Aus dem Physiologischen Institutder Tierärztlichen Hochschule Hannover
Simultane Registrierung neuronaler Aktivitätim enterischen Nervensystem des Dickdarms von
Maus, Meerschweinchen sowie des Menschen mit Hilfeder Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT)
I N A U G U R A L-D I S S E R T A T I O Nzur Erlangung des Grades einer
D O C T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt vonSaskia Elisabeth Christiane Peters
aus Siegburg
Hannover 2001
Angefertigt im Rahmen des Aufbaustudiumsan der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Gefördert durch die Studienstiftung des deutschen Volkesund die Deutsche Forschungsgemeinschaft
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. M. Schemann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. M. Schemann2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. A. Tipold
Tag der mündlichen Prüfung: 26. November 2001
Gefördert durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes währendder Dauer der Dissertation.
Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des SFB 280‚Gastrointestinale Barriere‘, Teilprojekt A10.
...HOMINES ENIM SUNT HAC LEGE GENERATI, QUI TUERENTURILLUM GLOBUM, QUEM IN HOC TEMPLO MEDIUM VIDES, QUAE TERRADICITUR, HISQUE ANIMUS DATUS EST EX ILLIS SEMPITERNIS IGNIBUS,QUAE SIDERA ET STELLAS VOCATIS, QUAE GLOBOSAE ET ROTUNDAE,DIVINIS ANIMATAE MENTIBUS, CIRCOS SUOS ORBESQUE CONFICIUNTCELERITATE MIRABILI. ...[CIC., REP 6, 15: SOMNIUM SCIPIONIS]
(...Denn die Menschen sind unter dem Gesetz geschaffen, daß sie jenenErde genannten Ball, den Du in der Mitte dieses Tempels siehst, schützensollen und es ist ihnen der Geist aus jenen ewigen Feuern gespendet, die ihrHimmelsbilder und Sterne nennt, die, rund zusammengeballt, mit göttlichemGeist beseelt, ihre Kreise und runden Bahnen mit wunderbarer Schnelligkeitdurchlaufen. ...)
Meinen Elternzur Freude und als Dank
Ergebnisse dieser Arbeit sind bereits vorab veröffentlicht worden:
Originalarbeiten
NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recording of excitability in the enteric nervous system.Neurogastroenterol. Motil. 11 (5), 393-402.
Vortragsabstracts und Kongressberichte
NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Optical recording of excitability in the enteric nervous system.Gastroenterology, 116, A1050.
NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recording of excitability in the enteric nervous system.In: Falk Symposium No. 112, Freiburg, 21. – 22. Juni 1999.
NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recording of excitability in the enteric nervous system.In: Fifth IBRO World Congress of Neuroscience, Jerusalem 11. – 15. July 1999.
PETERS, S., M. NEUNLIST, u. M. SCHEMANN (1999):Multisite optical recordings of excitability in the enteric nervous system of rodents andhuman.Neurogastroenterol. Motil. 11 (5), 280.
SCHEMANN, M., S. PETERS, u. K. KAMM (2000):Optical recording from enteric neurones using voltage sensitive dyes.Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical, 82, 4.
SCHEMANN, M., S. PETERS, u. S. BISCHOFF (2000):Optical recordings of excitability in the human enteric nervous system.Pflügers Arch., 439, R338.
SCHEMANN, M. (2000):Optical recording from enteric neurones using voltage-sensitive dyes.ISAN, International Society of Autonomic neuroscience, London 17.-21. July 2000.
PETERS, S., M. NEUNLIST, S.C. BISCHOFF, M. SCHEMANN (2000):Optical recordings of excitability in the human enteric nervous system.Gastroenterology, 118, A185.
SCHEMANN, M. (2001):Transmission in the Human Enteric Nervous SystemBrain-Gut 2001, Oxford 11. – 15. July 2001
Buchkapitel:
NEUNLIST, M., S. PETERS, u. M. SCHEMANN (2000):Simultaneous multisite optical recording of excitability in the enteric nervous systemusing voltage sensitive dye.In: H.-J. Krammer u. M.V. Singer (Eds.): Neurogastroenterology - From the Basics to theClinics.Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, S. 163-174.
INHALTSVERZEICHNIS
Verzeichnis der Abkürzungen............................................................................... I
Glossar ausgewählter Begriffe...............................................................................III
1 EINLEITUNG....................................................................................................17
2 GRUNDLAGEN................................................................................................ 202.1 Das enterische Nervensystem........................................................................... 20
2.1.1 Einführung................................................................................................202.1.2 Bau und Struktur...................................................................................... 212.1.3 Aufgabe und Funktion..............................................................................222.1.4 Neurotransmitter.......................................................................................232.1.5 Neuro-neuronale synaptische Aktivität und elektrisches Verhalten........ 272.1.6 Techniken und Methoden zur Untersuchung des ENS............................ 34
2.2 Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT)........................................ 352.2.1 Einführung................................................................................................352.2.2 Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe...............................................36
2.2.2.1 Bedeutung und Anwendung..............................................................362.2.2.2 Potentialsensitive Styrylfarbstoffe: Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS sowie Di-8-ANEPPQ............................................... 372.2.2.3 Mechanismus der Spannungssensitivität...........................................40
2.2.3 Meßtechnologie zur Detektion optischer Änderungen.............................41
3 UNTERSUCHUNGSGUT UND METHODIK...............................................423.1 Untersuchtes Darmgewebe............................................................................... 42
3.1.1 Maus und Meerschweinchen.................................................................... 423.1.2 Darmgewebe des Menschen.....................................................................43
3.2 Präparation........................................................................................................453.2.1 Darmgewebe von Maus und Meerschweinchen.......................................453.2.2 Humangewebe.......................................................................................... 46
3.3 Montage in die Versuchskammer..................................................................... 473.4 Apparatur der Fluoreszenzmeßtechnik und Versuchsaufbau der Fluoreszenzmessung.........................................................................................49
3.4.1 Lichtquelle, elektronischer Verschluß, Mikroskop, Filterblock und Objektive........................................................................................... 493.4.2 Glasfasergekoppeltes Photodioden-Array................................................523.4.3 Verstärker, Multiplexer und AD-Wandler............................................... 533.4.4 Hardware zur Datenerfassung, Datensicherung und Software NeuroPlexTM..............................................................................553.4.5 Schwarzweißkamera, Videobild...............................................................56
3.5 Ortsauflösung und Zeitauflösung..................................................................... 563.6 Protokoll des Meßzyklus.................................................................................. 603.7 Positionsstabilität und Gewebeimmobilisation................................................ 603.8 Einfluß verschiedener Faktoren auf das Signal-Rausch-Verhältnis................. 613.9 Anfärbung enterischer Neurone mit Fluoreszenzfarbstoffen........................... 63
3.9.1 Anwendung potentiometrischer Farbstoffe.............................................. 633.9.1.1 Phototoxizität.................................................................................... 633.9.1.2 Ausbleichen.......................................................................................643.9.1.3 Spannungssensitivität........................................................................65
3.9.2 Vorversuche..............................................................................................653.9.2.1 Protokoll zur enzymatischen Vorbehandlung und Färbung mit Di-8-ANEPPS in Anlehnung an OBAID et al. (1992)..................... 663.9.2.2 Variation des Protokolls zur enzymatischen Vorbehandlung........... 663.9.2.3 Färbeprotokoll mit extrazellulärer Applikation von Di-8-ANEPPS an frisch präpariertem Gewebe......................................................... 663.9.2.4 Einsatz von Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ bei Maus und Meerschweinchen..............................................................................68
3.9.3 Hauptversuche.......................................................................................... 683.9.3.1 Ansetzen des Farbstoffes Di-8-ANEPPS.......................................... 683.9.3.2 Färbung des enterischen Nervensystems.......................................... 69
3.10 Stimulation enterischer Neurone.................................................................... 703.11 Neuropharmakologische Untersuchung......................................................... 723.12 Datenanalyse, Auswertung der optischen Signale und Statistik.....................733.13 Signal-Raum-Zeitstruktur-Analyse............................................................... 753.14 Immunhistochemie......................................................................................... 78
3.14.1 Präinkubation..........................................................................................783.14.2 Primäre Antikörper.................................................................................793.14.3 Sekundäre Antikörper.............................................................................803.14.4 Immunfluoreszenzmikroskop und Auswertung..................................... 81
4 ERGEBNISSE....................................................................................................834.1 MSORT: Etablierung der Färbemethode und Vorversuche............................. 83
4.1.1 Enzymatisch vorbehandeltes Gewebe...................................................... 834.1.2 Frisch präpariertes Gewebe...................................................................... 84
4.1.2.1 ‚Systemische‘ Färbung......................................................................844.1.2.2 ‚Lokale‘ Färbung...............................................................................85
4.1.3 Tauglichkeit der angewendeten Färbemethoden für frisches Gewebe.....864.1.3.1 Vor- und Nachteile der ‚systemischen‘ Färbung.............................. 864.1.3.2 Vor- und Nachteile der ‚lokalen‘ Färbung........................................ 87
4.1.4 Färbecharakteristik und Eignung von Di-8-ANEPPS sowie seiner Derivate Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ........................................... 87
4.1.4.1 Humangewebe...................................................................................884.1.4.2 Gewebe der Maus..............................................................................894.1.4.3 Gewebe des Meerschweinchens........................................................92
4.2 Validierung optischer Signale neuronaler Herkunft.........................................934.2.1 Chemische Stimulation.............................................................................934.2.2 Elektrische Stimulation............................................................................ 97
4.2.2.1 Interganglionäre Nervenstränge........................................................ 974.2.2.2 Überschwellige und unterschwellige schnelle erregende postsynaptische Potentiale (f EPSP) sowie Nervenfaserpotentiale...98
4.2.2.3 Langsame erregende postsynaptische Potentiale (s EPSP)...............1024.2.3 Immunhistochemie................................................................................... 103
4.3 MSORT: Hauptversuche.................................................................................. 1054.3.1 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität am Darmnervensystem des Menschen........................................................................................... 105
4.3.1.1 Vorkommen von schnellen erregenden postsynaptischen Potentialen (f EPSP) nach Stimulation interganglionärer Nervenstränge........... 1054.3.1.2 Untersuchung auf das Vorkommen von langsamen erregenden postsynaptischen Potentialen (s EPSP)............................................. 1144.3.1.3 Vorkommen von nicht experimentell induzierter Aktivität („Spontanaktivität“) und Eigenschaften dieser Nervenzellen...........1174.3.1.4 Vorkommen einer andauernden Stimulus-induzierten Aktivitätsentladung, „late onset spike discharge“............................ 1264.3.1.5 Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien nach oraler bzw. analer Stimulation interganglionärer Nervenstränge........................ 1294.3.1.6 Aktivität von interganglionären Nervensträngen.............................. 1334.3.1.7 S/N-Verhältnis, relative Änderung der Fluoreszenz, durchschnitt- liche Belichtungszeit und Reproduzierbarkeit................................. 133
4.3.2 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität im Plexus submucosus der Maus................................................................................................... 135
4.3.2.1. Reproduzierbarkeit und S/N-Verhältnis............................................138
5 DISKUSSION.....................................................................................................1405.1 Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ im enterischen Nervensystem........................................ 1415.2 Vorteile und Limitationen der MSORT............................................................1455.3 Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen am Humandarm.............. 1505.4 Ausblick sowie möglicher Einsatz der optischen Methode am ENS............... 159
6 ZUSAMMENFASSUNG...................................................................................161
SUMMARY........................................................................................................164
7 LITERATURVERZEICHNIS......................................................................... 167
8 ANHANG...........................................................................................................1958.1 Spezifikationen der Meßapparatur....................................................................1958.2 Protokolle und Lösungen für die Vitalerhaltung der Gewebe..........................1978.3 Protokolle und Lösungen für die Multi-Site Optical Recording Technique.... 1988.4 Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologische Untersuchungen................................................................................................ 1998.5 Protokolle und Lösungen für die Immunhistochemie...................................... 2028.6 Tabellenanhang.................................................................................................203
DANKSAGUNG..................................................................................................... 205
I
Verzeichnis der Abkürzungen
AH “after-hyperpolarisation“, NachhyperpolarisationATP AdenosintriphosphatA/W Ampere/WattAC Wechselstrom, “Alternative Current“ACh AcetylcholinAD-Wandler Analog-Digital-WandlerAMCA 7-Amino-4-Methylcumarin-3-AcetatAMPA a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazolproprionic acidANEPPS Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinum-Propyl-SulfatANEPPQ Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinum-Propyl-Quaternatas. ascendensBNC “Bayonet Nut Connector“, Steckverbindung für KoaxialkabelCCD “Charge Coupled Device“ChAT Cholin-Acetyl-TransferaseCO2 KohlendioxidCy 2 CarbocyaninCy 3 CarboxymethylindocyaninCy 5 IndodicarbocyaninDAP “Data Acquisition Processor“dB Dezibeldes. descendensDMSO DimethylsulfoxidDNA DesoxyribonukleinsäureDTAF Dichlorotriazinyl AminofluorescinENS Enterisches NervensystemF Fluoreszenzf EPSP “fast excitatory postsynaptic potential“, schnelles erregendes
postsynaptisches PotentialGABA Gamma-Aminobuttersäure oder γ-AminobuttersäureGOhm Gigaohm5-HT 5-Hydroxytryptamin, SerotoninIDL “Interactive Data Language“, interaktive Programmiersprache
Verzeichnis der Abkürzungen II
IgG Immunglobulin GIPSP “inhibitory postsynaptic potential“, hemmendes postsynaptisches
PotentialkPa kiloPascalm männlichmAChR muskarinerger Acetylcholin-RezeptorM. MusculusMB MegabyteMSORT “Multi-Site Optical Recording Technique“MW “molecular weight“, MolekulargewichtN.A. numerische AperturnAChR nikotinerger Acetylcholin-Rezeptornm NanometerNPY Neuropeptid YNO StickoxidNSE Neuronenspezifische EnolaseO2 SauerstoffpA PicoamperePBS phosphatgepufferte KochsalzlösungpF PicofahrenheitPmy Plexus myentericusPsm Plexus submucosusRAM “Random Access Memory“, ArbeitsspeicherRMS “Root-Mean-Square“S synaptischs EPSP “slow excitatory postsynaptic potential“, langsames erregendes
postsynaptisches Potentialsig. sigmoideumSP Substanz Ptrans. transversumTTX TetrodotoxinVIP vasoaktives intestinales Polypeptidw weiblichZNS Zentralnervensystem
III
Glossar ausgewählter Begriffe
Aktionspotential Reizantwort einer Nervenzelle; Änderung der Ionenleitfähigkeit
und des Membranpotentials; es besteht aus einer
Depolarisations- und einer Repolarisationsphase
amphiphil Molekül mit einer lösungsmittelphilen und einer –phoben
Gruppe
Antagonist Pharmakon, das an einen Rezeptor bindet und dadurch
dessen Aktivierung verhindert
antidrom gegenläufig hier: Erregungsleitung entgegen der natürlichen
Leitungsrichtung
Axon Nervenzellfortsatz zwischen Nervenzellkörper (Soma) und
Synapsen, dient der Erregungsleitung vom Nervenzellkörper
zur Synapse
bipolar Nervenzelle mit einem Dendriten und einem Axon
cholinerg auf die Wirkung des Acetylcholins bezogen
Dendrit rezeptiver Fortsatz einer Nervenzelle, der Erregung zum
Zellkörper leitet
Depolarisation Abnahme des negativen Ruhemembranpotentials einer
Nervenzelle
Dunkelstrom Strom, der nach völligem Lichtabschluß in den Photozellen
fließt
extrinsisch äußerlich; hier: sympathische und parasympathische
Innervation
∆F/F Die relative Fluoreszenzänderung wird bei Darstellung der
Meßamplitude optischer Daten in Relation zur Hintergrund-
fluoreszenz dargestellt.
Zumeist erfolgt die Angabe in Prozent.
freie Radikale stark reaktionsfähige Atomgruppe mit einem ungepaarten
Elektron
Ganglion Anhäufung von Ganglienzellen, d. h. Nervenzellen
IV Glossar ausgewählter Begriffe
Hochpass Filter, der nur Schwingungen oberhalb einer gewünschten
Frequenz durchläßt (Gegensatz: Tiefpass)
hydrophil wasseranziehend
hydrophob wasserabstoßend
intrinsisch innerlich; hier: eigentliches Darmnervensystem
Manipulator Apparat zur präzisen Plazierung von feinen Instrumenten
multiaxonal Nervenzelle mit vielen Axonen
multidendritisch Nervenzelle mit vielen Dendriten
murin zur Maus gehörend
Neuron Nervenzelle mit ihren Fortsätzen (Dendriten und Axone);
Funktionseinheit des Nervensystems
Neurotransmitter chemische Überträgersubstanzen, die an den Synapsen einer
Nervenzelle ausgeschüttet werden und Erregungsimpulse
übertragen
nitrerg auf die Wirkung von Stickoxid bezogen
numerische Apertur Wert für die Auflösung eines Objektivs; abgekürzt N.A.
orthodrom Erregungsausbreitung, die der physiologischen
Leitungsrichtung entspricht
Photoisomerisierung durch Lichteinwirkung hervorgerufene Veränderung der
räumlichen Anordung bzw. Struktur eines Moleküls bei
unveränderter Summenformel
Quantenausbeute Verhältnis zwischen der Anzahl emittierter Elektronen und
einfallender Photonen
Rauschen Rauschen ist eine statistische Störung, die die Größe von
informationsübertragenden Signalen nach unten begrenzt.
Repolarisation Wiederherstellung des negativen Ruhemembranpotentials
nach der Depolarisation
Rippeleigenschaft Welligkeitsanteil; Verhältnis von Gleichstromanteil zu
Wechselstromanteil; für Netzgeräte Siebschaltung
V Glossar ausgewählter Begriffe
Synapse Axonendigung, an der auf einen Erregungsimpuls
(Aktionspotential) hin Neurotransmitter freigesetzt werden
Tiefpass Filter, der nur Schwingungen unterhalb einer gewünschten
Frequenz durchläßt, darüberliegende dagegen sperrt
Tracing Methode zur Markierung von bestimmten Populationen von
Nervenzellen oder neuronalen Strukturen mit
Fluoreszenzfarbstoffen
vagal den Nervus vagus betreffend
Zellsoma Körper einer Nervenzelle
17
1 Einleitung
Die neuronale Kontrolle gastrointestinaler Funktionen erfolgt weitgehend autonom
über ein darmeigenes Nervensystem. Dieses aus Millionen von Nervenzellen
bestehende enterische Nervensystem verfügt über ein breites Repertoire von
synaptischen Interaktionen. Kenntnisse über nervale Verschaltungen im enterischen
Nervensystem (ENS) gewinnen zunehmend an Bedeutung, da klinisch beobachtete
gastrointestinale Fehlfunktionen in Zusammenhang mit Störungen innerhalb des
ENS gebracht werden. Voraussetzung für das Verständnis physiologischer
Regulationsmechanismen auf neuronaler Ebene und deren Störungen unter
pathophysiologischen Bedingungen ist die Erfassung komplexer Verschaltungen
von mehreren Neuronen.
Auf Einzelzellebene sind verschiedene Nervenzellgruppen in
unterschiedlichen Regionen des Gastrointestinaltrakts identifiziert und
elektrophysiologisch sowie neurochemisch charakterisiert worden. Die Frage, wie
Nervenzellen im ENS miteinander kommunizieren und wie das komplexe Netz von
Neuronen seine Funktion ausführt, ist jedoch bisher nicht beantwortet. Unter diesem
Gesichtspunkt ist es von Interesse, eine seit einiger Zeit entwickelte optische
Meßtechnik zur Registrierung der Signalausbreitung mittels spannungssensitiver
Farbstoffe („Multi-Site Optical Recording Technique“, MSORT) am enterischen
Nervensystem anzuwenden, die es erlaubt, auf Einzelzellebene mehrere Neurone
gleichzeitig zu untersuchen. Am enzymatisch behandelten Dünndarm konnte 1992
prinzipiell die Anwendbarkeit dieser Methode am ENS des Meerschweinchens
gezeigt werden (OBAID et al. 1992). Bislang fehlen Untersuchungen über die
Anwendung am Dickdarm und am frischen, nicht enzymatisch behandelten Gewebe
des ENS. Im Hinblick auf speziesspezifische Unterschiede ist die Etablierung dieser
Technik auch an anderen Spezies erforderlich. Aufgrund der klinischen Relevanz
und einer hohen Prävalenz gastrointestinaler Funktionsstörungen besteht nicht nur
ein besonderes Interesse, das humane ENS selbst zu untersuchen. Die Etablierung
der optischen Technik auch am ENS der Maus, bietet die Möglichkeit, zukünftig
18 Einleitung
unter pathophysiologischen Gesichtspunkten vergleichende Untersuchungen an
„knock-out“-Tiermodellen zu ermöglichen.
Der eigenen Arbeit lagen folgende Zielsetzungen zugrunde:
1. Etablierung der „Multi-Site Optical Recording Technique“ am ENS des Kolon von
Maus und Meerschweinchen sowie des humanen Kolon und Rektum.
2. Neuropharmakologische Charakterisierung der optischen Signale und
Bestimmung des Potentials der optischen Methode sowie Kombination der
MSORT mit bisherigen immunhistochemischen Techniken zur Identifizierung
neuronaler Transmitter.
3. Anwendung der MSORT am ENS von Mensch und Maus, um mit Hilfe von
neuropharmakologischen Untersuchungen neuronale Erregungsmuster zu
identifizieren und beteiligte Neurotransmitter zu charakterisieren.
19
20
2 Grundlagen
2.1 Das enterische Nervensystem
2.1.1 Einführung
Seit über hundert Jahren ist die Existenz zweier Nervengeflechte im
Magen-Darm-Kanal bekannt. MEISSNER beschrieb 1857 einen zwischen Mukosa
und Zirkulärmuskulatur gelegenen Plexus. Einige Jahre später konnte
AUERBACH (1862) die Existenz eines weiteren Plexus, der sich zwischen Zirkulär-
und Longitudinalmuskulatur befindet, nachweisen. Bis Anfang des 20. Jahrhunderts
wurde dieses aus einer Vielzahl von Neuronen bestehende Netzwerk als ein
„diffuses parasympathisches Ganglion“ angesehen, von dem man annahm, daß es
allein durch Steuerung von extrinsischen präganglionären Nervenfasern
gastrointestinale Funktionen über postganglionäre Motoneurone aufrecht erhielt.
LANGLEY erkannte die Komplexität und Eigenständigkeit des Darmnervensystems
und prägte 1921 den Begriff des „enteric nervous system“ (ENS), um dieses
enterische Nervensystem vom sympathischen und parasympathischen
Nervensystem abzugrenzen. Heute gilt das ENS neben dem Sympathikus und
Parasympathikus als eigenständiges Nervensystem, welches mit schätzungsweise
bis zu hundert Millionen Nervenzellen wesentliche Aufgaben des
Gastrointestinaltraktes autonom reguliert und koordiniert. Es ist Gegenstand
zahlreicher Forschungen auf dem Gebiet der Neurogastroenterologie (WOOD et al.
1999). Da zunehmend eine Beteiligung des ENS auch bei gastrointestinalen
Dysfunktionen und Malfunktionen sowohl in der Tiermedizin als auch in der
Humanmedizin diskutiert wird, sind Kenntnisse über physiologische
Regulationsmechanismen innerhalb des enterischen Nervensystems immer mehr
von grundlegender Bedeutung sowie die Entwicklung und Etablierung neuer
Techniken zu seiner Erforschung.
Das enterische Nervensystem (ENS) 21
2.1.2 Bau und Struktur
Das enterische Nervensystem liegt in der Wand des Gastrointestinaltrakts und
erstreckt sich vom Ösophagus bis zum M. sphincter ani internus, dem inneren
Schließmuskel des Analkanals. Es besteht aus Nervenzellen, die in Ganglien
variierender Größe organisiert sind, und aus interganglionären Nervensträngen, in
denen Nervenzellfortsätze verlaufen. Über sie stehen die Nervenzellen miteinander
in Kontakt. Dieses neuronale Netz formt in erster Linie zwei Plexus, den luminalen,
inneren Plexus submucosus (MEISSNER 1857) und den äußeren, serosaseitigen
Plexus myentericus (AUERBACH 1864). Der Plexus submucosus, der in der
gleichnamigen Tela zwischen Mukosa und Zirkulärmuskulatur liegt, ist nur im Darm
prominent. In der Tunica muscularis befindet sich zwischen Zirkulär- und
Longitudinalmuskulatur der Plexus myentericus. Beim Menschen und bei großen
Säugetieren untergliedert sich der Plexus submucosus weiter in zwei bzw. drei
Abschnitte, in einen luminalen Meissner-Plexus und einen äußeren Plexus
Schabadasch (PEARSON 1994; SCHABADASCH 1930; SCHEUERMANN et al.
1987; STACH 1977). Beim Menschen existiert zwischen diesen beiden Plexus ein
dritter, intermediärer Plexus (DHATT u. BUCHAN 1994; HOYLE u. BURNSTOCK
1989; IBBA-MANNESCHI et al. 1995).
Mit einer Gesamtzahl von mehreren Millionen intrinsischer Neurone ist von
der Größenordnung her die Anzahl der Neurone im Gastrointestinaltrakt etwa mit
der des Rückenmarks vergleichbar (FURNESS u. COSTA 1980;
KARAOSMANOGLU et al. 1996). Demgegenüber steht mit einigen Tausend eine
vergleichsweise geringe Zahl extrinsischer sympathischer und parasympathischer
Fasern, die den Magen-Darm-Kanal innervieren und in ihrer Innervationsdichte stark
regionale Unterschiede aufweisen. Die strukturelle Verflechtung des ENS mit
Effektorsystemen, wie beispielsweise Muskulatur und Mukosa sowie die
Verknüpfung mit extrinsischen Fasern, deuten auf integrative Fähigkeiten dieses
Nervensystems hin.
22 Grundlagen
2.1.3 Aufgabe und Funktion
Eine der wichtigsten Aufgaben des enterischen Nervensystems und ein
wesentliches Merkmal des Magen-Darm-Kanals ist der oral-anal gerichtete
Transport der Nahrung. Verursacht wird der Weitertransport eines im Darm
befindlichen Bolus durch eine Kontraktion oral und Relaxation der Muskulatur anal
des Bolus. Dieser schon 1899 von BAYLISS und STARLING als „law of the
intestine“ beschriebene peristaltische Reflex kann sowohl durch mechanische
Reizung von Muskulatur und Mukosa als auch durch luminal verabreichte
chemische Stimuli ausgelöst werden (BAYLISS u. STARLING 1899; MAGNUS
1904). Die Tatsache, daß diese intestinale Propulsion selbst an isolierten
Darmsegmenten gerichtet erfolgt (LANGLEY u. MAGNUS 1905; LANGLEY 1921),
verdeutlicht die Fähigkeit des ENS zur autonomen Steuerung koordinierter
Mechanismen und überzeugte LANGLEY (1921) von der Eigenständigkeit des ENS.
Neben der Steuerung der Peristaltik wird das ENS heute auch für die
Kontrolle der Sekretion (DIENER u. RUMMEL 1990; GREENWOOD u. DAVISON
1987; KIRKEGAARD et al. 1984; NEUNLIST et al. 1998), der Mikrozirkulation der
Magen-Darm-Schleimhaut (NEILD et al. 1990; VANNER u. SURPRENANT 1996),
sowie für die Regulation des Ionentransportes (BIJLSMA et al. 1996; MEYER et al.
1997) und die Modulation von Immunreaktionen (FRIELING et al. 1994; WOOD
1991) verantwortlich gemacht. Dabei steuern nach bisherigem Kenntnisstand der
Plexus submucosus und der Plexus myentericus unterschiedliche Funktionen. So
werden dem luminalen Plexus submucosus überwiegend die Regulation
sekretorischer Funktionen, dem Plexus myentericus Steuerung der Motorik
zugeschrieben (TIMMERMANS et al. 1997). Extrinsische Nervenfasern des
Sympathikus und Parasympathikus üben mehr eine modulierende Funktion aus.
Aktuelle Konzepte betrachten das ENS als ein integratives System
bestehend aus drei verschiedenen Neuronentypen, die Schaltkreise zur adaptiven
Aktivitätsmodulation bilden: primär afferente Neuronen kodieren die Information
verschiedener chemischer und mechanischer Stimuli und leiten diese entweder
direkt oder über Interneurone an Motoneurone weiter, die die Effektorsysteme wie
Das enterische Nervensystem (ENS) 23
Muskulatur, Mukosa, Blutgefäße oder das Immunsystem innervieren (FURNESS
2000; WOOD 1994).
Diese komplexen Funktionsmechanismen prägten im anglo-amerikanischen
Raum den Begriff des „minibrain in gut“ oder „enteric minibrain“, ein kleines Gehirn
im Darm (WOOD 1991). In der Tat besitzt das enterische Nervensystem strukturell
und funktionell dem Gehirn ähnliche Charakteristika, die sich unter anderem auch in
einer breiten Anzahl verschiedener Neurotransmitter und Neuromodulatoren
darstellen und die die Grundlage für eine breite Palette informationsvermittelnder
hemmender und aktivierender neuronaler Mechanismen bilden. Einen großen
Vorteil für Studien neuronaler Netzwerke bietet das ENS verglichen mit dem
Zentralnervensystem (ZNS) durch seine verhältnismäßig überschaubare Zellzahl,
seine Nähe zu den Effektorsystemen und seine überwiegende Zweidimensionalität.
2.1.4 Neurotransmitter
Von etwa 25 verschiedenen Substanzen nimmt man heute an, daß sie im
Gastrointestinaltrakt als Neurotransmitter fungieren (MCCONALOGUE u.
FURNESS 1994).
Das lange Zeit in der Literatur postulierte und von ECCLES erstmals
vorgeschlagene Dale-Prinzip, das von der Ausschüttung eines einzigen
Überträgerstoffes an der Synapse einer Nervenzelle ausgeht (ECCLES 1986;
ECCLES et al. 1954), gilt mittlerweile als überholt. Heute geht man aufgrund von
neuropharmakologischen und immunhistochemischen Studien vielmehr von einer
‚plurichemischen Übertragung‘ aus (BURNSTOCK 1976; FURNESS et al. 1989).
Neben einem Hauptüberträgerstoff sind weitere Substanzen an der synaptischen
Übertragung beteiligt. Sogenannte Kotransmitter existieren neben dem
Haupttransmitter in einer Nervenzelle und besitzen eine ihm vergleichbare Wirkung.
Neuromodulatoren wird eine Beeinflussung der Intensität und Dauer der Wirkung
klassischer Überträgerstoffe zugeschrieben (WOOD 1982). Theoretisch sind
mehrere hundert Kombinationen kolokalisierter Neurotransmitter möglich. Allerdings
konnten bisher nur etwa 20-30 individuelle Gruppen im ENS nachgewiesen werden,
24 Grundlagen
die sich anhand ihres spezifischen neurochemischen Kodes einteilen lassen
(BORNSTEIN u. FURNESS 1992; COSTA et al. 1996; TIMMERMANS et al. 1997)
und die neben einer regionenspezifischen Variabilität stark speziesspezifische
Unterschiede aufweisen (MCCONALOGUE u. FURNESS 1994). Diese
Unterschiede könnten als Spezialisierung und Adaption des ENS für bestimmte
spezifische Funktionen interpretiert werden. Jedoch verdeutlicht diese Variabilität
auch, daß eine Übertragung gewonnener Daten auf andere Spezies oder andere
Regionen im Magen-Darm-Trakt nicht generell möglich ist. Die meisten Daten über
Transmitterkodierungen basieren bisher überwiegend auf Untersuchungen am
Magen und Darm des Meerschweinchens. Weit weniger Daten existieren
beispielsweise für die Maus, die in der gastrointestinalen Forschung durch die
Verfügbarkeit von „knock-out“-Tieren einen zunehmenden Stellenwert erlangt, oder
für den Menschen (WOOD 1994).
Ungefähr sieben von etwa 25 Neurotransmittern fungieren als
Hauptüberträger synaptischer Übertragung. Im folgenden werden Acetylcholin
(ACh), Substanz P sowie Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) exemplarisch
herausgegriffen.
Acetylcholin wurde über seine kontraktile Wirkung auf glatte Muskulatur als
erster exzitatorischer Transmitter im Magen-Darm-Kanal identifiziert (DALE u.
FELDBERG 1934; DIKSHIT 1938). Das für seine Synthese verantwortliche Enzym
ist die Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT), die immunhistochemisch in den Neuronen
nachgewiesen werden kann (SCHEMANN et al. 1993; STEELE et al. 1991). Im
Kolon des Menschen zeigen mehr als 50 % der Neurone im Plexus submucosus
Immunoreaktivität für ChAT (PORTER et al. 1996).
Neben dieser cholinergen exzitatorischen Komponente existieren weitere
erregende, nicht-cholinerge Neurotransmitter wie beispielsweise Substanz P.
Immunoreaktivität für dieses Neuropeptid wurde in Darmneuronen des Plexus
myenterius und Plexus submucosus verschiedener Spezies wie Hund, Schwein,
Meerschweinchen, Maus, Ratte und Mensch nachgewiesen (SANG u. YOUNG
1996; SUNDLER et al. 1989; TIMMERMANS et al. 1990; DANIEL et al. 1985;
KEAST et al. 1985). Beim Menschen konnten im distalen Kolon
Das enterische Nervensystem (ENS) 25
Substanz P-immunoreaktive Neurone nur im Plexus Schabadasch und im
intermediären Plexus gefunden werden, hingegen nicht im Meissner-Plexus
(CROWE et al. 1992). In der Taenia coli und im Dünndarm des Meerschweinchens
konnte in exzitatorischen Motoneuronen eine Kolokalisation von Acetylcholin und
Tachykininen, wie z. B. Substanz P, nachgewiesen werden (BROOKES et al. 1991;
FURNESS et al. 1992).
Das ebenfalls in enterischen Neuronen immunhistochemisch nachgewiesene
Vasoaktive Intestinale Polypeptid (VIP) wird der Hauptgruppe der inhibitorischen
Übertragungsmechanismen zugerechnet (FAHRENKRUG 1979), die nicht-cholinerg
und nicht-adrenerg vermittelt sind (BURNSTOCK et al. 1979; BURNSTOCK 1981).
VIP wird für die inhibitorische Wirkung auf glatte Muskulatur verantwortlich gemacht,
wobei gerade bei diesem Neuropeptid speziesspezifische und regionenspezifische
Unterschiede existieren, die es erschweren, die Rolle und Gewichtung von VIP als
hemmendem Neurotransmitter klar zu umreißen (MCCONALOGUE u. FURNESS
1994). Im distalen Kolon des Menschen konnten in allen drei Abschnitten des
Plexus submucosus VIP-erge Neurone immunhistochemisch identifiziert werden
(CROWE et al. 1992). Zusammen mit ACh erhöht VIP die Mukussekretion im
Magen-Darm-Kanal und ist Hauptüberträgerstoff in Sekretomotoneuronen (COOKE
1986; COOKE 2000). Bei synaptischen neuro-neuronalen
Übertragungsmechanismen induziert VIP exzitatorische Potentiale an den
Folgeneuronen (ZAFIROV et al. 1985).
Neben diesen drei Transmittern werden NPY, NO, ATP und Serotonin
ebenfalls zu den Haupttransmittern gerechnet.
Somit besitzt das ENS eine dem ZNS analoge Palette von erregenden und
hemmenden Mechanismen, die je nach Art der synaptischen Ausschüttung und
Vorkommen entsprechender Rezeptortypen nicht nur die interneuronale
Kommunikation definieren und depolarisierende oder hyperpolarisierende
Membranpotentiale induzieren, sondern auch die entsprechenden Effektorsysteme
aktivieren oder hemmen können. So konnte nachgewiesen werden, daß der
peristaltische Reflex durch oral projizierende erregende, cholinerge (Acetylcholin)
26 Grundlagen
Motoneurone und anal projizierende hemmende, nitrerge (Stickoxid) Motoneurone
vermittelt wird.
Vergleichbar mit dem ZNS können die Neurotransmitter des enterischen
Nervensystems anhand ihrer erregenden oder hemmenden Wirkung auf
postsynaptische Zielneurone klassifiziert werden. Tabelle 1 gibt einen Überblick
über wichtige Neurotransmitter und ihre synaptische Wirkung auf andere Neurone
im ENS wieder.
Tabelle 1: Wichtige Neurotransmitter des ENS und ihre synaptische Wirkung auf
postsynaptische Neurone (incl. identifizierter beteiligter Rezeptoren)
Exzitatorische Wirkung Inhibitorische Wirkung
f EPSP s EPSP PräsynaptischeHemmung IPSP
Acetylcholin [1]
nikotinergAcetylcholin [4]
M1, M2Acetylcholin [4]
M1, M2Acetylcholin [12]
ATP [2]
P2xVIP [5] Noradrenalin [9]
α 2Opioide [13]
δSerotonin [2]
5-HT3
Substanz P [6]
NK-1, NK-3NPY [10] Serotonin [14]
5-HT1a
Glutamat [3]
AMPAγ-Aminobuttersäure [7]
GABA ASerotonin [11]
5-HT1a
Noradrenalin [15]
α 2Serotonin [8]
5-HT1P
Galanin [16]
Somatostatin [17]
NPY [18,19]
Y1,Y2
[1] (NISHI u. NORTH 1973) [11] (PAN u. GALLIGAN 1994) [2] (GALLIGAN u. BERTRAND 1994) [12] (TOKIMASA et al. 1983) [3] (LIU et al. 1997) [13] (MIHARA u. NORTH 1986) [4] (NORTH et al. 1985b) [14] (WADE et al. 1994) [5] (ZAFIROV et al. 1985) [15] (NORTH u. SURPRENANT 1985) [6] (FRIELING et al. 1999) [16] (YAU et al. 1986) [7] (CHERUBINI u. NORTH 1984) [17] (MIHARA et al. 1987) [8] (MAWE et al. 1986) [18] (HIRAI et al. 1997) [9] (SHEN u. SURPRENANT 1990) [19] (CUNNINGHAM et al. 1994)[10] (SCHEMANN u. TAMURA 1992)
Das enterische Nervensystem (ENS) 27
2.1.5 Neuro-neuronale synaptische Aktivität und elektrischesVerhalten
Interneuronale Kommunikation über synaptische Übertragung kann im ENS
einerseits zwischen intrinsischen enterischen Neuronen erfolgen, andererseits kann
sie auch über extrinsische vagale und sympathische Neurone auf intrinsische
Neurone stattfinden (MCCONALOGUE u. FURNESS 1994).
Werden bei intrazellulären Ableitungen interganglionäre Nervenstränge
elektrisch stimuliert, können dabei abhängig von dem entsprechenden
Neurotransmitter und aktivierten Rezeptor am postsynaptischen Neuron zwei
Formen des synaptischen Input registriert werden:
- depolarisierende, exzitatorische postsynaptische Potentiale (EPSP) und
- hyperpolarisierende, inhibitorische postsynaptische Potentiale (IPSP).
Nach Art der synaptischen Ausschüttung können diese postsynaptischen Potentiale
jeweils in schnelle, nur einige Millisekunden dauernde (fast EPSP/ fast IPSP) und
langsame, mehrere Sekunden bis Minuten andauernde Antworten (slow EPSP/
slow IPSP) unterschieden werden. EPSP bleiben je nach Stärke und Grad der
Depolarisation entweder unterschwellig oder führen als überschwellige EPSP zur
Auslösung eines oder mehrerer Aktionspotentiale, die dann entlang der Axone in
orthodromer Richtung weitergeleitet werden. Nach Stimulation interganglionärer
Nervenfasern können Axone sowie Dendriten stimuliert werden, deren Potentiale
die dazugehörige Nervenzelle direkt aktivieren. Diese verlaufen hin zum Zellsoma
und können durch intrazelluläre Injektion hyperpolarisierender Strompulse
elektrophysiologisch von synaptischen Potentialen unterschieden werden. Der im
anglo-amerikanischen Raum verwendete Terminus des ‚process potential‘ umfaßt
die Ausbreitung des Aktionspotentials sowohl in den axonalen und dendritischen
Nervenzellfortsätzen als auch die elektrotonische Ausbreitung auf der
Somamembran.
Experimentell können s EPSP/ s IPSP durch elektrische Stimulation
interganglionärer Nervenstränge mit hochfrequenten Pulssalven, f EPSP/ f IPSP
durch Einzelpulse induziert werden. Die während intrazellulärer Ableitungen bei
f EPSP und s EPSP gemessenen Membranpotentialverläufe sind exemplarisch in
28 Grundlagen
A B
20 ms
20 mV10 mV*
*
führte. Das Artefakt der Stimulation (*) ist in der intrazellulären Ableitung vor Beginn des
synaptischen Potentials zu erkennen (nach WOOD 1994).
Abbildung 1 und 2 dargestellt. Im Darmtrakt nimmt bei f EPSP nach repetitiver
Stimulation (> 0,1 Hz) die Amplitude zunehmend ab. Dieses als „Rundown“
bezeichnete Phänomen beruht nicht auf postsynaptischen Änderungen, vielmehr
geht man von präsynaptischen Autoinhibitionsmechanismen aus (HIRST u.
MCKIRDY 1974; NORTH et al. 1985a), die zu einer Reduzierung der
Signalamplitude von f EPSP führen. Bei Stimulation interganglionärer Nerven-
stränge kann es durch Aktivierung mehrerer Synapsen außerdem zur räumlichen
Abbildung 1: Schnelle erregende
postsynaptische Potentiale (f EPSP)
eines S/Typ1- Neuron im Dünndarm
nach elektrischer Stimulation eines
interganglionären Nervenstrangs. In der
intrazellulären Ableitung ist der
Membranpotentialverlauf eines unter-
schwelligen f EPSP (A) und eines über-
schwelligen f EPSP (B) dargestellt, das
zur Auslösung eines Aktionspotentials
Depolarisation
Aktionspotentialentladung
1 s5 mV
Abbildung 2: Intrazelluläre
Ableitung eines langsamen
erregenden postsynaptischen
Potentials (s EPSP) eines
S/Typ1-Neuron im Dünn-
darm nach elektrischer
Stimulation eines intergang-
lionären Nervenstrangs mittels einer Pulssalve (Balken). Während des s EPSP entsteht
eine lang anhaltende Depolarisation, wobei es zu einer Entladung von mehreren
Aktionspotentialen kommt (nach SCHEMANN 1990).
Das enterische Nervensystem (ENS) 29
oder zeitlichen Addition der Einzelerregungen am postsynaptischen Neuron
kommen, die zu einer Erhöhung der Signalamplitude eines f EPSP führt und als
Summation bezeichnet wird.
Am jeweils aktivierten Neuron bewirken die ausgelösten s EPSP und f EPSP
eine unterschiedliche Dauer der Transmitterfreisetzung, worin eine unterschiedliche
funktionelle Bedeutung vermutet wird (WOOD 1994). Beispielsweise dauern die
beim peristaltischen Reflex auftretenden Muskelkontraktionen bzw. -relaxationen
einige Sekunden bis Minuten, ebenso wie sekretorische Mechanismen intestinaler
Krypten. Das entsprechende Korrelat auf neuronaler Ebene wird in s EPSP
vermutet, da sie am ehesten die Kriterien der kontinuierlichen
Transmitterfreisetzung an das nächste postsynaptische Neuron oder an ein
Effektorsystem erfüllen und an diesen eine kontinuierliche Inhibition oder Exzitation
bewirken können (WANG u. COOKE 1990; WOOD 1991). Innerhalb der
Reflexschaltkreise wird die funktionelle Bedeutung der f EPSP in der schnellen
Übertragung und Umwandlung neuronal kodierter Information gesehen. Gerade im
Zusammenhang mit Neuromodulation scheinen sie eine nicht unwesentliche Rolle
zu spielen, da abhängig vom Membranpotential des postsynaptischen Neuron
(hyper- oder depolarisiert) beim Eintreffen unterschwelliger EPSP die Erregung
entweder erlischt oder weitergeleitet wird. Die Rolle der inhibitorischen Potentiale
wird generell in der Beendigung auftretender Erregung gesehen. Durch den
hauptsächlich mehrere Sekunden andauernden membranhyperpolarisierenden
Mechanismus wird - als Gegensatz zum s EPSP - ein Zustand der geringen
Erregbarkeit erreicht bzw. wiederhergestellt. Ihre wichtige gegenregulatorische
Funktion wird beispielsweise bei sekretorischen Diarrhöen verdeutlicht: Die in ihrer
Aktivität gesteigerten Sekretomotoneurone werden durch Analoga-Gabe von
Opioiden, die als Transmitter für IPSP diskutiert werden, inhibiert (WOOD 1994).
Neuropharmakologisch werden an der synaptischen Übertragung beteiligte
Transmitter durch Einsatz spezifischer Agonisten oder Antagonisten und deren
Wirkung auf postsynaptische Neurone des ENS identifiziert (s. Tabelle 1).
Die meisten f EPSP werden wesentlich in ihrer Amplitude vermindert oder gar
vollständig unterdrückt, wenn nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Antagonisten
30 Grundlagen
(nAChR-Antagonisten) verwendet werden. Als Haupttransmitter für die schnelle,
erregende synaptische Übertragung wird daher Acetylcholin (ACh) angesehen, das
über nikotinerge Rezeptoren wirkt (HIRST et al. 1974; NISHI u. NORTH 1973).
Funktionell konnte gezeigt werden, daß der peristaltische Reflex durch
nAChR-Antagonisten wie z. B. Hexamethonium blockiert werden kann und damit
cholinerg vermittelt ist (FISHLOCK u. PARKES 1963; KOSTERLITZ u. LEES 1964).
Eine Beteiligung cholinerger oral und anal projizierender Interneurone bei der oralen
Kontraktion sowie bei der analen Relaxation wurde für den Menschen gezeigt
(GRIDER 1989). Bei der Pathophysiologie der Obstipation konnte eine Veränderung
cholinerger Mechanismen nachgewiesen werden (BURLEIGH 1988). Beim
Menschen existieren Hinweise, daß im Plexus myentericus f EPSP durch ACh über
nikotinerge Rezeptoren vermittelt werden (BROOKES et al. 1987). Beim
Meerschweinchen ist für den Plexus submucosus eine vollständige Inhibition aller
f EPSP durch die Verwendung von nAChR-Antagonisten beschrieben worden
(EVANS u. SURPRENANT 1992). Da aber im Plexus myentericus einige f EPSP
auch eine Hexamethonium-insensitive Komponente zeigen (GALLIGAN u.
BERTRAND 1994) und nur bei etwa 25 % eine vollständige Blockade mit
nAChR-Antagonisten erreicht wird (LEPARD u. GALLIGAN 1999; LEPARD et al.
1997), werden daher zwei Hauptgruppen von f EPSP definiert: eine nikotinerge und
eine gemischte Gruppe, letztere bestehend aus einer cholinergen,
Hexamethonium-sensitiven und einer nicht-cholinergen, Hexamethonium-
insensitiven Komponente (GALLIGAN et al. 2000; LEPARD et al. 1997).
Neben der cholinergen erregenden Komponente existieren im enterischen
Nervensystem des Meerschweinchens konkrete Hinweise, daß einige der
nicht-cholinergen erregenden f EPSP durch Serotonin und auch durch
Adenosintriphosphat (ATP) vermittelt werden (BURNSTOCK et al. 1970; EVANS et
al. 1992; GALLIGAN u. BERTRAND 1994; GALLIGAN 1999; LEPARD u.
GALLIGAN 1999; SPENCER et al. 2000). Daß dieses Mononucleotid nicht nur als
Energiespeicher und DNA-Baustein im Organismus fungiert, sondern auch als
Neurotransmitter, wurde in der von Burnstock aufgestellten „purinergic nerve
hypothesis“ formuliert (BURNSTOCK 1972; BURNSTOCK 1981). Diese purinerge
Das enterische Nervensystem (ENS) 31
Hypothese konnte mittlerweile durch mehrere Studien, die die Funktion von ATP an
neuromuskulären Synapsen als inhibitorischen Transmitter zeigen konnten,
untermauert werden. Auch beim Menschen existieren Hinweise für eine inhibitive
Wirkung und Beteiligung von ATP an der neuromuskulären Übertragung (XUE et al.
1999).
Weit weniger Daten liegen bisher für die ATP-Wirkung bei der
neuro-neuronalen Übertragung vor. Für das Meerschweinchen konnten im Plexus
myentericus f EPSP nachgewiesen werden, die über den
P2-Purinrezeptor-Antagonist Suramin zu blockieren waren und somit ATP-vermittelt
sind (GALLIGAN u. BERTRAND 1994; ZHOU u. GALLIGAN 1998; ZHOU u.
GALLIGAN 1996). ATP scheint im Plexus myentericus gerade bei anal
projizierenden, lokalen Verschaltungen ein potentiell nicht-cholinerger, erregender
Neurotransmitter zu sein (LEPARD u. GALLIGAN 1999; SPENCER et al. 2000).
Hinweise für das Vorhandensein von ATP im Plexus submucosus des Menschen
sind in der zugänglichen Literatur nicht zu finden. Für den Plexus myentericus
konnte in fetalem Humangewebe ATP indirekt mittels Quinacrin-Methode
nachgewiesen und hiermit histochemisch zumindest eine Kolokalisation von ATP
und Stickoxid-Synthase gezeigt werden (BELAI u. BURNSTOCK 2000).
Acetylcholin fungiert auch bei s EPSP als erregender Transmitter, wobei
diese Antworten Hexamethonium-insensitiv sind. Die ACh-Wirkung dieser
langsamen Potentiale wird über muskarinerge Rezeptoren vermittelt und ist durch
Atropin blockierbar. Substanz P depolarisiert exzitatorische enterische Neurone
(KATAYAMA et al. 1979) und führt im myenterischen Plexus zu einer vermehrten
ACh-Freisetzung (YAU u. YOUTHER 1982). Dabei scheint die Freisetzung von
Substanz P frequenzabhängig und prominent bei höheren Stimulusfrequenzen zu
sein (BARON et al. 1983). Eine Beteiligung von Substanz P bei s EPSP konnte
inzwischen durch den Einsatz spezifischer Antagonisten nachgewiesen werden
(NEUNLIST et al. 1999a). VIP, γ-Aminobuttersäure (GABA) sowie Serotonin werden
ebenfalls als Transmitter für die Generierung von s EPSP angesehen (s. Tabelle 1).
Wichtige Transmitter der inhibitorischen postsynaptischen Potentiale (IPSP)
sind in Tabelle 1 aufgelistet.
32 Grundlagen
Neben den postsynaptischen Mechanismen können im ENS ebenfalls
präsynaptische Mechanismen die Informationsvermittlung durch Hemmung oder
Verstärkung synaptischer Übertragung modulieren.
Bei der präsynaptischen Hemmung wird die axonale Transmitterfreisetzung
unterdrückt. Man unterscheidet zwischen der axo-axonalen Hemmung, bei der die
Transmitterausschüttung an einem Axon durch die eines zweiten Axons unterdrückt
wird, und der Autoinhibition, bei der die Transmitterfreisetzung durch präsynaptische
Rezeptoren am aktivierten Neuron im Sinne eines negativen
„feedback“-Mechanismus unterdrückt wird (WOOD 1994) und die über
präsynaptische, muskarinerge Acetylcholin-Rezeptoren (mAChR) vermittelt wird
(NORTH et al. 1985b). Die präsynaptische Hemmung tritt an Synapsen in
Erscheinung, die f EPSP, s EPSP und IPSP generieren, und ist für den
myenterischen und submukösen Plexus des Dick- und Dünndarms beschrieben
(DEMBOWSKI u. MAYER 1982; NORTH et al. 1985b; ORT et al. 1984). Neben
Acetylcholin existieren noch eine Reihe weiterer präsynaptisch hemmender
Transmitter, die in Tabelle 1 zu finden sind.
Eine Verstärkung der Transmitterfreisetzung über präsynaptische
Mechanismen ist im Plexus myentericus des Meerschweinchens für exzitatorische
Motoneurone beschrieben worden, die über nikotinerge Rezeptoren durch
Acetylcholin vermittelt wird (GALLIGAN 1999).
Das elektrische Verhalten wird ebenfalls zur Charakterisierung enterischer
Neurone herangezogen und nach intrazellulärer Stromapplikation anhand
elektrophysiologischer Merkmale klassifiziert (BORNSTEIN et al. 1994; HIRST et al.
1974; NISHI u. NORTH 1973; WOOD 1987). Demnach lassen sich basierend auf
Untersuchungen am Plexus myentericus des Meerschweinchenileum im Darmtrakt
mit Ausnahme des Magens - hier gilt ein anderes Schema - im wesentlichen zwei
Gruppen unterscheiden (nach WOOD): AH/Typ 2-Neurone und S/Typ 1-Neurone.
AH-Neurone zeigen infolge intrazellulärer Stromapplikation Aktionspotentiale
mit einer charakteristischen, mehrere Sekunden andauernden
After-Hyperpolarisation, einer über einen Calcium-sensitiven Kalium-Kanal
Das enterische Nervensystem (ENS) 33
gesteuerten Nachhyperpolarisation, die weitere Aktionspotentiale verhindert. Das
Aktionspotential der AH-Neurone, dessen halbmaximale Dauer etwa bei 2,3-2,5 ms
liegt (IYER et al. 1988; NEUNLIST et al. 1999a), wird über einen
spannungssensitiven Calcium-Kanal gesteuert und zeigt gegenüber dem
Natrium-Kanal-Blocker Tetrodotoxin (TTX) nur geringe Sensitivität. Einzelstimulation
interganglionärer Nervenfasern löst nur in sehr wenigen AH-Neuronen
12-20 Millisekunden andauernde f EPSP aus (TAMURA u. WOOD 1989). Nach
Stimulation mittels einer Pulssalve können bei AH-Neuronen gewöhnlich mehr als
10 Sekunden dauernde s EPSP induziert werden.
Im Gegensatz dazu erhalten S-Neurone synaptischen Input über f EPSP.
Auch sie generieren s EPSP. Das wesentlich kürzere Aktionspotential der
S-Neurone wird über einen spannungssensitiven Natrium-Kanal vermittelt und zeigt
nach intrazellulärer Depolarisation keine deutliche Nachhyperpolarisation. Es wird
durch den Natrium-Kanal-Blocker TTX vollständig blockiert.
Für den Plexus myentericus am distalen Kolon der Maus sind vergleichbare
Charakteristika auch hinsichtlich des Vorkommens von AH- und S-Neuronen
beschrieben (FURUKAWA et al. 1986). Am Plexus myentericus des distalen Kolon
des Menschen zeigt die intrazelluläre Ableitung jedoch Unterschiede (BROOKES et
al. 1987) hinsichtlich des Aussehens und der Verteilung von AH-Neuronen. In dieser
einzigen im Schrifttum vorhandenen Studie ist jedoch die untersuchte
Nervenzellzahl noch zu gering, um grundsätzliche Aussagen über
elektrophysiologische Charakteristika treffen zu können. Allerdings weisen
speziesspezifische Unterschiede auf die Problematik hin, Befunde am Tier auf den
Menschen zu extrapolieren.
Neben der experimentell ausgelösten Aktivität ist das Vorkommen von nicht
experimentell induzierter Aktivität, von Spontanaktivität beschrieben. Einzelne
spontane Aktionspotentiale sowie f EPSP treten häufig bei S-Neuronen, seltener bei
AH-Neuronen auf (FRIELING et al. 1991a; FRIELING et al. 1991b).
Elektrophysiologisch sind neben einzelnen Entladungen auch Salven von
Entladungen beschrieben, die auch nach Blockade synaptischer Übertragung
registriert werden können (WOOD 1994). Für den Menschen liegen nur sehr wenig
34 Grundlagen
Daten über das Vorkommen von Spontanaktivität vor. In der einzigen im Schrifttum
vorhandenen Untersuchung am Plexus myentericus konnten mittels intrazellulärer
Ableitung bei zwei Neuronen spontane f EPSP registriert werden (BROOKES et al.
1987). Die Autoren schließen aber als Ursache eine Schädigung der Zellen infolge
des Anstechens mit der Mikroelektrode nicht aus.
2.1.6 Techniken und Methoden zur Untersuchung des ENS
Die heutigen Erkenntnisse und Modellvorstellungen über funktionell
unterschiedliche Gruppen enterischer Neurone und über die Struktur und
Funktionsweise des ENS stützen sich grundlegend auf den kombinierten Einsatz
verschiedener histoanatomischer, elektrophysiologischer, neuropharmakologischer,
immunhistochemischer Techniken und Tracing-Studien sowie in vitro und in vivo
Registrierung der Aktivität der Effektoren.
Gerade die Etablierung intrazellulärer elektrophysiologischer Techniken
(HIRST et al. 1974; NISHI u. NORTH 1973) am ENS erbrachte Anfang der 80er
Jahre mit dem Einblick in das elektrische und synaptische Verhalten einzelner
Neurone entscheidende Fortschritte und bestätigte die bis dahin weitgehend
vermuteten komplexen neuronalen Funktionsmechanismen des ENS. Für Studien
komplexer Schaltkreise ist aber gerade das simultane Messen des synaptischen
Verhaltens mehrerer Neurone notwendig. Dies ist methodisch bisher nur in sehr
beschränktem Umfang möglich. KUNZE und Mitarbeitern gelang es, von zwei
interagierenden Neuronen - einem AH/Typ 2-Neuron und seinem entsprechenden
Folgeneuron - gleichzeitig abzuleiten (KUNZE et al. 1993). Damit konnte der
elektrophysiologische Nachweis geliefert werden, daß AH/Typ 2-Neurone in
Interneuronen und Motoneuronen s EPSP generieren. Dennoch ist die intrazelluläre
elektrophysiologische Methode für Studien neuronaler Netzwerke und für das
simultane Erfassen des synaptischen Verhaltens mehrerer Neurone aufgrund der
gegebenen Limitation auf sehr wenige Neurone nicht geeignet. Ein weiterer Nachteil
ist, daß gerade kleine Neurone aufgrund ihrer Größe nur äußerst selten mit
intrazellulären Elektroden angestochen werden und von ihnen nicht in
Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT) 35
ausreichendem Maß abgeleitet werden kann (FURNESS et al. 1988). Die
Anwendung einer optischen Meßmethode bietet das Potential, simultan mehrere
Neurone erfassen und untersuchen zu können.
2.2 Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT)
2.2.1 Einführung
Die Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT) erlaubt, simultan die Aktivität
mehrerer erregbarer Zellen durch optische Messung zu erfassen. Ein
spannungssensitiver Farbstoff fungiert dabei als molekularer Wandler und
transformiert Änderungen des Membranpotentials in optische Signale. Angewendet
wurde bislang diese Technik der optischen Membranpotentialmessung an
verschiedenen Geweben beispielsweise an Neuronen des Blutegels (SALZBERG et
al. 1973), an Bakterien (BREWER 1976), an der Speicheldrüse von Schnecken
(SENSEMAN et al. 1983), am Froschherz (KOMURO et al. 1986), am vital
gefärbten embryonierten Hühnerherz (KAMINO et al. 1989), am Abdominalganglion
der Meeresschnecke Aplysia (PARSONS et al. 1989) sowie verschiedenen
Gehirnarealen von Frosch (SALZBERG et al. 1983), Rochen (KONNERTH et al.
1987), Meerschweinchen (ALBOWITZ et al. 1990), Ratte (GRINVALD et al. 1982b)
und Mensch (SYVERSON et al. 1986).
An enzymatisch dissoziierten submukösen Neuronen des
Meerschweinchenileum konnten OBAID und Mitarbeiter 1992 prinzipiell die
Übertragbarkeit dieser optischen Methode auch auf Neurone des ENS zeigen
(OBAID et al. 1992). Die MSORT wurde bisher allerdings weder für Untersuchungen
am frisch präparierten ENS des Meerschweinchens eingesetzt noch ist sie bislang
am ENS des Menschen oder der Maus etabliert worden.
Die Multi-Site Optical Recording Technique geht auf verschiedene
Arbeitsgruppen zurück, die optische Aktivitätsmessungen an gefärbten und
ungefärbten Nervenmembranen Mitte des 20. Jahrhunderts durchführten (HILL u.
KEYNES 1949; USHAKOV 1950). 1968 konnten TASAKI und Mitarbeiter an vital
gefärbten und stimulierten Tintenfischaxonen Änderungen der Fluoreszenzintensität
36 Grundlagen
messen (TASAKI et al. 1968). Da der praktische Einsatz dieser Technik jedoch
zunächst auf große Membranoberflächen limitiert war und erhaltene optische
Signale nur von geringer Größe waren, wurden in den vergangenen Jahrzehnten
mehr als 1000 Farbstoffe auf ihre Eignung getestet (COHEN et al. 1974;
GRINVALD 1985a; ROSS et al. 1977). Viele Farbstoffe zur Messung von
Membranpotentialänderungen waren bei hohen Lichtintensitäten und in
Anwesenheit von Sauerstoff stark phototoxisch. Dies limitierte die Experimente
zunächst auf Invertebraten. Erst die stetige Entwicklung, Verbesserung und
Charakterisierung von spannungssensitiven Fluoreszenzfarbstoffen (GRINVALD et
al. 1982; GUPTA et al. 1981; LOEW et al. 1992; ROSS et al. 1977) sowie die
Optimierung der Meßapparatur durch Entwicklung leistungsstärkerer, schneller und
größerer Photodetektoren mit vielen Elementen und hoher Quantenausbeute
(COHEN et al. 1971; COHEN et al. 1974; GRINVALD et al. 1977; SALZBERG at al.
1973; WAGGONER 1979) und die Entwicklung der Computertechnik erbrachten die
technischen und instrumentellen Voraussetzungen, die optische Signalerfassung
Ende des 20. Jahrhunderts zur Untersuchung an Nervensystemen von Vertebraten
anzuwenden. Heute finden etwa 20-30 spannungssensitive Farbstoffe als
potentiometrische Sensoren Einsatz, die die Basis für diese optische Messung
bilden.
2.2.2 Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe
2.2.2.1 Bedeutung und Anwendung
Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe besitzen die Fähigkeit, sich einseitig in
Zellmembranen einlagern zu können und als molekulare Sonden Änderungen des
Membranpotentials mit einer Änderung ihrer optischen Eigenschaften, vor allem
ihres Absorptions- und Fluoreszenzverhaltens, zu beantworten. Ihre spektralen
Eigenschaften sind in mehreren Studien ausführlich untersucht worden (COHEN u.
SALZBERG 1978; FLUHLER et al. 1985; FROMHERZ u. LAMBACHER 1991;
FROMHERZ u. MULLER 1993; GUPTA et al. 1981; LOEW et al. 1985;
WAGGONER 1979).
Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT) 37
In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl von Farbstoffen an
unterschiedlichen biologischen Geweben, wie beispielsweise Nerven- und
Muskelzellen, angewendet. Ein großer Vorteil, verglichen mit dem Einsatz von
Mikroelektroden zur Zellableitung, ist ihre Anwendbarkeit auf nahezu alle Zellarten
und Zelltypen unabhängig von ihrer Größe. Mit der geeigneten optischen
Meßapparatur ermöglichen die spannungssensitiven Farbstoffe die Detektion von
Spannungstransienten mit hoher Orts- und Zeitauflösung und schaffen die
Voraussetzung, diese entlang des Untersuchungsobjektes zu kartieren.
Da spannungssensitive Farbstoffe auf Potentialänderungen des sie
umgebenden Milieus unterschiedlich schnell reagieren, wurde von WAGGONER
1976 die Einteilung in ‚slow-response probes‘ und ‚fast-response probes‘
vorgeschlagen, die seither verwendet wird. ‚Slow-response probes‘ antworten im
Bereich von Sekunden bis Minuten mit relativ großen Änderungen des
Fluoreszenzsignals von 80-90 % pro 100 mV.
‚Fast-response probes‘ reagieren auf Spannungstransienten typischerweise
im Submikrosekundenbereich und können damit schnelle Ereignisse wie
beispielsweise Aktionspotentiale zeitgleich darstellen (GRINVALD et al. 1987;
WAGGONER 1979). Die resultierende potentialabhängige Fluoreszenzänderung ist
bei dieser Farbstoffklasse allerdings gering und liegt bei 2-10 %
Fluoreszenzänderung auf 100 mV. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten
Chromophore gehören dieser Klasse potentiometrischer Farbstoffe an.
2.2.2.2 Potentialsensitive Styrylfarbstoffe: Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPSsowie Di-8-ANEPPQ
Die in dieser Arbeit eingesetzten Farbstoffe Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS und auch
Di-8-ANEPPQ (s. Abb. 3) zählen zur Strukturklasse der Styryl- bzw. der
Naphthylstyrylfarbstoffe. Diese Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinum Chromophore
wurden 1978 von LOEW entwickelt und zeichnen sich besonders durch eine
konstant sensitive Antwort aus (LOEW et al. 1978).
38 Grundlagen
Das Ziel von LOEW und Mitarbeitern, einen universellen potentiometrischen
Farbstoff zu erhalten, der sich auf die verschiedenen Anwendungsgebiete und
Untersuchungsprotokolle anwenden läßt, konnte mit Di-4-ANEPPS teilweise
realisiert werden. Der breite Einsatz in vielen unterschiedlichen Geweben,
beispielsweise Nervenzellen und Herzmuskelzellen, verdeutlich dies (LOEW et al.
1992; NEUNLIST et al. 1992). Di-4-ANEPPS zeichnet sich durch eine
verhältnismäßig hohe relative Fluoreszenzänderung aus bei Potentialänderungen
von 100 mV. Nachteil ist eine bei einigen Zelltypen auftretende
Membrandurchgängigkeit und auftretende Phototoxizität. Das daraufhin entwickelte
Derivat Di-8-ANEPPS besitzt hingegen eine gute Membranstabilität und zeigt eine
hohe Photostabilität bei gleichzeitig geringer Phototoxizität. Di-8-ANEPPQ ist ein
primär für neuronales Tracing entwickelter spannungssensitiver Farbstoff, der eine
sehr geringe Wasserlöslichkeit, aber hohe Lipidlöslichkeit besitzt. Allein
Di-8-ANEPPS wurde bisher am enzymatisch dissoziierten enterischen
Nervensystem angewendet und hier nur beim Meerschweinchen (OBAID et al.
1992).
Die Naphthylstyrylfarbstoffe sind größtenteils zwitterionische amphiphile
Farbstoffe und besitzen typischerweise zwei funktionelle Gruppen, einen
Naphthalinring als Elektronendonor und einen Pyridinring als Elektronenakzeptor.
Die beiden Ringsysteme sind meist über Kohlenstoffketten mit konjugierten
Doppelbindungen verknüpft. Bei der Photoexzitation kommt es zu einer
Verschiebung der positiven Ladung vom Pyridin zum Naphthalin.
Der polare Charakter von Di-8-ANEPPS und Di-4-ANEPPS wird durch die
negativ geladene Sulfatgruppe der Kohlenstoffkette hervorgerufen, die an dem
positiv geladenen Stickstoff des Pyridins gebunden ist. Hingegen besitzt das
kationische Di-8-ANEPPQ eine doppelt positive Ladung am Pyridin, die eine
einseitige Membranbindung verstärkt (LOEW 1996). Die bei einigen Derivaten
unterschiedlich langen, paarigen hydrophoben Kohlenwasserstoffketten, durch die
sich die in dieser Arbeit verwendeten Farbstoffe Di-8-ANEPPS/Di-8-ANEPPQ und
Di-4-ANEPPS unterscheiden, tragen nicht zur Fluoreszenz bei, sondern bewirken
die Verankerung in die Zellmembran. Die Tiefe und Stabilität der Verankerung steht
Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT) 39
in Abhängigkeit zu der Länge der Hydrokarbonketten (BAMMEL et al. 1990). In den
Interzellularraum ragt die hydrophile Kopfgruppe, die das Chromophor jeweils
senkrecht zur Membran-Wasser-Grenzschicht ausrichtet.
Abbildung 3: Strukturformel dreier Naphthylstyrylfarbstoffe (links) und Lage des
Farbstoffmoleküls in einem Membranmodell (rechts)
Links Die hydrophile Kopfgruppe wird durch einen Pyridinring mit einem positiv geladenen
Stickstoffatom (N+) repräsentiert, an dem über Kohlenstoffketten einfach negativ geladene
Sulfat-Gruppen (Di-8-ANEPPS/ Di-4-ANEPPS) bzw. eine einfach positiv geladene
Quaternat-Gruppe (Di-8-ANEPPQ) gekoppelt sind. Der unpolare Teil der Farbstoffe
besteht aus dem Naphthalinring und den beiden entsprechend langen
Kohlenwasserstoffketten.
Rechts Schematische Darstellung der Integration und Ausrichtung eines potentiometrischen
Farbstoffmoleküles in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran am Beispiel des
Styrylfarbstoffes Di-8-ANEPPS. Die hydrophile Kopfgruppe ragt in den Interzellularraum.
Di-8-ANEPPS
Di-4-ANEPPS
Di-8-ANEPPQ
Phospholipid-Doppelschicht
InterzellularraumDi-8-ANEPPS
Zellinneres
40 Grundlagen
2.2.2.3 Mechanismus der Spannungssensitivität
Für viele ‚fast-response‘-Farbstoffe sind die genauen Mechanismen der
Potentialsensitivität noch nicht hinreichend geklärt.
Jedoch konnte für die von LOEW synthetisierten Amino-Naphthyl-Ethenyl-
Pyridinum Chromophore gezeigt werden, daß die Potentialsensitivität überwiegend
auf intramolekularer Elektronenverschiebung beruht (LOEW u. SIMPSON 1981;
LOEW et al. 1979). Dieser als Elektrochromie bezeichnete Mechanismus ist
verantwortlich für die Sensitivität der Farbstoffe gegenüber dem Membranpotential.
Als Elektrochromie (Stark-Effekt) beschreibt man die Änderung der optischen
Eigenschaften eines Chromophors im elektrischen Feld der Membranspannung, die
sich in einer Frequenzverschiebung des Absorptions- bzw. Emissionsmaximums
äußert. Bei einer intramolekularen Ladungsverschiebung entgegen eines
elektrischen Feldes bedingt die zusätzlich erforderliche Photoexzitationsenergie
eine Blauverschiebung des Anregungs- sowie des Emissionsspektrums (LABHART
1967). Auch für die Styrylfarbstoffe ist diese Blauverschiebung der beiden Spektra
beschrieben (FROMHERZ u. LAMBACHER 1991).
Für eine elektrochrome Verschiebung ist eine Bewegung des Chromophors
in der Membran nicht erforderlich, deshalb können die Änderungen im
Subnanosekundenbereich stattfinden. Die optische Antwort ist damit schnell genug,
um transiente Spannungsänderungen im Millisekundenbereich, wie z. B.
Aktionspotentiale von Nervenzellen, zu detektieren. Die Ausrichtung des
Farbstoffmoleküls senkrecht zur Membran-Wasser-Grenzschicht garantiert, daß die
intramolekulare Ladungsverschiebung parallel zum transmembranen elektrischen
Feld erfolgt und durch diese erzielte Maximierung des elektrochromen
Mechanismus Spannungsänderungen linear erfaßt werden können (FLUHLER et al.
1985). Diese lineare Spannungssensitivität konnte in Kombination mit intrazellulären
Ableitungen und mit der Patch-Clamp Technik mehrfach gezeigt werden
(GRINVALD et al. 1982a; ZECEVIC u. ANTIC 1998; FLUHLER et al. 1985; ZHANG
et al. 1998). Außerdem ähnelten die simultan gemessenen optischen Signale in
Multi-Site Optical Recording Technique (MSORT) 41
ihrem Zeitverlauf den elektrophysiologisch registrierten transmembranalen
Spannungstransienten (ROSS et al. 1977).
Ein großer Vorteil für optische Messungen ist, daß diese Farbstoffe nur dann
stark fluoreszierend sind, wenn sie an Membranen gebunden sind. Sie sind
praktisch nicht fluoreszierend, wenn sie gelöst in Wasser vorliegen. Voraussetzung
für die Detektion der Fluoreszenzänderungen ist die Bindung entweder an die
Außenseite oder die Innenseite der Membran. Die in dieser Arbeit verwendeten
Farbstoffe werden ausschließlich auf der Außenseite der Membran appliziert. Die
Anregung erfolgt im grünen, die Emission im roten Spektralbereich.
2.2.3 Meßtechnologie zur Detektion optischer Änderungen
Optische Signale werden durch eine Vielzahl von Störgrößen beeinflußt, die als sog.
Rauschen die Größe der informationsübertragenden optischen Signale nach unten
begrenzen. Die Entwicklung der Meßsysteme zielt dementsprechend darauf,
Rauschkomponenten zu minimieren und Signale selbst mit geringer Lichtintensität
mit ausreichender Genauigkeit erfassen und darstellen zu können. Um
Membranpotentialänderungen an verschiedenen Orten zeitgleich und möglichst
genau zu registrieren, ist eine gute zeitliche und räumliche Auflösung erforderlich,
wobei das Ausmaß jeweils von der zu bearbeitenden Fragestellung abhängig ist.
Für die Detektion optischer Signale werden heute hauptsächlich
Photodioden-Systeme, Photomultipler und auch CCD-Kameras verwendet.
42
3 Untersuchungsgut und Methodik3.1 Untersuchtes Darmgewebe
3.1.1 Maus und Meerschweinchen
Die Untersuchungen am Plexus submucosus und Plexus myentericus wurden im
Bereich des proximalen Kolon von Maus und Meerschweinchen durchgeführt.
Für die Versuche am murinen Darmgewebe wurden männliche Tiere der
gängigen Inzuchtstämme BALB/cJ und C57BL/6 verwendet, die ad libitum mit
Altromin Haltungsfutter Nr. 1324 gefüttert wurden. Die Mäuse wurden im Alter von
3-6 Monaten durch zervikale Dislokation getötet, gleichzeitig entblutet und dann in
Rückenlage fixiert. Nach medianer Eröffnung des Abdomen wurde ein ca. 3 cm
langes Stück Colon ascendens ausgehend von der Ampulla coli (Abb. 4, X)
entnommen und mittels Inzisur oral markiert.
Bei den Untersuchungen am Meerschweinchen standen männliche und
weibliche Tiere des Auszuchtstammes BFA-bunt im Alter von 3-7 Monaten zur
Verfügung. Die Fütterung erfolgte mit Altromin Nr. 3122 und Heu ad libitum. Die
Tiere wurden zunächst per Kopfschlag betäubt und dann sofort mittels Dekapitation
getötet.
Abbildung 5: Darstellung zurEntnahmelokalisation des Dickdarmstückesbeim Meerschweinchen (modifiziert nachPOPESKO 1992a).
X Übergang vom Caecum zur Ampulla coli, [ ] entnommenes Stück Colon ascendens
Abbildung 4: Überblick über dieEntnahmelokalisation bei der Maus.Dargestellt sind Dickdarmabschnitte(modifiziert nach POPESKO 1992b).
[ ][
Untersuchungsgut und Methodik 43
Nach Fixierung in Rückenlage und medianer Bauchdeckeneröffnung wurde
ein ca. 4 cm großes Stück Colon ascendens etwa 6 cm distal der Ampulla coli
entnommen (Abb. 5) und oral markiert.
Die entnommenen Darmabschnitte wurden sofort in eisgekühlte, mit
Carbogen (O2 95 Vol%, CO2 5 Vol%, Linde GmbH, Höllriegelskreuth) gesättigte
Krebs-Lösung (s. Kapitel 8.2) verbracht.
3.1.2 Darmgewebe des Menschen
Im Zeitraum von März 1999 bis Oktober 2000 wurden vier Rektumbioptate und 30
etwa 2- 40 cm² große Ganzwandabschnitte von Teilen des Kolon und Rektum
untersucht (s. Abb. 6). Die Verwendung von Humangewebe war im Rahmen des
Teilprojektes A 10 des SFB 280 ‚Gastrointestinale Barriere‘ genehmigt worden.
Das Darmgewebe wurde jeweils bis
zur Untersuchung an der
Tierärztlichen Hochschule in
gekühlter, sauerstoffangereicherter
Krebs-Lösung aufbewahrt.
Die Bioptate waren mit
Einwilligung der Patienten durchge-
führte Probeentnahmen, bei denen
der Verdacht auf Amyloidose
bestand und ausgeschlossen werden
sollte. Die Gewebe waren unter Sicht
mit einer Exzisionszange (durch-
schneidend, mit abgewinkeltem Kopf,
8151.17, R. Wolf, Kneitlingen) 6-8 cm
ab ano aus dem dorsalen Rektum
entnommen worden. Die
Gewebestücke hatten einen
Durchmesser von ca. 0,4-0,6 cm.
Abbildung 6: Schematische Darstellung desgesamten Dickdarmes beim Menschen.Lokalisationen der hauptsächlichuntersuchten Dickdarmabschnitte sindmittels Pfeil markiert.
a Colon ascendens; b Colon transversum;c Colon descendens; d Colon sigmoideum;e Rectum
44 Eigene Untersuchungen
Die Ganzwandgewebe stammten aus Darmresektaten, hauptsächlich
entnommen im Rahmen von Karzinomoperationen. Für die Untersuchungen wurden
nur die nicht tumorös entarteten Bezirke des Resektates zur Verfügung gestellt. Ein
Teil der Darmgewebe wurde anal markiert. Die Ganzwandgewebe gelten als
Kontrolluntersuchungen. Es wurden keine Gewebe verwendet, bei denen
vorberichtlich eine Infektion mit Hepatitis oder mit dem Humanen Immundefizienz
Virus (HIV) vorlag.
Die Ganzwandgewebe waren Patienten im Alter von 35 bis 78 Jahren
entnommen worden. Das Durchschnittsalter betrug 59 ± 11 Jahre (Mittelwert ±
Standardabweichung). Das durchschnittliche Alter der Patienten, bei denen
Rektumbioptate entnommen worden waren, lag bei 46 ± 25 Jahre (Mittelwert ±
Standardabweichung, Bereich: 21-79 Jahre). Weitere Daten wie Geschlecht,
Diagnose und untersuchter Darmabschnitt sind in Tabelle 2 und Tabelle 3
aufgeführt.
Tabelle 2: Angaben zu den untersuchten Darmresektaten
Tiho-Nr. MHH-Nr. Alter Geschlecht Resektat DiagnoseH 01 MC 674 58 m Colon des. Kolon-KarzinomH 02 MC 677 48 m Rectum Rektum-KarzinomH 07 MC 684 52 m Colon des. Lionell-SarkomH 09 MC 690 35 w Colon as. AnastomosenstenoseH 10 MC 696 57 w Colon as. Pankreaskopf-KarzinomH 11 MC 703 73 w Colon des. Pankreaskopf-KarzinomH 13 MC 711 40 w Colon des. Rektum-KarzinomH 14 MC 712 78 w Colon des. Rektum-KarzinomH 18 MC 725 45 m Colon des. Rektum-Karzinom, PolyposisH 19 MC 734 64 m Colon sig. Kolon-KarzinomH 20 MC 736 54 m Rectum Rektum-KarzinomH 21 MC 741 65 m Rectum Rektum-KarzinomH 23 MC 755 60 m Colon sig. Sigma-KarzinomH 24 MC 758 61 m Colon sig. Rektum-KarzinomH 25 MC 762 77 m Rectum Sigma-KarzinomH 26 MC 764 64 m Colon des. Divertikel NachresektionH 27 MC 777 42 m Colon sig. Rektum-Karzinom
Untersuchungsgut und Methodik 45
(Fortsetzung von Tabelle 2)
Tiho-Nr. MHH-Nr. Alter Geschlecht Resektat DiagnoseH 30 MC 802 73 m Colon sig. Rektum-KarzinomH 33 MC 827 66 m Colon trans. Rektum- und Kolon-KarzinomH 38 MC 840 53 m Rectum Anal-KarzinomH 40 MC 842 56 m Colon des. Rektum-KarzinomH 41 MC 845 72 w Rectum Rektum-KarzinomH 42 MC 856 65 w Colon sig. Rektum-KarzinomH 43 MC 857 60 m Colon trans. Kolon-KarzinomH 44 MC 884 68 w Colon sig. Sigma-KarzinomH 45 MC 888 51 m Colon sig. Rektum-KarzinomH 46 MC 891 49 w Colon des. Kolon-KarzinomH 47 MC 893 66 m Colon sig. BeckenexenterationH 48 MC 894 64 w Colon sig. Sigma-KarzinomH 49 MC 897 63 m Rectum Rektum-Karzinom
m = männlich, w = weiblich, as.= ascendens, des.= descendens, sig.=sigmoideum, trans.=transversum
Tabelle 3: Angaben zu den untersuchten Rektumbioptaten
Tiho-Nr. MHH-Nr. Alter Geschlecht Pathologisch-histologische DiagnoseH 17 PE 749 33 m Amyloidose der RektummukosaH 34 PE 753 21 w diskrete Amyloidose der RektummukosaH 36 PE 754 79 m Unauffällige RektumbiopsieH 37 PE 755 51 w Unauffällige Rektumbiopsie
m = männlich, w = weiblich
3.2 Präparation (s. Abb. 7)
3.2.1 Darmgewebe von Maus und Meerschweinchen
Das jeweilige Colon ascendens wurde mesenterial eröffnet und die Ingesta durch
mehrmaliges Waschen mit Krebs-Lösung (s. Kapitel 8.2) entfernt. Zur Präparation
wurde der eröffnete Darm in eine mit einem Silikonelastomer (SylgardR 184, Dow
Corning, Midland, USA) ausgegossene Petrischale verbracht. In der Petrischale
befand sich Krebs-Lösung, die durch ein Perfusionssystem in der Schale
46 Eigene Untersuchungen
kontinuierlich zirkulierte und in einem Reservoir permanent mit Carbogen (95 Vol%
O2, 5 Vol% CO2) angereichert und zudem gekühlt wurde.
Die Präparation erfolgte unter einem Stereomikroskop (Olympus SZ 40,
Olympus, Hamburg, Deutschland) bei 7-40facher Vergrößerung. Zur Beleuchtung
wurde eine Kaltlichtquelle eingesetzt. Zunächst wurde das Gewebe mit luminaler
Seite nach oben mit 0,1 bzw. 0,2 mm feinen Präpariernadeln (Insect pins 10 mm,
Fine Science Tools, Heidelberg) aufgespannt. Die Mukosa wurde mit feinen Dumont
Uhrmacherpinzetten (No. 4 u. 5, Fine Science Tools, Heidelberg) und einer
Irisschere (Moria 9602, Fine Science Tools, Heidelberg) schrittweise entfernt.
Für die Präparation des Plexus submucosus wurde das Gewebe mit der
serosalen Seite nach oben erneut aufgespannt. Durch gesamthaftes stumpfes
Ablösen der Muskulatur wurde der Plexus submucosus separiert.
Der Plexus myentericus wurde, nachdem Mukosa und Plexus submucosus
entfernt worden waren, vorsichtig von der anhaftenden Zirkulärmuskulatur und nach
Wenden des Präparates von Teilen der Longitudinalmuskulatur befreit, indem
schrittweise die Muskelfaserbündel mit feinen Dumont Uhrmacherpinzetten
abgezogen wurden.
3.2.2 Humangewebe
Vergleichbar mit der Präparation des Plexus submucosus bei Maus und
Meerschweinchen wurden beim Humangewebe die Mukosa und Muskulatur von
den Rektum- bzw. Kolonabschnitten entfernt. Der verbliebene Plexus submucosus
wurde entlang einer Trennfläche, die zwischen dem inneren und intermediären
Plexusanteil beschrieben wird (IBBA-MANNESCHI et al. 1995), mittels Schere
aufgeteilt. Diese Trennfläche unterteilt den Plexus submucosus des Menschen in
ein inneres und zwei äußere Drittel. Für die optischen Untersuchungen wurde
ausschließlich der innere, mukosanahe Gewebeanteil verwendet, der überwiegend
den Meissner-Plexus beinhaltet.
Die Präparation des Plexus myentericus erfolgte durch möglichst
vollständiges Abpräparieren der Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur.
Untersuchungsgut und Methodik 47
Bei den maximal pfennigstückgroßen Rektumbioptaten wurde nur vorsichtig
die Mukosa entfernt. Das verbliebene Bindegewebe mit den darin enthaltenen
Plexusanteilen wurde für die optischen Fluoreszenzmessungen verwendet.
3.3 Montage in die Versuchskammer
Die Präparate wurden für die optischen Untersuchungen in einer eigens
konstruierten Spezialkammer aus Plexiglas (Abb. 8) montiert.
Das Gewebe wurde auf selbst gegossenen Silikonelastomerplatten (Sylgard®
184, Dow Corning Corporation, Midland, USA) mit gekürzten Präpariernadeln
(Länge: ca. 1-1,5 mm, Durchmesser: 0,1 mm) aufgespannt. Für die verschiedenen
Abbildung 7: Schematische Übersicht zur Präparation des Plexus submucosus (Psm) und
des Plexus myentericus (Pmy). Gezeigt ist ein Schnitt durch die Wand des eröffneten
Darmrohrs. Oben befindet sich die Schleimhaut, die zuerst entfernt wird. Der unterhalb der
Schleimhaut lokalisierte Plexus submucosus wird von der darunter liegenden Muskulatur
separiert. Schrittweises Entfernen der Zirkulärmuskulatur legt den Plexus myentericus frei.
Teile der Longitudinalmuskulatur, der der Plexus myentericus überwiegend anhaftet, können
partiell entfernt werden (umgezeichnet nach WOOD 1987).
Schleimhaut
Zirkulärmuskulatur
Longitudinal-muskulatur Psm
Pmy
48 Eigene Untersuchungen
Präparatgrößen standen selbst hergestellte Sylgard®- und Kunststoffplatten mit
jeweils drei unterschiedlichen Fensterungen zur Verfügung: 2 cm x 1 cm;
1,3 cm x 0,7 cm und 0,2 cm x 0,5 cm.
In eine vorgefertigte Vertiefung am Unterboden der Versuchskammeröffnung
wurde ein 160-170 µm dickes, austauschbares Deckglas mit einem Durchmesser
von 42 mm (Saur Laborbedarf, Reutlingen) durch hochvisköses Silikonelastomer
1
2
3 Gewinde
Deckglas
Zufluß
Plexiglaskammer
Abfluß
Fixierschraube
1: Druckring zur Fixation der Platten 2, 32: Starre Kunststoffplatte mit Fenster zur planen Fixierung von 33: Flexible, gefensterte Einmal- Sylgard®-Platte mit aufge- spanntem Gewebe
PERFUSION
Abbildung 8: Schematischer Aufbau der Versuchskammer, in der das zu untersuchende
Plexuspräparat auf das inverse Mikroskop montiert wurde. Ein jeweils austauschbares
Deckglas wurde an der entsprechenden Aussparung im Unterboden der Kammer
befestigt. Das Gewebe wurde auf eine dünne Sylgard®-Platte (3) aufgespannt und in die
Versuchskammer eingelegt. Auf diese Platte wurde eine starre Kunststoffplatte (2) gelegt,
um das Gewebe auf dem Deckglas plan positionieren zu können. Der Druckring (1)
wurde ebenfalls in die Versuchskammer gelegt und am Gewindestutzen mit einer
Schraube befestigt, um durch leichten Druck die beiden Platten zu fixieren.
Untersuchungsgut und Methodik 49
(z. B. Baysilone-Paste®, Bayer AG, Leverkusen) befestigt. Ein selbstklebender Film,
der an Deckglasrand und Versuchskammer angebracht wurde, sorgte zusätzlich für
die notwendige Stabilität. Das Gewebe konnte dann in die wasserdichte Kammer
eingelegt und, wie in Abbildung 8 schematisch dargestellt, mit den entsprechenden
Platten fixiert werden. Über einen Zu- und Abfluß erfolgte in der Kammer während
der gesamten Versuchsdauer die kontinuierliche Perfusion mit 37 °C warmer,
Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit einer Durchflußrate von 10 ml pro Minute bei
einem Kammervolumen von ca. 4 ml.
3.4 Apparatur der Fluoreszenzmeßtechnik undVersuchsaufbau der Fluoreszenzmessung
Das optische Meßsystem setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen:
• Lichtquelle
• Elektronischer Verschluß, „Shutter“
• Mikroskop, Filterblock, Objektive
• Glasfasergekoppeltes Photodioden-Array
incl. Verstärkern, Multiplexer und AD-Wandler
• Hardware zur Datenerfassung und entsprechende Software
• Schwarzweißkamera, Videobild
3.4.1 Lichtquelle, elektronischer Verschluß, Mikroskop,Filterblock und Objektive
Die Apparatur befand sich auf einem pneumatisch betriebenen, vibrationsfreien
Versuchstisch (Science Products GmbH, Hofheim), der durch einen Faraday-Käfig
abgeschirmt war. Optischer Baustein war ein inverses Mikroskop (IX 50, Olympus,
Tokyo, Japan), das für die Fluoreszenzmessungen im Auflichtmodus betrieben
wurde. Eine Halogenlichtquelle wurde für das Aufsuchen von Ganglien im Durchlicht
verwendet. Die Versuchskammer (s. S. 48) konnte durch eine von der
50 Eigene Untersuchungen
Institutswerkstatt angefertigte Halterung auf dem Objekttisch montiert und frei in
X- und Y-Richtung verschoben werden.
Für die optischen Messungen wurde als Lichtquelle eine 150 W
Xenonkurzbogenlampe (XBO 150W/CR OFR, Osram, München) verwendet, die
sich durch ihr weitgehend kontinuierliches Spektrum, ihre hohe Intensität (s. Anhang
S. 196) und gute Bogenstabilität gerade für die Fluoreszenzmessungen eignete. Sie
wurde in einem Mikroskoplampengehäuse (Model 770, OPTI QUIP, Highland Mills,
NY, USA) montiert. Das Netzteil der Lichtquelle (1600 Series D.C. Power Supplies,
OPTI QUIP, Highland Mills, NY, USA) erfüllte mit einer Rippeleigenschaft von
< 0,2% hinsichtlich der Restwelligkeit und Stabilität die erforderlichen
Anforderungen, um das bei der optischen Messung störende Rauschen durch
Fluktuation der Lichtquelle gering zu halten.
Beim Justieren der Lichtquelle wurde ein Kompromiß zwischen einer
homogenen Ausleuchtung des Gesichtsfeldes und gleichzeitig hoher Intensität
gewählt.
Aus dem Xenonlampenspektrum wurde das Anregungslicht des
Fluoreszenzfarbstoffes durch einen Exzitationsfilter (HQ 545/30 14903, Olympus,
Tokyo, Japan) herausgefiltert. Der sich anschließende dichroitische Spiegel
(DM 565, Olympus) lenkte das Licht durch entsprechende Objektive mit hoher
numerischer Apertur auf das mit dem potentiometrischen Chromophor beladene
Präparat enterischer Ganglien. Das vom Präparat emittierte und vom Objektiv
gesammelte Fluoreszenzlicht wurde dann von dem als Lichtteiler fungierenden
dichroitischen Spiegel in den Abbildungsstrahlengang freigegeben und über einen
Sperrfilter (BF 580, Olympus) auf die Glasfaseroptik des Photodioden-Arrays
gelenkt. Die Wahl dieser Filterkombination für den Farbstoff Di-8-ANEPPS stellt
eine Modifikation des Cy 3-Filters dar (s. Abb. 9) und wurde für Messungen mit
Di-8-ANEPPS durch Vergleich verschiedener Filterblöcke (s. Anhang Tab. 18)
empirisch bestimmt.
Auf die Spezifikationen des glasfasergekoppelten Photodioden-Arrays wird
im folgenden Kapitel eingegangen.
Untersuchungsgut und Methodik 51
Mit einem elektronischen Verschluß (UNIBLITZ Modell D122, Vincent
Associates, New York, USA), der über die Software NeuroPlex® (RedShirtImagingTM
LLC, Fairfield, CT, USA) angesteuert wurde, konnte der Anregungsstrahlengang
geöffnet bzw. unterbrochen werden. Dies mußte durch die Software hochpräzise
gesteuert werden, damit Belichtungszeit des Gewebes und Meßzeitraum
übereinstimmten. Das Gewebe sollte außerdem nur während der eigentlichen
Messung belichtet werden, um die durch die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs
verursachten Einflüsse (z. B. Radikalbildung) auf ein notwendiges Maß zu limitieren.
Das Steuerelement des elektronischen Verschlusses war separat vom
Versuchstisch außerhalb des Faraday-Käfig angebracht, um von ihm ausgehende
Störungen zu verhindern.
100 100
50 50
0 0
800750700650600550500Wellenlänge in nm
Fluo
resz
enz
Abso
rptio
n
Abbildung 9: Anregungsspektrum (links) und Emissionsspektrum (rechts) von
Di-8-ANEPPS in Phospholipidvesikeln aufgetragen über der Wellenlänge (modifiziert
nach HAUGLAND, Molecular Probes).
Ähnliche Spektren, die sich nicht signifikant voneinander unterscheiden, gelten für
Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ. Die Einheiten der Ordinaten sind normiert für einen
willkürlichen Höchstwert von 100. Eingezeichnet ist die bei den Hauptversuchen
verwendete Filterkombination: Anregungsfilter ( ), dichroitischer Spiegel ( ),
Emissionsfilter ( )
52 Eigene Untersuchungen
Bei der Wahl der Objektive für die optische Messung (s. Tabelle 4) mußte auf
hohe numerische Apertur (N.A.) geachtet werden, da sowohl Anregungs- als auch
Fluoreszenzlicht durch das Objektiv gelangten. In diesem Fall waren zwei Faktoren
relevant:
1. Die N.A. determiniert die Stärke der Beleuchtungsintensität, die im Falle der
Epifluoreszenzmikroskopie proportional zur vierten Potenz der N.A. ist (COHEN
u. LESHER 1986).
2. Darüber hinaus war die N.A. der Epifluoreszenzobjektive ein entscheidender
Wert, da das Signal-Rausch-Verhältnis proportional zum Quadrat der N.A. ist
(GRINVALD et al. 1988).
Tabelle 4: Bezeichnung, Numerische Apertur, mechanische Tubuslänge, Deckglaskorrektur
und Arbeitsabstand der verwendeten Objektive I.
Objektiv Bezeichnung Num. Apertur mechan. Tubuslänge/Deckglaskorrektur Arbeitsabstand
20er Olympus JAPAN UPlanApo 0.80 Öl °°/- 0,19 mm 40er Olympus JAPAN UApo/340 0.65-1.35 Öl Iris °°/0.17 0,10 mm100er Olympus JAPAN 103665
SplanApo 100 0.70-1.40 Öl Iris 160/0.17 0,15 mm
I Angaben stammen aus Datenblättern der Firma Olympus, Hamburg
Die beiden Objektive mit Iris wurden deshalb während der optischen Aufnahme
stets mit maximal geöffneter Blende eingesetzt.
Olympus-Objektive mit 1,25facher, 4facher und 10facher Vergrößerung standen für
die Positionierung der Manipulatoren im Durchlicht zur Verfügung.
3.4.2 Glasfasergekoppeltes Photodioden-Array
Bei dem eingesetzten Photodioden-Array handelte es sich um ein
glasfasergekoppeltes Photodioden-Array (Wu Tech Instruments, Potomac, MD,
USA) mit 464 Elementen, die an 464 Glasfasern photooptisch gekoppelt sind
(s. Anhang Abb. 44). Das Array ist in einem Aluminiumgehäuse untergebracht, das
Untersuchungsgut und Methodik 53
wie ein Faraday-Käfig Schutz vor elektromagnetischen Störungen bietet. Im
Photodioden-Array induzierten die einfallenden Photonen einen meßbaren
Elektronenstrom innerhalb jeder einzelnen Photodiode. Optische Signale wurden
dadurch in elektrische Signale umgewandelt.
Das glasfasergekoppelte Photodioden-Array wurde über einen C-Mount am
seitlichen Ausgang des inversen Mikroskops montiert. Jeweils zur Messung wurde
der Lichtstrahl über einen Umlenkspiegel zu nahezu 100 % auf die Glasfaseroptik
des Photodioden-Arrays gelenkt. Diese wurde am seitlichen Ausgang so justiert,
daß das Zentrum des Lichtstrahls annähernd dem Zentrum der Glasfaseroptik
entsprach. Der Lichtstrahl gelangte von den hexagonal gebündelten 464 Glasfasern
auf die entsprechenden 464 Photodioden. Diese Konstellation von Glasfasern und
Photodioden besaß für Fluoreszenzmessungen am Nervensystem des Darmes
einerseits den Vorteil, einen sehr hohen aktiven Meßbereich von 93 % (s. Anhang,
Tab. 16) zu besitzen - beispielsweise kann bei monolithischen Arrays von nicht
mehr als 50 % der Gesamtfläche gemessen werden - andererseits wurden durch
eine Glasfaserlänge von weniger als 15 cm Lichtverluste geringgehalten.
Die Photodioden sind Siliziumdioden. Durch die damit verbundene hohe
Quantenausbeute (s. Anhang, Tab. 17) wurde die Detektion selbst einer geringen
Zahl emittierter Photonen gestattet. Jedoch war selbst bei hohen Lichtintensitäten
eine Sättigung der Dioden - im Gegensatz beispielsweise zu CCD-Kamera-
Systemen - kein limitierender Faktor bei den Messungen (s. Anhang, S. 197).
Die Photoströme der einzelnen Photodioden wurden individuell verstärkt und
simultan ausgelesen.
Zusätzlich zu den 464 Dioden konnten über 8 BNC-Eingänge, parallel zu den
Messungen der Dioden, externe Pulse z. B. von einer Isolatoreinheit für elektrische
Nervenzellstimulationen eingelesen werden. Weitere Spezifikationen der Glasfasern
und der Photodioden sind im Anhang aufgeführt.
3.4.3 Verstärker, Multiplexer und AD-Wandler
Die Verstärkung des von den einzelnen Dioden erzeugten Photostroms erfolgte bei
diesem System in zwei Stufen. Die erste Verstärkerstufe war direkt im
54 Eigene Untersuchungen
Diodengehäuse montiert, wodurch bei den heute bevorzugt verwendeten
Photodiodensystemen das störende Meßrauschen reduziert wird. Die zweite
Verstärkerstufe war in einem separaten Gehäuse untergebracht.
1. Verstärkerstufe: Als Vorverstärker befand sich ein Strom-Spannungs-Wandler
mit zwei wählbaren Widerständen im Diodengehäuse. Die jeweilige Verstärkung
erfolgte individuell für jede Photodiode. Da die Lichtintensitäten bei
Fluoreszenzmessungen und insbesondere die zu messenden Änderungen der
Fluoreszenz sehr niedrig waren, bewegten sich die Photoströme in der
Größenordnung von einigen pA. Deshalb wurde die Einstellung der Verstärkung
mit 1 GOhm Widerständen gewählt, um diese Photoströme auf Spannungen im
Voltbereich verstärken zu können.
2. Verstärkerstufe: Die Daten wurden durch einen regelbaren 4poligen
Bessel-Tiefpass gefiltert. In den Versuchen wurde eine Grenzfrequenz von
330 Hz gewählt. Die Verstärker konnten wahlweise durch eine externe
Steuerung auf 1x, 200x, 1000x und 2000x geschaltet und mit zwei
verschiedenen Zeitkonstanten Hochpass gefiltert werden, wodurch nur
AC Signalkomponenten durchgelassen wurden. Bei den Versuchen wurde die
Zeitkonstante von 500 ms gewählt.
Die analogen Daten der Verstärkerausgänge wurden mit einem 512-Kanal
Multiplexer einem 12 bit AD-Wandler zur Digitalisierung zugeführt. Die AC-Kopplung
in den individuellen Kanälen erbrachte bei diesem System in Kombination mit dem
AD-Wandler eine effektive digitale Auflösung von 17-20 bits, da durch diesen
Aussteuerungsbereich auch Signale kleinerer Amplitude bei gutem
Signal-Rausch-Verhältnis (s. S. 61) gemessen werden konnten. Der effektive
Aussteuerungsbereich und niedrige Rauschanteil sowie eine
Hochgeschwindigkeitsbilderzeugung („High-speed Imaging“) mit ca. 1600 Rahmen
(„frames“) pro Sekunde (s. Kapitel 3.5) ermöglichten es, Messungen mit
potentiometrischen Farbstoffen am enterischen Nervensystem durchzuführen.
Untersuchungsgut und Methodik 55
3.4.4 Hardware zur Datenerfassung, Datensicherung und SoftwareNeuroPlexTM
Die Datenerfassung erfolgte durch einen Intel Pentium III Computer mit 450 MHz
Prozessor und 256 MB RAM und durch ein Data Aquisition Processor-Board
DAP3200e (Microstar Laboratories Inc., Bellevue, WA, USA). Das DAP-Board
diente zum Einlesen der optischen Daten, Zwischenspeichern und zum Transfer auf
den Rechner. Bei einer Messung mit 464 Dioden und den 8 externen
BNC-Eingängen entstanden mit einer Abtastrate von 1,6 KHz bei 1000 Meßpunkten
rund 1 MB, d.h. bei einer Aufnahmedauer beispielsweise von 10 Sekunden umfaßte
die entstehende Datenmenge ca. 17 MB. Das DAP-Board mit 4 MB RAM limitierte
den Datentransfer durch eine Übertragungsrate von etwa 1,3 µsec per Sample.
Mit diesem Computersystem und durch eine Modifikation der Software
konnten Aufnahmen von 10 Sekunden Dauer konstant reproduzierbar durchgeführt
und eine theoretische Meßdauer von bis zu 27 Sekunden erreicht werden. Der
zuvor für einen Teil der Versuche eingesetzte Intel Pentium I Computer (166 MHz,
64 RAM) ermöglichte nur Aufnahmen mit max. 7-10 Sekunden Dauer, wobei nach
entsprechender Belichtungszeit des Gewebes der Datentransfer auf den Rechner
wiederholt unterbrochen wurde.
Die im Bereich mehrerer Megabyte liegenden Versuchsdaten wurden
zunächst auf der Festplatte des Computers zwischengespeichert und dann im
Anschluß eines Versuches mittels CD-Brenner auf Compact-Disc gebrannt und
zusätzlich auf einem Streamer gesichert.
Die Koordination des Meßablaufes wurde durch die unter dem
Betriebssystem Windows laufende Software NeuroPlexTM (Versionen 2.01, 2.02,
3.01, 4.01 und 4.02, RedShirtImagingTM LLC, Fairfield, CT, USA) gesteuert. Dieses
kommerziell erhältliche Steuerprogramm benutzte die Programmsprache Interactive
Data Language und erforderte für den Betrieb IDL 5.2.1 (Research System Inc,
Boulder CO, USA).
Die Meßergebnisse der 464 Photodioden und die Daten, die von den
8 externen BNC-Eingängen erhalten wurden, wurden nach jeder Messung
entsprechend ihrer Lage im hexagonalen Array stark verkleinert auf dem
56 Eigene Untersuchungen
Computer-Bildschirm dargestellt und konnten einzeln selektiert und vergrößert
werden. Das Programm erlaubte zur Datenanalyse die Wahl verschiedener
Hoch- und Tiefpass-Filter (z. B. Butterworth, Gauß), sowie die Berechnung der
relativen Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) der einzelnen Photodioden (S. 74). Die
Daten der einzelnen Photodioden konnten zur weiteren Bearbeitung und Analyse in
andere Programme exportiert werden (s. Kapitel 3.12).
3.4.5 Schwarzweißkamera, Videobild
Die vital gefärbten Ganglien wurden mittels Videobild kurz nach der optischen
Messung im Fluoreszenzlicht aufgenommen, um die Meßergebnisse der einzelnen
Photodioden und die Nervenzellen im optisch untersuchten Ganglion einander
zuordnen zu können. Die zu Beginn der Versuche verwendete Videokamera
(TK-S310EG, JVC, Tokyo, Japan) erwies sich als nur bedingt geeignet. Es zeigte
sich, daß für die Überlagerung eine empfindliche und im Kontrast variabel
einstellbare Schwarzweißkamera (Mod. 4910, Cohu Inc., San Diego, Californien,
USA) unabdingbar war, um für eine Auswertung auf Einzelzellebene qualitativ gute
Videobilder auch bei verstärkter Hintergrundfärbung und schwierig erkennbaren
Neuronengrenzen zu erhalten.
Die Kamera war über einen binokularen Fototubus am Mikroskop montiert
und wurde über einen Frame-Grabber (Scion Corporation, Frederik, Maryland, USA)
gesteuert. Nach Justieren der Schwarzweißkamera mit dem Photodioden-Array
konnten Videobild und Photodiodenergebnisse im Anschluß an die jeweilige
Versuchsreihe überlagert und zugeordnet werden (s. Abb. 10).
3.5 Ortsauflösung und Zeitauflösung
Mit 464 Photodioden ist eine Meßfläche vorhanden, die die optische Ableitung von
Ganglien, die eine Vielzahl von Neuronen erhalten, erlaubt. Die Identifizierung
einzelner Nervenzellen wird durch eine hohe räumliche Auflösung erreicht. Das
Photodioden-Array befindet sich in der reellen Bildebene des Objektives. Damit ist
Untersuchungsgut und Methodik 57
die erreichte Ortsauflösung nur vom Vergrößerungsfaktor des Objektives und von
der Geometrie des Arrays abhängig. Die Verwendung der in Tabelle 4 aufgeführten
Objektive ergab folgende Werte für Durchmesser und Detektionsfläche pro
Photodiode. Die detektierbare maximale Gesamtmeßfläche ist ebenfalls aufgelistet.
Durchmesserpro
Photodiode
Flächepro
PhotodiodeGesamtfläche
Objektiv: 20er 38 µm 1134 µm² ~ 0,540 mm² 40er 19 µm 283 µm² ~ 0,135 mm²100er 8 µm 50 µm² ~ 0,028 mm²
Fast alle Messungen wurden mit dem 40er Objektiv durchgeführt. Dies bedeutet,
daß bei dieser Vergrößerung auf 1-4 Photodioden das Signal einer einzelnen
Nervenzelle je nach Größe und Lage abgebildet wurde. Unter optimalen
Färbebedingungen mit geringer Färbung des nicht-neuronalen Gewebes konnten
auch bei kleinen Ganglien vereinzelt Messungen mit dem 100er Objektiv erfolgen.
Bei dem 20er Objektiv konnten ebenfalls Fluoreszenzänderungen gemessen
werden, allerdings war die Ortsauflösung pro Photodiode für die bearbeitete
Fragestellung zu gering. Zudem ergaben die relativen Intensitätsänderungen ein
ungünstiges Signal-Rausch-Verhältnis.
Die maximale Abtastrate bei Verwendung aller 464 Photodioden
einschließlich der 8 externen BNC-Eingänge liegt bei 1,6 KHz. Die zeitliche
Auflösung beträgt demzufolge 613 µsec. Sie ist Voraussetzung für die Erfassung
von Potentialänderungen im Millisekundenbereich. Folglich können auch im Bereich
weniger Millisekunden liegende Aktionspotentiale gemessen werden. Durch
Erstellen eines „Subset“‘, d.h. Selektion einzelner Dioden, kann die Abtastrate
wesentlich erhöht werden. Fast alle Messungen wurden aber ohne Reduzierung der
Gesamtmeßfläche mit der vollen Diodenzahl durchgeführt, da das Frameintervall
von 613 µsec selbst für die Darstellung von Aktionspotentialen ausreichte (s. auch
Abb. 20, S. 98).
58 Eigene Untersuchungen
Multi-Site Optical Recording Technique(MSORT)
Versuchskammer mitDi-8-ANEPPSbeladenen Ganglien
Objektiv
VerschlußXenonLampe150 W
II. Überlagerung von Dioden- signalen und Ganglion
I. Videobild eines gefärbten Ganglion (Mensch, PSM)
Filter-block
464 Photodioden
SignalverstärkungEinlesen in Computer
A
B
Orts -, Zeitauflösung: 283 µm², 613 µs
40X
20 µm
∆ F/F= 0,2 %
100 ms
10 ms
Rohdaten Butterworth-Tiefpass
Untersuchungsgut und Methodik 59
Abbildung 10: Schematisierte Darstellung der Multi-Site Optical Recording Technique
(MSORT) mit einem Photodioden-Array bestehend aus 464 Elementen.
Lichtquelle ist eine 150 W Xenonkurzbogenlampe. Aus deren Spektrum wird nach Passage
eines elektronischen Verschlusses das Anregungslicht des Fluoreszenzfarbstoffs (grün)
selektiert und gelangt über Objektive eines hier nicht dargestellten inversen Mikroskops
auf das mit Di-8-ANEPPS beladene Nervengewebe. Das von hier emittierte
Fluoreszenzlicht (rot) wird nach Passage des Filterblocks auf die 464 Photodioden gelenkt.
Nach Verstärkung des Eingangssignals werden die Meßdaten zum Computer
weitergeleitet.
A zeigt die Computerdarstellung mit den Meßergebnissen der 464 hexagonal angeordneten
Photodioden. Die Photodioden, die sich nicht auf der Ganglionfläche befinden, wurden der
besseren Übersicht halber ausgeblendet und sind als glatte Linien abgebildet.
B Eine Photodiode mit einem Nervenzellsignal wurde exemplarisch vergrößert. Links zeigt
das Meßergebnis der Photodiode als unbearbeitetes Wandlersignal. Rechts wurde das
Signal in der NeuroPlex - Software mit einem 170 Hz Butterworth-Tiefpass gefiltert.
Die Amplitude des optischen Signals spiegelt die gemessene relative Änderung der
Fluoreszenz wider verursacht durch Änderung des neuronalen Membranpotentials. Die
zeitliche Auflösung beträgt 613 µs unter Verwendung aller Photodioden. Die
Ortsauflösung liegt beim Einsatz eines 40er Objektivs bei rund 280 µm².
Mit Hilfe eines zugleich aufgenommenen Videobildes (I.) des jeweils untersuchten
Ganglion können die einzelnen Photodiodensignale bei der Datenanalyse so überlagert
werden, daß die Meßergebnisse der einzelnen Photodioden mit den entsprechenden
Neuronen korrespondieren (II.).
60 Eigene Untersuchungen
3.6 Protokoll des Meßzyklus
Der komplette Versuchsablauf wurde zur Vermeidung von Umgebungsstreulicht im
Dunkeln durchgeführt. Folgende Vorgänge wurden bei allen Messungen der
Signalausbreitung eingehalten:
1. Anfärben der Neurone zur optischen Messung
2. Aufnahme der Resting Light Intensities (RLI‘s), d.h. Messung der
Hintergrundfärbung und Verrechnung des Dunkelstromes
3. Einstellung von Aufnahmedauer, Verstärkung und Zeitkonstanten,
ggf. Änderung der Abtastrate und Verminderung der Diodenzahl
4. Starten der Aufnahme
5. Softwaregesteuerte Öffnung des elektronischen Verschlusses, Beginn der
Messung
6. Belichtung des Präparates, Datenerfassung
7. Durchführung der entsprechenden Manipulationen wie elektrische Stimulation
oder Applikation von Pharmaka
8. Softwaregesteuerter Schluß des elektronischen Verschlusses, Ende der
Messung
9. Einlesen der Daten und Darstellung und Betrachtung der Meßergebnisse auf
dem Rechner
3.7 Positionsstabilität und Gewebeimmobilisation
Für die Meßdatenerfassung und –auswertung war die absolute Positionsstabilität
zwischen den Detektoren und dem zu untersuchenden Ganglion von großer
Bedeutung. Auch eine geringe Relativverschiebung zwischen mobilem Objekt und
statischem Detektor würde durch die Ortsabbildungsunschärfe die Aufnahmen
stören und würde damit die Auswertung unmöglich machen. Die durch
Bewegungsartefakte verursachte Ortsunschärfe kann die reizbedingte
Intensitätsänderung überlagern. Die Ursache der resultierenden Intensitätsänderung
ist dann jedoch nicht mehr bestimmbar.
Untersuchungsgut und Methodik 61
Dies ist bei den Messungen insbesondere beim myenterischen Plexus der
Maus durch z.T. erhebliche Muskelkontraktionen zu berücksichtigen. Deshalb wurde
das Muskelrelaxans Nifedipin - ein Calcium-Kanalblocker - in einer
Endkonzentration von 1 µM (bis max. 3 µM) der perfundierten Krebs-Lösung
zugesetzt. Die zusätzlich erforderliche mechanische Immobilisation des Gewebes
erfolgte durch Anfertigen von sog. ‚Druckfüßchen‘ (WOOD u. MAYER 1978). Zwei
Edelstahldrähte wurden in hochkonzentrierter Salzlösung per Elektrolyse zu feinen
sich gleichmäßig verjüngenden Spitzen geätzt und dann annähernd L-förmig
gebogen. Mittels Mikromanipulator konnten die feinen Drahtspitzen mit einem
Abstand von ca. 200 µm präzise neben dem Ganglion plaziert und zwecks
Immobilisation auf dem fragilen Gewebe leicht gespreizt werden. Da beim Plexus
submucosus gleichfalls Änderungen in der Meßposition durch Kontraktionen von
Zirkulärmuskulaturresten sowie Resten der Schleimhautmuskulatur auftreten
konnten, wurde hier die Immobilisation einzelner Ganglien mechanisch
vorgenommen.
3.8 Einfluß verschiedener Faktoren auf das Signal-Rausch-Verhältnis
Bedingt durch die geringen Änderungen der Fluoreszenz (relative
Intensitätsänderung: ~ 10-5 –10-3) stellt das Verhältnis vom Signal zum Rauschen
(S/N) während optischer Messungen das entscheidende apparative Problem bei der
Detektion der Fluoreszenz dar. Das Gesamtstörsignal setzt sich aus einer Vielzahl
verschiedener Rauschkomponenten zusammen und ist damit multifaktoriell.
Systemimmanent ist das Dunkelstromrauschen. Der Dunkelstrom, obwohl bei
diesem Photodiodensystem relativ niedrig (< 10 pA, s. Anhang S. 196), verringert
bei geringen Lichtintensitäten das Signal-Rausch-Verhältnis. Dieses konnte durch
Erhöhung der Beleuchtungsintensität verbessert werden, da bei geringen
Lichtintensitäten eine lineare Beziehung zwischen Intensität und S/N-Verhältnis
existiert. Vorteil ist, daß auch bei vergleichsweise hohen Lichtintensitäten eine
Sättigung der Dioden im Gegensatz zu CCD-Kamera-Systemen nicht erreicht wird.
62 Eigene Untersuchungen
Das Dunkelstromrauschen der Photodioden am Verstärkerausgang konnte bei den
in den Versuchen erzielten Lichtintensitäten (0,5-1,5 x 10-9 Ampere) als
Rauschquelle reduziert werden. Hohe Lichtintensitäten erhöhen allerdings
gleichzeitig auch die Phototoxizität der Farbstoffe (s. Kapitel 3.9.1.1).
Maßgeblich beeinflußt wurde das S/N-Verhältnis bei den Experimenten
weiterhin durch folgende Punkte:
Das Schrotrauschen ist Hauptanteil des Rauschens bei hohen
Lichtintensitäten und liegt in der statistischen Natur der Photonenemission und
-detektion begründet. Es treten Fluktuationen des Lichtstromes aufgrund der
Quantennatur des Lichtes auf: unter Annahme einer idealen Lichtquelle werden im
Durchschnitt n Photonen/ms emittiert. Die Root-Mean-Square (RMS) Abweichung
ist dann die Quadratwurzel von n (BRADDICK 1960; MALMSTADT et al. 1974).
Das S/N-Verhältnis ist in diesem Fall proportional zur Quadratwurzel der
Lichtintensität, die den Photostrom erzeugt. Das S/N-Verhältnis kann durch
Effizienzsteigerung des lichtleitenden Systems und durch Erhöhung der
Beleuchtungsintensität verbessert werden (s. Kapitel 3.4.1). Der Übergang von
Dunkelstromrauschen in Schrotrauschen wurde bei diesem System bei einem
Photostrom von etwa 0,5 x 10-9 Ampere angegeben. Eine hohe
Beleuchtungsintensität erhöht aber wiederum auch die Phototoxizität der
Fluoreszenzfarbstoffe (s. Kapitel 3.9.1.1). Bei Lichtintensitäten im Bereich von
2-5 x 10-9 Ampere konnten bei den eigenen Messungen kaum reproduzierbare
Signalantworten erzielt werden, was auf mögliche photodynamische Schäden
hinweisen könnte.
Bei den jeweiligen Messungen mußte also ein Mittelweg gesucht werden
zwischen gutem S/N-Verhältnis und minimaler Beleuchtungsintensität.
Neben der Belichtungsintensität wird die Größe der Signalamplitude von der
Menge des integrierten Farbstoffes in die neuronale Zellmembran bzw. vom Grad
der Hintergrundfluoreszenz beeinflußt. Eine hohe Farbstoffkonzentration wiederum
ist ein toxizitätsbestimmender Faktor und limitiert die Erhöhung der Signalamplitude.
Des weiteren war zu berücksichtigen, daß ein linearer Zusammenhang
zwischen dem elektrischen Signal des Nervenzellmembranpotentials und dem
Untersuchungsgut und Methodik 63
Fluoreszenzsignal besteht. Die Änderung der Fluoreszenz ist linear zur Änderung
der Membranspannung.
Das S/N-Verhältnis konnte ebenfalls durch die Wahl geeigneter Exzitations-
und Emissionsfilter beeinflußt werden (s. S. 51).
Auf weitere, technische Rauschquellen ist z. T. an entsprechender Stelle
schon eingegangen worden. Beispielsweise konnte das Vibrationsrauschen im
Strahlengang mit einem Frequenzbereich von etwa 1-50 Hz die Messungen
empfindlich stören und mußte soweit wie möglich reduziert werden. Hierzu zählte
die Vermeidung von perfusionsbedingten Bewegungen, die Gewebeimmobilisation,
die Verminderung der Bodenvibrationen durch pneumatische Isolation des
Versuchstisches sowie die Vermeidung akustischer Geräusche.
Der Rauschanteil wurde des weiteren beeinflußt durch den Verzicht auf
Raumbeleuchtung während der Messung, die Faradayabschirmung, die numerische
Apertur der Objektive (s. auch S. 52) sowie die Detektionsempfindlichkeit der
Meßapparatur, das Verstärkerrauschen und Fluktuationen der Licht- und
Spannungsquelle.
3.9 Anfärbung enterischer Neurone mit Fluoreszenzfarbstoffen
3.9.1 Anwendung potentiometrischer Farbstoffe
Obwohl die heute einsetzbaren Farbstoffe in ihren Eigenschaften wesentlich
optimiert sind, mußten bei der Anwendung generell die im folgenden aufgeführten
Aspekte berücksichtigt werden:
3.9.1.1 Phototoxizität
Photodynamischer Schaden tritt auf, wenn vital gefärbte Neurone intensiv und lang
andauernd belichtet werden. Es kommt dann bei optischen Messungen zu einer
Veränderung der Signalamplitude bis hin zum Ausbleiben der Zellantwort, wobei
teilweise auch sichtbare Schädigungen der Zellmembran auftreten.
Farbstoffmoleküle produzieren in Anwesenheit von Sauerstoff und bei intensiver
64 Eigene Untersuchungen
Belichtung reaktiven Singulett-Sauerstoff. Die gebildeten freien Radikale können
ihrerseits mit Membrankomponenten reagieren und können so die Neurone
zerstören (COHEN et al. 1974; POOLER u. VALENZENO 1979; ROSS et al. 1977;
WAGGONER 1976). Eine Desoxygenierung minimiert den photodynamischen
Schaden. Ein völliger Verzicht auf Sauerstoff ist jedoch bei Zellen kontraproduktiv,
die diesen zur Aufrechterhaltung ihres Stoffwechsels benötigen. Um die
photodynamische Zerstörung dieser Zellen so gering wie möglich zu halten, ist
deshalb die effektive Belichtungszeit bei den Versuchen auf das absolut notwendige
Maß zu reduzieren.
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Farbstoffe, insbesondere
Di-8-ANEPPS, zeichnen sich durch ihre relativ geringe Phototoxizität aus. Um
mögliche photodynamische Schäden in den Versuchen noch zu reduzieren, wurde
Krebs-Lösung mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen neben mit Carbogen
(95 Vol% O2, 5 Vol% CO2) und ferner mit sauerstoffreduziertem Corgon (20 Vol%
O2, 5 Vol% CO2, 75 Vol% Argon) begast. Mit beiden Lösungen wurden optische
Messungen am Plexus submucosus des Meerschweinchens durchgeführt.
Unterschiede konnten weder in der optischen Messungen noch in der
anschließenden immunhistochemischen Färbung, in der die Neurone mit dem
neuronalen Marker NSE (s. S. 79) gekennzeichnet wurden, festgestellt werden.
Inwieweit antioxidative Substanzen einen zusätzlichen protektiven Schutz bilden
könnten, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht.
3.9.1.2 Ausbleichen
Mit steigender Belichtungsdauer kommt es bei Fluoreszenzfarbstoffen zu einer
Abnahme der Fluoreszenzintensität. Der Grad des Bleichens ist abhängig von der
Beleuchtungsintensität. Als Ursache wird eine Photoisomerisierung der im Molekül
vorhandenen Doppelbindungen angenommen. Durch möglichst geringe
Belichtungszeiten ist eine Minderung des Ausbleichens bei optischen Messungen
möglich. Bedingt durch die AC-Kopplung des Systems wurde dieses methodisch
Untersuchungsgut und Methodik 65
bedingte Artefakt allerdings nicht oder nur sehr selten in den einzelnen optischen
Aufnahmen sichtbar.
3.9.1.3 Spannungssensitivität
Da die „fast-response“- Farbstoffe nur verhältnismäßig geringe Änderungen der
Fluoreszenzintensität zeigen, muß für die Signalerfassung bei den Versuchen das
Gesamtrauschen des Meßsystems so gering wie möglich gehalten werden.
3.9.2 Vorversuche
Für die Färbungen des enterischen Nervensystems wurden der spannungssensitive
Styrylfarbstoff Di-8-ANEPPS sowie Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ verwendet.
Das einzige in der zugänglichen Literatur beschriebene Verfahren zur
optischen Messung am enterischen Nervensystem (OBAID et al. 1992) wurde als
Basis für die eigenen optischen Untersuchungen genommen.
In mehreren Vorversuchen wurde in Anlehnung an das Protokoll von OBAID
und Mitarbeitern und in dem daraufhin modifizierten Protokoll der enzymatische
Andau am Plexus submucosus des Meerschweinchens durchgeführt und parallel
auch auf den Plexus submucosus der Maus übertragen. Die Integrität des
Gewebes, das Aussehen der Ganglien im Auflicht wurden als Maß für den
Andaugrad genommen und hinsichtlich seiner Reproduzierbarkeit überprüft. Als
weitere qualitative Kriterien wurde die Anfärbbarkeit der Ganglien und die Färbung
des Hintergrundes beurteilt.
In dem anschließenden Versuchsteil wurden Protokolle zur Färbung von
frisch präpariertem und nicht weiter behandeltem Nervengewebe entwickelt,
ausgehend von der von OBAID und Mitarbeitern eingesetzten
Farbstoffkonzentration für Di-8-ANEPPS. Die Vorversuche wurden sowohl am
Plexus submucosus des Meerschweinchens als auch am Plexus submucosus und
Plexus myentericus der Maus durchgeführt.
66 Eigene Untersuchungen
Abschließend wurden die Farbstoffe Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ als
Alternative zu Di-8-ANEPPS auf Anwendbarkeit am Plexus submucosus von Maus
und Meerschweinchen und am Plexus myentericus der Maus überprüft.
3.9.2.1 Protokoll zur enzymatischen Vorbehandlung und Färbung mitDi-8-ANEPPS in Anlehnung an OBAID et al. (1992)
120 min Inkubation bei Raumtemperatur in Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit
100 U/ml Collagenase VII (C-0773, Sigma GmbH, Steinheim, Deutschland)
1 mg/ml Protease IX (P-6141, Sigma GmbH, Steinheim, Deutschland)
10 min Inkubation des Gewebes in Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit folgender
Farbstoff- und Lösungsmittelkonzentration:
100 µg/ml Di-8-ANEPPS (Molecular Probes D-3167, Eugene, OR, USA)
0,95% DMSO (Sigma GmbH, Steinheim, Deutschland)
0,34% Pluronic® F-127 (Molecular Probes P-6867, Eugene, OR, USA)
Di-8-ANEPPS, DMSO und Pluronic® F-127 wurden als Stammlösung angesetzt.
3.9.2.2 Variation des Protokolls zur enzymatischen Vorbehandlung
Es wurden verschiedene Inkubationszeiten (60 min, 45 min, 30 min, 20 min und
10 min) jeweils bei Raumtemperatur und bei 37 °C erprobt, wobei das Gewebe sich
in Carbogen-begaster Krebs-Lösung mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen
von Collagenase VII (50; 100; 150 U/ 3ml) und Protease (0,75; 1,5 mg/ 3ml) befand.
3.9.2.3 Färbeprotokoll mit extrazellulärer Applikation von Di-8-ANEPPSan frisch präpariertem Gewebe
Ansetzen der Farbstoffstammlösung
Der Farbstoff Di-8-ANEPPS wurde in einer 13,5 mM Stammlösung mit 80 % DMSO
und 20 % Pluronic® F-127 angesetzt. Diese Stammlösung wurde bei 4 °C
Untersuchungsgut und Methodik 67
lichtgeschützt gelagert. Vor Beginn der Versuche wurde die Stammlösung in einem
Ultraschallbad bei ca. 40 °C für 5-10 Minuten erwärmt und dadurch homogen
vermengt. Die entsprechende Menge Farbstofflösung wurde dann der gewünschten
Menge Krebs-Lösung hinzugefügt.
A. ‚Systemische‘ Färbung
Das jeweilige präparierte und schon auf die Einmal-Sylgard®-Platte aufgespannte
Gewebe wurde mit verschiedenen Farbstoffkonzentrationen in Carbogen-begaster
Krebs-Lösung mit unterschiedlicher Inkubationsdauer und Inkubationstemperatur
inkubiert. Nach der Färbeprozedur wurde das Gewebe in Krebs-Lösung gespült und
dann in die Versuchskammer montiert.
• Plexus submucosus Meerschweinchen
Farbstoffkonzentration: 80 µM, 40 µM, 20 µM und 10 µM
Inkubationstemperatur: im Wasserbad bei 37 °C
Inkubationsdauer: 10 min, 15 min und 20 min
• Plexus submucosus Maus
Farbstoffkonzentration: 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, 2 µM und 1 µM
Inkubationstemperatur: im Wasserbad bei 4° C, 25° C und 37° C
Inkubationsdauer: 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 90 min, 120 min
• Plexus myentericus Maus
Farbstoffkonzentration: 160 µM, 40 µM und 20 µM
Inkubationstemperatur: im Wasserbad 37 °C
Inkubationsdauer: 10 min und 20 min
B. ‚Lokale‘ Färbung
Ausgehend von den Ergebnissen des vorhergehenden Protokolls für die
systemische Färbung wurde die lokale Applikation der Farbstofflösung mittels einer
Spritzpipette (Herstellung s. Kapitel 3.10) entwickelt. Die Di-8-ANEPPS-Lösung
68 Eigene Untersuchungen
wurde in einer Konzentration von 200 µM und 400 µM Farbstoff in die Kapillare
gefüllt, die an ein druckluftgesteuertes Mikroejektionsystem angeschlossen wurde
und die mittels Mikromanipulator direkt oberhalb auf das schon in der
Versuchskammer befindliche Gewebe plaziert werden konnte. Der Farbstoff wurde
mit geringen Volumina bei ausgeschalteter Perfusion für 10-20 Sekunden lokal auf
das zu untersuchende Ganglion appliziert. Nach einer Inkubationsdauer von
1-2 Minuten wurde die Perfusion wieder eingeschaltet. Der Färbegrad wurde visuell
in Intervallen von fünf Minuten überprüft. Außerdem wurden optische Messungen
zur Beurteilung des Färbegrades durchgeführt.
3.9.2.4 Einsatz von Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ bei Maus undMeerschweinchen
Die beiden potentiometrischen Farbstoffe Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ wurden
am Plexus submucosus des Meerschweinchens und sowohl am Plexus
submucosus als auch am Plexus myentericus der Maus auf Anwendbarkeit
überprüft. Die beiden Chromophore wurden basierend auf dem Protokoll für die
lokale Färbung mit Di-8-ANEPPS in folgenden Konzentrationen auf die
verschiedenen Ganglien appliziert:
Di-8-ANEPPQ wurde in einer Konzentration von 200 µM und 400 µM eingesetzt.
Di-4-ANEPPS wurde in einer Konzentration von 5, 10 und 20 µM lokal auf die
Ganglien appliziert.
3.9.3 Hauptversuche
3.9.3.1 Ansetzen des Farbstoffes Di-8-ANEPPS
Di-8-ANEPPS wurde mit DMSO zu einer 13,5 mM Stammlösung angesetzt und bei
4 °C lichtgeschützt gelagert. Da nach oftmaligem und mehrwöchigem Gebrauch ein
Ausfallen der Farbstofflösung bzw. eine reduzierte Zellfärbung beobachtet werden
konnte, wurde die Stammlösung in 60 µl Aliquods aufbewahrt. Das Detergenz
Pluronic® F-127, das die Integration des lipophilen Farbstoffes in die Zellmembran
Untersuchungsgut und Methodik 69
förderte, wurde jeweils in einer Konzentration von 2,75 mg/ 10 µl Stammlösung erst
am Versuchstag selbst hinzugefügt.
Pluronic® F-127 wurde mit Krebs-Lösung in einem Eppendorfgefäß angesetzt
und im Ultraschallbad bei ca. 40 °C für 5-10 Minuten gelöst.
Die aliquotierte Stammlösung wurde ebenfalls im Ultraschallbad bei ca. 40 °C
für 5-10 Minuten erwärmt, um eine gleichmäßige Vermischung von Farbstoff und
Lösungsmittel zu gewährleisten. Dann wurde die entsprechende Menge
Stammlösung zu der Krebs-Lösung mit Pluronic® F-127 hinzugefügt. Diese
Farbstoff-Krebs-Lösung wurde ebenfalls für einige Minuten im Ultraschallbad
belassen.
3.9.3.2 Färbung des enterischen Nervensystems
Zur Färbung des enterischen Nervensystems wurden die zwei im Rahmen dieser
Arbeit etablierten Methoden zur extrazellulären Farbstoffapplikation am frischen
Gewebe angewendet:
A. ‚Systemische‘ Färbung
Das folgende Färbeprotokoll fand ausschließlich beim Plexus submucosus des
Meerschweinchens Anwendung.
Das präparierte und schon auf die Einmal-Sylgard®-Platte aufgespannte
Gewebe wurde in der Farbstoffgesamtlösung mit 20 µM Di-8-ANEPPS für 10-15
Minuten bei 37 °C inkubiert und währenddessen permanent mit Carbogen begast.
Anschließend wurde das gefärbte Gewebe vier- bis fünfmal für je 1-2 Minuten in
Krebs-Lösung gespült und dann in die Kammer montiert.
Konzentration: 20 µM, Di-8-ANEPPS
Applikationsart: Gewebebad mit 37 °C für die Dauer der Inkubation
Menge: 4-6 ml Farbstoff-Krebs-Lösung
Inkubationsdauer:10-15 Minuten
Integrationszeit: 30 Minuten-5 Stunden
70 Eigene Untersuchungen
B. ‚Lokale‘ Färbung
Diese Färbemethode wurde hauptsächlich bei der Maus und am Humangewebe
angewendet.
Di-8-ANEPPS wurde in einer Konzentration von 200 µM verwendet. Die
Farbstoff-Krebs-Lösung wurde in eine Spritzpipette (Herstellung s. Kapitel 3.10)
gefüllt, die an ein druckluftgesteuertes Mikroejektionssystem angeschlossen war.
Der Farbstoff wurde bei ausgeschalteter Perfusion über einen Zeitraum von 10-20
Sekunden in der Versuchskammer unmittelbar auf das zu färbende Ganglion
appliziert. Die Verteilung des Farbstoffes konnte im Durchlicht verfolgt werden. Das
Ejektionsvolumen lag bei 3,75 nl ± 0,95 pro Sekunde (n=6). Die Perfusion wurde
nach einer Inkubationsdauer von max. einer Minute wieder eingeschaltet. In der sich
anschließenden Integrationszeit - sie betrug in Abhängigkeit vom untersuchten
Gewebe für das jeweilige Ganglion 5-15 Minuten und markierte den Beginn der
Meßreihe - verankerte sich der gebundene Farbstoff in die Membran. War die
Färbeintensität noch nicht ausreichend, wurde der Vorgang wiederholt.
Konzentration: 200 µM, Di-8-ANEPPS
Applikationsart: Spritzpipette für 10-20 sec
Menge: 400 µl Farbstoff-Krebs-Lösung
Inkubationsdauer: max. 1 Minute
Integrationszeit: 5-15 Minuten
3.10 Stimulation enterischer Neurone
Um enterische Neurone zu aktivieren, wurden neben elektrischer Stimulation
interganglionärer Nervenstränge auch direkt chemische Substanzen auf die
Ganglien appliziert.
Für die elektrische Stimulation enterischer Neurone wurden selbst
hergestellte monopolare Platinelektroden mittels Mikromanipulator auf verschiedene
interganglionäre Nervenbahnen plaziert. Die Platinelektroden bestanden aus einem
∅ 25 µm feinen, teflonisolierten Draht (MedwireR, Leico Industries, New York, USA),
der aus einem ca. 7 cm langen Glasschaft ragte, an dessen Ende er mit einer
Untersuchungsgut und Methodik 71
Steckvorrichtung verlötet wurde. Für die elektrische Stimulation waren die
Elektroden an einen Stimulusisolator (A 360, WPI, New Haven, CT) angeschlossen,
bei dem die Stromstärke im Bereich von 1 µA bis 10 mA variiert werden konnte.
Dieser war mit einer Steuereinheit (Pulsgenerator Master-8, A.M.P.I., Jerusalem,
Israel) gekoppelt, von der aus der Reizbeginn manuell getriggert und die Reizdauer
(400 µs) kontrolliert werden konnte. Ein Kanal der Steuereinheit, der parallel mit
dem Stimuluspuls getriggert wurde, wurde an die externen BNC-Eingänge des
Photodioden-Systems angeschlossen, damit Stimulationszeitpunkt und Anzahl der
gegebenen Pulse parallel zur optischen Messung aufgezeichnet und festgehalten
werden konnten.
Die Platinelektroden wurden in einer Entfernung von 200-600 µm zum jeweils
untersuchten Ganglion auf den Nervensträngen plaziert. Um sowohl schnelle als
auch langsame erregende postsynaptische Potentiale zu erzeugen (f EPSP und
s EPSP), wurden zwei Stimulationsarten verwendet. Es wurden einzelne Pulse
(Anzahl: 1-5 Pulse) unterschiedlicher Stromstärke (30-120 µA) zur Generierung von
über- und unterschwelligen f EPSP gegeben sowie Pulssalven (Anzahl: 20; 50 oder
100 Pulse, Frequenz: 20 Hz, Dauer: 1; 2,5 oder 5 sec) zur Auslösung von s EPSP.
Als Referenzelektrode im Bad diente eine Ag-AgCl-Pellet-Elektrode (EP2, WPI, FL,
USA).
Um Erregungsverteilungen innerhalb enterischer Ganglien erstmals zu
untersuchen, wurde die Aktivität innerhalb eines Ganglion nach elektrischer
Stimulation interganglionärer Nervenbahnen gemessen und neuropharmakologisch
untersucht (Kapitel 3.11). Bei oral-anal markierten Geweben wurden
interganglionäre Nervenstränge oral bzw. anal des zur Untersuchung stehenden
Ganglion elektrisch stimuliert. Als oral bzw. anal wurden die Nervenstränge definiert,
die vor bzw. hinter einer vertikal zur oral-anal Richtung gezogenen Linie durch das
entsprechende Ganglion verliefen.
Zur chemischen Stimulation der Nervenzellen wurden Acetylcholin bzw.
hyperosmolare Kaliumchlorid-Lösung (s. Kapitel 8.4) mit Spritzpipetten direkt auf
das zu untersuchende Ganglion appliziert. Die Spritzpipetten wurden aus
Borosilikatglas-Kapillaren (Kwik-FilTM, WPI, Berlin) hergestellt, die mit einem
72 Eigene Untersuchungen
Flaming-Brown-Puller (P-87, Sutter Instruments, San Rafael, USA) für diesen
Zweck geformt wurden. Die Parameter wurden so gewählt, daß Spritzpipetten mit
relativ parallel verlaufendem englumigen Schaft und schnell verjüngender Spitze
entstanden. Die Spitze mußte jeweils abgebrochen werden, um Spritzpipetten mit
dem notwendigen relativ konstanten Lumen zu erhalten. Die mit Pharmaka gefüllten
Spritzpipetten wurden in einen Spezialhalter montiert. Die Ejektion des Pharmakon
erfolgte mittels Druckluft (200 kPa). Über ein Steuergerät konnte eine der drei
verschiedenen Spritzplätze des Spezialhalters angewählt werden und die Dauer der
Applikation (5 ms-1000 ms) bestimmt werden. Das Ejektionsvolumen betrug
3,75 nl ± 0,95 pro Sekunde (n= 6). Dieses Steuergerät wurde ebenfalls über die
Steuereinheit angewählt und war an die externen BNC-Eingänge des
Photodiodensystems angeschlossen, um ebenfalls den Applikationszeitpunkt und
die Applikationsdauer des Pharmakons während der optischen Messung
festzuhalten.
3.11 Neuropharmakologische Untersuchung
Um die optisch gemessene Aktivität zu charakterisieren, wurden verschiedene
Pharmaka und Antagonisten eingesetzt, die eine Einstufung in nervale und
synaptische Aktivität erlaubten und die spezifische Rezeptoren enterischer Neurone
identifizieren konnten. Die im Folgenden aufgeführten Pharmaka wurden
überwiegend perfundiert oder wurden mittels Spritzpipette, wie bei der chemischen
Stimulation beschrieben, auf das Ganglion appliziert. Applikationsart, Konzentration
und Anwendungsdauer der eingesetzten Substanzen sind jeweils im Anhang
Kapitel 8.4 aufgeführt:
• Tetrodotoxin (TTX) Blockade Na+-Kanal abhängiger Aktivität
• Cobald-/Cadmiumchlorid-Lösung Blockade synaptischer Übertragung
• Ca2+-depletierte Lösung Blockade synaptischer Übertragung
• Hexamethonium, Mecamylamin Blockade nikotinerger Rezeptoren
• Atropin Blockade muskarinerger Rezeptoren
• Suramin Blockade purinerger Rezeptoren.
Untersuchungsgut und Methodik 73
3.12 Datenanalyse, Auswertung der optischen Signale und Statistik
Bei der Analyse der Meßdaten wurden zunächst das Videobild des untersuchten
Ganglion und das Hexagon, das die Messung der 464 Photodioden beinhaltete,
überlagert, um für die Signalzuordnung die genaue Position des Ganglion auf den
Photodioden zu erhalten. Hierfür war zuvor ein skaliertes Videobild auf das
Hexagon projiziert und dem Maßstab des Hexagon entsprechend angepaßt worden.
Die Meßergebnisse der einzelnen Photodioden, die sich im Bereich der
Ganglionfläche befanden, wurden auf Signalantworten manuell durchgemustert. Die
Software erlaubte es, mehrere Photodioden gleichzeitig und in vergrößerter und
expandierter Form zu betrachten. Durch die auf den 8 externen BNC-Eingängen
während der Messung eingespeisten Daten über Strompulsgabe und
Pipettenapplikation konnten diese mit den Nervenzellantworten in Beziehung
gesetzt werden. Bei meßbarer Faseraktivität nach interganglionärer
Faserstimulation wurde die Ausbreitungsgeschwindigkeit auf der Nervenfaser
berechnet und als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.
Anhand des Videobildes und unter Zuhilfenahme der anschließend
gewonnenen immunhistochemischen Daten (s. Kapitel 3.14), wurde die
Nervenzellzahl pro Ganglion bestimmt. Aufgrund der Photodiodenergebnisse wurde
nach Überlagerung mit dem Videobild der Anteil auf Stimulation aktivierter und nicht
aktivierter Neurone festgestellt, sowie der Anteil der Neurone ermittelt, die ohne
Stimulation Aktivität zeigten. Der Anteil wurde prozentual für jedes Ganglion
gesondert berechnet. Alle Ganglien wurden als Mittelwert ± Standardabweichung
der einzelnen prozentualen Anteile angegeben. Der Medianwert wurden ebenfalls
für alle Werte errechnet. Gleiches erfolgte für die elektrische Stimulation oral bzw.
anal eines Ganglion, hier wurden zusätzlich die 25 %- und 75 %-Perzentile
angegeben. Um eine Vergleichbarkeit mit vorhandenen Literaturdaten aus
intrazellulären Ableitungen zu ermöglichen, wurden die Ergebnisse neben der
prozentualen Verteilung innerhalb der Ganglien ebenfalls auf die
Gesamtneuronenzahl bezogen und prozentual berechnet.
74 Eigene Untersuchungen
Bei Applikation von Acetylcholin wurde für die aktivierten Neurone die
Frequenz sowie die Dauer der Entladung während des Meßzeitraums ermittelt.
Eine Beziehung zwischen Gangliongröße und prozentualem Anteil spontan
aktiver Neurone sowie zwischen Gangliongröße und prozentualem Anteil der durch
Einzelpulsstimulation aktivierten Neurone wurde mit dem Rangkorrelationstest nach
Spearman getestet. Bei Vergleichen zwischen elektrophysiologisch
charakterisierten Neuronengruppen und ihrer immunhistochemischen
Transmitterkodierung (s. Kapitel 3.14) wurde der exakte Mehrfeldertest nach
R. A. Fischer zur Überpüfung der Homogenität zweier Häufigkeiten verwendet. Bei
Vergleichen von Signaldauern wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse mit
nachfolgenden multiplen Vergleichen (Dunnett’s Test) durchgeführt. Insgesamt
wurden bei der statistischen Auswertung Unterschiede als signifikant gewertet,
wenn der P-Wert kleiner als 0,05 war.
Bei der optischen Messung kann anders als bei intrazellulären
elektrophysiologischen Ableitungen nur während des kurzen Zeitraumes der
Belichtung das elektrophysiologische Verhalten der Neurone gemessen und
aufgezeichnet werden. Um spontane Aktivität messen zu können, wurde die Form
der 'Leeraufnahme' für die eigenen Untersuchungen eingeführt. Dabei handelt es
sich bei der sog. 'Leeraufnahme' um einen Meßzeitraum, in dem keine Stimulation
erfolgt. Es wurde in der vorliegenden Arbeit diejenige Aktivität als spontan definiert,
die in einer ‚Leeraufnahme‘ oder vor einer Stimulationsfolge im Verlauf einer
Meßperiode auftrat. Bei der in einer ‚Leeraufnahme‘ registrierten Aktivität wurden
die Zeitintervalle zwischen den jeweiligen Signalen berechnet. Die Anzahl der
gemessenen Signale wurde ebenfalls ermittelt und bezogen auf den gesamten
Meßzeitraum als durchschnittliche Signalfrequenz angegeben.
Die Amplitude der optischen Signale wurde als relative Änderung der
Fluoreszenz (∆F/F) in Prozent berechnet. Die Intensitäten des Wandlersignals
waren in mV angegeben. Diese Rohdaten wurden durch die jeweiligen RLI‘s der
Photodioden und durch den entsprechenden Verstärkungsfaktor (s. Kapitel 3.4.3)
dividiert und in relative Fluoreszenzänderung in Prozent umgerechnet. Die
optischen Daten zeigen somit nur relative Änderungen der Fluoreszenz (∆F/F) an.
Untersuchungsgut und Methodik 75
Durch die entsprechende Wahl der Filter und unter Berücksichtigung des
Empfindlichkeitsspektrums der Farbstoffe führte ein zunehmendes
Membranpotential zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Meßdaten konnten mit
Hilfe der Software invertiert werden, so daß alle in dieser Arbeit dargestellten
Fluoreszenzsignale mit zunehmendem Membranpotential durch die Invertierung
eine ebenfalls ansteigende Amplitude besitzen.
Anders als bei konventionellen intrazellulären Zellableitungen war bei der
Analyse der optischen Meßdaten ein Vergleich der Absolutwerte der
Signalamplituden zwischen verschiedenen Messungen nicht aussagekräftig, da
keine Absolutfluoreszenzen gemessen wurden. Die Signalamplitude spiegelte eine
relative Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) wider und war damit von Messung zu
Messung verschiedenen Störfaktoren, wie z. B. Bleichen und Veränderung der
Hintergrundfärbung ausgesetzt, so daß ein Rückschluß auf die Größe oder absolute
Änderung des Membranpotentials anhand der absoluten Werte der
Signalamplituden nicht möglich war.
Die Meßpunkte der Photodioden konnten aus dem NeuroPlexTM-Programm
als ASCII-Format exportiert und in anderen Programmen (z. B. Igor Pro,
WaveMetrics Inc., Oregon, USA) weiter bearbeitet werden.
3.13 Signal-Raum-Zeitstruktur-Analyse
Um die zeitliche und räumliche Erregungsausbreitung innerhalb eines Ganglion
nach elektrischer Stimulation erstmals zu kartieren, wurden die einzelnen
Meßergebnisse der Photodioden mit der NeuroPlexTM-Software fehlfarbenkodiert.
Jeder Meßpunkt der 464 Dioden wurde einem Farbwert zugeordnet und die Punkte
desselben Meßzeitpunktes bildeten jeweils ein Bild. Dies ist in Abbildung 11
schematisch dargestellt. Bei der für die Darstellung gewählten Farbsequenz
kodieren die roten Farbtöne die Maximumamplitude eines Signals. Die für jeden
Meßpunkt gebildeten pseudokolorierten Bilder konnten einzeln dargestellt werden
(s. Abb. 11) oder in einer Filmsequenz mit variabel einstellbarer Bildrate abgespielt
werden, wodurch sich die Aktivitätslevel nach unterschiedlichen
76 Eigene Untersuchungen
Stimuluslokalisationen besser verdeutlichen ließen. Diese Filmsequenz konnte
außerdem als MPEG-Format exportiert werden. Deskriptiv wurde untersucht, wie
nach Einzelstimulation die zeitliche und räumliche Abfolge der Erregung innerhalb
enterischer Ganglien verlief.
Abbildung 11: Darstellung der räumlichen und zeitlichen Erregungsausbreitung innerhalb
eines Ganglion nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs anhand
fehlfarbenkodierter Bilder.
A Videobildaufnahme eines mit Di-8-ANEPPS vital gefärbten submukösen Ganglion des
Menschen.
B Die Meßergebnisse der 464 Photodioden des elektrisch stimulierten Ganglion sind stark
verkleinert als Hexagon gezeigt. Die Dioden, die sich nicht auf der Ganglionfläche und den
interganglionären Nervensträngen befinden, sind ausgeblendet und als gerade Linien
dargestellt. Aus der Ganglionmitte ist ein Diodensignal vergrößert worden, das mit einem
170 Hz Butterworth-Tiefpass der NeuroPlex -Software gefiltert ist. Exemplarisch ist für
18 Punkte die Abtastrate von 613 µs hervorgehoben. Die Meßwerte der Dioden werden zur
Kartierung der Erregungsausbreitung einem entsprechenden Farbwert der abgebildeten
Farbskala zugeordnet. Dabei kodieren rote Farbwerte den Maximalwert der
Signalamplitude.
C zeigt die sich daraus für alle mit einem 170 Hz Butterworth-Tiefpass gefilterten Dioden
ergebende fehlfarbenkodierte Karte dieses Ganglion. Die dargestellte Sequenz von
18 Bildern umfaßt eine Dauer von 10,2 ms, die sich aus der Abtastrate von 613 µs ergibt.
Die ausgeblendeten Dioden außerhalb des Ganglion wurden mit einem einheitlichen
Farbwert versehen. Anhand dieser Karten kann die zeitliche und räumliche
Erregungsausbreitung innerhalb eines Ganglion und entlang der Nervenstränge visualisiert
werden. In diesem Fall ist zu erkennen, wie die Erregung (rot) entlang der stimulierten
Nervenfaser (roter Pfeil) in das Ganglion eintritt und es über die Ganglionmitte auf der
gegenüberliegenden Seite wieder verläßt. Bei 6,6 ms erkennt man, wie im rechten Bereich
sich ein Erregungsfeld zeitlich verzögert entwickelt. Die Filmsequenz („movie“) ist auf der
Webseite http://www.tiho-hannover.de/einricht/phys/ag_schemann /index.html zu finden.
Untersuchungsgut und Methodik 77
0 ms 1.2
1.8
0.6
2.4 3.0
3.6 4.2 4.8
5.4 6.0 6.6
7.2 7.8 8.4
9.0 9.6 10.2 ms
Kartierung der Erregungsausbreitung innerhalb enterischerGanglien nach Stimulation eines interganglionären
Nervenstrangs
A C
10 ms
20 µm
B
78 Eigene Untersuchungen
3.14 Immunhistochemie
Im Anschluß an die fluoreszenzoptischen Messungen wurden die Humangewebe
und Gewebe des Meerschweinchens immunhistochemisch aufbereitet und mit
ausgewählten neuronalen Markern gefärbt, um einen kombinierten Einsatz von
optischer und immunhistochemischer Technik zu erproben und um zusätzlich zu
den optischen Daten Aussagen über Transmitterkodierungen zu erhalten.
Für die immunhistochemische Charakterisierung wurde die Versuchskammer
ausgebaut und das noch auf der Sylgard®-Platte aufgespannte Gewebe direkt im
Anschluß an die Versuche in 4%iger Paraformaldehydlösung (s. Kapitel 8.5) für
4 Stunden bei Raumtemperatur oder für 12 Stunden im Kühlschrank fixiert. Alle im
weiteren verwendeten Lösungen sind in Kapitel 8.5 aufgelistet.
Die 4%ige Paraformaldehydlösung wurde entfernt und das fixierte Gewebe
wurde 3 x 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 M Phosphatpuffer (PBS)
gewaschen. Die Sylgard®-Platte wurde verworfen und das Gewebe wurde bis zur
weiteren Verarbeitung in PBS mit 0,1 % Natriumazid (PBS/NaN3) bei 4 °C im
Kühlschrank verwahrt.
Dadurch, daß das Gewebe während der Fixierprozedur auf der
Sylgard®-Platte belassen wurde, konnte ein starkes Schrumpfen oder Verziehen
des Gewebes weitgehend vermieden werden, so daß die optisch untersuchten
Ganglien relativ einfach wieder aufgefunden werden konnten.
3.14.1 Präinkubation
Die Präparate wurden zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen im Gewebe
in einer Lösung bestehend aus 4 % Pferdeserum oder Ziegenserum (Horse IgG
bzw. Goat IgG, Firma Sigma, Dreisenhofen), 0,5 % Triton X-100
(t-Octylphenoxypolyethoxethanol, Firma Sigma, Dreisenhofen) und PBS/NaN3 für
60 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln (Taumelgerät Teak III,
Heidolph) präinkubiert. Das Detergenz Triton X-100 diente zur Permeabilisierung
der Zellmembran. Die Wahl des Serums war abhängig von der Herkunft der
gewählten Antikörper (s. Tabelle 5, Tabelle 6). Diese für die Präinkubation
Untersuchungsgut und Methodik 79
beschriebene Lösung wurde in allen folgenden Arbeitsschritten als Basislösung
verwendet, der die jeweiligen Antikörper zugesetzt wurden.
3.14.2 Primäre Antikörper
Das Gewebe wurde in die Lösung mit den verschiedenen primären Antikörpern
(s. Tabelle 5, Tabelle 6), in unterschiedlicher Konzentration verbracht und für 16
Stunden bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln inkubiert. Bei den
humanen Geweben wurde aufgrund der Präparatdicke die doppelte Inkubationszeit
gewählt. Dies galt auch für alle weiteren Arbeitsschritte. Am Ende der
Inkubationszeit wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS jeweils für
10-15 Minuten die überschüssigen, nicht gebundenen Antikörper entfernt.
Folgende Transmitter und neuronale Marker sollten immunhistochemisch
nachgewiesen werden:
Cholinerger Marker: Cholinacetyltransferase (ChAT)
Neuropeptide: Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP)
Substanz P (SP)
Neuronale Marker: Neuronen-spezifische Enolase (NSE)
Anti-Human neuronales Protein HuC/HuD-biotinilisiert
(Anti-Hu)
Die bei den verschiedenen Präparaten verwendeten Antikörper sind in
Tabelle 5 und 6 aufgelistet.
Tabelle 5: Primäre Antikörper, die beim Gewebe des Meerschweinchens verwendet wurden.
Antigen Tierart Typ Konzentration Code Hersteller
ChAT Ziege polyclonal 1:100 AB144P Chemicon, Temecula, USA
VIP Kaninchen polyclonal 1:1000 RIN-7161 Peninsula Laboratories,Belmont, USA
NSE Kaninchen polyclonal 1:3000 16625 Polysciences, Warrington,USA
80 Eigene Untersuchungen
Tabelle 6: Primäre Antikörper, die beim Humangewebe verwendet wurden.
Antigen Tierart Typ Konzentration Code Hersteller
ChAT Kaninchen polyclonal 1:1500 P3YEB SCHEMANN et al. 1993
VIP Maus monoclonal 1:1000 MaVIP91278
East Acres Biologicals,Southbridge, USA
SP Ratte monoclonal 1:1000 10-SO 15 Fitzgerald, Concord, USA
Anti-Hu Maus monoclonal 1:50 A-21272 Molecular Probes, Eugene,
USA
Die immunhistochemische Identifizierung von bis zu drei Transmittern konnte
parallel erfolgen, da die verwendeten primären Antikörper aus verschiedenen
Spezies stammten. Am Humangewebe erfolgte eine Dreifachfärbung mit ChAT, SP
und VIP und beim Meerschweinchen eine Zweifachfärbung mit ChAT und VIP. Um
einen zusätzlichen Einsatz neuronaler Marker trotz identischer Herkunftsspezies zu
ermöglichen, wurden die Gewebe erst nach Beendigung und Auswertung der
inmmunhistochemischen Transmitter-Färbungen mit den entsprechenden
neuronalen Markern erneut gefärbt.
3.14.3 Sekundäre Antikörper
Die primären Antikörper wurden zur Sichtbarmachung über einen Zeitraum von
4 Stunden mit sekundären, Fluorophor-gekoppelten Antikörpern inkubiert. Um die
Fluoreszenz zu verstärken, wurde in einigen Fällen vor Zugabe der Fluorophor-
gekoppelten Antikörper das Gewebe für 4 Stunden in Biotin-gekoppeltem
sekundären Antiserum inkubiert. Die sekundären, affinitätsgereinigten Antiseren
(Ziege bzw. Esel) waren mit folgenden Fluorophoren konjugiert (Jackson Labs,
Dianova, Hamburg):
• Carboxymethylindocyanin (Cy 3);
(anti-Ziege IgG, anti-Kaninchen IgG; Verdünnung 1:500)
• Carbocyanin (Cy 2)
(anti-Kaninchen IgG; Verdünnung 1:200)
Untersuchungsgut und Methodik 81
• Dichlorotriazinyl Aminofluorescin (DTAF);
(anti-Maus IgG; Verdünnung 1:200)
• 7-Amino-4-Methylcoumarin-3-Acetat (AMCA);
(anti-Ratte IgG; Verdünnung 1:50)
• Indodicarbocyanin (Cy 5);
(anti-Maus IgG; Verdünnung 1:500)
Am Ende der Inkubationszeit wurden die Gewebe wiederum dreimal mit PBS
jeweils für 10-15 Minuten gewaschen, so daß die überschüssigen, nicht
gebundenen Antikörper entfernt wurden. Die Gewebe wurden auf Poly-l-Lysin
beschichteten Objektträgern ausgebreitet, in Citifluor® AF 1 (Canterbury,
Großbritannien) eingebettet, um den Prozeß des Ausbleichens der Fluoreszenz zu
verlangsamen, und wurden dann mit einem Deckglas bedeckt.
3.14.4 Immunfluoreszenzmikroskop und Auswertung
Die immunhistochemisch gefärbten Präparate wurden an einem inversen
Fluoreszenzmikroskop (IX 70-S1F, Olympus, Tokyo, Japan) ausgewertet. Die mit
der optischen Methode untersuchten Ganglien konnten anhand ihrer Lokalisation im
fixierten Präparat wieder aufgefunden und anhand ihrer Morphologie eindeutig
identifiziert werden. Durch das Eindeckeln waren sie allerdings teilweise in ihrer
ursprünglichen Form etwas verzogen. In der folgenden Tabelle 7 sind die
verschiedenen Filterblöcke zur Anregung der Fluorophore aufgelistet.
Tabelle 7: Filterblöcke für die unterschiedlichen Fluorophore der Immunhistochemie
Filterblock- FilterblockFluorophor bezeichnung I Exzitationsfilter Dichroitischer Spiegel Emissionsfilter
AMCA (blau) U-MWU II BP 330-385 DM 400 BP 460-490
Cy 2/DTAF (grün) U-MNIBA II BP 470-490 DM 505 D 520/20
Cy 3 (rot) U-M41007 HQ 545/30X 565 DCLP HQ 610/75M
Cy 5 (infrarot) U-M41008 HQ 620/60 Q660 LP HQ 700/75I Angaben stammen aus Datenblättern der Firma Olympus, Hamburg bzw. Chroma
Technology, Brattelboro, USA. II Filterblöcke sind modifiziert.
82 Eigene Untersuchungen
Die Filterkombinationen erlaubten die überschneidungslose Analyse der
Fluorophore. Die Ganglien wurden mit einer Schwarzweißkamera (Mod. 4910, Cohu
Inc., San Diego, Californien, USA) aufgenommen. Diese war mit einem Computer
(Macintosh Power PC 8100/100) verbunden und wurde über die
Bildanalysesoftware IPLab Spektrum 3.1 (Signal Analytics, Vienna, Virginia, USA)
gesteuert. Im Falle des im Infrarotbereich fluoreszierenden Cy 5 konnte nur über
diese Kamera die Analyse erfolgen.
83
4 Ergebnisse
4.1 MSORT: Etablierung der Färbemethode und Vorversuche1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11T 1 2 3 4 5 6 7
4.1.1 Enzymatisch vorbehandeltes Gewebe
Die von OBAID und Mitarbeitern (1992) beschriebene enzymatische Vorbehandlung
am Ileum konnte für die eigenen Versuche am Kolon so nicht verwendet werden.
Das Häutchenpräparat des Plexus submucosus war sowohl bei der Maus als auch
beim Meerschweinchen nach diesem enzymatischen Protokoll nicht mehr in der
Versuchskammer aufzuspannen.
In Abänderung dieses Protokolls wurde der Grad der enzymatischen
Zersetzung (Dissoziation) durch Variation von Inkubationszeit, Enzymkonzentration
und Temperatur beeinflußt. Generell erwies sich der Andaugrad bei einer
Inkubationstemperatur von 37 °C als besser reproduzierbar verglichen mit der
Inkubation bei Raumtemperatur. Zwar konnten durch 35minütige Inkubation von
50 U/ ml Collagenase VII und 0,5 mg/ ml Protease beim Meerschweinchen und
durch eine 10minütige Inkubation von 50 U/ 3 ml Collagenase VII und 0,75 mg/ 3 ml
Protease auch bei der Maus erstmals Ganglien angefärbt und optische Signale
abgeleitet werden, jedoch erwies sich der Andaugrad der Gewebe von Maus und
Meerschweinchen trotz konstanter Behandlungsprozedur als nicht ausreichend
reproduzierbar. Zudem schritt die Zersetzung des Gewebes auch nach Ende der
Enzymbehandlung und selbst nach mehrmaligem Auswaschen stetig voran. Die
Ganglien erschienen bei Betrachtung im Auflicht nach wenigen Stunden alsbald
granulär und vakuolig.
Der für die zu bearbeitende Fragestellung reproduzierbar gleichbleibende
Zersetzungsgrad des Gewebes konnte somit weder bei der Maus noch beim
Meerschweinchen erzielt werden.
84 Eigene Untersuchungen
4.1.2 Frisch präpariertes Gewebe
4.1.2.1 ‚Systemische‘ Färbung
Plexus submucosus des Meerschweinchens
Mit der von OBAID und Mitarbeitern (1992) eingesetzten Konzentration des
Farbstoffes Di-8-ANEPPS konnten bei den eigenen Versuchen optische Signale
selbst bei kurzen Belichtungszeiten (< 3 Sekunden) im Plexus submucosus des
Meerschweinchens nicht reproduzierbar erhalten werden. Entweder blieben die
Signale bei erneuter Belichtung vollständig aus, oder zeigten sich um erheblich
verbreitert und in ihrer Amplitude stark verkleinert.
Die Reduzierung der von OBAID verwendeten Farbstoffkonzentration um fast
90 % auf 20 µM erbrachte für den Plexus submucosus des Meerschweinchens die
erforderliche Reproduzierbarkeit der optischen Antwort über mehrere Stunden
Versuchsdauer mit einer Gesamtbelichtungszeit von weit über 30 Sekunden. Die
optischen Antworten zeigten auch nach wiederholter Belichtung eine vergleichbare
Signalcharakteristik. Eine für die optische Messung ausreichende Färbung konnte
durch 10-15minütige Inkubation bei 37 °C erzielt werden. Durch die Verwendung
von frischem, nicht enzymatisch behandeltem Gewebe verstärkte sich allerdings die
Färbung des nun vorhandenen, überwiegend aus Bindegewebe und
Muskulaturresten bestehenden nicht-neuronalen Gewebes. Die damit verbundene
Erhöhung der Hintergrundfluoreszenz führte zu einer Verringerung des
Signal-Rausch-Verhältnisses, beeinträchtigte aber die Detektierbarkeit optischer
Signale nicht wesentlich.
Plexus submucosus der Maus
Am frisch präparierten Plexus submucosus der Maus erbrachte das ursprüngliche
Farbstoffprotokoll von OBAID und Mitarbeitern keine Signalantworten. Auch die
Variation der Parameter von Farbstoffkonzentration (1, 2, 5, 10, 20, 40, 80 µM),
Inkubationszeit (5, 10, 20, 40, 60, 90, 120 min) und Inkubationstemperatur (4, 25,
37 °C) führte bei der gesamthaften Färbung des Gewebes zu keinen optisch
meßbaren Nervenzellantworten.
Ergebnisse 85
Plexus myentericus der Maus
Im Plexus myentericus der Maus konnten nur bei einer Farbstoffkonzentration von
160 µM und einer Inkubationszeit von 20 Minuten vereinzelt Signale gemessen
werden, die aber größtenteils schnell in ihrer Amplitude ab- und stetig in ihrer Dauer
zunahmen. Das Nervengewebe erschien nach kurzer Belichtung körnig und blasig.
Reproduzierbare Signale über mehrere Meßzyklen konnten nicht erzielt werden.
Weiterhin war die Hintergrundfluoreszenz durch verstärkte Integration des
Farbstoffes in Muskelfaserreste der Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur erheblich.
Auch bei Veränderung der Färbeparameter konnte keine geeignete
Farbstoffkonzentration gefunden werden, die eine optimale und gleichbleibend gute
Nervenzellableitung am Plexus myentericus ermöglichte oder zumindest erwarten
ließ.
4.1.2.2 ‚Lokale‘ Färbung
Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte lokale Spritzapplikation einer
hochkonzentrierten Farbstofflösung von Di-8-ANEPPS auf die im Auflicht
aufgefundenen Ganglien erbrachte erstmals auch am frischen Gewebe des Plexus
submucosus der Maus optische Signale. Beim Plexus submucosus des
Meerschweinchens ermöglichte diese Art der Farbstoffapplikation teilweise eine
Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses.
Die Spritzapplikation einer 200 µM Di-8-ANEPPS Farbstofflösung für 10-20
Sekunden erzielte für die optischen Messungen einen guten Färbegrad des
Nervengewebes. Das Ausschalten der Perfusion noch über die Farbstoffapplikation
hinaus ermöglichte eine bessere Farbstoffanreicherung in dem zu untersuchenden
Ganglion und unterband gleichzeitig ein unerwünschtes Verteilen des Farbstoffes
auf die Ganglionumgebung. Ein einminütiges Ausschalten der Perfusion erschien
für die Farbstoffverteilung ausreichend, um möglichst schnell das Gewebe nach
Einschalten der Perfusion wieder mit sauerstoffangereicherter Krebs-Lösung zu
versorgen. Nach etwa 5-15 Minuten blieb die Färbung eines Ganglion nahezu
konstant, so daß nach diesem Zeitraum mit den ersten optischen Messungen
86 Eigene Untersuchungen
begonnen werden konnte. Da sich der Färbegrad des Gewebes mit der 400 µM
Farbstofflösung nur unwesentlich unterschied, wurde für die weiteren Versuche die
geringer konzentrierte Farbstofflösung (200 µM) gewählt, um die Konzentration des
Lösungsmittels DMSO möglichst niedrig zu halten.
Beim Plexus myentericus der Maus und des Menschen konnte durch diese
Applikationsart mit Di-8-ANEPPS keine optisch meßbare Signalantwort erreicht
werden. Die auf dem Plexus vorhandenen Muskelfasern wurden innerhalb kurzer
Zeit intensiv gefärbt. Eine ausreichende Färbung des neuronalen Gewebes konnte
mit der lokalen Farbstoffapplikation auch nach mehrmaligem Wiederholen der
Färbeprozedur nicht erreicht werden.
4.1.3 Tauglichkeit der angewendeten Färbemethoden für frischesGewebe
Bei dem Vergleich der beiden Färbemethoden zeigten sich Unterschiede in der
Färbecharakteristik des Gewebes. Die sich bei erfolgreicher Färbeprozedur mit
Di-8-ANEPPS für die jeweilige Färbetechnik ergebenden Unterschiede sind im
Folgenden als Vor- und Nachteile der jeweiligen Technik aufgeführt.
4.1.3.1 Vor- und Nachteile der ‚systemischen‘ Färbung
Vorteil:
• Anfärben einer Vielzahl von Ganglien im Gewebe gleichzeitig möglich
• nach Aufsuchen eines potentiellen Ganglion im Durchlicht kann ggf. die sofortige
Bestätigung im Fluoreszenzlicht erfolgen; geeignet für unklare Ganglion-
identifizierung im Durchlicht
• Zeitgewinn durch vorhergehende Färbung des Gewebes bei der Untersuchung
einer Vielzahl von Ganglien und mehrstündiger Versuchsdauer
Nachteil:
• höhere Hintergrundfluoreszenz als bei der ‚lokalen‘ Färbung
• Dauer zwischen Färbung der Ganglien und ihrer Untersuchung sehr variabel;
dadurch stark unterschiedliche Integrationszeit
Ergebnisse 87
• Bei mehrstündiger Versuchsdauer teilweise Farbstoffinternalisierung möglich
• Keine Überprüfung und Steuerung des Färbegrades möglich
• Belichtung noch nicht untersuchter, aber schon gefärbter Ganglien durch
Streustrahlung
4.1.3.2 Vor- und Nachteile der ‚lokalen‘ Färbung
Vorteil:
• niedrige Hintergrundfluoreszenz
• Überprüfung und Steuerung des Färbegrades eines Ganglion
• Nachfärbung möglich, Ausbleicheffekte können dadurch ausgeglichen werden.
• Für jedes Ganglion annähernd gleiche Integrationszeit, so daß auch bei über
mehrere Stunden andauernder Versuchsdauer kaum Farbstoffinternalisierung
beobachtet werden konnte.
Nachteil:
• Ganglien müssen für die lokale Färbung im Auflicht identifiziert werden können
• relativ aufwendige Färbeprozedur bei der Untersuchung mehrerer Ganglien
4.1.4 Färbecharakteristik und Eignung von Di-8-ANEPPS sowieseiner Derivate Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ
Die Untersuchungen in den Vor- und Hauptversuchen ergaben: Di-8-ANEPPS ist für
die optische Messung am enterischen Nervensystem von Maus, Meerschweinchen
und des Menschen in unterschiedlichem Maße geeignet und zeigt verschiedene
Färbecharakteristika. Bei den Geweben, bei denen Di-8-ANEPPS nicht optimal
erschien, wurden die Derivate Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ auf ihre Eignung
getestet.
Als Bemessungsgrundlage für die Eignung des jeweiligen Farbstoffes wurden
folgende visuell wahrnehmbare und mit der optischen Meßtechnik erfaßbare
Kriterien zugrunde gelegt:
88 Eigene Untersuchungen
- Anfärbbarkeit, Darstellbarkeit von interganglionären Fasern, Ganglien und
Neuronen in der Vitalfärbung
- Anteil von aufgefundenen zu anfärbbaren Ganglien
- Maß der unspezifischen Farbstoffintegration in Bindegewebe und Muskulatur
- Messung der Fluoreszenzintensität und Durchführbarkeit der optischen Messung
4.1.4.1 Humangewebe
Di-8-ANEPPS färbte beim Plexus submucosus des Menschen nahezu alle
aufgesuchten und lokal gefärbten enterischen Ganglien an, unabhängig von der
Darmregion. Die Umrisse der vital gefärbten Ganglien und interganglionären
Nervenstränge waren im Fluoreszenzlicht bei mehr als zwei Dritteln der Ganglien
gut von der unspezifischen Hintergrundfärbung abzugrenzen. Im Vergleich zum
Nervengewebe zeigte sich eine schwache Färbung des Bindegewebes. Die
Umrisse der Nervenzellen stellten sich als helle Bezirke im Gegensatz zu dem
dunkel erscheinenden Zellsoma dar (Abb. 12 links), so daß einzelne Nervenzellen
schon in der potentiometrischen Färbung des vitalen Humangewebes identifiziert
werden konnten. Ein Vergleich der Di-8-ANEPPS Aufnahmen vital gefärbter
Ganglien mit denen der anschließend fixierten und immunhistochemisch
aufbereiteten Ganglien bestätigte dies. Wie Abbildung 12 exemplarisch zeigt, sind
die mit dem neuronalen Marker Anti-Hu immunhistochemisch identifizierten
Nervenzellen des fixierten Ganglion ebenfalls in der potentiometrischen Vitalfärbung
desselben Ganglion erkennbar. Optische Signalantworten konnten bei rund 95 %
der individuell angefärbten submukösen Ganglien erhalten werden.
Es zeigte sich, daß sich Di-8-ANEPPS für Untersuchungen am submukösen
Humangewebe sehr gut eignete und eine effektive Versuchsdurchführung erlaubte.
Hingegen färbte sich im Plexus myentericus (n= 4 Gewebe) die Muskulatur
unabhängig von der Färbetechnik intensiv mit Di-8-ANEPPS. Das Nervengewebe
konnte weder im Fluoreszenzlicht visuell wahrgenommen werden, noch war es
möglich, optische Signale abzuleiten. Di-8-ANEPPS erwies sich für Untersuchungen
am myenterischen Plexus als nicht geeignet. Auch die Farbstoffe Di-4-ANEPPS und
Ergebnisse 89
Di-8-ANEPPQ ermöglichten ebenfalls keine optische Messung. Sie zeigten
hinsichtlich ihrer Färbecharakteristik eine mit der des Plexus myentericus der Maus
vergleichbare Färbung (s. Kapitel 4.1.4.2).
20µm 20µm
Abbildung 12: Enterisches Ganglion im Plexus submucosus des Menschen dargestellt in
der Vitalfärbung mit Di-8-ANEPPS und als Immunfluoreszenzaufnahme. Links zeigt die
Fluoreszenzaufnahme des vitalen Ganglion beladen mit dem spannungssensitiven
Farbstoff Di-8-ANEPPS. Durch die hellen Umrisse und dunklen Zellkörper sind die
Nervenzellen (n= 9) im Farbstoff-beladenen Ganglion deutlich zu erkennen. Rechts zeigt
die immunhistochemische Darstellung desselben Ganglion nach Fixierung. Mittels des
Fluorophor-gekoppelten Antikörpers Anti-Hu wurden spezifisch nur neuronale Zellkörper
markiert. Die einzelnen Nervenzellen sind durch ihre hellen Zellkörper zu erkennen. Alle
Nervenzellen des immunhistochemisch untersuchten Ganglion sind auch in der linken
Di-8-ANEPPS Färbung wie in einem Negativbild zu erkennen. Der Pfeil kennzeichnet
exemplarisch eine Nervenzelle.
4.1.4.2 Gewebe der Maus
Bei der Maus färbte Di-8-ANEPPS im Plexus submucosus des Kolon selbst bei
lokaler Farbstoffapplikation nur vereinzelt Ganglien mit ihren interganglionären
Nervensträngen, hingegen wurden Bindegewebe und Muskulaturreste intensiv
gefärbt. Allein von den im Fluoreszenzlicht sichtbaren Ganglien - das sind nach
Farbstoffapplikation weniger als 10 % - konnten Signalantworten erhalten werden.
90 Eigene Untersuchungen
Diese Ganglien stellen sich dann allerdings, wie in Abbildung 13 gezeigt,
vergleichbar mit denen des Menschen dar. Im Plexus myentericus zeigte sich eine
intensive Färbung verbliebener Muskulaturreste bei schemenhaft gefärbten
Ganglien (s. Abb. 14), von denen nur sporadisch Signale auf den interganglionären
Nervensträngen abgeleitet werden konnten. Di-8-ANEPPS zeigte sich für den
Plexus submucosus der Maus nur sehr bedingt geeignet. Eine effektive
Versuchsdurchführung war durch das nicht reproduzierbare Anfärben submuköser
Ganglien nicht gegeben. Für den Plexus myentericus der Maus war Di-8-ANEPPS
nicht geeignet. Zwischen den beiden Inzuchtstämmen BALB/cJ und C57BL/6
konnten bei der Anfärbbarkeit des Plexus submucosus und des Plexus myentericus
keine Unterschiede festgestellt werden.
Das ebenfalls im murinen Plexus submucosus und Plexus myentericus je an
drei Geweben getestete Farbstoffderivat Di-4-ANEPPS erwies sich als nicht
tauglich. Dieser gleichfalls extern applizierte Farbstoff internalisierte bei einer
Konzentration von 5 µM, 10 µM und 20 µM innerhalb weniger Minuten bis zu einer
halben Stunde in das Zellinnere. Dies ist in Abbildung 14 bei einem Großteil der
Neurone am Beispiel des Plexus myentericus zu erkennen. Charakteristischerweise
hob sich bei der Farbstoffinternalisation der dunkle Zellkern vom hellen Zellsoma
ab. Eindeutige Zellsignale waren dann nicht mehr zu erhalten. Wie in Abbildung 14
dargestellt, waren Ganglionumrisse und Zellgrenzen nur kurz nach der
Farbstoffapplikation gut sichtbar.
Der an vier Geweben zusätzlich getestete Farbstoff Di-8-ANEPPQ war bei
der Maus im Färbeverhalten mit Di-8-ANEPPS vergleichbar und bot keine
Alternative.
Abbildung 13: Vitales Ganglion im submukösen Plexus
der Maus gefärbt mit Di-8-ANEPPS. Die Nervenzellen
(n= 9) sind durch ihre hellen Umrisse zu erkennen. Die
Färbung des Hintergrundes beruht auf der verstärkten
Integration des Farbstoffes in nicht-neuronales Gewebe,
bei der Maus hauptsächlich aus Bindegewebe bestehend.20µm
Ergebnisse 91
Abbildung 14: Die drei Abbildungen stellen
Fluoreszenzaufnahmen von Ganglien im Plexus
myentericus der Maus dar, die mit einem 40er
Objektiv aufgenommen wurden.
Oben ist das mit Di-8-ANEPPS lokal
gefärbte Ganglion in der linken Bildhälfte nur
andeutungsweise zu erkennen (s. Pfeile).
Typischerweise färbt Di-8-ANEPPS bei der Maus
die Zellumrisse nicht an. Hingegen deutlich
erkennbar sind die hell gefärbten im Bild längs und
quer verlaufenden Muskulaturreste. In der rechten
Bildhälfte sind Ganglionkonturen nicht mehr von
der Hintergrundfärbung abzugrenzen.
In der Mitte ist ein Ganglion kurz nach der
Farbstoffapplikation mit Di-4-ANEPPS dargestellt.
Die Nervenzellen sind anhand ihrer hellen Umrisse
zu erkennen (Pfeil). Auffällig sind verglichen mit
der oberen Abbildung die nur undeutlich gefärbten
Muskulaturreste.
Unten ist ein mit Di-4-ANEPPS gefärbtes
Ganglion zu sehen, bei dem fast alle Nervenzellen
die für die Farbstoffinternalisation typische
Färbung des Zytoplasmas unter Aussparung des
Zellkerns („Spiegeleicharakteristik“) zeigt. Die
Pfeile markieren zwei solcher Nervenzellen.
Optische Signale konnten in diesem Fall nicht
mehr abgeleitet werden. 20µm
20µm
20µm
92 Eigene Untersuchungen
4.1.4.3 Gewebe des Meerschweinchens
Beim Meerschweinchen waren bei den mit Di-8-ANEPPS gefärbten submukösen
Geweben Ganglionumrisse und Nervenzellgrenzen teilweise schwierig von der
Hintergrundfärbung abzugrenzen (s. Abb. 15). Ohne immunhistochemische Färbung
war allein anhand der potentiometrischen Färbung eine eindeutige
Nervenzellidentifizierung selten möglich. Jedoch konnten die im Auflicht
aufgesuchten Ganglien stets gefärbt und bei nahezu allen Ganglien optische
Zellantworten abgeleitet werden, bei ebenfalls reproduzierbar guten
Signalantworten.
Di-4-ANEPPS internalisierte, wie bei der Maus, ebenfalls innerhalb kurzer
Zeit selbst bei einer Konzentration von 5 µM in die Neurone und war für die optische
Registrierung an submukösen Neuronen im Kolon nicht geeignet. Die Applikation
von Di-8-ANEPPQ auf fünf Ganglien des Plexus submucosus führte zu einer von
Di-8-ANEPPS nicht unterscheidbaren Ganglionfärbung und optischen
Signalantwort.
20µm 20µm
Abbildung 15: Diese Abbildungen zeigen die Fluoreszenzaufnahme eines vitalen Ganglion
im Plexus submucosus des Meerschweinchens. Links ist das Ganglion mit Di-8-ANEPPS
(200 µM) gefärbt. Die Zellgrenzen der Neurone sind allerdings beim Meerschweinchen,
verglichen mit Maus und Mensch, nur schemenhaft zu erkennen. Rechts zeigt dasselbe
Ganglion, zusätzlich gefärbt mit Di-4-ANEPPS (10 µM) 20fach geringer konzentriert als
Di-8-ANEPPS. Im Ganglion sind die neuronalen Zellkerne als dunkle Rundungen zu
erkennen, heller sind das Soma und die Zellumrisse. Diese Somafärbung ist charakteristisch
für eine Internalisation des Farbstoffs. Für Di-4-ANEPPS ist dies charakteristisch im Kolon
des Meerschweinchens.
Ergebnisse 93
4.2 Validierung optischer Signale neuronaler Herkunft1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15T 1 2 3 4 5 6 7
Optische Signale, die mit der MSORT von dem mit Di-8-ANEPPS beladenen
Darmgewebe von Maus, Meerschweinchen und des Menschen registriert wurden,
sollten zuerst auf ihre neuronale Herkunft hin untersucht werden.
Gängige, in elektrophysiologischen Experimenten verwendete chemische
und elektrische Stimuli wurden eingesetzt, um Nervenzellerregung auszulösen. Die
mit den Nervenzellen korrespondierenden Photodioden wurden daraufhin auf die
induzierte, optisch meßbare Nervenzellerregung untersucht. Die neuronale Herkunft
der mit der MSORT registrierten Aktivität wurde in Kombination mit
neuropharmakologischen Untersuchungen untermauert. Zudem wurden die
Signaldauer sowie der Signalverlauf zur Charakterisierung der optisch registrierten
Aktivität hinzugezogen.
Im folgenden werden die verschiedenen optisch gemessenen
Nervenzellantworten allgemein beschrieben und differenziert.
4.2.1 Chemische Stimulation
An vital gefärbten enterischen Neuronen wurden depolarisierende Änderungen des
Membranpotentials durch lokale Spritzapplikation von hyperosmolarer
Kaliumchloridlösung (100 mM) und des exzitatorischen Neurotransmitters
Acetylcholin (ACh; 0,5 mM) induziert. Die entsprechenden Photodioden wurden auf
optische Nervenzellaktivität überprüft.
Die extrazelluläre Erhöhung des Kaliums verursachte
Membrandepolarisationen, die auch in den optischen Messungen auf den
korrespondierenden Photodioden als transiente Änderung der Fluoreszenzintensität
detektiert werden konnten (s. Abb. 16).
Die lokale Applikation des Neurotransmitters ACh führte ebenfalls zu
meßbaren transienten Fluoreszenzänderungen. Diese nach Applikation von ACh
gemessenen Signale blieben in Anwesenheit des nAChR-Antagonisten
Mecamylamin aus, was auf eine Blockade der ACh-Wirkung schließen ließ (n= 17
Neurone). Die Signalantwort trat jedoch nach Auswaschen des rezeptorspezifischen
94 Eigene Untersuchungen
nAChR-Antagonisten wieder auf (s. Abb. 17). Nicht beeinflußt wurden die durch
lokale ACh-Applikation ausgelösten optischen Signale durch Calcium-depletierte
Lösung (n= 9 Neurone) (s. Abb. 18, Ia). Da Calcium-depletierte Lösung nur die
synaptische Übertragung blockiert, konnte damit die direkte postsynaptische
Wirkung von ACh nachgewiesen werden. In einem von der ACh-Applikationsstelle
entfernten und nicht direkt stimulierten Ganglion konnte hingegen die zeitlich etwas
verzögerte, optisch meßbare Aktivität durch die Calcium-depletierte Lösung
blockiert werden, wodurch die synaptische Herkunft der im benachbarten Ganglion
registrierten Signale belegt werden konnte (s. Abb. 18).
Die fluoreszenzoptisch erhaltenen Signale zeigten eine Dauer von etwa
4-6 ms mit einem steilen An- und Abstieg der Signalamplitude und ähnelten in ihrer
Signalcharakteristik konventionell intrazellulär abgeleiteten Aktionspotentialen.
Abbildung 16: Meßdaten einer Photodiode von einem mit Di-8-ANEPPS gefärbten
enterischen Neuron im Plexus submucosus der Maus nach Spritzapplikation von
hyperosmolarer Kaliumchloridlösung (links) und von Acetylcholin (rechts). Die „Peaks“
sind gemessene Änderungen der Fluoreszenz infolge neuronaler Membrandepolarisation
und entsprechen Aktionspotentialen. Die Signalamplitude ist als relative Änderung der
Fluoreszenz (∆F/F) angegeben. Während des Meßzeitraumes von 3,2 s konnten nach Gabe
von hyperosmolarer Kaliumchloridlösung 14 Aktionspotentiale mit einer
durchschnittlichen Entladungsfrequenz von 7 Hz registriert werden. Die Gabe von
Acetylcholin führte bei demselben Neuron zur Auslösung von 29 Aktionspotentialen mit
einer durchschnittlichen Entladungsfrequenz von 20 Hz. Die Daten wurden mit einem
Butterworth-Tiefpass bei 200 Hz gefiltert.
∆F/F= 0,1%
500 ms
Kaliumchloridlösung (100 mM) Acetylcholin (0,5 mM)
ACh500 ms
KCl1 s
Ergebnisse 95
Abbildung 17: Optisch registrierte Aktivität eines submukösen Ganglion der Maus nach
Spritzapplikation von Acetylcholin (500 ms; 0,5 mM). A In der Fluoreszenzaufnahme (JVC
Kamera) sind Nervenzellen (a-e) zu erkennen sowie interganglionäre Nervenstränge (*).
Rechts und links sind die Meßergebnisse der korrespondierenden Photodioden nach Gabe
von 500 ms ACh gezeigt. Die Aktivität der Nervenzellen a und e ist mit expandierter
Zeitachse in B dargestellt. Die lokale Applikation des nAChR-Antagonisten Mecamylamin
1 s vor ACh-Gabe blockiert die ACh induzierte Aktivität. Nach Auswaschen des
Antagonisten kann die ACh-Antwort wieder registriert werden.
500 msc
d
b
a
e ∆F/F
= 0,
2 %ACh 500 ms
A
∆F/F= 0,2 %
1 s Mecamylamin (1 mM)
1 min Auswaschen
4 min Auswaschen
eaB
ACh 500 ms ACh 500 ms
20 µm
cd
ba
e
*
*
**
500 ms
96 Eigene Untersuchungen
Abbildung 18: Optisch registrierte Aktivität zweier muriner submuköser Neurone in ver-
schiedenen Ganglien. A Fluoreszenzbild der beiden Ganglien I und II. B Auf Ganglion I
wurde lokal ACh (0,5 mM; 500 ms) appliziert, hingegen nicht auf Ganglion II. Der
Applikationszeitpunkt auf Ganglion I ist auch bei Ganglion II markiert ( ). Neuron I a zeigt
eine durch Ca2+-depletierte Lösung unbeeinflußte ACh-Antwort, die erst durch den nAChR-
Antagonisten Mecamylamin blockiert wird. Die zeitlich verzögert auftretende Aktivität in
Neuron II a kann hingegen durch Ca2+-depletierte Lösung blockiert werden.
AChII
I
Auswaschen
Calcium-depletierte Lösung (1,25 mM Calcium)
Mecamylamin (200 µM)∆F
/F=
0,1%
200 ms
20 µm
A B
ACh
II
I
ACh
ACh
ACh
I a II a
a
a
Ergebnisse 97
4.2.2 Elektrische Stimulation
Nach elektrischer Stimulation von interganglionären Nervensträngen wurde Aktivität
der interganglionären Nervenstränge und von der Ganglionzellen auf den
korrespondierenden Photodioden abgeleitet.
4.2.2.1 Interganglionäre Nervenstränge
Auf den interganglionären Nervensträngen konnte nach Stimulation die neuronale
Herkunft der optisch registrierten Aktivität durch reversible Blockierung mit dem
Neurotoxin Tetrodotoxin (TTX) nachgewiesen werden (s. Abb. 19). Die Dauer der
Signale lag im Bereich von 3-8 ms und die Signalcharakteristik zeigte den für
Aktionspotentiale typischen steilen Anstieg und Abfall der Signalamplitude. Es
zeigte sich, daß eine Verringerung des verwendeten Abtastintervalls von 0,6 ms auf
0,1 ms die Darstellbarkeit des Nervenstrangaktionspotentials nicht verbesserte
(s. Abb. 20). Die Signaldauer lag mit dem Abtastintervall von 0,613 ms bei
Nervenstrang TTX(0,3 µM)
Auswaschen
∆ F/F=0,5 %
5 ms
260
µm
Abbildung 19: Aktivität eines
interganglionären Nervenstrangs
nach dessen elektrischer
Stimulation (Pfeil) registriert auf
zwei verschiedenen Photo-
dioden. Das Summenaktions-
potential wird durch das Neuro-
toxin TTX reversibel blockiert.
Auf der 260 µm entfernten
Photodiode wird das Aktions-
potential zeitlich um ca. 0,6 ms
verzögert registriert. Die
Meßdaten wurden mit einem
Butterworth-Tiefpass bei 170 Hz
gefiltert.
98 Eigene Untersuchungen
4,6 ± 0,9 ms und die relative Änderun
(n= 18), verglichen mit einer Aktionspo
0,73 ± 0,19 (n= 18) bei einem Ab
unterschieden sich nicht sign
Ausbreitungsgeschwindigkeit der Aktion
4.2.2.2 Überschwellige und untepostsynaptische Potentia
Die elektrische Stimulation interganglio
von Nervenzellen in enterischen Gan
der Nervenzellkörper zeigten eine opti
und dem Amplitudenverlauf mit der v
vergleichbar war. Diese optisch gem
12 ms, zeigten eine langsame Abnahm
der konventionellen Elektrophysiol
Hexamethonium blockiert werden.
Neuropharmakologie jedoch, daß sich
verschiedenen Komponenten zusamme
∆ F/F= 0,5 %
1 msAbtastintervall0, 106 µs
Abtastintervall0,613 µs
Abbildung 20: Aktivität eines inter-
ganglionären Nervenstrangs nach elektrischer
Stimulation registriert mit zwei verschiedenen
Abtastraten. Eine Erhöhung der Abtastrate
von 1,6 kHz auf 9,4 kHz und Verkleinerung
des Abtastintervalls (°) von 0,613 µs auf
0,106 µs führt zu keiner signifikant besseren
Darstellbarkeit der Summenaktionspotential-
dauer.
g der Fluoreszenz (∆F/F) bei -0,68 ± 0,18
tentialdauer von 4,6 ± 0,9 ms und ∆F/F von
tastintervall von 0,1 ms. Diese Werte
ifikant voneinander. Die berechnete
spotentiale lag im Bereich von 0,2-0,5 m/s.
rschwellige schnelle erregendele (f EPSP) sowie Nervenfaserpotentiale
närer Nervenstränge führte zur Aktivierung
glien. Die korrespondierenden Photodioden
sche Signalcharakteristik, die von der Dauer
on f EPSP aus intrazellulären Ableitungen
essenen f EPSP dauerten stets mehr als
e der Amplitude und konnten - wie auch in
ogie - durch den nAChR-Antagonisten
Bei einigen Signalen zeigte die
die optisch registrierte Aktivität aus zwei
nsetzte:
Ergebnisse 99
- aus einer Aktionspotential-ähnlichen Hexamethonium-insensitiven Komponente
in der frühen Phase der Depolarisation (s. Abb. 21) und
- aus einer Hexamethonium-inhibitiven oder Hexamethonium-sensitiven
Komponente in der späten Phase der Depolarisation (s. Abb. 21, Pfeil).
Bei diesen gemischten optischen Antworten wurde die späte Phase der
Depolarisation durch Calcium-depletierte Lösung ebenfalls vollständig blockiert
(s. Abb. 21). Dies untermauerte die synaptische Herkunft dieser späten
Komponente und zeigte die Existenz von f EPSP. Hingegen konnte die frühe,
Abbildung 20: Expandierte Diodensignale gemessen auf einem interganglionären
Nervenstrang (oben) und auf einer Nervenzelle (unten) nach elektrischer Stimulation mit
Einzelstrompulsen (Pfeile) im Plexus submucosus des Menschen. Die obere Reihe zeigt
die Aufnahme von Axonspikes, die nicht durch Hexamethonium oder
Calcium-depletierte Lösung in ihrer Dauer beeinflußt werden. Die untere Reihe zeigt die
optische Aktivität eines Neuron, bei der ein Teil der Nervenzellantwort -in der späten
Phase der Depolarisation (unterbrochener Pfeil)- durch Hexamethonium und durch
Calcium-depletierte Lösung blockiert wird. Dies läßt auf eine gemischte Antwort von
synaptisch vermitteltem f EPSP (Pfeil) und „process potential“ schließen.
Kontrolle
50 ms
Hexamethonium(200 µM)
∆F/F= 0,2%
Auswaschen Calcium-depletierteLösung (0,25 mM)
100 Eigene Untersuchungen
Aktionspotential-ähnliche Phase der Depolarisation ebenso wie Aktionspotentiale
von interganglionären Nervensträngen in Anwesenheit Calcium-depletierter Lösung
nicht blockiert werden (s. Abb. 21). Tetrodotoxin (TTX) blockierte stets diese
fluoreszenzoptisch gemessenen Signale, wodurch eindeutig die neuronale Herkunft
gezeigt werden konnte. Diese registrierte Aktivität deutete auf
Nervenzellfortsatzaktivität im Sinne der „process potentials“ hin. Diese
Hexamethonium-insensitive und durch Calcium-Depletion nicht blockierbare
optische, Aktionspotential-ähnliche Signalform wurde hinsichtlich ihrer Herkunft
nicht weiter differenziert.
Beim Einsatz von Calcium-depletierter Lösung und von Cobald-Cadmium-
Lösung traten Effekte auf, die den Einsatz dieser Lösungen bei den optischen
Untersuchungen einschränkte. So konnten bei einigen Ganglien nach Auswaschen
der Lösung keine Signale mehr abgeleitet werden, selbst nach kurzer
Belichtungszeit. Teilweise trat nach 10-15 minütiger Perfusion auch eine irreversible
Verbreiterung der optischen Signalantwort auf, was gerade bei Aktionspotentialen
auffiel. Die Erhöhung der Calciumkonzentration in der Calcium-depletierten Lösung
von 0,25 mmol auf 1,25 mmol zeigte eine Verlangsamung der auftretenden
Wirkung. Weder eine Veränderung der Hintergrundfluoreszenz noch eine visuelle
Veränderung der Nervenzellen konnte beobachtet werden. Da mögliche toxische
Effekte nicht auszuschließen waren, wurden nur die Ganglien in die Auswertung
miteinbezogen, bei denen die Wirkung reversibel war.
Repetitive Gabe von Einzelstrompulsen während eines Meßzyklus führte in den
optischen Signalen teilweise zu einer Abschwächung sowie zu einer Verstärkung
der f EPSP-Charakteristik. Dies deutete generell darauf hin, daß mit der optischen
Methode sowohl „Rundown“ als auch Summation erfaßt werden konnten (Abb. 22).
Insgesamt zeigte sich ein hohes Maß an Übereinstimmung hinsichtlich der optisch
gemessenen Nervenzellantworten und den Daten aus der konventionellen
Elektrophysiologie hinsichtlich des Signalverlaufes und der Signaldauer.
Ergebnisse 101
4.2.2.3 Langsame erregende postsynaptische Potentiale (s EPSP)
Nach elektrischer Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs durch Gabe
von Pulssalven über eine extrazelluläre Elektrode konnten in der weiteren
stimulationsfreien und mehrere Sekunden andauernden optischen Meßperiode
transiente Fluoreszenzänderungen gemessen werden, die Aktionspotentialen
glichen und auf die Existenz von s EPSP hindeuteten. Die langsame Depolarisation
der Zellmembran während eines s EPSP konnte mit diesem System nicht
Abbildung 21: Optische Aktivität dreier Neurone eines submukösen Ganglion des Meer-
schweinchens nach elektrischer Stimulation (s. Pfeile) eines interganglionären Nerven-
strangs. Umrisse von Ganglion und Lokalisation der drei Neurone sind auf dem
Photodioden-Array rechts eingezeichnet. Neuron a zeigt zwei überschwellige f EPSP ( )
mit abnehmender Amplitude gefolgt von einem unterschwelligen dritten Signal. Neuron b
antwortet auf Einzelstrompulse mit unterschwelligen f EPSP ohne Abnahme der Amplitude.
Neuron c zeigt nach repetitivem Stimulus ein Summation, die zur Entladung eines
Aktionspotentials führt.
100 ms
∆F/F= 0,2%
Summation
f EPSPunterschwellig
Rundowna
b
c
Photodioden-Array
102 Eigene Untersuchungen
dargestellt werden. Neuropharmakologisch erwies sich die nach der Stimulussalve
gemessene Aktivitätsentladung als insensitiv gegenüber Hexamethonium,
wohingegen sich die nach Einzelstimulation ausgelösten f EPSP als nikotinerg
vermittelt erwiesen (s. Abb. 23). Dadurch konnte nachgewiesen werden, daß die
nach der Pulsfolge gemessenen Aktivität nicht von f EPSP, sondern von s EPSP
herrührte.
Abbildung 22: Optisch gemessene Nervenzellaktivität eines submukösen Neuron des
Meerschweinchens nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs (roter Pfeil)
sowie Aufnahme des fixierten Neurons mit Immunoreaktivität für ChAT. A Nach Ende der
Dauerstimulation (Balken) kommt es zu einer s EPSP ähnlichen Aktionspotentialent-
ladung. Nach Einzelstimulus zeigt dieses Neuron ebenfalls auch f EPSP. In Anwesenheit
des nACh-Antagonisten Hexamethonium bleibt die lang andauernde Erregung (s EPSP)
weiterhin auslösbar, wohingegen die schnelle Erregung (f EPSP) vollständig blockiert
wurde. B In der immunhistochemischen Aufnahme ist die Lage des Neurons im fixierten
Ganglion mittels Kreis markiert.
∆F/F
=0,0
8%
s EPSP
in Hexamethonium (200µM)
20 Hz, 5s
20 Hz, 5s
1 s
Pulssalve
f EPSP
60 ms
Einzel-stimulus
Pulssalve
ChAT
20 µm
Submuköses Ganglion desMeerschweinchens mit
Immunoreaktivität für ChAT
A B
Ergebnisse 103
Da die langsame Depolarisation im Verlaufe eines s EPSP nicht gemessen
werden konnte, mußte bei der Interpretation der Meßdaten berücksichtigt werden,
ob Nervenzellen beispielsweise Spontanaktivität zeigten. Der Einsatz eines
nAChR-Antagonisten allein war nicht ausreichend. Aufgrund der relativ hohen
Belichtungszeiten von bis zu 10 s konnten die Aufnahmen nicht beliebig oft
wiederholt werden, da nach 3-4 maliger Belichtung die Signalamplitude zunehmend
abnahm.
4.2.3 Immunhistochemie
Die im Anschluß an die optischen Messungen fixierten Gewebe wurden
immunhistochemisch aufbereitet. Dabei zeigte sich, daß eine Kombination von der
MSORT mit der Immunhistochemie sowohl beim Menschen (n= 26 Gewebe) als
auch beim Meerschweinchen (n= 10 Gewebe) generell möglich war. Eine
Überlagerung der optischen Signale mit der immunhistochemischen Aufnahme
∆F/F
=0,1
%
500 ms
ChATVIPSP
ACh 10ms
ACh 10ms
10µm
a
b
der Immunhistochemie (ChAT, VIP und SP) ist Neuron a
(rot). Bei Neurone b sind ChAT/VIP (gelb) kolokalisiert. Beid
Abbildung 23: Überlage-
rung von Immunhistoche-
mie und optisch registrier-
ter Aktivität. Dargestellt
ist ein Ganglion mit zwei
Nervenzellen (a, b) im
Plexus submucosus des
Menschen. Beide Neurone
wurden nach Spritzappli-
kation von ACh (0,5 mM,
roter Pfeil) aktiviert. In
immunoreaktiv für ChAT/-
e Neurone sind SP-negativ.
104 Eigene Untersuchungen
konnte durchgeführt werden (s. Abb. 24 und 25). Die immunhistochemische
Charakteristik ist für das Humangewebe im speziellen Teil Kapitel 4.3 zu finden.
Beim Meerschweinchen konnte nur bei etwa jedem 5ten Ganglion eine
ausreichende Färbung erreicht werden.
,
Abbildung 24: Immunhistochemische Aufnahme eines optisch untersuchten Ganglion mit
drei interganglionären Nervensträngen (*) im Plexus submucosus des Meerschweinchens.
Rot gefärbt sind Nervenzellen mit Immunoreaktivität für ChAT (n= 4), grün zeigt den
Neurotransmitter VIP (n= 3). Rechts: Die Meßdaten der Photodioden (weiß) wurden auf
die immunhistochemische Aufnahme des Ganglion projiziert. Nach elektrischer
Nervenstrangstimulation zeigten alle Neurone eine schnelle erregende Antwort.
10 µm
ChAT
VIP
100 ms
∆ F/F= 0,5%
*
*
*
Ergebnisse 105
4.3 MSORT: Hauptversuche1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 161718 1920 21 22 23 24 25 T 1 2 3 4 5 6 7
4.3.1 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität amDarmnervensystem des Menschen
Von insgesamt 30 Resektaten konnten vom Plexus submucosus in 26 Geweben
aus Kolon (n= 21) und Rektum (n= 5) Signale optisch abgeleitet werden. Bei 4
Geweben konnten keine Daten gewonnen werden (MHH-Nr. MC 696, 703, 736 und
741; s. Tab. 2, S. 44).
Von vier Rektum-Bioptaten konnten bei einem Gewebe Ganglien aufgefunden,
angefärbt und Signale erhalten werden (MHH-Nr. PE 749; s. Tab. 3, S. 45).
Insgesamt 74 submuköse Ganglien wurden in den 26 Resektaten und dem einen
Rektum-Bioptat untersucht. Bei 70 Ganglien mit über 660 Neuronen konnten
optische Signalantworten gemessen werden. Die Gesamtzellzahl innerhalb eines
Ganglion konnte in Kombination mit immunhistochemischen Daten bei 60 Ganglien
mit 610 Neuronen ermittelt werden. Die Nervenzellzahl pro Ganglion lag im Schnitt
bei 10,2 ± 5,9 Neurone (Median: 9,0; Bereich: 2-25 Neurone).
4.3.1.1 Vorkommen von schnellen erregenden postsynaptischenPotentialen (f EPSP) nach Stimulation interganglionärerNervenstränge
Um den prozentualen Anteil induzierbarer Aktivität innerhalb enterischer Ganglien
zu charakterisieren, wurden interganglionäre Nervenfasern durch Gabe von
Einzelstrompulsen elektrisch stimuliert. Der Anteil aktivierter Neurone wurde
ermittelt und prozentual auf die Gesamtzahl der im jeweiligen Ganglion
vorhandenen Neurone bezogen.
51 Ganglien (n= 22 Gewebe) mit insgesamt 537 Neuronen wurden
untersucht. Im Mittel befanden sich 10,5 ± 6,1 Neurone innerhalb eines Ganglion
(Median: 9; Bereich: 2-25 Neurone). Insgesamt wurden 83 interganglionäre
Nervenstränge elektrisch gereizt.
Durchschnittlich 55 % ± 32 % der Neurone (Median: 57 %) wurden innerhalb
eines Ganglion nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs aktiviert,
106 Eigene Untersuchungen
wobei der Anteil aktivierter Neurone nach Nervenstrangstimulation von
0 % bis 100 % reichte (s. Anhang, Tab. 19). Eine Beziehung zwischen der
Gangliongröße und dem prozentualen Anteil der aktivierten Neurone sowie
zwischen der Gangliongröße und der Aktivierung aller Neurone eines Ganglion
konnte nicht festgestellt werden.
Von 537 Neuronen wurden bei 83 Nervenfaserstimulationen insgesamt 366
Neurone (68,2 %) aktiviert. Zur Bestimmung der Qualität der induzierten
Nervenzellerregung wurden 247 Neurone in 31 Ganglien mit dem
nAChR-Antagonisten Hexamethonium weiter untersucht, um synaptische
Übertragungsmechanismen zu identifizieren und mögliche beteiligte
Neurotransmitter im Humandarm zu ermitteln.
Bei 68 Neuronen (27,5 %) konnte mit dem nAChR-Antagonisten die
Zellantwort vollständig blockiert werden (s. auch Abb. 36 A). Dieser Hexa-
methonium-inhibitive Effekt läßt auf eine ACh-Wirkung schließen, die rein nikotinerg
vermittelt ist. Die Dauer dieser nikotinergen f EPSP lag bei 14 analysierten
Neuronen im Bereich von 14,1 ms-92,7 ms mit einem Mittelwert von 41,3 ms ±
18,9 ms.
Als Hexamethonium-sensitiv erwies sich die Zellantwort ebenfalls bei 179 von
247 Neuronen. Dabei konnte bei 169 Nervenzellen (68,4 %) die Depolarisation im
Zuge des f EPSP ebenfalls blockiert werden. Ferner zeigten diese Nervenzellen
nach Stimulation eines Nervenstrangs ein verbleibendes optisches Signal, das von
der Morphologie mit einem Aktionspotential vergleichbar war. Die Dauer dieser
Aktionspotential-ähnlichen Signale lag bei 5,4 ± 1,2 ms. Diese Signale konnten
weder durch den muskarinergen-Acetylcholin-Rezeptor (mAChR)-Antagonisten
Atropin (n= 8 Neurone getestet) noch durch Calcium-depletierte Lösung zur
Hemmung synaptischer Übertragung blockiert werden (n= 12 Neurone getestet).
Durch den Natrium-Kanalblocker TTX hingegen konnten diese
Aktionspotential-ähnlichen Signale vollständig blockiert werden (n= 75 Neurone
getestet). Dies wies bei diesen Neuronen auf das Vorliegen von „process potentials“
hin. Die Stimulation eines weiteren Nervenstrangs bei 76 Neuronen führte bei 41 zu
Ergebnisse 107
einer vollständigen Blockierung der Nervenzellantwort, bei 35 Neuronen zeigten
sich wiederum die Aktionspotential-ähnlichen Signale.
Bei 10 der 179 Hexamethonium-sensitiven Neurone (4,0 %, n= 4 Ganglien),
deutete die Form der Signalamplitude und die Dauer von 30,7 ± 5,3 ms auf noch
vorhandene synaptische Übertragungsmechanismen und damit auf die Existenz von
f EPSP hin. Fünf dieser Neurone (n= 2 Ganglien) wurden neuropharmakologisch
untersucht, um die Hexamethonium-insensitive Komponente dieser f EPSP zu
analysieren. In Anwesenheit des nAChR-Antagonisten führte der
mAChR-Antagonist Atropin (0,5 µM) bei drei Neuronen zu einer vollständigen
Blockierung der direkten Stimulusantwort. Bei diesen Neuronen konnte in
Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium durch lokale, direkte
Applikation von Acetylcholin noch Nervenzellerregung induziert werden, wobei diese
Wirkung dann durch Atropin blockiert wurde. Bei einem weiteren Neuron wurden die
durch Hexamethonium reduzierten f EPSP durch Atropin ebenfalls blockiert, wobei
dann nur noch eine Aktionspotential-ähnliche Signalcharakteristik gemessen wurde,
was auf „process potentials“ hindeutete. Insgesamt konnte damit eine Beteiligung
∆F/F = 0,1 %
50 ms
Kontrolle Hexamethonium(200 µM)
Hexamethonium(200 µM)
Atropin (0,5 µM)
Auswaschen 15 min
Abbildung 26: Submuköses Neuron im Rektum des Menschen nach elektrischer
Stimulation (Pfeile) eines interganglionären Nervenstrangs. Das f EPSP zeigt Sensitivität
gegenüber dem nAChR-Antagonisten Hexamethonium und kann durch den
mAChR-Antagonisten Atropin vollständig blockiert werden. Nach dem Auswaschen der
Antagonisten erscheint die Signalantwort wieder .
108 Eigene Untersuchungen
muskarinerg vermittelter Übertragungsmechanismen aufgezeigt werden
(s. Abb. 26).
Die Nervenzellantwort des fünften pharmakologisch untersuchten Neuron
erwies sich in seiner f EPSP ähnlichen Signalcharakteristik unbeeinflußt durch den
mAChR-Antagonisten Atropin. Eine vollständige Blockierung der Signalantwort
wurde in Anwesenheit des P2-Rezeptor-Antagonisten Suramin erreicht (s. Abb. 27).
Hexamethonium(200 µM)Atropin (0,5 µM)
Suramin(100 µM)
Kontrolle Auswaschen10 min
100 ms
∆ F/F= 0,1%
Abbildung 27: Optisch registrierte f EPSP zweier submuköser Neurone im Rektum des
Menschen nach elektrischer Stimulation (s. Pfeil) eines interganglionären Nervenstrangs.
Bei Neuron a konnte die Aktivität durch den nAChR-Antagonisten Hexamethonium nicht,
bei Neuron b vollständig blockiert werden. Bei Neuron a trat eine vollständige Blockierung
der Aktivität durch den P2-Antagonisten Suramin ein. Nach 10 min Auswaschen können
f EPSP schon wieder ausgelöst werden. Die Meßwerte wurden mit einem
Butterworth-Tiefpass bei 200 Hz gefiltert.
In der Immunhistochemie (hier nicht dargestellt) zeigten beide Nervenzellen
Immunoreaktivität nur für ChAT und nicht für Substanz P oder VIP.
Ergebnisse 109
Die relative Fluoreszenzänderung (∆F/F) und die Dauer der f EPSP wurde getrennt
nach erster und zweiter Stimulation für 40 willkürlich gewählte Neurone (n= 11
Ganglien in vier Geweben) ermittelt (Tab. 8). Dabei erfolgte die zweite Stimulation
im Durchschnitt 0,38 ± 0,03 s nach der ersten Stimulation. In intrazellulären
Ableitungen wird „Rundown“ als Abnahme der Amplitude definiert. Bei den
optischen Messungen wurde eine Abnahme von 10 % als Grenzwert gewählt. Bei
15 Neuronen (Nr. 26-40, Tab. 8) trat beim zweiten f EPSP eine mehr als 10%ige
Reduzierung der Amplitude auf, was auf das Vorliegen von „Rundown“ hindeutete.
Die Amplitude des f EPSP nach der zweiten Stimulation wurde um durchschnittlich
24, 9% ± 8,4 % reduziert. 6 Neurone zeigten eine Zunahme der Amplitude beim
zweiten Stimulus um durchschnittlich 36,8 ± 13,6 %, was auf Summation hindeutete
(Nr. 1-6, Tab. 8). Weitere 19 Neurone zeigten eine Amplitudenveränderung, die im
Vergleich zum ersten f EPSP im Bereich von ±10 % schwankte (Nr. 7-25, Tab. 8)
und im Mittel bei 1,4 % ± 6,0% lag. Die Dauer des zweiten f EPSP verringerte sich
bei 21 Neuronen um mehr als 10 % im Vergleich zum ersten Stimulus. Bei 3
Neuronen verlängerte sich die Dauer um mehr als 10 %. Eine Korrelation zwischen
Amplitudenabnahme und Abnahme der Dauer erwies sich als statistisch nicht
signifikant.
Für alle untersuchten Neurone (n= 537) wurde der neurochemische Kode für
ChAT, Substanz P und VIP ermittelt (s. Tab. 9). Die Neurone, die nach elektrischer
Stimulation f EPSP zeigten, sind mit ihrem neurochemischen Kode aufgelistet.
Dabei zeigte sich hinsichtlich der neurochemischen Kodierung kein signifikanter
Unterschied (P-Wert=0,053) zwischen den durch f EPSP aktivierten und den nicht
aktivierten Neuronen. Allerdings schienen bei den nicht aktivierten Neuronen mehr
ChAT/- Neurone in Relation zu ChAT/VIP Neuronen aufzutreten (45 ChAT/- und
55 ChAT/VIP) als bei den Neuronen, die f EPSP zeigten (65 ChAT/- und
148 ChAT/VIP).
110 Eigene Untersuchungen
Tabelle 8: Relative Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) und Dauer (ms) für f EPSP
generierende Neurone (n= 40) nach wiederholter Stimulation interganglionärer
Nervenstränge.
∆∆∆∆F/F (%) Dauer (ms)Nr. 1.
f EPSP2.
f EPSP% von
f EPSP 11.
f EPSP2.
f EPSP% von
f EPSP 1 1 0,12 0,19 (158%) 36,8 41,1 (112%) 2 0,18 0,26 (144%) 56,4 50,9 (90%) 3 0,11 0,15 (136%) 33,7 36,2 (107%) 4 0,27 0,36 (133%) 53,3 52,1 (98%) 5 0,12 0,16 (133%) 47,8 38,6 (81%) 6
> 10
%
0,23 0,27 (117%) 33,7 30,7 (91%) 7 0,26 0,28 (108%) 73,6 66,8 (91%) 8 0,14 0,15 (107%) 25,7 26,4 (102%) 9 0,30 0,32 (107%) 56,4 49,0 (87%)10 0,29 0,31 (107%) 53,9 36,2 (67%)11 0,19 0,20 (105%) 48,4 34,3 (71%)12 0,42 0,42 (100%) 22,7 25,7 (114%)13 0,24 0,24 (100%) 31,9 33,7 (106%)14 0,30 0,30 (100%) 33,1 33,1 (100%)15 0,13 0,13 (100%) 55,2 49,0 (89%)16 0,20 0,20 (100%) 36,2 30,0 (83%)17 0,29 0,28 (97%) 41,1 36,2 (88%)18 0,23 0,22 (96%) 28,2 20,8 (74%)19 0,29 0,27 (93%) 48,4 58,8 (122%)20 0,28 0,26 (93%) 38,0 34,3 (90%)21 0,27 0,25 (93%) 34,3 29,4 (86%)22 0,42 0,39 (93%) 70,5 55,8 (79%)23 0,25 0,23 (92%) 27,6 26,4 (96%)24 0,13 0,12 (92%) 33,1 29,4 (89%)25
± 10%
0,21 0,19 (90%) 60,1 38,6 (64%)26 0,22 0,19 (86%) 35,6 31,3 (88%)27 0,34 0,29 (85%) 38,0 38,0 (100%)28 0,28 0,23 (82%) 25,1 24,5 (98%)29 0,22 0,18 (82%) 30,0 27,6 (92%)30 0,48 0,38 (79%) 35,6 38,6 (109%)31 0,34 0,27 (79%) 23,9 20,2 (85%)32 0,32 0,25 (78%) 50,9 41,1 (81%)33 0,22 0,17 (77%) 25,7 23,3 (90%)34 0,13 0,10 (77%) 52,7 40,5 (77%)35 0,23 0,17 (74%) 42,9 36,8 (86%)36 0,30 0,22 (73%) 58,8 52,1 (89%)37 0,21 0,15 (71%) 48,4 33,7 (70%)38 0,40 0,25 (63%) 33,1 28,2 (85%)39 0,33 0,20 (61%) 25,1 25,7 (102%)40
< 10
%
0,34 0,20 (59%) 44,1 33,1 (75%)
Ergebnisse 111
Tabelle 9: Neurochemische Kodierung (ChAT, SP, VIP) von Neuronen, die nach
elektrischer Stimulation f EPSP zeigten, und Kodierung von denen, die nicht aktiviert
wurden. Dargestellt ist ebenfalls die Gesamtkodierung.
Stimulusantwort Neurochemische Kodierung
MSORT ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...
GESAMTKODIERUNGn= 537
110(30%)
203(56%)
20(5%)
23(6%)
9(3%)
365(100%)
f EPSP ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...
gesamtn= 366 65 148 14 13 6 246
nikotinergn= 247
{davon Hexamethonium-sensitiv; n= 10}
45
1
108
3
10
-
6
2
6
-
175
6
nicht getestetn= 119 20 40 4 7 - 71
nicht aktivierte Neurone ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...
n= 171 45 55 6 10 3 119
112 Eigene Untersuchungen
Durch Spritzapplikation von ACh wurde die Aktivierung submuköser Neurone
des Menschen durch nikotinerge Mechanismen untersucht. 91 Neurone in 20
Ganglien (14 Gewebe) wurden durch Spritzapplikation von 0,5 mM Acetylcholin
(Dauer 5-200 ms) aktiviert. Mit ansteigender Applikationsdauer stieg die
Entladungsfrequenz der registrierten Aktionspotentiale (s. Abb. 28, Abb. 29). Die
Entladungsfrequenz betrug bei einer ACh-Applikationsdauer von 100-200 ms
8-55 Hz. Während des Meßzeitraumes dauerte die ACh-Wirkung bis zu 3 s. Bei 18
Neuronen (n= 5 Ganglien) wurde der nAChR-Antagonist Hexamethonium
perfundiert, wobei sich die Nervenzellantwort bei 6 Neuronen vollständig inhibieren
ließ. 12 Neuronen erwiesen sich als Hexamethonium-sensitiv, was sich in einer
Aktionspotentialentladung mit reduzierter Frequenz äußerte. Diese verbliebene
Hexamethonium-insensitive Antwort (s. Abb. 29) konnte vollständig durch den
mAChR-Antagonisten blockiert werden (n= 11 Neurone getestet).
Abbildung 28: Dosis-korrelierte Entladung von Aktionspotentialen bei acht submukösen
Neuronen des Menschen (siehe verschiedene Symbole) nach Spritzapplikation von 0,5 mM
Acetylcholin. Eine ansteigende Dauer der Spritzapplikation (Abszisse) führt bei den
Neuronen zu einer Erhöhung der Entladungsfrequenz der Aktionspotentiale (Ordinate).
50
40
30
20
10
0
10010 Dauer der ACh- Applikation (ms)
AP-
Fre
quen
z (H
z)
Ergebnisse 113
∆F/F=0,2%ACh 3 ms
Leeraufnahme
ACh 150 ms in Hexamethonium (200 µM)
ACh 150 ms in Hexamethonium (200 µM)+ Atropin (0,5 µM)
500 ms
ACh 150 ms
ACh 50 ms
ACh 10 ms
Abbildung 29: Dosis-korrelierte
Aktivität eines submukösen Neuron
des Menschen nach Spritzapplikation
des Neurotransmitters ACh (0,5 mM).
Dargestellt sind die Meßergebnisse
der korrespondierenden Photodiode
(280 µm²).
In einer Leeraufnahme, in der keine
Stimulation erfolgte, zeigt dieses
Neuron, wie auch in den
darauffolgenden Messungen, keine
Spontanaktivität.
Nach Spritzapplikation von ACh
zeigt sich eine Entladung von
Aktionspotentialen. Die
durchschnittliche Frequenz (5, 9, 22,
31 Hz) der Entladung und die Anzahl
der ausgelösten Aktionspotentiale
steigt mit zunehmender Dauer der
ACh-Spritzapplikation an (Pfeil;
3 ms, 10 ms, 50 ms and 150 ms).
Bei diesem Neuron wurde die
Aktivität in Anwesenheit des
nAChR-Antagonisten reduziert und
konnte durch den mAChR-Antago-
nisten Atropin vollständig blockiert
werden.
Die Daten sind mit einem 170 Hz
Butterworth-Tiefpass gefiltert.
114 Eigene Untersuchungen
4.3.1.2 Untersuchung auf das Vorkommen von langsamen erregendenpostsynaptischen Potentialen (s EPSP)
Wie häufig s EPSP im enterischen Nervensystem des Menschen auftreten, sollte
mit den folgenden Untersuchungen abgeklärt werden. 21 Ganglien (n= 15 Gewebe,
208 Neurone) mit durchschnittlich 9,9 ± 6,2 Neuronen innerhalb eines Ganglion
(Median: 9; Bereich: 2-21 Neurone) wurden nach elektrischer Stimulation eines
interganglionären Nervenstrangs mittels einer Pulssalve (20 Hz, 2-5 sec) auf das
Vorkommen von s EPSP untersucht. Dabei wurde eine im Verlaufe oder nach der
Stimuluspulsfolge auftretende Aktionspotentialsentladung als Hinweis auf das
Vorliegen von s EPSP gewertet. Um nikotinerg vermittelte ACh-Wirkungen, die
durch das Induzieren von f EPSP bei der optischen Messung eine ähnliche Aktivität
hervorrufen könnten, auszuschließen, wurde ein Teil der Experimente in Gegenwart
eines nAChR-Antagonisten durchgeführt (s. Abb. 30). Die Messungen in
Anwesenheit und ohne den nAChR-Antagonisten werden im folgenden zunächst
zusammen und dann getrennt dargestellt. Die Prozentangaben beziehen sich
einmal auf die mit dieser Fragestellung untersuchte Neuronengesamtzahl und dann
auf die durchschnittliche prozentuale Verteilung der Neurone innerhalb der
Ganglien.
Insgesamt konnte bei 5 von 208 nach einer Pulssalve aktivierbaren Neuronen
(2,4 %) s EPSP festgestellt werden, wobei diese sowohl im Kolon (n= 4) als auch im
Rektum (n= 1) registriert werden konnten. Diese fünf Neurone befanden sich in vier
verschiedenen Ganglien. Der Anteil von s EPSP generierenden Neuronen innerhalb
aller untersuchten enterischen Ganglien lag im Mittel bei 2,2 % ± 5,1 % (Median:
0 %; Bereich: 0 %-20 %). Dabei konnte bei den Neuronen, bei denen s EPSP
auftraten, nach Einzelstromstimulation auch stets f EPSP ausgelöst werden, welche
durch Hexamethonium blockiert wurden. In der Immunhistochemie konnte für 3 der
Neurone mit s EPSP der neurochemische Kode für ChAT, VIP und Substanz P
ermittelt werden: Zwei Nervenzellen zeigten Immunoreaktivität für ChAT/VIP, eine
nur für ChAT/-. Der überwiegende Anteil (86,3 %) der Neurone zeigte infolge der
Stimulation mittels Pulssalve keine lang andauernde optisch meßbare Aktivität und
Ergebnisse 115
somit keine mit der MSORT erfaßbaren Hinweise auf die Existenz von s EPSP. Für
28 Neurone (11,6 %) konnte die gemessene Aktivitätsentladung mit der optischen
Methode nicht als unmittelbare Folge der Pulssalve eindeutig interpretiert werden,
da diese Neurone vor und während dieser Dauerstimulation zusätzliche
Aktivitätsmuster (s. u.) aufwiesen.
Bei 13 von den 21 Ganglien (n= 8 Gewebe) mit 141 Neuronen wurde in
Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium eine Dauerstimulation an
17 interganglionären Nervensträngen durchgeführt. 19 der 141 Neurone (13,5 %)
zeigten optisch meßbare Erregung, die auch nach der Gabe der Pulssalve
fortdauerte und auf das Vorliegen von s EPSP hindeutete. Allerdings war bei 15
dieser Neurone (10,6 %) zuvor bereits Spontanaktivität oder eine andauernde
Aktivitätsentladungen auf Einzelpulsstimulation („late onset spike discharge“,
s. Kap. 4.3.1.4) aufgetreten. Somit konnte bei diesen Neuronen nicht zweifelsfrei
von einer stimulusinduzierten langsamen Depolarisation im Sinne der s EPSP
ausgegangen werden. Bei vier Neuronen (2,8 %, n= 3 Ganglien) konnte die Aktivität
∆F/F=0,1%
1 sPulssalve (20 Hz, 5 s)
Abbildung 30: Optisch registrierte Aktivität eines submukösen Neuron im Rektum des
Menschen in Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium (200 µm) nach
Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs. Die Dauer der Pulssalve ist durch den
breiten Balken markiert. Gegen Ende der Stimulation ist eine Signalentladung zu
erkennen, die auf die Existenz eines s EPSP hinweist. Gegen Ende der 9,5 sekündigen
Belichtungszeit tritt erneut eine Aktionspotentialentladung auf. Die Daten wurden mit
einem 240 Hz Butterworth-Tiefpass und einem 5,5 Hz Butterworth-Hochpass gefiltert.
116 Eigene Untersuchungen
als s EPSP klassifiziert werden, wobei eines dieser Neurone durch Stimulation von
zwei verschiedenen Nervensträngen aktiviert wurde. Ausgedrückt als prozentuale
Verteilung innerhalb der mit Hexamethonium untersuchten enterischen Ganglien
generierten damit durchschnittlich 3,0 % ± 6,3 % der Neurone (Median: 0%,
Bereich: 0 %-20 %) s EPSP.
Weitere acht Ganglien (n= 7 Gewebe) mit 67 Neuronen wurden mittels
Pulssalve ohne Anwesenheit eines nAChR-Antagonisten stimuliert. Hierbei zeigte
ein Neuron (1,5 %) ein charakteristisches s EPSP. Dies sind bei diesen Messungen,
bezogen auf die prozentuale Verteilung innerhalb der Ganglien, im Schnitt
0,6 % ± 1,8 % Neurone (Bereich: 0 %-5 %). Bei weiteren neun Neuronen (13,4 %)
konnte ebenfalls Aktivität gemessen werden, jedoch traten auch hier vorher
Spontanaktivität oder Aktivitätsentladungen auf Einzelstimulation hin auf.
Ergebnisse 117
4.3.1.3 Vorkommen von nicht experimentell induzierter Aktivität(„Spontanaktivität“) und Eigenschaften dieser Nervenzellen
Insgesamt 56 Ganglien (n= 24 Gewebe) wurden auf das Vorhandensein von
Spontanaktivität überprüft. Als Spontanaktivität wurden optische Signale
klassifiziert, die während der für die Untersuchungen eingeführten ‚Leeraufnahmen‘
auftraten bzw. die während einer Meßperiode vor Stimulationsbeginn registriert
wurden. Bei etwas mehr als der Hälfte der Ganglien (n= 29) konnten während des
Meßzeitraumes keine Hinweise auf Spontanaktivität beobachtet werden,
wohingegen bei 27 Ganglien ein Teil der enterischen Neurone spontan aktiv war. In
der vorliegenden Arbeit ist somit beim Menschen in ungefähr jedem zweiten
enterischen Ganglion spontane Aktivität nachgewiesen worden. Dabei trat diese
Aktivität unabhängig von der Darmregion sowohl im Kolon (n= 20) als auch im
Rektum (n= 7) auf.
Um von spontan aktiven Neuronen die Verteilung innerhalb enterischer
Humanganglien zu erhalten, wurde die Gesamtzahl enterischer Neurone jeweils pro
Ganglion ermittelt und der prozentuale Anteil spontan aktiver Neurone bestimmt.
Entsprechend dieser Fragestellung konnten 51 Ganglien (n= 23 Gewebe,
500 Neurone) von den 56 Ganglien ausgewertet werden. Es befanden sich
durchschnittlich 9,8 ± 5,7 Neuronen (Median: 9; Bereich: 2-21 Neurone) in einem
Ganglion. In den 25 Ganglien (n= 14 Gewebe, 258 Neurone), in denen
Spontanaktivität gemessen wurde, traten im Mittel 41,1 % ± 27,8 % spontan aktive
Neurone pro Ganglion auf (Median: 40 %, Bereich: 4,8 %-100 %). Bezogen auf alle
51 Ganglien konnte damit Spontanaktivität durchschnittlich in 20,1 % ± 28,3 % der
Neurone innerhalb enterischer Ganglien registriert werden (Median: 0 %, Bereich:
0 %-100 %).
Ob ein möglicher Zusammenhang zwischen Gangliongröße und
prozentualem Anteil von Spontanaktivität existiert, wurde mit dem
Rangkorrelationstest nach Spearman getestet. Zwar zeigt sich bei den untersuchten
Ganglien eine Tendenz, daß bei zunehmender Gangliongröße das Vorkommen von
Spontanaktivität abnimmt (Korrelationskoeffizient: -0,5; P-Wert 0,026), allerdings
beruht diese Signifikanz allein auf dem Vorhandensein zweier Ganglien mit sehr
118 Eigene Untersuchungen
geringer Neuronenzahl (2 und 3 Neurone; s. Abb. 31, Pfeil). Werden diese beiden
Ganglien nicht berücksichtigt, ist die Korrelation statistisch nicht aussagekräftig
(Korrelationskoeffizient: -0,3; P-Wert 0,16).
Bezogen auf die untersuchte Neuronenzahl z
Neuronen 88 Neurone (17,6 %) im Humangewebe spon
lag während einer Aufnahmedauer von 1 bis 3
Entladungsfrequenz bei 4,2 ± 3,1 Hz (Median: 3,2 Hz;
Neurone). Für einige Neurone (n= 46) wurden die
einzelnen Signalen und in einer Klassenbreite von 20
als absolute Häufigkeit für jedes normierte Intervall gra
Die Zeitintervalle zwischen den einzelnen Signalen lag
von 100 bis 200 ms, mit einem Maximum im Zeitinterva
als einem Drittel der Neurone auftrat. Wie die Inter
einzelne Neuron (n= 46) verteilt, ist in Abbildung 33 dar
Gesamtzahl der Neurone pro Ganglion0 5 10 15 20 25
Ant
eil d
er N
euro
ne m
it Sp
onta
nakt
ivitä
t (%
)
0
20
40
60
80
100
Abbildung 31: Vorkommen
von Spontanaktivität innerhalb
enterischer Ganglien des
Menschen. Die prozentuale
Verteilung spontan aktiver
Neurone innerhalb der
Ganglien (n= 25) ist gegen die
Gesamtzahl der Neurone pro
Ganglion aufgetragen. Der
Pfeil markiert diejenigen
Ganglien, aufgrund derer es zu
einer Korrelation zwischen
Gangliongröße und Anteil von
Spontanaktivität kommt.
eigten von insgesamt 500
tane Aktivitätsmuster. Dabei
sec die durchschnittliche
Bereich: 0,8-16,7 Hz; n= 48
Zeitintervalle zwischen den
ms-Intervallen eingeteilt und
phisch dargestellt (Abb. 32).
en am häufigsten im Bereich
ll 120-140 ms, das bei mehr
vallhäufigkeit sich auf jedes
gestellt. Mehr als 70% der
Ergebnisse 119
31
3
4
6
7
8
8
18
15
13
1110
76
2
6 6
32
32 2
5
1 2 1 1 1 1 1 1
4
1
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
05
1015
2025
3035
40
1510
5
0ab
solu
te H
äufig
keit
rela
tive
Häu
figke
it (%
)
klassierte Signaleinzelintervalle (ms)
Abbildung 32: Häufigkeitsverteilung der Signaleinzelintervalle von spontan aktiven
Neuronen (n= 46). Die Zeitabstände zwischen den Signalen wurden auf der
Abszissenachse in Intervallen von 20 ms klassiert. Die Ziffern oberhalb der Säulen
geben die Anzahl der Nervenzellen an, die das entsprechende Intervall belegten, wobei
die Unterteilung innerhalb der Säulen die einfache oder mehrfache Intervallbesetzung
für die jeweiligen Nervenzellen veranschaulicht. Die Verteilung ist eingipflig mit einem
Maximum im Intervall 120-140 ms. Dabei haben 9 Zellen dieses Intervall einfach,
9 mehrfach belegt.
120 Eigene Untersuchungen
Abbildung 33: Darstellung der Spontanaktivität von 46 Neuronen aus Kolon und
Rektum (a-t‘). Die Einzelintervalle zwischen den spontanen Signalen wurden für jedes
Neuron in einer Klassenbreite von 20 ms gegen die absolute Häufigkeit der
Intervallbesetzung dargestellt. 72 % der spontan aktiven Neurone (n= 33) zeigen
Signalabstände, die unter 200 ms liegen. Bei 20 % (n= 9) liegen die Signalabstände
zwischen 200 ms und 400 ms, 8 % (n= 4) zeigen Signalintervalle größer als 400 ms.
klassierte Signalintervalle (ms)
abso
lute
Häu
figke
it
Ergebnisse 121
Neurone zeigten zwischen einzelnen Signalen Intervalle von unter 200 ms. Neben
den Signalintervallen, also den Zeitabständen zwischen zwei Signalen, wurde
während des Meßzeitraumes von 1,2 bis 3,2 s die durchschnittliche
Entladungsfrequenz für 48 Neurone ermittelt und in 1 Hz-Intervallen klassiert. Dies
ist in Abbildung 34 graphisch dargestellt. Am häufigsten wurde (16-19%) eine
durchschnittliche Signalfrequenz zwischen 1-4 Hz registriert.
Inwieweit die optisch registrierte Spontanaktivität endogenen oder
synaptischen Ursprungs ist, wurde für 44 spontan aktive Neurone ermittelt. Es
zeigte sich, daß sowohl synaptische als auch endogene Mechanismen in
enterischen Humanganglien beteiligt sind. Calcium-depletierte Lösung (n= 10
Neurone getestet) blockierte die Aktivität bei acht spontan aktiven Neuronen.
86
42
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 170
1510
50
abso
lute
Häu
figke
it
rela
tive
Häu
figke
it (%
)
durchschnittliche Signalfrequenz (Hz)
Abbildung 34: Histogramm zur durchschnittlichen Signalfrequenz spontan aktiver
Humanneurone während eine Aufnahmedauer von 1,2 bis 3,2 s ohne experimentelle
Stimulation. Die Entladungsfrequenz der Neurone (n= 48) wurde auf der
Abszissenachse in einer Klassenbreite von 1 Hz gruppiert. Auf der Ordinatenachse ist
links die absolute Häufigkeit, rechts die relative Häufigkeit in Prozent angegeben.
Etwa 55 % der Nervenzellen (n= 26) zeigen Entladungsfrequenzen von 1-4 Hz.
Rund 70 % der Neurone (n= 33) haben Entladungsfrequenzen bis 5 Hz. 27 % der
Neurone befinden sich in den Intervallen von 5-10 Hz.
122 Eigene Untersuchungen
Bei zwei Neuronen wurde sie nicht beeinflußt, was bei diesen Nervenzellen auf den
endogenen, nicht-synaptischen Ursprung hinweist. Der nAChR-Antagonist
Hexamethonium blockierte vollständig die Spontanaktivität in 12 von 34
untersuchten Neuronen, was vermuten läßt, daß diese Spontanaktivität durch ACh
Ausschüttung und nachfolgender Aktivierung nikotinerger Rezeptoren erzeugt
worden war. Die Zeitintervalle zwischen einzelnen spontanen Signalen wurden für
Neurone, bei denen die spontane Aktivität nikotinerg vermittelt war, sowie für
Neurone, bei denen Hexamethonium die Aktivität nicht blockierte, in Klassen von
20 ms Breite dargestellt (s. Abb. 35).
Von den verbleibenden 22 Hexamethonium-insensitiven Neuronen wurde der
Anteil synaptisch vermittelter Aktivität nicht weiter abgeklärt. Allerdings wurden zwei
Neurone mit Suramin weiter untersucht (s. Abb. 36). Die Spontanaktivität erwies
sich bei einem Neuron als sensitiv, jedoch konnte nach dem Auswaschen keine
erneute Aktivität reproduziert werden.
Die immunhistochemische Charakterisierung für ChAT, VIP und SP konnte
bei insgesamt 46 Neuronen ermittelt werden (s. Tab. 10). Dabei zeigten 70 %
Immunoreaktivität für ChAT/VIP, 15 % für ChAT/-, 9 % für VIP/- und 7 % für
ChAT/SP. Verglichen mit der Gesamtkodierung zeigte sich bei der
Transmitterkodierung der spontan aktiven Neurone kein signifikanter Unterschied
(P-Wert=0,064).
Bei 84 Neuronen (n= 13 Ganglien), die während Leeraufnahmen keine
spontane Aktivität zeigten, trat reversibel in Gegenwart des nAChR-Antagonisten
Hexamethonium Spontanaktivität bei 7 Neuronen (n= 3 Ganglien) auf, die bei drei
der untersuchten Neuronen auch noch bei Gabe des mAChR-Antagonisten Atropin
fortdauerte. Ein weiteres Neuron zeigte erst in Anwesenheit von Atropin
Spontanaktivität. Bei 93 Neuronen (n= 10 Ganglien) trat während mehrerer
Meßzyklen vor und während der Hexamethoniumgabe keine Spontanaktivität auf.
Ergebnisse 123
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
02
4
11
3
1 1 1 1 1 1
1 2
abso
lute
Häu
figke
it
rela
tive
Häu
figke
it (%
)20
10
klassierte Signalintervalle (ms)
0
02
46
8
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
1 1 1 1 1 1 1 1111
11 222
23
2
3
4
4
4
4
abso
lute
Häu
figke
it
rela
tive
Häu
figke
it (%
)12
108
4klassierte Signalintervalle (ms)
146
20
Abbildung 35: Zwei Häufigkeitsverteilungen von Signaleinzelintervallen bei spontan
aktiven, submukösen Neuronen. Als Klassenbreite wurden 20 ms-Intervalle gebildet.
Die Anzahl der Nervenzellen, die das entsprechende Intervall belegt haben, gibt die
Ziffer oberhalb der jeweiligen Säulen an. Wie häufig von einer Nervenzelle das
Intervall belegt wurde, wird durch die Unterteilung innerhalb einer Säule dargestellt.
Oben Neurone (n= 6), deren Spontanaktivität in Anwesenheit des nAChR-Antago-
nisten Hexamethonium fortdauerte.
Unten Neurone (n= 10) mit nikotinerger Spontanaktivität.
124 Eigene Untersuchungen
Abbildung 36: Aktivität dreier submuköser Neurone im
Kolon des Menschen. A Alle drei Neurone (a; b; c) zeigten
nach Stimulation eines interganglionären Nervenstrangs
f EPSP, die durch den nAChR-Antagonisten
Hexamethonium inhibiert werden konnten. B Die ohne
Stimulation („Leeraufnahme“) registrierte Spontanaktivität wurde bei zwei der Neurone
(a; b) nicht blockiert. Bei Neuron c wurde die Aktivität blockiert. In Anwesenheit des
purinergen P2-Antagonisten Suramin trat bei Neuron a keine Aktivität mehr auf, bei
Neuron b konnte weiterhin spontane Aktivität registriert werden. Ein 170 Hz Butterworth-
Tiefpass wurde verwendet. C Das Videobild zeigt die Fluoreszenzaufnahme des Ganglion
mit den entsprechend markierten Nervenzellen. Der untere Nervenstrang des Ganglion
wurde zur Auslösung von f EPSP stimuliert (Pfeil).
Andauernde ”spontane” AktivitätDurch Stimulationausgelöste
f EPSP
20 µm
ab
”Leeraufnahme”
Hexamethonium (200 µM)
+ Suramin (100 µM)
∆ F/
F= 0
,2 %
100 ms
50 ms
a b ba
Hexamethonium (200 µM)
cc
c
A B
Ergebnisse 125
Tabelle 10: Immunhistochemische Dreifachfärbung mit ChAT/VIP/SP für Neurone mit
Spontanaktivität
Registrierte Aktivität Neurochemische Kodierung
Spontan aktive Neurone ChAT/- ChAT/VIP ChAT/ SP VIP/- -/- n= ...
Insgesamt 7(15%)
32(70%)
3(7%)
4(9%)
- n= 46(100%)
nikotinerg 1 3 - - - n= 4
Hexamethonium-insensitiv 3 9 - 2 - n= 13
GESAMTKODIERUNG 110(30%)
203(56%)
20(5%)
23(6%)
9(3%)
365(100%)
126 Eigene Untersuchungen
4.3.1.4 Vorkommen einer andauernden Stimulus-induziertenAktivitätsentladung, „late onset spike discharge“
Im Verlaufe der Untersuchungen konnte beim Menschen nach elektrischer
Einzelpulsstimulation (1-4 Hz) interganglionärer Nervenstränge wiederholt ein
Aktivitätsmuster beobachtet werden, das als eine andauernde stimulusinduzierte
Aktivitätsentladung, „late onset spike discharge“, in der vorliegenden Arbeit
bezeichnet wird. Dieses Aktivitätsmuster erscheint nach ein- bis zweimaliger
elektrischer Stimulation interganglionärer Nervenstränge als eine ausgeprägte, nach
dem Stimulus mehrere Millisekunden (> 800 ms) fortwährende Entladung von
erregenden Potentialen mit erhöhter Frequenz (14-31 Hz, n= 7 Neurone analysiert).
Im Folgenden soll dieses bisher in den optischen Untersuchungen nur beim
Menschen identifizierte Aktivitätsmuster näher charakterisiert werden.
48 Ganglien (n= 22 Gewebe) wurden analysiert mit durchschnittlich
11,3 ± 6,0 Neuronen (Median: 10; Bereich: 2-25 Neurone). Bei 9 Ganglien (18,8 %)
konnte nach Stimulation von interganglionären Nervensträngen dieses
Aktivitätsmuster registriert werden (n= 6 Gewebe). Diese Aktivitätsentladung trat bei
Ganglien der beiden untersuchten Darmregionen sowohl im Kolon (n= 4 Ganglien,
3 Gewebe) als auch im Rektum (n= 5 Ganglien, 3 Gewebe) auf. In diesen Ganglien
konnte bei 31,7 % ± 22,2 % der Neurone „late onset spike discharge“ ausgelöst
werden (Median: 29,2 %; Bereich: 7,7 % bis 75,0 %). Bezogen auf alle untersuchten
Ganglien zeigten im Mittel 5,1 % ± 14,6 % der enterischen Neurone (Median: 0 %,
Bereich: 0 %-75 %) „late onset spike discharge“.
Insgesamt wurden 67 interganglionäre Nervenstränge - ein bis drei pro
Ganglion - durch wiederholte Gabe von Einzelstrompulsen stimuliert. Von 366 durch
Stimulation aktivierten Neuronen wiesen 7,4 % der Neurone „late onset spike
discharge“ auf, die unabhängig von der Darmlokalisation sowohl bei Neuronen im
Kolon (n= 12 Neurone) als auch im Rektum (n= 15 Neurone) ausgelöst werden
konnte. Um die synaptische Herkunft und eventuell beteiligte Neurotransmitter zu
identifizieren, wurden 21 Neurone näher charakterisiert. Die synaptische Herkunft
dieses Aktivitätsmusters (n= 2 Neurone) konnte nach Perfusion mit
Calcium-depletierter Lösung gezeigt werden.
Ergebnisse 127
In Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium traten bei untersuchten
19 Neuronen die drei folgenden Antworten auf:
Vollständige Blockierung durch Hexamethonium (7 Neurone),
Hexamethonium-sensitiv (2 Neurone),
Hexamethonium-insensitiv (10 Neurone).
Bei 3 der 10 Hexamethonium-insensitiven Neuronen wurde die
pharmakologische Wirkung des mAChR-Antagonisten Atropin auf die vorhandene
„late onset spike discharge“ untersucht. Das Aktivitätsmuster konnte bei den drei
Neuronen durch Atropin vollständig blockiert werden (s. Abb. 37).
AuswaschenAtropin(0,5 µM)
Kontrolle Hexamethonium(200 µM)
∆F/F=0,05%
100 ms
100 ms
∆F/F= 0,05 %
Kontrolle Hexamethonium(200µM)
Auswaschen
Abbildung 37: Stimulusinduzierte Aktivität („late onset spike discharge“) in zwei
verschiedenen submukösen Neuronen enterischer Humanganglien. In Anwesenheit des
nAChR-Antagonisten Hexamethonium wurde die direkte Nervenzellantwort auf die
Stimulation jeweils vollständig blockiert. Oben ist bei dem Neuron ebenfalls die spät
einsetzende Aktivitätsentladung blockiert worden und ist damit nikotinerg vermittelt. Unten
konnte erst mit dem mAChR-Antagonisten Atropin die Aktivität reversibel blockiert
werden, was auf eine Beteiligung muskarinerger Mechanismen hinweist. Die
Meßergebnisse sind mit einem Butterworth-Tiefpass bei 200 Hz gefiltert.
128 Eigene Untersuchungen
Damit konnte bei 12 der 19 untersuchten Neurone eine Beteiligung
cholinerger Mechanismen an dieser „late onset spike discharge“ beim Menschen
gezeigt werden, d. h. der Neurotransmitter Acetylcholin war entweder über
nikotinerge oder über muskarinerge Mechanismen bei der Generierung involviert.
Für einige Neurone, die dieses Aktivitätsmuster zeigten, wurde die neurochemische
Kodierung für ChAT, Substanz P, und VIP ermittelt (n= 13, s. Tabelle 11). 12
Neurone zeigten Immunoreaktivität für ChAT, 9 Neurone für VIP und eines für SP,
wobei ChAT/VIP (n= 9) und ChAT/SP (n= 1) kolokalisiert waren. Ein weiteres
Neuron war nur für den neuronalen Marker immunoreaktiv. Verglichen mit der
Gesamtkodierung war der Unterschied in der Transmitterkodierung nicht signifikant
(P-Wert=0,49).
Tabelle 11: Pharmakologische und immunhistochemische Charakteristik (ChAT/VIP/SP)
von submukösen Humanneuronen, die eine andauernde stimulusinduzierte
Aktivitätsentladung („late onset spike discharge“) generieren.
Neurochemische KodierungNeuropharmakologischeCharakteristik
ChAT/- ChAT/VIP ChAT/SP VIP/- -/-
2 4 - - 1nikotinerg
(n= 9)
inhibitiv (n= 7)Hexamethonium sensitiv (n= 2) - 2 - - -Cholinerg
(n= 12)muskarinerg
(n= 3)Atropin inhibitiv (n= 3)
- 2 1 - -
(n= 1) Nicht-nikotinerg, n.a. - 1 - - -
Gesamt n= 13 2 9 1 - 1
n.a. = nicht analysiert
Ergebnisse 129
4.3.1.5 Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien nachoraler bzw. analer Stimulation interganglionärerNervenstränge
Interganglionäre Nervenstränge, die oral und anal enterischer Ganglien verliefen,
wurden bei 24 Ganglien (n= 11 Gewebe) elektrisch durch Gabe von
Einzelstrompulsen stimuliert. Dadurch sollten erstmals grundlegende Daten über die
Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien gewonnen werden. Die Anzahl
aktivierter exzitatorischer Neurone wurde anschließend für jede Stimulationsrichtung
bestimmt, auf die Gesamtzahl der Neurone eines Ganglion bezogen (s. Anhang,
Tab. 19) und miteinander für beide Stimulationsrichtungen verglichen.
Sowohl nach oraler als auch nach analer Stimulation wurden
Neuronenpopulationen aktiviert. Nach oraler Nervenfaserstimulation zeigten
durchschnittlich 62 %, nach analer etwa 57 % der Neurone innerhalb eines
Ganglion erregende Potentiale. Beim Vergleich der beiden Stimulationsrichtungen
ergaben sich hinsichtlich des Prozentsatzes der oral bzw. anal aktivierten Neurone
keine statistisch signifikanten Unterschiede. Ein Vergleich der nach jeweiliger
Stimulation aktivierter Neurone ergab:
• Durchschnittlich wurde etwa die Hälfte der Neurone (45 %) eines enterischen
Ganglion durch Stimulation zweier Nervenstränge, sowohl eines oral als auch
eines anal lokalisierten Nervenstrangs, aktiviert. Dies deutet auf die Existenz von
Konvergenz im ENS hin (Abb. 38; Säule ‚O u. A‘). Dabei wurden signifikant mehr
Neurone projektionsunspezifisch (oral und anal aktiviert) als
projektionsspezifisch (nur oral, nur anal) aktiviert.
• Etwa ein Drittel der Neurone (28 %) zeigte eine Nervenstrang-spezifische
Aktivierung, d.h. die entsprechenden Neurone wurden entweder nur durch
Stimulation des oral oder des anal verlaufenden Nervenstrangs aktiviert
(Abb. 38; Säule ‚O ≠ A‘). Ein Vergleich des prozentualen Anteils der nur durch
orale bzw. nur durch anale Stimulation aktivierten Neurone erwies sich als
statistisch nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 38; Säulen ‚nur oral‘ und
‚nur anal‘).
130 Eigene Untersuchungen
• Ein Drittel der Neurone (27 %) konnte weder nach Stimulation eines oralen noch
eines analen interganglionären Nervenstrangs aktiviert werden (Abb. 38; Säule
‚nicht aktiv‘).
Abbildung 38: Übersicht über das prozentuale Mittel aktivierter Neurone enterischer
Ganglien nach Stimulation oraler (O) bzw. analer (A) interganglionärer Nervenfasern.
Die prozentualen Angaben sind aus der Summe der untersuchten Ganglien (n= 24)
gebildete Werte. Die Säule O u. A zeigt Neurone, die durch beide
Stimulationsrichtungen projektionsunspezifisch aktiviert wurden, die Säule O ≠≠≠≠ A zeigt
die Nervenstrang-spezifische Aktivierung, aufgeteilt (s. Pfeile) in jeweilige
Stimulationsrichtung (nur oral, nur anal).
Median (%) 66 63 297 850 20
± 23
Erregungsverteilung in enterischen Ganglien
100
%
Mittelwert (%)
Standardabweichung
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80
100
57 27
Oral Analnicht
aktiviert
± 30 ± 2816
nur oral
± 2412
nur anal
± 20± 2845
O u. A
28
O ≠ A
± 2662
75%-Perzentil
25%-Perzentil 49 47 50 030 14
84 71 3429 1660 35
Ergebnisse 131
Unter Berücksichtigung der Darmregionen wichen von den Gesamtergebnissen die
für Rektum (8 Ganglien) und Kolon (16 Ganglien) erhaltenen Daten untereinander
nicht signifikant ab. Neuropharmakologisch zeigte sich mit dem
nAChR-Antagonisten Hexamethonium zwischen oral oder anal, also
projektionsspezifisch aktivierten Neuronen sowie projektionsunspezifisch aktivierten
Neuronen, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Vorkommens von
„process potentials“ sowie den synaptisch vermittelten Antworten.
Für die neuropharmakologisch untersuchten Neurone (n= 180 Neurone, 16
Ganglien) wurde die Immunoreaktivität für ChAT, VIP und Substanz P ermittelt. Bei
rund 70 % der Neurone (n= 124) konnten immunhistochemische Daten erfaßt
werden. Dabei wurde unterschieden zwischen Neuronen, die bei beiden
Stimulationen geantwortet haben (n= 104), und Neuronen, die nur nach Stimulation
einer Nervenfaser geantwortet haben (n= 35), sowie den Neuronen, die nicht
aktiviert wurden (n= 37). Ihre neuropharmakologischen Charakteristika sind mit der
Transmitterkodierung in Tabelle 12 ,Tabelle 13 und Tabelle 14 aufgelistet. Bei den
Neuronen, die projektionsspezifisch nur durch anale Stimulation aktiviert worden
waren, zeigten verglichen mit der Aktivierung oral signifikant (P-Wert =0,01) mehr
Neurone mit ChAT/VIP.
Tabelle 12: Neurone, die nach Stimulation eines Nervenstrangs nicht aktiviert wurden, und
ihr neurochemischer Kode
Neurochemische Kodierung
Faserstrangstimulation ChAT/- ChAT/VIP
ChAT/SP VIP /- -/- n= 37
Nicht aktiviert 17(46%)
15(41%)
2(5%)
1(3%)
2(5%)
37(100%)
2(5%)
GESAMTKODIERUNG 110(30%)
203(56%)
20(5%)
23(6%)
9(3%)
365(100%)
132 Eigene Untersuchungen
Tabelle 13: Neuropharmakologische Charakterisierung und neurochemischer Kode (ChAT,
Substanz P und VIP) der Neurone, die von einem Nervenstrang aktiviert wurden. Die
Prozentangaben wurden zur Veranschaulichung aufgeführt.
NeuropharmakologischeCharakterisierung Neurochemische Kodierung
Faserstrangoral n= 20 ChAT/
-ChAT/
VIPChAT/
SP VIP /- -/- n= 14
nikot. f EPSP 3 1(33%)
2(67%) - - - 3
(100%)
nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 17 4
(36%)1
(9%)2
(18%)1
(9%)3
(27%)11
(100%)
Faserstranganal n= 15 ChAT/- ChAT/
VIPChAT/
SP VIP /- -/- n= 8
nikot. f EPSP 8 - 6(100%) - - - 6
(100%)
nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 7 - 2
(100%) - - - 2(100%)
Tabelle 14: Neuropharmakologische Charakterisierung und neurochemischer Kode (ChAT,
Substanz P und VIP) der Neurone, die von zwei Nervensträngen aktiviert wurden. Die
Prozentangaben wurden zur Veranschaulichung aufgeführt.
NeuropharmakologischeCharakterisierung Neurochemische Kodierung
Faserstrangoral
Faserstranganal n= 104 ChAT/
-ChAT/
VIPChAT/
SPVIP/
- -/- n= 65
nikot. f EPSP nikot. f EPSP 23 1(8%)
11(84%)
1(8%) - - 13
(100%)
nikot. f EPSP nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 14 3
(50%)3
(50%) - - - 6(100%)
nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität nikot. f EPSP 27 7
(37%)8
(42%) - 1(5%)
3(16%)
19(100%)
nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität
nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität 35 7
(29%)15
(63%) - 1(4%)
1(8%)
24(100%)
nikot. f EPSP +Fortsatzaktivität
nikot. f EPSP +syn. Input +
Fortsatzaktivität5 - 2 - 1 - 3
Ergebnisse 133
4.3.1.6 Aktivität von interganglionären Nervensträngen
Aktivität von interganglionären Nervensträngen konnte beim Menschen nur
vereinzelt gemessen werden. Interganglionäre Nervenstränge wurden zum einen
bei der lokalen Färbung je nach Ausdehnung des Ganglion nicht immer ausreichend
mit Farbstoff beladen, zum anderen befanden sie sich meist nicht auf derselben
Fokusebene wie das entsprechende Ganglion und konnten bei der optischen
Messung damit nicht gleichzeitig erfaßt werden. Die in einigen Fällen gemessene
Aktivität elektrisch stimulierter interganglionärer Nervenfasern bestand aus der
Summe von Einzelfasersignalen. Für sechs Ganglien konnte die
Ausbreitungsgeschwindigkeit der Aktionspotentiale entlang der Nervenstränge mit
0,34 ± 0,11 m/s berechnet werden (Bereich: 0,20-0,48 m/s). Die Dauer der
gemessenen Aktionspotentiale lag bei 5,2 ± 1,3 ms (n= 82 Signale analysiert).
4.3.1.7 S/N-Verhältnis, relative Änderung der Fluoreszenz,durchschnittliche Belichtungszeit und Reproduzierbarkeit
Das ‚peak-to-peak‘ S/N-Verhältnis lag beim Humangewebe für Aktionspotentiale bei
24 % ± 8 % der Signalamplitude (Bereich 12%-45 %, n= 40 Ganglien analysiert).
Die relative Änderung der Fluoreszenz (∆F/F) betrug bei submukösen
Humanganglien durchschnittlich -0,38 % ± 0,20 % (Bereich von -0,11 % bis -1,53 %;
n= 40 Ganglien analysiert). Das Verhältnis zwischen Aktionspotentialen zu f EPSP
betrug etwa 2:1. Die Belichtungsdauer pro Ganglion lag im Durchschnitt bei 35,1 ±
17,2 s mit bis zu 80 s Gesamtbelichtungszeit. Die Dauer der optischen Experimente
betrug pro Ganglion durchschnittlich 105 ± 53 min (n= 65 Ganglien analysiert) mit
einer Maximaldauer von bis zu 5 Stunden. Während dieses Zeitraumes konnten
wiederholt Messungen durchgeführt werden. Nach Stimulation konnte
Nervenzellaktivität bei einer Belichtungsdauer von 9 s bis zu viermal hintereinander,
bei 3,1 s mehr als zehnmal hintereinander wiederholt registriert werden.
Einen zusammenfassenden Überblick über die im Humandarm mit der
MSORT registrierten Aktivität gibt Abbildung 39 wieder.
134 Eigene Untersuchungen
Abbildung 39: Übersicht über die mit der MSORT am Humandarm gemessene Nervenzell-
erregung. Die optisch registrierten erregenden Potentiale (f EPSP, „process potential“, Spon-
tanaktivität, „late onset spike discharge“, s EPSP) sind exemplarisch mit der entsprechenden
prozentualen Verteilung angegeben, z. B. waren 95 % der f EPSP rein nikotinerg vermittelt,
bei 5 % existierte zusätzlich eine weitere Komponente, bei der purinerge Mechanismen be-
teiligt waren. Die projektionsspezifische und -unspezifische Erregungsausbreitung ist anhand
fehlfarbenkodierter Bilder dargestellt. Rot kodiert die Maximumamplitude eines erregenden
Potentials. Die Zeitpunkte der elektrischen Stimulation von interganglionären Nerven-
strängen sind jeweils durch Pfeile (Einzelstimuli; rot) und Balken (Pulssalven; rot) markiert.
Projektionsspezifischeund projektions-unspezifischeErregungsausbreitung
∆F/F
= 0,
1 %
f EPSP
nikotinerg > 96%purinerg
Nervenzellfortsatzerregung”process potentials”in jedem Ganglion
20 ms
40 ms
Spontanaktivitätca. 18 %
100 ms
s EPSPca. 2 %
20 Hz 1000 ms
”late onset spike discharge”ca. 7 %
∆F/F= 0,1%
100 ms
∆F/F= 0,2%
0ms
6.1
12.2
18.3
0ms
6.1
12.2
18.3
∆F/F
= 0,
1 %
∆F/F
= 0,
1 %
Ergebnisse 135
4.3.2 Optische Registrierung von Nervenzellaktivität im Plexussubmucosus der Maus
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 161718 1920 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3435363738 39T 1 2 3 4 5 6 7 891011121314
Im Plexus submucosus der Maus konnten bei insgesamt 23 Ganglien (acht Tiere)
mit über 122 Neuronen Nervenzellantworten optisch untersucht werden.
Applikation von 0,5 mM ACh auf murine enterische Ganglien (n= 21, sieben
Tiere) führte zu einer Entladung von Aktionspotentialsalven (Abb. 40, 41). Bei
ACh-Applikation mit einer Dauer von 200-500 ms lag die Frequenz der induzierten
Aktionspotentialentladungen im Bereich von 5,0 bis 51,5 Hz. Die ACh-Wirkung hielt
abhängig von der Dauer des Meßzeitraums bis zu 2,7 s an. Sowohl Dauer als auch
Frequenz der Aktionspotentialentladung erwiesen sich Dosis-korreliert, d. h. eine
ansteigende Dauer der ACh-Applikation führte sowohl zu einer Erhöhung der
Frequenz als auch zur Erhöhung der Anzahl ausgelöster Aktionspotentiale in den
Neuronen (s. Abb. 42). Die Dauer der ausgelösten Aktionspotentiale lag bei
5,7 ± 1,6 ms (n= 50).
Bei 41 Neuronen (n= 10 Ganglien, drei Tiere) wurde die Neuropharmakologie
der ACh-Antwort untersucht (Abb. 17, Abb. 41). Der nAChR-Antagonist
Mecamylamin (200 µM) blockierte die Aktionspotentialentladung in 39 der 41 mit
100 ms 50 ms 20 msACh
500 ms
∆F/F=0,08 %
10 ms
Abbildung 40: Optische Registrierung der Acetylcholin-Antwort eines submukösen Neuron
der Maus. Die Applikation von ACh (0,5 mM; Pfeil) induziert Aktionspotentialentladun-
gen, die abhängig von der Dauer der ACh-Gabe ansteigen. Bei der Applikationsdauer von
10 ms, 20 ms, 50 ms und 100 ms wurden 1, 3, 10, und 17 Aktionspotentiale während des
Meßzeitraumes von 3,1 s ausgelöst. Die optischen Daten wurden mit einem Butterworth-
Tiefpass bei 170 Hz gefiltert.
136 Eigene Untersuchungen
ACh stimulierten Neurone (95,1 %), was auf eine nikotinerg vermittelte
ACh-Wirkung schließen ließ (s. auch Abb. 17, S. 95). Bei zwei der 41 untersuchten
Neurone (4,9 %) trat eine Mecamylamin-sensitive Antwort auf, die mit einer
reversiblen Senkung der Entladungsfrequenz von 40 Hz auf 8 Hz bzw. von 51,5 Hz
auf 3 Hz verbunden war und somit eine ebenfalls nikotinerg vermittelte
ACh-Wirkung aufzeigte (s. Abb. 41). Die verbleibende nicht-nikotinerge Antwort ist
sehr wahrscheinlich durch muskarinerge Rezeptoren vermittelt.
500 ms
Kontrolle Mecamylamin(200 µM)
Auswaschen10 min
∆F/F=0,05%
ACh ACh ACh1 s 1 s 1 s
Abbildung 41: Optische Aktivität eines murinen submukösen Neuron nach Spritz-
applikation Acetylcholin (0,5 mM; 1 s; Pfeil). In Anwesenheit des nAChR-Antagonisten
Mecamylamin senkte sich bei diesem Neuron die Frequenz der Aktionspotentialentladung
von 40 Hz auf 8 Hz. Nach Auswaschen des nAChR-Antagonisten konnte auf
ACh-Applikation die vorherige Zellantwort wieder ausgelöst werden.
Die Nervenzellzahl konnte bei 12 Ganglien (sechs Tiere), die mit
Di-8-ANEPPS gefärbt worden waren, ermittelt werden. Im Mittel befanden sich 5,2 ±
2,6 Neurone in einem Ganglion (Bereich: 2-10 Neurone, Median: 5). Bei Applikation
von ACh auf die murinen submukösen Ganglien haben durchschnittlich 87,8 % ±
17,8 % (Bereich: 40-100 %, Median: 95 %) der Neurone innerhalb eines Ganglion
auf ACh-Stimulation geantwortet (s. Tab. 15). Bezogen auf die
Ergebnisse 137
Gesamtneuronenzahl haben von 62 Nervenzellen 54 (87 %) auf Gabe von ACh
reagiert. 13 % der Neurone zeigten keine Antwort.
Etwa 2 % (n= 2) der murinen submukösen Neurone zeigten während des
Meßzeitraumes von zwei bis sechs Sekunden spontane Aktivität.
Durch elektrische Stimulation interganglionärer Nervenfasern konnte bei der
Maus Aktivität in Form von f EPSP und s EPSP induziert werden. Dies war
allerdings bei den wenigsten Ganglien (< 15 %, n= 3 Ganglien) möglich, da
interganglionäre Nervenstränge nur schwierig zu identifizieren waren. Abbildung 43
zeigt ein submuköses Ganglion, dessen interganglionärer Nervenstrang stimuliert
wurde. Während einer Pulssalve wurden alle Neurone innerhalb des Ganglion
aktiviert. Einige Neurone (s. Abb. 43 c, d) zeigten nach Ende der Stimulation eine
andauernde Aktionspotentialentladung, die auf das Vorhandensein von s EPSP
hindeutet.
Tabelle 15: Übersicht über den prozentualen Anteil von durch Acetylcholin aktiven
Neuronen innerhalb muriner submuköser Ganglien.
Nr. Neurone proGanglion
Antwortauf ACh
Anteilin %
M 1 4 3 75M 1 5 2 40M 1 7 7 100M 1 5 4 80M 2 5 4 80M 2 2 2 100M 3 8 7 88M 3 3 3 100M 3 2 2 100M 5 10 9 90M 6 8 8 100M 7 3 3 100
∑ 62 54 -Median 5 3,5 95
Mittelwert ±Standardabweichung
5,2 ± 2,6 4,5 ± 2,5 87,8 ± 17,8
138 Eigene Untersuchungen
4.3.2.1 Reproduzierbarkeit und S/N-Verhältnis
Die durch ACh-Applikation induzierten Membranpotentialänderungen konnten bei
einer Aufnahmedauer von 3,1 s mindestens achtmal innerhalb eines
Meßzeitraumes von 30 Minuten wiederholt werden. Nach elektrischer Stimulation
interganglionärer Nervenstränge zeigten die optisch gemessenen f EPSP während
eines Meßzeitraumes von etwa 80 Minuten mit durchschnittlich 13 Aufnahmen von
je 2,8 s Dauer eine reproduzierbare Signalcharakteristik.
Das ‚peak-to-peak‘ S/N-Verhältnis lag für die Aktionspotentiale der Maus bei
33 % ± 5 % der Amplitude der Aktionspotentiale (Bereich: 28 %-47 %, n= 15). Mit
einem 200 Hz Butterworth-Tiefpass betrug die relative Fluoreszenzänderung (∆F/F)
von Aktionspotentialen -0,29 % ± 0,15 %(Bereich: -0,11 % bis -0,63 %, n= 15)
Abbildung 42: Dosis-korrelierte
Entladung von Aktionspotentialen
von vier murinen submukösen
Neuronen ( , , , ) nach Gabe von
0,5 mM Acetylcholin in ansteigender
Dauer der Spritzapplikation. Auf der
Ordinate ist die Aktionspotential-
frequenz in Hz angegeben.
Dauer der ACh- Applikation (ms)
AP-
Fre
quen
z (H
z)
14
12
10
8
6
4
300200100
2
0
0
Ergebnisse 139
A
25 µm
dc
b
a
B
a
C
b d
c
20 ms
1 s∆F/F=0,2%
∆F/F=0,15%
Abbildung 43: Darstellung optischer Aktivität in einem murinen submukösen Ganglion
nach elektrischer Stimulation eines interganglionären Nervenstranges mittels Pulssalve.
A Videobild des Ganglion gefärbt mit Di-8-ANEPPS. Zellgrenzen und Ganglionumrisse
sind zu erkennen. B Ganglion wurde auf das Photodioden-Array projiziert, um die mit den
Neuronen korrespondierenden Photodioden zu identifizieren. C sind optische Signale von
vier Dioden nach elektrischer Stimulation (20 Pulse, 20 Hz, 400 µs Pulsdauer, 1 s ).
a zeigt die Aktivität gemessen auf einem interganglionären Nervenstrang. b ist die Aktivität
eines Neuron, in dem durch die Stimulation f EPSP ausgelöst wurden. c und d sind optische
Signale zweier Neurone, die nach Ende der Pulssalve eine s EPSP ähnliche Aktivität zeigen.
Bei d sind außerdem zwei Signale mit expandierter Zeitachse darstellt. Das linke Signal
zeigt ein f EPSP induziertes Aktionspotential mit ausgeprägter Schulter, die bei der
Entladung von Aktionspotentialen im Zuge des s EPSP fehlt. Die optischen Signale wurden
mit 170 Hz Tief- und mit 7,7 Hz Hochpass gefiltert.
140
5 DiskussionZiel dieser Arbeit war es, die „Multi-Site Optical Recording Technique“, MSORT, am
enterischen Nervensystem (ENS) des Dickdarms von Meerschweinchen, Maus und
vom Menschen zu etablieren, um Nervenzellaktivität von einer Vielzahl enterischer
Neurone auf Einzelzellebene simultan zu erfassen. Diese drei Spezies wurden
gewählt, weil das Meerschweinchen etabliertes Modelltier in der
Neurogastroenterologie ist und die Maus durch die Möglichkeit von „knock-out“
Tieren für zukünftige Fragestellungen im ENS an Bedeutung gewinnt. Die
Verfügbarkeit von Humandarm erlaubte auch im Hinblick auf gastrointestinale
Erkrankungen, die MSORT erstmals auch am Menschen zu etablieren, um
physiologische Mechanismen am Darmnervensystem zu charakterisieren. Ziel war
es, diese Untersuchungen an frischem, nicht enzymatisch behandelten Gewebe
durchzuführen. Für die Untersuchungen mit der MSORT wurden die
spannungssensitiven Farbstoffe Di-8-ANEPPS, Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ
aus der Klasse der Naphthylstyrylfarbstoffe gewählt und auf ihre Anwendbarkeit am
ENS getestet. Die jeweiligen Gewebe waren für die Messungen so mit einem
spannungssensitiven Farbstoff zu beladen, daß optisch gemessene Signale
reproduzierbar detektiert werden konnten. Die erhaltenen Signale sollten dann
weitgehend charakterisiert und das Potential dieser Methode ermittelt werden.
Darüber hinaus sollte eine Kombination der MSORT mit immunhistochemischen
Techniken überprüft werden. Zum Schwerpunkt der Arbeit wurde bei den
neuropharmakologischen Studien hauptsächlich das Humangewebe, da es trotz der
klinischen Relevanz an Kenntnissen über grundlegende elektrophysiologische
Eigenschaften des humanen ENS mangelt und da sich hier durch die optimale
Eignung der getesteten spannungssensitiven Farbstoffe eine effektive
Versuchsdurchführung ergab. Die Färbecharakteristika der verschiedenen Gewebe,
die Vorteile und Limitationen der optischen Methode sowie die Ergebnisse der
neuropharmakologischen Studien sind zu diskutieren. Abschließend erfolgt ein
Ausblick über zukünftige Anwendungsmöglichkeiten der MSORT am ENS.
Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe im ENS 141
5.1 Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe Di-8-ANEPPS,Di-4-ANEPPS und Di-8-ANEPPQ im enterischenNervensystem
Entscheidender Schritt für die Durchführung und Anwendung der MSORT am
enterischen Nervensystem ist die Integration eines potentiometrischen
Fluoreszenzfarbstoffs in die Nervenzellmembran. Intramembranal gelegene
spannungssensitive Farbstoffmoleküle detektieren Spannungstransienten, indem
sich die spektralen Farbstoffeigenschaften ändern. Dies erfordert prinzipiell eine
hohe Sensitivität, ausreichende Fluoreszenzintensität und eine gleichzeitig geringe
Phototoxizität der gewählten Farbstoffe, um elektrische Potentialdifferenzen als
optisches Signal vom störenden Meßrauschen abheben und erfassen zu können.
Neben diesen Farbstoffeigenschaften ist die Einlagerung in nicht-neuronales
Gewebe ein weiteres wesentliches Kriterium, um Membranpotentialänderungen mit
einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis detektieren zu können. Zum
nicht-neuronalen Gewebe gehören Muskelfasern, Bindegewebszellen,
Fettgewebszellen sowie Blutgefäße. Die Verankerung der Farbstoffmoleküle in
nicht-neuronale Membranen führt durch eine hohe Hintergrundfärbung zu einer
Verschlechterung der Signaldetektion. Die Eignung des spannungssensitiven
Farbstoffes war somit bei optischen Untersuchungen der zentrale Faktor, da mit ihm
- unabhängig von der apparativen Ausstattung - die Versuchsdurchführung steht
oder fällt. Da das membranphysiologische und membranspezifische Verhalten der
potentialsensitiven Farbstoffklassen weitgehend unerforscht ist, war eine
Vorhersage, ob sich ein Farbstoff für Untersuchungen eignet, nicht möglich. In
dieser Arbeit wurden spannungssensitive Farbstoffe erstmals am ENS des
Menschen und der Maus angewendet.
OBAID und Mitarbeiter verwendeten beim Meerschweinchen am Plexus
submucosus des Ileum vor der Gewebefärbung mit dem Farbstoff Di-8-ANEPPS ein
enzymatisches Protokoll, um durch Reduktion von nicht-neuronalem Gewebe, wie
beispielsweise Bindegewebe und Muskulatur, die Signalamplitude zu maximieren
(OBAID et al. 1992; OBAID et al. 1999). In den eigenen Untersuchungen konnte ein
Protokoll entwickelt werden, durch das optische Messungen am Plexus
142 Diskussion
submucosus im Kolon des Meerschweinchens sowie erstmals auch bei der Maus
möglich wurden, jedoch erwies sich der Andaugrad des Gewebes als nicht
reproduzierbar.
Am frischen Gewebe zeigten sich nach Inkubation mit Di-8-ANEPPS
unterschiedliche Färbecharakteristika für Maus, Meerschweinchen sowie für den
Menschen, die zu einer unterschiedlichen Eignung dieses Farbstoffes führten und
die die optische Registrierung im ENS der jeweiligen Spezies entweder
verhinderten, erschwerten oder, wie im Falle der Untersuchungen des Menschen,
eine effektive Versuchsdurchführung erlaubten. Zudem konnte gezeigt werden, daß
eine Anwendbarkeit des Farbstoffes am Plexus submucosus nicht gleichzeitig eine
Anwendbarkeit auch auf den myenterischen Plexus miteinschloß.
Ursachen der unterschiedlichen spezies- und plexusspezifischen
Gewebefärbung bei Maus, Meerschweinchen und beim Menschen sind
hauptsächlich im Zusammenhang mit dem Anteil nicht-neuronalen Gewebes zu
sehen, wodurch die Penetration der Farbstoffmoleküle zum Zielgewebe erschwert
wurde oder die Bindung des Farbstoffes an nicht-neuronales Gewebe zu einer
erhöhten Hintergrundfärbung führte. Inwieweit eine Verschiebung der
Farbstoffspektra, wie sie für die Farbstoffklasse der Merocyanine zwischen
Invertebraten und Vertebraten beschrieben wurde (ROSS u. REICHARDT 1979),
bei den eigenen Untersuchungen mit Styrylfarbstoffen möglich erscheint, ist fraglich.
Optische Signale konnten bei der Maus mit Di-8-ANEPPS an enzymatisch
behandelten Ganglien abgeleitet werden. Dies deutet darauf hin, daß eine
verminderte oder ausbleibende Signaldetektion bei frischem Gewebe primär auf
dem Vorhandensein und einer unterschiedlichen Zusammensetzung und Dichtigkeit
des nicht-neuronalen Gewebes beruht und nicht von einer Änderung der spektralen
Farbstoffeigenschaften abhängt. Daß die Färbung und Färbequalität in gewissem
Umfang auch durch die Art der Farbstoffapplikation beeinflußt werden konnte,
wurde durch die in dieser Arbeit entwickelte lokale Applikation einer konzentrierten
Farbstofflösung gezeigt. Bei der Maus wurde dadurch eine optische Ableitung an
frischem Gewebe überhaupt erst ermöglicht. Die mit lokaler hochkonzentrierter
Farbstoffapplikation gleichzeitig verbundene hohe Lösungsmittelkonzentration von
Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe im ENS 143
DMSO, die möglichst nicht über 0,1 % liegen sollte (SCHEMANN, persönliche
Mitteilung), schien offensichtlich aufgrund der kurzen Inkubationszeit das
Nervengewebe nicht zu beeinflussen, was in Kombination mit intrazellulärer
Ableitung bestätigt werden konnte (NEUNLIST et al. 1999b).
Die Färbecharakteristik mit den eingesetzten spannungssensitiven
Farbstoffen kann zusammengefaßt wie folgt bewertet werden: Es konnte gezeigt
werden, daß Di-8-ANEPPS für Studien am Plexus submucosus im Kolon und
Rektum des Menschen ein Farbstoff ist, der eine optimale Eignung für optische
Messungen besitzt, da neben einer reproduzierbar guten Anfärbung des neuronalen
Zielgewebes, schon in der Vitalfärbung ein Erkennen der Nervenzellumrisse
ermöglicht wurde. Dadurch steigerte sich die Effektivität der Versuchsdurchführung.
Beim Meerschweinchen wurde die Effektivität der Untersuchungen deswegen
eingeschränkt, weil die fluoreszenzoptische Identifizierung einzelner Nervenzellen
beim frischen, nicht-enzymatisch behandelten Gewebe erschwert war. Es wäre
wünschenswert, einen Farbstoff zu finden, der dies auch hier ermöglicht.
Bei der Maus war Di-8-ANEPPS am frischen submukösen Gewebe selbst bei
lokaler Färbung nicht ausreichend, da Ganglien nur vereinzelt anzufärben waren.
Eine enzymatische Vorbehandlung des Gewebes ist bei der Anwendung von
Di-8-ANEPPS generell empfehlenswert, um eine befriedigende Erfolgsquote bei der
optischen Registrierung zu erhalten. Es bleibt weiteren Untersuchungen
vorbehalten, für frisch präpariertes murines Gewebe (Plexus submucosus, Plexus
myentericus) andere potentiometrische Chromophore auf ihre Eignung zu testen.
Das Derivat Di-4-ANEPPS eignete sich nicht für die Anwendung am ENS des Kolon
von Maus und Meerschweinchen, und das extrazellulär applizierte Di-8-ANEPPQ
bot keine verbesserte Färbung verglichen mit Di-8-ANEPPS.
Die eigenen Untersuchungen unterschieden sich in einigen wesentlichen Punkten
von den Untersuchungen von OBAID und Mitarbeitern. Das von OBAID et al. (1992)
verwendete Färbeprotokoll für Di-8-ANEPPS gewährleistete in der vorliegenden
Arbeit trotz kurzer Belichtungszeiten von 1-3 s nicht die mehrmalige
Reproduzierbarkeit der optischen Signalantwort. Das Ausbleiben der Signalantwort
144 Diskussion
nach kurzer Belichtung und die Veränderung der Signalcharakteristik durch die
Verbreiterung der Signaldauer und die rapide Abnahme der Amplitude deuteten auf
phototoxische Schäden hin. Phototoxizität entsteht durch reaktiven
Singulett-Sauerstoff, der durch Farbstoffmoleküle im Anregungszustand
hervorgerufen wird (KALYANARAMAN et al. 1987; POOLER 1972; POOLER u.
VALENZENO 1979). Eine 90%ige Reduzierung der Farbstoffkonzentration führte in
der vorliegenden Arbeit bei der systemischen Färbung zu einer verlängerten
Gesamtbelichtungsdauer ohne Veränderung der Signalcharakteristik. Durch die
Senkung der Farbstoffkonzentration konnte die Radikalbildung von singulärem
Sauerstoff vermutlich reduziert werden. Dabei schienen sich lange
Belichtungspausen und möglichst kurze Belichtungszeiten (im Bereich von 1-2 s)
als positiv auf die Gesamtbelichtungszeit auszuwirken. Die trotz hoher
Farbstoffkonzentration von OBAID und Mitarbeitern erzielten Belichtungszeiten von
1minütiger (OBAID et al. 1992) bzw. 5minütiger (OBAID et al. 1999) Dauer wurden
vermutlich durch den Einsatz von Antioxidantien und Radikalfängern zur
Phototoxizitätssenkung ermöglicht, wobei eine wiederholte Belichtung jedoch nicht
realisierbar war. Antioxidantien und Radikalfänger wurden bei den eigenen
Untersuchungen nicht verwendet, da weder die Eigenwirkung dieser Substanzen
bekannt ist, noch Konzentrationsangaben existieren, die eine Beeinflussung
neuronaler Strukturen ausschließen lassen. Kritisch ist ebenfalls die von OBAID und
Mitarbeitern vorgenommene Senkung der Sauerstoffspannung im Perfusionsbad
zur Reduzierung der Phototoxizität (OBAID et al. 1992; OBAID et al. 1999), da
gerade für Nervengewebe die Sauerstoffversorgung essentiell ist. Zwar wurde
gleichzeitig die Stoffwechselaktivität durch Senkung der Versuchstemperatur von
37 °C auf Raumtemperatur verringert, allerdings führen Untersuchungen bei
Raumtemperatur zu einer Veränderung der Signale, indem sich beispielsweise die
Dauer verlängert. In den eigenen Untersuchungen konnte durch die vorgenommene
90%ige Senkung der Farbstoffkonzentration auf die Reduzierung der
Sauerstoffspannung und der Versuchstemperatur verzichtet werden. Zudem muß
bei der von OBAID et al. (1992, 1999) verwendeten enzymatischen Andauung des
Plexus submucosus die Frage nach der Vitalität des Gewebes gestellt werden.
Einsatz der spannungssensitiven Farbstoffe im ENS 145
Durch eine verbesserte Art der Farbstoffapplikation, d.h. durch die lokale Färbung
einzelner Ganglien, konnte im Rahmen dieser Arbeit auf eine enzymatische
Vorbehandlung verzichtet werden, so daß der Einsatz von frischem Gewebe
erstmals möglich wurde. In der vorliegenden Arbeit führten somit mehrere
entscheidende Modifikationen zu einer verbesserten optischen Registrierung, die
näher an den physiologischen Bedingungen liegt, als das von OBAID et al. (1992)
beschriebene Protokoll.
5.2 Vorteile und Limitationen der MSORT
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß mit der MSORT
eine große Anzahl enterischer Neurone simultan untersucht und auf Einzelzellebene
analysiert werden kann. Damit ist es möglich, innerhalb kurzer Zeit eine Vielzahl
enterischer Neurone unabhängig von ihrer Zellgröße zu untersuchen und die
interneuronale Kommunikation zu analysieren, wobei zugleich die zeitliche und
räumliche Erregungsausbreitung nicht nur innerhalb eines Ganglion, sondern auch
entlang interganglionärer Nervenstränge festgehalten werden kann. Im Vergleich zu
intrazellulären Ableitungen handelt es sich bei der optischen Technik um eine
nicht-invasive Methode, da ein Anstechen der Nervenzellen zur
Membranpotentialmessung nicht erforderlich ist.
Die in der vorliegenden Arbeit erfolgte Charakterisierung der optischen
Signale anhand neuropharmakologischer Untersuchungen mit spezifischen
Antagonisten und anhand der verschiedenen Signaleigenschaften zeigte, daß eine
weitgehende Übereinstimmung mit Daten elektrophysiologischer Techniken
existierte. Der direkte Vergleich zwischen optisch registrierten Signalen und
intrazellulärer Ableitung wurde durch den kombinierten Einsatz beider Techniken im
ENS des Meerschweinchens untersucht (NEUNLIST et al. 1999b). Wir konnten die
intrazellulär gemessenen Signale wie f EPSP und s EPSP gleichzeitig in den
optischen Messungen registrieren, wobei langsame Depolarisation des s EPSP
aufgrund der AC-Kopplung des Systems nicht gemessen werden konnten.
Hingegen wurden die infolge depolarisierender intrazellulärer Pulse ausgelösten
146 Diskussion
Aktionspotentiale ebenso, wie die durch das s EPSP generierten Aktionspotentiale
registriert. Hinsichtlich der Signalform fiel bei den optisch abgeleiteten f EPSP und
auch bei den Aktionspotentialen ein schnellerer Zeitverlauf auf: „fast-response
probes“ sind in der Lage, Membranpotentialänderungen besser als Mikroelektroden
darzustellen (MULLER et al. 1986).
Trotz der weitgehend übereinstimmenden Daten erfordert die optische
Messung neuronaler Spannungstransienten verglichen mit konventionellen
elektrophysiologischen Techniken ein Umdenken hinsichtlich der
Versuchsdurchführung und der Interpretation der Ergebnisse. Hierfür sind folgende
Faktoren wesentlich:
• Direkte Manipulationen des Membranpotentials über Applikation intrazellulärer
Strompulse sind durch den alleinigen Einsatz der optischen Methode nicht
möglich. So können mit der MSORT beispielsweise antidrome von orthodromen
Potentialen nicht - wie in der intrazellulären Ableitung durch Klemmen der
Membranspannung - differenziert werden. Allein anhand der Signalmorphologie
kann keine Unterscheidung getroffen werden, da es sich richtungsunabhängig
jeweils um Aktionspotentiale handelt.
Eine Abgrenzung zum f EPSP kann jedoch über neuropharmakologische
Ansätze erfolgen.
• Im Verlaufe der eigenen Untersuchungen zeigte sich jedoch, daß der Einsatz
von Calcium-depletierter Lösung oder Cobald-/Cadmiumchlorid-Lösung zur
Unterscheidung synaptischer oder antidromer Potentiale nur mit Einschränkung
bei optischen Messungen verwendet werden kann. Die auftretenden Probleme
waren gekennzeichnet durch einen rapiden Abfall der Amplitude und die
Verbreiterung der Signaldauer. Ursächlich könnten phototoxische Effekte,
Veränderungen der Farbstoffmoleküle oder Änderungen in der Membranfluidität
bzw. -stabilität zugrunde liegen. Bisher liegen für ‚fast-response probes‘
allerdings keinerlei Literaturdaten vor, die dieses Phänomen erklären könnten.
Für die Anwendung von ‚slow-response probes‘ ist die Möglichkeit zur Bildung
nichtfluoreszierender Komplexe mit verschiedenen Pharmaka (z. B. Phloretin,
Vorteile und Limitationen der MSORT 147
Dinitrophenol, Antimycin A) beschrieben (WAGGONER 1979). Da jedoch bei
dieser Farbstoffklasse generell andere Membraninteraktionen und
Funktionsmechanismen vorliegen, ist ein Vergleich mit ‚fast-response probes‘
nicht möglich. In Kombination mit intrazellulären Ableitungen konnten bei
Di-8-ANEPPS gefärbten Geweben Hinweise gefunden werden, daß in
Anwesenheit der Cobald/Cadmium-Lösung keine Nervenzellerregung mehr
durch intrazelluläre Pulse ausgelöst werden konnte (KAMM, unveröffentlichte
Ergebnisse), was auf eine irreversible Schädigung der Nervenzelle hindeutet.
• Die gängigen elektrophysiologischen Klassifikationsschemata intrazellulärer
Ableitungen und Unterscheidung in AH- und S-Neurone können bisher direkt
nicht vorgenommen werden. Die für AH-Neurone typische
Nachhyperpolarisation des Aktionspotentials sowie die Calcium-bedingte
‚Schulter‘ in der Repolarisationsphase, die eine verlängerte
Aktionspotentialdauer im Vergleich zu S-Neuronen bedingt, können in der
verwendeten Systemkonfiguration anhand des Signalverlaufes nicht identifiziert
werden. Ein direkter Vergleich von elektrophysiologischen Daten und optisch
gewonnenen Daten ist deshalb nur in beschränktem Umfang möglich. Eine
neuropharmakologische Unterscheidung könnte jedoch durch den Einsatz von
TTX getroffen werden, da Aktionspotentiale von AH-Neuronen im Gegensatz zu
S-Neuronen nur geringe TTX-Sensitivität aufweisen (HIRST et al. 1974; HIRST
et al. 1985). Inwieweit das Signal-Rausch-Verhältnis für eine sichere
Identifizierung ausreicht, müßte in Kombination mit intrazellulären Ableitungen
untersucht werden.
• Mit der in dieser Studie verwendeten Systemkonfiguration (relative Fluoreszenz-
änderung, AC-Kopplung) konnten quantitative Messungen der Änderungen des
Membranpotentials sowie die Messung langsamer Depolarisationen oder
Hyperpolarisation nicht bestimmt werden. Die Identifizierung von s EPSP und
s IPSP ist damit nur mit Einschränkung oder indirekt möglich. Für die
Identifizierung von s EPSP ist die gleichzeitige neuropharmakologische
Untersuchung mit nAChR-Antagonisten notwendig, um eine sichere Abgrenzung
148 Diskussion
zu f EPSP zu erhalten. IPSP können nur dann identifiziert werden, wenn eine
zuvor beobachtete Erregung nicht mehr induziert werden kann oder reduziert ist.
• Die kontinuierliche Ableitung von Nervenzellaktivität über mehrere Minuten bis
Stunden ist aufgrund der Phototoxizität der Farbstoffe limitiert. Um
photodynamische Schäden zu reduzieren und einen längeren Meßzeitraum zu
ermöglichen, werden bei optischen Messungen Antioxidantien und
Radikalfänger eingesetzt (OBAID et al. 1992; OBAID et al. 1999; SCHAFFER et
al. 1994). Kontinuierliche Aufnahmen von 5 min werden beschrieben,
wiederholte Messungen sind aber dennoch nicht möglich (OBAID et al. 1999).
Bei den optischen Messungen handelt es sich, verglichen mit intrazellulären
Techniken, die 30 min bis zu 6 Stunden permanent ableiten können, um
Momentaufnahmen. Die weitere Entwicklung neuer Farbstoffe mit verminderten
phototoxischen Eigenschaften und der gezielte Einsatz von Antioxidantien
könnten die optische Technik weiter verbessern. Allerdings ist noch nicht geklärt,
welchen Einfluß Antioxidantien selbst auf die Vitalfunktion der Nervenzellen
besitzen und in welchen Konzentrationen diese Stoffe angewendet werden
können.
In den letzten Jahren wurden mehrere nicht-invasive Techniken etabliert, die
enterische Nervenzellaktivität registrieren und visuell erfaßbar machen. Zunächst
beschränkten sich diese Methoden auf sehr langsame Änderungen nervaler
Aktivitätslevel. So wurde eine Erhöhung der Cytochrom-Oxidase-Aktivität als
Hinweis für eine gesteigerte neuronale Aktivität beschrieben (MAWE u. GERSHON
1986). Die Expression des DNA-Bindungsproteins Fos, einem
Transskriptionsprodukt von c-fos Proonkogenen, wurde ebenfalls in mehreren
Studien als Indikator für Transskriptions-Translations-Aktivität und damit als
Parameter für stimulusinduzierte nervale Aktivität eingesetzt (KIRCHGESSNER et
al. 1992; MIAMPAMBA et al. 1997; SHARKEY et al. 1999). Der Nachteil dieser
beiden Methoden liegt darin, daß sie nur sehr langsame Änderungen widerspiegeln
und der Stimulus über mehrere Minuten bzw. Stunden andauern muß. Zudem
Vorteile und Limitationen der MSORT 149
belegte eine Studie die eingeschränkte Spezifität der stimulusinduzierten Fos
Expression (RITTER et al. 1997).
Eine verbesserte räumliche und zeitliche Auflösung konnte durch die optische
Registrierung neuronaler Calciumionenströme („Calcium-Signaling“,
„Calcium-Imaging“) erzielt werden. Allerdings können auch mit dieser bisher am
ENS etablierten Methode schnelle Änderungen der Nervenzellaktivität nicht
aufgelöst werden, da die Calciumfluxe nur im Sekundenbereich detektiert werden
(KIMBALL u. MULHOLLAND 1995; SIMEONE et al. 1996; VANDEN BERGHE et al.
2000). Darüber hinaus ist eine Änderung intrazellulärer Calciumkonzentrationen
kein direkter Hinweis auf einen erhöhten oder erniedrigten Aktivitätslevel in
enterischen Nervenzellen, da intrazelluläre Calciumspiegel nicht zwingend mit einer
erhöhten oder verringerten elektrischen Aktivität korreliert sind, so daß hierfür die
Technik des „Calcium-Signaling“ mit intrazellulären Ableitungen (SHUTTLEWORTH
u. SMITH 1999; VOGALIS et al. 2000) kombiniert werden muß. Demgegenüber
besitzt die optische Registrierung neuronaler Spannungstransienten mit Hilfe der
„fast-response probes“ den Vorteil, Nervenzellerregung direkt und - verglichen mit
„slow-response probes“- in Echtzeit („Real-Time“) messen zu können. Die in der
vorliegenden Arbeit etablierte MSORT ist in der Lage, mit einer hohen räumlichen
und zeitlichen Auflösung Aktionspotentialentladungen sowie unterschwellige
synaptische Vorgänge zu registrieren und somit Nervenzellerregungen direkt zu
messen (NEUNLIST et al. 1999b). Die MSORT ermöglicht damit erstmals die
Registrierung aller Nervenzellen in einem Ganglion und die Darstellung der
Erregungsausbreitung innerhalb und zwischen enterischen Ganglien.
Wie die vorliegende Arbeit zeigte, liegt das Potential von der MSORT auch
darin, direkte Ableitungen in humanen Darmgeweben einschließlich Bioptaten
durchzuführen. Bisher existierte aufgrund methodischer Limitationen nur eine
Studie, die den Versuch unternommen hatte, mit intrazellulären Ableitungen
enterische Neurone in Humangeweben zu untersuchen. BROOKES et al. (1987)
benötigten mehrere Jahre, um 27 Nervenzellen im Plexus myentericus intrazellulär
abzuleiten. Im Vergleich dazu ist mit der MSORT eine Charakterisierung von
Nervenzellzahlen in dieser Größenordnung innerhalb eines Versuchstages möglich.
150 Diskussion
Damit ist die MSORT nicht nur eine wertvolle und konkurrenzfähige Alternative zu
bisherigen konventionellen elektrophysiologischen Techniken, sondern sie ist die
einzige Methode, die in Zukunft intrazelluläre Ableitungen ersetzen könnte.
Zukünftige Herausforderungen auf dem Gebiet der Neurogastroenterologie liegen
also in der nicht-invasiven Ableitung neuronaler Aktivität im enterischen
Nervensystem.
5.3 Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen amHumandarm
Mit der MSORT sollte am Humangewebe untersucht werden, welche
Neurotransmitter bei der schnellen neuro-neuronalen Übertragung im Plexus
submucosus von Kolon und Rektum beteiligt sind und ob Acetylcholin alleiniger
Neurotransmitter bei der schnellen synaptischen Übertragung ist. Weiterhin sollte
festgestellt werden, welche Aktivitätsmuster im ENS des Menschen existieren.
Außerdem sollte eine Aussage über das Verteilungsmuster der Erregung nach
oraler und analer Stimulation innerhalb enterischer Ganglien getroffen werden.
In der vorliegenden Studie konnte beim Menschen im submukösen Plexus
von Kolon und Rektum die Rolle nikotinerger Mechanismen im Zusammenhang mit
schnellen EPSP bei der neuro-neuronalen Kommunikation aufgezeigt werden.
Acetylcholin ist über nikotinerge Rezeptoren Transmitter bei der schnellen
synaptischen Übertragung im Plexus submucosus des Menschen. Etwa 96 % der
induzierten f EPSP wurden durch den nAChR-Antagonisten Hexamethonium
vollständig blockiert und erschienen allein durch ACh vermittelt zu werden. Direkte
Spritzapplikation von ACh auf submuköse Neurone bewirkte bei den getesteten
Nervenzellen gleichermaßen Änderungen des Membranpotentials, die durch den
nAChR-Antagonisten Hexamethonium reduziert bzw. vollständig blockiert wurden.
Damit konnte gezeigt werden, daß ACh auch auf Einzelzellebene im Humandarm
als wesentlicher Neurotransmitter fungiert, was in Übereinstimmung mit
Ergebnissen funktioneller Untersuchungen im humanen Kolon steht, die die
wesentliche Bedeutung cholinerger, nikotinerger Mechanismen bei der Kontrolle der
Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen am Humandarm 151
Motilität aufgezeigt haben (FISHLOCK u. PARKES 1963). Immunhistochemische
Studien bestätigen ebenfalls, daß das zur ACh-Synthese relevante Enzym, die
ChAT, bei mehr als 50 % der Neurone im submukösen Plexus des Dickdarms
prominent ist (PORTER et al. 1996), im Rektum sind es annähernd 90 %
(SCHNEIDER et al. 2001). ACh kann damit auch im Humandarm als
Haupttransmitter angesehen werden, wie es schon für verschiedene Spezies u. a.
Meerschweinchen, Schwein, Ratte, Maus und Frettchen gezeigt wurde (LOMAX u.
FURNESS 2000; MANN et al. 1999; SANG u. YOUNG 1998; SANN et al. 1998;
TIMMERMANS et al. 2001).
Allerdings zeigten im humanen Plexus submucosus einige Nervenzellen in
Anwesenheit des nAChR-Antagonisten Hexamethonium weitere synaptische
Aktivität, die das Vorliegen einer nicht-cholinergen Komponente aufzeigte. Dies
steht im Gegensatz zu bisherigen Befunden im Plexus submucosus des
Meerschweinchens, wo f EPSP durch nAChR-Antagonisten vollständig blockiert
werden (EVANS u. SURPRENANT 1992; GALLIGAN et al. 2000). Die Existenz von
nicht-cholinergen f EPSP korreliert jedoch mit Untersuchungsergebnissen im Plexus
myentericus des Meerschweinchens (GALLIGAN u. BERTRAND 1994). Hier zeigen
nur etwa 25 % der f EPSP eine vollständige Blockade durch nAChR-Antagonisten.
Dreiviertel der Neurone weisen eine nicht-cholinerge Komponente auf, die
hauptsächlich durch ATP und zu etwa 10 % durch Serotonin vermittelt wird. Als
weiterer exzitatorischer Kotransmitter von ACh wird bei AH/Typ 2-Neuronen
Glutamat diskutiert, das über postsynaptische AMPA-Rezeptoren glutamaterge
f EPSP auslöst (LIU et al. 1997).
Die inhibitive Wirkung des P2-Antagonisten Suramin bei den eigenen
Untersuchungen zeigte, daß im Plexus submucosus des Menschen nicht-cholinerge
f EPSP ebenfalls durch ATP vermittelt werden. Damit konnte in der vorliegenden
Arbeit erstmals ATP als Neurotransmitter der schnellen neuro-neuronalen
Übertragung im ENS des Menschen nachgewiesen werden. Ob alle
nicht-cholinergen f EPSP auch ATP vermittelt sind und nicht noch weitere
Neurotransmitter wie Serotonin oder Glutamat beteiligt sind, muß zukünftigen
Untersuchungen vorbehalten bleiben. Die Existenz von nicht-cholinergen f EPSP im
152 Diskussion
Plexus submucosus läßt, verglichen mit dem Plexus submucosus des
Meerschweinchens, speziesspezifische und funktionelle Unterschiede vermuten. Es
wird angenommen, daß ATP am Plexus myentericus ein Transmitter
deszendierender Interneurone ist, die neben ACh Somatostatin oder Serotonin als
Kotransmitter besitzen (GALLIGAN et al. 2000; LEPARD et al. 1997; SPENCER et
al. 2000). Einige Autoren sehen ATP aber auch als Neurotransmitter der primär
afferenten, sensorischen Neurone (BROOKES et al. 1995; FURNESS 2000). Beide
diskutierten Funktionen von ATP könnten im Plexus submucosus des Menschen
zutreffen.
Überraschend ist die Tatsache, daß in den eigenen Untersuchungen einige f EPSP
(n= 4) mit einer nicht-nikotinergen Komponente durch den mAChR-Atropin blockiert
werden konnten. Als Erklärungsmöglichkeiten stehen zur Diskussion:
• Schnelle postsynaptische Potentiale werden durch ACh über muskarinerge
postsynaptische Rezeptoren vermittelt. Dies würde im Gegensatz zu bisherigen
Literaturangaben stehen, bei denen f EPSP im ENS durch den
mAChR-Antagonisten Atropin nicht beeinflußt werden (BROOKES et al. 1987;
NISHI u. NORTH 1973; NORTH et al. 1985a).
• Neben der Ausschüttung von ACh kommt es zur Freisetzung eines
Kotransmitters, wobei die Freisetzung dieses nicht-nikotinergen Transmitters
erst über Aktivierung präsynaptischer muskarinerger ACh-Rezeptoren erfolgt.
Eine Blockade dieser präsynaptischen ACh-Rezeptoren mit
mAChR-Antagonisten würde die Freisetzung des Kotransmitters und damit das
nicht-nikotinerge f EPSP blockieren. Im Rückenmark der Ratte zeigen
Untersuchungen, daß durch muskarinerge Rezeptoren die Erregbarkeit
inhibitorischer Interneurone erhöht wird und die Freisetzung des
Neurotransmitters GABA gesteigert wird (BABA et al. 1998). Eine Verstärkung
der Transmitterfreisetzung über muskarinerge präsynaptische Rezeptoren wird
ebenfalls beim Nervus phrenicus angenommen (WESSLER 1989) und wird für
die Freisetzung von ACh in der Harnblase des Menschen beschrieben
(SOMOGYI u. DE GROAT 1999). Präsynaptische muskarinerge Rezeptoren
Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen am Humandarm 153
werden im enterischen Nervensystem nur im Zusammenhang mit präsynaptisch
hemmenden Mechanismen genannt, über die Acetylcholin seine eigene
Ausschüttung hemmt (NORTH et al. 1985a; WOOD 1994). Bisher ist lediglich
über nikotinerge Mechanismen die erhöhte Freisetzung von ACh beschrieben
worden (GALLIGAN 1999).
Die Reduzierung der Amplitude von f EPSP nach repetitiver Gabe von
Einzelstrompulsen, die bei einem Teil der Neurone auftrat, deutet im submukösen
Plexus des Menschen darauf hin, daß die Transmitterfreisetzung an der Synapse
abhängig von der Stimulationsfrequenz reduziert wird. Diese als „Rundown“
bezeichnete Inhibition erscheint in ähnlicher Weise beim Meerschweinchen im
Plexus submucosus des distalen Kolon (FRIELING et al. 1991b), im Plexus
myentericus des Dünndarms (DEMBOWSKI u. MAYER 1982; ORT et al. 1984) und
im Rektum (TAMURA u. WOOD 1989). Auf regionale Unterschiede weist das
Fehlen dieses Phänomens im Plexus myentericus des Kolon (WADE u. WOOD
1988) ebenso wie im Magen des Meerschweinchens hin (SCHEMANN u. WOOD
1989a; TACK u. WOOD 1992). Beim Schwein wurde hingegen im myenterischen
Plexus des Dünndarms kein „Rundown“ beobachtet, was zudem auf
speziesspezifische Unterschiede hindeutet (CORNELISSEN et al. 2001). Im Colon
descendens der Ratte zeigten anders als beim Meerschweinchen 22 % der
myenterischen Neurone „Rundown“ (BROWNING u. LEES 1996). Welche
funktionelle Bedeutung dieses Phänomen „Rundown“ innerhalb der enterischen
Schaltkreise besitzt, ist noch nicht geklärt. „Rundown“ wird z. T. durch
präsynaptische Hemmung der Acetylcholinausschüttung erklärt. Neben ACh,
welches über muskarinerge Rezeptoren wirkt, werden eine Reihe weiterer
Neurotransmitter wie beispielsweise Noradrenalin, NPY oder Serotonin diskutiert
(WOOD 1994).
Nach Blockierung des synaptischen Inputs durch den
nAChR-Antagonisten-Hexamethonium zeigten etwa zwei Drittel der Neurone
Aktionspotential-ähnliche Aktivität. Es konnte jedoch nicht abgeklärt werden, ob das
morphologische Korrelat dieser Aktionspotential-ähnlichen Aktivität auf dendritischer
154 Diskussion
oder axonaler Stimulation der entsprechenden Neurone beruhte. Nach Stimulation
mehrerer Nervenstränge können Rückschlüsse auf die Morphologie der Neurone
insofern nur bedingt geschlossen werden, da es sich sowohl um multidendritische,
multiaxonale als auch um bipolare Neurone, also Neurone mit einem axonalen und
einem dendritischen Nervenzellfortsatz handeln könnte. Im Plexus submucosus des
Dünndarms werden mukosal projizierende Nervenzellen mit multidendritischer
uniaxonaler Morphologie und Immunoreaktivität für Somatostatin und VIP
beschrieben, sowie Dogiel Typ II Neurone (HENS et al. 2000; TIMMERMANS et al.
2001), die als primär afferente (sensorische) Neurone diskutiert werden (KUNZE et
al. 1995; KUNZE u. FURNESS 1999). Im Kolon konnten nach retrograder
Markierung von Mukosa, Submukosa und Zirkulärmuskulatur bisher uniaxonale
Neurone mit filamentösen Dendriten nachgewiesen werden (PORTER et al. 1999).
Welche Funktion diese Neurone ausüben und welche morphologischen
Charakteristika generell submuköse Neurone im Humandarm besitzen, ist jedoch
noch weitgehend unklar.
Auffällig bei den eigenen Untersuchungen war der vergleichsweise geringe
Prozentsatz von s EPSP. Im Plexus submucosus des Meerschweinchens wurden in
intrazellulären Ableitungen s EPSP bei 40 % der Neurone registriert
(SURPRENANT 1984b). 64 % des S-Neurone und 74 % der AH-Neurone zeigen im
distalen Kolon s EPSP (FRIELING et al. 1991b). Im Plexus myentericus wird das
Vorkommen von s EPSP bei 25 % der Neurone angegeben (WADE u. WOOD
1988). Bei der Ratte wurde bei 8 % der myenterischen Neurone im Kolon s EPSP
beobachtet (CORNELISSEN et al. 2001). Im Dickdarm des Meerschweinchens
wurde bei 15 % der AH-Neurone s EPSP nachgewiesen (TAMURA u. WOOD
1989). Bei myenterischen, zur Mukosa projizierenden Neuronen konnten s EPSP in
dieser Subpopulation bei 94 % ausgelöst werden (NEUNLIST et al. 1999a). Ähnlich
wie in den eigenen Untersuchungen sind auch im myenterischen Plexus des
Menschen selten s EPSP abgeleitet worden (BROOKES et al. 1987). Dies
unterstreicht die Vermutung, daß speziesspezifische Unterschiede eine Rolle
spielen. Altersbedingte Änderungen in der Innervation (KOCH et al. 1986) als
Ursache für Unterschiede werden trotz des hohen Durchschnittsalters der
Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen am Humandarm 155
Patienten, verglichen mit Untersuchungen am Meerschweinchen, von BROOKES et
al. (1987) als unwahrscheinlich angesehen. Das seltene Vorkommen von s EPSP in
der vorliegenden Arbeit könnte außerdem methodisch bedingt sein. Langsame
Depolarisationen können mit diesem AC-gekoppelten System nicht registriert
werden (NEUNLIST et al. 1999b), so daß möglicherweise nur die s EPSP registriert
wurden, die überschwellig werden und als Folge Aktionspotentiale auslösten. Eine
Veränderung der Operationsgewebe durch die Manipulationen im Rahmen der
OP-Entnahme gilt als Ursache für die geringe Anzahl an s EPSP als
unwahrscheinlich (BROOKES et al. 1987).
Nervenzellen im enterischen Nervensystem lassen sich anhand ihrer
Tansmitterkodierung in verschiedene individuelle Gruppen einteilen. In der
vorliegenden Arbeit wurden drei Neurotransmitter immunhistochemisch untersucht:
VIP und Substanz P sowie ACh, das über das ACh-synthetisierende Enzym, die
ChAT, nachgewiesen wurde. Es zeigten mehr als die Hälfte aller optisch
untersuchten Neurone im Kolon und Rektum ChAT/VIP (56 %), gefolgt von
ChAT/- (30 %), ChAT/SP (5 %) und VIP/- (6 %). Eine Kolokalisation von ChAT/VIP
und Substanz P trat nicht auf. Dies ähnelt Daten vom Plexus submucosus des
humanen Rektum (SCHNEIDER et al. 2001): ChAT/VIP (58 %) bildete bei dieser
Untersuchung ebenfalls die größte Population, gefolgt von ChAT/- (22 %),
ChAT/SP (8 %) und VIP/- (2 %). Zwar konnten in der vorliegenden Studie keine
signifikanten Unterschiede zwischen dem neurochemischen Kode und der
jeweiligen elektrischen Aktivität gefunden werden, allerdings zeigten die nicht durch
f EPSP aktivierten Neurone, im Vergleich zu Neuronen mit f EPSP, eine
verhältnismäßig größere Population von ChAT/- als von ChAT/VIP Neuronen. Auch
im myenterischen Plexus existiert eine Population von ChAT-Neuronen, die keine
schnellen cholinergen EPSP aufweist. Diese Population enthält zusätzlich
Substanz P und Calbindin und fungiert als intrinsische primär afferente Neurone
(FURNESS et al. 1998; NEUNLIST u. SCHEMANN 1997; NEUNLIST et al. 1999a).
Anhand des neurochemischen Kodes Rückschlüsse auf die funktionelle Bedeutung
zu ziehen, ist derzeit für den Menschen nicht möglich. Auffällig ist, daß die Neurone,
156 Diskussion
die in dieser Arbeit nur durch anale Stimulation aktiviert wurden, signifikant mehr
ChAT/VIP aufwiesen, als nach oraler Stimulation, obwohl neuropharmakologisch
keine Unterschiede festgestellt werden konnten. Retrograde Tracingstudien im
humanen Kolon haben innerhalb des submukösen Plexus VIP-erge
Zirkulärmuskelmotoneurone identifiziert, die anale Projektionen zeigen (PORTER et
al. 1999). Die Autoren konnten jedoch polarisierte Projektionen VIP-erger
submuköser Neurone nicht feststellen. VIP-positive submuköse Neurone könnten
beim Menschen sowohl als Sekretomotoneurone, Interneurone oder
Zirkulärmuskelmotoneurone fungieren. Welche Bedeutung ChAT/VIP-Neurone im
Humandarm besitzen, die zudem die größte Population bilden, ist nicht geklärt.
Beim Meerschweinchen existiert im Kolon jedoch eine strikte Trennung zwischen
ChAT-positiven und VIP-positiven Neuronen (NEUNLIST et al. 1998; NEUNLIST u.
SCHEMANN 1998), ebenso wie im Dünndarm, wobei fast alle submukösen
Neurone durch diese beiden Transmitter identifiziert werden (BORNSTEIN u.
FURNESS 1992; GERSHON et al. 1994).
Im enterischen Nervensystem geht man davon aus, daß funktionell
individuelle Neurone nicht in speziellen Ganglien liegen, sondern sich auf
verschiedene Ganglien verteilen. Ein submuköses Ganglion könnte damit primär
afferente Neurone, Interneurone sowie Motoneurone beinhalten (COOKE u.
REDDIX 1994). In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die
Erregungsausbreitung innerhalb enterischer Ganglien nach elektrischer Stimulation
interganglionärer Nervenstränge registriert. Nach oraler bzw. analer Stimulation
konnten in der vorliegenden Studie etwa gleich viele Neurone aktiviert werden, was
darauf hindeutet, daß funktionell individuelle Neuronentypen nicht in einzelnen
Ganglien mit Projektionspräferenzen angeordnet sind. Untersuchungen mit
DiI-markierten, über Mukosa, Submukosa und Zirkulärmuskulatur
retrograd-gelabelten submukösen Neuronen zeigten beim Menschen weder orale
noch anale oder zirkumferentielle Projektionspräferenzen (PORTER et al. 1999).
Durch die Stimulation interganglionärer Nervenstränge wurden prinzipiell alle
Neurone, die über diese Faser synaptischen Input erhielten, unabhängig von ihrer
Funktion, aktiviert. Zudem erschienen nicht alle Neurone gleichzeitig in einem
Aspekte neuropharmakologischer Untersuchungen am Humandarm 157
Ganglion aktiviert zu werden, was auf unterschiedliche Projektionslängen hindeutet.
Hierfür spricht, daß Neurone, die am Eintritt des stimulierten Faserstrangs lokalisiert
waren, früher als in anderen Bereichen des Ganglion aktiviert wurden.
Die nicht durch experimentelle Manipulationen hervorgerufene Spontanaktivität
konnte in der vorliegenden Studie im Plexus submucosus des Menschen bei etwa
der Hälfte der untersuchten Ganglien beobachtet werden, wobei sie bei rund ein
Fünftel der untersuchten Neurone gemessen wurde. Diese Aktivität wurde dabei
nicht nur durch endogene Mechanismen hervorgerufen. Es konnte gezeigt werden,
daß synaptische Mechanismen ebenfalls involviert sind. Dabei konnte eine
Beteiligung nikotinerger Rezeptoren gezeigt werden, was auf ACh als
Neurotransmitter verweist und mit bisherigen Daten beim Meerschweinchen
übereinstimmt (NISHI u. NORTH 1973; WADE u. WOOD 1988). Im Plexus
submucosus der Maus wurde etwa 10fach weniger Spontanaktivität beobachtet.
Das Phänomen der neuronalen Spontanaktivität ist bisher im ENS des
Magens und des Darmtrakts verschiedener Spezies beschrieben worden. Im Plexus
myentericus des Menschen wurde bei 2 von 27 Neuronen spontane Aktivität
nachgewiesen (BROOKES et al. 1987). Insgesamt schwanken die Angaben in der
Literatur zum Vorkommen von Spontanaktivität zwischen 7-30 % der jeweils
untersuchten Neuronenpopulationen (BROOKES et al. 1987; FRIELING et al.
1991b; NISHI u. NORTH 1973; SCHEMANN u. WOOD 1989b; SURPRENANT
1984a). In Plexus myentericus-Muskulatur-Präparaten vom Meerschweinchen und
von der Maus kommt sogar bei 50 % bis 95 % der Neurone Spontanaktivität vor,
was mit der Intaktheit neuro-muskulärer Schaltkreise in Zusammenhang gebracht
wird (FURUKAWA et al. 1986; HIRST et al. 1974; SURPRENANT 1984a). Die
durchschnittliche Signalfrequenz spontan aktiver Neurone lag bei den eigenen
Untersuchungen zwischen 0,8 bis 17 Hz, wobei 94 % der Nervenzellen
Entladungsfrequenzen von 1 Hz bis 8 Hz zeigten. Im intestinalen Plexus
submucosus des Meerschweinchens werden in optischen Messungen
durchschnittliche Entladungsfrequenzen im Bereich von < 1 bis 7 Hz angegeben,
wobei nur wenige Neurone Entladungsfrequenzen über 1 Hz zeigen (OBAID et al.
1999). Andere intrazelluläre Studien beobachteten Maximalfrequenzen von 4-6 Hz
158 Diskussion
über 10 s, gefolgt von 10-45minütigen Ruhephasen (SURPRENANT 1984a). Die
Variation bei den Angaben über durchschnittliche Entladungsfrequenzen ist mit den
unterschiedlich langen Meßzeiträumen bzw. Beobachtungszeiträumen der Neurone
zu erklären, die von einigen Sekunden - bei den eigenen Untersuchungen - über
mehrere Minuten (OBAID et al. 1999) bis hin zu Stunden variieren (SURPRENANT
1984a). Bei den Ergebnissen von OBAID et al. (1999) ist eine methodisch bedingte
Beeinflussung der Nervenzellaktivität nicht ganz auszuschließen, da die
beobachtete Spontanaktivität als Folge der enzymatischen Vorbehandlung und der
reduzierten Sauerstoffspannung im Perfusionbad entstanden sein könnte. Dies
könnte zudem erklären, warum vermehrt Frequenzen unterhalb von 1 Hz
beobachtet wurden.
Die in dieser Arbeit erstmals im Humandarm beobachtete stimulusinduzierte
andauernde Aktivitätsentladung („late onset spike discharge“) trat nach
Einzelstimulation interganglionärer Nervenstränge auf und war durch eine länger
andauernde Entladung erregender Potentiale mit einer Frequenz von 14 bis 31 Hz
gekennzeichnet. Dieses Aktivitätsmuster, das etwa in jedem fünften Ganglion
beobachtet werden konnte, trat bei etwa 8 % aller untersuchten Neurone auf. Die
Ergebnisse dieser Studie lassen vermuten, daß dieses Aktivitätsmuster mindestens
aus zwei Signalkomponenten besteht, einer muskarinergen und einer nikotinergen
Komponente. Die ebenfalls beobachtete Hexamethonium-Insensitivität läßt darauf
schließen, daß weitere bisher noch nicht identifizierte Neurotransmitter involviert
sind. In Frage kämen hierfür glutamaterge wie auch serotoninerge Mechanismen
(GALLIGAN et al. 2000).
Ausblick sowie möglicher Einsatz der optischen Methode am ENS 159
5.4 Ausblick sowie möglicher Einsatz der optischen Methode amENS
In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, daß die MSORT bei
Untersuchungen des enterischen Nervensystems sowohl in der Tiermedizin als
auch in der Humanmedizin eingesetzt werden kann. Dies ist insofern von
Bedeutung, da gerade am ENS speziesspezifische Unterschiede existieren und in
der Humanmedizin idiopathische gastrointestinale Dysfunktionen und
Malfunktionen, wie beispielsweise der Symptomkomplex des Reizdarms, ein
enormes klinisches Problem mit hoher Prävalenz darstellen. Erforderlich für die
Analyse von Funktionsstörungen ist jedoch die Erfassung komplexer interneuronaler
Interaktion. Das simultane und dennoch getrennte Ableiten von einer Vielzahl von
Neuronen war bisher am Humandarm nicht realisiert worden. Ein Ziel der
vorliegenden Studie, die MSORT erstmals auch beim Menschen zu etablieren,
ermöglicht in Zukunft, Studien neuronaler Netze direkt am vitalen Humangewebe
durchzuführen. Es bietet sich zudem die Möglichkeit, wie in dieser Studie ebenfalls
gezeigt werden konnte, tiefe, in die Submukosa dringende Rektumbioptate von
Patienten vital zu untersuchen, worin das Potential für einen neuen diagnostischen
Ansatz in der gastroenterologischen Funktionsprüfung liegt.
Die Etablierung der MSORT am Humandarm zeigt zugleich die Aussicht, die
MSORT in der Tiermedizin nicht nur bei Labornagern, sondern auch bei Großtieren
anwenden zu können. Voraussetzung ist allerdings die Eignung des
potentiometrischen Chromophors sowie die präparatorische Zugänglichkeit von
Plexusanteilen bei Geweben mit einer Dicke von mehreren Millimetern.
Seitens der klinischen Neurogastroenterologie werden zukünftige
Herausforderungen darin liegen, Eigenschaften des enterischen Nervensystems
des Menschen eingehender unter pathophysiologischen Fragestellungen zu
charakterisieren. Die MSORT kann in Abhängigkeit von der jeweiligen Fragestellung
beispielsweise bei pathophysiologischen Studien oder bei der Testung von
Pharmaka eingesetzt werden. Für das Verständnis neuronaler Netzwerke kann die
160 Diskussion
MSORT eine wertvolle Ergänzung im Rahmen der „Computional Neuroscience“
bieten, die entwickelten Computermodelle (THOMAS et al. 1999; THOMAS et al.
2000) am vitalen enterischen Netzwerk zu verifizieren und durch neue, mit der
MSORT gewonnene Daten zu ergänzen bzw. diese Daten als Basis für neue
Computermodelle zu verwenden.
161
6 Zusammenfassung
Das enterische Nervensystem (ENS) besteht aus zwei Nervengeflechten, dem
Plexus submucosus und dem Plexus myentericus. Bisher wurden konventionelle
elektrophysiologische Techniken wie intra- und extrazelluläre Ableitungen
eingesetzt, um die elektrophysiologischen Eigenschaften enterischer Neurone zu
untersuchen. Diese Methoden sind nur begrenzt einsetzbar, da sie nicht geeignet
sind, mehrere Neurone simultan auf Einzelzellebene zu untersuchen oder die
Aktivität enterischer Neurone im Humandarm zu messen.
Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, die ‚Multi-Site Optical Recording
Technique‘ (MSORT) am frisch präparierten Darmgewebe von Maus,
Meerschweinchen und vom Menschen zu etablieren, um erstmals simultan auf
Einzelzellebene eine Vielzahl von Neuronen zu untersuchen.
Neuropharmakologische Studien wurden aufgrund der klinischen Relevanz
hauptsächlich am enterischen Nervensystem des Menschen durchgeführt.
Ergebnisse dieser Arbeit können wie folgt zusammengefaßt werden:
1. Die MSORT wurde erfolgreich am frisch präparierten Plexus submucosus des
Kolon von Maus und Meerschweinchen sowie im Kolon und Rektum des
Menschen (Operationsgewebe und Bioptate) zur Charakterisierung
elektrophysiologischer Eigenschaften etabliert. Ein speziell entwickeltes
Färbeprotokoll ermöglichte die gezielte lokale Färbung einzelner enterischer
Ganglien mit dem spannungssensitiven Farbstoff Di-8-ANEPPS, der sich für
Studien am Plexus submucosus eignete.
2. Die MSORT konnte am Plexus submucosus mit immunhistochemischen
Techniken kombiniert werden, um Transmitterkolokalisationen und damit den
neurochemischen Kode submuköser Neurone zu erfassen (Mensch,
Meerschweinchen). Beim Menschen wurden im Kolon und im Rektum bei rund
70 % der optisch untersuchten Neurone immunhistochemische Daten
162 Zusammenfassung
gewonnen: 56 % der Neurone zeigten ChAT/VIP, 30 % ChAT/- , 5 % ChAT/SP
und 6 % VIP/-.
3. Neuropharmakologische Untersuchungen submuköser Neurone zeigten beim
Menschen im Kolon und Rektum die Dominanz cholinerger Mechanismen bei
synaptischen Vorgängen. Die Gabe von Acetylcholin auf 91 Neurone induzierte
Aktionspotentialsalven, deren Entladungsfrequenz einen Dosis-korrelierten
Anstieg im Zusammenhang mit der Acetylcholin-Applikationsdauer zeigten.
Elektrische Stimulation interganglionärer Nervenstränge induzierte bei 366 von
537 Neuronen f EPSP. Nach repetitiver Stimulation konnte bei einigen Neuronen
„Rundown“ registriert werden. Etwa 96 % der untersuchten f EPSP wurden
durch Hexamethonium blockiert und waren damit über postsynaptische
nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren vermittelt. Vier Prozent der f EPSP zeigten
neben der nikotinergen eine weitere nicht-nikotinerge Komponente. Hier konnte
durch die Blockierung mit Suramin ATP als ein Neurotransmitter identifiziert
werden.
4. 18 % der Neurone zeigten Spontanaktivität, die synaptischen Ursprungs war.
Eine Beteiligung nikotinerger Mechanismen konnte bei 12 von 34 Neuronen
gezeigt werden. Die außerdem auftretende Hexamethonium-Insensitivität
deutete auf endogene, nicht-synaptisch vermittelte Mechanismen hin.
5. Bei ca. 2 % der Neurone wurden s EPSP nach Gabe von Stimulationssalven
nachgewiesen.
6. Bei 7 % der Neurone trat ein als „late onset spike discharge“ bezeichnetes
Aktivitätsmuster auf, das sich nach ein- bis zweimaliger Stimulation
interganglionärer Nervenstränge als länger andauernde Entladung erregender
Potentiale in einer Frequenz von 14-31 Hz zeigte. Bei 12 von 19 untersuchten
Neuronen konnte eine Beteiligung nikotinerger und muskarinerger Mechanismen
gezeigt werden. Die Hexamethonium-Insensitivität bei 10 Neuronen läßt auf die
Existenz weitere Transmitter bei der Generierung dieses Aktivitätsmusters
schließen.
7. Nach oraler Stimulation interganglionärer Nervenstränge wurden im Durchschnitt
62 % und nach analer Stimulation 57 % der Neurone innerhalb enterischer
Zusammenfassung 163
Ganglien aktiviert. Dabei wurden 45 % der Neurone durch beide Richtungen,
28 % wurden Nervenfaserstrang-spezifisch und 27 % wurden nicht aktiviert. Die
Population der Neurone, die nur nach analer Stimulation aktiviert wurde, zeigte
signifikant mehr ChAT/VIP.
Es konnte dargelegt werden, daß die MSORT eine wertvolle und konkurrenzfähige
Alternative zu bisherigen konventionellen elektrophysiologischen Techniken
darstellt. Zudem erlaubt die MSORT eine zuverlässige und reproduzierbare
Ableitung vom enterischen Nervensystem des Menschen.
164
Summary
Saskia Elisabeth Christiane Peters
Simultaneous recordings of neuronal activity in the enteric nervous system ofthe large intestine of the mouse, the guinea-pig and humans using theMulti-Site Optical Recording Technique (MSORT)
The enteric nervous system (ENS) consists of two ganglionated plexus, the plexus
submucosus and the plexus myentericus. Up to now conventional
electrophysiological methods like intra- and extracellular recordings were used to
study electrophysiological properties of enteric neurones. These methods have
certain limitations in that they are unsuitable for recording from a large population of
neurones simultaneously or for measuring activity of enteric neurones in human
specimens.
The aim of this study was to establish the ‘Multi-Site Optical Recording Technique‘
(MSORT) to record from freshly isolated preparations from mice, guinea-pigs and
humans and simultaneously from a large population of enteric neurones. The
neuropharmacological properties were mainly investigated in human enteric
neurones because of its clinical importance.
The results of the present study were:
1. The MSORT was successfully established to characterise electrophysiological
properties of submucosal neurones in the colon (mouse and guinea-pig) as well
as in the colon and rectum of humans. It was possible to stain individual enteric
ganglia by local application of the voltage sensitive dye Di-8-ANEPPS.
2. It was possible to combine the MSORT with immunhistochemical techniques to
detect transmitter colocalisation patterns and thereby the neurochemical code of
submucosal neurones (human, guinea-pig). In the human colon and rectum
immunhistochemical data were obtained from 70 % of the optically studied
Summary 165
neurones: 56 % of the neurones were ChAT/VIP, 30 % ChAT/- , 5 % ChAT/SP
and 6 % VIP/-.
3. In the colonic and rectal human submucosal plexus, neuropharmacological
studies demonstrated the importance of cholinergic mechanisms in mediating
synaptic events. Similarly the application of acetylcholine onto 91 neurones
elicited a burst of action potential discharge which increased in a concentration-
dependent fashion with, the increased duration of the acetylcholine application.
Electrical stimulation of interganglionic fibre tracts revealed f EPSPs in 366 out of
537 neurones. After repetitive stimulation run-down was detected in colonic as
well as in rectal neurones. About 96 % of f EPSP were blocked by
hexamethonium and therefore mediated by the release of acetylcholine
activating postsynaptic nicotinic receptors. 4 % of the f EPSP showed
non-nicotinic components. Some of these were blocked by suramine and hence
ATP could be identified as one of the involved transmitters.
4. 18 % of the neurones showed spontaneous activity which was synaptically
mediated. Cholinergic nicotinic mechanism played a role in 12 out of 34
neurones. However this spontaneous potential discharge was also in part
hexamethonium insensitive, indicating endogenous, non-synaptic mechanisms
responsible for its initiation.
5. About 2 % of the neurones showed s EPSP after application of trains of stimuli to
interganglionic fibre tracts.
6. 7 % of the neurones showed activation patterns which are referred to as ‘late
onset spike discharge’. They were evoked by single pulse electrical stimulation
of interganglionic nerve fibres and consisted of a volley of action potentials which
occurred with a longer latency than the f EPSP. Potentials during the late onset
spike discharge occurred at a frequency of 14-31 Hz. In 12 of 19 neurones
nicotinic and muscarinic mechanism were involved. Because ‘late onset spike
discharge’ was not affected by hexamethonium in 10 neurones it must be
concluded that additional transmitters were involved in the initiation of this
activity pattern.
166 Summary
7. After oral stimulation of interganglionic fibre tracts, on average 67 % of the
neurones within enteric ganglia were activated; however after anal stimulation
this was the case for 57 % of the neurones. In this process 45 % of the neurones
were activated by both methods of stimulation whereas 28 % were fibre tract
specifically activated and 27 % were not at all activated. The population of those
neurones which were only activated after anal stimulation revealed significantly
more ChAT/VIP.
It has been shown that the MSORT is a powerful new tool for recording excitability
in the enteric nervous system and has advantages over conventional
electrophysiological methods. Thus, MSORT enabled reliable and reproducible
recordings from human enteric nerves.
167
7 Literaturverzeichnis
ALBOWITZ, B., U. KUHNT, u. L. EHRENREICH (1990):
Optical recording of epileptiform voltage changes in the neocortical slice.
Exp. Brain Res. 81 (2), 241-256.
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195
8 Anhang8.1 Spezifikationen der Meßapparatur
Abbildung 44: Photo-
optische Kopplung von
Glasfasern und Photodioden
im Gehäuse des
Photodioden-Arrays.
Das auf das
Glasfaserbündel auftreffende
Licht (Pfeil) wird von den
464 Glasfasern auf die 464
Photodioden geleitet und
erzeugt dort einen
Photostrom (aus Daten der
Firma RedShirtImaging).
Tabelle 16: Spezifikationen Glasfaseroptik (nach Herstellerangaben)
Glasfaserlänge: < 15 cm
Photooptische Kopplung: Epoxid
Glasfaserkern: Polymethyl Methacrylat
Ummantelung: Fluorgeniertes Polymer
Faserdurchmesser: 0,75 mm
Aktive Meßfläche: 93%
Optische Eigenschaften: Spektrale Empfindlichkeit: 400-800 nm
Abschwächung: <200 dB/km @ 650 nm
Brechungsindex: Kern: 1,492 / Mantel: 1,417
Numerische Apertur: 0,47
Einfangwinkel: 56o
196 Anhang
Tabelle 17: Spezifikationen Photodioden (nach Herstellerangaben)
Photodiodenarray:Wu Tech InstrumentsPotomac MD USASN # H 469020_
Diodenanzahl: 464 Elemente
Externe Eingänge: 8 externe BNC
Material: Silizium
Dunkelstrom: < 10 pA
Parallelwiderstand: > 50 Gohm
Strahlungsempfindlichkeit: (630 nm) 0,42 A/W
Parallelkapazität: 200 pF
Quantumeffizienz: > 0,9
500300 400 600 700 800 900
Wellenlänge ( nm)
Spek
trale
Stra
hlun
gsin
tens
ität (
rel.
Einh
eite
n)
20
40
60
80
100
Abbildung 45: Spektrale Verteilung
der Strahlungsintensität einer XBO-
Kurzbogenlampe (Verändert nach
Datenblättern der Firma Osram).
Abbildung 46: Transmissionskurven
des modifizierten Cy3-Filterblocks für
die Messungen mit dem Farbstoff
Di-8-ANEPPS. (Verändert nach
Datenblättern der Firma Olympus).
HQ 545/30X
565 DCLP
400 600 800
50
100
0
Tran
smis
sion
(%)
Wellenlänge (nm)
BF 580
Spezifikationen der Meßapparatur 197
Tabelle 18: Getestete Filterblöcke für die Fluoreszenzmessungen
Fluoreszenz- Filterblock- FilterblockAnwendung bezeichnung I Exzitationsfilter Dichroitischer Spiegel Emissionsfilter
Breitbandfilter U-MWIG BP 520-550 565 DCLP BA 580 IFCy 3 U-M41007 HQ 545/30X 565 DCLP HQ 610/75M
Cy 3 II U-M41007 II HQ 545/30X 565 DCLP BF 580Texasrot U-MWIY BP 545-580 DM 600 BA 610 IF
I Angaben stammen aus Datenblättern der Firma Olympus, Hamburg; II Filterblock ist modifiziert.
8.2 Protokolle und Lösungen für die Vitalerhaltung der Gewebe
Krebs-Lösung (293 mosmol/l, begast mit Carbogen pH 7,4)
Na H2 PO4 MW: 120,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,144 g
NaCl MW: 58,44 g/mol, 117 mmol/l 6,84 g
NaHCO3 MW: 84,01 g/mol, 25 mmol/l 2,10 g
Glucose MW: 180,2 g/mol, 11 mmol/l 1,98 g
KCl MW: 74,55 g/mol, 4,7 mmol/l 0,350 g
Mg Cl2*6H2O MW: 203,3 g/mol, 2,5 mmol/l 0,244 g
Vor Zugabe von Calciumchlorid ca. 15 min mit Carbogen begasen (pH!)
Ca Cl2*2H2O MW: 147,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,368 g
Aqua bidest. ad 1l
Abbildung 47: Leistungskurve des NeuroPlex
Dioden-Systems. A Dioden messen nahe der
Ideallinie (3x106-1010 Photonen/ms) z. B. bei
Fluoreszenz- (II) und Absorptionsmessungen
(III) von in vitro Gehirnschnitten sowie
Ganglien B Übergang vom Dunkelstrom- zum
Schrotrauschen (5x103-106 Photonen/ms) z. B.
bei Fluoreszenzmessungen von Einzelzellen (I)
C Technisches Rauschen bewirkt bei sehr hohen
Intensitäten Abflachung.
(aus: http://www.redshirtimaging.com)
101
102
103 104 105 106 107 108 109 1010 1011
103
104
105
102
Lichtintensität(Photonen/ms auf 0,2% der Abbildungsfläche)
Lich
tinte
nsitä
t div
idie
rt du
rch
Rau
sche
n
NeuroPlex
Ideal (limitiert durch Schrotrauschen)
I II III
A
B
C
198 Anhang
8.3 Protokolle und Lösungen für die Multi-Site Optical RecordingTechnique
DI-8-ANEPPS (MW: 592,88 g/mol), Molecular Probes D-3167
DI-8-ANEPPS 5,0 mg
DMSO 625 µl
Stammlösung (13,5 mM) aliquotieren zu 60 µl, bei 4 °C lichtgeschützt lagern
Aliquods jeweils vor Gebrauch 10-15 min im Ultraschallbad bei 40 °C erwärmen
Farbstofflösung für ‚lokale Färbung‘ mit Spritzpipette (200 µM)
tgl. frisch ansetzen
Pluronic - F127 1,65 mg
Krebs-Lösung 400 µl
10-15 min im Ultraschallbad bei 40 °C auflösen
Stammlösung (13,5 mM) 6,0 µl
10-15 min im Ultraschallbad bei 40 °C auflösen
Farbstofflösung für ‚systemische Färbung‘ des Gewebes (20 µM)
tgl. frisch ansetzen
Pluronic - F127 1,65 mg
Krebs-Lösung 4,0 ml
10-15 min im Ultraschallbad bei 40 °C auflösen
Stammlösung (13,5 mM) 6,0 µl
10-15 min im Ultraschallbad bei 40 °C auflösen
DI-4-ANEPPS (MW: 481 g/mol), Molecular Probes D-1199
DI-4-ANEPPS 5,0 mg
DMSO 625 µl
Stammlösung (10,3 mM), bei 4 °C lichtgeschützt lagern
DI-8-ANEPPQ (MW: 732 g/mol), Molecular Probes D-6925
DI-8-ANEPPQ 5,0 mg
DMSO 500 µl
Stammlösung (13,6 mM), bei 4 °C lichtgeschützt lagern
Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologische Untersuchungen 199
8.4 Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologischeUntersuchungen
Acetylcholin (MW: 182 g/mol), Sigma A-6625
Aqua bidest. 1,0 ml
Acetylcholinchlorid 1,8 mg
Stammlösung aliquotieren zu 50 µl, bei –20 °C lagern
Endkonz. für Spritzpipette 0,5 mM
Stammlösung (10-2 M) 50 µl
Krebs-Lösung ad 1,0 ml
Atropin (MW: 676,8 g/mol), Sigma A-0257
Aqua bidest. 1,0 ml
Atropin 0,7 mg
Stammlösung aliquotieren zu 50 µl, bei –20 °C lagern
Endkonz. für Perfusion 0,5 µM
Stammlösung (10-3 M) 50 µl
Krebs-Lösung ad 100 ml
lichtsensitiv
Calcium-depletierte Lösung; ‚low-Calcium high-Magnesium‘-Lösung
Na H2 PO4 MW: 120,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,144 g
NaCl MW: 58,44 g/mol, 98 mmol/l 5,73 g
NaHCO3 MW: 84,01 g/mol, 25 mmol/l 2,10 g
Glucose MW: 180,2 g/mol, 11 mmol/l 1,98 g
KCl MW: 74,55 g/mol, 4,7 mmol/l 0,350 g
Mg Cl2*6H2O MW: 203,3 g/mol, 16 mmol/l 3,25 g
Vor Zugabe von Calciumchlorid ca. 15 min mit Carbogen begasen (pH!)
Ca Cl2*2H2O MW: 147,0 g/mol, 0,25 mmol/l 0,037 g
Aqua bidest. ad 1,0 l
200 Anhang
Cobald-/Cadmiumchlorid-Lösung
NaCl MW: 58,44 g/mol, 117 mmol/l 6,84 g
NaHCO3 MW: 84,01 g/mol, 25 mmol/l 2,10 g
Glucose MW: 180,2 g/mol, 11 mmol/l 1,98 g
KCl MW: 74,55 g/mol, 4,7 mmol/l 0,350 g
MgCl2*6H2O MW: 203,3 g/mol, 2,5 mmol/l 0,244 g
Vor Zugabe von Calciumchlorid ca. 15 min mit Carbogen begasen (pH!)
CaCl2*2H2O MW: 147,0 g/mol, 1,2 mmol/l 0,368 g
CoCl2 MW: 237,9 g/mol, 2 mmol/l 0,476 g
Hexamethonium (MW: 362,2 g/mol), Sigma H-0879
Aqua bidest. 1,0 ml
Hexamethoniumbromid 36 mg
Stammlösung (10-1 M), bei 4 °C lichtgeschützt lagern
Endkonz. für Perfusion 200 µM
Stammlösung (10-1 M) 200 µl
Krebs-Lösung ad 100 ml
Endkonz. für Spritzpipette 1 mM
Stammlösung (10-1 M) 10 µl
Krebs-Lösung ad 1 ml
Kaliumchlorid Lösung (MW: 74,551 g/mol), Merck
Aqua bidest. 100 ml
Kaliumchlorid 3,73 g
mit 5x10-1 M Kalium-Acetat-Lösung auf pH 7,25 einstellen
Stammlösung (5x10-1 M), bei 4 °C lagern
Endkonz. für Spritzpipette 100 mM
Stammlösung (5x10-1 M) 213 µl
Krebs-Lösung mit 17 mM NaCl 850 µl
Protokolle und Lösungen der Pharmaka für neuropharmakologische Untersuchungen 201
Nifedipin (MW: 346,3 g/mol), Sigma N-7634
Ethanol 1,0 ml
Nifedipin 3,46 mg
Stammlösung (10-2 M), bei 4 °C lagern, wöchentlich erneuern
Endkonz. für Perfusion 1 µM - 5 µM
Stammlösung (10-2 M) 50 µl - 250 µl
Krebs-Lösung 500 ml
Mecamylamin (MW: 203,8 g/mol), Sigma M-902
Aqua bidest. 1,0 ml
Mecamylaminhydrochlorid 20 mg
Stammlösung (10-1 M), bei 4 °C lagern
Endkonz. für Perfusion 200 µM
Stammlösung (10-1 M) 200 µl
Krebs-Lösung ad 100 ml
Endkonz. für Spritzpipette 1 mM
Stammlösung (10-1 M) 10 µl
Krebs-Lösung ad 1,0 ml
CdCl2 MW: 183,3 g/mol, 0,4 mmol/l 0,073 g
Aqua bidest. ad 1,0 l
Suramin (MW: 1429,2 g/mol), Sigma S-2671
Aqua bidest. 0,699 ml
Suramin Natriumsalz 100 mg
Stammlösung (10-1 M) aliquotieren zu 100 µl, bei –20 °C lagern
Endkonz. für Perfusion 100 µM
Stammlösung (10-3 M) 100 µl
Krebs-Lösung ad 100 ml
202 Anhang
Tetrodotoxin, TTX (MW:511,4 g/mol), Tocris 1069
Aqua bidest. 1,9554 ml
Tetrodotoxin Citrat 1,0 mg
Handschuhe tragen, hgr. neurotoxisch;
Stammlösung (10-3 M) aliquotieren zu 50 µl, bei –20 °C lagern
Endkonz. für Perfusion 300 nM
Stammlösung (10-3 M) 30 µl
Krebs-Lösung ad 100 ml
8.5 Protokolle und Lösungen für die Immunhistochemie
Fixierlösung: 4 % Paraformaldehyd
Paraformaldehyd 2,0 g
Phosphate Buffer ad 50 ml
unter Rühren bei 60°C unter Abzug lösen, abkühlen lassen
Pikrinsäure (1,2 %). 100 µl
möglichst frisch ansetzen, max. 5 Tage bei 4 °C aufbewahren
Phosphate Buffer (0,1 M)
Aqua bidest. 800 ml
Na H2 PO4 * H2O 3,0 g
Na2 HPO4 * 2H2O 21,7 g
mit 1M NaOH oder 1M H3 PO4 auf pH 7,44 einstellen
Aqua bidest. ad 1,0 l
PBS Phosphate Buffered Saline
NaCl 8,8 g
Aqua bidest. 800 ml
Phosphate Buffer (pH= 7,44) 116 ml
Aqua bidest. ad 1,0 l
bei 4 ° lagern
Protokolle und Lösungen für die Immunhistochemie 203
PBS-Natriumazid (0,1 %): PBS/NaN3
Natriumazid (NaN3) 1,0 g
PBS ad 1,0 l
bei 4 ° lagern
8.6 Tabellenanhang
Tabelle 19: Erregungsverteilung innerhalb enterischer Ganglien (n=24) nach oraler bzw.
analer Stimulation interganglionärer Nervenstränge
MHH-Nr.
GanglionZellzahl
Oral Anal Projektions-unspez.
Projektions-spez.
Nuroral
Nuranal
Inaktiv
MC 888 2 0(0%)
2(100%)
0(0%)
2(100%)
0(0%)
2(100%)
0(0%)
MC 893 2 2(100%)
2(100%)
2(100%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
0(0%)
MC 840 4 0(0%)
1(25%)
0(0%)
1(25%)
0(0%)
1(25%)
3(75%)
MC 894 4 3(75%)
1(25%)
1(25%)
2(50%)
2(50%)
0(0%)
1(25%)
MC 893 5 5(100%)
0(0%)
0(0%)
5(100%)
5(100%)
0(0%)
0(0%)
MC 840 6 0(0%)
1(17%)
0(0%)
1(17%)
0(0%)
1(17%)
5(83%)
MC 827 7 3(43%)
4(57%)
3(43%)
1(14%)
1(14%)
0(0%)
3(43%)
MC 884 7 7(100%)
5(71%)
5(71%)
2(29%)
2(29%)
0(0%)
0(0%)
MC 891 7 4(57%)
5(71%)
4(57%)
1(14%)
0(0%)
1(14%)
2(29%)
MC 884 8 7(88%)
7(88%)
6(75%)
2(25%)
1(13%)
1(13%)
0(0%)
MC 827 9 5(56%)
6(67%)
5(56%)
1(11%)
0(0%)
1(11%)
3(33%)
MC 840 9 6(67%)
4(44%)
4(44%)
2(22%)
2(22%)
0(0%)
3(33%)
MC 840 9 4(44%)
0(0%)
0(0%)
4(44%)
4(44%)
0(0%)
5(56%)
MC 888 10 5(50%)
7(70%)
5(50%)
2(20%)
0(0%)
2(20%)
3(30%)
MC 891 10 9(90%)
8(80%)
8(80%)
1(10%)
1(10%)
0(0%)
1(10%)
204 Anhang
(Fortsetzung Tabelle 19)
MHH-Nr.
GanglionZellzahl
Oral Anal Projektions-unspez.
Projektions-spez.
Nuroral
Nuranal
Inaktiv
MC 897 10 8(80%)
5(50%)
5(50%)
3(30%)
3(30%)
0(0%)
2(20%)
MC 897 12 6(50%)
8(67%)
6(50%)
2(17%)
0(0%)
2(17%)
4(33%)
MC 884 15 15(100%)
9(60%)
9(60%)
6(40%)
6(40%)
0(0%)
0(0%)
MC 840 17 11(65%)
9(53%)
6(35%)
8(47%)
3(18%)
5(29%)
3(18%)
MC 856 17 13(77%)
15(88%)
13(77%)
2(12%)
0(0%)
2(12%)
2(12%)
MC 842 20 12(60%)
13(65%)
12(60%)
1(5%)
0(0%)
1(5%)
7(35%)
MC 845 20 14(70%)
13(65%)
12(60%)
3(15%)
2(10%)
1(5%)
6(30%)
MC 894 21 10(48%)
12(57%)
9(43%)
4(19%)
1(5%)
3(14%)
8(38%)
MC 827 25 18(72%)
13(52%)
13(52%)
4(16%)
4(16%)
0(0%)
8(32%)
205
DanksagungMein Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. M. Schemann, für die Überlassung derabwechslungsreichen, innovativen und fächerübergreifenden Thematik, für seine jederzeitzugesagte Unterstützung und für die Möglichkeit, völlig selbständig zu arbeiten.
Der Studienstiftung des deutschen Volkes möchte ich für die großzügige finanzielleUnterstützung danken. Darüber hinaus möchte ich mich ganz besonders bei Herrn Prof.Dr. H. Gasse und Herrn Dr. M. Brocker bedanken, da sie Ansprechpartner und Ratgeber injeder Phase der Dissertation waren und mich stets ermutigt und unterstützt haben.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Drommer und den Mitgliedern derKommission für das Aufbaustudium, da ich das nach mehr als 30 Jahren auslaufendeAufbaustudium an der Tierärztlichen Hochschule abschließen durfte.
Herrn Dr. R. Koch, Fachgebiet Medizinische Physik der Tierärztlichen Hochschule, dankeich ganz besonders für die unkomplizierte und tatkräftige Hilfe in physikalisch-technischenFragen, für viele sehr bereichernde Diskussionen und für so machen guten Rat.
Allen jetzigen (K. Michel, M. Rohn) und ehemaligen Mitarbeitern (U. Firzlaff, H. Sann, M.Neunlist, K. Kamm, H. Pfannkuche, E. Köhn, D. Reiche, C. König) der „Arbeitsgruppe Schemann“möchte ich für die Arbeitsatmosphäre danken. Insbesondere danke ich Herrn Dr. MichelNeunlist für die Einweisung in die optische Apparatur und Herrn Dr. Klaus Michel für seineHilfe bei Computer- und Druckerproblemen. Frau Susanne Hoppe danke ich ganz herzlichfür die Unterstützung bei den immunhistochemischen Färbungen und für viele gute Ideen.Bei Frau Bärbel Leppich möchte ich mich sehr herzlich für die zahlreichen Hilfestellungenbei zeitaufreibenden „Kleinigkeiten“, für viele gute Taten und so manches aufmunterndeWort gerade in der Schlußphase der Dissertation bedanken. Herrn Dirk Voigtländer sei fürseine immer aufmunternde Hilfsbereitschaft gedankt.
Den Tierpflegern Michael Rohde, Yvonne Armbrecht und Nadine Helms danke ich sehrherzlich für ihr kompetentes Engagement bei der Zucht und Haltung der Meerschweinchenund bei der Versorgung der Mäuse (Stichwort: „Mäuse-Häuser“).Dem Feinmechanikermeister Klaus Grunert und den Auszubildenden der InstitutswerkstattPaul und Marian danke ich ganz herzlich für die reibungslose Planung und die schnelleAnfertigung der für die Versuche notwendigen Manipulatoren und für viele „dringendeBauteile“. Auch Herrn Schnabel möchte ich danken.
Allen Mitgliedern der „Arbeitsgruppe Dr. S. Bischoff“ an der Medizinischen HochschuleHannover insbesondere Frau Weiher, Nicole Abraham, Claudia Mierke und ThomasGebhardt sei für die schnelle und stets zuverlässige Bereitstellung des OP-Materials undder Rektumbioptate gedankt.
Herrn Wallbrecht vom Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannovermöchte ich für die freundliche und die stets pünktliche Bereitstellung der beidenMäusestämme danken.
Nicht zuletzt danke ich allen Mitarbeitern des Physiologischen Institutes, insbesondere FrauBecker und Frau Pufal.