890 H. Scn~O~ und E. I ~ o F : Zur Teehnik der Liquor-Einengung Klinische Wochenschrift

Z U R T E C H N I K D E R LIQUOR-EINENGUNG F~R DIE PAPIERELEKTROPHORESE Von

H. SCHR6EI~ und E. IMItOF ),us dem Physiologischen Insti~n~ der Universit~t

Einer h/~ufigeren Anwendung der Liquorelektro- phorese zu diagnostischen Zweeken stehen immer noch die technischen Sehwierigkeiten im Wege, die mit der notwendigen Eindickung der Riickenmarksflfissigkeit vor ihrer Verwendung zur Papierelektrophorese (P. E.) verbunden sind. Eine Zusammenstellung der ge- br/~uchlichen Anreieherungsverfahren finder sich in einer kfirzlich in dieser Zeitsehrift erschienenen Arbeit yon MU~E~T~An~ und MX~KX s. Beziiglich einer Ein- fiihrung in theoretische und methodisehe Einzelfragen

d e r Liqnor-P.E. sei eben- falls auf diese Arbeit and die ihr beigeffigte Literatur- iibersicht verwiesen.

Unter den zahlreichen vorgeschlagenen Anreiehe- rungsverfahren scheint sieh die Methode der Ultra- filtration durchgesetzt zu haben. G~I~S und Mitarb. ~ konnten nur mit dieser Methode reproduzierbare Ergebnisse erhalten. Es be- steht jedoehkeine Einigkeit darfiber, ob man zweck- m/il]iger mit ~ber- oder Unterdruck uttrafiltriert.

Die Vakuum]iltration bietet im Gegensatz zur Druckfiltration die Mbg- ]iehkeit, w/~hrend des Fil- trationsvorganges das Vo-

Abb, 1, Querschnit,~ dutch das verwendeteDzuckfiltrationsgeriit, l u m e n des Liqnorkonzen- 1 l~£etalldruckschlauch zum An- t rats fiber dem Filter zu schluBanStickstoffbombe.2~Jber- beobachten und somit bei wurfmutter. 3 Einfilllstutzen.

Druckglocke. 5 Schraubring zur bekanntem LiquoreiweiB- Verschraubung yon Druckglocke geha]t auf die EiweiBkon- und Ablaufstutzen, 6 Gummi- dithering, 7 ltlutdenf6rmig vet- zentration des eingeengten tiefte Siebplatte (Durchmesser Liquors zu sehlieBen. der Filtrieril~iche 35 ram), 8 Ab- Die Druck/iltration ist

laufstutzen. 9 S~ativ. 10 ~eSzylinder dennoeh aus Grfinden der

]eichteren t tandhabung und der betrgcht]ichen Zeitersparnis der Vakuumfiltration vorzuziehen. Die im folgenden besehriebene, yon uns seit langem mit gutem Erfolg gefibte Anreieherungs- methode, deren wesent]icher Bestandteil die Verwen- dung friseher Ko]lodiumdoppelmembranen zur Druek- filtration ist, scheint uns den geforderten Anspriichen zu geniigen. Das Verfahren enthglt keine grund- siitzlichen methodisehen Neuenmgen und ist in dieser Form zur routinemiiBigen Ausffihrung im klinischen Laboratorium geeignet.

2~f ethodik Als UItra]ilter werden doppelschichtige Kol]odiummembra-

non eigener tIerstellung verwendet: Eine 4%ige L6sung yon Kollodium in J~ther * wird in eine trockene Petri-Schale mit glattem Boden yon etwa 15 em Durehmesser gegossen, so dab die Flfissigkeit den Seh~lenboden in dicker Sehicht bedeckt. Zur Beseitigung eventuetI ents tandener Luftbli~sehen schwenkt

• Kollodiam ~fir medizinische Zwecke, 4%, DAB 6 (E. i~erck, Darm- stadt),

Wfirzburg (Direktor: Prof, Dr. Dr. E. WbHLISCH)

man die Sehale rasch einlge Male hin und her und lgBt dann sofort die Lbsung bei zun~chst sehr~g, dann senkrecht gehaL toner Sehale wieder in die I(o]lodiumflasche zurfickfliel~en bzw. -tropfen. Nach etw~ 3 rain ist der ~ t h e r ~us dem am Boden der Schale zuriickgebliebenen Kollodiumfilm ver- dampft . Zur Anfert igung einer zweiten Ko]lodiumschicht, welche der ersten unmi t te lbar aufliegen soil, wird die gieiche Manipula~tion in derselben Petri-Schale wiederholt. Wichtig ist, d~B die Vorg~nge des EingieBens, Schwenkens und Aus- gieBens rasch aufeinander folgen. Ungef~hr 5 rain nach dem letzten AbgieBen der Kollodiumlbsung wird die angetrocknete Doppelmembran durch Aufspfilen yon reichl]eh Aqua dest. vom Sch~tenboden abgel6st, vorsichtig aus der Sehale heraus- gehoben und in ein Gefi~$ mi t destiliiertem ~Vasser getaucht , worin sie his zu ihrer Benutzung aIs Ultraffl ter verbleibt. Die iV~embran sol] in frischem Zustande, ~lso mbglichst im AnschluB

• an ihre Herste]lung, verwendet werden.

Zur Druck]iltration bedienen wir uns des Druckfil trations- ger~tes MD 70/15 der Membranfiltergesellschaft Gbttingen, aus dessen einfzchem Aufbau (Abb. 1) die Handhabung aueh ffir den Ungefibten leicht zu ersehen ist. Vor dem Auflegen der Kol]odiumdoppelmembran muB der Boden der Siebplatte mi t einem feuchteu Fil tr ierpapier bedeckt werden, ])er iiber- stehende Rand der Membr~n wird mi t einer Schere abge- sehnitten, l~ach dem Aufsetzen der Druckglocke werden Ober- und Unter te i l der eigentlichen ~i l t r iervorr ichtung mittels Schraubring lest mi te inander vel~cbra.ubt. Man fiil]t da, n a den Liquor dureh einen ~n der..Druckgloeke angebrachten FiilI- stutzen ein. Der wirksame Uberdruek yon 10 Arm. wird nach VersehlieBen des Ffillstutzens durch AnschluB einer Stiekstoff- bombe an die Druekglocke des Ger~tes erzielt. Das abgepreBte Filtrat soll so lange in einen kleinen l~IeBzylinder abtrop~en, bis das Filtratvolumen dem ¥olumen des eingefiillten Liquors entspricht. ])ann l/~$t man sofort den Stiekstoff durch den Fiillstutzen ab. ])as Ultrafilter ist dann immer noch gut durch- feuchtet und enth/flt in seiner Mitre, fiber der mulden~Srmigen Vertiefung der Siebpl~tte, in der Regel noch eine Spur frei beweglicher Fliissigkeit. 20 cm a Liquor passieren das Filter in etwa 30 rain. Bevor man d~s Filtr~t verwirft, wird es mit S~ure ~uf EiweiBfreiheit geprfift.

Die Kol]odiummembran wird nach Beendigung der Fil- tration dem Ger~t vorsichtig entnommen, zusammen mit 0,1 cm a der zur P.E. verwendeten Pufferlbsung in ein spitzes Zentrifugenglas gebraeht und w&hrend etwa 5 rain mit einem Glasst~b mehrm~ls kr&ftig ausgepreBt. Das fiberstehende Eluat ha.t d~s Aussehen und eine/~hnliche E~weiBkonzentration wie normales Serum. Es kann in tier iiblichen Weise zur P. E. verwendet werden; im al]gemeinen genfigen 0,01 em a.

Versuche zur Methodik

l~aehdem sich in Vorversuchen gezeigt hatte, da, B bei Verwendung der beschriebenen doppelsehichtigen Kollodiummembranen eiweiBfreie Filtrate erhalten werden, wurde zur Priifung der Gen~uigkeit der Me- rhode 1:100 verdiinntes Serum dureh Druekfiltration und naehfolgende Elution rekonzentriert, das l~e- konzentrat naeh der ~ethode yon G~ASS~A~WN und HA~m papierelektrophoretisch aufgetrennt und mit dem Pherogramm des gleichen, aber nicht behandelten Serums verglichen. Die Auswertung der mit Amido- schwarz angef/~rbten Streifen erfolgte mit dem auto- matischen Auswertger~4 der Firma Bender & Hobein, Mfinchen. Aus den in Tabelle 1 zusammengestellten Werten ist zu ersehen, dub die Verteilung der elektro- phoretischen EiweiBfraktionen des nativen Serums mit der Verteilung der Fraktionen im Pherogramm des re- konzentrier~en Serums im Rahmen der Fehlerbreife der Methodik fibereinstimmt. Es zeigte sieh auBerdem, dab die prozentuale Verteilung der Serum-EiweiB-

Yg. 85, I~eft 17 Kurze wissenschaftliche Mitteilungen 891 1. September 1957

Tabelle I

S ll, S I- tL

! i 1,061. 4,01 ,817,91 8,4 9,6 9,9116,9115,7 9,8!61;: 13,6 3,919,6 9,5 10,1 10,5115,7!15,0

62,9 62,01331 3,818,81 10,0 11,6 10,6] 14,0 15,7

Drei versehiedene Seren warden je 12mal papierelektro- phoretiseh aufgetrennt und aasgewertet. Spalte S (Serum) enthMt die Mittelwerte dieser 12 Bestimmungen in Prozent des Serumeiweii~gehatges.

Jedes der 3 Seren wurde 1:100 mit Veronal-Natrinm- Natrinmacetatpuffer (pH8,6; # = 0 , 1 ) verdi~nnt, mittels DrueMittration rekonzentriert und ebenfalls 12real elektro- phoretiseh aufgetrermt und ausgewertet. Spalte R (Rekonzen- trat) enthMt die Mittelwerte dieser 12 Bestimmnngen.

frakt ionen nieht yon der Gr613e der Eiweigkonzentra- t ion des Eluats abhgngt . Die quantita.tiven Eiweil3- bes~immungen wurden mit~ dem Kjeldahl-Verfahren durehgeifihr?~; der EiweiggehMt ~vnarde aus der Diffe- renz zwisehen Gesamtsfiekstoff und Restst ickstoff er- nlittelt..

Ergebnisse aus je 5 Papierelektrophoresen zweier Liquores naeh einzeln erfolgter Anreieherung mi~tels Druckfi l t raf ion zeigt Tabelle 2 (Angaben in Prozent des LiquoreiweiggehMtes). Ein Vergleieh der fiinf ge- t renn t bes t immten Werte jeder Frak t ion 1/iBt bei bei- den Liquores eine weitgehende Ubereins t immung er- kermen.

Tabelte 2

V.-F. Albumin

Liquor I 3,9 50,2 4,0 50,5 3,9 51,8 4,2 49,4 3,7 49,3

Liquor I I 2,6 47,1 2,9 46,4 2,5 47,9 2,8 48,2 2,4 47,7

5,5 9,6 5,0 10,5 5,2 9,8 5,4 10,2

6,0 13,7 5,8 14,2 5,5 14,4 6,2 13,9 6,5 13,1

17,9 16,7 18,1 18,4

18,3 17,9 18,7 17,5 16,9

5,6 7,2 5,3 7,9 4,2 7,6 5,7 7,8 5,2

6,0 6,3 6,3 6,5 5,4 5,6 5,5 5,9 6,6 6,8

Disku~sion Die Druekfi l t rat ion kann naeh unseren Erfahrun-

gen in der besehriebenen Form ohne Bedenken zur Anreieherung yon Liquor eerebrospinMis oder anderen eiweiBarmen Flfissigkeiten verwendet werden. Das Verfahren k o m m t den Bedfirfnissen des Krankenhaus- laboratoriums aus folgenden Griinden entgegen:

1. Die Anreieherung dutch ~be rd ruek beansprueht erheblieh weniger ZeR als die Vakuumfil trat ion.

2. Da keine P u m p e benS~ig~ wird, verl/~uf~ die Pi l t raf ion vSltig ger/~usehlos.

3. Die Methode karm yon teehnisehem I~Ifsperso- nal verhglt, nismgl~ig teieh~ ausgeffihrt werden; die Her- stellung der Kol lodiumdoppelmembranen effordert n u t geringe Einiibung.

4. Da die Gefahr einer Ein t roeknung des Liquors auf dem Filter innerhalb der no~wendigen Filtrations- dauer nieht besteht, erfibrigen sich EiweiBbestimmun- gen zur Kontrolte der Einengung.

Der bei jeder Ul~rafil~rafion yon EiweigI6sungen unvermeidliehe Eiweigverlust, der dm'eh Haf~enblei- ben kolloider Teilehen im Filter verursaeh~ wird, muB setbstversff/ndlieh aueh bei der bier besehriebenen Methode in Kauf genommen werden; er verursaeh~ abet keine fehlerhafte Auswertung, da sieh der EiweilL verlust auf alle Frakt ionen gleiehmgl~ig ausMrk t (vgl. auehL ~, s, ~).

Zu~ammen/assung. Es wird fiber elue einfaehe Methode zur Einengung yon Liquor eerebrospinalis und anderen eiweiflarmen ~tiissigkeiten durch Druck- Ultraff l t rat ion berichtet , die sich zur routinem/~t3igen Durchff ihrung im klinischen Labora~orium eignet. Wesentlich zur Erzielung kurzer Fil trat ionszeiten und tines eiweiBfreien Filtrates ist dabei die Verwendung frischer Kollodiumdoppelmembranen. Die Braueh- barkeit der Methode wird durch Versuche belegt und diskutiert.

Literatur. ~ AI,~, F. W.: Zur Methodik der Papierelektro- phorese des Liquor eerebrospinalis. Diss. Marburg 1952. - - 2 B~em~, T]~., D. MATZELT U. D. P~T:rE: t(hn. Wschr. 1952, 325. - - ~ Ew~B~eK, H.: Klin.]Vsehr. 1950, 692. ---~ GR~s, G., ~ . W . ALYU. H . F . OLDE~2~S:I~AVSEN: K] in . Wschr. 1953, 644. - -

~ s , H.-J. :Klin. Wsehr. 1958, 1 5 9 . - ~ MU~E~T~n~, M., u. If. MXRKI sen. : Klin. Wschr. 1957, 1.

K U R Z E W I S S E N S C H A F T L I C H E M I T T E I L U N G E N

ZUR BIOLOGISCHEN WIRKUNG IN 15 c~-STELLUNG OXYDIERTER PROGESTERONDERIVATE

Yon F. I~o~r~-s~ nnd H. ~VEr~E~C~

Aus den Wissenschafttichen Labora~orien des ¥EB ffenupharm, Jena

(Eingegangen am 12. Juni 7957)

~ber die mikrobielle Oxydation yon Progesteron in 15~-Stellung wurde in der Literatur ~ berichtet. Von unserer Arbeitsgruppe wurde kfirzlich mitgeteil~ ~, dal~ diese Umset- zung aueh mit einigen Fusarienst&mmen zu erzielen ist. Zur biotogisehen Wirkung dieser Substanzen ist nach unserer Kennt~fis bislang nichts verfffentlicht.

Wit untersuehten 15 c¢-Oxyprogesteron (I), 15 c~-Oxypro- gesteronaeetat (II) und 15-Ketoprogesteron (III) vergleiehend zu Progesteron (IV) als Standardsubst~nz an Kaninchen (~Veil]e Wiener). Die Substanzen warden intramuskut/~r und oral appliziert, wobei technisch so vorgegangen wurde, wie kiirzlich yon PINccs et al.~ beschrieben; die Auswertung er- ~olgte nach MeP~rAmL Es warden yon I - - I I I 2,0; 4,0; 10,0 und 20,0 rag/Tier bzw. 50,0 mg oral gegeben; IV wurde mit

0,5; 1,0 und 2,0 mg dosierb. Bis znr Dosis yon 10,0 mg/Tier zeigten I I und I I I keine ges~agene Wirkung, I war bei 10 rag/ Tier deutlich wirksam (2 + naeh McPmtm). Oral waren alle Substanzen unwirksam.

Bei Anwendung der Technik yon ttOOK~R und FORBES ~ zeigten jedoch I - - t I I Aktivitaten, welehe der Wirksamkeit des Standards IV entsprachen (Injektionsvolumen 0,0005 ml, deutliehe Wirkung noch bls 0,0001/~g). Dieser ~efund seheint mit den geltenden Ansichten fiber die Spezffita~ beider Metho- den nicht rech~ vereinbar. ZA?CDER et al. 6 haben jedoch kfirzlich in dieser Zeitschrif% mitgeteflL dal~/£hnllche Diskre- panzen auch bei der Untersuchung yon Z4-3-Ke%opregnen- 20fl-ol beobaehtet werden konnten.

Literatur. I FI~I~D, J., R. W. T~to~IA, D. PXt~LMAX, J .E . Hxl~z and A. BO~AN: Recent ProgL in Hormone ~es. 11, 149 (1955). - - ~ KL~GE~, B., R. S I ~ T u. A. SO~tmE~T: Naturwiss. 44, 40 (1957). - - 3 PI~cVs, G., M. C. CHA~-G, M. X. ZA~ROW, E. S. E. H ~ z ~nd A. MERILL: Endocrinology 59, 695 (1956). - - ~ MCPHAIL, M. K. : J. of Physiol. 83, 145 (1934).

HooJ~E~, C. W., and F. R. FORBES: Endocrinology 41, 158 (1947). - - e ZAPPEd, J., T. R. FORBES, R. NmtEI~ u. P. DESAVLL~S: Klin. Wsehr. 1957, 143.