Tierärztliche Hochschule Hannover
Entwicklung eines Tiermodells zur Untersuchung
eines Biofilms und einer assoziierten Entzündungsreaktion bei chirurgischen Implantaten
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Silke Paret
aus Berlin
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. André Bleich, PhD Medizinische Hochschule Hannover Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium
2. Prof. Kerstin Schwabe, PhD
Medizinische Hochschule Hannover Experimentelle Neurochirurgie der Klinik für Neurochirurgie
1. Gutachter: Prof. André Bleich, PhD
Medizinische Hochschule Hannover Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium
2. Gutachter: Prof. Peter Valentin - Weigand Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2015
Für Frederic
Inhaltsverzeichnis V
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG ......................................................................................................... 1
II. LITERATURÜBERSICHT ................................................................................... 2
1. Implantatinfektionen .......................................................................................... 2
1.1. Übersicht über Implantatinfektionen .................................................................. 2
1.2. Implantatinfektionen in der Neurochirurgie....................................................... 4
1.3. Implantatinfektionen in der Tiermedizin ............................................................ 5
2. Ablauf von bakteriellen Infektionen am Implantat ..................................... 6
2.1. Entzündungsreaktionen am Implantat............................................................... 6
2.2. Die Immunantwort auf eine bakterielle Infektion.............................................. 8
2.3. Biofilme................................................................................................................... 9
2.3.1. Biofilmbildung .......................................................................................... 9
2.3.2. Nachweismethoden für Biofilme auf Implantaten ............................ 11
2.4. Staphylococcus aureus...................................................................................... 13
3. Tiermodelle für die Untersuchung von Implantatinfek tionen ............... 15
4. Fragestellung ..................................................................................................... 19
III. MATERIAL UND METHODEN ......................................................................... 20
1. Versuchstiere ..................................................................................................... 20
2. Ablauf des Tierversuches .............................................................................. 20
2.1. Versuchsgruppen................................................................................................ 20
2.2. Anzüchtung und Konzentration der Bakterien ............................................... 21
2.3. Operativer Eingriff............................................................................................... 22
2.4. Postoperative Behandlung ................................................................................ 24
2.5. Entnahme der Blutproben und weitere Bearbeitung ..................................... 25
2.6. Entnahme der Implantate und Schädelkalotten und deren weitere
Bearbeitung ......................................................................................................... 26
3. Auswertung der Proben .................................................................................. 26
3.1. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie der Implantate ............................... 26
Inhaltsverzeichnis VI
3.2. Histologie der Schädelkalotten ......................................................................... 29
3.2.1. Einbettung in Technovit........................................................................ 29
3.2.2. Erstellung der histologischen Schnitte............................................... 30
3.2.3. Histologische Beurteilung der Knochenschnitte............................... 32
4. Statistik ............................................................................................................... 36
IV. ERGEBNISSE ..................................................................................................... 37
1. Biofilmbildung an den Implantaten ............................................................. 38
2. Histologische Auswertung der Schädelkalotten ..................................... 40
V. DISKUSSION ...................................................................................................... 46
1. Biofilmbildung ................................................................................................... 46
2. Entzündungsreaktion ...................................................................................... 50
3. Beurteilung des Tiermodells ......................................................................... 56
4. Fazit und Ausblick ............................................................................................ 58
VI. ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... 60
VII. SUMMARY .......................................................................................................... 62
VIII. LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................. 64
DANKSAGUNG ..................................................................................................................... 84
Abkürzungsverzeichnis VII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ANOVA Varianzanalyse (analysis of variance)
CLSM Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
CSA Ciclosporin A
DNS Desoxyribonukleinsäure
EPS extrazelluläre Polysaccharide
°C Grad Celsius
g Gramm
h Stunde
HE Hämalaun-Eosin
IL Interleukin
i.p. intra-peritoneal
KBE Kolonie-bildende Einheiten
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
MEA 2-Methoxyethylacetat
MMA Methylmethacrylat
µl Mikroliter
µm Mikrometer
mg Milligramm
min Minute
NaCl Natrium-Chlorid
ng Nanogramm
nm Nanometer
OD optische Dichte
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PMMA Polymethylmethacrylat
% Prozent
Abkürzungsverzeichnis VIII
qPCR quantitative PCR
rt-PCR real-time PCR
S.E.M. Standardfehler (standard error of mean)
TSB Tryptic Soya Broth
VE vollentsalzt
I. Einleitung 1
I. EINLEITUNG
Implantate werden in vielen Bereichen der Medizin eingesetzt, wobei Katheter,
künstliche Gelenke, Herzschrittmacher oder Zahnimplantate hier nur einige wenige
Beispiele sind (SCHALDACH 1975; TRINDADE ET AL. 2014). Im Bereich der
Neurochirurgie werden beispielsweise ventrikuläre Shunt-Systeme zum Ausgleich
eines erhöhten Liquordruckes oder nach einem Trauma Implantate für
Kranioplastiken mit Schrauben befestigt (EL GHOUL ET AL. 2014; HUTTNER ET AL.
2008). Im Bereich der Tiermedizin wird inzwischen ebenfalls häufig mit Implantaten
gearbeitet, vor allem im orthopädischen Bereich (STIFFLER 2004; WETSCHER 2012).
Die wichtigsten Ursachen von Implantatversagen sind Infektionen und
Knochenabbau in Umgebung der Implantate (BERENDT UND BYREN 2004; BØE ET AL.
2011; SAKKA UND COULTHARD 2011). In diesem Zusammenhang ist bekannt, dass
eine Biofilmbildung, also der organisierte Zusammenschluss von Bakterien, die
bevorzugt auf inerten Oberflächen oder totem Gewebe wachsen, am Implantat mit
einer sehr hohen Komplikationsrate einhergeht. Mehr als 65% aller Infektionen des
Menschen sind mit Biofilmen assoziiert sind, wobei Staphylococcus aureus der am
häufigsten für Implantatversagen verantwortliche Keim ist (ARCHER ET AL. 2011;
CAMPOCCIA ET AL. 2006; GBEJUADE ET AL. 2015; HANKE UND KIELIAN 2012; RAMÍREZ ET
AL. 2013; SNOWDEN ET AL. 2012). Der Bedarf an Implantaten ist in den letzten Jahren
kontinuierlich angestiegen, so dass inzwischen pro Jahr über eine halbe Milliarde
Implantate weltweit verwendet werden (CAMPOCCIA ET AL. 2013; HALLAK 2014; YUE ET
AL. 2015). Diese Entwicklung zeigt, dass in diesem Bereich und vor allem im Gebiet
der Implantatinfektionen weitere Forschung und Entwicklung nötig und sinnvoll ist.
Das hier beschriebene Vorhaben hat das Ziel, ein Rattenmodell zu entwickeln und zu
charakterisieren, bei dem mit Staphylococcus aureus reproduzierbar ein Biofilm auf
einem Implantat mit begleitender Entzündungsreaktion hervorgerufen werden kann
und mit dem später neue Implantatmaterialien oder -oberflächen evaluiert werden
können.
II. Literaturübersicht 2
II. LITERATURÜBERSICHT
1. Implantatinfektionen
1.1. Übersicht über Implantatinfektionen
Innerhalb der letzten Jahre wurden zunehmend mehr Implantate eingesetzt, was an
der Entwicklung in der medizinischen Forschung und an dem demographischen
Wandel liegt (HALLAK 2014; YUE ET AL. 2015). Im Jahr 2007 wurden etwa eine halbe
Milliarde Implantate weltweit verwendet und der Bedarf ist seitdem noch gestiegen
(CAMPOCCIA ET AL. 2013). Infektionen an Implantaten sind eine der häufigsten
Ursachen für Implantatversagen, wobei in der Regel das infizierte Implantat mit dem
umgebenden Gewebe entfernt werden muss, da bei einer Biofilmbildung auf der
Implantatoberfläche gewöhnlich keine andere Behandlung erfolgreich ist (DAROUICHE
2004; HALLAK 2014; KASLIWAL ET AL. 2013; YUE ET AL. 2015). Es besteht unter
anderem die Problematik, dass kaum wirksame antibakterielle Medikamente gegen
das zunehmend resistente Erregerspektrum im Bereich der Implantatinfektionen
eingesetzt werden können, was vor allem der schwer zugänglichen Verbindung
zwischen Implantat, Knochen und umgebendem Weichgewebe geschuldet ist
(HALLAK 2014). Es kann in der Folge einer Implantatinfektion zur Besiedlung von
anderen Organen durch die Verbreitung der vorhandenen Bakterien oder zu einer
systemischen Infektion mit entsprechenden Symptomen kommen, was im
schlimmsten Fall zu einer Sepsis mit Todesfolge führen kann (CRAMTON ET AL. 1999;
WODTKE UND LÖHR 2008). Im Falle einer Infektion tritt diese in der Regel akut oder
subakut nach einer Implantation auf, jedoch ist diese bei Verbleiben der Implantate
durch eine hämatogene Absiedlung von Bakterien noch Jahre später möglich
(CAMPOCCIA ET AL. 2013).
Neben den weitreichenden Folgen für die Patienten entstehen durch
Implantatinfektionen hohe volkswirtschaftliche Kosten, da Revisionsoperationen, also
die Entfernung eines bereits infizierten Implantates um ein neues einzubringen, mit
einem erhöhten Operationsrisiko, einer höheren Komplikationsrate und einem
II. Literaturübersicht 3
dadurch bedingten längeren Krankenhausaufenthalt einhergehen (DAROUICHE 2004;
STEIN 2011). Allein die Kosten für orthopädische Revisionsoperationen im Bereich
des Gelenkersatzes belaufen sich in Deutschland pro Jahr auf etwa 180 Millionen
Euro (OTTO 2008).
Nach Einbringung eines Implantates genügt im Vergleich zu Situationen, in denen
kein Fremdmaterial beteiligt ist, bereits eine millionenfach geringere Keimlast um
eine Infektion hervorzurufen (ZIMMERLI ET AL. 1982). Dies ist einer der Hauptgründe
dafür, dass 60 - 70% aller nosokomialen Infektionen auf Implantate zurückzuführen
sind (VEERACHAMY ET AL. 2014).
In der Orthopädie infizieren sich etwa 0,5 - 2% der Gelenkprothesen, wobei sehr oft
Staphylococcus aureus (S. aureus) nachgewiesen wird (GEIPEL UND HERRMANN
2004). Bei transkutanen Fixateuren, die bei einigen Frakturen verwendet werden,
zeigen sich Infektionsraten von 5% bis zu 50%, wobei diese Angaben, abhängig von
den Lokalisationen am Körper, stark schwanken (CAMPOCCIA ET AL. 2013; KRAEMER ET
AL. 2010). Zahnimplantate zeigen in bis zu 8% der Fälle eine Periimplantitis, die mit
einer Entzündungsreaktion und Knochenverlust in der Umgebung des Implantates
einhergeht (SINGH 2011; YUE ET AL. 2015). In der Neurochirurgie liegen die
Infektionsraten nach Verwendung von Implantaten in der Regel zwischen 3,4 - 8,5%
(CAMPOCCIA ET AL. 2013; STAVRAKIS ET AL. 2015). Bei Risikofaktoren wie hohem Alter,
Diabetes mellitus, Adipositas, Rauchen oder einer Immunsuppression des Patienten
kommt es zu einer deutlichen Erhöhung der Infektionsraten (BJERKNES ET AL. 2014;
HALLAK 2014; POELSTRA ET AL. 2000; STAVRAKIS ET AL. 2015). Diese werden zusätzlich
verstärkt, wenn im Operationsbereich bereits eine Infektion vorliegt oder es sich um
eine Revisionsoperation handelt (GOH ET AL. 2010).
Es gibt bis jetzt einige Ansätze zur Verminderung von Implantatinfektionen. So wird
in der Regel bei den Operationen neben der allgemeinen Asepsis eine systemische
prophylaktische antimikrobielle und antiinflammatorische Therapie durchgeführt (YUE
ET AL. 2015). Zusätzlich gibt es Versuche, bei denen Implantate mit Nanopartikeln
aus Silber beschichtet wurden, wodurch eine antibakterielle Wirkung erzielt werden
soll. Diese Art der Beschichtung zeigte erste Erfolge beim orthopädischen Einsatz.
Eine langfristige geringere Infektionsrate und Reduzierung der Biofilmvorkommen
II. Literaturübersicht 4
müssen allerdings erst noch gezeigt werden (BRENNAN ET AL. 2015). Weitere Ansätze
sind die Verwendung von Kupfer in Implantaten, welches die Biofilmbildung stört,
indem es die Anheftung der Bakterien an der Oberfläche des Implantates verhindert,
die Beschichtung mit Peroxiden, die eine bakterizide Wirkung haben sollen, oder
antibakteriell wirkenden Phagen, also Viren, die spezifisch Bakterien infizieren und
zerstören (CONNAUGHTON ET AL. 2014). Bei diesen und anderen Beschichtungen
besteht leider häufig das Problem, dass sich zwar keine Bakterien mehr an die
Implantate anheften können, gleichzeitig jedoch die Anlagerung von körpereigenen
Zellen und somit eine mögliche medizinische Funktion oder die Einheilung gestört
sind (BRENNAN ET AL. 2015). Demzufolge ist durch bereits eingesetzte Substanzen
oder Implantatveränderungen zwar eine Reduktion der Infektionsraten ermöglicht
worden, letztendlich können Implantatinfektionen jedoch nicht vollständig verhindert
werden (ARCHER ET AL. 2011; CAMPOCCIA ET AL. 2013; CONNAUGHTON ET AL. 2014;
HALLAK 2014).
1.2. Implantatinfektionen in der Neurochirurgie
Die Verwendung von Implantaten in der Neurochirurgie ist in den letzten Jahren
deutlich angestiegen und hat für unterschiedliche Zwecke eine große Bedeutung
erlangt (BRAXTON ET AL. 2005; CAMPOCCIA ET AL. 2013). Am Schädel werden unter
anderem verschiedene Platten in Kombination mit Schrauben zur Rekonstruktion bei
Frakturen, einer Osteomyelitis der Schädelknochen oder bei Kraniostenosen zur
Translokation der Schädelplatten verwendet (BÜCHELER ET AL. 2002; HOSEIN ET AL.
1999; SCHMIDT 2003). Operationen, bei denen ein zunächst entferntes Knochenstück
später wieder als Implantat eingesetzt wird, werden am Schädel unter anderem zum
Verschluss nach einem intracraniellen Eingriff aufgrund von Blutungen oder Tumoren
durchgeführt (HOSEIN ET AL. 1999). An der Wirbelsäule werden Implantate
beispielsweise bei einer Fusion von Wirbelkörpern zur Stabilisierung bei einer
Spondylolisthese oder einer Osteomyelitis der Wirbelkörper verwendet (SANSUR ET
AL. 2010; SHAD ET AL. 2003).
Osseointegrative Implantate werden in der Neurochirurgie vielseitig eingesetzt und
bergen ebenso wie an anderen Stellen des Körpers immer das Risiko einer Infektion
II. Literaturübersicht 5
mit möglicherweise schwerwiegenden Folgen, unter anderem durch die häufig
assoziierte Biofilmbildung und den damit verbundenen Schwierigkeiten bei der
Behandlung (BRAXTON ET AL. 2005). Bei Implantatinfektionen am Schädel und der
Wirbelsäule können die Infektion und die Entzündung auf das zentrale Nervensystem
übergehen. Ebenso sind unspezifische Kopfschmerzen und Ausfälle der
psychomotorischen Funktionen möglich (BJERKNES ET AL. 2014; CAMPOCCIA ET AL.
2013; HOSEIN ET AL. 1999). Letztendlich kann sich infolge einer Infektion eine
lebensbedrohliche Sepsis entwickeln, welche in etwa 14% der Infektionsfälle eintritt
(BRAXTON ET AL. 2005; HOSEIN ET AL. 1999). Die durchschnittliche Infektionsrate bei
neurochirurgischen Eingriffen mit Implantaten ist mit 3,4 - 8,5% etwa doppelt so hoch
wie bei Operationen, bei denen kein Implantat eingebracht wird. Ebenso wie im
orthopädischen Bereich, ist in der Neurochirurgie der am häufigsten gefundene Keim
S. aureus (BRAXTON ET AL. 2005; LIETARD ET AL. 2008; POELSTRA ET AL. 2000;
STAVRAKIS ET AL. 2015).
1.3. Implantatinfektionen in der Tiermedizin
Implantate werden auch in der Veterinärmedizin zunehmend verwendet,
hauptsächlich für orthopädische Zwecke, aber auch bei neurochirurgischen Eingriffen
(STIFFLER 2004; WETSCHER 2012). Beispiele für orthopädische Erkrankungen bei
Tieren, bei denen operativ mit osseointegrativen Implantaten gearbeitet wird, sind
Kreuzbandrisse bei Hunden, Frakturen beim Klein- und beim Großtier oder Arthrosen
der Zehengelenke beim Pferd (AIKEN ET AL. 2015; KNOX UND WATKINS 2006; NICOLL ET
AL. 2014; WETSCHER 2012). Im neurochirurgischen Bereich werden Implantate zum
Beispiel bei der Diskospondylitis beim Hund oder bei Schädelknochenverletzungen
durch Trauma sowohl beim Kleintier, als auch beim Großtier eingesetzt (AUGER ET AL.
2000; CHEN ET AL. 2014; GERDING ET AL. 2014; HUSKA ET AL. 2014).
Infektionsraten von Implantaten im Knochen beim Tier liegen zwischen 4 - 12% und
können in der Folge zu einer Osteomyelitis und bei Kontakt zu Gelenken gleichzeitig
zu einer septischen Arthritis führen. Ebenso wie beim Menschen sind systemische
Infektionen und eine Sepsis mit Todesfolge möglich (AIKEN ET AL. 2015; GALLAGHER
UND MERTENS 2012). Staphylokokken sind auch in der Veterinärmedizin die am
II. Literaturübersicht 6
häufigsten an Implantatinfektionen beteiligten Keime (GALLAGHER UND MERTENS
2012). Risikofaktoren, die zu einer schlechteren Heilung nach der Operation oder zu
höheren Infektionsraten führen, sind ähnlich wie beim Menschen vor allem das Alter
des Tieres, die Dauer der Operation sowie Diabetes mellitus und Adipositas (AIKEN
ET AL. 2015).
Auch im tierexperimentellen Bereich sind Infektionen infolge von Implantaten
problematisch. In den Neurowissenschaften werden häufig Elektroden für die
elektrophysiologische Ableitung oder Stimulation von bestimmten Gehirnregionen
implantiert. Für die chronische Anwendung werden diese Implantate mit Hilfe von
kleinen Schräubchen und Knochenzement an der Schädeloberfläche befestigt. Nach
mehreren Wochen können sich ohne prophylaktische Antibiose Entzündungen
entwickeln und es kann teilweise zur Bildung von Abszessen im Gehirn kommen
(LEBLANC ET AL. 2013). Ebenso können Osteomyelitiden auftreten, die zu
Implantatverlusten führen. Diese Probleme werden in der Literatur meist als
„Tierverluste während eines Versuches“ gekennzeichent und selten als
Implantatverluste aufgrund von Infektionen benannt. Dementsprechend könnte eine
Verhinderung solcher Infektionen die Zahl der für einen Versuch verwendeten Tiere
deutlich verringern.
2. Ablauf von bakteriellen Infektionen am Implantat
2.1. Entzündungsreaktionen am Implantat
Eine lokale Entzündung im Gewebe ist eine normale Reaktion des Körpers auf das
Einbringen eines Fremdkörpers. Gleichzeitig ist eine persistierende Entzündung in
der Umgebung von Implantaten, die über diese normale Reaktion hinausgeht, eine
der Hauptursachen von Implantatversagen. Eine Entzündungsreaktion ist nicht an
eine Beteiligung von Bakterien gebunden (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008;
REFAI ET AL. 2004; TRINDADE ET AL. 2014).
Entzündungsprozesse lassen sich in drei Phasen unterteilen. Während der akuten
Entzündung, die maximal einige Tage dauert, kommt es infolge einer Verletzung
II. Literaturübersicht 7
zunächst zu Blutgerinnung und Gewebekontraktion. Gleichzeitig findet eine zelluläre
Reaktion statt, die durch eine ausgeprägte Einwanderung von Leukozyten,
hauptsächlich neutrophiler Granulozyten und Monozyten gekennzeichnet ist.
Gleichzeitig zeigt sich eine Ödembildung durch Exsudation von Gewebeflüssigkeit
(ANDERSON 1988, 1993; KOCHANOWSKI 2012; REFAI ET AL. 2004). In dieser Phase
kommt es bereits zur Phagozytose von zerstörten Zellen (PAJARINEN ET AL. 2013;
TONETTI UND SCHMID 1994).
Es folgt eine chronische Entzündung, die durch die Anwesenheit von Makrophagen
und Lymphozyten geprägt ist. Die chronische Entzündung wird durch einen
persistierenden Stimulus erhalten, wobei es sich im Falle eines Implantates zum
Beispiel um die Materialbeschaffenheit oder eine permanente leichte Bewegung des
Implantates handeln kann (ANDERSON 1993; SUSKA ET AL. 2005). Auf zellulärer Ebene
findet Kollagensynthese, die Bildung extrazellulärer Matrix und die Proliferation neuer
Blutgefäße statt (ANDERSON 1993; PRIBILA ET AL. 2004). Die wichtigsten Zellen in
dieser Phase sind Makrophagen, unter anderem aufgrund ihrer Fähigkeit eine
Vielzahl an Mediatoren zu sezernieren (zum Beispiel Proteasen, Zytokine und
chemotaktische Faktoren) (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008; REFAI ET AL.
2004). Zusätzlich haben sie eine deutlich längere Überlebensdauer (Tage bis
Wochen) als neutrophile Granulozyten (24 - 48 Stunden) (ANDERSON 1988; SILVA
2011). Im weiteren Verlauf der Entzündungsreaktion kommt es zur Bildung von
Granulationsgewebe und teilweise einer Bindegewebskapsel (ANDERSON ET AL.
2008). Granulationsgewebe besteht aus neu gebildeten kleinen Blutgefäßen und
Fibroblasten und bildet sich etwa drei bis fünf Tage nach einer Implantation
(ANDERSON 1993).
Die letzte Phase der Entzündung ist durch eine Fibrose und die Bildung von
Narbengewebe gekennzeichnet (TRINDADE ET AL. 2014). Grundsätzlich sollten die
Phasen der Entzündung nicht als ein streng chronologischer Prozess betrachtet
werden, da sich die Ereignisse überlappen und ineinander übergehen (SILVA 2011).
Bei Implantaten wird die sogenannte Fremdkörper-Reaktion von einer chronischen
Entzündung differenziert (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008). Eine normale
Fremdkörper-Reaktion auf das Einbringen von Implantaten besteht aus der
II. Literaturübersicht 8
Ansammlung von Makrophagen, Fremdkörper-Riesenzellen und den typischen
Komponenten des Granulationsgewebes, zu denen Makrophagen, Fibroblasten und
Kapillaren gehören (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008). Aufgrund der Größe
und der hauptsächlich nicht resorbierbaren Implantatmaterialien können nur die
ersten Schritte der Phagozytose, also die Anheftung an das Implantat und die
Erkennung als Fremdkörper, erfolgen (ANDERSON 1993). Die Folge davon ist die
sogenannte frustrierte Phagozytose, welche unter anderem zu einer Verschmelzung
von Makrophagen zu mehrkernigen Riesenzellen, auch Fremdkörper-Riesenzellen
genannt, führt (HENSON 1971; MORENO ET AL. 2007). Diese Fusion ist einer der
wichtigsten Vorgänge der Fremdkörper-Reaktion (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL.
2008; TRINDADE ET AL. 2014). Makrophagen und Fremdkörper-Riesenzellen, die sich
an der Implantatoberfläche angesammelt haben, setzen unterschiedliche Mediatoren
und Enzyme frei, mit dem Ziel der Phagozytose und der Zersetzung des Implantates.
Durch diesen Vorgang werden weitere Entzündungszellen angelockt und es kann zu
einem deutlichen Knochenabbau kommen, was in der Folge zu einer Lockerung und
dem Verlust des Implantates führen kann (HENSON 1971; MORENO ET AL. 2007;
TRINDADE ET AL. 2014).
Eine lokale zelluläre Fremdkörper-Reaktion kann dauerhaft bestehen bleiben, jedoch
durch eine fibröse Einkapselung vom umgebenden Gewebe abgeschirmt werden
(ANDERSON 1993; TRINDADE ET AL. 2014). Durch die Bildung von Narbengewebe um
das Implantat sollte es möglichst zur vollständigen Einheilung des Implantates
kommen. Eine unvollständige Einheilung von Implantaten begünstigt immer eine
Infektion mit Bakterien (ANDERSON 1993; TRINDADE ET AL. 2014).
2.2. Die Immunantwort auf eine bakterielle Infektio n Pathogene Bakterien führen in der Regel zu einer Reaktion des Immunsystems mit
dem Ziel der Eliminierung der eingedrungenen Mikroorganismen (GONZALEZ ET AL.
2015). Die erste Reaktion des Körpers auf Bakterien ist eine massive Infiltration des
entsprechenden Gewebes durch neutrophile Granulozyten und Makrophagen (FRANK
1980). In nahezu jedem Gewebe des Körpers gibt es ortsständige Makrophagen, die
eine direkte und sofortige Abwehr von Bakterien gewährleisten können und eine
Vielzahl proinflammatorischer Mediatoren produzieren, die wichtig für die
II. Literaturübersicht 9
Rekrutierung und Aktivierung anderer Immunzellen sind (FOSTER 2005). Neutrophile
Granulozyten sezernieren als erste Antwort auf eine bakterielle Infektion zahlreiche
bakterizide Substanzen, wie Defensine, Lysozyme und Sauerstoffradikale (HANKE
UND KIELIAN 2012). Sie gelten daher als die wichtigsten Zellen der Immunreaktion auf
eine bakterielle Infektion (SILVA 2011).
2.3. Biofilme
2.3.1. Biofilmbildung
Bei Biofilmen handelt es sich um organisierte Zusammenschlüsse von Bakterien, die
bevorzugt auf inerten Oberflächen oder totem Gewebe wachsen (COSTERTON 1999;
DONLAN UND COSTERTON 2002; SHIRTLIFF ET AL. 2002). Durch die Vermehrung von
Bakterien entstehen dichte Verbände, sogenannte Plaques, die in eine extrazelluläre
Matrix aus Polysacchariden, Nukleinsäuren und verschiedenen Proteinen eingebettet
sind. Diese Matrix wird als extrazelluläre Polysaccharide (EPS) bezeichnet (BRAXTON
ET AL. 2005; DAVIES ET AL. 1998; STOODLEY ET AL. 2002). Solche mehrzelligen
Verbände stehen planktonischen Einzelzellen gegenüber (MAH UND O’TOOLE 2001).
Biofilme werden in mehreren Schritten gebildet. Dabei unterscheidet man die drei
Phasen der Anheftung, Reifung und Ablösung zur weiteren Verbreitung (ARCIOLA ET
AL. 2011; O’TOOLE ET AL. 2000; OTTO 2008).
Die Bildung von Biofilmen beginnt durch die Aggregation von Bakterien an einer
Oberfläche. Dieser Vorgang führt zu einer veränderten Genexpression der Bakterien,
wodurch die nachfolgenden Schritte der Biofilmbildung erst ermöglicht werden
(DONLAN UND COSTERTON 2002; HALL-STOODLEY ET AL. 2004). Anschließend beginnt
die Sezernierung der EPS, wodurch die Anheftung der Bakterien an der Oberfläche
verstärkt wird und in einen nahezu irreversiblen Zustand übergeht. Diese Vorgänge
sind, abhängig von der Bakterienspezies, bei optimalen Umgebungsbedingungen
meist nach wenigen Stunden abgeschlossen (STOODLEY ET AL. 2002).
In der Phase der Reifung kommt es zu einer spezifischen Ausbildung der Architektur
und der Anheftung von weiteren planktonischen, frei flotierenden Bakterien an den
bereits bestehenden Biofilm (DAVIES ET AL. 1998; STOODLEY ET AL. 2002). Während
II. Literaturübersicht 10
der Reifung eines Biofilmes wird dieser hauptsächlich stabiler gegenüber äußeren
Einflüssen, was nicht immer mit einer Verdickung des Biofilms oder Vermehrung der
Bakterien einhergeht (GÜNTHER ET AL. 2009). Nach der Ausreifung können
planktonische Einzelzellen freigesetzt oder ganze Mikrokolonien abgelöst und
abgeschwemmt werden, die sich an anderen Orten im Körper ansiedeln und
Infektionen von weiteren Organen verursachen können (SHIRTLIFF ET AL. 2002;
STOODLEY ET AL. 2002).
Innerhalb eines Biofilmes bewirken unterschiedliche Mediatoren eine komplexe
Kommunikation zwischen den Zellen, welche „Quorum-sensing“ genannt wird. Dies
führt zu einer Veränderung der Stoffwechselaktivität und einem veränderten
Verhalten im Vergleich zu planktonischen Bakterien (BRAXTON ET AL. 2005; HALL-
STOODLEY ET AL. 2004; O’GARA 2007). Bakterien haben in einem Biofilm mehrere
Vorteile gegenüber planktonischen Bakterien. Durch verschiedene Mechanismen
können zum Beispiel die Umgebungsbedingungen den Bedürfnissen der Bakterien
angepasst werden. Weiterhin steigt die Überlebensrate der Mikroorganismen durch
Schutz vor der körpereigenen Abwehr sowie vor antibakteriell wirksamen
Medikamenten (ARCHER ET AL. 2011; BRAXTON ET AL. 2005; YARWOOD UND BARTELS
2004). Beispiele für solche Vorteile innerhalb von Biofilmen sind:
1. Nährstoffspeicherung in der umgebenden Matrix, vor allem von Stickstoff und
Phosphat. Die entsprechenden Moleküle können durch Biofilm-eigene kleine
Kanäle transportiert werden (BRAXTON ET AL. 2005).
2. Schutz vor Scherkräften durch die extrazelluläre Matrix (SHIRTLIFF ET AL. 2002).
3. Die Matrix als Diffusionsbarriere, die die Bakterien in einem Biofilm vor
antimikrobiellen Substanzen oder Abwehrzellen schützt (AKIYAMA ET AL. 1993;
COSTERTON 1999).
4. Absinken der Stoffwechselrate der Bakterien in einen sogenannten Persister-
Zustand. Dadurch sind die Mikroorganismen deutlich weniger durch viele
antibakteriell wirksamen Medikamente angreifbar, da diese in den
Stoffwechsel der Bakterien eingreifen (XU ET AL. 2000).
II. Literaturübersicht 11
Da die Eliminierung des Biofilms durch das Immunsystem häufig nicht möglich ist,
kommt es zu einer fibrösen Einkapselung. Man geht davon aus, dass durch diesen
Vorgang der Biofilm möglichst vollständig abgegrenzt werden soll. Allerdings wird
hierdurch auch das Überleben der Bakterien gefördert, da weder weitere
Immunzellen noch antimikrobielle Wirkstoffe den infizierten Bereich erreichen können
(HANKE UND KIELIAN 2012).
Grundsätzlich wird die Anheftung von Bakterien an eine Implantatoberfläche nur
dadurch ermöglicht, dass keine gute Einheilung in das Gewebe stattgefunden hat.
Bei ausreichender Einheilung wird die Implantatoberfläche von Gewebezellen belegt,
sodass weniger Fläche für eine Biofilmbildung zur Verfügung steht. Im Gegensatz
dazu ist keine ausreichende Einheilung in das umgebende Gewebe mehr möglich,
sobald sich ein Biofilm auf der Implantatoberfläche gebildet hat (ANDERSON 1993).
2.3.2. Nachweismethoden für Biofilme auf Implantate n
Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von Bakterien und Biofilmen auf
Implantaten, die verschiedene Vor- und Nachteile haben. Für eine aussagekräftige
Beurteilung sollte die gewählte Methode eine Unterscheidung zwischen
planktonischen Bakterien und Biofilmen ermöglichen und eine Quantifizierung
erlauben. Interessant ist zudem die Darstellung, ob die Bakterien noch lebensfähig
sind.
Ein häufig gewähltes Instrument zum Bakteriennachweis ist die Polymerase-
Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) (FREIRE 2011; LI ET AL. 2008; VERMA
ET AL. 2010). Die PCR ist sehr sensitiv zur Detektierung vorhandener
Desoxyribonukleinsäure (DNS) der nachzuweisenden Keime. Nachteilig ist jedoch,
dass es sich bei einer normalen PCR um einen rein qualitativen Nachweis handelt
(AMMANN ET AL. 2013; TAVERNIER UND COENYE 2015). Eine genau Quantifizierung des
Biofilmes ist durch eine sogenannte real-time PCR (rt-PCR), oder auch quantitative
PCR (qPCR), möglich. Dabei wird mit Hilfe einer Fluoreszenz-Reaktion dargestellt,
wie viel genetisches Ausgangsmaterial vervielfältigt wurde. Somit erlaubt diese
Methode eine sehr genaue Quantifizierung vorhandener Bakterien beziehungsweise
eines Biofilmes (AMMANN ET AL. 2013).
II. Literaturübersicht 12
Als weitere Möglichkeit zum Nachweis von Bakterien werden Abstriche vom
Implantat genommen, die anschließend mit Hilfe eines Ausstrichs auf einem
entsprechenden Nährmediums angezüchtet werden. Alternativ wird das Implantat
direkt auf einem Nährboden ausgerollt um anhaftende Bakterien nachzuweisen.
Danach können die Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) als Maß für die Menge der
vorhandenen Bakterien bestimmt werden (LUCKE ET AL. 2003). Diese Methode ist
kritisch zu betrachten, da dadurch eher ein qualitativer Nachweis von Bakterien
erfolgt, da mit einem solchen Vorgehen nicht alle vorhandenen Keime, insbesondere
nicht fest angehefteter Biofilm, vom Implantat abgelöst werden können. Gleichzeitig
ist zu beachten, dass ein Biofilm aus Bakterien besteht, die sich in verschiedenen
Stoffwechsel-Zuständen befinden. So sind zum Beispiel inaktive Persister-Bakterien
nahezu nicht kultivierbar, obwohl sie lebendig, vermehrungsfähig und in der Lage
sind, den Wirt zu schädigen. Des Weiteren ist bei einer Anzüchtung zu beachten,
dass je nach verwendetem Medium und gewählten Umgebungsbedingungen
bestimmte Keime selektiert werden (BJERKNES ET AL. 2014; TAVERNIER UND COENYE
2015).
Eine andere Art der mikrobiologischen Kultivierung ist die Homogenisierung und
Lösung von dem das Implantat umgebenden Gewebe, um damit ebenfalls eine
Anzüchtung zum Nachweis von Bakterien durchzuführen. Mittels der KBE wird so
eine Quantifizierung erreicht und anhand der Koloniemorphologie werden die
Bakterien identifiziert (CHEN ET AL. 2005, 2009; POELSTRA ET AL. 2000). Der Nachteil
dieses Vorgehens ist jedoch, dass nicht ersichtlich ist, ob die Keime sich direkt auf
dem Implantat oder im umgebenden Gewebe befanden. Es ist wahrscheinlich, dass
im Falle einer maturen Biofilmbildung auf dem Implantat diese Bakterien mit dem
Implantat entfernt werden und nicht im untersuchten Gewebematerial nachweisbar
sind. Außerdem ist nicht erkennbar, ob die Keime in einem Biofilm organisiert waren
(KERSTENS ET AL. 2015).
Eine Ablösung der Bakterien von Implantaten wurde zudem mittels Zentrifugation
des Implantates in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) beschrieben (CUCARELLA
ET AL. 2001; HAENLE ET AL. 2013; RUPP ET AL. 1999). Die entstandene Flüssigkeit wird
anschließend auf ein Nährmedium gegeben und mit der KBE eine Quantifizierung
II. Literaturübersicht 13
erreicht. Bei diesem Vorgehen ist es wahrscheinlich, dass anhaftender maturer
Biofilm nicht abgelöst wird, sondern hauptsächlich planktonische Bakterien und
unreifer, nicht fest etablierter Biofilm nachgewiesen wird (KERSTENS ET AL. 2015). Eine
weitere Möglichkeit zur Ablösung eines Biofilms vom Implantat zur nachfolgenden
Anzüchtung und Untersuchung ist die Inkubation in einem Ultraschall-Bad, was sich
bereits in verschiedenen Untersuchungen als zuverlässig erwiesen hat (BEENKEN UND
DUNMAN 2004; KERSTENS ET AL. 2015; SNOWDEN ET AL. 2012; VAN WIJNGAERDEN ET AL.
1999).
Alle beschriebenen Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass nicht erkennbar ist,
ob es sich bei den nachgewiesenen Keimen um planktonische Keime oder um
Bakterien handelt, die in einem Biofilm organisiert waren. Zusätzlich ist keine
zuverlässige Quantifizierung mittels einer Anzüchtung zu erreichen, da ein Biofilm
aus Bakterien besteht, die sich in sehr unterschiedlichen Stoffwechsel-Zuständen
befinden und nicht kultivierbar sein können, obwohl sie noch lebensfähig sind
(BJERKNES ET AL. 2014; TAVERNIER UND COENYE 2015). Außerdem ist eine Anzüchtung
in der Regel sehr arbeits- und zeitintensiv (HANNIG ET AL. 2010).
Eine weitere Methode ist die direkte Darstellung von Bakterien auf einem Implantat
mit Hilfe der Mikroskopie, wobei die Elektronen-Scanning-Mikroskopie oder die
konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) verwendet werden kann (ALT ET AL.
2011; ARAD ET AL. 2013; SNOWDEN ET AL. 2012; WINDOLF ET AL. 2013). Insgesamt ist zu
sagen, dass sowohl die Qualifizierung als auch Quantifizierung von Bakterien auf
Implantaten sehr schwierig ist (FREIRE 2011; LI ET AL. 2008; VERMA ET AL. 2010).
2.4. Staphylococcus aureus
Der am häufigsten bei Implantat-assoziierten Infektionen nachgewiesene Keim ist
S. aureus, welcher in diesem Zusammenhang für eine hohe Morbidität und Mortalität
verantwortlich gemacht wird (GREENSPON ET AL. 2008; SCHROEDER ET AL. 2009; SMITH
ET AL. 2008). Bei S. aureus handelt es sich um aerobe, grampositive Kokken mit
saprophytärem Vorkommen. Sie sind bei Menschen und Tieren hauptsächlich auf
der Haut und den Nasenschleimhäuten zu finden und führen erst durch bestimmte
Voraussetzungen, wie zum Beispiel ein hohes Alter oder eine Immundefizienz des
II. Literaturübersicht 14
Patienten oder dem Verbringen einer hohen Keimlast in eine Operationswunde, zu
schweren Erkrankungen (ARCHER ET AL. 2011; GALLAGHER UND MERTENS 2012; KLOOS
UND BANNERMAN 1994). S. aureus ist unbeweglich, gehört zu den Koagulase-
positiven Staphylokokken und ist ein häufiger Erreger nosokomialer Infektionen
(DASCHNER ET AL. 2006; KLOOS UND BANNERMAN 1994; PFANZELT 2006; SHIRTLIFF ET AL.
2002). Die pathogenen Eigenschaften Koagulase-positiver Staphylokokken sind
abhängig von Virulenzfaktoren, welches in der Regel Zellwand-assoziierte Proteine
sind und wozu zum Beispiel das Protein A, Staphylokinase, DNasen, Lipasen,
Hyaluronidasen, Hämolysine und Leukozidine gehören (FOURNIER UND PHILPOTT
2005; HARRO ET AL. 2010; LINDE UND LEHN 2002). Die Expression der Virulenzfaktoren
ist unter anderem von Quorum-sensing-Mechanismen abhängig (ARCIOLA ET AL.
2011). Um eine manifeste Infektion zu verursachen, müssen in der Regel mehrere
Virulenzfaktoren in koordinierter Form vorhanden sein (FOURNIER UND PHILPOTT
2005). S. aureus induziert unter anderem am Knochen eine Entzündungsreaktion, an
der Mediatoren beteiligt sind, die die Aktion von Osteoblasten und Osteoklasten
beeinflussen können. S. aureus ist in der Lage in Osteoblasten eindringen und über
verschiedene Signalwege eine Apoptose induzieren (ALEXANDER ET AL. 2003;
ELLINGTON ET AL. 1999; WRIGHT UND NAIR 2010).
S. aureus kann einen mehrlagigen Biofilm bilden, der unter anderem aus Blut und
Gewebeflüssigkeit besteht (ARCHER ET AL. 2011; SHIRTLIFF ET AL. 2002). Außerdem
enthält dieser viel Fibrin, wodurch er widerstandsfähig gegen physikalische und
immunologische Einflüsse ist (NEMOTO ET AL. 2000). Zur Biofilmbildung durch
S. aureus sind unterschiedliche bakterieneigene Oberflächenproteine notwendig, um
die einzelnen Schritte der Biofilmbildung zu vollziehen (ABRAHAM UND JEFFERSON
2010; AKIYAMA ET AL. 1993; ARCIOLA ET AL. 2011; CAIAZZA UND O’TOOLE 2003;
HERRMANN ET AL. 1988; SCHROEDER ET AL. 2009). S. aureus kann über verschiedene
Signalwege eine Phagozytose durch neutrophile Granulozyten verhindern (ARCHER
ET AL. 2011; FOSTER 2005; GÜNTHER ET AL. 2009; THURLOW ET AL. 2011). Zudem
kommt es zu einer Thrombus-Bildung aus Thrombozyten und Fibrin, in denen die
Bakterien wachsen, aber nicht von den neutrophilen Granulozyten eliminiert werden
können (FOSTER 2005).
II. Literaturübersicht 15
Die Behandlung einer Infektion mit einem S. aureus-Biofilm ist schwierig und
langwierig, da der Biofilm vor allem im ausgereiften Zustand weitestgehend resistent
gegen die körpereigene Abwehr und gegen antimikrobielle Therapien ist (ARCHER ET
AL. 2011; THURLOW ET AL. 2011).
3. Tiermodelle für die Untersuchung von Implantatin fektionen
Tiermodelle werden in der Forschung für unterschiedliche Zwecke verwendet. Dazu
gehören unter anderem die Erprobung neuer Materialien in der Implantologie oder
die präklinische Testung von Behandlungsmöglichkeiten, bevor diese Ansätze am
Patienten untersucht werden (AMORENA UND GRACIA 1999; HAENLE ET AL. 2013;
NORDEN 1988; STAVRAKIS ET AL. 2015). Ebenso ist es möglich, pathophysiologische
Vorgänge mit Hilfe von Tiermodellen besser zu verstehen (ARAD ET AL. 2013; FOSTER
2005). Für die Untersuchung von Implantatinfektionen gibt es bereits einige
Tiermodelle, wobei der Großteil dieser Modelle mit orthopädischen oder dentalen
Implantaten durchgeführt wurde (ALT ET AL. 2011; AN UND FRIEDMAN 1998; CHEN ET AL.
2005; FREIRE 2011; VERMA ET AL. 2010).
In der Regel werden Nager für solche Modelle verwendet, wie zum Beispiel Mäuse
oder Ratten. Die Haltung dieser Tiere ist einfacher und in höherer Zahl möglich als
bei größeren Tieren, wie Hund, Schwein oder Schaf. Ratten eignen sich sehr gut als
Modelltier, da sie nach der Maus das am zweitbesten untersuchte Versuchstier sind
und aufgrund ihrer Größe erlauben, komplexere Implantate als bei Mäusen zu
untersuchen. Das Genom der Ratte ist inzwischen vollständig sequenziert worden,
wobei bei vielen Genen, die für die Entstehung von Krankheiten verantwortlich sind,
Parallelen zum Menschen gefunden wurden (GIBBS ET AL. 2004). Ein weiterer Vorteil
von Nagern ist eine große kontrollierte genetische Variabilität, die im zukünftigen
Verlauf eines Modells verwendet werden könnte. So zeigen zum Beispiel einige
Stämme eine sehr hohe Inzidenz an Diabetes mellitus, welches unter anderem ein
Faktor ist, der die Infektionsraten von Implantaten deutlich erhöht. Durch die
Verwendung solcher Tiere können zusätzlich die Einflüsse verschiedener
Risikofaktoren evaluiert werden (HALLAK 2014; HEINONEN ET AL. 2015; STAVRAKIS ET
II. Literaturübersicht 16
AL. 2015). Die Verwendung von Ratten als Modelltier birgt jedoch neben den
genannten Vorteilen vor allem für Infektionsversuche auch einige Nachteile. Ratten
haben ein sehr effektives Immunsystem, was dazu führt, dass Bakterien, die
aufgrund der angestrebten prädiktiven Validität häufig humanen Ursprungs sind, sehr
schnell eliminiert werden und es schwierig ist, chronische Infektionen insbesondere
unter Beteiligung von Biofilmen hervorzurufen, wie sie beim Menschen vorkommen
(OFLUOGLU ET AL. 2007).
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, das Immunsystem der Tiere zu beeinflussen,
um eine entsprechende Infektion durch humanpathogene Bakterien auszulösen. Ein
häufig gewählter Ansatz ist die Verwendung genveränderter, immundefizienter
Nacktratten zur Untersuchung solcher Infektionen (DRAKE ET AL. 2011; OHASHI ET AL.
1999). Die Kosten für die Anschaffung sind jedoch verhältnismäßig hoch. Zudem
sind die Haltung und das Handling der Ratten insbesondere bei chirurgischen
Eingriffen vergleichsweise schwierig (JÄCKEL 2012).
Ein weiterer Ansatz wäre eine pharmakologische Immunsuppression der Tiere. Für
diesen Zweck ist oft die Behandlung mit Ciclosporin A (CSA) das Mittel der Wahl und
wurde schon in mehreren Tiermodellen erfolgreich verwendet (HANDRECK ET AL.
2015; DA SILVA PERALTA ET AL. 2015; ZIJLSTRA ET AL. 2009). Das Einsatzgebiet liegt
hauptsächlich in der Transplantationsmedizin, wo es zur Verhinderung von
Transplantatabstoßungen eingesetzt wird (SCHRAMM 2005). CSA beeinflusst durch
die spezifische Hemmung der T-Zellen die zelluläre Immunantwort und wird als
Calcineurin-Inhibitor eingestuft (SCHRAMM 2005; STUCKER UND ACKERMANN 2011). Die
Calcineurin-Hemmung wird durch eine Komplexbildung von CSA und Cyclophilin
erreicht, welches ein immunkompetentes Protein in den T-Helferzellen ist
(LADENBURGER 2003; LIU ET AL. 1991). Es erfolgt eine Blockade von aktivierten T-
Lymphozyten und zusätzlich wird die Antigen-Erkennung durch T-Zellen über
mehrere Signalwege gehemmt (ALLISON 2000; SCHRAMM 2005). CSA zeigt jedoch
relativ starke Nebenwirkungen und eine geringe therapeutische Breite (CURTIS ET AL.
1986; PADOVAN ET AL. 2002; STUCKER UND ACKERMANN 2011).
Eine Alternative zur Immunsuppression der Tiere stellt die Verwendung von
II. Literaturübersicht 17
rattenpathogenen Keimen dar, um die schnelle Eliminierung von Bakterien durch das
Immunsystem zu erschweren und eine der humanen chronischen Erkrankung
ähnliche Infektion zu simulieren (MEISSNER 1959). Auch bei Ratten kommen normale
S. aureus - Stämme auf der Haut vor, sodass vor allem durch spezifisch pathogene
Keime eine erkennbare Entzündung hervorgerufen werden kann.
Es gibt bereits zahlreiche Implantatmodelle, die allerdings in manchen Aspekten
optimierbar sind. Man findet zum Beispiel häufig eine Vorbesiedlung der Implantate
mit Bakterien in vitro, was jedoch nicht der tatsächlichen Ursache einer
Implantatinfektion, nämlich der intraoperativen Kontamination oder der
postoperativen, hämatogenen Absiedlung von Bakterien an dem Fremdmaterial,
entspricht (BRAXTON ET AL. 2005; CAMPOCCIA ET AL. 2013; KLOOS UND BANNERMAN
1994). Zum Beispiel inkubierte FREIRE (2011) Implantate für die Maulhöhle bis zu drei
Tage in einer Aggregatibacter actinomycetemcomitans-Lösung, sodass zum
Zeitpunkt der Implantation bereits ein maturer Biofilm vorhanden war. Die Gruppe um
INZANA ET AL. (2015) inkubierte Implantate zur Auslösung einer Osteomyelitis
mindestens zwei Stunden vor der Operation in einer S. aureus-Lösung, sodass die
Bakterien zum Zeitpunkt der Implantation bereits am Implantat angeheftet sein
konnten. Ebenfalls wurden Zeiten von vier Stunden oder 20 Minuten bei den
Versuchen von SNOWDEN ET AL. (2012) oder LI ET AL. (2008) verwendet, um eine
solche Anheftung zu realisieren.
Zusätzlich findet man häufig lange Standzeiten der Tiere nach der Implantation. So
nutzen VERMA ET AL. (2010) in einem Infektionsmodell in der Mundhöhle von Ratten
Standzeiten von sieben bis zu zwölf Wochen. Ebenfalls findet man häufiger
Standzeiten von vier bis sechs Wochen in der Literatur (HAENLE ET AL. 2013; LUCKE ET
AL. 2003). Diese langen Zeiträume führen sowohl zu einer hohen Belastung der Tiere
und gleichzeitig zu einer geringen Praktikabilität für die Experimentatoren, um das
Modell regulär für Testungen neuer Materialien oder Oberflächen zu nutzen.
Zusätzlich sind solche langen Zeiten teuer aufgrund der langen Tierhaltung und des
sehr hohen Arbeitsaufwandes.
II. Literaturübersicht 18
Gleichzeitig ist es bei der Entwicklung eines Modells wichtig, geeignete Methoden
zur Auswertung zu wählen. Diese sollten die Bakterien auf der Implantatoberfläche
nachweisen, eine Unterscheidung von planktonischen Bakterien und einem Biofilm
zulassen und gleichzeitig zumindest eine Semiquantifizierung der Keime
ermöglichen. Zusätzlich sollte die Entzündungsreaktion im umgebenden Gewebe
beurteilt werden, da diese eine sehr große Rolle bei Implantatversagen spielt.
Häufig werden die PCR oder eine mikrobielle Kultivierung zum Bakteriennachweis
verwendet. Beide Methoden wurden bereits in Kapitel 2.3.2. erörtert. Ebenfalls ist bei
bisherigen Modellen häufig zu finden, dass die Experimentatoren das
Hauptaugenmerk ausschließlich auf den Bakteriennachweis gelegt haben und die
umgebende Entzündungsreaktion vollständig vernachlässigt wurde. Ein Modell, bei
dem beides ausführlich ausgewertet wird, ist selten zu finden. Zum Beispiel haben
POELSTRA ET AL. (2000) und HAENLE ET AL. (2013) bei der Auswertung ausschließlich
Bakterien nachgewiesen. CHEN ET AL. (2014) haben eine Kombination aus einer PCR
und einer Kultivierung von Bakterien durchgeführt, die Entzündung wurde nur durch
eine makroskopische Beurteilung evaluiert. Ebenso haben ARAD ET AL. (2013) nur
vorhandene Bakterien nachgewiesen, welche einerseits mit Hilfe einer
Ultraschallbehandlung vom Implantat abgelöst und anschließend angezüchtet
wurden. Außerdem wurde noch mit einem Elektronenmikroskop die
Implantatoberfläche untersucht und somit Bakterien direkt auf dem Implantat
nachgewiesen. Die wahrscheinlich vorhandene Entzündung im umgebenden
Gewebe wurde nicht evaluiert. Neben einer Anzüchtung und einer PCR wurde ein
direkter Nachweis von Bakterien auf dem Implantat von FREIRE (2011) mit einem
konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) durchgeführt. Vorteil dieser Methode
war die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Bakterien, sowie der
gleichzeitige direkte Nachweis der Bakterien auf dem Implantat. Die
Entzündungsreaktion wurde jedoch nicht beurteilt. Eine Kombination aus Bakterien-
Anzüchtung und histologischer Auswertung der umgebenden Entzündung infolge
einer Osteomyelitis zeigten JOHANSEN ET AL. (2012), OFLUOGLU ET AL. (2007) und
LUCKE ET AL. (2003), wobei der Bakteriennachweis nur mittels Anzüchtung erfolgte
und somit die bereits genannten Nachteile aufwies. Eine sehr umfassende
II. Literaturübersicht 19
Auswertung zeigten SNOWDEN ET AL. (2012). Hier wurde nach Infektion eines
cerebroventriculären Katheters neben dem Nachweis von Bakterien mittels
Elektronen-Mikroskop, CLSM, Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) und
einer Anzüchtung aus einer Lösung von Bakterien, die mit Ultraschall vom Implantat
gelöst worden waren, auch das Gehirngewebe auf Entzündungsanzeichen
untersucht.
All diese Beispiele zeigen, dass ein praktikables Modell notwendig ist, mit dem direkt
eine Biofilmbildung am Implantat nachgewiesen werden kann und gleichzeitig auch
die Entzündungsreaktion des umgebenden Gewebes beurteilt wird.
4. Fragestellung
In dieser Arbeit soll ein Rattenmodell zur Untersuchung der Biofilmbildung und der
begleitenden Entzündungsreaktion an chirurgischen Titan-Implantaten entwickelt und
charakterisiert werden. Hierbei wird eine intraoperative Besiedlung der Implantate zur
Simulierung einer Kontamination während eines operativen Eingriffes gewählt. Die
Nutzung eines rattenpathogenen S. aureus-Stammes und die Verwendung
immunsupprimierter Ratten mit CSA im Vergleich zu unbehandelten
immunkompetenten Ratten soll eine chronische Reaktion und Biofilmbildung
ermöglichen. Außerdem sollen unterschiedliche Standzeiten getestet werden, um
den zeitlichen Verlauf der Bakterienentwicklung und der assoziierten Entzündung zu
evaluieren.
Die Bakterien sollen durch eine CLSM-Untersuchung direkt auf dem Implantat
nachgewiesen werden, wobei eine semiquantitative Auswertung angestrebt wird.
Gleichzeitig erfolgt eine Beurteilung der Entzündung des umliegenden Gewebes
durch eine histologische Auswertung des Knochens mit angrenzendem
Weichgewebe.
III. Material und Methoden 20
III. MATERIAL UND METHODEN
1. Versuchstiere
Es wurden für den Versuch weibliche Sprague-Dawley Ratten (Stammcode: Crl:CD
(SD)) mit einem Gewicht von 210 - 260 g verwendet (Charles River, Sulzfeld). Die
Tiere wurden für den Versuchszeitraum im Tierhaltungsbereich des CrossBIT
Forschungszentrums, Hannover gehalten.
Die Ratten wurden in einem klimatisierten Raum (Temperatur 22 °C ± 2 °C; relative
Luftfeuchte 55% ± 10%) mit einem Tag-/Nacht-Rhythmus (14 h/ 10 h) mittels
Kunstlicht in Typ IV-Käfigen mit hohem Deckel (1800 cm2; Makrolon®-Käfige,
Tecniplast Deutschland, Hohenpeißenberg) in Gruppengrößen bis zu fünf Tieren pro
Käfig gehalten. Leitungswasser und ein pelletiertes Haltungsfutter (Altromin 1324
TPF, Altromin Spezialfutter, Lage) stand den Tieren ad libitum zur Verfügung. Nach
einer Akklimatisierungsphase von sieben Tagen wurde mit den Experimenten
begonnen.
Die Durchführung des Tierversuches wurde genehmigt vom Niedersächsischen
Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES). Der
genehmigte Tierversuchsantrag trägt das Aktenzeichen 14/1526.
2. Ablauf des Tierversuches
2.1. Versuchsgruppen
Allen Tieren wurden zwei Titan-Schrauben (Gebr. Brasseler, Lemgo) unter
Vollnarkose in die Schädelkalotte implantiert. Bei der Hälfte der Tiere wurden diese
Implantate intraoperativ mit S. aureus besiedelt. In der Kontrollgruppe wurde anstelle
der Bakterienlösung PBS (Biochrom, Berlin) verwendet. Die Tiere wurden abhängig
von der Immunkompetenz in zwei Gruppen eingeteilt, es wurden immunkompetente
Ratten (naiv) und pharmakologisch immunsupprimierte Tiere (CSA); Sandimmun®,
III. Material und Methoden 21
Novartis Pharma, Nürnberg) verwendet. Sowohl die infizierte Versuchsgruppe, als
auch die Kontrollgruppe bestand aus naiven und pharmakologisch
immunsupprimierten Tieren. Postoperativ wurden die Tiere zwei, zehn und 21 Tage
nach der Operation zur Probenentnahme euthanasiert, um den Einfluss der Zeit auf
das Bakterienwachstum und die Entzündungsreaktion zu evaluieren. Eine Übersicht
über die Versuchsgruppen mit jeweils n = 7 Ratten gibt Tabelle 1.
Tabelle 1: Übersicht über die Versuchsgruppen. Behandlung intraoperativ Immunstatus Standzeit
2 Tage 10 Tage Naiv 21 Tage 2 Tage
10 Tage
PBS, 5 µl
Immunsupprimiert (CSA) 21 Tage 2 Tage
10 Tage Naiv 21 Tage 2 Tage
10 Tage
Staphylococcus aureus, 5x107 KBE in 5 µl
Immunsupprimiert (CSA) 21 Tage
2.2. Anzüchtung und Konzentration der Bakterien
Bei den verwendeten Bakterien handelte sich um einen rattenpathogenen S. aureus-
Stamm (36/07), der vom Institut für Versuchstierkunde und Zentrales
Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover isoliert und uns zur
Verfügung gestellt wurde. Die Bakterien wurden in der Klinik für Zahnärztliche
Prothetik und Biomedizinische Werkstoffkunde der Medizinischen Hochschule
Hannover angezüchtet und für die intraoperative Besiedlung der Implantate
vorbereitet.
Es wurde eine aerobe Vorkultur der Bakterien in 5 ml Tryptic Soya Broth (TSB)
(Oxoid, ThermoFisher Scientific, Wesel) hergestellt, welchem 15 mg Yeast extract
(Carl Roth, Karlsruhe) zugegeben wurden. Diese wurde 18 Stunden bei 37 °C im
Schüttelinkubator inkubiert. Zur Herstellung der Keimsuspension wurde mit Hilfe
III. Material und Methoden 22
eines Photometers (BioPhotometer, Eppendorf, Hamburg; Wellenlänge 600 nm) eine
optische Dichte (OD) von 0,794 in der Vorkultur eingestellt. Im Anschluss wurden
davon 10 ml für 15 min mit 4000 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert
(Multifuge 1S-R, Thermo40Scientific, Waltham, USA) und der Überstand
anschließend abgegossen. Das entstandene Pellet wurde in 50 ml PBS
resuspendiert und erneut 15 min mit 4000 U/min zentrifugiert. Das zuletzt
entstandene Pellet wurde in 200 µl PBS resuspendiert, wodurch diese Suspension
eine Bakterienkonzentration von 1010 KBE/ml enthielt.
2.3. Operativer Eingriff
Vor der Operation wurde jedem Tier Metamizol (Novalgin® Tropfen 500 mg/ml;
WDT, Garbsen) in der Dosierung von 200 mg/kg Körpergewicht (KGW) oral
verabreicht um eine Analgesie während und nach der Operation zu gewährleisten.
Die Anästhesie wurde mit einer intra-peritonealen Injektion (i.p.) (1 ml Spritzen:
Injekt-F, Tuberkulin; B.Braun, Melsungen) von Xylazin (Sedaxylan® 20 mg/ml
Injektionslösung für Tiere; WDT, Garbsen; Dosierung 4 mg/kg KGW) und Ketamin
(Ketamin 10%; WDT, Garbsen; Dosierung 75 mg/kg KGW) eingeleitet. Sobald die
Ratten nach der Injektion keine Reflexe mehr zeigten, wurde das Operationsfeld
geschoren (Aesculap Exacta; B. Braun, Melsungen). Anschließend wurden die
Ratten in einem stereotaktischen Rahmen (Stoelting Co., Wood Dale, USA) mittels
abgerundeter Ohrenstifte (45° Spitze) in den äußeren Gehörgängen und einem
Gebisshalter zum Einhaken der Schneidezähne fixiert. Auf beide Augen wurde
Bepanthen Augen- und Nasensalbe (Bayer, Leverkusen) aufgetragen um ein
Austrocknen während der Operation zu verhindern. Das rasierte Operationsfeld
wurde mit 70-prozentigem Ethanol (Th. Geyer, Hamburg) desinfiziert und es wurde
das Lokalanästhetikum Prilocain (Xylonest® 2%, AstraZeneca, Wedel) im
Operationsfeld aufgetragen. Daraufhin wurde ein etwa 2 cm langer Hautschnitt in der
Medianen über dem Schädelkalotte gemacht (Skalpell Nr. 10; pfm medical ag, Köln)
und die Haut seitlich mittels Klemmen (Bulldog Serrefine, 35 mm Länge, gerade;
Fine Science Tools, Heidelberg) fixiert, sodass das Operationsfeld frei lag. Mit Hilfe
des Skalpells wurde das Periost im Bereich der geplanten Implantation entfernt.
III. Material und Methoden 23
Nun wurde mit einer Handbohrmaschine (Minimot 40/E; PROXXON Micromot
Systems, Föhren) mit dem passenden Mikrobohrer (0,5 mm; PROXXON Micromot
Systems, Föhren) die Schädelkalotte rechts und links der Medianen angebohrt zum
späteren Einschrauben der Implantate (Abbildung 1a). Zur Besiedlung der
Implantate wurde in jedes Bohrloch 5 µl Bakteriensuspension mit der Konzentration
von 1010 Keime/ml gegeben, es wurden also jeweils 5 x 107 Keime eingebracht.
Vorangegangene Studien zeigten, dass dies eine adäquate Bakterienkonzentration
zur Auslösung einer Implantat-assoziierten Infektion darstellt (AN UND FRIEDMAN 1998;
CHEN ET AL. 2009; RUPP ET AL. 1999). In der Kontrollgruppe wurden je 5 µl PBS in die
Bohrlöcher eingegeben. Anschließend wurde mit einem passenden Applikator (Gebr.
Brasseler, Lemgo) jeweils eine Titan-Schraube (Gewinde: 1,0 mm Durchmesser;
2,3 mm Länge; Gebr. Brasseler, Lemgo; Abbildung 1b) rechts und links der
Medianen in die Schädelkalotte in die vorgebohrten Löcher geschraubt.
Nach Platzierung der Schrauben wurde die Haut mit einer Nadel-Faden-Kombination
(4/0 USP, Polyamid; Resorba®, Nürnberg) vernäht. Dafür wurde als Nahtmuster ein
einfaches U-Heft verwendet um eine gute Adaptation und eine breite
Berührungsfläche der Wundränder zu gewährleisten. Nach der Operation wurde den
Tieren Kochsalzlösung (5 ml i.p., Natrium-Chlorid 0,9%; B. Braun, Melsungen)
appliziert (Spritze: 5 ml, B. Braun, Melsungen; Kanüle: 100 Sterican, 23 Gx1“; B.
Braun, Melsungen) um einer Dehydratation vorzubeugen.
Abbildung 1: Zeichnung der knöchernen Schädeloberfläche (verändert nach Paxinos and Watson 1998) zur Darstellung der Implantationsstellen beidseits zwischen Bregma und Lambda (Pfeile; a). Abbildung der verwendeten Schrauben auf Millimeterpapier (b).
III. Material und Methoden 24
2.4. Postoperative Behandlung
Nach der Operation wurden die Tiere einzeln in Typ III-Käfige mit hohem Deckel
(810 cm2, 18 cm Höhe, Makrolon®-Käfige, Tecniplast Deutschland,
Hohenpeißenberg) und Filterdeckel gesetzt um ein ungestörtes Erwachen zu
gewährleisten. Wenn die Tiere am folgenden Tag ein gutes Allgemeinbefinden
zeigten und die Naht trocken und gut adaptiert war, wurden die Tiere mit infizierten
Implantaten in Gruppen zu zwei Tieren in einen Typ III-Käfig mit Filterdeckel gesetzt.
Die Kontrolltiere wurden wie bereits vor der Operation zu fünf Tieren in einem Typ IV-
Käfig gehalten.
Anschließend wurde täglich das Allgemeinbefinden der Tiere kontrolliert. Zur
Bewertung wurde das Schema nach GRIENSVEN UND DAHLWEID (2002) verwendet, wie
in Tabelle 2 beschrieben.
Tabelle 2: Bewertungsschema zur Beurteilung des Allgemeinbefindens nach GRIENSVEN UND DAHLWEID (2002)
Punkte Bewertung Kriterien 1 sehr aktiv kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen, normale
Futteraufnahme 2 aktiv kräftig, neugierig, gelegentliche Unterbrechungen in
der Aktivität, normale Futteraufnahme 3 weniger aktiv adäquate Antworten auf exogene Reize, häufige
Unterbrechungen in der Aktivität, ggf. verminderte Futteraufnahme
4 ruhig schläfrig, langsame Bewegungen, stark verminderte Futteraufnahme
5 apathisch keine Aktivität, bewegungsarm, keine Futteraufnahme
Bei einer Bewertung von > 2 wurde den Tieren einmal täglich Metamizol (200 mg/kg
oral; Novalgin® Tropfen 500 mg/ml; WDT, Garbsen) verabreicht. Außerdem wurde
am Tag nach der Operation und nachfolgend mindestens dreimal pro Woche das
Gewicht der Tiere bestimmt.
Die Abbruchkriterien für den Versuch waren so definiert, dass während des
gesamten Versuchsverlaufes im Falle eines Gewichtsverlustes von über 20% oder
einem Allgemeinbefindens mit einem Score von 4 oder schlechter das
III. Material und Methoden 25
entsprechende Tier sofort euthanasiert wurde.
Den Tieren, die pharmakologisch immunsupprimiert wurden, wurde ab einem Tag
vor der Operation täglich zur gleichen Tageszeit CSA in einer Dosierung von
10 mg/kg KGW i.p. injiziert (2 ml Spritze, B. Braun, Melsungen). Bei den behandelten
Tieren wurde täglich das Gewicht bestimmt, da die therapeutische Breite von CSA
gering ist und somit eine möglichst genaue Dosierung erforderlich ist. Es wurde eine
1:25 Verdünnungslösung hergestellt (1 ml Ciclosporin A 50 mg/ml (Sandimmun®,
Novartis Pharma, Nürnberg) und 24 ml Natrium-Chlorid 0,9% (B. Braun,
Melsungen)), wovon den Tieren einmal täglich 0,5 ml/100 g KGW appliziert wurde.
Dieses Vorgehen zur Immunsuppression mit CSA wurde bereits mehrfach
beschrieben und ist mit einem Blutspiegel im therapeutischen Bereich von über
200 ng/ ml verbunden (HANDRECK ET AL. 2015; REIS ET AL. 1998; DA SILVA PERALTA ET
AL. 2015). Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieser Wert stichprobenartig überprüft.
2.5. Entnahme der Blutproben und weitere Bearbeitun g
Die Tiere wurden an Tag zwei, zehn oder 21 nach der Implantation der Schrauben
mittels einer Überdosis Ketamin und Xylazin euthanasiert. Sobald die Tiere keine
Reflexe mehr zeigten, wurde bei zwei zufällig ausgewählten Tieren pro
immunsupprimierter Gruppe Blut abgenommen. Dies erfolgte mittels retrobulbärer
Punktion mit Kapillaren (Natrium-Heparin Mikro-Hämatokrit Kapillaren; Brand,
Wertheim), wobei das Blut in EDTA-beschichteten Eppendorf-Gefäßen (Probengefäß
K3E; Sarstedt, Nümbrecht) aufgefangen wurde. Diese Stichproben sollten
sicherstellen, dass die Tiere einen Blutspiegel von CSA im therapeutischen Bereich
oberhalb von 200 ng/ ml aufwiesen.
Die Blutproben wurden bis zur Untersuchung bei -80 °C eingefroren. Die Analyse des
Blutes wurde im Labor für Klinische Chemie der Medizinischen Hochschule
Hannover mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektometrie
durchgeführt (LC-MS/MS).
III. Material und Methoden 26
2.6. Entnahme der Implantate und Schädelkalotten un d deren weitere
Bearbeitung
Nach Aussetzen der Atmung wurden die Tiere dekapitiert und anschließend wurde
die Haut über der Schädelkalotte eröffnet (Skalpell Nr. 10; pfm medical ag, Köln).
Nach der Freilegung der Schraubenköpfe wurden diese mittels des Applikators
(Gebr. Brasseler, Lemgo) aus der Schädelkalotte gedreht. Die Schrauben wurden
jeweils einzeln in ein Eppendorf-Gefäß (Reagiergefäß 1,5 ml easy cap; Sarstedt,
Nümbrecht) mit 1 ml PBS gegeben, damit das anhaftende Gewebe und der
gegebenenfalls vorhandene Biofilm nicht austrockneten. Eventuell vorhandene
planktonische Bakterien am Implantat wurden so schon teilweise abgelöst, während
fest anhaftender Biofilm sich nicht vom Implantat löst. Im Anschluss wurden die
Schädelkalotten der Ratten mit einer Knochenzange (Bone Pliers; Fine Science
Tools, Heidelberg) abgetragen und zur Fixierung in 4-prozentiges Formalin (10%
gepufferte Formalin-Lösung, Sigma Aldrich, Seelze; verdünnt auf 4% mit PBS)
gegeben. Von den beiden Schrauben wurde jeweils eine Schraube pro Tier unter
dem CLSM (Leica DM LFSA; Leica Mikrosysteme, Wetzlar) untersucht. Das zweite
Implantat wurde für etwaige spätere Analysen bei -80 °C eingefroren. Die
Schädelkalotten wurden für eine ausreichende Fixierung mindestens einen Tag in
Formalin gelagert. Danach wurden sie zur histologischen Untersuchung vorbereitet.
3. Auswertung der Proben
3.1. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie der Impla ntate
Zur Untersuchung der Implantate mittels des CLSM wurden die Schrauben zur
weitgehenden Entfernung planktonischer Bakterien zunächst mit 4 ml PBS gespült.
Danach erfolgte eine Lebend-Tot-Färbung (Life Technologies, ThermoFisher
Scientific, Wesel) mit anschließender Fixierung (siehe Tabelle 3). Hierzu wurden die
Farbstoffe Propidiumjodid und Syto 9 1:1000 mit PBS (je 1 µl Farbstoff + 1 ml PBS)
gemischt. Syto 9 kann alle Membranen durchdringen und färbt daher alle Zellen an,
während Propidiumjodid nur bereits beschädigte Membranen durchdringt und somit
III. Material und Methoden 27
nur die DNS von toten Bakterien anfärbt (FREIRE 2011; HANNIG ET AL. 2010). Die
Schrauben wurden mit der Färbelösung bedeckt und für 15 min im Dunkeln inkubiert.
Danach wurde die Farbstofflösung abgezogen. Für die anschließende Fixierung
wurden die Schrauben in einer 2,5-prozentigen Glutardialdehydlösung (Verdünnung
1:10, 25% Glutardialdehyd (Carl Roth, Karlsruhe) mit PBS) für 15 min im Dunkeln
inkubiert. Die Schrauben konnten noch kurzfristig bis zur Mikroskopie in PBS bei
4 °C im Dunkeln gelagert werden. Die maximale Farbstabilität lag bei etwa 24 h.
Tabelle 3: Färbung und Fixierung der Schrauben
Medium Zeit
Färbung Propidiumjodid + Syto 9 (Verdünnung 1:1000 in PBS)
15 min im Dunkeln
Fixierung 2,5% Glutardialdehyd 15 min im Dunkeln
Bei dem verwendeten Mikroskop handelt es sich um das Auflichtmikroskop Leica DM
LFSA (Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Wetzlar). Die Proben wurden in einer
Flüssigkeits-Immersion (PBS als Immersionslösung) mit einem Laser mit einer
emittierten Wellenlänge von 488 nm untersucht. Durch die Färbung wurden lebende
Zellen bei dem verwendeten Laser in grün angezeigt, tote Zellen hingegen rot. Eine
gelbe Farbe kam durch die Überlagerung der Farben grün und rot zustande. Dies ist
unter anderem der Fall bei metabolisch inaktiven Bakterien, da diese eine etwas
erhöhte Zellpermeabilität haben und somit das Propidiumjodid zumindest teilweise in
die Bakterien eindringen kann (FREIRE 2011).
Bei der Untersuchung der Schrauben am CLSM wurden die detektierten Bakterien
nach einem Scoring-System eingeteilt (Tabelle 4). Wurden keine Bakterien detektiert,
wurde der Score 0 vergeben. Ein Score von eins stand für diffus verteilte Bakterien
oder sehr kleine Mikrokolonien aus einzelnen Bakterien. Bei einer größeren, gut
abgegrenzten Mikrokolonie ergab sich ein Score von zwei. Der Score drei stand für
die Detektion von zwei bis zu fünf Mikrokolonien. Bei mehr als fünf Mikrokolonien
wurde der Score vier vergeben und eine sehr große Biofilmformation wurde mit
einem Score von fünf bewertet.
III. Material und Methoden 28
Tabelle 4: Score zur Bewertung der Bakterien auf den Schrauben im CLSM mit jeweils einer repräsentativen Aufnahme. Die unterschiedliche Größe der Maßstäbe kommt durch die Einstellungen am Mikroskop zustande.
Score 0 Score 1 Score 2
Keine Bakterien vorhanden (bei den angefärbten Strukturen
handelt es sich um Zellen)
Diffus verteilte Bakterien (kleine grüne Punkte)
Eine abgegrenzte Mikrokolonie (Pfeil)
Score 3 Score 4 Score 5
2 - 5 Mikrokolonien (Pfeile) > 5 Mikrokolonien (Pfeile) Sehr große
Biofilmformationen (über das komplette Bild)
III. Material und Methoden 29
3.2. Histologie der Schädelkalotten
3.2.1. Einbettung in Technovit
Die Knochenproben wurden in Technovit 9100 (Heraeus Kulzer, Wehrheim)
eingebettet. Das ist ein Polymerisationssystem auf der Basis von Methylmethacrylat
(MMA), das der Einbettung von mineralisiertem Gewebe dient. Durch die
Hartschnitttechnik ist die Untersuchung mit einem Lichtmikroskop möglich.
Zu diesem Kunststoffeinbettungssystem gehören mehrere Komponenten. Die erste
Komponente ist die Basisflüssigkeit, welche aus stabilisiertem MMA besteht und für
die weitere Verwendung mit Aluminiumoxid (Carl Roth, Karlsruhe) entstabilisiert wird.
Dafür werden 800 ml Basisflüssigkeit mit 48 g Aluminiumoxid für eine Stunde
inkubiert und anschließend filtriert. Die zweite Komponente ist das
Polymethylmethacrylat- (PMMA-) Pulver, welches für einen reibungslosen
Polymerisationsablauf notwendig ist. Des Weiteren gehören die Härter 1 und 2 zu
Technovit 9100, welche zusammen die Polymerisation starten. Zusätzlich wird noch
ein Regler benötigt, der für eine gute Polymerisation sorgt.
Die Bearbeitung der Knochenproben verlief in mehreren Schritten. Zuerst wurden die
Proben fixiert. Darauf folgten die Dehydratation, die Präinfiltration, die Infiltration und
schließlich die Polymerisation. Ein Überblick über die einzelnen Schritte bietet
Tabelle 5.
Nach der Fixation der Schädelkalotten in 4-prozentigem Formalin erfolgte die
Dehydratation über sechs Tage mit einer aufsteigende Alkoholreihe aus 70-
prozentigem Ethanol, 96-prozentigem Ethanol (Th. Geyer, Hamburg) und
Isopropanol (Carl Roth, Karlsruhe) und abschließend dem Intermedium Xylol (Carl
Roth, Karslruhe). Die Proben wurden jeweils 48 h in dem entsprechenden Medium
inkubiert, wobei dreimal täglich das Medium erneuert wurde. Die komplette
Dehydratation erfolgt bei Raumtemperatur auf einem Rüttler (IKA-Vibrax VXR; IKA,
Staufen).
Anschließend erfolgte die Präinfiltration, wofür eine Lösung aus 500 ml
entstabilisierter Basislösung mit 2,5 g Härter 1 angesetzt wurde. Die Proben wurden
III. Material und Methoden 30
darin drei Tage bei 4 °C inkubiert. Es folgte die Infiltrationsphase in einer Lösung, die
aus 250 ml Präinfiltrationslösung mit 20 g gelösten PMMA-Pulver bestand. Die
Proben inkubierten sieben Tage bei 4°C in der Infiltrationslösung.
Der letzte Schritt zur Einbettung der Proben stellte die Phase der Polymerisation dar.
Dafür wurden die Stammlösung A aus 250 ml entstabilisierter Basislösung, 40 g
PMMA-Pulver und 1,5 g Härter 1 und die Stammlösung B aus 25 ml entstabilisierter
Basislösung, 2 ml Härter 2 und 1ml Regler angesetzt. Aus beiden Lösungen wurde
das Polymerisationsgemisch hergestellt, welches sofort verwendet werden musste,
da die Polymerisation direkt nach der Mischung der beiden Stammlösungen beginnt.
Nach der Einbettung der Proben in der Polymerisationslösung in den
entsprechenden Förmchen (Polyethylen-Einbettförmchen, Heraeus Kulzer,
Wehrheim) wurde mittels eines Vakuumexsikkators (VacuBottle System; Inotech
LabLogic Systems, Brandon, USA) ein Vakuum erzeugt, um vorhandene Luft aus der
Polymerisationslösung zu entfernen, da diese die Polymerisation behindert. Zur
Aushärtung wurden die Proben anschließend für mindestens 48 h bei 4 °C gelagert.
Danach war die Polymerisation abgeschlossen und die Blöcke konnten aus den
Förmchen gelöst werden.
Tabelle 5: Protokoll für die Dehydratation und Einbettung in Technovit 9100 Medium Zeit Temperatur
70% Ethanol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur 96% Ethanol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur Isopropanol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur
Xylol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur Präinfiltratioslösung 3 Tage 4°C Infiltrationslösung 7 Tage 4°C
Polymerisationslösung 2 Tage 4°C
3.2.2. Erstellung der histologischen Schnitte
Vor dem Schneiden der Technovit-Blöcke wurden die Objektträger
(SuperFrost®Plus, Menzel, Braunschweig) mit einer Poly-L-Lysine Stammlösung
(Sigma-Aldrich, Seelze) und Ponal Express Holzleim (Henkel AG, Düsseldorf)
beschichtet. Hierfür wurden 3 g Ponal Express in 150 ml vollentsalztem (VE-)
Wasser gelöst und 7,5 ml Poly-L-Lysine mit 75 ml VE-Wasser verdünnt. Beide
III. Material und Methoden 31
Lösungen wurden gemischt und die sauberen Objektträger für 10 min in diese
Lösung gestellt. Danach mussten die Objektträger vor der Benutzung noch 24 h bei
37 °C trocknen.
Von den Blöcken wurde mit Hartschnitttechnik an einem Rotationsmikrotom (Leica
RM 2165; Leica, Wetzlar) und dem entsprechenden Messer (16 cm
Hartmetallschneide, Profil c; Leica, Wetzlar) Dünnschnitte mit einer Dicke von 5 µm
angefertigt. Die Schnitte wurden mit einer Polyethylen-Folie (Heraeus Kulzer,
Wehrheim) abgedeckt und in einer Objektträgerpresse (Heraeus Kulzer, Wehrheim)
bei 37 °C mindestens 48 h getrocknet.
Entplastung
Für die anschließende Hämalaun-Eosin-Färbung (HE-Färbung) war eine Entplastung
der Technovit-Schnitte erforderlich. Hierfür wurden die Schnitte dreimal 20 Minuten in
2-Methoxyethylacetat (MEA; Merck, Darmstadt) inkubiert.
Färbung
Anschließend wurden die Schnitte mit einer HE-Färbung angefärbt. Dies ist eine weit
verbreitete Standardfärbung, wobei es sich um eine Doppelfärbung mit zwei
Farbstoffen handelt. Hämalaun ist ein positiv geladener Farbstoff, der an saure
Gewebebestandteile bindet und somit eine blaue Kernfärbung hervorruft. Bei Eosin
handelt es sich um einen negativ geladenen Farbstoff, der an positiv geladenen
Gewebebestandteilen bindet und diese in unterschiedlichen Rottönen färbt (OTT
2011). Eine Übersicht der anfärbbaren Gewebestrukturen mittels HE-Färbung bietet
Tabelle 6.
Tabelle 6: Färbung der verschiedenen Strukturen mit Hämalaun-Eosin Gewebestruktur Färbung
Kerne Blau (Hämalaun)
Zytoplasma Rosa - Rot (Eosin)
Bindegewebe Rosa (Eosin)
Knochen Rosa – Rot (Eosin)
Bakterien (basophil) Blau (Hämalaun)
III. Material und Methoden 32
Für die HE-Färbung wurde ein Standard-Protokoll verwendet, das in Tabelle 7
aufgeführt ist.
Tabelle 7: Protokoll für die HE-Färbung Reagenz Zeit
100% Ethanol 5 min
96% Ethanol 2 min
70% Ethanol 2 min
Aqua dest. 2 min
Hämalaun (Merck, Darmstadt) 15 min
Warmes Leitungswasser Kurz spülen
0,3% Salzsäure (in 70% Ethanol) 10 sec
Fließendes Leitungswasser (warm) 10 min
Aqua dest. 2 x dippen
96% Ethanol 15 sec
Eosin (AppliChem, Darmstadt) 15 sec
96% Ethanol 2 x dippen
96% Ethanol 2 min
100% Ethanol 2 x 2 min
Roti-Histol + 100% Ethanol 5 min
Roti-Histol (Carl Roth, Karlsruhe) 2 x 5 min
Danach wurden die Schnitte eingedeckt (Menzel-Gläser 24 x 60 mm, Menzel,
Braunschweig; Vitro-Clud®, Langenbrinck, Emmendingen) und unter einem
Lichtmikroskop beurteilt.
3.2.3. Histologische Beurteilung der Knochenschnitt e
Die Beurteilung der gefärbten Knochenschnitte erfolgte mit einem Lichtmikroskop
(AXIO, Zeiss, Peine). Hierfür wurde ein Scoring-System zur Beurteilung der
Entzündungszellen im Gewebe, des Knochenumbaus, der Fremdkörper-Reaktion
und der Fibrose entwickelt und angewendet. Die Bewertung der Entzündung, des
Knochenumbaus durch Osteoklasten und der Fremdkörper-Riesenzellen erfolgte
quantitativ mittels Zellzählung (siehe Tabelle 8 bis 11).
III. Material und Methoden 33
Als Entzündungszellen wurden vor allem neutrophile Granulozyten und Lymphozyten
in dem den Knochen umgebenden Weichgewebe gefunden. Es wurden jeweils drei
Gesichtsfelder in der 40fachen Vergrößerung ausgezählt und davon der Mittelwert
gebildet. Die Scorewerte gingen von null bis fünf, wobei null für keine vorhandenen
Entzündungszellen stand und ein Wert von fünf über 320 Entzündungszellen pro
Gesichtsfeld entsprach. Die Werte von eins bis vier wurden gleichmäßig dazwischen
verteilt (Tabelle 8).
Tabelle 8: Histologischer Score zur Beurteilung der Entzündungszellen im Gewebe (Neutrophile Granulozyten, Lymphozyten, Makrophagen), Beurteilung der Gesichtsfelder in der 40er Vergrößerung
Score 0 Score 1 Score 2
In allen histologischen
Schnitten waren
Entzündungszellen zu finden,
daher gibt es keine Abbildung
zu Score 0.
Keine Entzündungszellen Geringgradig,
< 80 Entzündungszellen pro Gesichtsfeld
Mittelgradig, 80 - 159 Entzündungszellen
pro Gesichtsfeld
Score 3 Score 4 Score 5
Hochgradig, 160 - 239
Entzündungszellen pro Gesichtsfeld
Höchstgradig, 240 - 320
Entzündungszellen pro Gesichtsfeld
Deutliche Abszessbildung, > 320 Entzündungszellen
pro Gesichtsfeld
III. Material und Methoden 34
Der Knochenumbau wurde anhand der Anzahl der Osteoklasten im gesamten
histologischen Schnitt beurteilt. Diese wurden in der 20fachen Vergrößerung gezählt,
wobei der Score zwischen null und drei lag (Tabelle 9).
Tabelle 9: Histologischer Score zur Beurteilung des Knochenumbaus durch Osteoklasten. Die Osteoklasten sind in den Abbildungen mit Pfeilen markiert. Bewertungsgrundlage hierfür war der gesamte Schnitt.
Score 0 Score 1
Keine Osteoklasten Geringgradig, 1 - 9 Osteoklasten im gesamten Bereich der Entzündung
Score 2 Score 3
Mittelgradig, 10 - 20 Osteoklasten im gesamten Bereich der Entzündung
Hochgradig, > 20 Osteoklasten im gesamten Bereich der Entzündung
III. Material und Methoden 35
Die Fremdkörper-Reaktion wurde mit einem Score zwischen null und zwei bewertet,
wobei, wie bei den Osteoklasten, alle Fremdkörper-Riesenzellen im gesamten
histologischen Schnitt gezählt wurden (Tabelle 10).
Tabelle 10: Histologischer Score zur Beurteilung der Fremdkörper-Reaktion anhand der Anzahl der vorhandenen Fremdkörper-Riesenzellen. Die Fremdkörper-Riesenzellen sind in den Abbildungen mit Pfeilen markiert. Bewertungsgrundlage hierfür war der gesamte Schnitt.
Score 0 Score 1 Score 2
Keine Fremdkörper-Riesenzellen vorhanden
Geringgradig, 1-12 Fremdkörper-Riesenzellen im gesamten Bereich der
Entzündung
Hochgradig, > 12 Fremdkörper-Riesenzellen im gesamten Bereich der
Entzündung
Die Beurteilung der Fibrose erfolgte in der 10fachen Vergrößerung semiquantitativ
mittels Einteilung in vier Grade, somit wurden Scorewerte zwischen null und drei
vergeben (Tabelle 11).
Tabelle 11: Histologischer Score zur Beurteilung der Fibrose Score 0 Score 1
Keine Fibrose erkennbar Geringgradige Fibrose erkennbar
III. Material und Methoden 36
Score 2 Score 3
0
Mittelgradige Fibrose erkennbar Hochgradige Fibrose erkennbar
4. Statistik
Die statistische Auswertung wurde mit dem Programm SigmaStat (Version 3.5,
Systat Software, Erkrath) durchgeführt. Ein Signifikanzniveau von p < 0,05 wurde bei
allen statistischen Tests als signifikant angesehen. Alle Daten sind als Mittelwerte ±
Standardfehler (S.E.M.; standard error of mean) angegeben.
Die Ergebnisse der CLSM-Untersuchung und der histologischen Untersuchung
wurden zunächst mit einer dreifaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit den
Faktoren Standzeit nach der Operation, Bakterienbesiedlung, also dem Einbringen
von S. aureus oder PBS und Immunstatus, also der Behandlung mit CSA,
ausgwertet. Im Anschluss erfolgte bei einem Wert p < 0.05 der paarweise Vergleich
mit einem post hoc Tukey-Test.
IV Ergebnisse 37
IV. ERGEBNISSE
Pro Gruppe wurden jeweils sieben Tiere operiert und untersucht (siehe Tabelle 12).
Da 5 Tiere nach der Einleitung der Narkose starben, wurden für die Auswertung von
84 Tieren insgesamt 89 operiert. Alle operierten Tiere nahmen während der
Versuchszeit an Gewicht zu unabhängig davon, ob die Implantate mit S. aureus
besiedelt waren. Zehn Tiere zeigten einen Tag nach der Operation ein geringgradig
reduziertes Allgemeinbefinden (Score 2-3), so dass diese Tiere noch einmalig mit
Metamizol (200 mg/kg KGW, oral) behandelt wurden. Bei der täglichen klinischen
Kontrolle der Tiere war während der gesamten Versuchszeit bei keinem Tier ein
stark eingeschränktes Allgemeinbefinden erkennbar. Die stichprobenartige
Blutuntersuchung auf einen ausreichenden CSA-Spiegel zeigte bei allen
untersuchten Tieren Werte im therapeutischen Bereich über 200 ng/ml.
Ein immunkompetentes Tier, bei dem die Implantate mit S. aureus besiedelt wurden,
hatte nach 21 Tagen Standzeit beide Schrauben abgestoßen, daher wurden in dieser
Gruppe nur die Schrauben von sechs Tieren am CLSM untersucht.
Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Tiere
Behandlung Immunstatus Standzeit Tierzahl CLSM/
Histologie 2 Tage 7 / 7
10 Tage 7 / 7 Naiv 21 Tage 7 / 7 2 Tage 7 / 7
10 Tage 7 / 7
PBS, 5 µl Immunsupprimiert
(CSA) 21 Tage 7 / 7 2 Tage 7 / 7
10 Tage 7 / 7 Naiv 21 Tage 6 / 7 2 Tage 7 / 7
10 Tage 7 / 7
Staphylococcus aureus,
5 x 107 KBE in 5 µl Immunsupprimiert (CSA)
21 Tage 7 / 7
IV Ergebnisse 38
Bei der dreifaktoriellen ANOVA zeigte sich bei keinem der ausgewerteten Parameter
ein Einfluss der CSA-Behandlung auf die Ergebnisse. Dies zeigte sich für bei allen
histologischen Parametern für den Faktor Immunstatus alleine (F1,83: 0,06 - 2,02;
p: 0,16 - 0,81), für die Interaktion zwischen dem Immunstatus und der Standzeit
(F1,83: 0,38 - 2,32; p: 0,11 - 0,69), für die Interaktion zwischen dem Immunstatus und
der Bakterienbesiedlung (F1,83: 0,06 - 3,6; p: 0,06 - 0,81) und für die Interaktion
zwischen allen drei Faktoren (F1,83: 0,45 - 2,86; p: 0,06 - 0,64).
Für die statistische Auswertung wurden daher CSA-behandelte Tiere mit den
unbehandelten Tieren in einer Gruppe zusammengefasst. Die endgültige
Auswertung erfolgte mit einer zweifaktoriellen ANOVA mit den Faktoren
Bakterienbesiedelung und Standzeit und dem entsprechenden post hoc Tukey’s
Test. Graphisch werden allerdings zur Veranschaulichung sowohl die CSA-
behandelte als auch die unbehandelten Gruppen gezeigt.
1. Biofilmbildung an den Implantaten
Die CLSM-Untersuchung zeigte auf den mit S.aureus besiedelten Schrauben ein
Bakterienwachstum, während auf keiner der Schrauben der Kontrolltiere Bakterien
nachgewiesen wurden. Zwei Tage nach der Operation war der Score deutlich größer
als an Tag zehn, blieb aber danach unverändert.
Die statistische Analyse der Biofilmbildung zeigte einen signifikanten Effekt für den
Faktor Bakterienbesiedlung (F1, 82 = 167; p < 0,001), für den Faktor Standzeit
(F2, 82 = 19,4; p < 0,001) und für die Interaktion zwischen beiden Faktoren
(F2, 82 = 19,4; p < 0,001). Die post hoc Analyse zeigte, dass an jedem Tag auf den
besiedelten Schrauben mehr Bakterienwachstum nachweisbar war, als auf den
Schrauben der Kontrolltiere (alle p < 0,001). Zudem zeigte sich, dass an Tag zwei
nach der Operation ein deutlich höherer Score erkennbar war als an den Tagen zehn
und 21 (beide p < 0,001). Der Vergleich zwischen den Tagen zehn und 21 zeigte
eine konstante Kolonisierung (p = 0,62; siehe Abbildung 2).
IV Ergebnisse 39
Die qualitative Auswertung der lebenden und toten Bakterien zeigte, dass sich über
den gesamten Versuchszeitraum das Verhältnis von mindestens zwei Drittel
lebenden zu maximal einem Drittel toter Keime nicht verändert hat.
Eine Auswertung mittels CLSM sichert nicht vollständig, ob es sich um eine
Biofilmbildung oder eine Anhäufung planktonischer Bakterien handelt. In der
histologischen Auswertung konnten Bakterienkolonien gefunden werden, die die
Interpretation der gefundenen Bakterien als einen Biofilm unterstützen. Abbildung 3
zeigt eine Bakterienkolonie mit kokkenförmigen Keimen, die in einer extrazellulären
Matrix eingebettet ist (Pfeil) und von neutrophilen Granulozyten umgeben ist. Dies
ist ein eindeutiger Hinweis auf eine adäquate Biofilmbildung durch S. aureus.
Abbildung 2: Die CLSM-Aufnahmen zeigen ein typisches Bakterienwachstum nach zwei Tagen mit einer großen Bakterienformation (a; Score 5), nach zehn Tagen mit einer Mikrokolonie (b; Pfeil, Score 2) und eine abgegrenzte Mikrokolonie (Pfeil) und verteilten Bakterien (Dreiecke) an Tag 21 (c; Score 2-3). d: Das Balkendiagramm zeigt das Bakterienwachstum als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammengefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. der Scorewerte. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).
IV Ergebnisse 40
2. Histologische Auswertung der Schädelkalotten
Im vorliegenden Experiment wurde die Entzündungsreaktion am Knochen und dem
Weichgewebe mit Hilfe eines histologischen Scores beurteilt. Hierbei wurden das
Vorkommen von Entzündungszellen, der Knochenumbau durch Osteoklasten, die
Fremdkörper-Reaktion anhand von Fremdkörper-Riesenzellen und die Ausbildung
einer Fibrose beurteilt.
Entzündungszellen
Die Anzahl der Entzündungszellen (vor allem neutrophile Granulozyten und
Lymphozyten) war zu jedem Zeitpunkt bei den Tieren mit S. aureus besiedelten
Implantaten deutlich höher als bei den Kontrolltieren. Sowohl bei den infizierten
Tieren als auch bei den Kontrolltieren änderten sich die Scorewerte im Verlauf des
Versuches nicht.
Die statistische Auswertung zeigte für den Faktor Bakterienbesiedlung einen
signifikanten Effekt (F1, 83 = 674; p < 0,001), jedoch keinen Effekt für die Standzeit
(F2, 83 = 0,79; p = 0,46) und die Interaktion zwischen den Faktoren (F2, 83 = 0,26;
p = 0,77). Der post hoc Test zeigte, dass zu jedem Zeitpunkt eine deutlich höhere
Anzahl an Entzündungszellen bei den infizierten Tieren zu finden war als bei den
entsprechenden Tieren der Kontrollgruppen (alle p < 0,001). Im Vergleich der
Standzeiten ergaben sich über den gesamten Versuchszeitraum innerhalb der
Abbildung 3: Bakterienkolonie mit kokkenförmigen Keimen, umgeben von extrazellulärer Matrix (Pfeil). Dies ist ein eindeutiger Hinweis auf eine Biofilmbildung durch S. aureus. Die Matrix wird von neutrophilen Granulozyten umgeben.
IV Ergebnisse 41
infizierten Tiere und der Kontrolltiere keine Unterschiede (alle p ≥ 0,575; siehe
Abbildung 4).
Knochenumbau
Bei der Bewertung des Knochenumbaus durch Osteoklasten wurde erst an Tag zehn
nach der Operation bei den infizierten Tieren eine stärkere Reaktion als bei den
Kontrolltieren deutlich, diese nimmt bis zu Tag 21 wieder ab.
Die statistische Auswertung zeigte einen signifikanten Effekt für die Faktoren
Bakterienbesiedlung und Standzeit, sowie für deren Interaktion (alle F-Werte > 12,5,
alle p-Werte < 0,001). Die post hoc Analyse zeigte, dass an Tag zwei nach der
Abbildung 4: Die histologischen Aufnahmen zeigen die Entzündungs-zellinfiltration im Gewebe nach zehn Tagen Standzeit bei einem Kontrolltier (a; Score 1) und einem infizierten Tier (b; Score 5). c: Das Balkendiagramm zeigt die Anzahl der Entzündungszellen als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammengefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. der Scorewerte. Signifikante Unterschiede zu den jeweiligen Kontrollgruppen sind mit einem Stern gekennzeichnet (*; ANOVA mit post hoc Tukey Test, p < 0,05).
IV Ergebnisse 42
Operation kein signifikanter Unterschied zwischen den infizierten Tieren und der
Kontrollgruppe nachweisbar war (p = 0,12). Nach zehn und 21 Tagen war die Anzahl
an Osteoklasten bei den infizierten Tieren deutlich höher als bei den entsprechenden
Tieren der Kontrollgruppen (beide p < 0,001). Bei den infizierten Tieren nimmt die
Osteoklastenanzahl von Tag zwei zu Tag zehn (p < 0,001) und zu Tag 21 (p < 0,001)
signifikant zu. Im Vergleich zu Tag zehn ist die Anzahl der Osteoklasten an Tag 21
jedoch geringer (p = 0,002). Bei den Kontrolltieren ist der Knochenumbau zu allen
Zeiten gleich (alle p ≥ 0,07; siehe Abbildung 5).
Abbildung 5: Die histologischen Aufnahmen zeigen die typische Knochenreaktion eines Kontrolltieres nach zehn Tagen mit einem einzelnen Osteoklasten (a; Pfeil, Score 1) und eines infizierten Tieres mit einer größeren Ansammlung von Osteoklasten (b; Score 3). c: Das Balkendiagramm zeigt den Knochenumbau als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammen-gefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden gekennzeichnet mit einem Stern (*). Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#), zu Tag zehn mit einem Kreis (o; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).
IV Ergebnisse 43
Fremdkörper-Reaktion
Zu allen Analysezeitpunkten war bei den Tieren mit infizierten Implantaten eine
stärkere Fremdkörper-Reaktion zu beobachten als bei den Kontrolltieren. Bei den
infizierten Tieren zeigte sich eine Vermehrung der Fremdkörper-Riesenzellen von
Tag zwei zu Tag zehn, danach blieben sie nahezu konstant. Bei den Kontrolltieren ist
nur von Tag zwei zu Tag 21 ein erkennbarer Anstieg der Zellzahl vorhanden.
Bei der statistischen Auswertung ergab sich ein signifikanter Effekt für den Faktor
Bakterienbesiedlung (F1, 83 = 111; p < 0,001), für den Faktor Standzeit (F2, 83 = 13,8;
p < 0,001) und ebenso für die Interaktion zwischen beiden Faktoren (F2, 83 = 3,14;
p = 0,05). Die post hoc Auswertung ergab, dass zu allen drei analysierten
Zeitpunkten eine deutlich stärkere Fremdkörper-Reaktion bei den infizierten Tieren
nachweisbar war als bei den Kontrolltieren (alle p < 0,001). Bei den infizierten Tieren
zeigte sich darüber hinaus eine starke Erhöhung der Zellzahl von Tag zwei zu Tag
zehn (p < 0,001), von Tag zehn zu Tag 21 blieb die Fremdkörper-Reaktion dann
konstant (p = 0,21). Dagegen nahm die Anzahl der Zellen bei den Kontrolltieren nur
im Vergleich zwischen Tag zwei und Tag 21 zu (p = 0,03; siehe Abbildung 6).
IV Ergebnisse 44
Fibrose
Die Fibrose hing hauptsächlich von der Standzeit der Tiere ab. Bei den mit
S. aureus infizierten Tieren gab es einen kontinuierlichen Anstieg der Fibrose über
alle drei Analysezeitpunkte hinweg. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die
infizierten Tiere jedoch nur an Tag 21 eine signifikant stärker ausgeprägte Fibrose.
Die Kontrolltiere wiesen nur eine Vermehrung von Tag zwei zu Tag zehn auf, danach
blieb die Fibrose unverändert.
Abbildung 6: Die histologischen Aufnahmen zeigen die Fremdkörper-Reaktion nach zehn Tagen Standzeit bei einem Kontrolltier mit wenigen Fremdkörper-Riesenzellen mit maximal drei Kernen (a; Pfeile, Score 1) und bei einem infizierten Tier mit einer deutlich größere Ansammlung von Fremdkörper-Riesenzellen mit bis zu sechs Kernen (b; Pfeile, Score 2). c: Das Balkendiagramm zeigt die Fremdkörper-Reaktion als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammen-gefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden gekennzeichnet mit einem Stern (*). Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).
IV Ergebnisse 45
Die statistische Analyse zeigte signifikante Effekte für die Faktoren
Bakterienbesiedlung, Standzeit und die Interaktion zwischen beiden Faktoren (alle F-
Werte > 3,92, alle p-Werte < 0,04). Die post hoc Analyse zeigte nur an Tag 21 bei
den infizierten Tieren eine stärkere Fibrose als bei den Kontrolltieren (p = 0,001).
Dagegen zeigte sich bei den Kontrolltieren ein Anstieg des Scores von Tag zwei zu
Tag zehn, anschließend blieb die Fibrose konstant. Bei den infizierten Tieren zeigte
sich ein stetiger Anstieg von Tag zwei, über Tag zehn bis zu Tag 21 (alle p < 0,001;
siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Die histologischen Aufnahmen zeigen die Fibrose eines infizierten Tieres an Tag zwei (a; Score 1) und an Tag 21 (b; Score 2-3). c: Das Balkendiagramm zeigt die Fibrose als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immun-supprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammen-gefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden gekennzeichnet mit einem Stern (*). Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#), und zu Tag zehn mit einem Kreis (o; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).
V Diskussion 46
V. DISKUSSION
Die Ergebnisse unserer Versuche zeigen, dass man bei der Ratte durch die
intraoperative Besiedlung von Titan-Implantaten mit einem rattenpathogenen
S. aureus Stamm zuverlässig eine Biofilmbildung mit begleitender
Entzündungsreaktion hervorrufen kann. Die Behandlung mit CSA hatte keinen
Einfluss auf die untersuchten Parameter.
1. Biofilmbildung
Im vorliegenden Modell wurde nach der intraoperativen Infektion der Implantate
zuverlässig zu jedem Analysezeitpunkt eine Biofilmbildung mittels CLSM auf den
Titan-Implantaten nachgewiesen. Trotz des hohen Scorewertes an Tag zwei sehen
wir die Tage zehn und 21 zur Untersuchung einer chronischen Infektion mit einer
Biofilmbildung am Implantat als geeignet an. Tag zwei wird von uns nicht als der
beste Zeitpunkt zur Bewertung des Bakterienvorkommens auf dem Implantat
bewertet, da diese große Menge an Bakterien wahrscheinlich hauptsächlich auf das
kurze Zeitintervall zwischen der intraoperativen Besiedlung und der Untersuchung
der Implantate zurückzuführen ist. Ein ähnliches Ergebnis zeigte die Studie von ARAD
ET AL. (2013), die bei intraoperativ mit Methicillin-resistentem S. aureus besiedelten
Brustimplantaten bei Ratten nach vier Tagen Standzeit etwa zehnmal mehr Bakterien
nachweisen konnten als nach elf Tagen.
Die Auswertung an den Tagen zehn und 21 zeigten dann ebenfalls, dass sich diese
an Tag zwei gefundenen sehr großen Bakterienformationen nicht langfristig als
maturer Biofilm am Implantat etablieren konnten. Dies könnte ein Hinweis darauf
sein, dass es sich an Tag zwei noch nicht um einen maturen Biofilm handelte,
sondern sich die Bakterien gerade in der Phase der Anheftung und beginnenden
Reifung befinden, jedoch dauerhaft nicht resistent gegen das Immunsystem sind. In
vitro Versuche haben gezeigt, dass nach 18 bis 48 Stunden ein ausgereifter Biofilm
von S. aureus nachweisbar sein kann (AKIYAMA ET AL. 1993; COELHO ET AL. 2008;
V Diskussion 47
WAGNER ET AL. 2011). Wir würden jedoch nach unseren Untersuchungen davon
ausgehen, dass nach dieser kurzen Zeit noch keine robuste Biofilmbildung in vivo
erreicht wurde, die über einen längeren Zeitraum stabil, reproduzierbar, und somit
repräsentativ, wäre. Diese Vermutung wird unter anderem von THURLOW ET AL. (2011)
unterstützt, die zeigten, dass ein Biofilm in vitro schneller ausreift als in vivo, wo das
Immunsystem und gleichzeitig nicht optimale Nährstoffbedingungen einen negativen
Einfluss auf das Bakterienwachstum haben. Da sich die Ergebnisse an den Tagen
zehn und 21 im Bereich der Biofilmbildung nicht unterscheiden, kann man davon
ausgehen, dass die nachgewiesenen Bakterien zu diesen Zeitpunkten robust genug
gegenüber der Immunantwort der Tiere und fest am Titanimplantat angeheftet sind
(WAGNER ET AL. 2011). Somit sehen wir diese beiden Zeitpunkte zur Untersuchung
einer chronischen Infektion mit einer Biofilmbildung am Implantat als geeignet an.
Es gibt Studien, bei denen präoperativ die Implantate in einer Bakterienlösung
zwischen 20 Minuten und bis zu drei Tagen inkubiert wurden, sodass sich die Keime
zum Zeitpunkt der Implantation bereits am Implantat angeheftet oder sogar schon
einen maturen Biofilm gebildet hatten (ARAD ET AL. 2013; FREIRE 2011; INZANA ET AL.
2015; LI ET AL. 2008; SNOWDEN ET AL. 2012). Dieses Vorgehen ist nicht mit einer
klinischen Situation zu vergleichen, da dort intraoperativ sterile Implantate verwendet
werden. Die von uns verwendete Methode mit der intraoperativen Besiedlung ist
hingegen relativ nah an einer klinischen Situation, bei der es zu einer intraoperativen
Kontamination mit ubiquitär vorkommenden Bakterien kommen kann (PORTILLO ET AL.
2013; VAN WIJNGAERDEN ET AL. 1999).
Zum Nachweis von Bakterien wurden in bisherigen Arbeiten oft eine PCR oder die
Anzüchtung der Bakterien mit Hilfe passender Nährmedien gewählt. Beide Methoden
ermöglichen keine Unterscheidung zwischen planktonischen Bakterien und einem
Biofilm. Ebenfalls ist eine Quantifizierung der Bakterien nicht zuverlässig ohne
großen Aufwand möglich, ebenso wie eine Unterscheidung von lebenden und toten
Bakterien (HANNIG ET AL. 2010; KERSTENS ET AL. 2015; TAVERNIER UND COENYE 2015).
Mit der CLSM-Untersuchung, wie wir sie durchgeführt haben, ist ebenfalls nicht
sicher unterscheidbar, ob es sich um Keime handelt, die in einem Biofilm organisiert
sind oder planktonisch vorkommen. Durch das Spülen der Proben mit PBS vor der
V Diskussion 48
Färbung ist jedoch von einer weitgehenden Entfernung planktonischer Bakterien
auszugehen (BÜRGERS ET AL. 2010; FURUSTRAND TAFIN ET AL. 2015; HARRISON ET AL.
2006; KERSTENS ET AL. 2015; SMITH ET AL. 2008). Zusätzlich kann man aufgrund der
histologischen Bilder von Bakterienkolonien mit umgebender extrazellulärer Matrix
davon ausgehen, dass eine adäquate Biofilmbildung stattgefunden hat (ALT ET AL.
2011). Gleichzeitig ist durch das verwendete Score-System eine einfache
Semiquantifizierung möglich, die alle Kolonien erfasst, die sich auf der
Implantatoberfläche fest angeheftet haben.
Eine Optimierungsmöglichkeit des Modells wäre eine Kristall-Violett-Färbung der
Schrauben. Durch diese Methode wird hauptsächlich die extrazelluläre Matrix eines
Biofilmes angefärbt, unter anderem durch die Bindung an Polysaccharide, wodurch
sichergestellt wird, dass es sich tatsächlich um einen Biofilm und nicht um eine
Anhäufung planktonischer Bakterien handelt (KERSTENS ET AL. 2015; SMITH ET AL.
2008). Gleichzeitig wäre eine genaue Quantifizierung möglich, indem man nach der
Färbung mit Hilfe eines ELISAs oder eines Photometers die Menge des absorbierten
Farbstoffes misst (HANNIG ET AL. 2010; KERSTENS ET AL. 2015). Es ist jedoch nicht klar,
welchen Einfluss eine Kontamination mit Blut oder Geweberesten auf diese Methode
hätte, da darin ebenfalls unterschiedliche Polysaccharide enthalten sind. Um also
eine Kristall-Violett-Färbung in einem solchen in vivo Modell erfolgreich anwenden zu
können, müsste diese Frage erst eindeutig geklärt werden.
Ein Vorteil unseres Modells im Bereich der Beurteilung der Biofilmbildung ist die
Lebend-Tot-Färbung, wodurch der vorhandene Biofilm im CLSM nicht nur gut
sichtbar gemacht wurde, sondern zusätzlich erkennbar ist, ob es sich um lebende
oder bereits abgestorbene Bakterien handelte. Eine Auswertung dieses Parameters
ist jedoch sehr schwierig, da aufgrund der komplexen Oberfläche der Schraube,
welche von allen Seiten genau gescannt werden müsste, keine objektive quantitative
Auswertung von lebenden und toten Keimen möglich ist. Dieser Aspekt wurde somit
nur während der semiquantitativen Bewertung des vorhandenen Biofilms optisch
beurteilt. Über den gesamten Versuchszeitraum hat sich das Verhältnis von
mindestens zwei Drittel lebenden zu maximal einem Drittel toter Keime nicht
verändert.
V Diskussion 49
Bei der Charakterisierung unseres Tiermodells war eine Quantifizierung der
vorkommenden Biofilme wichtig um bei der nachfolgenden Nutzung einen
Vergleichswert zu haben. Diese haben wir semiquantitativ mittels einer Score-
Bewertung durchgeführt. Im Gegensatz dazu stehen Modellen, bei denen keinerlei
Quantifizierung der Bakterien vorgenommen wurde (ALT ET AL. 2011). Die Nutzung
eines Scores ist zwar einfach und hilfreich um Richtwerte zu erarbeiten, bietet jedoch
keine genaue quantitative Bestimmung der vorhandenen Bakterien oder der
Biofilmmasse. In diesem Bereich wäre unser Modell zu optimieren. In diesem
Zusammenhang ist die Quantifizierung mit Hilfe der Anzüchtung der Bakterien und
Zählen der KBE jedoch ebenfalls kein zuverlässiges Instrument wie bereits
beschrieben wurde. Ein Hilfsmittel in diesem Zusammenhang wäre zum Beispiel eine
qPCR, welche eine sehr genaue Quantifizierung vorhandener Bakterien
beziehungsweise eines Biofilmes erlaubt (AMMANN ET AL. 2013). Um eine wirklich
genaue Quantifizierung zu gewährleisten muss jedoch sichergestellt sein, dass alle
vorhandenen Bakterien vom Implantat abgelöst worden sind, was zum Beispiel mit
Hilfe von Ultraschall möglich wäre (FERREIRA ET AL. 2012; KERSTENS ET AL. 2015).
Derart abgelöste Keime könnten anstatt mit einer qPCR ebenso mit Hilfe einer
Durchflusszytometrie quantifiziert werden (ALMEIDA ET AL. 2011; ARAD ET AL. 2013;
KERSTENS ET AL. 2015; TAVERNIER UND COENYE 2015). Eine qPCR wäre jedoch
deutlich aufwendiger als unsere gewählte Methode und man hätte nicht den
optischen Eindruck von hauptsächlich lebenden Keimen bei der Auswertung
erhalten.
Wir konnten bereits an Tag zehn einen stabilen Biofilm nachweisen, der sich bis
Tag 21 nicht veränderte. Dies ist ein Vorteil des entwickelten Modells, da es sich um
eine relativ kurze Standzeit handelt, die trotzdem robuste Ergebnisse liefert. Neben
bereits erwähnten sehr langen Standzeiten von vier bis zu zwölf Wochen mit den
dazugehörigen Nachteilen gibt es auch Modelle mit sehr kurzen Standzeiten, von
drei bis vier Tagen (HAENLE ET AL. 2013; LUCKE ET AL. 2003; VERMA ET AL. 2010; VAN
WIJNGAERDEN ET AL. 1999). Nach unseren Untersuchungen unterstellen wir jedoch,
dass nach dieser kurzen Zeit noch keine robuste Biofilmbildung in vivo erreicht
wurde, was ebenfalls von anderen Studien unterstützt wird (THURLOW ET AL. 2011).
V Diskussion 50
Aus diesem Grund ist eine Standzeit von zehn bis maximal 21 Tagen ein großer
Fortschritt. Im Vergleich zu den langen Standzeiten werden die Belastung der Tiere
und der finanzielle Aufwand deutlich verringert und die Praktikabilität für die
Experimentatoren erhöht. Im Gegensatz zu den sehr kurzen Standzeiten, ist hier ein
robustes Ergebnis erkennbar, das tatsächlich mit einer Implantatinfektion mit
Biofilmbildung bei Menschen oder bei Tieren vergleichbar ist.
Eine genauere Quantifizierung der Bakterien wäre sicherlich eine Bereicherung für
das Modell. Es gibt bisher jedoch keine zuverlässigen Quantifizierungsmöglichkeiten
für komplexe Implantate, die aus dem lebenden Organismus entnommen wurden,
insbesondere da anhaftende Gewebe einige Auswertungsansätze in einem noch
nicht erfassbaren Maße verfälschen. Insgesamt betrachten wir daher die von uns
gewählte semiquantitiative Beurteilung der Biofilmbildung durch die CLSM-
Untersuchung als einen sinnvollen Kompromiss zu einem sehr arbeits- und apparativ
aufwendigen Quantifizierungsversuch. Für die Zukunft sollte allerding die
Entwicklung von quantitativen Methoden zum Nachweis des Biofilms weiter
vorangetrieben werden. Hierzu ist zum Beispiel auch der Verbund vom Implantat und
umgebenden Gewebe ex-vivo, oder der direkte Nachweis in vivo anzustreben.
2. Entzündungsreaktion
Bei dem entwickelten Modell wurde eine ausführliche histologische Untersuchung
des Knochens und des Weichgewebes durchgeführt, da bei einer Infektion ebenfalls
das umliegende Gewebe Entzündungsanzeichen aufweist, und nicht nur der
Knochen selbst (MCCREA 2014; OFLUOGLU ET AL. 2007). Im Gegensatz dazu haben
zum Beispiel LUCKE ET AL. (2003) nur den Knochen mit dem Knochenmark, jedoch
nicht das angrenzende Weichgewebe histologisch untersucht. Des Weiteren gibt es
mehrere Modelle, bei denen keinerlei histologische Auswertung durchgeführt wurde,
sondern ausschließlich das Vorkommen von Bakterien ermittelt wurde (CHEN ET AL.
2005; HAENLE ET AL. 2013).
V Diskussion 51
Es gibt bereits Veröffentlichungen, die wie bei unserem Modell die Infiltration des
Gewebes durch Leukozyten als das Maß für die Entzündungsreaktion verwendeten
(ERICSSON ET AL. 1995; ZIJLSTRA ET AL. 2009). Bei unseren Untersuchungen konnte zu
jedem Analysezeitpunkt bei den infizierten Tieren eine ausgeprägte
Entzündungsreaktion der Schädeldecke und des umgebenden Gewebes dargestellt
werden. Die Anzahl der Entzündungszellen, hauptsächlich neutrophile Granulozyten
und auch Lymphozyten, war bei den infizierten Tieren zu allen Analysezeitpunkten
identisch. Man kann also davon ausgehen, dass die Infektion dauerhaft zu einer
starken Infiltration des Gewebes mit Entzündungszellen führt, unabhängig von der
vorhandenen Bakterienanzahl, die an den Tagen zehn und 21 deutlich geringer war
als an Tag zwei. Ähnliche Ergebnisse zeigten SNOWDEN ET AL. (2012), die ein Maus-
Modell mit ventrikulären Kathetern entwickelten, die mit S. aureus infiziert waren. In
dieser Arbeit wurden Zellzählungen mit Hilfe von Fluoreszenz aktiviertem Cell Sorting
(FACS) im umgebenden Gewebe durchführten, wobei hauptsächlich neutrophile
Granulozyten und Makrophagen erfasst wurden. Vor allem die Anzahl der
neutrophilen Granulozyten war über einen Zeitraum von drei Wochen nahezu
konstant.
Diese dauerhaft stark ausgeprägte Infiltration des Gewebes durch
Entzündungszellen wird hauptsächlich durch den vorhandenen Biofilm verursacht.
Die Kontrolltiere wiesen ebenfalls Entzündungszellen auf, jedoch deutlich weniger als
die Tiere mit besiedelten Implantaten. Neutrophile Granulozyten sind die wichtigsten
Zellen in der Abwehr bakterieller Infektionen, wobei sie sehr gut in der Lage sind,
planktonische Bakterien durch Phagozytose zu eliminieren (FRANK 1980; HANKE UND
KIELIAN 2012; SILVA 2011). Biofilme sind hingegen deutlich resistenter und können
sich der Phagozytose weitgehend entziehen (JESAITIS ET AL. 2003). Dies ist für uns
ein weiteres Indiz, dass im vorliegenden Modell eine Biofilmbildung stattgefunden
hat. Wenn es sich ausschließlich um planktonische Keime gehandelt hätte, hätte in
der Zeit zwischen Tag zehn und Tag 21 die Bakterienanzahl durch Phagozytose
wahrscheinlich abgenommen. Somit wären wahrscheinlich ebenfalls an Tag 21
weniger Entzündungszellen zu finden gewesen als an den vorangegangenen
Analysezeitpunkten. So lange der Biofilm vorhanden ist und nicht durch eine
V Diskussion 52
umgebende Fibrose oder ähnliches eingekapselt und somit vom Immunsystem
weitestgehend abgeschottet ist, bleibt der Reiz, der zu einer permanenten Anlockung
der Entzündungszellen führt, bestehen (COSTERTON UND VEEH 2003). Gegebenenfalls
wäre bei einem längeren Versuchszeitraum zu erkennen, dass die Anzahl der
Entzündungszellen mit zunehmender umgebender Fibrose abnimmt.
Das permanent hohe Vorkommen von Entzündungszellen bei den infizierten Tieren
ist gleichzeitig durch das Phänomen der frustrierten Phagozytose zu erklären. Es
sind vor allem Makrophagen, aber auch neutrophile Granulozyten aktiv, um
vorhandenes Fremdmaterial, wie zum Beispiel den Biofilm oder auch das Implantat
zu phagozytieren. Da die Phagozytose jedoch erfolglos bleibt, kommt es zu einer
ausgeprägten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, was zu einer anhaltenden
Infiltration des Gewebes mit Entzündungszellen und zur Bildung von Fremdkörper-
Riesenzellen durch Makrophagen führt (BAINTON ET AL. 1989; BRAXTON ET AL. 2005;
HENSON 1980; LEID ET AL. 2002). Da die Kontrolltiere mit unbehandeltem Implantat
eine deutlich geringer ausgeprägte Infiltration mit Entzündungszellen zeigten, ist
davon auszugehen, dass die anhaltend hohe Zahl an Entzündungszellen im Gewebe
hauptsächlich durch den vorhandenen Biofilm hervorgerufen wurde und nicht durch
das Titan-Implantat.
MAYER (2012) zeigte, dass bei einem Entzündungsgeschehen in Umgebung von
Knochen, die Anzahl der Osteoklasten mit der Dichte des Entzündungszellinfiltrates,
vor allem mit den neutrophilen Granulozyten, korreliert. Dieses Phänomen konnten
wir nicht uneingeschränkt nachvollziehen. Bei unseren Versuchen zeigten die
infizierten Tiere zwar ein deutlich vermehrtes Vorkommen von Osteoklasten als die
Kontrolltiere an den Tagen zehn und 21, jedoch war zu diesen Zeitpunkten immer die
gleiche Anzahl an Entzündungszellen bei den infizierten Tieren nachweisbar.
Anscheinend besteht im vorliegenden Versuch ein Zusammenhang zwischen
vorhandenen Bakterien und Osteoklasten. Eine solche Annahme wird unter anderem
von LI ET AL. (2008) unterstützt, die zeigten, dass es an infizierten Implantaten zu
einem deutlich vermehrten Vorkommen von Osteoklasten mit Sequestrierung des
Knochens kommt, was ein Zeichen einer Osteomyelitis ist (KOCH UND MASCHE 1999;
LEW UND WALDVOGEL 2004). Bei uns war sowohl an Tag zehn, als auch an Tag 21 ein
V Diskussion 53
signifikanter Unterschied zwischen den Kontrolltieren und den besiedelten Tieren im
Bereich des Knochenumbaus nachzuweisen, was zeigt, dass S. aureus den
Knochenumbau nachhaltig beeinflusst. Zusätzlich verändert sich die Anzahl der
Osteoklasten bei den Kontrolltieren nicht im Laufe der Zeit, was auch dafür spricht,
dass vor allem die vorhandenen Bakterien den Knochenumbau anregen.
Untermauert werden diese Ergebnisse durch Studien, die zeigten, dass S. aureus
eine Entzündungsreaktion am Knochen hervorruft und die Aktivität von Osteoklasten
beeinflussen kann (ALEXANDER ET AL. 2003; ELLINGTON ET AL. 1999; WRIGHT UND NAIR
2010). Gleichzeitig mit dem Einfluss von S. aureus fördern die
Entzündungsmediatoren ebenfalls den Knochenumbau und -abbau (BROGGINI ET AL.
2003).
Fremdkörper-Riesenzellen werden häufig bei Versuchen mit Implantaten gefunden,
wobei die Ausprägung der Fremdkörper-Reaktion von verschiedenen Faktoren
abhängig und ihr Vorkommen unter anderem ein Ausdruck der frustrierten
Phagozytose ist (ANDERSON ET AL. 2008; BAINTON ET AL. 1989). So ist sie bei einer
ausschließlichen Implantation von unbehandelten Implantaten aus Metall oder
Keramik deutlich geringer ausgeprägt als bei gleichzeitigem Einbringen von anderem
Fremdmaterial, wie zum Beispiel Bakterien (HOLLSTEIN 2003). Im vorliegenden Modell
ist die Fremdkörper-Reaktion wie erwartet durch die Infektion mit S. aureus stärker
ausgeprägt als beim unbehandelten Titanimplantat, für das bereits eine gute
Biokompatibilität und Osseointegration gezeigt wurde (BÜCHELER ET AL. 2002; NOWAK
2010). HOLLSTEIN (2003) zeigte ebenfalls, dass gleichzeitig mit einer ausgeprägten
Fremdkörper-Reaktion infolge eines Implantates der Knochenumbau durch
Osteoklasten deutlich vermehrt ist. Dieses Phänomen können wir bestätigen, da in
unserem Modell bei den infizierten Tieren zu allen Analysezeitpunkten eine deutlich
stärkere Fremdkörper-Reaktion erkennbar ist und an Tag zehn und Tag 21 ebenfalls
ein ausgeprägter Knochenumbau durch Osteoklasten nachweisbar ist.
Bei der Fibrosebildung konnten wir nur nach 21 Tagen Standzeit bei den infizierten
Tieren eine signifikant stärkere Ausprägung dieses Parameters im Vergleich zu den
Kontrolltieren nachweisen. Dieses Ergebnis passt zu bisherigen Erkenntnissen, dass
eine Biofilm-Infektion im Körper langfristig fibrös eingekapselt wird (HANKE UND
V Diskussion 54
KIELIAN 2012). Der dahinterstehende Mechanismus ist jedoch noch weitgehend
unbekannt. Man geht davon aus, dass das Ziel eine Eindämmung und Abkapselung
der Infektion ist, wenn keine Eliminierung des Biofilmes durch das Immunsystem
möglich ist (HANKE UND KIELIAN 2012; THURLOW ET AL. 2011). Zudem fördern
bestimmte Proteine auf der Oberfläche von S. aureus die Bildung und Anlagerung
von Fibronectin und Kollagen. Somit profitiert gleichzeitig der Biofilm selbst von einer
fibrösen Einkapselung, da diese zu einer weiteren Abschottung von äußeren
Einflüssen wie Immunzellen oder antibakteriellen Substanzen führt (ALEXANDER ET AL.
2003).
Dass an den Tagen zwei und zehn nach der Operation kein Unterschied bei der
Fibrose zwischen den infizierten Tieren und der Kontrollgruppe nachweisbar ist,
jedoch bei beiden Gruppen ein signifikanter Anstieg von Tag zwei zu Tag zehn
stattgefunden hat, ist durch die normale Reaktion des Körpers auf das Einbringen
eines Implantates und auf eine Verletzung von Gewebe erklärbar. Diese Ereignisse
führen immer zu einer vorläufigen Entzündungsreaktion mit dem Ziel der
Regeneration oder Reparation des Gewebes, was mit einer Fibrose und
Narbenbildung verbunden ist (ANDERSON 1993). Dies erklärt ebenfalls, dass es in der
Kontrollgruppe von Tag zehn zu Tag 21 keinen nennenswerten Anstieg der Fibrose
mehr gab, da in diesem Zeitraum das Implantat ohne Infektion eingeheilt sein sollte
und somit keine weitere Narbenbildung mehr stattfindet (FREIRE 2011).
Als eine Ergänzung der histologischen Auswertung wären Hartschnitte oder -schliffe
mit den Implantaten möglich, was eine aufschlussreiche Beurteilung der
Osseointegration zu den unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Implantation
ermöglichen würde (HOLLSTEIN 2003; WENG ET AL. 2008). So könnte genau dargestellt
werden, ob ein guter Kontakt zwischen Knochen und Implantat besteht und wie sich
die periimplantäre Knochenneubildung und die periimplantäre Fibrose entwickeln
(MARTINEZ ET AL. 2014; SCHÄFER 2011). Hierbei wäre zu vermuten, dass nach zehn
Tagen Standzeit die Implantate am wenigsten gut in den umliegenden Knochen
integriert sind, da zu diesem Zeitpunkt der stärkste Knochenumbau durch
Osteoklasten nachgewiesen wurde.
V Diskussion 55
In mehreren Studien wurden während der Standzeit der Tiere röntgenologische oder
computertomographische Untersuchungen des Knochens mit den Implantaten
durchgeführt (CHEN ET AL. 2005; FREIRE 2011; HAENLE ET AL. 2013; LI ET AL. 2008).
Dies ist sinnvoll um den Verlauf der Einheilung in vivo beurteilen und Vergleiche
zwischen den unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Operation am gleichen Tier
anstellen zu können. Im vorliegenden Versuch mit den Implantaten in der
Schädeldecke ist eine solche Art der Beurteilung jedoch nicht so entscheidend wie
bei Implantaten, die einer deutlich höheren mechanischen Belastung ausgesetzt
sind, wie zum Beispiel bei orthopädischen oder oralen Implantaten (EERENBERG ET
AL. 1994; INZANA ET AL. 2015; WINDOLF ET AL. 2013).
Ebenso wären noch weitere Färbungen der histologischen Schnitte möglich, um
einen größeren Informationsgewinn zu erhalten (WILLBOLD UND WITTE 2010). Eine
Masson-Goldner-Trichrom-Färbung wäre zum Beispiel hilfreich um eine gute
Differenzierung des fibrösen Gewebes von den restlichen Zellen zu erreichen.
Ebenso ist durch diese Färbung eine Unterscheidung zwischen mineralisierter und
nicht-mineralisierter Knochenmatrix möglich, was den Knochenumbau sehr präzise
darstellt (NOWAK 2010; OTT 2011; WEBSTER ET AL. 2012). Eine ähnliche Aussage wäre
mit einer Toluidin-Blau-Färbung möglich, die vor allem Osteoblasten und
nicht-kalzifizierte Regionen des Knochens sichtbar macht und eine sehr genaue
Beurteilung der Knochenveränderungen durch die Unterscheidung zwischen altem
stabilem und umgebautem Knochen ermöglichst (SCHÄFER 2011; WILLBOLD UND
WITTE 2010). Eine TRAP-Färbung (Tartratresistente saure Phosphatase) zeigt
eindeutig Osteoklasten an, was ebenfalls die Beurteilung des Knochenumbaus
erweitern könnte (LI ET AL. 2008; SCHÄFER 2011). Mit Hilfe einer von-Kossa-Färbung
könnten man durch die Affinität von Silber-Ionen zu saurem Milieu die calciumreichen
Bereiche eines Knochens gezielt anfärben (WILLBOLD UND WITTE 2010). Ebenso
könnte man über eine Gramfärbung zur Detektierung der Bakterien im Gewebe
nachdenken (SCHMIDMAIER ET AL. 2006). Diese weiteren Färbungen wären jedoch
sehr arbeitsintensiv im Vergleich zu einem relativ geringen größeren
Informationsgewinn, da mit der verwendeten HE-Färbung bereits die wichtigsten
Parameter ausreichend erfasst und beurteilt werden können.
V Diskussion 56
Des Weiteren wäre zur Beurteilung der Entzündungsreaktion eine Bestimmung
unterschiedlicher spezifischer Zytokine möglich (ANDERSON 1993; WRIGHT UND NAIR
2010). Die Beurteilung der Entzündung mit Hilfe von Zytokinen kann zum Beispiel mit
Hilfe des Plasma-Spiegels des Tumor-Nekrose-Faktors-α, Interleukin-1, Interleukin-6
oder Interleukin-17 durchgeführt werden. Diese gelten als entscheidende
Entzündungsmarker, bieten unter anderem einen Nachweis der Ausprägung des
Knochenumbaus im Zuge einer Osteomyelitis und können somit als Indikatoren für
die Biokompatibilität eines Implantates dienen (ROSENGREN ET AL. 1997; SNOWDEN ET
AL. 2012; THURLOW ET AL. 2011; WRIGHT AND NAIR 2010). Durch Blutproben könnten
somit im Verlauf der Untersuchung zu unterschiedlichen Zeitpunkten am gleichen
Tier diese Entzündungsmarker ausgewertet werden. Zytokine könnten ebenfalls mit
Hilfe einer immunhistochemischen Auswertung in histologischen Schnitten beurteilt
werden (ROSENGREN ET AL. 1997; SNOWDEN ET AL. 2012). Aufgrund der höheren
Belastung der Tiere durch eine regelmäßige Blutentnahme und einem deutlich
vermehrten Arbeitsaufwand wurden diese Methoden jedoch nicht durchgeführt.
Zusammenfassend kann man über die histologische Auswertung sagen, dass diese
umfangreich und aussagekräftig ist, aber im Falle spezieller Fragestellungen
erweitert werden kann.
3. Beurteilung des Tiermodells
Wir konnten zeigen, dass bei der Ratte durch die intraoperative Besiedlung von
Titan-Implantaten mit einem rattenpathogenen S. aureus zuverlässig Auslösung
einer Biofilmbildung mit begleitender Entzündungsreaktion möglich ist, wobei die
Belastung der Tiere als gering eingestuft werden kann. Die Behandlung mit CSA
hatte keinen Einfluss auf die untersuchten Parameter.
Die tägliche Beurteilung des Allgemeinbefindens der Tiere und die regelmäßige
Gewichtskontrolle zeigten kaum Unregelmäßigkeiten. Alle Tiere hatten spätestens ab
dem zweiten Tag nach der Operation ein ungestörtes Allgemeinbefinden und alle
Tiere nahmen im Verlauf des Versuchs an Gewicht zu. Auch unmittelbar postoperativ
V Diskussion 57
kam es zu keinem Gewichtsverlust von 20%. Bei keinem Tier war die Wundheilung
gestört und trotz der Infektion wurde keine Ratte auffällig in dem Sinne, dass sie sich
verstärkt an der Implantationsstelle gekratzt hat.
Die Immunsuppression mittels CSA zeigte keinen Effekt auf die Biofilmbildung oder
die Entzündungsreaktion, sodass man für die Verwendung dieses Modells von der
täglichen Belastung der Tiere durch die i.p. Injektion absehen kann. Dies verringert
einerseits die Belastung der Tiere und gleichzeitig den Arbeitsaufwand bei
Verwendung des Modells. Die Unwirksamkeit von CSA ist wahrscheinlich darauf
zurückzuführen, dass diese Substanz mit der spezifischen Hemmung der T-Zellen
nicht direkt in die Immunabwehr gegen Bakterien eingreift, die hauptsächlich durch
neutrophile Granulozyten gewährleistet ist (FRANK 1980; SCHRAMM 2005). Ob eine
solche immunsuppressive Behandlung bei humanpathogenen Erregern vorteilhaft
wäre, können wir mit unserem Ansatz allerdings nicht erkennen.
Wir konnten in unserem Modell eine sehr starke Entzündungsreaktion nachweisen,
wohingegen es bei der Biofilmbildung wünschenswert wäre, wenn sie großflächiger
auf dem Implantat verteilt wäre. Ob eine Immunsuppression durch eine andere
Substanz die Biofilmbildung verstärken würde, müsste in weiteren Versuchen
getestet werden. Eine weitere Möglichkeiten der pharmakologischen
Immunsuppression wären zum Beispiel hochdosierte Kortikosteroide, wie etwa
Prednisolon (COSÍO ET AL. 2005; TAYLOR ET AL. 2005). Kortikosteroide hätten in einem
Infektionsversuch jedoch mehrere Nachteile. Sie bewirken eine ausgeprägte
Entzündungshemmung, unter anderem durch eine Stabilisierung von
Zellmembranen, eine Reduktion der Kapillarpermeabilität, eine reduzierte
Freisetzung von Zytokinen und eine Beeinträchtigung der Funktion von Makrophagen
(COSÍO ET AL. 2005; TAYLOR ET AL. 2005). Dieser Effekt ist jedoch für das entwickelte
Modell nicht sinnvoll, da mit der Biofilmbildung gleichzeitig die Entzündungsreaktion
beurteilt wurde. Zum anderen ist in vorangegangenen Versuchen gezeigt worden,
dass Kortikosteroide einen negativen Einfluss auf das Wachstum von S. aureus
haben, was durch die angestrebte Biofilmbildung ebenfalls nicht erwünscht war
(GOGGIN ET AL. 2014). Zusätzlich beeinflussen sie den Knochenstoffwechsel und
führen durch eine erhöhte Resorptionsrate zu einer geringeren Knochendichte und
V Diskussion 58
somit einem erhöhten Frakturrisiko, was die Evaluierung der Knochenreaktion auf ein
infiziertes Implantat erschwert. Die hochdosierte Gabe von Kortikosteroiden zur
Immunsuppression führt zudem zu ausgeprägten Nebenwirkungen, wie einem
erhöhten Infektionsrisiko. Bei einer chronischen Applikation kommt es zusätzlich zu
einem vermehrten Vorkommen von Tumoren, sowie Herz-Kreislauf- und
Stoffwechselerkrankungen (HSU ET AL. 2008; SCHÄCKE ET AL. 2002; TAYLOR ET AL.
2005). Somit wären die Kortikosteroide als Alternative zum CSA für den vorliegenden
Infektionsversuch an Implantaten nicht geeignet.
4. Fazit und Ausblick
Im Vergleich aller Ergebnisse gab es zwischen den Standzeiten von zehn und 21
Tagen keine großen Differenzen, während Tag zwei weder als Biofilm- noch als
Entzündungsmodell geeignet ist. Zu diesem Zeitpunkt ist das Bakterienvorkommen
noch nicht stabil und die histologische Auswertung zeigt, dass weder die Fibrose
noch der Knochenumbau durch Osteoklasten bei den infizierten Tieren stärker
ausgeprägt ist als bei den Kontrolltieren. Bei den Entzündungszellen und den
Fremdkörper-Riesenzellen zeigten sich keine Unterschiede bei den Ergebnissen an
den Tagen zehn und 21, nur die Zahl der Osteoklasten und die Fibrosebildung
zeigten Abweichungen. Ebenso war das Bakterienvorkommen auf den Implantaten
zu diesen Zeitpunkten vergleichbar. Aufgrund der nur halb so langen Standzeit und
der daher geringeren Belastung der Tiere, wäre somit eine Standzeit von zehn
Tagen zu empfehlen. Im Falle einer Untersuchung, die gezielt auf die
Knochenreaktion oder die umgebende Narben- und Fibrosebildung ausgerichtet ist,
wäre individuell zu entscheiden, ob eine Standzeit von zehn oder von 21 Tagen von
Vorteil ist.
Es gibt die Möglichkeit, das Modell für einen größeren Informationsgewinn durch
weitere Untersuchungen zu erweitern. Diese bringen immer den Nachteil eines
deutlich höheren Arbeitsaufwandes und teilweise auch einer höheren Belastung der
Tiere mit sich. Dabei wäre entsprechend individuell zu entscheiden, ob ein größerer
Erkenntnisgewinn dies rechtfertigen würde. Eines der Ziele bei der Entwicklung
V Diskussion 59
unseres Modells war die Praktikabilität. Vor allem bei der Semiquantifizierung der
Biofilme würde das Modell von einer optimierten Methode profitieren, welche jedoch
bei heutigem Kenntnisstand nur schwierig zu realisieren ist. Für die histologische
Auswertung könnten die oben erwähnten zusätzlichen Methoden im Falle einer
spezifischen Fragestellung zusätzlich angewendet werden.
Zudem spricht die geringe Belastung der Tiere für die Eignung als Screening-Modell.
Somit können mit Hilfe dieses Modells neue Implantatmaterialien oder
-beschichtungen in vivo im Vergleich zu Titan untersucht werden. Diese könnten
dann später in aufwendigeren Ansätzen mit humanpathogenen Erregern verifiziert
werden. Des Weiteren bietet das Modell die Möglichkeit der Weiterentwicklung von
Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten von Implantatinfektionen. Es gibt
bereits einige Innovationen in diesen Bereichen, wie zum Beispiel unterschiedliche
Beschichtung von Implantaten. Die zuverlässige Wirksamkeit dieser Optionen muss
jedoch erst tierexperimentell untersucht werden, wofür sich unser Ansatz als
Screening-Modell eignet.
VI Zusammenfassung 60
VI. ZUSAMMENFASSUNG
Silke Paret
Entwicklung eines Tiermodells zur Untersuchung eine s Biofilms und einer
assoziierten Entzündungsreaktion bei chirurgischen Implantaten
Implantatinfektionen sind sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin ein
großes Problem in vielen Bereichen der Chirurgie und sehr häufig mit einer
Biofilmbildung assoziiert. Aufgrund der abweichenden Verhaltensweisen der
Bakterien in einem Biofilm gegenüber planktonischen Bakterien sind solche
Infektionen sehr schwierig zu behandeln. Durch verschiedene
Resistenzmechanismen sind konservative antimikrobielle Therapien in der Regel
nahezu wirkungslos und das infizierte Implantat muss entfernt werden mit einem
großzügigen Debridement des umgebenden Gewebes. Diese Behandlungen sind
sehr kostenintensiv und haben gleichzeitig ein hohes Risiko einer erneuten Infektion.
Aus diesem Grund befassen sich zahlreiche Arbeitsgruppen mit dem Thema der
Implantatinfektionen und es gibt bereits einige Tiermodelle zu unterschiedlichen
Implantaten im Körper. Bei vielen dieser Modelle ist jedoch kein direkter Nachweis
eines Biofilms auf den Implantaten gelungen und gleichzeitig wird nur selten die
Entzündungsreaktion des umgebenden Gewebes bewertet, obwohl diese
entscheidend an den Vorgängen des Implantatversagens beteiligt ist.
Vor diesem Hintergrund sollte in diesem Dissertationsvorhaben ein Rattenmodell
entwickelt werden, das sowohl praktikabel aufgrund der gewählten Standzeit und der
verwendeten Methoden ist und gleichzeitig aussagekräftig die Biofilmbildung und die
assoziierte Entzündungsreaktion bewertet.
Mittels einer intraoperativen Besiedlung von zwei Schrauben mit einem
rattenpathogenen Staphylococcus aureus, die in die Schädelkalotte von Ratten
eingebracht wurden, wurde eine intraoperative Kontamination von Implantaten mit
einer anschließenden Implantatinfektion simuliert. Es wurden sowohl
immunkompetente als auch mit Ciclosporin A immunsupprimierte Tiere verwendet,
VI Zusammenfassung 61
um einen Einfluss der Immunsuppression auf die Biofilmbildung zu evaluieren.
Nach zwei, zehn und 21 Tagen wurden die Tiere euthanasiert um die Entwicklung
eines Biofilms auf der Implantatoberfläche mit Hilfe eines konfokalen Laser-
Scanning-Mikroskops und einem Score zu evaluieren. Durch eine histologische
Untersuchung der Schädelkalotten wurde die assoziierte Entzündungsreaktion
ebenfalls mit Hilfe eines Scores beurteilt. Dafür wurden die Anzahl der
Entzündungszellen, der Knochenumbau durch Osteoklasten, die
Fremdkörperreaktion und die Fibrose jeweils einzeln mit einem Score bewertet.
Zu allen Zeitpunkten war bei den infizierten Tieren eine Biofilmbildung nachweisbar,
die mit einer ausgeprägten Entzündungsreaktion einherging, wobei aufgrund der
Ausprägung der unterschiedlichen Parameter zu den verschiedenen Zeitpunkten die
Tage zehn und 21 als geeignet betrachtet werden können.
Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass sich die intraoperative Besiedelung
eines Implantats mit Staphylococcus aureus eignet, um als Screening-Modell zur
Untersuchung neuer Implantatmaterialien oder -oberflächen zu dienen um ihren
Einfluss auf die Biofilmbildung und die assoziierte Entzündungsreaktion in vivo zu
testen. Für spezielle Fragestellungen wäre jedoch eine Erweiterung der Methoden
zur Auswertung möglich und sinnvoll.
VII Summary 62
VII. SUMMARY
Silke Paret
Development of an animal model for the investigatio n of biofilms and the
associated inflammatory reaction on surgical implan ts
In human and in veterinary medicine implant infections is a major problem in most of
the surgery fields and often associated with biofilm formation. These infections need
long term and elaborate treatment because of the altered properties of bacteria in a
biofilm in comparison to planktonic bacteria. They have several mechanisms of
resistance against conservative antimicrobial treatment and the infected implant often
needs to be removed with a large debridement. This therapy is very expensive and
the risk of a new infection is high. For this reason, numerous working groups deal
with the issue of implant infections and some animal models for different aspects of
this topic are already available. Most of these models, however, did not detect
bacteria directly on the implants. Further, the inflammatory reaction of the
surrounding tissue has been evaluated only in a few cases although it is one of the
main reasons of implant failure.
For this reason we aimed to develop a rat model for implant infection with a
reasonable but short duration and direct detection of bacteria on the implants for
evaluation of a biofilm and the associated inflammatory reaction.
During implantation of two titanium screws in the cranium of rats, an intraoperative
contamination was simulated by giving Staphylococcus aureus in the drillholes.
Immunocompetent and immunosuppressed rats (Ciclosporin A) were used to
evaluate the influence of immunosuppression on biofilm formation.
Two, ten and 21 days after surgery, the implants and the cranial bone were
harvested for examination. Biofilm formation on the implant surface was investigated
with a confocal laser scanning microscope and rated with a score between zero and
five. The cranial bone was evaluated histologically with a four parameter score for
VII Summary 63
quantity of inflammatory cells, bone remodeling by osteoclasts, foreign-body reaction
and fibrosis.
At every timepoint of analysis, biofilm formation and a significant higher inflammatory
reaction was detectable on the infected animals. With respect to the severity of the
different parameter used for histological evaluation, either day 10 or day 21 are
considered appropriate for the use of this animal model.
In conclusion, we suggest that intra-operative contamination of implants with
staphylococcus aureus can be used as a valid in-vivo screening-model to evaluate
new implant materials and surfaces with respect to biofilm formation and the
associated inflammatory reaction. However, an extension of the methods of analysis
would be possible and useful for specific questions.
VIII. Literaturverzeichnis 64
VIII. LITERATURVERZEICHNIS
ABRAHAM, N. M. UND K. K. JEFFERSON. 2010. “A low molecular weight component of serum inhibits biofilm formation in Staphylococcus aureus.” Microbial pathogenesis 49(6):388–91.
AIKEN, M. J., T. K. HUGHES, R. H. ABERCROMBY, M. A. HOLMES UND A. A. ANDERSON. 2015. “Prospective, randomized comparison of the effect of two antimicrobial regimes on surgical site infection rate in dogs undergoing orthopedic implant surgery.” Veterinary Surgery 44:661-667.
AKIYAMA, H., R. TORIGOE UND J. ARATA. 1993. “Interaction of Staphylococcus aureus cells and silk threads in vitro and in mouse skin.” Journal of Dermatological Science 6(93):247–57.
ALEXANDER, E.H., F. A. RIVERA, I. MARRIOTT, J. ANGUITA, K. L. BOST UND M. C. HUDSON. 2003. “Staphylococcus aureus - induced tumor necrosis factor - related apoptosis - inducing ligand expression mediates apoptosis and caspase-8 activation in infected osteoblasts.” BMC microbiology 3(5):1-11.
ALLISON, A.C. 2000. “Immunosuppressive drugs: The first 50 years and a glance forward.” Immunopharmacology 47(2-3):63–83.
ALMEIDA, C., N. F. AZEVEDO, S. SANTOS, C. W. KEEVIL UND M. J. VIEIRA. 2011. “Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH).” PloS one 6(3):1–13.
ALT, V., K. S. LIPS, C.HENKENBEHRENS, D. MUHRER, M. C. OLIVEIRA CAVALCANTI, M. CAVALCANTI-GARCIA, UR.SOMMER, U. THORMANN, G. SZALAY, C. HEISS, T. PAVLIDIS, E.DOMANN UND R. SCHNETTLER. 2011. “A new animal model for implant-related infected non-unions after intramedullary fixation of the tibia in rats with fluorescent in situ hybridization of bacteria in bone infection.” Bone 48(5):1146–53.
AMMANN, T. W., N. BOSTANCI, G. N. BELIBASAKIS UND T. THURNHEER. 2013. “Validation of a quantitative real-time PCR assay and comparison with
VIII. Literaturverzeichnis 65
fluorescence microscopy and selective agar plate counting for species-specific quantification of an in vitro subgingival biofilm model.” Journal of Periodontal Research 48(4):517–26.
AMORENA, B. UND E. GRACIA. 1999. “Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro.” Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:43–55.
AN, Y. UND R. FRIEDMAN. 1998. “Animal models of orthopedic implant infection.” Investigative Surgery 11:139–46.
ANDERSON, J. M. 1988. “Inflammatory response to implants.” ASAIO transactions / American Society for Artificial Internal Organs 34:101–7.
ANDERSON, J. M. 1993. “Mechanisms of inflammation and infection with implanted devices.” Cardiovascular Pathology 2(3):33–41.
ANDERSON, J. M., A. RODRIGUEZ UND D. T. CHANG. 2008. “Foreign body reaction to biomaterials.” Seminars in Immunology 20:86–100.
ARAD, E., S.NAVON-VENEZIA, E. GUR, B. KUZMENKO, R. GLICK, D. FRENKIEL-KRISPIN, E. KRAMER, Y. CARMELI UND Y. BARNEA. 2013. “Novel rat model of methicillin-resistant Staphylococcus aureus-infected silicone breast implants: A study of biofilm pathogenesis.” Plastic and reconstructive surgery 131(2):205–14.
ARCHER, N.K., M. J. MAZAITIS, J. W. COSTERTON, J. G. LEID, M. E. POWERS UND M. E. SHIRTLIFF. 2011. “Staphylococcus aureus biofilms. Properties, regulation and roles in human disease.” Virulence 25(October):445–59.
ARCIOLA, C. R., L. VISAI, F. TESTONI, S. ARCIOLA, D. CAMPOCCIA, P. SPEZIALE UND L. MONTANARO. 2011. “Concise survey of Staphylococcus aureus virulence factors that promote adhesion and damage to peri-implant tissues.” The International journal of artificial organs 34(9):771–80.
AUGER, J., J. DUPUIS, A. QUESNEL UND G. BEAUREGARD. 2000. “Surgical treatment of lumbosacral instability caused by discospondylitis in four dogs.” Veterinary Surgery 29(1):70–80.
VIII. Literaturverzeichnis 66
BAINTON, D. F., R. TAKEMURA, P. E. STENBERG UND Z. WERB. 1989. “Rapid fragmentation and reorganization of golgi membranes during frustrated phagocytosis of immobile immune complexes by macrophages.” The American Journal of Pathology 134(1):15–26.
BEENKEN, K.E. UND P.M. DUNMAN. 2004. “Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.” Journal of bacteriology 186:4665–84.
BERENDT, T. UND I. BYREN. 2004. “Bone and joint infection.” Clinical medicine (London, England) 4(6):510–18.
BJERKNES, S., I.M. SKOGSEID, T.SÆHLE, E. DIETRICHS UND M. TOFT. 2014. “Surgical site infections after deep brain stimulation surgery: Frequency, characteristics and management in a 10-year period.” PLoS ONE 9(8):1–9.
BØE, B., T. HEIER UND L. NORDSLETTEN. 2011. “Measurement of early bone loss around an uncemented femoral stem.” Acta orthopaedica 82(3):321–24.
BRAXTON, E.E., G.D. EHRLICH, L.HALL-STOODLEY, P. STOODLEY, R. VEEH, C. FUX, F. Z. HU, M. QUIGLEY UND J. C. POST. 2005. “Role of biofilms in neurosurgical device-related infections.” Neurosurgical review 28(4):249–55.
BRENNAN, S. A, C. NÍ FHOGHLÚ, B. M. DEVITT, F. J. O. MAHONY, D. BRABAZON UND A. WALSH. 2015. “Silver nanoparticles and their orthopaedic applications.” The Bone & Joint Journal 97-B:582–89.
BROGGINI, N., L. M. MCMANUS, J. S. HERMANN, R. U. MEDINA, T. W. OATES, R. K. SCHENK, D. BUSER, J. T. MELLONIG UND D. L. COCHRAN. 2003. “Persistent acute inflammation at the implant-abutment interface.” Journal of dental research 82:232–37.
BÜCHELER, M., S. WEIHE UND H. EUFINGER. 2002. “Rekonstruktion des Os frontale mit individuellen Titanimplantaten nach chirurgischer Therapie der Stirnbeinosteomyelitis.” HNO 50:339–46.
BÜRGERS, R., T. GERLACH, S. HAHNEL, F. SCHWARZ, G. HANDEL UND M. GOSAU. 2010. “In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces.” Clinical oral implants research 21(2):156–64.
VIII. Literaturverzeichnis 67
CAIAZZA, N. C. UND G. A. O’TOOLE. 2003. “Alpha-toxin Is required for biofilm formation by Staphylococcus aureus.” Journal of bacteriology 185(10):3214–17.
CAMPOCCIA, D., L. MONTANARO UND C. R. ARCIOLA. 2006. “The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance.” Biomaterials 27:2331–39.
CAMPOCCIA, D., L. MONTANARO UND C. R. ARCIOLA. 2013. “A review of the clinical implications of anti-infective biomaterials and infection-resistant surfaces.” Biomaterials 34(33):8018–29.
CHEN, W. H., L. S. JIANG UND LI YANG DAI. 2009. “A novel canine model of acute pyogenic spondylodiscitis.” Neurosurgical Review 32(4):485–90.
CHEN, W. H., Y. J. KANG, L. Y. DAI, B. WANG, C. LU, J. LI UND GUO HUA LÜ. 2014. “Bacteria detected after instrumentation surgery for pyogenic vertebral osteomyelitis in a canine model.” European Spine Journal 23(4):838–45.
CHEN, X., D. T. TSUKAYAMA, L. S. KIDDER, C. BOURGEAULT, A. H. SCHMIDT UND W. D. LEW. 2005. “Characterization of a chronic infection in an internally-stabilized segmental defect in the rat femur.” Journal of Orthopaedic Research 23(4):816–23.
COELHO, L.R., R. R. SOUZA, F. A. FERREIRA, M. A. GUIMARÃES, B. T. FERREIRA-CARVALHO UND A. M. SÁ FIGUEIREDO. 2008. “Agr RNAIII divergently regulates glucose-induced biofilm formation in clinical isolates of Staphylococcus aureus.” Microbiology 154(11):3480–90.
CONNAUGHTON, A., A. CHILDS, S. DYLEWSKI UND V. J. SABESAN. 2014. “Biofilm disrupting technology for orthopedic implants: What’s on the horizon?” Frontiers in Medicine 1:1–4.
COSÍO, B. G., A. TORREGO UND I. M. ADCOCK. 2005. “Molecular mechanisms of glucocorticoids.” Archivos de bronconeumologia 41(1):34–41.
COSTERTON, J. W. 1999. “Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.” Science 284(5418):1318–22.
VIII. Literaturverzeichnis 68
COSTERTON, W. UND R. VEEH. 2003. “The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections.” The Journal of Clinical Investigantion 112(10):1466–77.
CRAMTON, S. E., C. GERKE, N. F. SCHNELL, W. W. NICHOLS UND F. GÖTZ. 1999. “The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation.” Infection and immunity 67(10):5427–33.
CUCARELLA, C., C.SOLANO UND J. VALLE. 2001. “Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation.” Journal of bacteriology 183(9):2888–96.
CURTIS, J. J., R. G. LUKE, E. DUBOVSKY, A. G. DIETHELM, J. D. WHELCHEL UND P. JONES. 1986. “Cyclosporin in therapeutic doses increases renal allograft vascular resistance.” Lancet 2(8505):477–79.
DAROUICHE, R.O. 2004. “Treatment of infections associated with surgical implants.” The New England journal of medicine 350(14):1422–29.
DASCHNER, F., M. DETTENKOFER, U. FRANK, UND M. SCHERRER. 2006. Praktische Krankenhaushygiene und Umweltschutz. 3. Auflage, Springer Verlag, Freiburg
DAVIES, D.G., M. R. PARSEK, J. P. PEARSON, B. H. IGLEWSKI, J. W. COSTERTON UND E. P. GREENBERG. 1998. “The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.” Science 280:295–98.
DONLAN, R.M. UND J.W. COSTERTON. 2002. “Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.” Clinical microbiology reviews 15(2):167–93.
DRAKE, M. T., C. BESCH-WILLIFORD, M. H. MYLES, J. W. DAVIS UND R. S. LIVINGSTON. 2011. “In vivo tropisms and kinetics of rat theilovirus infection in immunocompetent and immunodeficient rats.” Virus Research 160(1-2):374–80.
EERENBERG, J. P., P. PATKA, H. J. HAARMAN UND B. J. DWARS. 1994. “A new model for posttraumatic osteomyelitis in rabbits.”
VIII. Literaturverzeichnis 69
Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical
Research 7(5):453–65.
ELLINGTON, J. K., S. S. REILLY, W. K. RAMP, M. S. SMELTZER, J. F. KELLAM U ND M. C. HUDSON. 1999. “Mechanisms of Staphylococcus aureus invasion of cultured osteoblasts.” Microbial pathogenesis 26:317–23.
ERICSSON, I., L. G. PERSSON, T. BERGLUNDH, C. P. MARINELLO, J. LINDHE UND B. KLINGE. 1995. “Different types of inflammatory reactions in peri-implant soft tissues.” Journal of clinical periodontology 22:255–61.
FERREIRA, F. A., R. RODRIGUES SOUZA, R. R. BONELLI, M. A. AMÉRICO, S. E.LONGO FRACALANZZA U ND A.M. SÁ FIGUEIREDO. 2012. “Comparison of in vitro and in vivo systems to study ica-independent Staphylococcus aureus biofilms.” Journal of microbiological methods 88(3):393–98.
FOSTER, T. J. 2005. “Immune evasion by staphylococci.” Nature reviews. Microbiology 3(December):948–58.
FOURNIER, B. UND D. J. PHILPOTT. 2005. “Recognition of Staphylococcus aureus by the innate immune system.” Clinical Microbiology Reviews 18(3):510–40.
FRANK, R. M. 1980. “Bacterial penetration in the apical pocket wall of advanced human periodontitis.” Journal of periodontal research 15(1978):563–73.
FREIRE, M. O. 2011. “Development of an animal model for Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilm-mediated oral osteolytic infection: A preliminary study.” Journal of periodontology 82(5):778–89.
FURUSTRAND TAFIN, U., B. BETRISEY, M. BOHNER, T. ILCHMANN, A. TRAMPUZ UND M. CLAUSS. 2015. “Staphylococcal biofilm formation on the surface of three different calcium phosphate bone grafts: A qualitative and quantitative in vivo analysis.” Journal of Materials Science: Materials in Medicine 26(3):130.
VIII. Literaturverzeichnis 70
GALLAGHER, A. D. UND W. D. MERTENS. 2012. “Implant removal rate from infection after tibial plateau leveling osteotomy in dogs.” Veterinary Surgery 41:705–11.
GBEJUADE, H. O., A. M. LOVERING UND J. C. WEBB. 2015. “The role of microbial biofilms in prosthetic joint infections.” Acta Orthopaedica 86(2):147–58.
GEIPEL, U. UND M. HERRMANN. 2004. “The infected implant. Part 1: Bacteriology.” Der Orthopäde 33(12):1411–28.
GERDING, J. C., A. CLODE, B. C. GILGER UND K. W. MONTGOMERY. 2014. “Equine orbital fractures: A review of 18 cases (2006-2013).” Veterinary Ophthalmology 17(1):97–106.
EL GHOUL, W., S. HARRISSON UND A. BELLI. 2014. “Autologous cranioplasty following decompressive craniectomy in the trauma setting.” British Journal of Neurosurgery 29(April 2014):1–6.
GIBBS, R., G. WEINSTOCK UND M. METZKER. 2004. “Genome sequence of the brown norway rat yields insights into mammalian evolution.” Nature 428(6982):493–521.
GOGGIN, R., C. JARDELEZA, P.-J. WORMALD UND S.VREUGDE. 2014. “Corticosteroids directly reduce Staphylococcus aureus biofilm growth: An in vitro study.” The Laryngoscope 124(3):602–7.
GOH, R. C. W., C. N. CHANG, C. L. LIN UND L. J. LO. 2010. “Customised fabricated implants after previous failed cranioplasty.” Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery 63(9):1479–84.
GONZALEZ, R. J., M. C. LANE, N. J. WAGNER, E. H. WEENING UND V.L. MILLER. 2015. “Dissemination of a highly virulent pathogen: Tracking the early events that define infection.” PLOS Pathogens 11:e1004587.
GREENSPON, A. J., E. S. RHIM, G. MARK, J. DESIMONE UND R. T. HO. 2008. “Lead-associated endocarditis: The important role of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.” PACE 31:548–53.
VIII. Literaturverzeichnis 71
GRIENSVEN, M. VAN UND F.M. DAHLWEID. 2002. “Dehydroepiandrosterone (DHEA) modulates the activity and the expression of lymphocyte subpopulations induced by cecal ligation and puncture.” Shock 18(5):445–49.
GÜNTHER, F., G. H. WABNITZ, P. STROH, B. PRIOR, U. OBST, Y. SAMSTAG, CHRISTOF
WAGNER UND G. M. HÄNSCH. 2009. “Host defence against Staphylococcus aureus biofilms infection: Phagocytosis of biofilms by polymorphonuclear neutrophils (PMN).” Molecular immunology 46(8-9):1805–13.
HAENLE, M., C.ZIETZ, T. LINDNER, K. ARNDT, A. VETTER, W. MITTELMEIER, A. PODBIELSKI, UND R. BADER. 2013. “A model of implant-associated infection in the tibial metaphysis of rats.” The Scientific World Journal (481975):1–8.
HALLAK, G. 2014. “Wirksamkeit des quantitativen Rapid-PCR-Screenings für den Nachweis einer Kolonisation mit methicillin-resistenten Staphylococcus-aureus-Spezies (MRSA) sowie der unmittelbaren Kontaktisolierung positiv-getesteter Patienten zur Reduktion von nosokomialen MRSA-Infektionen und direkten Kosten in einem Traumazentrum.” Berlin, Charité Universitätsmedizin, Medizinische Fakultät, Diss.
HALL-STOODLEY, L., J. W. COSTERTON UND P. STOODLEY. 2004. “Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.” Nature reviews. Microbiology 2(2):95–108.
HANDRECK, A., E. M. MALL, D. A. ELGER, L. GEY UND M. GERNERT. 2015. “Different preparations, doses, and treatment regimens of cyclosporine A cause adverse effects but no robust changes in seizure thresholds in rats.” Epilepsy Research 112:1–17.
HANKE, M. L. UND T. KIELIAN. 2012. “Deciphering mechanisms of staphylococcal biofilm evasion of host immunity.” Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2(May):1–12.
HANNIG, C., M. FOLLO, E. HELLWIG UND A. AL-AHMAD. 2010. “Visualization of adherent micro-organisms using different techniques.” Journal of medical microbiology 59(Pt 1):1–7.
HARRISON, J. J., H. CERI, J. YERLY, C. STREMICK, Y. HU, R. MARTINUZZI UND R. J. TURNER. 2006. “The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the calgary biofilm device.” Biological procedures online 8(1):194–215.
VIII. Literaturverzeichnis 72
HARRO, J.M., B. M. PETERS, G. A. O’MAY, N. ARCHER, P. KERNS, R. PRABHAKARA UND M. E. SHIRTLIFF. 2010. “Vaccine development in Staphylococcus aureus: Taking the biofilm phenotype into consideration.” FEMS Immunology and Medical Microbiology 59:306–23.
HEINONEN, M. T., A. P. LAINE, C. SODERHALL, O. GRUZIEVA, S. RAUTIO, E. MELEN, G. PERSHAGEN, H. J. LAHDESMAKI, M. KNIP, J. ILONEN, T. A. HENTTINEN, J. KERE UND R. LAHESMAA. 2015. “GIMAP GTPase family genes: Potential modifiers in autoimmune diabetes, asthma and allergy.” The Journal of Immunology 194:5885–94.
HENSON, P. M. 1971. “The immunologic release of constituents from neutrophil leukocytes: II. Mechanisms of release during phagocytosis, and adherence to nonphagocytosable surfaces.” Journal of Immunology 107:1547–57.
HENSON, P. M. 1980. “Mechanisms of exocytosis in phagocytic inflammatory cells.” American Journal of Pathology 101(3):494–511.
HERRMANN, M., P. E. VAUDAUX, D. PITTET, R. AUCKENTHALER, P. D. LEW, F. SCHUMACHER-PERDREAU, G. PETERS UND F. A. WALDVOGEL. 1988. “Fibronectin, fibrinogen and laminin act as mediators of adherence of clinical staphylococcal isolates to foreign material.” The Journal of infectious diseases 158(4):693–701.
HOLLSTEIN, E.-P. 2003. “Knöcherne Integration und Biokompatibilität eines neuen resorbierbaren Polymers zur Schraubenaugmentation im osteoporotischen Knochen.” München, Ludwig-Maximilian-Universität, Institut für Tierzucht, Bereich Versuchstierkunde, Diss.
HOSEIN, I. K., D. W. HILL UND R. H. HATFIELD. 1999. “Controversies in the prevention of neurosurgical infection.” Journal of Hospital Infection 43(1):5–11.
HSU, D. C. UND C. H. KATELARIS. 2008. “Long-term management of patients taking immunosuppressive drugs.” Australian Prescriber 32(3):68–71.
HUSKA, J. L., L. GAITERO, B.A. BRISSON, S. NYKAMP, J. THOMASON UND W. C. SEARS. 2014. “Presence of residual material following mini-hemilaminectomy in dogs with
VIII. Literaturverzeichnis 73
thoracolumbar intervertebral disc extrusion.” The Canadian Veterinary Journal 55:975–80.
HUTTNER, H. B., D. STAYKOV, J. BARDUTZKY, C. NIMSKY, G. RICHTER, A DOERFLER UND S. SCHWAB. 2008. “Treatment of intraventricular hemorrhage and hydrocephalus.” Der Nervenarzt 79(12):1369–70, 1372–74, 1376.
INZANA, J.A., E. M. SCHWARZ, S.L. KATES UND H. A. AWAD. 2015. “A novel murine model of established staphylococcal bone infection in the presence of a fracture fixation plate to study therapies utilizing antibiotic-laden spacers after revision surgery.” Bone 72:128–36.
JÄCKEL, S. 2012. “Rekonstruktion von kritischen Knochendefekten am Kiefer immundefizienter Ratten durch xenogene Transplantation humaner adulter fettabgeleiteter Stammzellen.” Gießen, Justus-Liebig-Universität, Fachbereich Veterinärmedizin, Diss.
JESAITIS, A. J., M. J. FRANKLIN, D. BERGLUND, M. SASAKI, C. I. LORD, J. B. BLEAZARD, J. E. DUFFY, H. BEYENAL UND Z. LEWANDOWSKI. 2003. “Compromised host defense on Pseudomonas aeruginosa biofilms: Characterization of neutrophil and biofilm interactions.” The Journal of Immunology 171(8):4329–39.
JOHANSEN, L. K., J. KOCH, D. FREES, B. AALBÆK, O. L. NIELSEN, P. S. LEIFSSON, T. M. IBURG, E. SVALASTOGA, L. E. BUELUND, T. BJARNSHOLT, N. HØIBY UND H. E. JENSEN. 2012. “Pathology and biofilm formation in a porcine model of staphylococcal osteomyelitis.” Journal of Comparative Pathology 147(2-3):343–53.
KASLIWAL, M. K., L. TAN UND V.C. TRAYNELIS. 2013. “Infection with spinal instrumentation: Review of pathogenesis, diagnosis, prevention, and management.” Surgical neurology international 4(Suppl 5):S392–403.
KERSTENS, M., G. BOULET, M. VAN KERCKHOVEN, S.CLAIS, E. LANCKACKER, P. DELPUTTE, L. MAES UND P. COS. 2015. “A flow cytometric approach to quantify biofilms.” Folia Microbiologica 60(4).
KLOOS, W. E. UND T. L. BANNERMAN. 1994. “Update on clinical significance of coagulase-negative staphylococci.” Clinical Microbiology Reviews 7(1):117–40.
VIII. Literaturverzeichnis 74
KNOX, P. M. UND J. P. WATKINS. 2006. “Proximal interphalangeal joint arthrodesis using a combination plate-screw technique in 53 horses (1994-2003).” Equine Veterinary Journal 38(6):538–42.
KOCH, T. UND U. P. MASCHE. 1999. “Gelenk- und Knocheninfektionen.” pharma-kritik 11:41–44.
KOCHANOWSKI, A. 2012. “Differenzierte morphometrische Bewertung der lokalen Entzündungsreaktion nach Implantation von Phospholipid-beschichteten Titanimplantaten im Tiermodell Ratte.” Greifswald, Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Fachber. Medizinische Biochemie, Diss.
KRAEMER, P., M. B. LEE, H.ENGLEHARDT, J. R. CHAPMAN UND R. J. BRANSFORD. 2010. “Infectious pin complication rates in halo vest fixators using ceramic versus metallic pins.” Journal of spinal disorders & techniques 23(8):e59–62.
LADENBURGER, S. 2003. “Relevanz der Galenik am Beispiel des Critical Dose Pharmakons Ciclosporin: Untersuchungen zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik verschiedener galenischer Formulierungen an gesunden Probanden.” Regensburg, Universität, Fachber. Pharmakologie, Diss.
LEBLANC, M., K. BERRY, H. MCCORT UND J. D. REUTER. 2013. “Brain abscess in a rhesus macaque (Macaca Mulatta) with a cephalic implant.” Comparative Medicine 63(4):367–72.
LEID, J. G., M. E. SHIRTLIFF, J. W. COSTERTON UND P. STOODLEY. 2002. “Human leukocytes adhere to, penetrate and respond to Staphylococcus aureus biofilms.” Infection and immunity 70(11):6339–45.
LEW, D.P. UND F.A. WALDVOGEL. 2004. “Osteomyelitis.” The Lancet 364(9431):369–79.
LI, D., K. GROMOV, K. SOBALLE, J. E. PUZAS, R. J. O’KEEFE, H. AWAD, H. DRISSI UND E. M. SCHWARZ. 2008. “Quantitative mouse model of implant-associated osteomyelitis and the kinetics of microbial growth, osteolysis and humoral Immunity.” Journal of Orthopedic Research 26:96–105.
VIII. Literaturverzeichnis 75
LIETARD, C., V. THÉBAUD, G. BESSON UND B. LEJEUNE. 2008. “Risk factors for neurosurgical site infections: An 18-month prospective survey.” Journal of neurosurgery 109(4):729–34.
LINDE, H. J. UND N. LEHN. 2002. “Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA).” Der Hautarzt 53(10):690–701.
LIU, J., J. D. FARMER, W. S. LANE, J. FRIEDMAN, I. WEISSMAN UND S. L. SCHREIBER. 1991. “Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes.” Cell 66(4):807–15.
LUCKE, M., G. SCHMIDMAIER, S. SADONI, B. WILDEMANN, R. SCHILLER, A. STEMBERGER, N. P. HAAS UND M. RASCHKE. 2003. “A new model of implant-related osteomyelitis in rats.” Journal of biomedical materials research. Part B, Applied biomaterials 67(1):593–602.
MAH, T. F. UND G. A O’TOOLE. 2001. “Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.” Trends in microbiology 9(1):34–39.
MARTINEZ, A., F. GUITIÁN, R. LÓPEZ-PÍRIZ, J. F. BARTOLOMÉ, B. CABAL, L. ESTEBAN-TEJEDA, R.TORRECILLAS UND J. S. MOYA. 2014. “Bone loss at implant with titanium abutments coated by soda lime glass containing silver nanoparticles: A histological study in the dog.” PloS one 9(1):e86926.
MAYER, B.C.G. 2012. “Knochenabbau in der Osteitis - Rolle neutrophiler Granulozyten bei der Osteoklastogenese.” Heidelberg, Universität, Fachber. Immunologie, Diss.
MCCREA, S. J. J. 2014. “Advanced peri-implantitis cases with radical surgical treatment.” Journal of periodontal & implant science 44(1):39–47.
MEISSNER, G.. 1959. “Untersuchungen an atypischen Mycobakterien.” Beiträge zur Klinik der Tuberkulose und Spezifischen Tuberkulose-Forschung 121(3):365–80.
MORENO, J. L., I. MIKHAILENKO, M. M. TONDRAVI UND A.D. KEEGAN. 2007. “IL-4 promotes the formation of multinucleated giant cells from macrophage precursors by a STAT6-dependent, homotypic mechanism: Contribution of E-
VIII. Literaturverzeichnis 76
cadherin.” Journal of leukocyte biology 82(December):1542–53.
NEMOTO, K., K. HIROTA, T. ONO, K. MURAKAMI, D. NAGAO UND Y. MIYAKE. 2000. “Effect of varidase (streptokinase) on biofilm formed by Staphylococcus aureus.” Chemotherapy 46(2):111–15.
NICOLL, C., A.SINGH UND J. S. WEESE. 2014. “Economic impact of tibial plateau leveling osteotomy surgical site infection in dogs.” Veterinary Surgery 43:899–902.
NORDEN, C. W. 1988. “Lessons learned from animal models of osteomyelitis.” Reviews of infectious diseases 10(1):103–10.
NOWAK, I. 2010. “Die knöcherne Einheilung von Zirkon- und Titanimplantaten - Eine histologische und ultrastrukturelle Untersuchung.” Düsseldorf, Heinrich-Heine-Universität, Klinik für Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie, Diss.
O’GARA, J.P. 2007. “Ica and beyond: Biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.” FEMS microbiology letters 270(2):179–88.
O’TOOLE, G., H.B. KAPLAN UND R. KOLTER. 2000. “Biofilm formation as microbial development.” Annual Reviews Microbiology 54:49–79.
OFLUOGLU, E. A., M. ZILELI, D. AYDIN, Y. S. BARIS, O. KUÇUKBASMACI, N. GONULLU, O. OFLUOGLU UND H.TOPLAMAOGLU. 2007. “Implant-related infection model in rat spine.” Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery 127(5):391–96.
OHASHI, T., S. HANABUCHI, H. KATO, Y. KOYA, F. TAKEMURA, K. HIROKAWA, T. YOSHIKI, Y. TANAKA, M. FUJII UND M. KANNAGI. 1999. “Induction of adult T-cell leukemia-like lymphoproliferative disease and its inhibition by adoptive immunotherapy in T-cell-deficient nude rats inoculated with syngeneic human T-cell leukemia virus type 1-immortalized cells.” Journal of virology 73(7):6031–40.
OTT, M. D. F. 2011. “Knochenkompakta als Osteosynthesematerial. Vergleichende histologische Studie unter Verwendung von autoklaviertem und gammabestrahltem
VIII. Literaturverzeichnis 77
kompakten Knochen am Kaninchen.” Düsseldorf, Heinrich-Heine-Universität, Fachber. Unfall- und Handchirurgie, Diss.
OTTO, M. 2008. “Klassifikation bei Protheseninsuffizienz und Partikelbestimmung.” Pathologe 29(2):232–39.
OTTO, M. 2008. “Staphylococcal biofilms.” Current Topics in Microbioogy andl Immunology. 322:207–28.
PADOVAN, C. S., P. SOSTAK UND A. STRAUBE. 2002. “Neurologische Komplikationen nach Organtransplantation.” Aktuelle Neurologie 29(6):282–87.
PAJARINEN, J., V.-P. KOURI, E. JÄMSEN, T.-F. LI, J. MANDELIN UND Y. T. KONTTINEN. 2013. “The response of macrophages to titanium particles is determined by macrophage polarization.” Acta biomaterialia 9(11):9229–40.
PAXINOS, G. UND C. WATSON. 1998. The Rat Brain in Stereotactic Coordinates. 4. Auflage, Academic Press, San Diego
PFANZELT, D. 2006. “Epidemiologie boviner Staphylococcus epidermidis Isolate: Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene und klonale Verwandtschaft mit humanen Isolaten.” Hannover, Tieräztliche Hochschule, Institut für Mikrobiologie, Diss.
POELSTRA, K. A, N. A BAREKZI, D. W. GRAINGER, A G. GRISTINA UND T. C. SCHULER. 2000. “A novel spinal implant infection model in rabbits.” Spine 25(4):406–10.
PORTILLO, M. E., S. CORVEC, O. BORENS UND A. TRAMPUZ. 2013. “Propionibacterium acnes: An underestimated pathogen in implant-associated infections.” BioMed Research International 1–10.
PRIBILA, J. T., A. C. QUALE, K. L. MUELLER UND Y. SHIMIZU. 2004. “Integrins and T cell-mediated immunity.” Annual review of immunology 22:157–80.
RAMÍREZ, P., M. GORDÓN, A. SORIANO, S. GIL-PEROTIN, V. MARTI, E. M. GONZALEZ-BARBERA, M. T. SANCHEZ-AGUILAR, J. A SIMAL UND J. BONASTRE. 2013.
VIII. Literaturverzeichnis 78
“Assessment of the in vivo formation of biofilm on external ventricular drainages.”
European journal of clinical microbiology & infectious diseases : official
publication of the European Society of Clinical Microbiology 32(11):1437–43.
REFAI, A. K., M. TEXTOR, D. M. BRUNETTE UND J. D. WATERFIELD. 2004. “Effect of titanium surface topography on macrophage activation and secretion of proinflammatory cytokines and chemokines.” Journal of biomedical materials research. Part A 70:194–205.
REIS, A., T. REINHARD, C. BRAUNSTEIN, E. GODEHARD UND R. SUNDMACHER. 1998. “Perforierende Keratoplastik im Rattenmodell: Vergleichende Untersuchung des immunsuppressiven Effektes von Cyclosporin A (CSA), Mycophenolatemofetil (MMF) und der Kombination CSA/MMF auf die Abstoßungsreaktion nach allogener, orthotoper Hornhauttransplan.” Spektrum Augenheilkunde 12/4:137–39.
ROSENGREN, A., N. DANIELSEN UND L. M. BJURSTEN. 1997. “Inflammatory reaction dependence on implant localization in rat soft tissue models.” Biomaterials 18(14):979–87.
RUPP, M. E., J. S. ULPHANI, P. D. FEY, K. BARTSCHT UND D. MACK. 1999. “Characterization of the importance of polysaccharide intercellular adhesin/hemagglutinin of Staphylococcus epidermidis in the pathogenesis of biomaterial-based infection in a mouse foreign body infection model.” Infection and Immunity 67(5):2627–32.
SAKKA, S. UND P. COULTHARD. 2011. “Implant failure: Etiology and complications.” Medicina Oral Patología Oral y Cirugía Bucal 16(1):42–44.
SANSUR, C. A., D. L. REAMES, J. S. SMITH, D. K. HAMILTON, S.H. BERVEN, P. A
BROADSTONE, T. J. CHOMA, M.J. GOYTAN, H. H. NOORDEEN, D. R. KNAPP, R. HART, R. D. ZELLER, W. F. DONALDSON, D. W. POLLY, J. H. PERRA, O. BOACHIE-ADJEI UND
C. I. SHAFFREY. 2010. “Morbidity and mortality in the surgical treatment of 10,242 adults with spondylolisthesis.” Journal of neurosurgery. Spine 13(5):589–93.
SCHÄCKE, H., W. D. DÖCKE UND K. ASADULLAH. 2002. “Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids.” Pharmacology & therapeutics 96(1):23–43.
VIII. Literaturverzeichnis 79
SCHÄFER, M.. 2011. “Vergleichende histologische Untersuchungen von intramedullären Implantaten auf Magnesiumbasis im Kaninchenmodell.” Hannover, Tierärztliche Hochschule, Klinik für Kleintiere, Diss.
SCHALDACH, M. 1975. “Implantierbare Materialien.” Klinische Wochenschrift 53(21):1029–39.
SCHMIDMAIER, G., M. LUCKE, B. WILDEMANN, N. P. HAAS UND M. RASCHKE. 2006. “Prophylaxis and treatment of implant-related infections by antibiotic-coated implants: A review.” Injury 37 (Suppl 2):S105–12.
SCHMIDT, C. 2003. “Komplikationsanalyse der frontoorbitalen Mobilisation bei Kraniostenosen. Eine retrospektive Studie.” München, Technische Universität, Fakultät Medizin, Diss.
SCHRAMM, D. 2005. “Einfluss der Dauer der Ciclosporin A-Therapie und der Höhe des Ciclosporin A-Spiegels auf die Entwicklung der akuten Transplantatabstoßung und der Transplantatvaskulopathie am heterotopen Herztransplantationsmodell der Ratte.” Franfurt, Johann Wolfgang Goethe-Universität, Fachber. Kardiologie, Diss.
SCHROEDER, K., M. JULARIC, S. M. HORSBURGH, N. HIRSCHHAUSEN, C. NEUMANN, A. BERTLING, A. SCHULTE, S. FOSTER, B. E. KEHREL, G. PETERS UND C. HEILMANN. 2009. “Molecular characterization of a novel Staphylococcus aureus surface protein (SasC) involved in cell aggregation and biofilm accumulation.” PloS one 4(10):1–14.
SHAD, A., S. SHARIFF, J. FAIRBANK, I. BYREN, P. J. M. A D. TEDDY, T. A D. CADOUX-HUDSON UND K. DONS. 2003. “Internal fixation for osteomyelitis of cervical spine: The issue of persistence of culture positive infection around the implants.” Acta Neurochirurgica 145(11):957–60.
SHIRTLIFF, M.E., J.T. MADER UND A.K. CAMPER. 2002. “Molecular interactions in biofilms.” Chemistry & biology 9(02):859–71.
SILVA, M. T. 2011. “Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: A cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation.” Journal of leukocyte biology 89(May):675–83.
VIII. Literaturverzeichnis 80
DA SILVA PERALTA, F., D. PALLOS, C. SILVA QUEIROZ UND L. HERNANDES RICARDO. 2015. “Previous exposure to cyclosporine A and periodontal breakdown in rats.” Archives of Oral Biology 60(4):566–73.
SINGH, P. 2011. “Understanding peri-Implantitis: A strategic review.” Journal of Oral Implantology 37(5):622–26.
SMITH, K., A. PEREZ, G. RAMAGE, D. LAPPIN, C. G. GEMMELL UND S. LANG. 2008. “Biofilm formation by scottish clinical isolates of Staphylococcus aureus.” Journal of Medical Microbiology 57(8):1018–23.
SNOWDEN, J. N., M. BEAVER, M. S. SMELTZER UND T. KIELIAN. 2012. “Biofilm-infected intracerebroventricular shunts elicit inflammation within the central nervous system.” Infection and immunity 80(9):3206–14.
STAVRAKIS, A. I., A. H. LOFTIN, E. L. LORD, Y. HU, J. E. MANEGOLD, E. M. DWORSKY, A. A. SCADUTO UND N. M. BERNTHAL. 2015. “Current animal models of postoperative spine infection and potential future advances.” Frontiers in Medicine 2(May):1–5.
STEIN, K. 2011. “Mittelfristige Ergebnisse von Hüft-TEP Wechseloperationen unter Verwendung des kurvierten zementlosen Revisionsschaftes „ Revitan Kurviert “ (Zimmer GmbH, Winterthur, Schweiz).” Hamburg, Universität, Medizinische Fakultät, Diss.
STIFFLER, K. S. 2004. “Internal fracture fixation.” Clinical Techniques in Small Animal Practice 19(3):105–13.
STOODLEY, P., K. SAUER, D. G. DAVIES UND J. W. COSTERTON. 2002. “Biofilms as complex differentiated communities.” Annual review of microbiology 56:187–209.
STUCKER, F. UND D. ACKERMANN. 2011. “Immunsuppressiva - Wirkungen, Nebenwirkungen und Interaktionen.” Therapeutische Umschau 68(12):679–86.
SUSKA, F., C. GRETZER, M. ESPOSITO, L. EMANUELSSON, A. WENNERBERG, P.TENGVALL
UND P. THOMSEN. 2005. “In vivo cytokine secretion and NF-κB activation around titanium and copper implants.” Biomaterials 26:519–27.
VIII. Literaturverzeichnis 81
TAVERNIER, S. UND T. COENYE. 2015. “Quantification of Pseudomonas aeruginosa in multispecies biofilms using PMA-qPCR.” PeerJ 3:1–15.
TAYLOR, A. L., C. J. E. WATSON UND J. A.BRADLEY. 2005. “Immunosuppressive agents in solid organ transplantation: Mechanisms of action and therapeutic efficacy.” Critical Reviews in Oncology/Hematology 56:23–46.
THURLOW, L. R., M. L. HANKE, T. FRITZ, A. ANGLE, A. ALDRICH, S. H. WILLIAMS, I. L. ENGEBRETSEN, K. W. BAYLES, A. R. HORSWILL UND T. KIELIAN. 2011. “Staphylococcus aureus biofilms prevent macrophage phagocytosis and attenuate inflammation in vivo.” Journal of immunology 186(11):6585–96.
TONETTI, M. S. UND J. SCHMID. 1994. “Pathogenesis of implant failures.” Periodontology 2000 4:127–38.
TRINDADE, R., T. ALBREKTSSON UND P. TENGVALL. 2014. “Foreign body reaction to biomaterials: On mechanisms for buildup and breakdown of osseointegration.” Clinical Implant Dentistry and Related Research: 1–12.
VEERACHAMY, S., T. YARLAGADDA, G. MANIVASAGAM UND P. K. YARLAGADDA. 2014. “Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review.” Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine 228(10):1083–99.
VERMA, R. K., S. RAJAPAKSE, A. MEKA, C. HAMRICK, S. POLA, I. BHATTACHARYYA, M. NAIR, S. M. WALLET, I. AUKHIL UND L.KESAVALU. 2010. “Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola mixed microbial infection in a rat Model of periodontal disease.” Interdisciplinary perspectives on infectious diseases 2010:1-10
WAGNER, C., S. AYTAC UND G. M. HÄNSCH. 2011. “Biofilm growth on implants: Bacteria prefer plasma coats.” The International journal of artificial organs 34(9):811–17.
WEBSTER, T. J., A A PATEL, M. N. RAHAMAN UND B. SONNY BAL. 2012. “Anti-infective and osteointegration properties of silicon nitride, poly(ether ether ketone), and titanium implants.” Acta biomaterialia 8(12):4447–54.
WENG, D., M. J. H. NAGATA, M. BELL, A. F. BOSCO, L. G. NASCIMENTO DE MELO UND E.-J. RICHTER. 2008.
VIII. Literaturverzeichnis 82
“Influence of microgap location and configuration on the periimplant bone morphology in submerged implants. An experimental study in dogs.” Clinical oral implants research 19(11):1141–47.
WETSCHER, A.-P. 2012. “Retrospektive Analyse ausgewählter Frakturen der Schultergliedmaße bei der Katze – Behandlung und Ergebnisse.” München, Ludwig-Maximilian-Universität, Zentrum für klinische Tiermedizin, Diss.
VAN WIJNGAERDEN, E., W. E. PEETERMANS, J. VANDERSMISSEN, S. VAN LIERDE, H. BOBBAERS UND J. VAN ELDERE. 1999. “Foreign body infection: A new rat model for prophylaxis and treatment.” The Journal of antimicrobial chemotherapy 44(5):669–74.
WILLBOLD, E. UND F. WITTE. 2010. “Histology and research at the hard tissue-implant interface using technovit 9100 new embedding technique.” Acta biomaterialia 6(11):4447–55.
WINDOLF, C. D., W. MENG, T. T. LÖGTERS, C. R. MACKENZIE, J. WINDOLF UND S. FLOHÉ. 2013. “Implant-associated localized osteitis in murine femur fracture by biofilm forming Staphylococcus aureus: A novel experimental model.” Journal of Orthopaedic Research 31(12):2013–20.
WODTKE, J. UND J. F. LÖHR. 2008. “Das infizierte Implantat.” Der Orthopäde 37(3):257–67.
WRIGHT, JOHN A. AND SEAN P. NAIR. 2010. “Interaction of staphylococci with bone.” International Journal of Medical Microbiology 300(2-3):193–204.
XU, K. D., G. A. MCFETERS UND P. S. STEWART. 2000. “Biofilm resistance to antimicrobial agents.” Microbiology (March):547–49.
YARWOOD, J. M. UND D. J. BARTELS. 2004. “Quorum sensing in Staphylococcus aureus biofilms.” Journal of bacteriology 186(6):1838–50.
YUE, C., B. ZHAO, Y. REN, R. KUIJER, H. C. VAN DER MEI, H. J. BUSSCHER UND E. T. J. ROCHFORD. 2015. “The implant infection paradox: Why do some succeed when others fail? Opinion and discussion paper.” European Cells and Materials 29:303–13.
VIII. Literaturverzeichnis 83
ZIJLSTRA, G.S., J. WOLTING, J. PROP, A. H. PETERSEN, W. L. J. HINRICHS, D. R. A UGES, H. A M. KERSTJENS, W. VAN DER BIJ UND H. W. FRIJLINK. 2009. “Efficacy of a new pulmonary cyclosporine A powder formulation for prevention of transplant rejection in rats.” Journal of Heart and Lung Transplantation 28(5):486–92.
ZIMMERLI, W., F. A WALDVOGEL, P. VAUDAUX UND U. E. NYDEGGER. 1982. “Pathogenesis of foreign body infection: Description and characteristics of an animal model.” The Journal of infectious diseases 146(4):487–97.
Danksagung 84
DANKSAGUNG
Ich danke Herrn Prof. André Bleich für die Übernahme der Arbeit für die Tierärztliche
Hochschule Hannover.
Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Prof. Kerstin Schwabe für die Überlassung des
Themas und die jederzeit hervorragende wissenschaftliche Betreuung. Ich möchte
mich für die stetige Hilfsbereitschaft und ihr Vertrauen bedanken, was zu so einem
tollen Arbeitsklima geführt hat.
Vielen Dank an Dr. Silke Glage für die Hilfe bei der Entwicklung des histologischen
Scores und für die ganze Zeit, meine anschließenden Fragen zu beantworten.
Herzlichen Dank an Dr. Andreas Winkel, der mir bei vielen Fragen sehr geholfen und
somit diese Arbeit unterstützt hat.
Ich bedanke mich bei Marly Dalton für die Anzüchtung und Konzentration der
Bakterien und für die jederzeit nette Unterstützung.
Ebenso gilt mein Dank der Abteilung Mikrobiologie des Institutes für
Versuchstierkunde und Zentralem Tierlaboratorium für die Überlassung des
rattenpathogenen Staphylococcus aureus Stammes.
Ich danke der gesamten Arbeitsgruppe der Experimentellen Neurochirurgie, dass sie
mich so nett aufgenommen hat, für eine tolle Arbeitsatmosphäre und die viele Hilfe.
Vielen Dank an Nadine John für die netten Gespräche und die wissenschaftliche
Unterstützung. Lieben Dank an Anne Beck, dass ich so oft zu ihr kommen konnte für
eine kurze Abwechslung und Motivation. Vielen Dank an Svilen Angelov für die nette
Tischnachbarschaft. Ebenso gilt mein Dank Jürgen Wittek und Monika van Iterson für
die jederzeit tolle Unterstützung.
Ich danke Claudia Feldbusch und Veronique Watzlaw für die immer sehr nette und
zuverlässige Betreuung der Tiere.
Ich danke Luzie Rettenbeck für die „fachfremde Korrektur“ meiner Arbeit, ihre
Danksagung 85
gesamte Unterstützung und die tolle Freundschaft.
Ich danke Alexandra Thoms, Uta Böttner, Maria Leurs, Eva Nordemann, Inga
Konieczny und Anna Tippe dafür, dass sie mich aufgeheitert haben, wenn es nötig
war. Dafür, dass sie mich abgelenkt haben, mir zugehört haben, mich unterstützt
haben und ich mich immer auf sie verlassen kann.
Ein großer Dank gilt meinen Eltern für die Unterstützung auf meinem Weg dorthin,
wo ich heute bin. Ohne sie wäre vieles nicht möglich gewesen.
Ich danke Triny und Onida für das Glück, das sie mir jeden Tag schenken.
Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Mann Frederic, auf den ich mich immer
verlassen kann und der mich unterstützt, unabhängig davon, was ich mir
vorgenommen habe, was bestimmt nicht immer leicht für ihn ist. Ich bin unendlich
dankbar dafür, dass er mein Leben jeden Tag aufs Neue so sehr bereichert.
Zuletzt danke ich „Biofabrication“ für die finanzielle Unterstützung meiner
Doktorarbeit.