden (Nichols et
al., 1998). Untersuchungen in ES-Zellen haben gezeigt, dass die Expression
von OCT3/4 mit drei verschiedene Zellschicksalen korreliert ist (Niwa et al.,
2000). ES-Zellen benötigen eine kritische Expressionsrate an OCT3/4 zur
Stammzellerneuerung. Ein Expressionsanstieg führt zur Differenzierung in
Endoderm und Mesoderm und eine Reduktion führt zu Dedifferenzierung in
Trophoektoderm (Niwa et al., 2000).
OCT3/4 kann als Hauptregulator der Differenzierung von pluripotenten Zellen
angesehen werden (Niwa, 2001).
1.3 In Vitro-Differenzierung embryonaler Stammzellen
Sobald ES-Zellen in Suspension kultiviert werden, beginnen sie, sogenannte
Embryoidkörperchen zu bilden. Nach einigen Tagen in Kultur, können die
Embryoidkörperchen in Zellkulturflaschen mit adhäsiver Oberfläche transferiert
und dadurch die Differenzierung begonnen werden. Unter entsprechenden
Bedingungen differenzieren sie in spezialisierte Zelltypen: kardiale (Maltsev et
al., 1994; Rohwedel et al., 1998; Wobus et al., 1991), myogene (Rohwedel et
al., 1998; Rohwedel et al., 1994), neuronale (Bain et al., 1995; Gajovic et al.,
1997), hämatopoetische (Schmitt et al., 1991; Wiles, 1993), epitheliale (Bagutti
Einleitung 4
et al., 1996), endodermale (Sauer et al., 1998), adipogene (Dani et al., 1997)
und chondrogene Zellen (Kramer et al., 2000). Die Rekapitulation der
entwicklungsspezifischen Genexpressionsmuster ermöglicht die in-vitro-
Analyse von Entwicklungsprozessen auf molekularer Ebene. Die in-vitro-
Differenzierung embryonaler Stammzellen ist ein wichtiges Modell für die
Analyse der frühen Embryonalentwicklung.
1.4 PBX1
Das PBX1-Gen ist auf dem Chromosom 1q23
lokalisiert (Abb. 1-1) (Monica et al., 1991). Es ist
beim Menschen bei akuten lymphoblastischen
prä-B Leukämien durch Untersuchungen der
Translokation zwischen Chromosom 1 und 19
entdeckt worden, die zu dem onkogenen
Fusionsprotein E2a–PBX1 führt. Es handelt sich
bei PBX1 daher um ein Protoonkogen, das als
Transkriptionsfaktor fungiert (Kamps, 1997;
Kamps et al., 1990). PBX1 kann durch
alternatives Splicing für die längere Isoform
PBX1a und die kürzere Form PBX1b kodieren
(Asahara et al., 1999; Schnabel et al., 2001).
PBX1 gehört zur PBX-Familie von Homöobox
Genen in Vertebraten, die auch PBX2, PBX3 und
neuerdings PBX4 einschließen (Monica et al.,
1991; Wagner et al., 2001). Die PBX-Proteine gehören zur Klasse der TALE
(three amino acid loop extension)-Familie, eine Gruppe von Proteinen mit einer
Homöodomäne. PBX2 und PBX3 wurden aufgrund ihrer Sequenzhomologie mit
94%iger Sequenzidentität zu PBX1 entdeckt. Eine eventuelle Bedeutung in
Neoplasien oder anderen Krankheiten ist noch nicht bekannt. Während das
PBX1-Protein in allen Geweben außer in der B- und T–Zelllinie exprimiert wird,
werden PBX2 und PBX3 ubiquitär exprimiert. PBX4 wird während der
Spermatogenese gebildet (Wagner et al., 2001).
Abb. 1-1: Die genetische Struktur des Chromosoms 1 (http://www.informatics.jax.org)
Einleitung 5
Abb. 1-2: Kooperative DNA-Bindung von HOX- und PBX-Proteinen
Hox B1
PBX1
PBX1-Proteine binden mit HOX-Proteinen als
kooperative Partner an DNA in einem Komplex
mit einer Reihe von Proteinen und verändern
dadurch ihre Affinität und Spezifität (Abb. 1-2).
Die Dimerisierung von PBX- und HOX-
Proteinen an der DNA ist abhängig von einem
konservierten Pentapeptid-Motiv nahe dem N-
Terminus in der HOX-Homöodomäne. In
einigen Fällen ändert die Heterodimerisierung
die DNA bindende Spezifität und damit die
biologische Aktivität (Asahara et al., 1999;
Kamps, 1997; Knoepfler and Kamps, 1995).
Alternativ ist das Protoonkogen Meis1 ein häufiger intrazellulärer Partner für die
PBX-Proteine (Chang et al., 1997). Meis1 gehört zu den MEINOX-Proteinen,
eine weitere Subgruppe der TALE-Familie. Meis1 wurde zunächst in
myeloischen Leukämien in BXH-2
Mäusen identifiziert. BXH-2 Mäuse
entwickeln myeloische Leukämien,
verursacht durch ein ektopes murines
Leukämievirus, dessen Genprodukte
als eingebaute Mutagene die
Expression von zellulären
Protoonkogenen beeinflussen
(Moskow et al., 1995). Meis1 kann mit
PBX1 an bipartiten DNA-Sequenzen,
die aus 5`PBX1 (TGAT) und 3`Meis
(TGACAG) bestehen, dimerisieren. Die
Bindungsstelle von Meis1
unterscheidet sich demnach von der
von HOX-Proteinen (Chang et al.,
1997).
In einem sogenannten „kompetitiven
Modell“ wird angenommen, dass Meis
Abb. 1-3: Modell der unterschiedlichen DNA –Bindung durch PBX1-HOX und PBX1-Meis Heterodimere (aus Knoepfler et al., 1997)
Einleitung 6
und HOX-Proteine um die Heterodimerisierung von PBX1 konkurrieren. Ein
weiteres, sogenanntes „kooperatives Modell“ geht davon aus, dass HOX-
Proteine mit bereits gebildeten PBX-Meis-Komplexen zusammenwirken (Chang
et al., 1997).
Abbildung 1-3 zeigt ein Modell für die unterschiedliche DNA-Bindung durch die
PBX1-HOX und PBX1-Meis1 Heterodimere. Das monomere PBX1 besitzt eine
N-terminale Domäne, die die DNA-Bindung durch Homöodomäne-Proteine
verhindert. Die Dimerisierung mit HOX oder Meis1 wandelt PBX1 in eine DNA-
bindende Konformation, wobei HOX und Meis1 an eine unterschiedliche
Sequenz binden (Knoepfler et al., 1997).
Murine PBX1(-/-) Embryonen sterben zwischen Embryonaltag (E) 15,5 und E
16,5 und weisen sowohl schwere Skelettdeformitäten als auch schwere
Hypoplasien von abdominalen und thorakalen Organen und eine Aplasie der
Niere auf (Selleri et al., 2001). Optisch sehr auffallend ist die Blässe und ein
subkutanes Ödem der Embryonen (Abb. 1-4). Diese Merkmale treten zum
ersten Mal am E 12,5 auf und gehen mit einer schweren Anämie einher
(DiMartino et al., 2001; Selleri et al., 2001). PBX1(-/-) zeigen zudem schwere
Pankreashypoplasien mit markanten Defekten in exokrinen und endokrinen
Zelltypen. In diesen Embryos ist die Expression von ISL1 und ATOH5,
essentiellen Regulatoren der Pankreasmorphogenese und -differenzierung,
stark reduziert. PBX1(+/-) Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar und zeigen
interessanterweise auch einen Phänotyp. Sie haben signifikant kleinere
Körpergrößen und zeigen
gravierende Abnormitäten in
den Inseln des Pankreas,
eine pathologische
Glukosetoleranz und
verminderte Insulinwerte.
Diese Veränderungen sind
mit dem Beginn eines
Diabetes mellitus assoziiert.
PBX1 scheint also essentiell
zu sein für die normale
Abb. 1-4: WT und PBX1(-/-) Embryos E 14, 5 (aus DiMartino et al., 2001)
Einleitung 7
Entwicklung und Funktion des Pankreas und seine Dysfunktion fördert die
Entwicklung eines Diabetes mellitus (Kim et al., 2002).
Bei der Maus wird PBX1 in vielen embryonalen Geweben in charakteristischer
Weise während der embryonalen Entwicklung exprimiert.
Immunhistochemische Analysen haben nachgewiesen, dass PBX1b nach der
Implantation durchweg während der Entwicklung exprimiert wird, besonders
aber in der frühen und mittleren Gestationsphase (Schnabel et al., 2001). Auch
die Daten dieser Experimente unterstreichen die Bedeutung von PBX1 in der
Embryogenese: PBX1 wird in Derivaten aller drei Keimblätter (Ektoderm,
Mesoderm und Endoderm) stark exprimiert. Sie erfolgt zunächst im paraxialen
Mesoderm und Endoderm, insbesondere aber ist die PBX1-Expression an
solchen Orten lokalisiert, wo eine mesenchymale - epitheliale Interaktion in der
aktiven Morphogenese von Geweben wie Lunge, Niere, Zähne und Haarfollikel
stattfindet (Schnabel et al., 2001).
Experimente mit BrdU Markierung
haben gezeigt, dass die Expression
von PBX1 sich teilweise mit Regionen
zellulärer Proliferation überschneidet,
z. B. in der Entwicklung des
Dienzephalons. Diese
Untersuchungen zeigen, dass PBX1 in
mehreren regulatorischen
Signaltransduktionswegen eine große
Rolle spielt, die teilweise auch die
zelluläre Proliferation und
Gewebeexpansion kontrollieren
(Schnabel et al., 2001).
Bei der Ratte wird PBX1 während der
embryonalen Entwicklung am
stärksten in neuronalen Gewebe
exprimiert (Roberts et al., 1995).
PBX1-Expression wird zuerst am E 14
im Rattenhirn nachweisbar, die
Abb. 1-5: In situ Analyse der PBX1 Expression im Gehirn einer Ratte. Nähere Erläuterungen im Text (aus Redmond et al., 1996)
Einleitung 8
Expressionsrate steigt bis zum E 17 und erreicht ihr Maximum in der ersten
postnatalen Woche. Anschließend sinkt die Konzentration auf ein niedrigeres
Niveau, welches auch im adulten Gehirn erhalten bleibt. PBX1 wird
interessanterweise vor allem in Regionen aktiver Neurogenese exprimiert:
während der embryonalen Entwicklung im Telenzephalon, postnatal in der
subventrikulären Zone, auf dem Migrationsweg zum Bulbus olfactorius und in
verschiedenen Schichten des Bulbus olfactorius, die Zielorte der migrierenden
Neuronen sind (Abb. 1-5). Das Expressionsmuster von PBX1 überschneidet
sich mit dem von HOX-Proteinen. Diese Überlappung deutet darauf hin, dass
sie zusammen mit HOX-Genen bestimmte Zielgene regulieren (Redmond et al.,
1996).
In situ Hybridisierung von PBX1 zusammen mit Markern für Zellproliferation
(PCNA), postmitotische Neurone (Klasse III β-Tubulin) und Gliazellen (GFAP)
zeigen, dass v.a. proliferierende Zellen der subventrikulären Zone und Neurone
PBX1 exprimieren und weniger die Gliazellen. Diese Ergebnisse deuten auf
eine wichtige Rolle von PBX1 in der Neurogenese hin (Redmond et al., 1996;
Roberts et al., 1995).
1.5 Klinische Relevanz von PBX1
1984 wurde die Translokation (1;19)
(q23;p13.3) zum ersten Mal bei prä-B
ALL beschrieben (Abb. 1-6) (Crist et al.,
1990; Williams et al., 1984). 25% aller
pädiatrischen prä-B ALL weisen die
Translokation (1;19) auf (Carroll et al.,
1984).
Obwohl es sich um eine der häufigsten
Translokationen in humanen Leukämien
handelt, wurde sie bisher in keiner
anderen Leukämie gefunden. Kinder mit
prä-B ALL und t(1;19) haben eine
schlechtere Prognose als Kinder, deren
prä-B Zellen keine feststellbare Chromosomentranslokation zeigen. Sie werden
deswegen mit einer aggressiveren Therapie behandelt (Crist et al., 1990). E2A
Abb. 1-6: Die molekularen Konsequenz der Chromosomentranslokation (1;19)
Einleitung 9
ist ein Transkriptionsaktivator, der an den Immunglobin κ L-Ketten Enhancer
bindet. Es wird vor allem in der B-Zellreihen exprimiert. Die Translokation
fusioniert die Homöodomäne von PBX1 mit der transkriptionalen
Aktivierungsdomäne von E2A. Das E2A–PBX1 Onkoprotein behält die
Fähigkeit, DNA als Komplex mit HOX-Proteinen zu binden, während es die
Möglichkeit, mit Meis1 zu dimerisieren, verliert. Die Sequenz, an der Meis1
bindet, geht durch die Translokation mit E2A verloren (Knoepfler et al., 1997).
Man geht daher davon aus, dass die Zielgene von PBX1 und E2A-PBX1 sich
nur teilweise überlappen. E2A-PBX1 trägt zur Pathogenese der akuten
Leukämie wahrscheinlich auch dadurch bei, dass es die aberrante Aktivierung
von Zielgenen bewirkt, wodurch die Differenzierung der B-Zellen blockiert und
das Wachstum der undifferenzierten Zellen induziert wird (Fu and Kamps, 1997;
Kamps, 1997). Die Expression von E2A-PBX1 in Mäuseknochenmark, kultiviert
in Gegenwart von GM-CSF, resultiert in einem rapiden Auswuchs einer
immortalisierten, GM-CSF abhängigen Myeloblastenzelllinie (Kamps and
Wright, 1994). E2A–PBX1 hat also folgende onkogene Wirkungen: 1.
Blockierung der Differenzierung von murinen myeloischen Zellen; 2. Induktion
myeloisch und T-lymphatisch Leukämien in Mäusen; 3. Induktion von Foci in
Fibroblastenkulturen (Dedera et al., 1993; Kamps and Baltimore, 1993; Kamps
et al., 1990).
1.6 HOX-Gene
Die HOX-Genfamilie umfasst eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die durch
die Existenz einer bestimmten DNA-Bindungsdomäne charakterisiert werden.
Diese DNA-Bindungsdomäne wird Homöobox genannt (McGinnis and
Krumlauf, 1992). Homöoboxgene und ihre Proteine sind zuerst bei Drosophila
entdeckt worden. PBX-Proteine sind homolog zu dem Extradentical(Exd)-
Protein; es besteht eine 71%ige Sequenzidentität (Rauskolb et al., 1993).
Der Verlust dieser Gene durch Mutation oder Deletion führt zu bizarren
Phänotypen: z. B. Antennapedia Mutanten bei Drosophila Fliegen haben Beine
anstelle der Antennen, Ultrabithorax Mutanten haben ein weiteres Flügelpaar
(Ingham, 1988; Scott and O'Farrell, 1986); in der Maus verwandelt sich bei den
Mutanten ein Wirbelbogen in einen anderen oder der Entwicklungsablauf im
Hinterhirn ist geändert (Lumsden, 1990; McGinnis and Krumlauf, 1992). Beim
Einleitung 10
Menschen haben Mutanten Fusionen und Duplikationen in den Hand - oder
Fußknochen (Alberts, 1997).
Bei allen Lebewesen haben HOX-Gene eine multifunktionelle Rolle in der
Entwicklung der lebenswichtigen Organe wie Gehirn, Muskel und Knochen.
HOX-Gene kodieren Transkriptionsfaktoren, die die Expression von Genen
regulieren, die für die Einleitung verschiedener Entwicklungswege erforderlich
sind (McGinnis and Krumlauf, 1992).
HOX-Gene spielen in der Embryonalentwicklung eine große Rolle, vor allem in
der Entwicklung von Körpersegmenten (McGinnis and Krumlauf, 1992). Sie
bestimmen die axiale Identität des sich entwickelnden Embryos. Die Maus
besitzt 39 HOX-Gene, die in vier spezifischen Komplexen (HOXA – HOXD) auf
verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind (Graham et al., 1989; Krumlauf,
1992). Jedes Gen innerhalb eines Komplexes wird mit einer Nummer
bezeichnet (1-13). Besonders eindrucksvoll ist die Organisation der HOX-
Genfamilie untereinander. Gene, die näher am 3`Ende von der Gruppe stehen,
werden zeitlich früher und weiter anterior in der Entwicklung exprimiert als
diejenigen Gene, die sich weiter am 5`Ende befinden. HOX-Gene wirken
entweder als aktivierende oder reprimierende Transkriptionsfaktoren (Graham
et al., 1989; Hunt and Krumlauf, 1991; Trainor et al., 2000).
Zielsetzung 11
2 Zielsetzung
PBX1-Knock-out-Mäuse sterben 15 – 16 Tage nach Gestation mit schwerer
Hypoplasie bzw. Aplasie multipler Organsysteme. PBX1 wird in der
embryonalen Entwicklung in Regionen aktiver Neurogenese exprimiert. Da
PBX1-Knock-out-Mäuse nicht überleben, kann die Funktion von PBX1 in der
neuronalen Entwicklung nur durch konditionale Knock-out-Techniken und durch
Untersuchungen in vitro analysiert werden.
Durch Verwendung des Cre-lox-Systems haben wir murine ES-Zellen mit einem
Einzel- und Doppelallel-Knock-out erzeugt.
Ziel dieser Arbeit war es, zunächst ein Differenzierungsprotokoll in vitro zu
etablieren. Im ersten Teil wurden bereits veröffentliche Protokolle getestet und
modifiziert. Der Erfolg der Differenzierung sollte morphologisch,
immunhistochemisch und molekular gesichert werden. Dann wurde die
Differenzierung in vitro in die neuronale Zelllinie an den Wildtyp, den PBX1(+/-)
und den PBX1(-/-) embryonalen Stammzellen durchgeführt und miteinander
verglichen.
Im zweiten Teil der Arbeit sollten die verschiedenen Zelllinien auf molekularer
Ebene miteinander verglichen werden. Dazu wurde an verschiedenen
Kontrollpunkten während der Differenzierung RNA isoliert. Um unterschiedliche
Genexpressionsmuster zu evaluieren, wurden RT-PCR Untersuchungen und
Genexpressionsanalysen mit Mikroarrays durchgeführt.
Mit diesem System können potentielle Zielgene von PBX1 während der
zellulären Differenzierung identifizieren werden.
Material und Methoden 12
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte
Brutschrank Heraeus, Hanau
Eismaschine Ziegra, Isernhagen
Elektrophorese - Apparatur BioRad, München
Filmentwicklungsmaschine X-OMAT Kodak AG, Stuttgart
Fluidics Station 400 Affymetrix, Santa Clara/USA
GeneChip Scanner mit Workstation Affymetrix, Santa Clara/USA
Handcounter LB 122 (ß-Detector) Berthold, Wildbach
Heizblock TCR 100 Roth, Karlsruhe
Hybridisierungsofen Bachofer, Reutlingen
Hybridisierungsofen 640 Affymetrix, Santa Clara/USA
Inkubator, geregelte CO2-Atmosphäre Heraeus, Hanau
Magnetrührer Heidolph, Schwabach
Mikroskop Axiovert 100 Zeiss, Oberkochem
Mikroskop Axioplan 2 Zeiss, Oberkochem
Mikroskop DMIL Leica, Wetzlar
Mikroskop ID03 Zeiss, Oberkochem
Mikrowellenherd Siemens, Karlsruhe
Monitor Hantarex, Florenz/Italien
Murine Genome Array, U74Av2 Affymetrix, Santa Clara/USA
Neubauer Zählkammer Merck, Darmstadt
pH-Meter 761 Calimatic Knick, Berlin
Pipette, 10 µl Eppendorf, Hamburg
Pipette, 20 µl, 200 µl, 1000 µl Gilson,Villiers-le-Bel/Frankreich
Pipettierhilfe Pipet-Boy Integra Bioscience, Fernwald
Schüttelinkubator G25 New Brunswick Sc., Edison/USA
Spannungsgeräte Gibco BRL, Eggenstein
Spektrophotometer, GeneQuant pro Amersham, Braunschweig
ß-Counter, EASI COUNT 2000 Scotlab, Washington/USA
Material und Methoden 13
Sterilbank, Lamin Air HLB 2448 Heraeus, Hanau
Sterilbank, Microflow Nunc, Wiesbaden
Stickstofftank Air Liquide Kryotechnik, Düsseldorf
Thermocycler Gene Amp PCR 2400 Perkin-Elmer Cetus, Norwalk/USA
Thermoprinter Herolab, Wiesloch
UV – Cross linker Stratagene, Heidelberg
UV-Handlampe Typ HL-6-KM Bachofer, Reutlingen
UV-Transilluminator UVP, San Gabriel/USA
Video Copy Processor Herolab, Wiesloch
Vortex Super-Mixer Heidolph, Schwabach
Waagen Sartorius, Göttingen
Wasserbad Janke & Kunkel, Staufen
Wasserbad Haake, Karlsruhe
Zentrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge Megafuge 3.0R Heraeus, Hanau
Zentrifuge Megafuge1.0R Heraeus, Hanau
Zentrifuge, Varifuge 3.0R Heraeus, Hanau
3.1.2 Verbrauchsmaterialien
Anzuchtkolben Schott, Mainz
Deckgläser Engelbrecht, Edermünde
Insulin-Spritzen Braun, Melsungen
Falcon- Röhrchen Falcon, Becton Dickinson
Gewebekulturflaschen Nunc, Wiesbaden
Glaswolle Serva, Heidelberg
Hybond-N+-Transfermembran Amersham, Braunschweig
Kryoröhrchen Nalge Nunc, Rochester N.Y./USA
Nalgene Filtrationssysteme Nalge Nunc, Rochester N.Y./USA
Objektträgerflaschen Nunc, Wiesbaden
Objektträgerkasten Roth, Karlsruhe
Pasteurpipetten aus Glas Brand, Wertheim
Pipettenspitzen Gibco BRL, Eggenstein
Petrischalen Greiner, Frickenhausen
Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg
Material und Methoden 14
Röntgenfilme X-OMAT AR Kodak, Stuttgart
Schalen zum Abwiegen Bender & Holbein, Bruchsal
Skalpelle Feather, Basel/Schweiz
Sterilfilter, Millex-GP, 0.22 µm Millipore, Molsheim/Frankreich
Spritzen, steril Braun, Melsungen
Stericup Vakuumfiltereinheit Millipore, Molsheim/Frankreich
Whatman 3 MM-Papier Bender & Holbein, Bruchsal
3.1.3 Chemikalien
Alle Chemikalien besaßen den Reinheitsgrad pro analysi.
Agarose Sigma, Deisenhofen
Bacto-Hefe-Extract Difco, Detroit / USA
Bacto-Trypton Difco, Detroit / USA
Borsäure Merck, Darmstadt
Bromophenolblau Sigma, Deisenhofen
BSA BioLabs, Schwalbach/Taunus
Chloroform Merck, Darmstadt
DEPC Sigma, Deisenhofen
Dinatriumdiamintetraacetat Gibco BRL, Eggenstein
1,4-Dithiothreitol (DTT) Biomol, Hamburg
EDTA –Na2 x H2O (Titriplex) Merck, Darmstadt
Ethanol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Serva, Heidelberg
Ficoll Sigma, Deisenhofen
Formamid Fluka, Neu - Ulm
Formaldehyd Merck, Darmstadt
Gelatine Serva, Heidelberg
Glukose Merck, Darmstadt
Glycerol Serva, Heidelberg
Isopropanol Merck, Darmstadt
Kaliumacetat Merck, Darmstadt
Luria Broth Base Gibco BRL, Eggenstein
2 – Mercaptoethanol Sigma, Deisenhofen
Methanol Fluka, Neu - Ulm
Material und Methoden 15
Magnesiumacetat Merck, Darmstadt
Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) Merck, Darmstadt
Mowiol Calbiochem, La Jolla/USA
Natriumacetat Merck, Darmstadt
Natriumcitrat Merck, Darmstadt
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid Merck, Darmstadt
Paraformaldehyd ICN Biomedicals, Ohio/USA
Salzsäure HCl Merck, Darmstadt
Sephadex G-50 Pharmacia, Freiburg
Sodiumdodecylsulfat Sigma, Deisenhofen
Tri Pure Isolation Reagent Boehringer, Mannheim
Tris Base Merck, Darmstadt
Tris-Acetat Sigma, Deisenhofen
Triton Sigma, Deisenhofen
Tween 20 Merck, Darmstadt
Xylencyanol Sigma, Deisenhofen
3.1.4 Enzyme
Klenow-Enzym Calbiochem, LaJolla/USA
Restriktionsendonukleasen New England Biolabs, Frankfurt
Ribonuclease A Roche, Mannheim
Ribonuclease H Gibco BRL, Eggenstein
Reverse Transkriptase Gibco BRL, Eggenstein
E. coli DNA Polymerase Gibco BRL, Eggenstein
E. coli DNA Ligase Gibco BRL, Eggenstein
Taq-DNA Polymerase Perkin Elmer, Weiterstadt
3.1.5 Antibiotika
Ampicillin, Na-Salz Merck, Darmstadt
Penicillin/Streptomycin Gibco BRL, Eggenstein
Material und Methoden 16
3.1.6 Standards
1 kb-, 100bp-DNA-Leiter Gibco BRL, Eggenstein
Heringspermien-DNA Promega, Madison/USA
Lachsspermien-DNA Sigma, Münche
oligo p (dT) Primer Gibco BRL, Eggenstein
dNTPs 10mM Perkin Elmer,Weiterstadt
Bio-11-CTP 10mM Enzo Diagnostics Inc., Farmindale
Bio-16-UTP 10mM Enzo Diagnostics Inc., Farmindale
X-Gal Sigma, Deisenhofen
IPTG Sigma, Deisenhofen
Random-Primer Amersham, Braunschweig
3.1.7 Kits zur Bearbeitung von DNA und Protein
Ambion MEGA Script System Ambion Inc., Austin, Texas
GeneAmpRPCR Reagent Kit Perkin Elmer Cetus, Norwalk/USA
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
Qiagen Maxi Prep Kit Qiagen, Hilden
Qiagen Mini Prep Kit Qiagen, Hilden
Qiagen RNeasy Kit Qiagen, Hilden
Superskript Choice System Gibco BRL, Eggenstein
3.1.8 Radioaktive Substanzen
α-32P-dCTP Amersham, Braunschweig
3.1.9 Antikörper
PBX1 Santa Cruz, Heidelberg
β-Tubulin TUJI HISS Diagnostics GmbH, Freiburg
FITCm Dianova, Hamburg
Cy5 Dianova, Hamburg
ERK1 Dianova, Hamburg
3.1.10 Medien, Medienzusätze und gepufferte Salzlösungen
Knock-out-DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Gibco BRL, Eggenstein
Material und Methoden 17
Knock-out-Serum Gibco BRL, Eggenstein
DMSO Roth, Karlsruhe
Fötales Kälberserum (FCS), steril Gibco BRL, Eggenstein
L-Glutamin, 200 mM , steril G Gibco BRL, Eggenstein
LIF Esgro, steril Chemicon, Temecula/USA
ß-Mercaptoethanol, steril Gibco BRL, Eggenstein
nicht-essentielle Aminosäuren, steril Gibco BRL, Eggenstein
PBS, Dulbecco´s (w/o Ca, Mg), steril Gibco BRL, Eggenstein
Penicillin/ Streptomycin, 200 x Gibco BRL, Eggenstein
Trypsin/EDTA, 0.5 g/l, steril Gibco BRL, Eggenstein
3.1.11 Medien für das Arbeiten mit embryonalen Stammzellen
3.1.11.1 Medium zur Kultivierung embryonaler Stammzellen
500 ml Knock-out-DMEM
80 ml Serum (statt FCS)
5 ml P/S
10 ml Glutamin
5 ml nicht-essentielle Aminosäuren
0,5 ml β-mercaptoethanol
0,5 ml LIF
3.1.11.2 Medium zur Differenzierung embryonaler Stammzellen
500 ml Knock-out-DMEM
5 ml FCS
5 ml P/S
10 ml Glutamin
5 ml nicht-essentielle Aminosäuren
50 µl ATRA in 50 ml Medium (Falcon)
3.1.11.3 Medium zum Einfrieren embryonaler Stammzellen
40 ml Knock-out-Serum
10 ml DMSO
0.5 ml Zellen + Medium + 0.5 ml Einfrierlösun in ein steriles Einfrierröhrchen
geben
Material und Methoden 18
3.1.12 Stamm-und Standardlösungen
5 x TBE: 54 g Tris Base
27,5 g Borsäure
5 ml 0,5 M EDTA
wurden in 1 l H2O gelöst.
20 x SSC: 175,3 g NaCl
88,2 g Na-Citrat
wurden in H2O bidest. gelöst , der pH- Wert auf 7,0
eingestellt und das Volumen auf 1 l aufgefüllt.
20% SDS: 20 g Natriumdodecylsulfat
wurden in 100 ml H2O bidest. bei 65 °C gelöst und
sterilfiltriert.
0.5 M EDTA: 181,1 g Dinatriumdiamintetraacetat x 2 H2O wurden in 800
ml H2O bidest. gelöst, der pH-Wert mit konzentrierter
Natronlauge auf 8,0 eingestellt, das Volumen auf 1 l
aufgefüllt und autoklaviert.
1 M Tris HCl: 121,1 g Tris
wurden in 800 ml H2O bidest. gelöst , der pH-Wert mit
konzentrierter HCl auf den gewünschten Wert zwischen 7,2
und 9,0 eingestellt und das Volumen auf 1 l aufgefüllt und
autoklaviert.
10 x TE: 100 mM Tris HCl (pH 7,6)
10 mM EDTA
20 x MOPS 12 g MOPS
4,1 g Na-Acetat
8,7 g EDTA
Material und Methoden 19
wurde in 500 ml H2O gelöst und mit NaOH auf pH 7
eingestellt.
Mowiol 2,4 g Mowiol
6,0 g Glycerol
6 ml aqua dest
Ein Magnetrührer wurde 1 h lang eingesetzt 12 ml 0,2 M
Tris-HCl, pH 8,5 wurde im Wasserbad (50 °C) inkubiert und
gelegentlich umgerührt. Der Ansatz wurde bei 5000 g 15 min
lang zentrifugiert, anschließend aliquotiert und im Kühlfach (-
20 °C) aufbewahrt.
3.1.13 Bakterien
E. coli TOP10F' F{lacIqTn10(TetR)}mcrA∆(mrrhsdRMSmcrBC)Φ80lacZ∆M15
∆lacX74 recA1 deoR araD139∆(ara-leu)7696 galU galK rpsL
(StrR) endA1 nupG Invitrogen
3.1.14 Medien zur Anzucht von Bakterien
LB-Medium: 10 g Bacto-Trypton
5 g Bacto-Hefe-Extract
8 g NaCl
wurden in 800 ml dH2O gelöst , mit 1 M NaOH auf pH 7,5
eingestellt und autoklaviert. Das LB-Medium wurde bei 4 °C
gelagert.
LB-Agarplatten: 15 g Agar pro Liter noch nicht autoklaviertes LB-Medium
Die Lösung wurde dann autoklaviert, nach Abkühlen auf
etwa 45 °C das jeweils benötigte Antibiotikum in der
erforderlichen Konzentration hinzugefügt und auf der
Sterilbank in Petrischalen gegossen. Nach Erstarren wurden
die Platten in 4 °C gelagert.
Material und Methoden 20
3.1.15 Oligonukleotide
Es wurden verschiedene Oligonukleotide als Primer für PCR verwendet. Diese
wurden nach Sequenzvorgabe von Dr. Igloi (Biologische Fakultät der
Universität Freiburg) synthetisiert und von ihm erworben.
3.1.15.1 RT-PCR Primer
Plus-Primer 5` 3` Minus-Primer 5` 3` Aktin GGCACCACACCTTCTACAATGAGC TGTAGCCACGCTCGGTCAGGAT
BMP4 AACTTTCGATGTGAGCCCTG
TGGTTGGTTGAGTTGAGGTG
FGF15 CAGAACTGAGAGCCAGGAGC
GCAAGCCAGAAGGTATGAAGT
GFAP TCGGAGTTGAAAGTTACAGG
AGGATGGTTGTGGATTCTTC
N-CAM CTGTGCGAGTTTCTACTACAGG
CATCCTCATTGAACTGGACG
Nestin GGAGAGTCGCTTAGAGGTGC TCAGGAAAGCCAAGAGAAGC
OTX1 GCTGTTCGCAAAGACTCGCTAC
ATGGCTCTGGCACTGATACGGATG
OTX2 CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG
GAAGCTCCATATCCCTGGGTGGAAAG
PAX6 ACGTACAGTGCTTTGCCACCCA
CCGCCATTTCTCTTTCTTTCCTGA
PBX1 5` GGTCGAAGCAATCAGCAAACACAA
GCACCTTTAGAAGCCCAGTTATGG
PBX1 3´ GATGCAGCTGAAACAGAG
ACCGGATTCGCTTATTTCCA
WNT1 ACCTGTTGACGGATTCCAAG
TCATGAGGAAGCGTAGGTCC
3.1.16 Primer für die Northern Blot Analyse
Plus-Primer 5` 3` Minus-Primer 5` 3` OCT3/4 ATTCTGATGTCTGGTCCTTCG CAGAGGCCCATGTCAGTTAAG
IGF1R ATTCTGATGTCTGGTCCTTCG CAGAGGCCCATGTCAGTTAAG
IGF1 CTACCAAAATGACCGCACCTGC GGGGAAATGCCCATCTTTGTAATG
IGF2R AGCTCGATGATGCGTCTGTC GAAAAGAATCCACAGCCAGTG
IGF2 TGTGCTGCATCGCTGCTTAC GGACATCTCCGAAGAGGCTC
H19 CAGGTATCGGACTCCAGAGGGATT GGTGGGTGCTATGAGTCTGCTCTT
Colipase CTTCCAGCTTCCATCCACCC CCAGCTAACTGCGTGATCTC
Aktin GGCACCACACCTTCTACAATGAGC GTAGCCACGCTCGGTCAGGAT
Material und Methoden 21
3.2 Methoden
3.2.1 Methoden zur Arbeit mit eukaryoten Zellen
Die Arbeit mit eukaryoten Zellen erfolgte in einem Zellkulturlabor. Es wurde
unter einem sterilen Abzug gearbeitet und nur steril verpackte Plastikware
genutzt. Es wurden stets Handschuhe und Labormäntel getragen, um die
Wahrscheinlichkeit von Kontaminationen so gering wie möglich zu halten. Die
Zellen wurden in wassergesättigter Atmosphäre unter 5% CO2 bei 37 °C
kultiviert. Medien und Lösungen wurden bei –20 °C bzw. 4 °C aufbewahrt und
vor Gebrauch auf 37 °C vorgewärmt.
3.2.1.1 Kultivierung embryonaler Stammzellen
Durch Verwendung des Cre-lox system wurden Einzel– und Doppelallel Knock-
out-ES-Zellen muriner embryonaler Stammzellen erzeugt. Die PBX1(+/-)- und
PBX1(-/-)-ES-Zellen wurden von M. Kolanczyk hergestellt. Der
Herstellungsprozess wird im Anhang (Kap. 8-1) erläutert.
Die ES-Zellen verschiedenen Genotyps wurden jeweils in mit 0,1% Gelatine
beschichtete Gewebekulturflaschen kultiviert. Als Medium wurde
standardisiertes Knock-out-DMEM verwendet, und jeweils 500 ml davon mit 80
ml Knock-out-Serum, 5 ml Penicillin/Streptomycin, 10 ml 200 mM Glutamin, 5
ml nicht-essentielle Aminosäuren, 0,5 ml β-Mercaptoethanol und 0,5 ml
Leukemia inhibitory factor (LIF) ergänzt. Das Medium wurde nach Zubereitung
in 4 °C aufbewahrt und kurz vor Gebrauch auf 37 °C aufgewärmt.
ES-Zellen können undifferenziert gehalten werden, indem sie auf Ammenzellen
oder in mit 0,1% Gelatine beschichtete Gewebekulturflaschen unter Zusatz von
LIF kultiviert werden. Die ES-Zellen wurden regelmäßig mit PBS ohne Ca2+ und
Mg2+ gewaschen und mit Trypsin von der gelatinierten Gewebekulturplatte
gelöst. Die Zellmorphologie wurde immer unter dem Mikroskop beobachtet, das
Medium regelmäßig gewechselt und abhängig von der Wachstumsrate
gesplittet. Bei regulären Passagen wurden die ES-Zellen zweimal durch Zugabe
von PBS-Puffer gewaschen und anschließend nach Trypsinierung 1:3 bis 1:6
geteilt. Vor der erneuten Plattierung wurde die Trypsinlösung durch
Material und Methoden 22
Zentrifugation bei 1200 U/min entfernt. Bei jeder Passage wurde ein Teil der
ES-Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert.
3.2.1.2 Gelatinisieren von Zellkulturflaschen bzw. -platten
Gelatine-Lösung: 0,1 g zellkulturgetestete Gelatine wurde in 100 ml PBS
durch Aufkochen und Mischen gelöst und anschließend auf
der Sterilbank durch einen 0,22 µm-Filter sterilfiltriert.
Die Böden der Zellkulturflaschen wurden für 10 min mit 0,1% Gelatine-Lösung
beschichtet. Die Gelatine wurde schließlich abgesaugt und nach mindestens 10
min Trocknen konnten die Zellkulturflaschen mit Zellen beschichtet werden.
3.2.1.3 Trypsinieren von Zellen
Das Medium wurde von der Zellkulturflasche abpipettiert und die Zellen 1 x mit
PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen für ca. 5 min mit Trypsin/EDTA bis
zur Abrundung (mikroskopische Kontrolle) bzw. nach leichtem Klopfen
makroskopisch sichtbaren Ablösung bei 37 °C, 5% CO2 inkubiert. Die
Trypsinierung wurde durch Zugabe von Medium gestoppt, die Zellen durch Auf-
und Abpipettieren vereinzelt und in einem Falconröhrchen abzentrifugiert (1200
rpm, 5 min). Nun wurden die Zellen entweder in serumhaltigem Medium
resuspendiert und in der gewünschten Dichte ausplattiert oder zur weiteren
Verarbeitung (z.B. RNA-Isolierung) 1 x mit PBS gewaschen.
3.2.1.4 Einfrieren von Zellen
Einfriermedium: 50% ES-Zellmedium
40% Knock-out-Serum
10% DMSO
Die Zellen wurden trypsiniert und anschließend in ES-Zellmedium
aufgenommen. Nach dem Abzentrifugieren (5 min, 1200 rpm) und Absaugen
des Überstandes wurde das Zellpellet in 500 µl kaltem ES-Zellmedium
resuspendiert. In Kryoröhrchen wurden 500 µl kaltes Einfriermedium vorgelegt,
anschließend die Zellsuspension zügig hinzugemischt und mit Hilfe einer
Styropor-Ummantelung langsam auf –70 °C abgekühlt. Die Lagerung erfolgte
nach 18 – 24 h in flüssigem Stickstoff.
Material und Methoden 23
3.2.1.5 Auftauen und Revitalisieren von Zellen
Ein Kryoröhrchen wurde nach der Entnahme aus dem Stickstofftank für etwa 1
min im 37 °C-Wasserbad gehalten und unter Schwenken aufgetaut. Die
Zellsuspension wurde dann sofort in 6 ml Medium überführt, gemischt und bei
1200 rpm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das
Pellet in Medium resuspendiert.
3.2.1.6 ES-Zelldifferenzierung
ES-Zellen differenzieren bei ausreichender Dichte und dem Entzug von
Leukemia Inhibitory Faktor (LIF) und Feederzellen spontan in verschiedene
Zelltypen aller drei Keimblätter, wie z.B. Blut-, Endothel-, Skelettmuskel- und
Herzmuskelzellen. Diese Eigenschaft kann benutzt werden, um die Expression
bestimmter Gene während dieses Differenzierungsprozesses zu studieren.
In der vorliegenden Arbeit wurden PBX1-K.O.-ES-Zellen und WT-ES-Zellen in
vitro differenziert, um die Expression der Gene zu analysieren, die durch die
funktionelle PBX1-Elimination unterschiedlich reguliert werden. Es wurden die
Protokolle aus Bain et al. (Bain et al., 1995) und Gajovic et al. (Gajovic et al.,
1997) zugrundegelegt und modifiziert. Für die Induktion der Differenzierung
wurden die ES-Zellen 8 Tage lang auf Petrischalen in Suspension gehalten, um
die Bildung von Zellaggregaten zu fördern. Auf dem Boden dieser Petrischalen
sind ES-Zellen nicht in der Lage, sich anzuheften. Durch das E-Cadherin
Molekül, welches in der Zellmembran von ES-Zellen verankert ist, haben ES-
Zellen eine ausgeprägte Affinität zueinander und bilden spontan Aggregate, die
sogenannten Embryoidkörperchen. Sobald die Zellen auf den mit 0,1% Gelatine
überzogenen Gewebekulturflaschen (10 cm Durchmesser) eine bestimmte
Dichte erreicht hatten, wurden sie vorsichtig trypsiniert. Es war nicht möglich,
die Zellen in diesem Stadium zu zählen. Hätten wir sie noch stärker dissoziiert,
um einzelne Zellen zu erhalten, wäre die Fähigkeit, Aggregate zu bilden
verloren gegangen. Sie wurden auf eine Petrischale (14 cm Durchmesser) in
Knock-out-DMEM transferiert, das mit 1% FCS anstatt Serum, kein LIF und kein
β-Mercaptoethanol enthielt. Als FCS Konzentration wurde zunächst 10%
gewählt. Da jedoch mit 1% FCS bessere Ergebnisse erzielt wurden, wurde ein
Differenzierungsmedium mit 1% FCS verwendet (Kap. 4.1.2).
Material und Methoden 24
Nach 4 Tagen wurde das Medium gewechselt und zusätzlich 100 nM all-trans
Retinsäure (ATRA) beigefügt. Nur bei einer Kontrollgruppe wurde kein ATRA
hinzugefügt. Die Anzahl der Tage in Suspension entsprechend 4-/4- und 4-/4+
stammt aus dem Protokoll von Bain et al. (Bain et al., 1995). Die Konzentration
an ATRA wurde aufgrund der von Gajovic et al. beschriebenen Ergebnisse
gewählt (Gajovic et al., 1997).
Nach der 8 tägigen Induktionsperiode (4-/4+ bzw. 4-/4-) in der Petrischale,
wurden die Zellen auf je zwei 0,1% Gelatine überzogene Gewebekulturflaschen
(10 cm Durchmesser) und zwei mit 0,1% Gelatine überzogene Objektträger
transferiert, und für weitere 9 Tage kultiviert. Hier gingen sie spontan in den
Differenzierungsprozess über.
An zwei Kontrollpunkten (nach 3 und 9 Tagen) nach Zelladhäsion wurden die
Zellen morphologisch, molekularbiologisch und proteinchemisch analysiert.
3.2.2 Molekularbiologische Methoden
Alle folgende Methoden und Vorschriften wurden, soweit nicht anders
vorgegeben, dem Laborhandbuch „Molecular Cloning“ von Sambrock et al.
(1989) bzw. „Current Protocols in Molecular Biology“ von Ausubel et al. (1995)
entnommen.
3.2.2.1 RNA-Isolierung aus kultivierten Zellen
Die für die Präparation verwandten Chemikalien wurden ausschließlich für
diesen Zweck verwendet. Als Lösungsmittel wurde steriles pyrogenfreies
Wasser verwendet. Alle Präparationsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Die
RNA-Isolierung wurde nach dem vom Boehringer Mannheim gestellten
Protokoll durchgeführt. Mit Hilfe des TriPure Isolation Reagent (Boehringen-
Mannheim) konnten RNA, DNA und Protein von der gleichen Probe gewonnen
werden. Die Methode basiert auf Flüssigkeitsphasentrennung. TriPure Isolation
Reagent enthielt Phenol und Guanidin Thiocyanat. Während der
Homogenisierung mit der Probe lysierte es die Zellen und denaturierte
endogene Nuklease.
Die Zellen aus einer 160 ml Zellkulturflasche wurden zweimal jeweils mit 1x
PBS gewaschen und anschließend wurden 3-4 ml TriPure Isolation Reagent
Medium dazugegeben und solange mit der Pipette auf- und abgezogen, bis alle
Material und Methoden 25
Zellen von der Oberfläche gelöst waren. Jeweils 1 ml wurde in ein 1,5 ml
Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und 5 min inkubiert.
Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde 15 sec gründlich durch Vortexen
gemischt und bei Raumtemperatur (RT) 15 min lang inkubiert. Nach
Zentrifugation (15 min, 14000 rpm, 4 °C) wurden drei Phasen: eine klare obere
Phase (für RNA-Isolierung), eine weiße Interphase und eine rote organische
untere Phase (für DNA- und Protein-Isolierung) erzeugt. Die obere Phase
wurde von den anderen beiden Phasen separiert und in ein neues 1,5 ml
Eppendorf Reaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropanol versehen und
durch Vortexen gemischt. Nach 10 min Inkubation bei RT wurde die DNA durch
Zentrifugation (10 min, 13000 rpm, 4 °C) pelletiert und der Überstand
verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml 75% Ethanol resuspendiert. Nach
Zentrifugation (5 min, 8000 rpm, 4 °C) wurde Ethanol vorsichtig abpipettiert und
das Pellet luftgetrocknet. Das Pellet wurde in 20 µl aqua dest. dilutiert und bei –
80 °C gelagert. Anschließend stand die RNA zur weiteren Verarbeitung zur
Verfügung.
3.2.2.2 Konzentrationsbestimmung von cDNA- bzw. RNA-Lösung
Die photometrische Messung zur Quantifizierung und Reinheitsbestimmung der
DNA und RNA erfolgte bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm gegen
TE oder H2O in einer Quarzküvette.
3.2.2.3 Aufreinigung der präparierten gesamt RNA mittels RNAeasy
Das Volumen der gesamt RNA-Probe wurde mit RNase-freien Wasser auf 100
µl eingestellt, 350 µl Puffer RLT wurden zugegeben und der Ansatz wurde
kräftig geschüttelt. Nach Zugabe von 250 µl 100% Ethanol wurde das Lysat
gründlich mit der Pipette gemischt.
Eine RNeasy Minisäule wurde auf ein Sammelgefäß gesetzt und die Probe (700
µl) wurde auf die Minisäule gegeben und für 15 sec bei 10000 g bei RT
zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Die Minisäule wurde auf ein
neues Sammelgefäß transferiert. Nach Zugabe von 500 µl Puffer RPE und
Zentrifugation für 15 sec bei 10000 g wurde der Durchfluss nochmals verworfen
und der Waschvorgang wiederholt. Nach Transfer der Minisäule auf ein frisches
1,5 ml Eppendorf-Gefäß und nach Zugabe von 25 µl RNase-freiem Wasser
Material und Methoden 26
exakt auf die Membran der Minisäule wurde bei RT 5 min inkubiert und 2 min
bei max. Geschwindigkeit zentrifugiert. Dieser Elutionsschritt wurde wiederholt.
Das Eluat (ca. 50 µl) wurde mittels Vortexen gründlich gemischt.
Es folgte die Quantifizierung und Qualitätskontrolle, dazu wurde 1 µl Probe + 49
µl H2O und 1 µl Probe auf 1% Agarosegel gegeben und analysiert.
3.2.2.4 cDNA-Synthese
Um RNA in cDNA umzuwandeln, wurde das Superskript Choice System
verwendet.
Erststrangsynthese
10 µg/µl Gesamt-RNA wurden in Gegenwart von 1 µl oligo p(dT)15-Primer für
10 min bei 70 °C inkubiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Hierbei
hybridisiert der Primer an die poly(A)-Schwänze der mRNA.
4 µl First Strand Buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3 bei RT; 375 mM KCl; 15 mM
MgCl2), 2 µl 0,1 M DTT und 1 µl 10 mM dNTPs wurden in ein 0,5 ml Eppendorf
Reaktionsgefäß gegeben und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Die cDNA-
Erstrangsynthese wurde durch Zugabe von 2 µl (200 U) Superscipt II (RNase H
(-) -Reverse-Transkriptase) und Inkubation 50 min bei 42 °C durchgeführt.
RTase synthetisiert mit den vier dNTPs eine Kopie der mRNA: es entsteht so
ein cDNA-mRNA-Hybrid.
Zweitstrangsynthese
In jede Erststrangsynthese-Reaktion (20 µl) wurden 130 µl 2nd- Strand Master
Mix (5 x 2nd-Strand Buffer, 10 mM dNTP, 10 U/µl E. coli DNA-Ligase, 10 U/µl
E. coli-DNA-Polymerase, 2 U/µl RNase H, H2O) gegeben und für 2 h bei 16 °C
inkubiert. Durch Zugabe von 10 µl 0,5 M EDTA wurde die Reaktion beendet.
Dann wurde die RNA durch RNase verdaut, und die einzelsträngige cDNA mit
Hilfe der DNA-Polymerase in eine doppelsträngige cDNA umgewandelt.
3.2.2.5 In-vitro-Transkription
Im nächsten Schritt wurde eine in-vitro-Transkription mit Hilfe des Ambion
MEGA Script Systems durchgeführt, wobei biotin-markierte cRNA hergestellt
wurde. 1,5 µl cDNA wurde mit 18,5 µl Master-Mix versehen (75 mM AmbT7
ATP, 75 mM AmbT7 GTP, 75 mM AmbT7 CTP, 75 mM AmbT7 UTP, 10 mM
Bio-11-CTP, 10 mM Bio-16-UTP l, 10 x T7 Buffer Mix, 10 x T7 Enzymmix) und
Material und Methoden 27
kurz zentrifugiert. Der Ansatz wurde für 6 h bei 37 °C inkubiert. Für die
Biotinmarkierung wurde Bio-11-CTP und Bio-16-UTP verwendet.
3.2.2.6 RT-PCR
Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine
empfindliche Methode zum Nachweis spezifischer mRNAs. Zunächst wurde die
mRNA von den undifferenzierten ES-Zellen und den mit ATRA und ohne ATRA
behandelten differenzierten Zellen an d3 und an d9 mittels des Superskript
Choice Systems in cDNA umgewandelt.
Es wurde die Erststrangsynthese durchgeführt (Kap. 3.2.2.4), und anschließend
wurde die Reaktion durch Erhitzen bei 70 °C für 15 min gestoppt. Danach
wurde 1 µl RNase H hinzugegeben und bei 37 °C für 20 min inkubiert, um die
RNA zu entfernen. Die cDNA wurde für die PCR eingesetzt .
Durch die PCR kann eine spezifische DNA-Sequenz millionenfach vermehrt
werden. Ausgehend von einer Matrize aus einzelsträngiger DNA synthetisieren
DNA-Polymerasen einen komplementären DNA-Strang. Als Startpunkt
benötigen DNA-Polymerasen einen doppelsträngigen DNA-Abschnitt. Dieser
Abschnitt kann dadurch erzeugt werden, dass Einzelstrang-DNA mit Primer
inkubiert wird. Ein PCR-Zyklus umfasst drei Schritte:
1. Denaturierung der dsDNA
2. Annealing der spezifischen Primer an die ssDNA
3. Extension der Primer mit Hilfe der Taq-Polymerase
Die PCR-Reaktionen wurden mit einem Thermocycler Gene Amp PCR 2400
durchgeführt. Soweit nicht anders erwähnt, wurden PCR-Reaktionen in einem
Gesamtvolumen von 50 µl in folgender Standardzusammensetzung
durchgeführt:
cDNA 25 – 50 ng
Primer: up- and downstream 25 pM
dNTPs (dATP, dGPT, dCTP, dTTP) 0,2 mM
Taq-Polymerase 1,25 U
PCR - Puffer 1 x
Mg2+ 1,5 mM
ddH2O
Material und Methoden 28
Die eingesetzte Menge an DNA war bei den verschiedenen PCR-Verfahren
unterschiedlich. Bei mehr als einer PCR-Reaktion mit identischen Primerpaaren
wurden grundsätzlich sogenannte Master-Mixe, bestehend aus den o.g.
Komponenten ohne DNA, hergestellt und diese dann zur DNA pipettiert.
Der PCR-Thermocycler wurde wie folgt programmiert:
Zyklen Temperatur Zeit
Vorabdenaturierung 1 96 °C 2 min
Denaturierung
Annealing
Extension
15 – 35
15 – 35
15 - 35
96 °C
46 – 56 °C
72 °C
20 sec
30 sec – 1min
1 min / 1 kb
Extension 1 72 °C 7 min
Kühlen 1 4 °C ∞
Die Dauer der Extensionsphase wurde je nach bp-Länge der zu
amplifizierenden Sequenz modifiziert. Es wurde pro kb 1 min berechnet. Nach
Beendigung der PCR wurden die Amplifikationsprodukte auf einem 1%
Agarosegel ausgewertet.
Primer Design
Der Design von Primerpaaren ist für PCR-Reaktionen von entscheidender
Bedeutung und wurde durch das Computerprogramm Vector NTI durchgeführt.
Alle Primer wurden in einem Servicelabor von Dr. Igloi (Biologische Fakultät der
Universität Freiburg) nach Sequenzvorgabe synthetisiert.
Semiquantitative PCR
Die semiquantitative PCR wurde verwendet, um indirekt RNA-Konzentrationen
eines Zelllysates zu bestimmen. Aktin, ein konstitutiv exprimiertes
Haushaltsgen, wurde hierbei als Standard benutzt. In einer ersten
Versuchsreihe wurde bestimmt, wie viele PCR-Zyklen durchgeführt werden
konnten, ehe das PCR-Fragment die logarithmische Amplifikationsphase
verließ. Die Intensität der amplifizierten DNA-Fragmente nahm bis zum
Verlassen dieser Phase zu. Anschließend konnten nun verschiedene Zelllysate
miteinander abgeglichen werden, indem jeweils nur so viel Zelllysat für die PCR
eingesetzt wurde, dass das Aktin in allen Reaktionen die gleiche
Bandenintensität erzielte. Die Intensität ließ sich mit dem bloßen Auge
abschätzen.
Material und Methoden 29
3.2.2.7 Verdauung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
(Lehrach und Frischauf, 1982)
Die Aktivität von Restriktionsendonukleasen wird in Units (U) angegeben. Eine
Unit entspricht der Menge an Restriktionsenzym, die benötigt wird, um 1 µg
Lambda-DNA in einer Stunde vollständig zu schneiden.
Reaktionsansatz: x µg DNA
2 µl geeigneter 10 x Puffer (nach Angabe der Hersteller)
2 U Restriktionsendonuklease
20 µl H2O
Der Ansatz wurde 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend im Agarosegel
analysiert. Als Reaktionspuffer wurde das New England Biolabs (NEB) Puffer-
System verwendet. Diese Puffer werden vom Hersteller zusammen mit den
Enzymen geliefert.
3.2.2.8 Transformation von E. coli mit Plasmid- DNA
Es wurden 100 µl E. coli auf Eis aufgetaut. 1-2 µl DNA wurden (entsprechend
ca. 1 µg DNA) zugegeben, vorsichtig gerührt und 30 min auf Eis inkubiert. Der
Ansatz wurde für 2 min einem Hitzeschock von 42 °C im Wasserbad
unterzogen. Nach 2 min auf Eis wurden 250 µl SOC-Medium zugegeben und
für 1 h bei 37 °C im Schüttelinkubator bei 225 rpm inkubiert. Anschließend
wurden 20 µl und 200 µl auf LB-Agarplatten, die 200 µg/ml Ampicillin enthielten
und 30 min zuvor mit 40 µl IPTG (Isopropylthiogalactosid) und 40 µl X-Gal
behandelt wurden, ausgestrichen. Die Kultivierung erfolgte über Nacht bei 37
°C.
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid) ist ein farbloses Substrat
der β-Galactosidase. E. coli synthetisiert das Enzym normalerweise, wenn es
Laktose verarbeitet, kann aber auch durch IPTG, ein Laktoseanalogon,
angeregt werden. Wird X-Gal gespalten, entsteht ein blaues Produkt, mit dem
sich die Expression von lacZ (β-Galactosidase) einfach nachweisen lässt.
Bakterien, die das Plasmid mit der zu klonierenden DNA-Sequenz tragen,
haben durch die Zerstörung des lac-Genes die Fähigkeit verloren, β-
Galaktosidase zu bilden. Sie erscheinen deshalb als weiße Kolonien. So
können bestimmte Klone selektioniert werden.
Material und Methoden 30
3.2.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA (Qiagen-Methoden)
Mini-Präparation von Plasmid-DNA
5 ml LB-Medium mit 100 µg/ ml Ampicillin wurden mit einer transformierten E.
coli-Kolonie angeimpft und über Nacht im Schüttelinkubator (225 rpm) bei 37 °C
inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde anschließend zentrifugiert (20 min, 4
°C, 3500 rpm), der Überstand verworfen, das Pellet in 250 µl P1-Puffer
(Resuspensionspuffer: 50 mM Tris Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase
A) resuspendiert und 250 µl P2-Puffer (Lysepuffer: 200 mM, NaOH, 1% SDS)
hinzugegeben. Nach 5 min Lyse wurde diese durch Zugabe von 350 µl N3-
Puffer (Neutralisationspuffer: 3,0 M Kaliumazetat, pH 5,5) gestoppt.
Anschließend wurde für 10 min bei 14000 g zentrifugiert, der Überstand auf
eine Qiaprep spin Säule gegeben und diese 1 min bei 14000 g zentrifugiert. Die
DNA bindet dabei an die Silica Gel Membran der Säule. Sie wurde dann mit
0,75 ml PE-Puffer gewaschen, dieser 2 mal abzentrifugiert (jeweils 1 min,
14000 g), bevor die DNA mit 40 µl Wasser eluiert wurde. Die Lagerung erfolgte
in –20 °C.
Die Identität des Plasmids wurde durch Restriktionsverdau der Plasmid-DNA
überprüft.
Maxi-Präparation von Plasmid-DNA
250 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin wurden mit einer transformierten E.
coli Kolonie angeimpft und für 12 bis 16 h im Schüttelinkubator (225 rpm) bei 37
°C inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde in 250 ml konische
Falconröhrchen umtransferiert. Nach Zentrifugation (20 min, 4 °C, 3500 rpm)
wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 10 ml Puffer P1 resuspendiert
und in ein 50 ml Falconröhrchen überführt. Es wurden 10 ml Puffer P2
hinzugefügt, das Ganze durch vorsichtiges 4 bis 6 maliges Umkippen gemischt
und für 5 min bei RT inkubiert. 10 ml gekühlter Puffer P3 wurden zugegeben, es
wurde gemischt und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In der
Zwischenzeit wurde ein Qiagen-tip 500 mit 10 ml QBT- Puffers (750 mM NaCl,
50 mM MOPS, pH 7,0, 15% Isopropanol, 0,15% Triton X-100) äquilibriert.
Anschließend wurde der Überstand im Falconröhrchen auf die Qiagensäule
gegeben, nach Durchlaufen die Säule zweimal mit 10 ml QC-Puffer (1,0 M
NaCl, 50 mM MOPS: pH 7.0, 15% Isopropanol) gewaschen und die DNA mit 10
Material und Methoden 31
ml QF-Puffer (1,25 M NaCl, 50 mM Tris Cl, pH 8,5, 15% Isopropanol) eluiert.
Dem aufgefangenenen Eluat wurde zur DNA-Präzipitation 10,5 ml Isopropanol
hinzugegeben, es wurde gemischt und für 2 h bei 4 °C, 4000 rpm zentrifugiert.
Der Überstand wurde abgegossen, das DNA-Pellet in 10 ml 70% Ethanol
resuspendiert und für 15 min bei 4 °C, 4000 rpm zentrifugiert. Das
luftgetrocknete Pellet wurde in 200 - 400 µl TE-Puffer aufgenommen. Durch
Restriktionsverdau wurde die Identität der Plasmid-DNA überprüft.
3.2.2.10 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA und RNA–Fragmenten
Agarosegel – Elektrophorese
Zur Auftrennung von DNA–Fragmenten unterschiedlicher Größe wurden
Agarosegele verwendet. Je nach Größe der zu trennenden Fragmente wurden
unterschiedliche Agarose-Konzentrationen verwendet (meist 1% Agarose).
2g Agarose wurden abgewogen, 200 ml TBE-Puffer, hinzugegeben und im
Mikrowellenherd aufgekocht bis die Agarose vollständig aufgelöst war. Nach
Abkühlen auf unter 55 °C wurde 20 µl Ethidiumbromid hinzugefügt, das Gel in
eine zuvor vorbereitete Gelform mit Kamm gegossen und bei RT abgekühlt.
Nach Erstarren des Gels wurde der Kamm und die Gelform entfernt und das
Gel in die mit TBE-Puffer gefüllte Elektrophoreseskammer eingebaut. Die
Proben wurden zusammen mit DNA–Ladepuffer (0,25% Bromophenolblau,
0.25% Xylencyanol, 30% Glycerol in H2O) in die durch den Kamm vorgeformten
Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese wurde unter einer Spannung von 3-4
V/cm2 durchgeführt. Die negativ geladenen DNA-Moleküle wandern zum
positiven Pol. Die Geschwindigkeit hängt von ihrer Größe und Konformation ab.
Durch den mit der DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid
wurden die DNA-Fragmente unter UV-Licht als Banden sichtbar. Zur
Dokumentation wurden die Agarosegele auf dem UV-Transilluminator mittels
eines Video Copy Processors aufgenommen und über ein Thermoprinter ein
Ausdruck des Bildes erstellt.
Agarose- Formaldehyd-Gele zur Auftrennung von RNA
Die Gelkammer wurde zunächst über Nacht mit NaOH gefüllt. 1% Agarose
wurde in Laufpuffer (Laufpuffer: 20 mM MOPS; 5 mM Na-Acetat; 1 mM EDTA;
in H2O mit 2 N NaOH auf pH 7,0 eingestellt) aufgekocht, auf ca. 55 °C
Material und Methoden 32
abgekühlt, mit Ethidiumbromid und Formaldehyd (0,65%) versetzt und in den
vorbereiteten RNase-freien Gelträger gegossen.
Die RNA-Proben wurden mit 25 – 30 µl RNA-Ladepuffer (10 ml Formamid, 3,5
ml Formaldehyd 37%, 1 ml 20 x MOPS, 0,2 g Ficoll, 20 ml H20, Bromophenol
blau Pulver) versetzt, für 5 min auf 65 °C erhitzt und kurz auf 4 °C abgekühlt.
Die Elektrophorese wurde unter einer Spannung von 3-4 V/cm2 durchgeführt.
3.2.2.11 Isolierung von DNA–Fragmenten aus Agarosegelen
Die DNA wurde mittels des Qiaquick Gel Extraction Kits isoliert. Die
gewünschte DNA–Bande wurde unter UV – Licht (λ = 312 nm, UV–Handlampe)
mit einem sterilen Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten und in ein 1,5
ml Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion und Aufreinigung erfolgte unter
Verwendung des Protokolls für den Quiagen Gel Extraction Kit. 1 Vol. Gel
wurde mit 3 Vol. Solubilisierungspuffer QG versetzt und für 10 min inkubiert, bis
das Gel vollständig aufgelöst war. Nach Gabe von 1 Vol. Isopropanol, wurde die
Lösung auf eine Säule aufgetragen und für 1 min bei 15000 rpm in der
Minizentrifuge zentrifugiert. Die nun an die Säule gebundene DNA wurde mit
Waschpuffer (PE-Puffer mit Ethanol) gewaschen. Anschließend wurde 50 µl EB
Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) auf die Membran platziert, ca. 1 min bei RT
inkubiert und schliesslich die DNA in einem letzten Zentrifugationsschritt eluiert.
3.2.2.12 Northern-Blot
Ein Restriktionsfragment mit einer bestimmten Basensequenz kann durch die
Hybridisierung der im Gel aufgetrennten und auf einen Filter übertragenen RNA
mit einer radioaktiv-markierten, komplementären RNA-Sonde detektiert werden
(Northern Blot). Die Sonden wurden RT-PCR basiert selber hergestellt. Die
dazu verwendeten Primer sind in Kap. 3.1.16 aufgelistet.
Markierung von DNA mit α³²P-dCTP
Die Proben wurden mittels RT-PCR gewonnen. Zur radioaktiven Markierung
von doppelsträngiger DNA wurde das Megaprime DNA Labeling System von
Amersham Pharmacia Biotech verwendet. Es wurden 5 µl DNA-Fragment (in
dH2O mit einer Konzentration von 0,5 – 1,0 µg/µl) mit 5 µl Random-Primer für 5
min aufgekocht (95 °C – 100 °C Heizblock) und kurz zentrifugiert. Danach
wurden 10 µl Labelling-Puffer (dNTP, Tris pH 7,8, MgCl2, β-Mercaptoethanol),
Material und Methoden 33
23 µl H2O, 2 µl Klenow-Enzym (1 U/µl) und 5 µl α-32P-dCTP (50 µCi)
hinzugeben. Der Ansatz wurde für 10 min bei 37 °C inkubiert. Sephadex G-50
(5 g Sephadex G –50 wurden in 50 ml TE aufgeschwemmt und autoklaviert)
wurde zur Abtrennung der radioaktiv markierten DNA–Fragmente von nicht
inkorporierten Nukleotiden eingesetzt. Eine sterile Einmalinsulinspritze wurde
mit einem Stopfen aus silanisierter Glaswolle am unteren Ende verschlossen
und mit Sephadex G-50 gefüllt. Die Spitze der Spritze wurde in ein 1,5 ml
Eppendorfreaktionsgefäß gestellt, in einem 15 ml Falconröhrchen 5 min bei
2500 rpm zentrifugiert und das Eluat verworfen. Der Ansatz wurde auf diese
Sephadex-G-50-Säule gegeben und zentrifugiert (2500 rpm, 5 min). Der
abzentrifugierte Ansatz wurde in ein Eppendorfgefäß überführt, für 5 min bei 95
°C - 100 °C inkubiert und danach für 5 min auf Eis gestellt. Die Radioaktivität
der Probe wurde vor Inkubation mit dem Hybond N-Filter im Scotlab easicount
(β-Counter) gemessen und lag bei ca. 10 - 100 kcpm/µl.
Transfer von RNA auf Hybond N-Filter Die RNA wurde nach ihrer Länge mittels eines formaldehydhaltigen
Agarosegels aufgetrennt. Das Formaldehyd denaturiert die RNA und verhindert
damit Basenpaarungen. Die RNA wurde von dem Gel mittels Kapillarblotting auf
eine Membran transferiert (Abb. 3-1).
Abb. 3-1: Blot-Aubau:
• Transfer-Puffer = 10 x SSC
• Basis-Block = Schwamm
• Filterpapier = 3 Schichten MM-Whatmannpapier
• Gel = Agarosegel mit aufgetrennter DNA
• Membran = Hybond N+Filter
• Gewiht = 300 bis 500 g Bleigewicht
(aus Nicholl, 1995)
Material und Methoden 34
Der Transfer der RNA auf den Filter erfolgte über Nacht. Der Filter wurde
anschließend für 5 min in 2 x SSC gewaschen. Die RNA-Seite des Filters wurde
markiert und nach 10 min Trocknen des Filters bei RT wurde durch UV-
Bestrahlung (20 sec) der RNA-Seite auf dem UV-Transluminator die RNA auf
die Filteroberfläche fixiert („cross-link“).
Hybridisierung der Hybond N+-Filter mit radioaktiv markierten DNA-
Sonden
Der Filter mit fixierter DNA wurde zunächst 5 min in 2 x SSC gewaschen und
vorsichtig in eine Glasröhre gerollt. Nun wurden 10 ml Church Puffer (0,5 M
Natriumhydrogenphosphat, pH 7,4, BSA, 1% SDS, 7% EDTA pH 8,0, 0,1
mg/ml, 65 °C ) und 100 µl Lachsspermien-DNA (zuvor in für 5 min in 100 °C
denaturiert) hinzugeben und schließlich für 30 min im Rotationsofen bei 65 °C
vorhybridisiert. Nachfolgend wurde das radioaktiv-markierte Oligonukleotid in
den Church Puffer gegeben und über Nacht im 65 °C Rotationsofen inkubiert.
Der Filter wurde dann 2 x 5 min mit LSW-Puffer (20 ml 20 x SSC, 2,5 ml 10%
SDS / 500 ml H2O) und anschließend 2 x 20 min mit zuvor auf 65 °C erwärmten
HSW-Puffer (2,5 ml 20 x SSC, 5,0 ml 10% SDS/500 ml H2O) im 65 °C
Rotationsofen gewaschen. Der Filter wurde feucht in Plastikfolie verpackt und in
einer Filmkassette bei –80 °C mit einem Kodak X-OMAT AR-Röntgenfilm
autoradiographiert.
3.2.2.13 Genexpressionsanalyse
Ein DNA-Mikroarray ('Chip') besteht aus Oligonukleotiden, die in höchster
Dichte auf einem Objektträger aufgebracht und fixiert werden. Die RNA der
verschiedenen Zelllinien werden mit den Arrays hybridisiert. Zueinander
komplementäre Nukleotidstränge gehen eine stabile nicht-kovalente
Wechselwirkung ein und können nachfolgend detektiert werden. Die
abschließende Auswertung der Expressionsdaten erfolgt durch den Einsatz
spezifischer Software (Mikroarray Suite Software 5.0) (Sherlock, 2000).
Mikroarray Chips wurden mit der RNA von den WT-ES-Zellen und PBX1(-/-)-
ES-Zellen im undifferenzierten und differenzierten Stadium hybridisiert.
Zusätzlich wurde noch ein zweiter PBX1(-/-)-Klon nach der Differenzierung
hybridisiert. Die zu untersuchende RNA wird in cDNA umgeschrieben und in
einer nachfolgenden in-vitro-Transkription amplifiziert. Dabei werden von der
Material und Methoden 35
T7-RNA-Polymerase biotinylierte Ribonukleotide in die wachsende cRNA-
Stränge inkorporiert. Die Detektion erfolgt nach Anfärben der DNA-cRNA
Hybride mit Streptavidin-Phycoerythrin mittels eines Argon-Ionen Lasers
(Kohlmann et al., 2002).
Als Mikroarray wurde das Murine Genome U74Av2 Array
verwendet (Abb. 3-2). Dieses Mikroarray umfasst 12000
murine Gene, davon sind 6000 Gene in der Mouse UniGene
database funktionell charakterisiert und 6000 Gene gehören
zu den EST-cluster. Die Gene werden jeweils durch 16
verschiedene Oligonukleotide repräsentiert. Als interne
Mismatch-Kontrolle werden ebenfalls sequenzspezifische
Oligonukleotide mit einer zentralen Punktmutation
verwendet. Die Mikroarray Software ist in der Lage, die
Hybridisierungsintensität von der „mismatch“ Probe von der exakt
komplementären Probe zu subtrahieren und errechnet damit für jede Probe die
spezifische Intensität
Zum Affymetrix Gene Chip system gehören zusätzlich zum Mikroarray, noch ein
„Fluidicis Station“, Scanner und eine „Computer Workstation“ (Abb. 3-3). Die
„Fluicids Station“ dient zum Waschen und Anfärben der Proben. Sie enthält vier
Module für je eine Probe. Jedes Modul wird unabhängig durch die Microarray
Software kontrolliert. Beim Scanner handelt es sich um ein Argon-Ionen Laser,
der in der Lage ist, die markierte cRNA zu detektieren. „Die Computer
workstation“ dient mit Microarray Software dazu, die „Fluicids Station“ und den
Scanner zu kontrollieren.
Abb. 3-3: Affymetrix GeneChip System: Fluicids Station, Scanner und ein Computer mit Worksstation (http://info.med.yale.edu)
Abb. 3-2: Murine Genome U74Av2 Array
Material und Methoden 36
Herstellung der cRNA
Aus den WT-Zellen und zwei PBX1(-/-)-Klonen wurden jeweils im
undifferenzierten und differenzierten Stadium (d9) biotin-markierte cRNA als
Sonde für die Hybridisierung der DNA-Mikroarraychips hergestellt. Dafür wurde
zunächst RNA isoliert (Kap. 3.2.2.1). Im Anschluss daran wurde die gesamt
RNA mittels RNAeasy (Quiagen) aufgereinigt (Kap. 3.2.2.3). Die mRNA wurde
in einer Erst-Strangsynthese und Zweit-Strangsynthese cDNA umgeschrieben
(Kap. 3.2.2.4). Im nächsten Schritt wurde eine in-vitro-Transkription mit Hilfe
des Ambion MEGA Script Systems durchgeführt (Kap. 3.2.2.5), wobei biotin-
markierte cRNA hergestellt wurde. Die Produkte aus der in-vitro-Transkription
wurden nochmals mittels des RNeasy Mini Kits aufgereinigt (Kap. 3.2.2.1)
Hybridisierung
Für die Hybridisierung wurde die biotinmarkierte cRNA in kleinere Fragmente
zerteilt. Die Fragmentierung wurde in einem Fragmentierungspuffer (200 mM
Tris-Acetat pH 7,5, 500 mM K-Acetat, 150 mM Mg-Acetat) durchgeführt. Es
wurde 35 min bei 95 °C inkubiert und sofort aufs Eis gelegt. Vor der
Hybridisierung wurden die Arrays mit 200 µl Hybridisierungspuffer befüllt und für
10 min bei 45 °C im Rotationsofen prähybridisiert. Nachdem die fragmentierten
cRNA (20 µl) für 2 min bei 65 °C erhitzt worden war, wurden 280 µl
Hybridisierungscocktail (10 mg/ml Heringspermien-DNA, 20x Kontroll-RNA 50
mg/ml acetyliertes BSA, 2x Hybridisierungspuffer) hinzugefügt. Der Ansatz
wurde zunächst bei 99 °C für 5 min, dann bei 45 °C für 5 min inkubiert und für 2
min bei maximaler Drehzahl zentrifugiert. Der Puffer wurde aus den Arrays
entfernt und die entsprechenden Arrays wurden mit 200 µl des entsprechenden
Hybridisierungscocktails befüllt und die Öffnungen wurden mit Klebepunkten
abgedichtet. Die Hybridisierung wurde 16 h bei 45 °C im Rotationsofen (60 rpm)
durchgeführt. Direkt im Anschluss auf die Hybridisierung folgten automatisierte
Waschschritte in den „Fluidics Stations“ der Firma Affymetrix. Jedem Array –
Typ ist ein bestimmtes Waschprotokoll zugeordnet. Es wurde mit stringentem
Waschpuffer (100 mM MES, 0,1 M Na+ + 0,01% Tween-20) und nicht-
stringentem Waschpuffer (6x SSPE (20xSSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02
M EDTA), 0,01% Tween-20) gewaschen. Die Arrays wurden in die passende
Module der Fluidics Station platziert und die Gefäße mit der Sape-Solution in
Material und Methoden 37
den Sample-Holder des entsprechenden Moduls gestellt. Das Waschprogramm
(EukGE-WS1) lief automatisch ab. Nach den Waschgängen wurde die
hybridisierte RNA auf den Chips gefärbt. Der Färbeschritt erfolgte im
Färbepuffer (2 x stain buffer, IgG 10 mg/ml, H2O), in Gegenwart von 50 mg/ml
acetyliertem BSA und 0,5 g/ml des Farbstoffs Anti - Streptavidin phycoerythrin
(SAPE).
Die Detektion erfolgt nach Anfärben der DNA-cRNA-Hybride mit Steptavidin-
Phycoerythrin mittels eines Argon-Ionen Lasers. Die „GenChip“-Software der
Firma Affymetrix wurde benutzt, um für jedes Gen aus der Intensität der Signale
einen einzelnen Wert berechnet. Die Werte wurden mit Hilfe einer Datenbank
ausgewertet.
3.2.3 Proteinchemische Methoden
3.2.3.1 Immunzytochemie für Zellkulturen (Fluoreszenz-Methode)
Das Prinzip beruht auf der Visualisierung der spezifischen Bindung eines
Antikörpers an sein Antigen. Die Detektion erfolgte mit einem direkt an den
Fluoreszenz-Farbstoff FITC oder CY5 gekoppelten Sekundärantikörper. Nach
Absaugen des Mediums wurden die Zellen in den Objektträgerflaschen mit 4%
Paraformaldehyd / PBS für 10 min fixiert. Anschließend wurden die Zellen 10
min in 3,7% Formaldehyd / PBS inkubiert und bei RT zweimal für je 5 min mit
PBS gewaschen. Da Paraformaldehyd die Membran nur fixiert, aber keine
Permeabilisierung der Zellmembran hervorruft, wurden die Zellmembranen
zweimal je 5 min mit 0,3% Triton-TX / PBS bei RT permeabilisiert, um den
Antikörpern den Zugang zu intrazellulären Antigenen zu ermöglichen.
Anschließend wurde erneut zweimal für je 5 min mit PBS gewaschen. Um
unspezifische Antigenbindungen des Sekundärantikörpers und damit ein falsch-
positives Ergebnis zu verhindern, erfolgte die Inkubation in Blocking Solution
(5% BSA / PBS) für 1 h im Dunkeln auf einen Schüttler. Nach zweimaligem
Waschen mit PBS erfolgte die Zugabe des Primärantikörpers (Eigenschaften
und Arbeitskonzentrationen siehe Tab.3-1) in 3% BSA und Inkubation für 24 h
bei 4 °C in einer feuchten Kammer. Nach Auswaschung mit PBS wurde der
Fluoreszenz-markierter Sekundärantikörper benutzt, in 3% BSA hinzugegeben
(Eigenschaften und Konzentrationen siehe Tab.3-2) und für 1 h bei RT
Material und Methoden 38
inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurde die Objektträgerflasche vom
Objektträger entfernt. Nach Lufttrocknung wurde das Präparat mit Mowiol fixiert
und ein Deckblatt befestigt. Die Fluoreszenzpräparate wurden mit Hilfe eines
Fluoreszenzmikroskops photographiert (Axiovert, Zeiss).
Antikörper Eigenschaft Firma Verdünnung
TUJ1 monoklonal, Maus HISS Diagnostics Gmbh 1:500
ERK1 monoklonal, Maus Dianova 1:500
konjugierter Farbstoff
Eigenschaft Firma Verdünnung
FITC Ziege-anti-Maus IgG Dianova 1:200
Cy5 Ratte-anti-Maus IgG Dianova 1:200
Tab. 3-2: Liste der verwendeten Sekundärantikörper, deren Eigenschaft, Firma und Arbeitskonzentration
Tab. 3-1: Liste der verwendeten Primärantikörper, deren Eigenschaft, Firma und Arbeitskonzentration
Ergebnisse 39
Abb. 4-1: RT-PCR von OCT3/4 an undifferenzierten embryonalen Stammzellen „0“ von PBX1(+/+-), PBX1(+/-) und den beiden PBX1(-/-)-Zelllinien. „(-)“ bedeutet Negativkontrolle.
4 Ergebnisse
4.1 Etablierung eines neuronalen Differenzierungsprotokolls
Ziel dieser Dissertation war es, zunächst ein funktionstüchtiges Protokoll für die
Differenzierung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) in neuronale Zellen zu
etablieren.
4.1.1 ES-Zellkultur
Die Pluripotenz der benutzten ES-Zelllinien wurde über die OCT3/4-Expression
nachgewiesen (Kap. 1-2). Bei den undifferenzierten Wildtyp (WT)-, PBX1(+/-)-,
und zwei verschiedenen PBX1(-/-)-ES-Zelllinien wurde eine starke OCT3/4
Expression nachgewiesen. Die durch RT-PCR evaluierte Expressionsstärke
war in allen Zelllinien gleich (Abb. 4-1).
Die Morphologie der ES-Zellen wurde täglich unter dem Mikroskop observiert
und in regelmäßigen Abschnitten photographisch festgehalten. Sowohl die WT-
ES-Zelllinien, als auch die PBX1(+/-) und die PBX1(-/-)-ES-Zelllinien blieben
unter dem Zusatz von leukemia inhibitory factor (LIF) undifferenziert. Abbildung
4-2 zeigt die Morphologie der undifferenzierten WT-ES-Zellen (A und B) sowie
der PBX1(+/-)- (C und D) und der PBX1(-/-)-ES-Zelllinien (E - H). Die ES-Zellen
wuchsen in scharf abgrenzbaren Kolonien. Es konnte im undifferenzierten
Zustand kein Unterschied zwischen den Zelllinien verschiedenen Genotyps
festgestellt werden (Abb. 4-2).
Ergebnisse 40
Abb. 4-2: Die Morphologie im Phasenkontrastmikroskop der undifferenzierten ES-Zellen als WT-ES-Zellen und nach homologen Rekombination zum Knock-out des PBX1-Gens. Die ES-Zellen wuchsen auf zuvor mit EMFI Ammenzellen beschichteten Zellkulturflaschen in Kolonien und befanden sich im subkonfluenten Zustand. Es war kein Unterschied zwischen den Zelllinien sichtbar. A + B: PBX1(+/+); C + D: PBX1(+/-); E + F: PBX1(-/-) Klon 1; G + H: PBX1(-/-)Klon 2
Ergebnisse 41
Abb. 4-4: Embryoidkörperchen nach 4 Tagen in Suspension. A: PBX1(+/+), B:PBX1(+/-) und C: PBX1(-/-)
4.1.2 In-vitro-ES-Zelldifferenzierung
Abbildung 4-3 illustriert die Durchführung der Differenzierung von ES-Zellen in
vitro. Die Differenzierung wurde begonnen, indem die Zellen in Suspension
ohne LIF Faktor und zunächst ohne all-trans Retinsäure (ATRA) kultiviert
wurden. In diesem Stadium wurden die ES-Zellen in nichtadhäsiven
Petrischalen im Differenzierungsmedium gehalten. Unter diesen Bedingungen
adhärierten die ES-Zellen nicht an der Schalenoberfläche und begannen
Embryoidkörperchen mit dreidimensionalen Zell-Zell Interaktionen zu formen.
Diese Embryoidkörperchen waren zunächst klein und unregelmäßig geformt
(Abb. 4-4). Es zeigte sich kein Unterschied zwischen den WT-, PBX1(+/-)- und
PBX1(-/-)-Zelllinien.
Nach 4 Tagen in Suspension wurden die Zellen in zwei Gruppen geteilt, die
eine Hälfte wurde als Kontrollgruppe in Suspension ohne ATRA (4-/4-) und die
andere Hälfte in Suspension mit ATRA (4-/4+) gehalten.
Abb. 4-3: Schema für die in-vitro-Differenzierung von ES-Zellen. ES-Zellen wurden 4 Tage als Embryoidkörperchen kultiviert, gefolgt von weiteren 4 Tagen entweder mit oder ohne ATRA. Das Stadium in der Differenzierung wurde als X-/Y + oder – bezeichnet, wobei X die Anzahl der Tage bis zur ATRA Beigabe bezeichnet und Y die Tage mit (Y+) bzw. ohne (Y-) ATRA Zugabe. Die Zellen wurden auf Zellkulturflaschen transferiert. Als Kontrollpunkte wurden 3dpi, 3 Tage nach Induktion, und 9dpi, 9 Tage nach Induktion, festgelegt. (modifiziert nach Bain et al., 1996)
Ergebnisse 42
Die Embryoidkörperchen vergrößerten sich ab dem 5. und 6. Tag in Suspension
und nahmen eine Kugelform an (Abb. 4-5). Der morphologische Aspekt der ES-
Zelllinien unterschied sich nicht zwischen den einzelnen Genotypen.
Abb. 4-5: Embryoidkörperchen (4-/4+) nach 8 Tagen in Suspension nach Behandlung mit 100 nM ATRA. A,B: PBX1(+/+); C,D: PBX1(+/-); E,F: PBX1(-/-) Klon 1; G,H: PBX1(-/-) Klon 2.
Ergebnisse 43
Abb. 4-6: Embryoidkörperchen (3dpi) 3 Tage nach Readhäsion auf Zellkulturflaschen nach 100 nM ATRA Behandlung (4-/4+) Suspension A: PBX1(+/+), B: PBX1(+/-) und C: PBX1(-/-)
Nach 8 Tagen in Suspension wurden die Embryoidkörperchen wieder in
Gelatine-beschichtete Zellkulturflaschen transferiert. Innerhalb eines Tages
adhärierten die Embryoidkörperchen an den beschichteten Boden der
Zellkulturflasche. Nach der Wiederanheftung begannen sie in verschiedene
Gewebetypen zu differenzieren. In den folgenden Tagen begannen die
Embryoidkörperchen sich abzuflachen und auszustrecken (Abb. 4-6). Es waren
zunächst keine neuronale Fortsätze zu erkennen. In diesem Stadium der
Differenzierung (3dpi) konnten keine Unterschiede zwischen den Zelllinien
verschiedenen Genotyps (WT-, PBX1(+/-) und PBX1 (-/-) beobachtet werden.
Die ES-Zellen, die mit dem ATRA induzierten Differenzierungsprotokoll
behandelt wurden, differenzierten hauptsächlich zu neuronale Zellen, während
bei den anderen ES-Zellen, die nicht mit ATRA behandelt wurden,
verschiedene Zelltypen wie Herzmuskel-, Skelettmuskel- und hämatopoetische
Zellen vorlagen. Herzzellen kontrahierten rhythmisch und waren von daher
allein durch lichtmikroskopische Beobachtung leicht von den anderen Zelltypen
zu unterscheiden. Diese Herzzellen wurden allerdings nur bei Verwendung von
10% FCS im Differenzierungsprotokoll und in den Zellkulturen ohne ATRA-
Behandlung (–4/-4) beobachtet (Abb. 4-7). Als FCS-Konzentration im
Differenzierungsmedium wurde zunächst 10% FCS gewählt. Da jedoch
aufgrund morphologischer Kriterien mit 1% FCS bessere Ergebnisse erzielt
wurden (Steigerung Anzahl neuronaler Zellen, Verminderung Anzahl
Herzzellen), wurde ein Differenzierungsmedium mit 1% FCS verwendet.
Abb. 4-7: PBX1(+/+)-Embryoidkörperchen 3 Tage nach Readhäsion (3dpi) auf Zellkulturflaschen ohne ATRA Behandlung (4-/4-), 10% FCS. Pfeil zeigt auf sich rhythmisch kontrahierende Herzzellen.
Ergebnisse 44
Am Ende des Differenzierungsprozesses wurden die Zellen photographiert. Bei
allen Zelllinien konnte der Differenzierungsprozess erfolgreich durchgeführt
werden. Die neuronalen Zellen waren morphologisch an den Fortsätzen zu
erkennen. Sie begannen nach 4 –5 Tagen während der Readhäsion Fortsätze
zu bilden, bis sich nach 8-9 Tagen ein Netzwerk aus neuronalen Fortsätzen
ergab. Abbildung 4-8 zeigt am Beispiel von WT-Zellen in drei verschiedenen
Vergrößerungen die neuronalen Auswüchse. Die am Boden adhärierten
Embryoidkörperchen bildeten die Fortsätze aufeinander zu. So waren am Ende
des Differenzierungsprozesses mehrere Embryoidkörperchen durch diese
Fortsätze im Sinne eines netzwerkartigen Musters verbunden.
Bei den verschiedenen Zelllinien war der Aufbau dieses netzwerkartiges Muster
unterschiedlich. Bei den WT-Zellen waren die einzelnen Zellen in den
Fortsätzen perlenschnurartig aneinander gewachsen. Die PBX1(+/-)-Zellen
zeigten eine ähnliche Morphologie, dort befanden sich zusätzlich mehr Zellen
flach auf dem Boden anhaftend. Die PBX1(-/-)-Zellen wiesen noch mehr solcher
flachen Zellen auf, die Fortsätze waren aber nicht so strangartig geordnet wie
bei den WT-Zellen, sondern weiter gefächert (Abb. 4-9).
Abb. 4-8: WT-Embryoidkörperchen 9 Tage nach Readhäsion (9dpi) auf Zellkulturflaschen nach Behandlung mit 100 nM ATRA. Man sieht in drei verschiedenen Vergrößerungen die neuronalen Fortsätze, die die adhärierten Embryoidkörperchen aufeinander zubilden.
B
C
Ergebnisse 45
Abb. 4-9: Embryoidkörperchen 9 Tage nach Readhäsion (9dpi) auf Zellkulturflaschen nach Behandlung mit 100 nM ATRA. A,B: PBX1(+/+); C,D: PBX1(+/-); E,F: PBX1(-/-) Klon 1; G,H: PBX1(-/-) Klon 2
Ergebnisse 46
4.2 Vergleichende Charakterisierung der Genexpression in Wildtyp-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien
Nach Etablierung des Differenzierungssystems wurden die WT-, die PBX1(+/-)-
und zwei verschiedene PBX1(-/-)-Zelllinien miteinander verglichen. Folgende
Experimente wurden deshalb durchgeführt:
• Zu verschiedenen Kontrollzeitpunkten wurde mRNA isoliert (im
undifferenzierten Stadium, 3 Tage und 9 Tage nach Readhäsion der
Embryoidkörperchen).
• RT–PCR Untersuchungen wurden mit verschiedenen neuronalen und
mesodermalen Markern durchgeführt.
• Die Embryoidkörper wurden immunhistochemisch mit verschiedenen
Antikörpern analysiert.
• Genexpressionsanalyse mit Microarrays wurde zur Identifikation von
PBX1-Zielgen-Kandidaten durchgeführt.
• Northern Blot Analysen wurden angewandt, um die Ergebnisse der
Genexpressionsanalyse zu bestätigen.
4.2.1 Vergleichende semiquantitative RT-PCR Analyse
Abbildungen 4-10, 4-11 und 4-12 zeigen die Ergebnisse der semiquantitativen
PCR Analyse, die im folgenden näher beschrieben werden.
4.2.1.1 Expression von PBX1 während der zellulären Differenzierung
Bei der WT-Zelllinie und der PBX1(+/-)-Zelllinie wurde PBX1 sowohl in der
5´Region als auch in der 3`Region so gut wie nicht von ES exprimiert, aber
während der frühen zellulären Differenzierung („3“) hochreguliert (Abb. 4-10).
Die PBX1(-/-)-Zelllinien produzierten während der zellulären Differenzierung
eine mRNA ohne funktionsfähige Homöodomäne. In der entsprechenden PBX1
5`Region waren demnach auch bei den PBX(-/-)-Zelllinien nach der zellulären
Differenzierung RT-PCR-Banden sichtbar (Abb. 4-10). Da diese Mutante nicht
in der Lage ist, mit DNA oder HOX-Proteinen zu interagieren, wurde davon
ausgegangen, dass das mutierte PBX1-Produkt die Expression von Zielgenen
nicht regulieren kann. Das PCR Ergebnis zeigte, dass die entsprechende
Region in der PBX1 3`Region eliminiert wurde, denn bei den PBX1(-/-) Zellen
Ergebnisse 47
war zu keinem Zeitpunkt während der Differenzierung eine Bande sichtbar
(Abb. 4-10).
4.2.1.2 Expression von neuronalen Genen während der zellulären Differenzierung
Abbildung 4-11 zeigt Transkripte verschiedener neuronaler Gene (PAX6,
Nestin, OTX1, OTX2, N-cam, GFAP), deren neuronale Funktion in Tabelle 4-1
zusammengefasst ist.
Gen Funktion Referenz PAX6 wichtiger Transkriptionsfaktor in der Entwicklung des ZNS (Gajovic et al., 1997) Nestin intermediäres Filamentprotein, das in ZNS-Stammzellen
gebildet wird (Yang et al., 2001)
OTX 1 und 2
topisch und zeitlich begrenzte Expression während der Entwicklung des embryonalen Maushirns
(Acampora et al., 2000)
N-cam Funktion bei der Adhäsion zwischen neuronalen Zellen (Tomasiewicz et al., 1993)
GFAP Marker für Astrozyten im ZNS (Reeves et al., 1989)
Zellkulturen der WT-, der PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinie zeigten nach ATRA-
induzierter Differenzierung eine Expression all dieser Gene:
• PAX6 wurde in undifferenzierten ES-Zellen („0“) nur geringfügig
exprimiert und wurde bereits während der frühen zellulären
Differenzierung („3“) hochreguliert.
• Nestin wurde nicht von undifferenzierten ES-Zellen („0“) exprimiert. Die
Expressionsrate steigte während der frühen Differenzierung („3“) und
nahm geringfügig während der späten Differenzierung („9“) ab.
Abb. 4-10: Expression von PBX1 in der 5`Region und 3`Region. Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen. Auf der X-Achse sieht man PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien im Vergleich. „0“ bedeutet undifferenziert, „3“ drei Tage und „9“ neun Tage nach Readhäsion. „+“ bedeutet mit 100 nM ATRA Behandlung, „-“ ohne ATRA. Aktin diente als Ladekontrolle. „(-)“ zeigt die Negativkontrolle.
Tabelle 4-1: Charakterisieung der verwendeten neuronalen Marker
Ergebnisse 48
• OTX1 wurde in der späten zellulären Differenzierung („9“) exprimiert,
während OTX2 in den undifferenzierten ES-Zellen („0“) und in der
späteren Differenzierungsphase („9“) gebildet wurde.
• N-cam wurde nur während der späten Differenzierung („9“) gebildet. Es
wurde nicht von den ES-Zellen exprimiert („0“), aber während der
zellulären Differenzierung langsam hochreguliert („3“).
• GFAP wurde nicht von den undifferenzierten ES-Zellen („0“) exprimiert,
während der frühen Differenzierung („3“) hochreguliert.
Der Vergleich der mit ATRA-behandelten Zellkulturen („+“) mit der
Kontrollgruppe („-“) zeigte, dass die neuronalen Marker mit Ausnahme von
OTX2 von den Zellkulturen mit ATRA-Behandlung mehr exprimiert wurden als
in den Zellkulturen ohne ATRA-Behandlung (Abb. 4-11).
Der Vergleich der Zelllinien untereinander zeigte, dass die neuronalen Marker
nach der zellulären Differenzierung („9“) von den PBX1(-/-)-Zelllinien stärker
exprimiert wurden als von den WT-Zelllinien.
Abb. 4-11: Expression von neuronalen Genen. Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen. Auf der X-Achse sieht man PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien im Vergleich. „0“ bedeutet undifferenziert, „3“ drei Tage und „9“ neun Tage nach Readhäsion. „+“ bedeutet mit 100 nM ATRA Behandlung, „-“ ohne ATRA. Aktin diente als Ladekontrolle. „(-)“ zeigt die Negativkontrolle.
Ergebnisse 49
4.2.1.3 Expression von FGF15, WNT1 und BMP4
Die RT-PCR-Ergebnisse von Verwendung WNT1-, BMP4- und FGF15-
spezifischer Primer sind von besonderem Interesse. WNT1 und FGF15 wurden
bei den WT- und PBX1(+/-)-ES-Zellen in der frühen Differenzierung („3“)
hochreguliert und anschließend wieder herunterreguliert („9“) (Abb. 4-12).
Bei den PBX1(-/-)-ES-Zellen wurden sie zeitgleich („3“) zu den WT-ES-Zellen
hochreguliert, allerdings während der späten Differenzierung nicht reprimiert,
sondern weiter hochreguliert („9“) (Abb. 4-12).
BMP4 verhielt sich bei allen Zelllinien während der zellulären Differenzierung
gegenläufig zu WNT1. Bei hoher WNT1-Expression wurde BMP4 in niedrigen
Mengen exprimiert und umgekehrt (Abb. 4-12).
WNT1 und FGF15 wurden in den Zellen, die mit ATRA behandelt wurden („+“)
stärker exprimiert als in den unbehandelten Kontrollzellen („-“). Der
mesodermale Marker BMP4 hingegen wurde in den unbehandelten Zellen mehr
exprimiert als in den mit ATRA behandelten Zellen (Abb. 4-12).
Abb. 4-12: Expression von FGF15, WNT1 und BMP4. Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen. Auf der X-Achse sieht man PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien im Vergleich. „0“ bedeutet undifferenziert, „3“ drei Tage und „9“ neun Tage nach Readhäsion. „+“ bedeutet mit 100 nM ATRA Behandlung, „-“ ohne ATRA. Aktin diente als Ladekontrolle. „(-)“ zeigt die Negativkontrolle.
Ergebnisse 50
Die Tabelle 4-2 fasst die RT-PCR Ergebnisse aus Kap. 4.2.1.2, Kap. 4.2.1.3
und Kap. 4.2.1.4 zusammen. Tabelle 4-2: Zusammenfassung der Ergebnisse der semiquanitativen RT-PCR Analyse.
PBX1 5`Region o < + < ++ WT o < + < ++ PBX1 (-/-) PBX1 3`Region o < (+) < + WT o = o = o PBX1 (-/-) PAX6 o < + < ++ WT o < + < ++ PBX1 (-/-) Nestin o < ++ > + WT o < ++ > + PBX1 (-/-) OTX1 o < (+) < + WT o < (+) < + PBX1 (-/-) OTX2 + > o < (+) WT + > o < (+) PBX1 (-/-) N-cam o = o < + WT o = o < + PBX1 (-/-) GFAP o < (+) < + WT o < (+) < + PBX1 (-/-) FGF15 (+) < + > (+) WT (+) < + < ++ PBX1 (-/-) WNT1 o < + > (+) WT o < + < ++ PBX1 (-/-) BMP4 + > (+) < + WT + > (+) = (+) PBX1 (-/-)
undifferenzierte
ES-Zelle
differenzierte
ES-Zelle (3dpi)
differenzierte
ES-Zelle (9dpi)
Die Tabelle fasst die semiquantitativen RT-PCR Ergebnisse für die WT- und PBX1(-/-)-Zellen, die mit 100 nM ATRA behandelt wurden, zusammen. „-“ bedeutet keine Expression, „(+)“ geringe Expression, „+“ starke Expression und „++“ bedeutet sehr starke Expression. In der linken Spalte sind die verschiedenen Gene angeordnet. In der rechten Spalte sind die zu der Zeile dazugehörigen Genotypen (entweder WT oder PBX1(-/-) angegeben.
Ergebnisse 51
4.2.2 Vergleichende immunzytochemische Analyse der Embryoidkörperchen
Immunzytochemische Analysen wurden an differenzierten Embryoidkörperchen
9 Tage nach Readhäsion mit einem gegen einen neuronalen Marker, β-Tubulin
Klasse III, gerichteten Antikörper durchgeführt. Zur Verbesserung des
Kontrastes wurde auch das Zytoplasma mit einem spezifischen Antikörper,
ERK1, gefärbt. Während der CY5-markierte Anti-Tuj1-Antikörper rot
fluoreszierte, wurde der FITC-markierte Anti-ERK1-Antikörper an der grünen
Fluoreszenz erkannt. Die Grünfluoreszenz von ERK 1 wies auf die Anzahl der
Zellen in dieser Region hin. Die Rotfluoreszenz zeigte die neuronalen
Auswüchse (Abb. 4-13; Abb. 4-14).
Abbildung 4-13 zeigt exemplarisch eine Übersichtsaufnahme der
Embryoidkörperchen mit neuronalen Fortsätzen bei WT- und PBX1(+/-)-Zellen.
Die Bilder zeigen nahezu kugelförmige Embryoidkörperchen, die aufeinanderzu
in Form eines Netzwerkes neuronale Fortsätze ausbilden.
Abbildung 4-14 zeigt in einer stärkeren Vergrößerung die verschiedenen
Zelllinien im Vergleich. Bei den Wildtypzellen waren die neuronalen Auswüchse
strangförmig angeordnet und begannen proximal an den Embryoidkörperchen.
Dieses Phänomen war bei den PBX1(+/-)-Zellen noch zum Teil sichtbar. Bei
den PBX1(-/-)-Zellen waren die neuronalen Fortsätze flächenhaft deckend. Bei
den PBX1-K.O.-ES-Zellen wurden allerdings vermehrt neuronale Auswüchse im
Vergleich zu den WT-Zellen entdeckt.
Abb. 4-13: Anti β-Tubulin Klasse III immunzytochemische Analysen an Embyoidkörperchen (9dpi). Grün zeigt FITC-markierte Anti-ERK1-Antikörper. Rot zeigt CY5-markierte Anti-Tuj1-Antikörper. A PBX1(+/+) und B PBX1(+/-) zeigen Embyoidkörperchen mit neuronalen Auswüchsen.
Ergebnisse 52
Abb. 4-14: Immunzytochemische Analysen an Embryoidkörperchen 9dpi. Schichtweise im Fluoreszenzmikroskop photographiert und verschiedene Scans übereinanderprojiziert.Grün: FITC-markierter anti-ERK1-Antikörper Rot: CY5-anti-Tuji-Antikörper A, B: PBX1(+/+) C, D: PBX1(+/-) E,F: PBX1(-/-) Klon 1 G,H: PBX1(-/-) Klon 2
Ergebnisse 53
4.2.3 Vergleichende Genexpressionsanalyse
In dieser Arbeit wurde die oligonukleotidgestütze Affymetrixmethode benutzt,
um eine genomweite Expressionsanalyse durchzuführen.
Der Expressionsvergleich der Zelllinien wurde zur Identifikation potentieller
Zielgene von PBX1 durchgeführt. Es bestand aber die Möglichkeit, die
undifferenzierten WT-ES-Zellen mit den differenzierten WT-Zellen, die
differenzierten WT-Zellen mit den differenzierten PBX1-K.O.-ES-Zellen und die
beiden verschiedenen PBX1-K.O.-Klone miteinander zu vergleichen (Abb. 4-
17).
Die Ergebnisse der beiden PBX1-K.O.-Klone waren weitgehend
deckungsgleich. Es handelte sich um heterogene Zellpopulationen, vollkommen
identische Ergebnisse waren daher nicht zu erwarten. Es wurden 235 Gene
unterschiedlich exprimiert, die Spannbreite der Werte reichte +5,7 bis –13.
Insgesamt sind die Zahlen wesentlich niedriger als bei allen anderen
Vergleichen. Der Vergleich Wildtyp undifferenzierte ES-Zellen und Wildtyp
differenzierte Zellen (Kap. 4.2.3.1) und der Vergleich Wildtyp- und Knock-out-
Zellen im differenzierten Stadium (Kap. 4.2.3.2) werden im folgenden
ausführlich dargestellt.
Abb. 4-17: Vergleichsmöglichkeiten der Wildtyp und PBX1(-/-) Zelllinien in verschiedenen Stadien der Differenzierung
Ergebnisse 54
4.2.3.1 Vergleich der undifferenzierten WT-ES-Zellen und der differenzierten WT-Zellen
Der Vergleich zwischen der undifferenzierten WT-ES-Zelllinie und der
differenzierten WT-Zelllinie zeigte die unterschiedlichsten Expressionsmuster.
2281 Gene wurden differentiell exprimiert. Die Spannbreite der Werte reichte
von +132,4 bis –136,5.
Die Expression von OCT3/4 wurde um das 131,6 fache nach Induktion der
Differenzierung herunterreguliert.
Auch einige Gene, die eine regulatorische Rolle im Zellzyklus spielen, wurden
während der Differenzierung herunterreguliert, so z.B. Cyclin E um das 51,5
fache. Die Mikroarray-Analyse zeigte darüber hinaus eine Vielzahl von Genen,
die während der Differenzierung hochreguliert wurden.
Diese Gene wurden in funktionelle Kategorien klassifiziert:
• Neuronale Marker
• Myogene Marker
• Zytoskelett- und extrazelluläre Marker
• Proteasen und Proteaseinhibitoren
• Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren
• Transkriptionsfaktoren
Jeder funktionellen Gruppe ist im folgenden ein Balkendiagramm (Abbildung 4-
18 bis 4-23) zugeordnet. In diesen Balkendiagrammen sind die einzelnen Gene
aufgelistet.
Ergebnisse 55
Neuronale Marker: Viele verschiedene neuronale Marker wurden während der zellulären
Differenzierung hochreguliert. Dazu gehören Neuronatin (X83569), Brain fatty
acid-binding protein (U04827), Zinc finger protein of the cerebellum (D32167),
Neuroserpin (AJ001700), Sialyltransferase 8 (X99646), Reelin (U24703) und
Microtubule-associated protein tau (M18775) (Abb. 4-18). Der Faktor „- fold
change“ in der Abbildung gibt an ,um welchen Wert die Gene jeweils höher
exprimiert wurden.
Abb. 4-18: Expressionsmuster der neuronalen Marker in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: X83569 Neuronatin U04827 Brain fatty acid binding-protein D32167 Zinc finger protein des Cerebellums AJ001700 Neuroserpin X99646 Sialyltransferase 8 U24703 Reelin M18775 Microtubule-associated protein tau
2,7
4,8
7
10
20,8
54,4
76,8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
M18775
U24703
X99646
AJ001700
D32167
U04827
X83569
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 56
Myogene Marker: Interessanterweise differenzierten die WT-ES-Zellen in unserem System auch
zum Teil in myogene Zellen. Verschiedene myogene Marker wurden während
der zellulären Differenzierung hochreguliert z.B. Murine MLC1V gene for
myosin alkali light chain (X12972); Actin, alpha 1, skeletal muscle (M12347);
Myosin Vb (M55253); vascular smooth muscle alpha-actin (X13297) und
slow/cardiac troponin C (M29793) (Abb. 4-19). Der Faktor „- fold change“ in der
Abbildung gibt an ,um welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.
Abb. 4-19: Expressionsmuster der myogenen Marker in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: X12972 Murine MLC1V gene for myosin alkali light chain M12347 Actin, alpha 1, skeletal muscle M29793 Myosin Vb X13297 vascular smooth muscle alpha-actin M29793 slow/cardiac troponin C
3,7
8,6
8,6
10
12,7
0 2 4 6 8 10 12 14
M29793
X13297
M55253
M12347
X12972
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 57
Zytoskelett und extrazelluläre Matrix Es wurden auch viele Gene während der zellulären Differenzierung
hochreguliert, die eine Rolle in der Zusammensetzung des Zytoskeletts und der
extrazellulären Matrix spielen.
So wurde beispielsweise die Expressionsrate verschiedener Keratine
gesteigert: Keratin 18 Typ 1 (M22832), Keratin 18 Typ 2 (X15662) und Keratin
19 (M36129).
Verschiedene Kollagentypen wurden vermehrt von differenzierten Zellen
exprimiert: Procollagen Typ I Alpha1 (U03419), Pocollagen Typ IV Alpha1
(M15832), Procollagen Typ III Alpha1 (X52046), Procollagen Typ V Alpha2
(L02918), Procollagen Typ VI Alpha1 (X66405) und Procollagen Typ VI Alpha2
(Z18272).
Auch viele Vertreter der Gruppe der Laminine wurden nach der Differenzierung
verstärkt exprimiert: Laminin Alpha1 (M36775), Laminin Alpha4 (U69176),
Laminin B1 C-Terminus (X05212), Laminin Beta2 (U43541), Laminin Beta3
(U43298) und Laminin Gamma2 (U43327).
Hinzu kamen weitere verschiedene extrazelluläre Matrixproteine wie das
extrazelluläre Matrixprotein 1 (L33416), das extrazelluläre Matrixprotein 2
(U66166), Mucin 3 (AF027131) und Osteoblast specific factor 2 (auch: Runx2)
(D13664) (Abb. 4-20). Der Faktor „- fold change“ in der Abbildung gibt an ,um
welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.
Ergebnisse 58
Abb. 4-20: Expressionsmuster des Zytoskeletts und der extrazellulären Matrix in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: Z18272 Procollagen, Typ VI, Alpha 2 X52046 Procollagen, Typ III, Alpha 1 U66166 Extracellular matrix protein 2 M22832 Keratin 18 Typ1 X66405 Procollagen, Typ VI, Alpha 1 AF027131 Mucin 3, intestinal D13664 osteoblast specific factor 2, Runx2 U43327 Laminin, gamma 2 U03419 Procollagen, Typ I, Alpha 1 U43541 Laminin, Beta 2 X15662 Keratin 18 Typ2 X05212 Laminin B1 C-Terminus M36120 Keratin 19 L02918 Procollagen, Typ V, Alpha 2, U43298 Laminin, Beta 3 M36775 Laminin, Alpha 1 M15832 Procollagen, Typ IV, Alpha 1 U69176 Laminin, Alpha 4 L33416 Extracellular matrix protein 1
2,3
2,4
2,2
2,7
2,7
3,4
3,7
3,9
4,6
4,8
5,4
5,5
5,8
6,8
7,6
10,2
10,7
10,7
14,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
L33416
U69176
M15832
M36775
U43298
L02918
M36120
X05212
X15662
U43541
U03419
U43327
D13664
AF027131
X66405
M22832
U66166
X52046
Z18272
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 59
Proteasen und Proteaseinhibitoren Sowohl bei spezifischen Proteasen als auch bei einigen Proteaseinhibtoren
konnte eine Steigerung der Expressionsrate in WT-ES-Zellen nach der
Differenzierung feststellt werden.
Dazu gehörte die Gruppe der Cathepsine: Cathepsin B (M665270), Cathepsin F
(AJ131851) und Cathepsin H (U06119).
Auch andere Protease waren vertreten: tissue plasminogen activator (J03520),
serine protease (D89871), calpain-like Protease (Y12582), serine protease
inhibitor 3 (U25844) und serine protease inhibitor 6 (U96700) (Abb. 4-21). Der
Faktor „- fold change“ in der Abbildung gibt an ,um welchen Wert die Gene
jeweils höher exprimiert wurden.
Abb. 4-21: Expressionsmuster der Proteasen und Proteaseinhibitoren in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: Y12582 calpain-like Protease J03520 Plasminogen activator, tissue AJ131851 Cathepsin F U96700 Serine protease inhibitor 6 D89871 Serine protease U25844 Serine protease inhibitor 3 U06119 Cathepsin H M65270 Cathepsin B
2,2
3,2
3,3
4,5
6
10,4
14,7
66,7
0 10 20 30 40 50 60 70 80
M65270
U06119
U25844
D89871
U96700
AJ131851
J03520
Y12582
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 60
Wachstumsfaktoren und die Rezeptoren
Viele verschieden Wachstumsfaktoren wurden während der zellulären
Differenzierung von den WT-ES-Zellen heraufreguliert.
Dazu gehörten zahlreiche Vertreter der IGF-Familie: Insulin-like growth factor
(IGF)1 Rezeptor (AF056187), IGF2 (X71922), IGF binding protein 1 (X81579),
IGF binding protein 5 (L12447) und IGF binding protein 10 (M32490). Zusätzlich
wurden auch Wachstumshormonrezeptoren (M31680 und U15012)
hochreguliert (Abb. 4-22).
Gleichermaßen stieg auch die Expressionsrate der Familie der transforming
growth factor-beta. TGF-Beta type1 receptor (D25540), TGF-Beta 1 (X62940),
TGF-Beta 2 (X57413), TGF-Beta Tsk 7L (L15436) und TGF beta binding protein
(AF022889). Auch der leukemia inhibitory factor receptor (D17444) und bone
morphogenetic receptors (L25602 und D16250) wurden während der zellulären
Differenzierung hochreguliert (Abb. 4-22). Der Faktor „- fold change“ in der
Abbildung gibt an, um welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.
Ergebnisse 61
Abb. 4-22: Expressionsmuster der Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: L12447 Insulin-like growth factor binding protein 5 X71922 Insulin-like growth factor 2 X81579 Insulin-like growth factor binding protein 1 M31680 Growth hormone receptor U15012 Growth hormone receptor AF056187 Insulin-like growth factor I receptor L25602 Bone morphogenetic protein 2 M32490 Insulin-like growth factor binding protein 10 D17444 Leukemia inhibitory factor receptor L15436 Transforming growth factor-beta type I receptor (Tsk 7L) D25540 TGF-beta type I receptor D16250 Bone morphogenetic receptor for Bmp2 and Bmp4 AF022889 TGF beta binding protein (LTBP-1) X57413 Transforming growth factor, beta 2 X62940 Transforming growth factor beta 1 induced transcript 4
2
2,1
2,5
3,2
3,3
5
5,2
6,8
7,2
11,8
15,1
16,4
42,4
115,9
132,4
0 20 40 60 80 100 120 140
X62940
X57413
AF022889
D16250
D25540
L15436
D17444
M32490
L25602
AF056187
U15012
M31680
X81579
X71922
L12447
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 62
Transkriptionsfaktoren Schließlich wurden auch zahlreicheTranskriptionsfaktoren heraufreguliert. Dazu
gehörten Gene mit einer Homöodomäne: Sine oculis-related homeobox gene 2
(X80338), Short stature homeobox gene 2 (U66918), Distal-less homeobox
gene 2 (M80540), hox a3 (Y11717), iroquois homeobox protein 3 (Y15001) und
Homeobox A2 (M93148), Homeodomain protein Nkx-2,2 (U31566) und
Homebox protein PSX (AF017453). Einige der induzierten
Transkriptionsfaktoren sind bekanntermaßen ATRA abhängig: z.B. Stimulated
by retinoic acid gene 6 (AF063476), CRABP mRNA for cellular retinoic acid
binding (X15789) und Cellular retinoic acid binding protein II (M35523) (Abb. 4-
23).
Dazu kamen weitere Transkriptionsfaktoren, die in Prozesse der zellulären
Differenzierung involviert sind: LIM domain transcription factor LMO4
(AF074600), zinc finger protein (X95503), POU domain class 3 TF 3 (M88299)
und TF4(M88301) und die Transkriptionsfaktoren NF-ATc (AF087434) und
TFIIH (AJ002366) (Abb. 4-23). Der Faktor „- fold change“ in der Abbildung gibt
an, um welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.
Ergebnisse 63
Abb. 4-23: Expressionsmuster der Transkriptionsfaktoren in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: X80338 Sine oculis-related homeobox 2, (Drosophila) AF074600 LIM domain transcription factor LMO4 X95503 Zinc finger protein AJ002366 Zranscription factor TFIIH AF017453 Homeobox protein PSX AF062476 Stimulated by retinoic acid gene 6 AF087434 Transcription factor NF-ATc isoform a (NF-ATca) X15789: Cellular retinoic acid binding protein U66918 Short stature homeobox 2 U31566 Homeodomain protein (Nkx-2,2) M80540 Distal-less homeobox 2 M88301 POU domain, class 3, transcription factor 4 Y11717 Hoxa3 gene Y15001 Iroquois homeobox protein 3 M93148 Homeo box A2 M88299 POU domain, class 3, transcription factor 3 M35523 Cellular retinoic acid binding protein II
16,5
15,2
15,2
12,5
10,5
8,9
6
4,3
4,2
4,2
3,7
2,9
2,9
2,6
2,6
2,6
2,3
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
X80338
AF074600
X95503
AJ002366
AF017453
AF062476
AF087434
X15789
U66918
U31566
M80540
M88301
Y11717
Y15001
M93148
M88299
M35523
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 64
4.2.3.2 Vergleich Wildtyp und Kock-out Zellen im differenzierten Stadium
Im Vergleich zwischen WT- und PBX1-K.O.-ES-Zellen wurden 790 Gene
unterschiedlich reguliert: die Spannbreite der Werte reichte von +33,2 bis –
109,8. Es wurden diejenigen Gene herausgefiltert, die sich in beiden
differenzierten PBX1-K.O.-Klonen gleichermaßen von den differenzierten WT-
Zellen unterschieden und solche ausgeschlossen, die weniger als um einen
Faktor 2 differierten. Es blieben 257 Gene übrig. Diese Gene wurden in
folgende funktionelle Gruppen kategorisiert:
• Neuronale Marker
• Myogene Marker
• Zelladhäsion und extrazelluläre Matrix
• Proteasen und Proteaseinhibitoren
• Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren
• Transkriptionsfaktoren
• Enzyme
Jeder funktionellen Gruppe ist im folgenden ein Balkendiagramm (Abbildung 4-
24 bis 4-30) zugeordnet.
Ergebnisse 65
Neuronale Marker Viele neuronale Marker wurden während der zellulären Differenzierung von
beiden PBX1-K.O.-Klonen stärker hochreguliert als von den WT-Zellen:
Dazu gehörten Sialytransferase 8 (X99646), Reelin (U24703), mouse brain H5
(X61452), nel-like 2 (U59230), Catenin alpha 2 (D25281), neuron specific gene
family member 1 (M98530), microtubule-associated protein tau (M18775), h2-
Calponin (Z19543), GT12 Protein (Y13832), Amphiregulin (L41352) und
neuronal intermediate filament protein (L27220) (Abb. 4-24).
Abb. 4-24: Expressionsmuster der neuronalen Marker. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1(-/-)-Klon höher exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): U24703 Reelin X99646 Sialytransferase 8 X61452 mouse brain H5 D25281 Catenin alpha 2 U59230 Mel91 nel-like 2 homolog M18775 microtubule-associated protein tau M98530 neuron specific gene family member 1 Y13832 GT12 Protein L41352 Amphiregulin L27220 neuronal intermediate filament protein
9,63,6
7,36,2
6,72,9
4,82,6
4,44,4
3,82,3
3,42,7
2,92,2
2,42,3
2,12
0 2 4 6 8 10 12
U24703
X99646
X61452
D25281
U59230
M18775
M98530
Y13832
L41352
L27220
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 66
Myogene Marker Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse zeigten, dass die Zellen zum Teil in
Muskelzellen differenzierten. Dabei wurden die myogenen Marker stärker von
den beiden PBX1(-/-)-Klonen als von den WT-Zellen produziert. Dazu gehörten:
skeletal muscle Aktin Alpha (M12347), vascular smooth muscle alpha-actin
(X13297), slow myosin heavy chain (AJ223362), Transgelin SM 22 α (Z68618),
cardia actin Alpha (M15501), Murine MLC1V gene for myosin alkali light chain
(exon 1) (ventricular/slow muscle isoform) (X12972), cardiac ankyrin repeat
protein, myosin light chain (AF041847) (Abb. 4-25).
Abb. 4-25: Expressionsmuster der myogenen Marker. Expressionsmuster der neuronalen Marker. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1(-/-)-Klon höher exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): M12347 Skeletal muscle Aktin Alpha X13297 Vascular smooth muscle actin Alpha AJ223362 Slow myosin heavy chain Z68618 Transgelin SM 22 α, cardia actin Alpha X12972 Murine MLC1V gene for myosin alkali light chain (ventricular/slow
muscle isoform M15501 Aktin Alpha, cardiac AF041847 Cardiac ankyrin repeat protein AA839903 Myosin light chain
33,226,1
30,719,5
13,37,7
9,54,4
6,53,6
6,54,4
6,23,3
3,32,7
0 5 10 15 20 25 30 35
M12347
X13297
AJ223362
Z68618
X12972
M15501
AF041847
AA839903
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
be
- fold change
Ergebnisse 67
Zelladhäsion und extrazelluläre Matrix Proteine der extrazellulären Matrix wurden unterschiedlich reguliert. Einige
Intermediärfilamente (AA755126) und Procollagene (AB000636) wurden von
den PBX1(-/-)-Zelllinien nach der Differenzierung höher reguliert, einige
Procollagene (X66405 und Z18272) wurden weniger von den WT-Zellen
exprimiert (Abb. 4-26). Einige Proteine, die in der Zelladhäsion eine Rolle
spielen wurden von den PBX1(-(-)-Zellen höher reguliert: Integrin beta 4
(L04678), transient receptor potential cation channel (AI842649), claudin 3
(AF095905), membrane-associated protein 17 (AW011791). Der endodermale
Marker Aquaporin (L02914) hingegen wurde herunterreguliert (Abb. 4-26).
Abb. 4-26: Expressionsmuster der Zelladhäsion und der extrazelluläre Matrix. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): L04678 Integrin beta 4 AI842649 transient receptor potential cation channel AF095905 claudin 3 AW011791 membrane-associated protein 17 L02914 Aquaporin AA755126 Wayne State University 77, intermediate filament AB000636 Procollagen, type XIX, alpha1 X66405 Procollagen, type VI, alpha1 Z18272 Procollagen, type VI, alpha1
72,3
4,64,1
3,83,5
2,72
-3-4,5
9,14,4
2,52,3
-2,9-4,1
-5-6,7
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10
L04678
AI842649
AF095905
AW011791
L02914
AA755126
AB000636
X66405
Z18272
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 68
Proteasen und Proteaseinhibitoren Die Proteasen und Proteaseinhibitoren verhielten sich nach der Differenzierung
unterschiedlich. Einige wurden nach Differenzierung von den PBX1-K.O.-ES-
Zellen vermehrt produziert: Serin Protease 11 (AW125478) und Serin Protease
Inhibitor (AB006960). Andere wurden in den WT-Zellen stärker exprimiert:
Cathepsin H (U06119), Serin Protease Inbitor mReck (AB006960), Calpain 6
(AI747133), Tissue Plasminogen activator (J03520) und Cathepsin B
(AI851255) (Abb. 4-27).
Abb. 4-27: Expressionsmuster der Proteasen und Proteaseinhibitoren Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): AW125478 Serin Protease 11 AB006960 Serin Protease Inhibitor U06119 Cathepsin H AB006960 Serin Protease Inbitor mReck AI747133 Calpain 6 J03520 Tissue Plasminogen activator AI851255 Cathepsin B
4,53,1
3,32,7
-2,1-2,7
-2,4-4,9
-2,4-2,9
-3-3,5
-4,6-6,3
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6
AW125478
AB006960
U06119
AB006960
AI747133
J03520
AI851255
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 69
Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren In der Gruppe der Wachstumsfaktoren zeigte die IGF-Familie ein besonders
interessantes Verhalten. Vor allem IGF2 (X71922) und der dazugehörige
Rezeptor (U04710) wurde nach der Differenzierung wesentlich weniger von den
WT-Zellen als von den PBX1-K.O.-ES-Zellen produziert. Einige andere
Wachstumsfaktoren wurden hochreguliert wie z.B. Interferon-induced 15-KDa
Protein (X56602), TGF β1 (L22482) und Cyclin dependent kinase inhibitor 1C
(U22399), andere wurden herunterreguliert wie z. B. Dlk1-like homologe
(Z12171) und der Prostaglandin F Rezeptor (D17433) (Abb. 4-28).
Abb. 4-28: Expressionsmuster der Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren.Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): X56602 Interferon-induced 15-KDa Protein U43084 Interferon-induced protein tetratricopeptide repeats L22482 TGF β1 U22399 Cyclin dependent kinase inhibitor 1C Z12171 Dlk1-like homologe D17433 Prostaglandin F Rezeptor U04710 IGF2-Rezeptor X71922 IGF2
15,98,4
11,64,1
2,12
-2-3,4
-2,1-2,8
-3-5,1
-9,5-12,4
-97,7-109,8
-120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40
X56602
U43084
L22482
U22399
Z12171
D17433
U04710
X71922 I
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 70
Transkriptionsfaktoren Viele Transkriptionsfaktoren unterschieden sich in ihrer Expressionsrate
zwischen WT- und PBX(-/-)-Zellen nach der Differenzierung. Folgende
Trankriptionsfaktoren wurden von beiden PBX1(-/-)-Klonen mehr exprimiert als
von den WT-Klonen: Cysteine rich protein (D88793 und AI837625), LRG-21
(U19118), regulatory factor X-associated (AV328604) und HNF 3 Alpha
(U44752) (Abb. 4-29).
Andere Transkriptionsfaktoren wurden mehr von den WT-ES-Zelllinien
exprimiert als von beiden PBX(-/-)-Klonen: p8 Protein (AI852641), CRABPII
(M35523), Sorbin (AV359416), Sine oculis-related homebox2 (X80338),
stimulated by retinoic acid gene 6 (AF062476), mSox7 (AB023419), SRY-box
containing gene 10 (AW125812) und Myeloblastosis ongene-like2 (X70472)
(Abb. 4-29).
Ergebnisse 71
Abb. 4-29: Expressionsmuster der Transkriptionsfaktoren. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): AV328604 Regulatory factor X-associated U44752 Hepatocyte nuclear factor 3 Alpha U19118 Transcription factor LRG-21 D88793 Cysteine rich protein AI837625 Cysteine rich protein AI852641 nuclear protein, p8 Protein M35523 Cellular retinoic acid binding protein II AV359416 Sorbin and SH3 domain containing 1 X80338 Sine oculis-related homebox2 AF062476 stimulated by retinoic acid gene 6 AB023419 mSox7 () AW125812 SRY-box containing gene 10 X70472 Myeloblastosis ongene-like2 .
5,12,7
3,42
32,4
2,82,5
2,72,3
-2-3,6
-2,2-2,9
-2,3-2,7
-2,3-3,5
-2,9-6,3
-2,9-2,4
-3,1-3,4
-3,7-5,2
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6
AV328604
U44752
U19118
D88793
AI837625
AI852641
M35523
AV359416 S
X80338
AF062476
AB023419
AW125812
X70472
Gen
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k ac
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ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 72
Enzyme Viele Enzyme wurden unterschiedlich von WT-ES-Zellen und PBX1(-/-)-Zellen
nach zellulärer Differenzierung reguliert. Zu den Enzymen, die mehr von den
PBX1(-/-)-Zellen exprimiert wurden, zählen: Cytochrome P450 (Y12657),
Inhibitor of cAMP-dependent protein kinase (M63554), Creatinin kinase
(Z13969), Annexin III (AJ001633), Prostacyclin synthase (AB001607) und
Polymerase gamma (U53584). Zu den Enzymen, die mehr von den WT-ES-
Zellen exprimiert wurden zählen: Endothel-specific receptor tyrosine kinase
(X72426), Fatty acid Coenzyme A ligase (A1838021), Lysosomal alpha-N-
acetylglucosaminidase (U85247), Protein tyrosine phosphatase receptor type B
(X58289), Murine MAP kinase 6c (U39066), Glutamyl aminopeptidase (M
29961), Sialtansferase (D28941), Galacosyltransferase (A1841494),
Acetylchoinesterase (X56518) und Colipase (AA710635) (Abb. 4-30).
Besonders auffallend war das Ergebnis von Colipase, die in beiden PBX1(-/-)-
Klonen erheblich weniger exprimiert wurde als von den WT-Zellen (Abb. 4-30).
Ergebnisse 73
Abb. 4-30: Expressionsmuster der Enzyme. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): Y12657 Cytochrome P450, 26, retinoic acid M63554 Inhibitor of cAMP-dependent protein kinase Z13969 Creatinin kinase, mitochondrial 1 AJ001633 Annexin III AB001607 Prostacyclin synthase U53584 Polymerase gamma X72426 Endothel-specific receptor tyrosine kinase A1838021 Fatty acid Coenzyme A ligase U85247 Lysosomal alpha-N-acetylglucosaminidase X58289 Protein tyrosine phosphatase receptor type B U39066 Murine MAP kinase 6c M29961 Glutamyl aminopeptidase D28941 Alpha-2,3-Sialyltansferase A1841494 Beta-1,3-Galactosyltransferase X56518 Acetylcholinesterase AA710635 Colipase
5,24,7
3,42,1
3,42,1
3,32,3
3,12,4
32,2
-2-2,1
-2,1-2,2
-2,2-2,4
-2,3-2,7
-2,3-2,9
-2,4-3,5
-2,5-2,6
-3,1-3,9
-3,3-6,9
-55,5 -45,9
-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10
Y12657
M63554
Z13969
AJ001633
AB001607
U53584
X71426
AI838021
U85247
X58289
U39066
M29961
D28941
AI841494
X56518
AA710635
Gen
eBan
k ac
cess
ion
num
ber
- fold change
Ergebnisse 74
4.2.4 Northern Blot Analyse
Die Expression mit dem größten Wert in „- fold change“ wurden durch Northern
Blots bestätigt (Abb. 4-31).
OCT3/4 wurde im undifferenzierten Zustand von allen Zelllinien (WT-, PBX1(+/-
)- und PBX1 (-/-)), in ausgeprägtem Maß exprimiert und während der zellulären
Differenzierung bei allen Zelllinien stark herunterreguliert.
Besonders interessant war das genotypabhängige Verhalten während der
Differenzierung von IGF1 und 2 und deren Rezeptoren IGF1R und IGF2R, H19
und Colipase (Abb. 4-31):
• IGF1R wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von allen Zelllinien
exprimiert. Während der Differenzierung wurde es von der WT-Zelllinie
herunterreguliert, von den PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien aber weiter
hochreguliert („9“).
• IGF1 wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von keiner Zelllinie
exprimiert. Es wurde nach der Differenzierung von PBX1(+/-) und PBX1(-
/-)-Zellen mehr exprimiert als von den WT-Zellen („9“).
• IGF2R wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von allen Zelllinien
exprimiert. Auf der anderen Seite wurde es aber während der
Differenzierung der WT-Zelllinie hochreguliert, während der
Differenzierung von PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien wurde es
erheblich herunterreguliert („9“).
• IGF2 wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von keiner Zelllinie
exprimiert. Es wurde nach der Differenzierung kaum von PBX1(+/-)- und
PBX1(-/-)-Zelllinien exprimiert, aber während der Differenzierung der
WT-Zelllinien stark hochreguliert („9“).
• H19 wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von allen Zelllinien
exprimiert. H19 dagegen wurde von den PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-
Zelllinien nach der Differenzierung stärker hochreguliert („9“).
• Colipase unterschied sich im Expressionsmuster zwischen den WT- und
PBX1-K.O.-Zelllinien. Es wurde im undifferenzierten Zustand („0“) und
nach der Differenzierung nur von den WT-Zelllinien gebildet („9“).
Ergebnisse 75
Abb. 4-31: Ergebnisse der Northern Blot Analyse. „0“ bedeutet undifferenzierte ES-Zellen und „9“ bedeutet differenzierte ES-Zellen (9dpi). Zellen wurden mit 100 nM ATRA während der Differenzierung behandelt. Man sieht jeweils im Vergleich PBX1(+/+), PBX1(+/-) und PBX1(-/-) Klon 1 und Klon 2.
IGF1R
H19
Colipase
IGF2
IGF2R
Tag
EtBr
OCT3/4
IGF1
PBX1-Genotyp
Diskussion 76
5 Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit war es, zunächst ein in-vitro-Differenzierungssystem
embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) in Richtung der neuronaler Zellen zu
etablieren. In einem weiteren Schritt sollten die WT-, die PBX1(+/-) und die
PBX1(-/-)-ES-Zelllinien parallel neuronal differenziert werden und die
Auswirkungen der verschiedenen Genotypen auf molekularer Ebene verglichen
werden. Aus den Ergebnissen dieser Experimente lassen sich drei
Schlussfolgerungen ziehen:
Erstens konnte gezeigt werden, dass nicht nur WT-ES-Zellen, sondern auch
PBX1-K.O.-ES-Zellen in der Lage sind, neuronal zu differenzieren (Kap. 5-1).
Zweitens begünstigte die Inaktivierung von PBX1 die neuronale und
mesodermale Differenzierung (Kap. 5-2).
Drittens traten während der zellulären Differenzierung unterschiedliche
Genexpressionsmuster in WT- und PBX1-K.O.-Zellen auf, die Hinweis auf
potentielle PBX1-Zielgene geben (Kap. 5-3).
Jeder dieser Punkte wird im Folgenden diskutiert. Aus den Ergebnissen leiten
sich Fragestellungen für eine Reihe von Anschlussprojekten ab. Exemplarisch
werden einige mögliche Projekte zur Diskussion gestellt (Kap 5-4).
5.1 Neuronale Differenzierung der embryonalen Stammzellen in vitro
Bei der Etablierung des in-vitro-Differenzierungssystems embryonaler
Stammzellen wurden bereits publizierte Differenzierungsprotokolle (Bain et al.,
1995; Gajovic et al., 1997) zugrundegelegt und modifiziert. Unsere Arbeit zeigte
erstmals, dass es möglich war, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen in
neuronale Zellen zu differenzieren.
Es ist zwar bekannt, dass die PBX1-Expression essentiell für die
Embryogenese ist, die PBX1-K.O.-Maus stirbt jedoch sehr früh während der
embryonalen Entwicklung am Tag E 15 - 16 mit Aplasie und Hypoplasie
multipler Organsysteme (Kap. 1.4). Die in-vitro-Differenzierung erlaubte das
Problem der frühen Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen zu umgehen, indem die
Auswirkung des Verlustes von PBX1 auf zellulärer Ebene untersucht wurde.
Diskussion 77
Abb. 5-1: Strukturformel von All-trans Retinsäure (http://www.serva.de)
5.1.1 Etablierung des neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems
Die Anzahl der neuronalen Zellen konnte durch Anwendung ein spezielles
Differenzierungsprotokoll gesteigert werden (Kap 3.2.1.6).
Es wurde bereits publiziert, dass die Anzahl der neuronalen Zellen während der
Differenzierung durch den Gebrauch von 1% FCS gesteigert werden kann (Bain
et al., 1995; Gajovic et al., 1997). Diese Beobachtung konnte durch unsere
Untersuchungen bestätigt werden. Unter Anwendung morphologischer Kriterien
brachte der Gebrauch von 1% FCS im Vergleich zu 10% FCS bessere
Ergebnisse. Die Anzahl an neuronalen Zellen konnte bei 1% FCS im Vergleich
zu 10% FCS erhöht werden und die Anzahl an sich spontan kontrahierenden
Herzzellen konnte erheblich reduziert werden.
ATRA steigert den Anteil an neuronalen Zellen in der Kultur, indem ATRA eine
entsprechende Genexpressionskaskade induziert (Gajovic et al., 1997). Die
Anwesenheit von ATRA in vitro hat zwei deutliche phänotypische Effekte: Zum
einen bilden die Aggregate nach Behandlung mit ATRA Neuriten im höheren
Ausmaß, zum anderen wird ein höherer Anteil an neuronalen Zellen gebildet
(Bain et al., 1995). Diese bereits publizierten Effekte konnten auch in unseren
Untersuchungen bestätigt werden. Die ES-Zellen, die mit ATRA Behandlung
differenziert wurden, zeigten ein höheres Ausmaß an neuronalen Zellen als die
ES-Zellen, die nicht mit ATRA behandelt wurden. Diese Beobachtung konnte
sowohl morphologisch als auch bei den RT-PCR Untersuchungen gemacht
werden.
Die Mechanismen der Differenzierung durch ATRA in unserem Zellsystem war
zwar nicht Gegenstand unserer Untersuchungen, doch gibt es zahlreiche
Untersuchungen, die die Wirkung von ATRA bei Regenerations- und
Differenzierungsvorgängen beleuchten.
ATRA (Abb. 5-1) ist essentiell für die
normale Entwicklung eines Embryos und
für die Beibehaltung der Differenzierung
in adulten Organismen. ATRA ist die
aktive Form von Vitamin A und ist über
Retinoidrezeptoren in zahlreiche
Signaltransduktionswege involviert (Zile,
Diskussion 78
1998). Es ist bekannt, dass ATRA über zwei Rezeptorklassen wirkt: die retinoic
acid receptors (RARs) und die retinoid X receptors (RXRs). Die Subtypen der
beiden Rezeptorklassen werden in charakteristischer Weise und nur zum Teil
überlappend während der Embryogenese exprimiert (Ross et al., 2000).
ATRA hat einen Einfluss auf die Zellreifung, wovon therapeutisch Gebrauch
gemacht wird: Isoretinoin® und Accutane® werden bei der akuten myeloischen
Leukämie des FAB-Subtyps M3 bzw. Psoriasis und Akne bereits eingesetzt,
gelten allerdings als sehr teratogen. Sowohl bei Vitamin A Mangel als auch
einem Überangebot an ATRA kommt es zu schwerwiegenden Störungen in der
Embryonalentwicklung bei Mensch und Tier. Retinoidrezeptor-K.O.-Modelle
haben gezeigt, das ATRA für die Entwicklung von Herz, embryonalem Kreislauf
und ZNS benötigt wird (Ross et al., 2000).
Im embryonalen ZNS spielt ATRA eine wichtige Rolle in der Segmentierung der
anteroposterioren und dorsoventralen Achse und reguliert die Entwicklung von
Interneuronen. ATRA fördert in vitro die Replikations- und Überlebensrate von
Neuralleisten-Vorläuferzellen und steigert die Differenzierungsrate dieser Zellen
(Henion and Weston, 1994). ATRA stimuliert auch die Regeneration von
auditorischen Haarzellen, eine hoch spezialisierte Sinneszellform im Corti-
Organ der Kochlea (Chardin and Romand, 1995). Außerdem reguliert ATRA die
Produktion von Neurotransmittern von postmitotischen Neuronen in vitro
(Berrard et al., 1993) und begünstigt die Differenzierung von Vorläuferzellen der
Retina zu Photorezeptoren (Kelley et al., 1999).
Bei verschiedenen neuronalen Erkrankungen (Morbus Parkinson,
Motoneuronerkrankungen und Schizophrenie) scheint der Defekt des
Retinoidsignalsystems eine Rolle zu spielen, so dass es möglich erscheint,
dass ATRA in Zukunft als Therapeutikum bei neurologischen Erkrankungen
eingesetzt wird (Maden, 2002; Ross et al., 2000; Werner and Deluca, 2002).
5.1.2 Bestätigung der neuronalen in-vitro-Differenzierung
Ein großer Anteil der ES-Zellen mit WT-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Genotyp
zeigte nach ATRA-induzierter Differenzierung Eigenschaften neuronaler Zellen.
Embryoidkörperchen, die durch diesen Prozess induziert wurden, entwickelten
neuronale Auswüchse und ähnelten primären Kulturen von Gehirnzellen.
Diskussion 79
Unsere immunzytochemischen Untersuchungen zeigten, dass diese Aggregate
β-Tubulin Klasse III stark exprimierten.
Verschiedene neuronale Gene wurden in allen Zelllinien, WT-, PBX1(+/-) und
PBX1(-/-), während der zellulären Differenzierung hochreguliert: PAX6, Nestin,
OTX1 und OTX2, N-cam und GFAP. Einige dieser Gene wurden bereits von
undifferenzierten ES-Zellen exprimiert (OTX2, BMP4), andere wurden während
der frühen Differenzierung (WNT1, FGF15, PAX6, Nestin, OTX1) und weitere
erst während der späten Differenzierung (OTX2, GFAP, N-cam) hochreguliert.
Zum Teil wurde das Expressionsmuster dieser Gene in vitro schon in anderen
publizierten neuronalen Differenzierungssystemen beschrieben. Für unsere
Experimente dienten diese Genexpressionsmuster in den WT-ES-Zellen als
Kontrolle für die erfolgreiche Etablierung des neuronalen
Differenzierungssystems.
Bain et al. hat die Expressionsmuster von WNT1 (Bain et al., 1996) und GFAP
(Bain et al., 1995) während der zellulären Differenzierung gezeigt. Gajovic et al.
hat das Expressionsmuster von PAX6 während der frühen Differenzierung
gezeigt (Gajovic et al., 1997). Lee et al. hat die Expressionsmuster für Nestin,
OTX1 und OTX2 beschrieben (Lee et al., 2000). Diese publizierten
Expressionsmuster stimmen mit den von uns gezeigten Expressionsmustern
überein. Zusätzlich zeigten unsere Untersuchungen, dass auch N-cam und
FGF15 während der zellulären Differenzierung hochreguliert wurden.
Kelly et al. hat eine Microarray Analyse von undifferenzierten WT-ES-Zellen und
ATRA-induzierten differenzierten WT-ES-Zellen am Tag 3 nach Readhäsion
durchgeführt (Kelly and Rizzino, 2000). Wir haben die dort vorgenommene
Klassifikation der Gene als Leitfaden für unsere eigene Klassifikation genutzt.
Das Expressionsmuster vieler dort beschriebener Gene aus unterschiedlichen
funktionellen Gruppen deckte sich mit den Expressionsmustern unserer WT-
ES-Zellen, so z.B. IGF2 (Wachstumsfaktor), Keratin 18 und 19 (Zytoskelett) und
Cathepsine (Proteasen).
Unsere Arbeit zeigt erstmals die Kombination des in-vitro-
Differenzierungssytems in Kombination mit dem Knock-out-System. Darüber
hinaus zeigten wir erstmals, dass es möglich ist, auch PBX1(+/-)-Zellen und
PBX1(-/-)-Zellen neuronal zu differenzieren.
Diskussion 80
5.1.3 Vergleich der Differenzierung in vitro mit der Entwicklung in vivo
Die ES-Zellen entsprechen in vivo den Zellen der inneren Zellmasse der
Mausblastozyste in der Phase der Präimplantation. Zu dieser Zeit werden
bereits verschiedene Zellschichten erkannt: eine äußere Hülle, das
Trophoektoderm, aus der später das extraembryonale Gewebe entsteht, und
eine innere Zellmasse, aus der sich u.a. der Embryo entwickelt. Durch den
Prozess der Gastrulation bilden sich die drei Zellschichten: das Endoderm, das
Ektoderm und das Mesoderm (Rohwedel, 2001). Das axiale Mesoderm
induziert im anliegenden Ektoderm die Differenzierung des Neuroektoderms.
Aus dem Neuroektoderm entwickelt sich das Neuralrohr, das zum ZNS und
Rückenmark wird (Abb. 5-2).
Obwohl einige Zellen sich in vitro in den Embryoidkörperchen in
epithelähnlichen Strukturen anordnen, werden die Komplexität und die
hochorganisierten Interaktionen zwischen den Zellen eines dreikeimblättrigen
Embryos, wie sie in vivo vorherrschen, niemals erreicht.
Dennoch fand bei unseren Untersuchungen eine substantielle neuronale
Differenzierung in vitro statt, was den Schluss zulässt, dass es
Abb. 5-2: Schema der primären Neurulation. Nähere Erläuterungen siehe Text. (http://www.macalaster.edu)
Diskussion 81
Differenzierungswege von ES-Zellen zu neuronalen Zellen gibt, die nicht auf die
zellulären Interaktionen eines intakten Embryos angewiesen sind. Allerdings
darf nicht außer Acht gelassen werden, dass unsere Microarray Analyse zeigte,
dass einige ES-Zellen auch mesodermal differenzierten. Es könnte also sein,
dass die Zellen, die in die neuronale Zelllinie differenzieren, den Kontakt zu den
mesodermalen Zellen oder deren Sekretionsprodukte nutzen (Bain et al., 1995).
Bei Drosophila wurde bereits gezeigt, dass das Ektoderm auch ohne Interaktion
mit dem Mesoderm zur neuronalen Differenzierung fähig ist (Rao et al., 1991).
Zumindest von einigen der in vitro gezeigten Differenzierungsprozesse ist
bekannt, dass sie in vivo sehr ähnlich sind:
Zum Beispiel wurde in unseren Experimenten WNT1 während der zellulären
Differenzierung in vitro früh exprimiert und anschließend herrunterreguliert.
Dieses transiente Expressionsmuster ist auch bereits in vivo gezeigt worden
(Mastick et al., 1996; McMahon et al., 1992). Bain et al. konnten allerdings die
transiente Expression von WNT1 in vitro nicht zeigen (Bain et al., 1996), was
wahrscheinlich damit zusammenhängt, dass die Differenzierung an Tag 5 nach
Readhäsion abgebrochen wurde, wogegen in unserer Arbeit die RNA auch an
Tag 9 kontrolliert wurde.
Auch Nestin wurde in vitro in unseren Untersuchungen und wird in vivo
transient exprimiert. Hierzu passende in vivo-Daten liegen in der Literatur vor:
Nestin wird in vivo hauptsächlich in den Stammzellen des ZNS im Neuralrohr
gebildet. Am Ende der neuronalen Differenzierung wird die Expression von
Nestin verringert und später durch Neurofilament ersetzt (Yang et al., 2001).
PAX6 wurde in vitro früh hochreguliert und wird auch in vivo während der
embryonalen Entwicklung früh exprimiert, zunächst am E 8 im Vorderhirn und
Hinterhirn (Gajovic et al., 1997).
OTX2 wird in vivo zunächst im Epiblast produziert und später wird die
Expression auf das anteriore Neuroektoderm begrenzt, wo es für das Vorder-
und Mittelhirn benötigt wird. OTX1 wird zunächst im Neuroektoderm im
dorsalen Telencephalon exprimiert, und die Interaktionen der beiden OTX Gene
bewirken die Spezifizierung der Entwicklung von Mittelhirn und Hinterhirn
(Acampora et al., 1999). Dieses Verhalten könnte sich in unserem in-vitro-
Modell wieder spiegeln: OTX1 wurde während der späten Differenzierung
Diskussion 82
hochreguliert. OTX2 wurde von den undifferenzierten ES-Zellen und während
der späteren zellulären Differenzierung gebildet.
Gajovic et al. hat die Genexpression nach in-vitro-Differenzierung (d5) mit E
11,5 alten Embryos in vivo verglichen. Dabei zeigte sich, dass die meisten
Gene, die in vitro exprimiert werden auch in vivo aktiv sind (Gajovic et al.,
1998).
Wir können daher davon ausgehen, dass die von uns in vitro aufgedeckten
unterschiedlichen Genexpressionsmuster mit großer Wahrscheinlichkeit auf ein
Mausmodell übertragbar sind.
5.2 Auswirkung der Inaktivierung von PBX1 in embryonalen Stammzellen auf die in-vitro-Differenzierung
Interessant war im Anschluss an die Etablierung des in-vitro-
Differenzierungssystems der Vergleich zwischen den WT- und den PBX1-K.O.-
Zelllinien.
Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass alle Zelllinien, WT-ES-Zelllinie,
PBX1(+/-)-Zelllinie und beide PBX1(-/-)-Zelllinien in der Lage waren,
morphologisch gleichaussehende Embryoidkörperchen zu bilden. Diese
Beobachtung war nicht überraschend, da PBX1 von den undifferenzierten WT-
ES-Zellen nicht gebildet wurde und die Expression erst während der zellulären
Differenzierung hochreguliert wurde.
Im differenzierten Zustand zeigten sich Unterschiede zwischen den WT-Zellen
und den PBX1-K.O.-Zellen. Morphologisch zeigten die PBX1-K.O.-Zellen ein
ausgeprägtes Netzwerk neuronaler Fortsätze. Dieses Netzwerk unterschied
sich im Aufbau von den WT-Zelllinien. Bei den WT-Zelllinien wurden die
neuronalen Auswüchse strangförmig angeordnet und die neuronalen Fortsätze
begannen proximal an den Embryoidkörperchen. Bei den PBX1-K.O.-ES-Zellen
waren die neuronalen Fortsätze zwar vermehrt sichtbar, aber ungeordneter und
eher flächenhaft deckend. Immunzytochemische Untersuchungen zeigten, dass
sich in den PBX1-K.O.-Zelllinien mehr β-Tubulin positive Neurone entwickelten
als in den WT-Zelllinien. Die RT-PCR Ergebnisse bestätigten diese
Beobachtung dadurch, dass die neuronalen Marker nach der zellulären
Differenzierung der PBX1-K.O.-Zelllinien mehr exprimiert wurden als der WT-
Diskussion 83
Zelllinien. Auch die Microarray Analyse konnte diese Hypothese unterstützen.
Bei den PBX1-K.O.-Zelllinien wurden mehr neuronale Gene während der
zellulären Differenzierung hochreguliert als bei den WT-Zelllinien. Somit können
wir die Schlussfolgerung ziehen, dass die Inaktivierung des PBX1 Gens in den
ES-Zellen einen neuroektodermalen Shift während der zellulären
Differenzierung bewirkt.
Unsere Untersuchungen zeigten auch, dass alle ES-Zelllinien unterschiedlichen
Genotyps zum Teil in Muskelzellen differenzierten. Ähnlich wie bei den
neuronalen Markern wurden interessanterweise die myogenen Marker stärker
von den beiden PBX1-K.O.-Zelllinien exprimiert als von den WT-Zelllinien.
Andere endodermale Marker, wie z.B. Aquaporin wurden von den WT-Zelllinien
stärker hochreguliert als von den PBX1-K.O.-Zelllinien.
Viele Gene wurden aus verschiedenen funktionellen Gruppen von den WT- und
PBX1-K.O.-Zellen unterschiedlich exprimiert. Die Anzahl dieser Gene betrug in
unseren Mikroarray-Untersuchungen ca. 260. Aus jeder Gengruppe wurden
einige Vertreter von den WT-Zelllinien und andere von den PBX1-Zelllinen
stärker exprimiert, so dass eine gruppeninterne Analyse nicht möglich war.
Folgende funktionelle Gruppen zeigten unterschiedliche Expressionsmuster
zwischen den WT- und PBX1-K.O.-Zelllinien:
• Zytoskelett und extrazelluläre Matrix: Diese Gene werden während
der frühen Differenzierung hochreguliert und sind wichtig für die
Stabilität, Motilität und Apoptose von Zellen (Evans, 1998; Oshima et al.,
1996).
• Proteasen und Proteaseinhibitoren: Diese Gene spielen eine wichtige
Rolle in der Entwicklung der Maus, indem sie die extrazelluläre Matrix
modulieren, sowie zelluläre Migration und Invasion regulieren (Afonso et
al., 1997; Hamilton et al., 1991).
• Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren: Diese Gene üben
essentielle Funktionen während des embryonalen Wachstums und der
Entwicklung aus und werden auch in den differenzierten Zellen induziert.
Sie sind wichtige Regulatoren der Zellproliferation und Differenzierung
(Kelly et al., 1990; Mummery et al., 1990).
• Transkriptionsfaktoren: Viele dieser Gene sind in die zelluläre
Differenzierung involviert (McGinnis and Krumlauf, 1992).
Diskussion 84
• Enzyme: Diese Gene decken sehr unterschiedliche, aber vielfältige
Aufgabenbereiche.
Die Entwicklung der sich differenzierenden Stammzellen hängt von einer
Großzahl an Faktoren ab, wie z.B. Wachstumsfaktoren, Signalmolekülen und
extrazellulären Matrixproteinen. Die Funktionen dieser Faktoren und ihre
wechselseitige Interaktionen sind noch nicht vollkommen verstanden. Es war im
Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, im einzelnen auf alle Gene
einzugehen. Die auffälligsten unterschiedlichen Genexpressionsmuster
zwischen WT- und PBX1-K.O.-Zelllinien werden in Kapitel 5.3 näher diskutiert.
Wir können schlussfolgern, dass die PBX1(-/-)-Zellen mehr als die
Wildtypzelllinien neuroektodermal und mesodermal differenzierten und dass bei
den PBX1-K.O.-Zellen der endodermale Differenzierungsweg supprimiert
wurde. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist, dass durch die
Inaktivierung von PBX1 in den PBX1-K.O.-Zelllinien während der
Differenzierung andere Genaktivierungskaskaden stimuliert wurden als in den
WT-Zelllinien.
5.3 Vergleichende Charakterisierung der Genexpressionsmuster in WT und PBX1-K.O.-Zellen zur Identifikation von potentiellen Zielgenen
Wir können davon ausgehen, dass diejenigen Gene, die von den WT-Zelllinien
und von den PBX1-K.O.-Zelllinien unterschiedlich reguliert wurden, als
potentielle PBX1-Zielgene in Frage kommen. Um nach unterschiedlichen
Genexpressionsmustern zu fahnden, wurden RT-PCR Untersuchungen und
Genexpressionsanalysen durchgeführt.
Bei den RT-PCR Untersuchungen war das Genexpressionsmuster in PBX1-
K.O.-Zelllinien von WNT1, BMP4 und FGF15 interessant. Diese Befunde
werden im Kapitel 5.3.1 und 5.3.2 näher diskutiert.
Bei der vergleichenden Genexpressionsanalyse zwischen differenzierten WT-
Zelllinien und differenzierten PBX1(-/-)-Zelllinien war der Wert des Faktor („-fold
change“) bei der IGF-Familie und Colipase mit Abstand am höchsten. Diese
beiden Genfamilien werden deshalb in Kapitel 5.3.3 und 5.3.4 näher diskutiert.
Die Ergebnisse unsere RT-PCR Untersuchungen und Mikroarray-Analyse
Diskussion 85
machen es sehr wahrscheinlich, das die in den folgenden Kapiteln
beschriebenen Gene von PBX1 reguliert werden. Unser in-vitro-Modell erlaubt
allerdings keine Schlussfolgerungen über die Form der Regulation. Ziel der
nachstehende Kapitel ist es, diese Gengruppen vorzustellen und spekulativ die
Rolle der PBX1-Regulation in diesen Gengruppen darzustellen.
5.3.1 WNT1 und BMP4
Die Ergebnisse unserer RT-PCR Untersuchungen zeigten, dass die WNT1-
Expression zwar in den PBX1-K.O.-Zelllinien zeitgleich mit den WT-Zelllinien
induziert wurde, aber im Spätstadium der zellulären Differenzierung nicht wie
bei den WT-Zelllinien herrunterreguliert, sondern weiter hochreguliert wurden.
BMP4 verhielt sich bezüglich des Genexpressionsmusters gegenläufig zu
WNT1. Unsere PCR Ergebnisse weisen daraufhin, dass WNT1 und BMP4
gegenläufig von PBX1 reguliert werden.
Die gegensätzliche Wirkungsweise von WNT1 und BMP4 wurde auch in vivo in
der frühen Mausentwicklung beobachtet, wo BMP4 die Entwicklung des
Mesoderms steuert und WNT1 die Bildung des Neuroektoderms determiniert
(Czyz and Wobus, 2001). Analysen von mutanten Allelen von WNT1, entweder
spontan generiert (Thomas et al, 1991) oder durch homologe Rekombination
(Thomas and Capecchi, 1990; McMahon and Bradley, 1990) haben gezeigt,
dass WNT1 v.a. für die Entwicklung des Mittelhirns wichtig ist (Thomas and
Capecchi,1990; McMahon and Bradley, 1990; Thomas et al, 1991; McMahon et
al.1992). Die Inaktivierung von BMP4 führt zur frühen embryonalen Letalität
aufgrund mesodermaler Defekte (Mishina et al., 1995). Die genauen
Mechanismen der biochemischen Kaskaden von WNT1 und BMP4 sind noch
nicht bekannt. Der momentan angenommene Signaltransduktionsweg von
WNT1 ist in Abbildung 5-3 dargestellt. Es ist schwer abschätzbar, wie PBX1 in
die Regulation dieser Kaskade eingreift. Weitere Untersuchungen müssen
hierzu durchgeführt werden.
In Drosophila allerdings gehört die WNT und BMP-Familie bereits zu den
Zielgenen von Extradenticle (Exd), dem Homolog von PBX1 (Rauskolb and
Wieschaus, 1994). Wegen der Homologie zu Drosophila (71% Homologie
zwischen Exd und PBX) kann erwartet werden, dass PBX1 diese Zielgene auch
bei den Mammalien reguliert.
Diskussion 86
Abb. 5-3: Wnt-Signaltransduktion. WNT1 interagiert mit Frizzle class Rezeptoren an der Zelloberfläche und aktiviert somit sogenannte „dishevelled“ Proteine, die die Glykogen Synthase Kinase (GSK-3) inhibieren. Die Inhibition führt zu einer Stabilisierung und Akkumulation von unphosphoryliertem β-Catenin (Gradl et al., 1999). β-Catenin tritt in den Nukleus und interagiert mit verschiedenen Transkriptionfaktoren: TCF, LEF, Smad4 und triggert damit die Transkription von Zielgenen wie Brachyury und Connexin 43 (Ai et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999). In der Abwesenheit von WNT wird β-Catenin durch die Glykogen Synthase Kinase (GSK-3) phosphoryliert und daraufhin abgebaut (Cadigan and Nusse, 1997; Gradl et al., 1999; Nusse, 1999). AG Hecht, IMMZ, Freiburg
In unseren Untersuchungen führte die Inaktivierung von PBX1 zur Verhinderung
der Differenzierungs-assoziierten Repression von WNT1. Diese Beobachtung
könnte die verstärkte Neuronalisierung der PBX1-K.O.-ES-Zellen erklären, denn
WNT1 induziert in vivo die Differenzierung ins Neuroektoderm und die PBX1-
K.O.-Zellen exprimierten während der späten Differenzierung mehr WNT1 als
die WT-Zellen. Allerdings gibt es noch keine Erklärung für die Beobachtung,
dass die PBX1 Inaktivierung nicht zu einer Repression myogener Marker führt.
Man könnte erwarten, dass die vermindert Produktion von BMP4 zur
Repression myogener Marker führt. Allerdings spielen bei dem
Differenzierungsweg viele Faktoren eine Rolle und die Mikroarray-Analyse
zeigte, dass die PBX1-Inaktivierung die Expressionsmuster von mehreren
funktionell unterschiedlichen Gengruppen veränderte. Ein interessantes
Anschlussprojekt wäre es somit, zu untersuchen, ob PBX1 WNT1 oder BMP4
direkt reguliert.
Diskussion 87
5.3.2 FGF15
Die Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen zeigten, dass das
Expressionsmuster von FGF15 in WT- und PBX1-K.O.-Zelllinien während der
zellulären Expression unterschiedlich war. In den PBX1-K.O.-Zelllinien wurde
die Expression von FGF15 zwar zeitgleich mit den WT-Zelllinien induziert, aber
wurde im Spätstadium der zellulären Differenzierung nicht wie bei den WT-
Zelllinien herrunterreguliert, sondern weiter hochreguliert.
FGF15 wird in vivo während der Embryogenese nur im fetalen Gehirn gebildet
und spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Zellteilung und
Segmentierung in spezifischen Regionen im embryonalen Gehirn, Rückenmark
und sensorischen Organen (McWhirter et al., 1997). Die Expression von FGF15
erscheint auch in vivo während der frühen embryonalen Entwicklung: zunächst
am E 7,5 im Neuroektoderm, später im Mittelhirn und Dienzephalon (E8,5-E9),
dann im Mesencephalon und Bulbus olfactorius (E9,5-E12) (McWhirter et al.,
1997).
Interessanterweise reguliert E2A-PBX1 direkt die Transkription von FGF15
reguliert (McWhirter et al., 1997). Es bleibt jedoch unklar, ob diese Regulation
auf der Fusion von PBX1 zu E2A beruht oder auch die normale Funktion von
PBX1 reflektiert. Die Ergebnisse unserer RT-PCR Untersuchungen lassen
vermuten, dass FGF15 von PBX1 reguliert wird. Die direkte Regulation der
FGF15-Expression durch PBX1 muss jedoch noch in zukünftigen
Untersuchungen erst nachgewiesen werden.
5.3.3 IGF-Familie
Die Fehlregulation der IGF-Familie während der zellulären Differenzierung von
homozygoten PBX1-K.O.-ES-Zellen scheint uns von besonderem Interesse zu
sein. Während IGF1 und der IGF1R von den PBX1-K.O.-ES-Zellen nach der
zellulären Differenzierung etwas höher reguliert wurden als von den WT-Zellen,
wurden IGF2 und IGF2R nach der zellulären Differenzierung von PBX1-K.O.-
ES-Zellen fast gar nicht exprimiert. Die Ergebnisse sind sehr eindrucksvoll, da
die Genexpressionsmuster stark unterschiedlich zu denen der WT-Zellen
waren, und lassen auf eine PBX1-Regulierung schließen, die weiter untersucht
werden sollte.
Diskussion 88
Salmon and Daughaday haben gezeigt, dass das Somatotropin über
Somatomedine (IGF1/Somatomedin C und IGF2/Somatomedin A) und Insulin
wirkt (Salmon and Daughaday, 1990). Somatomedine weisen untereinander
eine hohe Sequenzhomologie auf und haben ein ähnliches Spektrum an
biologischen Funktionen. Sie spielen eine große Rolle beim präadolescenten
Wachstum, bei metabolischer Regulationen und beeinflussen die fetale
Zellteilung und Differenzierung. Sie spielen eine wichtige Rolle in der
embryonalen Entwicklung und sind an der Zellproliferation und Differenzierung
vieler Organe und Gewebearten beteiligt. Sie wirken über drei Zellrezeptoren
und ihre Funktion wird durch sechs Bindungsproteine beeinflusst. Die Aufgabe
der Bindungsproteine ist wahrscheinlich, die IGFs an den Rezeptor zu führen
und ihre Aktivitäten zu modulieren. IGFs werden hauptsächlich in der Leber
gebildet, aber auch in anderen Geweben und in fast allen Geweben werden
autokrine oder parakrine Aktivitäten gefunden. Der Rezeptor Typ1 vermittelt die
meisten biologischen Effekte von IGF1 und IGF2. Der IGF2 Rezeptor ist in die
IGF2 Degradation involviert (O'Dell and Day, 1998).
IGF1 und IGF2 und die Rezeptoren werden durchweg während der
Embryogenese des ZNS exprimiert (Ayer-le Lievre et al., 1991).
Die genaue Verteilung von IGF1-, IGF2- und Insulin-Rezeptoren im Rattenhirn
während der Entwicklung bis zum Erwachsenenalter sind in der Literatur
beschrieben (Kar et al., 1993). IGF1 und 2 scheinen eine Rolle bei der DNA
Synthese und Zellproliferation fetaler Gehirnzellen, bei der
Oligodendrozytendifferenzierung, bei der Bildung von Axonen, der Regulation
von Neurotransmittern und der Hormonausschüttung zu spielen. Das
Expressionsniveau von Gen, Protein und Rezeptor ist während der Entwicklung
höher als im Erwachsenenalter. Insulin partizipiert in der Regulation und
Reifung des Gehirns und spielt als Neuromodulator im ZNS eine Rolle. Die
höchste Expressionsrate dieser Liganden wird im Bulbus olfactorius, Kortex,
Hippocampus, Plexus choroideus und im Cerebellum gefunden. In all diesen
Regionen verteilen sich die einzelnen Rezeptoren auf distinkte Subareale. Zum
Beispiel wird im Cerebellum der IGF2R im Stratum granulosum, der Insulin-
Rezeptor im Stratum moleculare und IGF1R in beiden Zellschichten gefunden.
Die höchste Expressionsrate zeigt sich in der späten embryonalen und frühen
postnatalen Entwicklung, die dann bis ins Erwachsenenalter allmählich absinkt.
Diskussion 89
Beim Menschen bleibt im Gegensatz zur Maus die IGF2-Expression postnatal
erhalten. In der adulten Maus ist die Expression auf den Plexus choroideus und
die Leptomeningen reduziert (Kar et al., 1993).
5.3.3.1 IGF1
Unsere Northern-Blot-Analyse bestätigte das Mikroarray-Ergebnis, dass IGF1
während der zellulären Differenzierung von den PBX1-K.O.-Zellen höher
hochreguliert wurde als von den WT-K.O.-Zellen.
Die IGF1-Expression ist in vivo in der Ratte am höchsten während der
embryonalen Entwicklung des ZNS, wird aber auch noch endogen im adulten
Gehirn produziert, z. B. im Hippocampus, Bulbus olfactorius und im Cerebellum.
Hinzu kommt, dass IGF1 die Blut-Hirn-Schranke passiert. Deswegen wird das
ZNS zusätzlich von zirkulierendem IGF1 mitbeeinflusst (Anderson et al., 2002).
IGF1 spielt eine Rolle bei der Neurogenese, wobei sein Einfluss auf die
Entwicklung des ZNS gut untersucht ist. Es zeigten sich Effekte auf
verschiedende Stadien der Entwicklung, wie z.B. Zellproliferation,
Differenzierung und Überlebensrate (Anlar et al., 1999). IGF1-K.O.-Mäuse
entwickeln weniger neuronale Zellen in vivo (Beck et al., 1995). Mäuse, die
IGF1 überexprimieren, entfalten ein größeres Gehirn (Ye et al., 1995; Ye et al.,
1996). Es ist belegt, dass IGF1 mitogen auf sympathische Neuroblasten wirkt
und das Wachstum sympathischer neuronaler Fortsätze stimuliert (Caroni and
Grandes, 1990; DiCicco-Bloom and Black, 1988; Mill et al., 1985). Es fördert
außerdem die Differenzierung postmitotischer Neurone auch in vitro
(Arsenijevic and Weiss, 1998; Drago et al., 1991; Hughes et al., 1993).
IGF1 beeinflusst sowohl die frühe bzw. die späte Entwicklung des ZNS, wobei
die molekularen Mechanismen noch nicht bekannt sind (Arsenijevic and Weiss,
1998; D'Ercole et al., 2002).
Passend zu den oben zitierten Literaturbefunden könnte also die von uns
beobachtete IGF1-Hochregulierung der PBX1-K.O.-ES-Zellen ein Grund dafür
sein, dass die PBX1-K.O.-ES-Zellen mehr neuronale Zellen produzieren und
dass diese Zellen mehr neuronale Auswüchse hervorbringen.
Diskussion 90
5.3.3.2 IGF1R
Unsere Northern-Blot-Analyse zeigte, dass IGF1R während der zellulären
Differenzierung von den PBX1-K.O.-Zellen höher hochreguliert wurde als von
den WT-K.O.-Zellen (Abb. 4-31).
IGF1R wirkt sowohl in vitro als auch in vivo mitogen und kann Zellen vor
apoptotischen Signalen schützen. Es induziert Zelldifferenzierung und spielt
eine wichtige Rolle in der Transformation von Zellen. Der IGF1R ist aber auch
in der Lage, das Wachstum zu inhibieren (Baserga, 2000).
IGF1R-K.O.-Mäuse sterben kurz nach der Geburt aufgrund respiratorischen
Versagens und weisen Muskelhypoplasien, verspätete Ossifikation und
Hautverdünnung auf (Liu et al.1993).
Die Tatsache, dass IGF1R in unserem in-vitro-Modell hochreguliert wurde
könnte damit zusammenhängen, dass IGF2 selbst nur wenig produziert wird.
IGF2 wirkt während der embryonalen Entwicklung hauptsächlich über den
IGF1R. Eine geringere Konzentration an IGF2 könnte die Produktion von IGF1R
stimulieren.
5.3.3.3 IGF2
Unsere Northern-Blot-Analyse bestätigte, das IGF2 sowohl im undifferenzierten
Stadium als auch während der zellulären Differenzierung kaum von den PBX1-
K.O.-Zellen exprimiert wurde, wogegen IGF2 während der zellulären
Differenzierung von den WT-ES-Zellen sehr stark hochreguliert wurde.
Die IGF2-Expression unterliegt im Mausembryo in vivo dem genomic imprinting
und wird deshalb nur von einem Allel abgelesen. Die Expression von IGF2
erfolgt nur während der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung,
Ausnahmen sind der Plexus choroideus und die Leptomeningen, in denen die
Expression biallel und lebenslang erfolgt (Stylianopoulou et al., 1988). IGF2
wird vom väterlichen Allel exprimiert und H19 vom mütterlichen Allel. Sie zeigen
reziproke topische und zeitliche Spezifitäten. Das humane IGF2 Gen wird von
vier Promotoren transkribiert. Im Erwachsenen wird IGF2 von Promotor 1 (P1)
biallel transkribiert. In der Maus und der Ratte gibt es den humanen P1
Promotor nicht, und die Promotoren P2-P4 werden an Stelle von den
Promotoren P1-P3 genutzt (Vu and Hoffman, 1994). In der Maus ist allerdings
ein neuer Promotor beschrieben worden (P0), welcher zur paternalen
Diskussion 91
Expression eines Transkripts von Exon 4-6 führt, das spezifisch in der Plazenta
gebildet wird (Moore et al., 1997). IGF2 beeinflusst das Wachstum und die
Funktion der Plazenta (Constancia et al., 2002).
Während der frühen Entwicklung wird in der Maus IGF2 mRNA und Protein
zunächst im primitiven Endoderm (E 6,5), später im extraembryonalen
Mesoderm (E 7) und dann im anterior-proximalen und lateralen Mesoderm
produziert. Später wird es vor allem stark in Mesoderm Derivaten exprimiert
(Lee et al., 1990).
IGF2(+/-)-K.O.-Mäuse zeigen eine signifikante fetale Wachstumsretardierung.
Die Wachstumsretardierung tritt vor dem 16. embryonalen Tag auf und
persisiert nach der Geburt. Möglicherweise ist sie durch verschlechterte
trophische Funktionen der Plazenta zu erklären. Die Mäuse sind lebensfähig
und fertil (DeChiara et al., 1990). Transgene Mäuse, die IGF2 konstitutiv
überexprimieren, zeigen keine ZNS Veränderungen (D'Ercole et al., 2002).
Nach verschiedenen in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen an murinen ES-
Zellen wurde ein funktionelles Modell vorgeschlagen, in dem IGF2 über IGF1R
an der Oberfläche von mesodermalen Vorläuferzellen die Bildung von
Mesodermzellen stimuliert (Morali et al., 2000).
Die Regulation von IGF2 ist sehr komplex. Die Tatsache, dass IGF2 in unseren
Untersuchungen den Marker mit dem auffälligsten Unterschied zwischen den
PBX1-K.O.-ES-Zellen und den WT-Zellen darstellt, sollte in weiteren
Untersuchungen Anlass sein, die PBX1-Regulation näher zu untersuchen, da
unsere Ergebnisse zwar Korrelationen zeigen, doch nicht eindeutig belegen,
dass PBX die IGF-Familie direkt reguliert.
In diesem Zusammenhang wäre es auch interessant zu untersuchen, in
welchen Zelltypen PBX1 das IGF-System beeinflusst.
5.3.3.4 IGF2R
Unsere Northern-Blot-Analyse bestätigte, dass IGF2R zwar im undifferenzierten
Stadium von den PBX1-K.O.-Zellen exprimiert wurde, aber während der
zellulären Differenzierung stark herunterreguliert wurde, wogegen IGF2R
während der zellulären Differenzierung von den WT-ES-Zellen hochreguliert
wurde.
Diskussion 92
IGF2R-K.O.-Mäuse sterben perinatal aufgrund gravierender kardialer
Abnormalitäten. Sie sind 25%-30% größer als die WT-Mäuse und haben
erhöhte IGF2 und IGF-BP Konzentrationen (Lau et al., 1994).
Die Hauptaufgabe von IGF2R besteht in der Degradation von IGF2 und damit in
der Kontrolle des IGF2 Spiegels. Warum IGF2R in unserem Versuchssystem
von den PBX1-K.O.-ES-Zellen während der zellulären Differenzierung so stark
herunterreguliert wurde, bleibt unklar. Eine mögliche Erklärung ist, dass die
geringe Konzentration, die an IGF2 noch vorhanden ist, durch
Herrunterregulation von IGF2R vor einem Abbau durch Internalisation geschützt
wird.
5.3.3.5 H19
Unsere Northern-Blot-Analysen zeigten, dass H19 stärker von den PBX1-K.O.-
Zellen als von den WT-Zellen während der zellulären Differenzierung
hochreguliert wurde.
H19 und IGF2 werden während der fetalen und frühen postnatalen Phase in
vivo reziprok exprimiert und zeigen reziproke topische und zeitliche
Genexpressionsmuster (Kaffer et al., 2001). Hierzu passt unsere Beobachtung,
dass die Herunterregulierung von IGF2 in den PBX1-K.O.-Zellen bei unserem
Differenzierungssystem mit einer Hochregulierung von H19 einhergeht.
Das aktuelle Modell (Reik and Murrell, 2000; Thorvaldsen and Bartolomei,
2000) zum genomic imprinting von IGF2 und H19 besagt, dass die Expression
von diesen Genen durch Konkurrenz von verschiedenen Promotern um eine
gemeinsame Gruppe von Enhancern reguliert wird. Die Expression des
Monoallels des jeweiligen Gens hängt von einem gemeinsamen cis-acting
element – ICE (imprinting control element) ab. ICE liegt upstream von dem H19
Promoter. Sequenzen innerhalb dieser Region sind hypermethyliert, vor allem
auf dem paternalen Allel. Differentiell methylierte Regionen (DMR) sind
identifiziert worden. Auf dem paternalen Allel wird die Expression von IGF2
ermöglicht, weil die H19 Transkription durch DNA-Methylierung inaktiviert wird.
Beim maternalen Allel wird die Aktivität des Enhancers bevorzugt zum
unmethylierten H19 Promotor gesteuert. Hier scheint es sich mehr um eine
Enhancer Konkurrenz zu handeln. Die Expression von IGF2 wird reprimiert,
aber keinem vollständigen Silencing unterworfen. Die bevorzugte Expression
Diskussion 93
von H19 lässt sich wahrscheinlich dadurch erklären, dass die Enhancer näher
an H19 als an IGF2 liegen. Der Methylierunsgrad von DMR unterscheidet sich
in den verschiedenen Gewebetypen und Entwicklungsphasen und wird
während der frühen Embryogenese festgelegt (Kaffer et al., 2001; Kaffer et al.,
2000).
Die durch die Inaktivierung von PBX1 bedingte Fehlregulation der IGF-Familie
ist eine interessante Neuentdeckung, die mit Sicherheit Gegenstand der
Forschung bleiben wird und evtl. mögliche Erklärungsansätze für den Phänotyp
der PBX1-K.O.-Maus bietet (Kap. 5.4).
5.3.4 Colipase
Auch die Colipase gehört zu den Genen, die in unseren Untersuchungen eine
Fehlregulation in PBX1-K.O.-Zellen aufwiesen. Colipase wurde während der
zellulären Differenzierung nur in geringen Mengen von den PBX1-K.O.-Zellen
im Vergleich zu den WT-Zellen hochreguliert.
Colipase wird in vivo im Pankreas, Magen und Darm produziert. Pankreatische
Colipase ist ein 12-kD Polypeptid Kofaktor für pankreatische Lipase, ein Enzym,
das essentiell für die Fettresorption ist (Lowe, 1994). Die Colipase-K.O.-Maus
zeigt, dass Colipase aber auch von der Lipase unabhängige Funktionen haben
muss (D'Agostino et al., 2002). In vitro stellt Colipase die Aktivität der
pankreatischen Lipase auch in Anwesenheit von Inhibitoren wie Gallensäuren,
Phospholipiden und Speiseproteinen wieder her. Colipase wird aus einer
Proform, Procolipase, synthetisiert. Procolipase(-/-)-K.O.-Mäuse zeigen eine
reduzierte postnatale Überlebensrate, reduzierten Gewichtsgewinn, Stearrhö
nach fettreicher Nahrung und auch reduziertes Körpergewicht nach fettarmer
Nahrung (D'Agostino et al., 2002).
Die Regulation von Colipase durch PBX1 ist bisher noch nicht in der Literatur
beschrieben und bietet möglicherweise auch neue Erklärungsansätze für den
Phänotyp der PBX1-K.O.-Maus.
Diskussion 94
5.3.5 Zusammenfassende Darstellung potentieller Zielgene von PBX1
Die im in-vitro-Modell gezeigten unterschiedlichen Genexpressionsmuster
zwischen den WT-ES-Zellen und den homozygoten PBX1-K.O.-Zellen sind sehr
interessant, weil verschiedene publizierte Arbeiten gezeigt haben, das PBX1 mit
HOX-Proteinen und Meis-Proteinen interagiert und Zielgene reguliert (Popperl
et al., 1995; Rauskolb and Wieschaus, 1994) (Kap. 1.4). PBX1 ist in der Lage,
sowohl die Bindungsaffinität und Spezifität zur DNA, als auch ihre
Transkriptionsaktivität zu erhöhen. Beispielsweise erkennt die Mehrheit der
HOX-Monomere das DNA-Motiv TAAT, während HOX-PBX und PBX-Meis viel
längere DNA-Motive erkennen, was in höherer Affinität und Spezifität von
möglichen DNA-Bindungen resultiert (Knoepfler et al., 1997).
Es ist bisher wenig bekannt über die direkten Zielgene von PBX1. Am besten
charakterisiert sind als Zielgene die HOX-Gene selber. Es ist bekannt, das
HOX-Gene sich selbst regulieren. So enthält beispielsweise HOXb1 ein
autoregulatives Element (ARE) mit drei Bindungsstellen für PBX1 (McWhirter et
al., 1997).
Saleh et al. konnten zeigen, dass diese HOX-PBX-Komplexe durch bestimmte
Signale von Repressoren in Aktivatoren umgewandelt werden können und
diese Umwandlung auch in zelltypspezifischer Weise erfolgt. Unter bestimmten
zellulären Bedingungen überwiegen die Korepressoren gegenüber Aktivatoren
und der Komplex wird repressiv. Allerdings kann sich unter der Wirkung von
Proteinkinase A, Zellaggregation, Anstieg der Koaktivatoren und/oder
Verringerung der Korepressoren die Balance verschieben. Der Komplex bewirkt
dann eine Aktivierung der Zielgene (Abb. 5-4) (Saleh et al., 2000). Die oben
beschriebenen Gene (WNT1, FGF15, IGF und Rezeptoren, Colipase) könnten
als Zielgene dieses Komplexes eine Rolle spielen.
Abb. 5-4: Vereinfachte Darstellung der Regulation der Zielgenexpression durch HOX- und PBX-Gene. Nähere Erläuterungen im Text. „AD“= HOX activation domain „RD“= PBX repression domain (modifiziert nach Saleh et al., 2000)
Diskussion 95
5.4 Korrelation des zuvor beschriebenen in-vitro-Differenzierungssystems mit einem in vivo PBX1-K.O.-Maus-Modell
M. Kolanczyk etablierte in unserer Arbeitsgruppe PBX1-Knock-out-Mäuse. Die
Analyse dieser PBX1-K.O.-Mäuse erfolgte parallel zu den Untersuchungen des
in-vitro-Differenzierungssystems. Obwohl die Charakterisierung des Phänotyps
dieser PBX1-K.O.-Mäuse zum Teil bereits publiziert wurde (Kap. 1.4), fehlt noch
das molekulare Verständnis über die Ursachen der Entstehung des Phänotyps.
Die Korrelation der Daten des in-vitro-Systems mit dem in-vivo-Modell könnte
daher interessante Ergebnisse liefern. Zunächst sollten die unterschiedlichen
Genexpressionsmuster in vivo bestätigt werden. Die unterschiedlichen
Expressionsmuster können dann bestimmte Aspekte des Phänotyps erklären.
Ein mögliches Anschlussprojekt wird in Kapitel 5.4.1 exemplarisch vorgestellt.
Die in unserer Arbeitsgruppe etablierten PBX1-K.O.-Mäuse zeigen bisher den in
der Literatur bereits beschriebenen Phänotyp (DiMartino et al., 2001; Kim et al.,
2002; Selleri et al., 2001), obwohl bei unseren PBX1-K.O.-Mäusen selektiv die
PBX1-Homöodomäne eliminiert wurde. Die Mäuse mit einem totalen PBX1-K.O.
sterben während der embryonalen Entwicklung zwischen E 15,5 und E 16,5 mit
schweren Hypoplasien und Aplasien multipler Organsysteme
.
5.4.1 Rolle von PBX1 in der Entwicklung des Pankreas und in der Pathogenese des Diabetes
In bereits veröffentlichten Arbeiten wurde gezeigt, dass der Phänotyp von
PBX1-K.O.-Embryos eine Pankreashypoplasie und Defekte im exokrinen und
endokrinen Teil des Pankreas aufweist. In diesen Embryos ist die Expression
von ISL1 und ATOH5, zwei wichtigen Pankreasmarkern, reduziert, wohingegen
die Expression von PDX1, einen für die die Entwicklung des Pankreas
unentbehrlichen Transkriptionsfaktor, dagegen unverändert zum WT ist. Die
Expression von Glukagon und Insulin ist ebenfalls reduziert (Kim et al., 2002).
Interessanterweise zeigen auch die hetereozygoten Mäuse einen Phänotyp.
PBX1(+/-) Mäuse weisen eine Pankreasmalformation, eine pathologische
Glukosetoleranz und verminderte Insulinwerte auf. Diese Veränderungen sind
Diskussion 96
Konditionen, die mit dem Beginn von Diabetes mellitus assoziiert sind (Kim et
al., 2002).
Es ist bekannt, dass PBX1 die Aktivität von PDX1 reguliert (Dutta et al., 2001).
PDX1 spielt eine entscheidende Rolle in der Entwicklung des Pankreas und in
der Homöostase der Glukose. PDX1(-/-)-K.O.-Mäuse haben kein Pankreas
(Jonsson et al., 1994). PDX1(+/-)-Mäuse entwickeln sich zunächst normal,
zeigen aber im adulten Stadium eine Glukoseintoleranz (Ahlgren et al., 1998).
PDX1 wird hauptsächlich in β-Zellen exprimiert, ist aber auch in Azinuszellen
aktiv (Ahlgren et al., 1998). PDX1 beteiligt sich an der Aktivierung von
mindestens einem Azinus spezifischen Gen–Elastase I (Swift et al., 1998).
PDX1 ist alleine aktiv, aber auch als PDX-PBX-Komplex. PDX1 enthält das
entsprechende TGATTAAT Motiv, das die kooperative DNA-Bindung mit PBX1
ermöglicht. PBX1b und Meis2b können im Komplex mit PDX1 seine
transkriptionale Aktivität verändern. In Azinuszellen wirkt PDX1 im Komplex (bei
der Aktivierung von Elastase I), in β-Zellen jedoch allein (Liu et al., 2001;
MacDonald and Swift, 1998). PDX1PBX1-Komplexe sind während der
Entwicklung und der Regeneration des Pankreas essentiell für die Organisation
und Proliferation von duktalen, endokrinen und azinären Zelllinien (Dutta et al.,
2001).
Immunzytochemische Analysen zeigen eine teilweise Überschneidung von
PBX1- und PDX1-Expression im Pankreas der embryonalen und adulten Maus.
Diese Beobachtung zeigt auch, dass PBX1 sowohl PDX1-abhängige als auch
PDX1-unabhängige Pankreasfunktionen hat, die jedoch bisher nicht näher
charakterisiert sind (Kim et al., 2002).
Hier könnte die von uns beschriebene Fehlregulation von IGF nach PBX Verlust
eine große Rolle spielen. Der Diabetes mellitus Typ2 ist eine komplexe
metabolische Erkrankung, die durch eine verschlechterte Insulinwirkung im
peripheren Gewebe und eine gestörte Pankreas β-Zellfunktion charakterisiert ist
(White, 2002). Obwohl diese beiden Abnormalitäten miteinander einhergehen,
ist noch nicht klar, ob sie die gleiche Pathogenese haben. Insulin und dem IGF
Signalsystem wird im zunehmenden Maße eine Rolle für den Metabolismus des
Pankreas zugeschrieben. In der Entwicklung des Pankreas ist IGF2 für die
Regulation von Inselzellgröße und Differenzierung verantwortlich (Han et al.,
Diskussion 97
1988). IGF2 ist in den β-Zellen des Pankreas mit Insulin kolokalisiert (Maake
and Reinecke, 1993).
IGF2 wird eine zunehmende Bedeutung auch in der Pathogenese des Diabetes
mellitus Typ 2 zugeschrieben. Serradas et al. konnten zeigen, dass im Goto-
Kakizaki (GK) Fetus von Ratten, ein Modell für Diabetes mellitus Typ 2, die
IGF2-Expression in Leber, Pankreas und Serum reduziert ist. Die reduzierte
Expression von IGF2 im Pankreas von GK Feten könnte eine entscheidende
Rolle für Anomalität der β-Zellmasse in den fetalen GK Ratten spielen
(Serradas et al., 2002).
Die kombinierte Inaktivierung von Insulinrezeptor und IGF1 Rezeptor, aber
keine von beiden Mutationen allein, führt zu eine 90%igen Reduktion der Größe
des exokrinen Pankreas. Der Phänotyp wird bereits am E12,5 sichtbar. Daher
wird dieser Effekt wahrscheinlich auf IGF2 zurückzuführen sein (Kido et al.,
2002).
Die näheren Funktionen von PBX1 in der Entwicklung des Pankreas und der
Pathogenese des Diabetes mellitus soll in Folgeprojekten der vorliegenden
Arbeit in Kooperation mit dem Deutschen Diabetes Institut in Düsseldorf
untersucht werden. Die folgenden Experimente sind in Planung:
1. Bestimmung der Expression von β-Zell-Progenitormarkern in der
vorhandenen cDNA unserer differenzierten neuronalen Zellen
2. Differenzierung unserer PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen zu β-Zellen
3. Untersuchung des Effekts von Überexpression von PBX1 in β-Inselzellen
4. Analyse der Expression von Progenitormarkern im Pankreas der PBX1-
K.O.-Mäuse
5. Elektronenmikroskopie von Inselzellen in den PBX1(+/-)-Mäusen
6. Etablierung einer konditionalen PBX1-K.O.-Maus
Diskussion 98
5.4.2 Rolle von PBX1 in der Hämatopoese
Die Hämatopoese
beinhaltet die Produktion
von unterschiedlichen
Reihen reifer Blutzellen
und wird durch
verschiedene
regulatorische Proteine
kontrolliert. Die Tatsache,
dass PBX1 im Rahmen
der prä-B akuten
lymphatischen Leukämie
mit der Translokation
t(1;19) identifiziert wurde,
suggeriert, dass auch
PBX1 eine Rolle bei der Regulation der Hämatopoese spielen könnte
(DiMartino et al., 2001).
Akute Leukämien sind maligne Erkrankungen unreifer hämatopoetischer
Progenitorzellen. Sie sind durch eine fehlende Ausreifung und unregulierte
Proliferation dieser Zellen gekennzeichnet. Bei ca. 75% der Patienten mit ALL
finden sich in den Leukämiezellen spezifische genetische Veränderungen, die
die Ursache für die Entstehung der malignen Erkrankung darstellen und die
Einteilung in Risikogruppen mitbestimmen (Abb. 5-5) (Koletzko and von
Harnack, 2000). Diese Veränderungen führen zu einer aberranten
Genexpression und beeinflussen dadurch die Proliferation, die Differenzierung
und die Überlebensrate der Zellen (Look, 1997).
In prä-B-Zell-Leukämien mit der Translokation t(1;19) wird PBX1 mit der
Aktivierungsdomäne des bHLH Transkriptionsfaktors E2a fusioniert (Carroll et
al., 1984). Patienten mit dieser Translokation gehören in die
Hochrisikokategorie und müssen mit einer aggressiveren Therapie behandelt
werden (Crist et al., 1990). E2A-PBX1 behält die Fähigkeit, an DNA zu binden
und mit HOX-Proteinen zu interagieren. Es wird vermutet, dass die E2A-PBX1
Fusion zum Teil die Transkriptionsfaktoren reguliert, die auch von PBX1
Abb. 5-5: Chromosomenveränderungen bei ALL. (aus Look, 1997)
Diskussion 99
reguliert werden. E2A-PBX1 verliert die Fähigkeit, mit Meis zu interagieren, so
dass es wahrscheinlich zur aberranten Expression von PBX/HOX Zielgenen
kommt (Knoepfler et al., 1997; Look, 1997).
McWhirter et al. zeigten, dass FGF15 zwar direkt von E2A-PBX1 reguliert wird,
allerdings nicht in t(1;19) positiven prä-B-Zelllinien. Dort bindet E2A-PBX1 nicht
an den Promotor und die Transkription von FGF15 wird auch nicht induziert. Es
wird vermutet, dass der Kofaktor, der für die FGF15 Induzierung notwendig ist,
nicht in prä-B Zellen exprimiert wird (McWhirter et al., 1997).
Bei der Übertragung der Zielgene von PBX1 auf t(1;19) positive prä-B ALL-
Zelllinien muß beachtet werden, dass zum einen die Fusion mit E2A zu
aberranten Funktionen führen kann und zum anderen Kofaktoren
unterschiedlich in verschiedenen Geweben exprimiert werden (McWhirter et al.,
1997). Eine direkte Übertragung unserer Ergebnisse auf Zellen mit E2A-PBX1
positive Zellen ist daher nicht möglich.
Hinzu kommt, dass die Mikroarray-Analyse von prä-B ALL mit der Translokation
t(1;19) keine signifikante Fehlregulation von IGF2 aufgedeckt hat (Yeoh et al.,
2002). Dies kann zum einen daran liegen, dass IGF2 kein Zielgen von E2a-
PBX1 ist, zum anderen daran, dass in der prä-B-Zelllinie andere Kofaktoren
eine Rolle spielen.
PBX1(-/-) Mäuse weisen eine Hypoplasie der fetalen Leber und eine starke
Anämie auf (DiMartino et al., 2001). Es sind allerdings sowohl kernhaltige als
auch entkernte Erythrozyten vorhanden. Eine definitive Hämatopoese findet
demnach statt, kann aber mit dem Wachstum des embryonalen Fetus nicht
mithalten. Ursachen dafür liegen in quantitativen und qualitativen Defekten in
verschiedenen Phasen der Hämatopoese. Die Anzahl als auch die Aktivität der
hämatopoetischen Stammzellen sind verringert. Dies gilt auch für die common
myeloid progenitors und die megakaryocyte / erythrocyte committed
progenitors. PBX1 wird also für die Erhaltung und nicht für die Initiierung der
definitiven Hämatopoese benötigt. PBX1 stimuliert die mitotische Amplifikation
der Vorläuferzellen und erzeugt damit reife Blutzellen (DiMartino et al., 2001).
Die Ursache auf molekularer Ebene ist nicht bekannt. Vielleicht spielt hier die
von uns dokumentierte Fehlregulation von IGF oder den HOX-Proteinen eine
Rolle.
Diskussion 100
Die IGF-Familie reguliert Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer
Zellen (Zumkeller, 2002). IGF wirkt über spezifische Rezeptoren auf wachsende
und sich differenzierende Blutzellen. Das IGF System ist sehr komplex, es kann
sowohl aktivierend als auch inhibierend über die Interaktion mit IGF und IGF
Bindungsproteinen wirken. IGF stimuliert Erythrozyten und Lymphozyten, aber
steigert auch die leukämische hämatopoetische Zellproliferation (Zumkeller,
2002). IGF1 und 2 sind mitogene Faktoren, die von malignen Zellen sezerniert
werden. IGF2 wird während der Entwicklung im Knochenmark biallel abgelesen,
wobei die Expression im peripheren Blut weiterhin nur vom paternalen Allel
transkribiert wird (Morison et al., 2000). IGF1 reguliert prä-B-Zelldifferenzierung
(Landreth et al., 1992).
HOX-Proteine werden während der Hämatopoese in einem spezifischen
topischen und zeitlichen Muster exprimiert (Lawrence and Largman, 1992).
Mindestens 22 von 39 HOX-Genen werden in verschiedenen Subpopulationen
der CD34+ Progenitorzellen im Knochenmark exprimiert (Sauvageau et al.,
1994). Jedes dieser HOX-Gene hat einen eigenständigen Effekt z.B. führt die
HOXB4 Überexpression zu einer selektiven Expansion von primitiven
hämatopoetischen Stammzellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung
beibehalten (Sauvageau et al., 1995). Mäuse, die HOXB3 überexprimieren,
weisen Defekte in der frühen B Zelldifferenzierung und myeloproliferative
Erkrankungen auf, die sich durch eine Splenomegalie und eine Expansion von
klonalen myeloiden Progenitorzellen zeigen (Sauvageau et al., 1997). Die
Pathogenese auf molekularer Ebene ist nicht bekannt.
Ein interessantes Anschlussprojekt an die vorliegene Arbeit wäre es, die Rolle
von PBX1 in der Hämatopoese zu untersuchen, auch hinsichtlich der von uns
gewonnenen Microarray Daten.
5.5 Schlussfolgerung und Perspektiven
Unsere Anwendung des neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems an WT-,
PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen erlaubte es uns, das Problem der frühen
Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen zu umgehen, das bei in vivo-Versuchen die
Analyse der Auswirkung des Verlustes von PBX1 auf zellulärer Ebene
unmöglich macht. Aus den Ergebnissen der vergleichenden Charakterisierung
der Zelllinien unterschiedlichen Genotyps folgern wir, dass die Inaktivierung des
Diskussion 101
PBX1-Gens zu einer verstärkten mesodermalen und neuronalen
Differenzierung führt. Eine Erklärung hierfür könnte die fehlende Repression
von WNT und FGF15 nach der zellulären Differenzierung in den PBX1(-/-)-
Zelllinien dienen.
Die unterschiedlichen Genexpressionsmuster während der zellulären
Differenzierung von WT- und PBX1(-/-)-ES-Zellen deuten auf potentielle
Zielgene von PBX1 hin. Die oben beschriebenen, differenziell regulierten Gene
(WNT1, FGF15, IGF und Rezeptoren, Colipase) könnten als Zielgene eine
Rolle spielen. Aus den hier beschriebenen Untersuchungen alleine können
allerdings noch keine Aussagen über direkte Regulationsvorgänge abgeleitet
werden, dazu müssen weitere Untersuchungen angeschlossen werden.
Im in-vitro-in-vivo-Vergleich können die Ergebnisse unserer Untersuchungen
herangezogen werden, um Aspekte des Phänotyps der PBX1(-/-) und PBX1(+/-
)-Mäuse zu verstehen. So erklärt die fehlende Induktion von IGF2
möglicherweise die Fehlentwicklung des Pankreas und die Pathogenese des
Diabetes mellitus, möglicherweise auch die Störung der Hämatopoese in den
PBX1-K.O.-Mäusen.
Unser in vitro-System könnte in weiterführenden Untersuchungen sowohl auf
andere Differenzierungswege von PBX1-K.O.-ES-Zellen, z.B. die
Differenzierung zu β-Inselzellen, als auch auf andere K.O.-ES-Zellen
übertragen werden. So könnte das System einen wesentlichen Beitrag zum
tieferen Verständnis der Pathophysiologie des Diabetes mellitus und anderer
Erkrankungen sowie der Funktionsanalyse ausgeschalteter Gene liefern,
insbesondere in Situationen, wo ein Gen-Knock-out sich embryonal letal
auswirkt.
Zusammenfassung 102
6 Zusammenfassung
Die Expression des PBX1-Gens ist essentiell für die normale Embryogenese. PBX1 wird in
Regionen aktiver Neurogenese exprimiert. Somit war das Ziel dieser Arbeit die Etablierung
eines neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems embryonaler Stammzellen (ES-Zellen),
das das Problem der frühen Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen umgeht und so die Analyse
der Auswirkungen des Verlustes von PBX1 während der neuronalen Differenzierung auf
zellulärer Ebene erlaubt.
Unter Verwendung des CreLox-Systems wurden Einzel- und Doppelallel-PBX1-K.O.-ES-
Zellen aus Wildtyp (WT) murinen embryonalen Stammzellen erzeugt. Nach der Etablierung
des in-vitro-Differenzierungssystems wurden die Zelllinien der verschiedenen Genotypen
neuronal differenziert und untereinander in unterschiedlichen Differenzierungsstadien
morphologisch, immunzytochemisch und auf molekularer Ebene verglichen.
Lichtmikroskopisch-morphologische Analysen und immunzytochemische Untersuchungen
zeigten, dass die beiden PBX1-K.O.-Zelllinien mehr neuronalisierten als die WT-Zelllinien.
Die semiquantitativen RT-PCR-Ergebnisse und die Mikroarray-Genexpressionsanalyse
bestätigten diese Beobachtung insofern, als die neuronalen Marker nach der zellulären
Differenzierung von den PBX1(-/-)-Zelllinien stärker exprimiert wurden als von den WT-
Zelllinien. Zusätzlich zeigte die Mikroarray-Analyse, dass die PBX1(-/-)-Zellen im Vergleich
zu den WT-Zellen mehr mesodermale Marker und weniger endodermale Marker
exprimierten. Während der zellulären Differenzierung traten bei WNT1, FGF15, IGF1, IGF2,
IGF1R, IGF2R und Colipase besonders große Unterschiede im Vergleich der
Genexpressionsmuster von PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen auf.
Die Ergebnisse unserer Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass PBX1(-/-)-Zellen
während der zellulären Differenzierung neuroektodermal und mesodermal differenzieren,
während der endodermale Differenzierungsweg supprimiert wird. Die neuronale
Differenzierung der PBX1-K.O.-Zellen in vitro erlaubt auch Rückschlüsse auf potentielle
Zielgene von PBX1. So könnten die zwischen PBX1-K.O.-Zellen und WT-Zellen differenziell
exprimierten Gene (insbesondere WNT1, FGF15, IGFs und ihre Rezeptoren, sowie
Colipase) als Zielgene von PBX1 eine Rolle spielen.
Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass eine Kombination des neuronalen in-vitro-
Differenzierungssytems mit einem Knock-out-System möglich ist. Das hier beschriebene
Verfahren könnte zukünftig sowohl auf andere Differenzierungswege, als auch auf andere
ES-Zellen mit anderen K.O.s übertragen werden und so die Funktionsanalyse verschiedener
ausgeschalteter Gene auf zellulärer Ebene in spezifischen
Differenzierungszusammenhängen ermöglichen.
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Anhang 113
8 Anhang
8.1 Herstellung der Embryonalen Stammzellen mit einem PBX1-Knock-out
8.1.1 Konstrukt des Vektors
Der Vektor zur Herstellung eines K.O.-Allels wurde von Dr. Jürgen Scheele
hergestellt. Es handelt sich um ein Konstrukt, das auf dem pFLOX Vektor
basiert, ein sequenzspezifisches Cre/lox P Rekombinationssystem aus dem
Bakteriophagen P1 (Austin et al., 1981). Das zu untersuchende PBX1-Gen
wurde in ES-Zellen von loxP Sequenzen flankiert.
Die gewünschte Zielsequenz wurde zwischen den Basenpaaren 1192 und 1356
der PBX1a mRNA-Sequenz lokalisiert. Diese Region kodiert den C –terminalen
Teil der PBX1-Homöodomäne, die die Helices α-3, 3-10 und α-4 einschließt,
welche für die PBX1 Interaktion mit HOX-Proteinen und DNA verantwortlich
sind (Abb. 8-1).
Abb. 8-1: Die Zielsequenz für die funktionale Elimination des PBX1-Gens. (Piper et al., 1999)
Anhang 114
Die Integration von drei loxP Sequenzen ermöglichte die Entfernung der
Selektionskassette durch die transiente Expression der Cre-Rekombinase in
den ES.
8.1.2 Homologe Rekombination
M. Kolanczyk führte in unserer Arbeitsgruppe die Herstellung des Einzel-Allel-
Knock-outs (PBX1(+/-)) als auch die Herstellung des totalen Knock-outs
(PBX1(-/-)) durch.
Erste homologe Rekombination Das Konstrukt (Abb. 8-2 A) wurde in die E14-ES-Zelllinie elektroporiert. Es
erfolgte eine positive Selektion durch die Gabe von G418. Die homologen
Rekombinanten konnten durch Southern Blot Analyse nach Hind III Verdau
identifiziert werden Es wurde ein Shift von 8 zu 16 kb nach dieser ersten
homolgen Rekombination des 1. Allels gefunden (Abb. 8-3 A). Die Häufigkeit
der homologen Rekombination betrug 1-10%. 500 Kolonien wurden analysiert.
Die Ergebnisse des Southern Blots wurden durch Long-Range-PCR an der
5´Region (8kb) und Standard-PCR an der 3`Region (2kb) des Vektors bestätigt
(Abb. 8-3 B). Ein Primer wurde immer außerhalb des Vektors angesetzt.
Nach Selektion und Expansion dieser Klone wurde die CRE Rekombinase
eingesetzt. 20 µg des Expressionsvektors für die CRE Rekombinase wurde für
die Transfektion des Klons E9 verwendet. Eine große Verdünnung von
elektroporierten Zellen erlaubte eine Selektion von Einzelzellkolonien. 500
Zellkolonien wurden durch Southern Blot analysiert. Die Bande lag bei 11 kb, da
die Selektionskassette und Zielsequenz fehlten (Abb. 8-3 C). Auf diese Weise
wurde der Klon G5 selektioniert. Dieser Klon hat durch die Behandlung mit dem
CRE-Enzym sowohl die beiden Selektionskassetten als auch die Zielsequenz
verloren (non conditional knock-out clone) (Abb. 8-2 B). G 5 wurde expandiert
und für eine homologe Rekombination mit dem 2. Allel vorbereitet.
Zweite homologe Rekombination Diesmal wurde eine modifizierte Variante des pFlOX Vektors verwendet, wobei
die Zielsequenz zwischen den Lox Schnittstellen durch Bam H1 Verdau und
anschließender Re-Ligation herausgeschnitten wurden (Abb. 8-2 C). Ein auf
dieser Weise verkleinerter Vektor führt nach Integration zu einer Verzerrung des
Locus, so dass eine folgende Runde von CRE Rekombination nicht notwendig
Anhang 115
war. 500 Klone wurden mit Southern Blot analysiert. Diesmal wurde ein Shift
von 8 kb auf 15 kb erhalten, da dem modifizierten Vektor die PBX1-Zielsequenz
fehlt und das Konstrukt nur über die flankierenden genomischen Sequenzen
verfügt. Zur gleichen Zeit kann das erste modifizierte Allel an der 11 kb Bande
erkannt werden, so dass den Klonen anhand der Banden in Abb. 8-3 C der
Genotyp zugeordnet werden kann. Auf diese Weise wurden sowohl ES-Zellen
mit einem Einzel-Allel-Knock-out (G5) als auch ES-Zellen mit einem Doppel-
Allel-Knock-out (H7, C10, H5) erzeugt, die für in-vitro-Experimente genutzt
werden konnten.
Abb. 8-2: Strategie der homologen Rekombination. A: PBX1-Konstrukt, das auf dem pFlOX Vektor basiert. „target ex 6“ = PBX1-Zielsequenz ist von loxP-Sequenzen flankiert. B: PBX1-Konstrukt nach CRE-Rekombinase Behandlung. Beide Selektionskassetten und die Zielsequenz fehlen. C: PBX1-Konstrukt nach Bam H1-Verdau: dadurch wurde die Zielsequenz eliminiert.
Anhang 116
Abb. 8-3: Strategie des Nachweises der homologen Rekombination A: Southern Blot Analyse nach Hind III-Verdau: Shift von 8 zu 16 kb in clone 1,2 und 3 nach 1. homologer Rekombination. B: RT-PCR Ergebnisse nach 1.homologer Rekombination. Long-Range-PCR an der 5`Region (8kb) und Standard-PCR an der 3`Region (2kb). C: Southern Blot Analyse nach HindII-Verdau nach 2. homologer Rekombination: Anhand der Bden konnte den Klonen der Genotyp zugordnet werden.
Abkürzungen 117
9 Abkürzungen
A Ab Antibody
Abb. Abbildung
Amp Ampicillin
AS Aminosäure
B bp Basenpaar
BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
bzw. beziehungsweise
C cDNA komplemtentäre Desoxyribonukleinsäure
Cre cyclization recombination
D d Tag
dATP Desoxy-Adenosintriphosphat
dCTP Desoxy-Cytosintriphosphat
dGTP Desoxy-Guanosintriphosphat
dH2O deionisiertes H2O
DMEM Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNS Desoxyribonukleinsäure
dNTP 2’-Desoxynukleosid-5’-triphosphat
dTTP Desoxy-Thymidintriphosphat
E E. coli Escherichia coli
E Embryonaltag
EB embroid body (Embryoidkörperchen)
EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure
ES-Zellen embryonale Stammzellen
et al. et alii (lat.: und andere)
F FBS Fötales Rinderserum
Abkürzungen 118
FITC fluorecein isothiocyanate
FSC forward scatter
G GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
I i.d.R. in der Regel
IPTG Isopropyl-b-D-thiogalaktosid
K K.O. Knock-out
kb kilobase
L LB Luria-Bertani
LIF Leukämie-inhibierender Faktor
loxP locus of cross-over of P1
N nt Nukleotid
P p.c. post coitum
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PI Propidium Iodid
R ATRA all- trans retinoic acid (Retinsäure)
RNS Ribonukleinsäure
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
S SDS Natriumdodecylsulfat
sec Sekunde(n)
ssDNA (salmon sperm DNA) = Lachssperma-DNS
SSC side scatter
T TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TE Tris-EDTA-Puffer
Abkürzungen 119
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamin
Tris a,a,a,-Tris-(hydroxymethyl)-methylamin
U U Unit, Einheit
u.a. unter anderem
UV Ultraviolett
V Vol. Volumen
W Wildtyp Wildtyp
X X-Gal 5-Brom-4
Die chemischen Elemente wurden mit den üblichen Symbolen abgekürzt.
Verwendete Vorsilben für Potenzen der Zahl 10: p = Piko (10-12), n = Nano
(1x10-9), µ = Mikro (1x10-6), m = Mikro (1x10-3), k = Kilo (1x103), M = Mega
(1x106). Zeitbegriffe: d = Tag, min = Minute, sec = Sekunde.
Bei einigen Begriffen wurden die englischen Fachtermini verwendet wie Blot,
Knock-out usw., da auch in der deutschsprachigen Fachliteratur eine
Übersetzung dieser Begriffe unüblich und unzureichend ist.
Danksagung 120
10 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. med. Roland Mertelsmann, ärztlicher Direktor,
Abteilung Innere Medizin I, Hämatologie/Onkologie, für die Betreuung dieses Projektes
und für die vielen anspornenden Diskussionen und auch für die nette und lehrreiche
Integration von Studierenden in die Klinik.
Dr. med. Jürgen Scheele, dem Leiter unserer Arbeitsgruppe, danke ich für die
interessante Themenstellung, vielen Diskussionen und seine freundliche
Unterstützung.
Ohne Mateusz Kolanzcyk, biologischer Doktorand in unserer Arbeitsgruppe, wäre die
Arbeit in dieser Form sicherlich nicht entstanden. Ich danke für die Einführung in die
Methodik. Er war jederzeit mit Rat und Tat zur Stelle und sorgte mit seiner
ausgeglichenen, freundschaftlichen Art dafür, dass das Arbeiten Spaß gemacht hat.
Mateusz Kolanzcyk, meinem „personal supervisor“ gilt besonderer Dank.
Allen Mitgliedern der AG Scheele, AG Otto, AG Lübbert und AG Trepel danke ich für
die kollegiale Zusammenarbeit und Hilfsbereitschaft, die die angenehme
Arbeitsatmosphäre im Labor wesentlich geprägt haben.
Dr. Martin Trepel danke ich besonders für die Durchsicht dieses Manuskriptes.
Michael Behrens danke ich für seine kompetente und jederzeit verfügbare Beratung in
EDV Fragen.
Ich danke Prof. Dr. med. Stefan Burdach, Direktor der Universitätsklinik und Poliklinik
für Kinder- und Jugendmedizin, und Uwe Hattenhorst, biologischer Doktorand, von der
Martin-Luther-Universität Halle-Witteberg für die Möglichkeit, Genexpressionsanalysen
mit Mikroarrays in Halle durchführen zu können. Wir hatten freundlicherweise die
Möglichkeit, die Methode der Mikroarray-Analyse selbst zu erlernen und diese Methode
dabei an unseren Proben anzuwenden.
Ich möchte mich auch bei allen Freunden und Bekannten bedanken, die zum Gelingen
dieser Arbeit beigetragen haben.
Ich danke Michael und meiner Familie, insbesondere meinen Eltern, – für alles.
Veröffentlichungen 121
11 Veröffentlichungen
11.1 Abstracta
Scheele, J.S., Juergens, A., Sykes, D, Kamps, M.P. and Kolanczyk, M.
In-Vitro Differentiation of Homozygous Pbx1 Knock-out ES Cells Reveals a Role of
Pbx1 in Transcriptional Regulation of Genes Potentially Relevant for Brain
Development.
Blood 98, A 4372, 2001.
Juergens, A., Kolanczyk, M. and Scheele, J.S.
In-vitro differentiation of homozygous pbx1-knock-out ES cells: a system to identify and
study potential target genes of the pbx1-homeoboxprotein during cellular differentiation.
Onkologie 25, Suppl 4, A 492, 2002.
Scheele, J.S., Juergens, A., Zemojtel, T., Sykes, D, Kamps, M.P. and Kolanczyk, M.
Identification of IGF2 as a potential target gene of the pbx1-homeobox protein by in-
vitro differentiation of homozygous pbx1 knock-out ES cells.
Blood 100, A 2118, 2002.
11.2 Tagungsbeiträge
Anne S. Jürgens, Mateusz K. Kolanczyk and Jürgen S. Scheele
„In-Vitro Differentation of Homozygous PBX1 Knock-out ES Cells: A Potential System
to Study Structure Function Relationship to the PBX1-Homeoboxprotein in Cellular
Differentiation.”
Vortrag, 9th EuCC Meeting Clinical and Experimental Oncology, Basel, Friday, June 7th
2002
Jürgens A.S., Kolanczyk M.K., Scheele J.S., Freiburg
„In-Vitro Differenzierung von homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen Stammzellen:
Ein System zur Identifikation und zum Studium potentieller Zielgene des Pbx1 -
Homeoboxproteins während der zellulären Differenzierung.“
Vortrag in der Sitzung „Best Abstracts“, Gemeinsame Jahrestagung der Deutschen und
Österreichischen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie, München, 27.-30.
Oktober 2002
Veröffentlichungen 122
Jürgen S. Scheele, Anne S. Jürgens ,Tomasz C. Zemojtel, *David B. Sykes, *Mark P.
Kamps and Mateusz K. Kolanczyk
„Identification of IGF2 as a Potential Target Gene of the Pbx1- Homeobox Protein by
In-Vitro Differentiation of Homozygous Pbx1 Knock-out ES Cells.”
Poster bei “The American Society of Hematology 44th Annual Meeting”, Philadelphia,
Pennsylvania, December 6-10, 2002
11.3 Seminarvorträge
Anne S. Jürgens
„Funktionelle Genomik von PBX1 in der neuronalen Differenzierung.“
Seminarvortrag im Rahmen der „Wissenschaftlichen Kolloquium des Universitäts-
klinikums für Kinder- und Jugendmedizin." an der Martin-Luther-Universität in Halle-
Wittenberg, 21.11.2001
Anne S. Jürgens
„In-Vitro Differenzierung von murinen homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen
Stammzellen: Ein System zur Identifikation und zum Studium potentieller Zielgene des
Pbx1-Homeoboxproteins waehrend der zellulaeren Differenzierung."
Seminarvortrag am Deutschen Diabetes-Forschungsinstitut, Düsseldorf, 16.12.2002
Lebenslauf 123
12 Lebenslauf
Persönliche Daten: Name: Anne Siobhain JÜRGENS Adresse: Christophstr. 21 40225 Düsseldorf Telefon: 0211 3160870
e-mail: [email protected] Geburtsdatum: 08.07.1977 Geburtsort: Neuss Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: Deutsch
Schulbildung: 1984 - 1988 Grundschule, Düsseldorf 1988 - 1991 Görres-Gymnasium, Düsseldorf 1991- 1997 Gymnasium Paulinum, Münster 1994 Auslandsaufenthalt: St. Leonard’s Mayfield School,
East Sussex 1997 Abitur
Leistungsfächer: Biologie, Englisch, Mathematik and Geographie
Studium: seit 10/1997 Albert-Ludwigs-Universtät Freiburg
Physikum: September 1999 1.Staatsexamen: September 2000 2.Staatsexamen: September 2003 3.Staatsexamen: November 2004
Beruf: seit 01/2005 Assistenzärztin für Humangenetik, Uniklinikum Düsseldorf Tätigkeiten:
07-08/1997 Pflegepraktikum in Royal Victoria Infirmary in Newcastle/England 03/2000 Famulatur in Flinders University in Adelaide / Australien (Radiologie) 09/2001 Famulatur im Diakoniekrankenhaus in Freiburg (Innere Medizin) 09/2002 Famulatur im St. Vincent Hospital in Indianapolis / USA (Neurologie) 2002 POL – Gruppenleiterin für 2.Semester Studenten
Freiburg, den 07.06.2005 Anne Jürgens