-Allgemeine Aspekte -Spezielle Aspekte Hämostasediagnostik Hannover, November 2005

- Allgemeine Aspekte

- Spezielle Aspekte

Hämostasediagnostik

Hannover, November 2005

Allgemeine Aspekte

- Testsystematik

- Qualitätssicherung

- Befundinterpretation

Testsystematik

- Phänotyp-Analytik- Funktionelle Testverfahren- Strukturelle Testverfahren

- Genotyp-Analytik- DNA-basiert- RNA-basiert

Funktionelle Testverfahren

- Funktionelle Testverfahren bestimmen die biologische Aktivität eines Analyten.

- Testmatrix: Vollblut, plättchenreiches Plasmaoder plättchenarmes Plasma

- „Read-out-System“:- turbidometrisch- koagulometrisch- amidolytisch

Thromboplastinzeit

Messprinzip: koagulometrisch

Messparameter: Fibrinbildung

Messgröße: Gerinnungszeit in Sek.

Befundmitteilung: in Prozent bezogen auf Normalplasma

Prothrombin-Ratio

International normalized ratio (INR)

Prothrombin-Ratio = Patientenwert

Normalwert

INR = Prothrombin-RatioISI-Wert

ISI = International Sensitivity Index

0

1

2

3

4

5

6

0 25 50 75 100 125 150

Quick-Wert (%)

INR

Korrelation „Quick-Wert“ und INR

Koagulometrisches Testverfahren

Thrombin

Fibrinogen Fibrin

Messparameter: Fibrinbildung

Amidolytisches Testverfahren

H-D-Phe-Pip-Arg-pNA pNA

Thrombin

Messparameter: Hydrolyse eines Peptidsubstrats

0

50

100

150

200

250

0,001 0,01 0,1 1 10

Thrombinkonzentration (U/ml)

Ger

inn

un

gsz

eit

(s)

Thrombinbestimmung: koagulometrisch

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0,001 0,01 0,1 1 10

Thrombinkonzentration (U/ml)

Del

ta O

D (

405

nm

)

Thrombinbestimmung: amidolytisch

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 2 4 6 8 10

Time after TF (min)

T-A

T c

om

ple

xes

(ng

/ml)

TF-induced thrombin formation

clot formation

Amidolytische Testverfahren

Amidolytische Testverfahren

- sind eine Alternative zu koagulometrischenVerfahren.

- ermöglichen kinetische Untersuchungen Endogene Thrombinbildungspotenzial.

Testsystematik

- Phänotyp-Analytik- Funktionelle Testverfahren- Strukturelle Testverfahren

- Genotyp-Analytik- DNA-basiert- RNA-basiert

Antigenteste

Definition:Antigenteste messen die Konzentration und/oder die molekulare Struktur eines Analyten.

Beispiele:ELISA-VerfahrenElektrophoresetechniken/Western-BlotHPLCDurchflusszytometrie

Sandwich-ELISA: Prinzip (1)

Fänger-Ak

Mikrotiterplatte

Sandwich-ELISA: Prinzip (2)

Fänger-Ak

Mikrotiterplatte

Antigen

Sandwich-ELISA: Prinzip (3)

Fänger-Ak

Mikrotiterplatte

* *Detektions-Ak

Antigen

Sandwich-ELISA: Prinzip (4)

Fänger-Ak

Mikrotiterplatte

* *Detektions-Ak

Antigen

Substrat Farbstoff

Allgemeine Aspekte

- Testprinzipien

- Qualitätssicherung

- Befundinterpretation

Testvalidität

- Eignung des Tests für die klinische Diagnostik.

Testvalidität: Parameter

- Präzision (RiLiBÄK)

- Spezifität

- Sensitivität

Testpräzision

Intra-assay Varianz: Schwankungen eines Messwertes innerhalbeiner Messserie.

Inter-assay Varianz: Schwankungen einesMesswertes von Seriezu Serie.

Testsensitivität: Definition

Die Testsensitivität ist definiert als die

Wahrscheinlichkeit mit der erkrankte

Personen vom Test als krank erkannt

werden.

Krankheits- Testergebnisstatus

positiv negativ

positiv richtig positiv falsch negativ

negativ falsch positiv richtig negativ

Testvalidität

Testsensitivität: Definition

Sensitivität =RP

RP + FN

RP = richtig positiv, FN = falsch negativ

D-Dimer und DVT-Diagnostik

Test Sensitivität Negativer prä-(%) diktiver Wert

Elisa 97 96Vidas-DD 98 98Latex-Assay 83 92Simplired 85 92

Perrier A, Bounameaux. Thromb Haemost 2001; 86: 475 - 487

Testspezifität: Definition

Die Testspezifität ist definiert als die

Wahrscheinlichkeit mit der gesunde

Personen vom Test als nicht krank

erkannt werden.

Krankheits- Testergebnisstatus

positiv negativ

krank richtig positiv falsch negativ

gesund falsch positiv richtig negativ

Testvalidität

Testspezifität: Definition

Spezifität =RN

RN + FP

RN = richtig negativ, FN = falsch positiv

Testvalidität

- Eignung des Tests für die klinische Diagnostik.

- Evidence-based diagnostics

EBD: Bewertungen

Das Ergebnis des diagnostischen Verfahrens ist ...

Level 1: diagnoseentscheidend und therapierelevant.

Level 2: diagnoseentscheidend oder therapierelevant.

Level 3: diagnosehinführend.

Level 4: zur Diagnostik und Therapie ungeeignet.

Qualitätssicherung: Ziele

- Erkennen von Einflüssen, die unab-hängig von dem Messparameter dasTestergebnis beeinflussen.

- Sicherung einer gleichbleibendenErgebnisqualität.

Einflussgrößen

Einflussgrößen beeinflussen das Messergebnis

unabhängig von der eigentlichen Messgröße.

Einflussgrößen

- Physiologische Einflussgrößen

- Methodische Einflussgrößen(Analytische Störgrößen)

Analytische Störgrößen

- Präanalytische Fehler

- In-process Fehler

- Interpretationsfehler

Präanalytische Störgrößen

- Art der Blutabnahme

- Verhältnis Blut : Antikoagulanz

- Art des Antikoagulanz

Anti-FXa-Bestimmung: Antikoagulanz

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5

CTAD-antikoaguliertes Plasma

Cit

rat-

an

tik

oa

gu

liert

es

Pla

sm

a

Anti-FXa-Bestimmung: Antikoagulanz

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5

CTAD-antikoaguliertes Plasma

Cit

rat-

an

tik

oa

gu

liert

es

Pla

sm

a

Analytische Störgrößen: Beispiel aPTT

Präanalytische Fehler: Abnahme in SerumröhrchenAbnahme aus Heparinzugang

In-process Fehler:Fehlende Zugabe von CalciumchloridVerzicht auf Präzisionskontrollen

Interpretationsfehler:Interpretation bei fehlendem Referenz-bereich

Physiologische Einflussgrössen

- Alter

- AB0-Blutgruppe

- Akute-Phase-Reaktion

- Geschlecht

Parameter BlutgruppenA/B 0

vWF-Ag: 64 – 150 % 46 – 125 %

RiCof: 65 – 165 % 50 – 130 %

CBA: 69 – 116 % 61 – 121 %

vWF-Parameter: Referenzbereiche*

* IHT Uniklinikum Bonn

Referenzintervall*: Definition

- Das Referenzintervall bildet die bio-logische Streuung eines Messpara-meters in einer definierten Popula-tion ab.

- Die obere und untere Grenze des Referenzintervalls wird durch das 95% Konfidenzintervall bestimmt.

* Synonym: Referenzbereich

X

- 2s + 2s95 %

Referenzgrenzen: Bewertung

Referenzwerte

- Referenzstichprobe

- Referenzintervall

- Referenzgrenzen

Referenzstichprobe: Selektion

Induktiv:Ausgewählte Population ohne Krankheits-merkmale (Blutspender, Krankenhausper-sonal)

Deduktiv:Unselektierte Patienten bilden das Basis-material. Durch Ausschlusskriterien wirddas Kollektiv der „nicht kranken“ ermittelt.

Mathematisch:„Bhattacharya Plot“

Referenzstichprobe: induktiv

Population: 100 gesunde Blutspender50 Frauen/ 50 Männer

Berechnung: 95 % Konfidenzintervall*

* Fast alle Hämostaseparameter sind nicht normalverteilt.

Referenzstichprobe: Deduktiv

Parameter: D-Dimer als Thrombose-indikator

Basiskollektiv: Patienten mit thrombose-typischer Symptomatik

Selektionskriterium: bildgebende Diagnostik

Allgemeine Aspekte

- Testprinzipien

- Qualitätssicherung

- Befundinterpretation

Transversalbeurteilung

Wert in Bezug zum Referenzintervall:

- innerhalb: gesund?

- außerhalb: pathologisch?

Entscheidungsgrenzen

- Entscheidungsgrenzen korrelieren eine klinische Symptomatik mit ein-em Messwert.

- Entscheidungsgrenzen können nur an einem Kollektiv von erkrankten Personen ermittelt werden.

- Entscheidungsgrenzen und Referenz-grenzen sind nicht deckungsgleich.

Entscheidungsgrenzen: Beispiel

Parameter: FVIII-Aktivität

Referenzintervall: 60 – 150 %

Entscheidungsgrenze:

- Hämophilie: < 30 %

- Thrombophilie: > 250 %

Messwert

Bewertungsalgorithmus: Laboranalytik

laborinterne Qualitätskontrolle

fehlerfrei

Freigabe Fehlersuche

Arzt informierenWiederholung

ärztliche Befundung

ja nein

Qualitätskontrolle & Referenzintervall

Unpräzision von Tag zu Tag:- höchstens 1/8 des Referenzintervalls- besser 1/12 des Referenzintervalls

Beispiel: aPTT (26 – 34 s)- 1/8 1 s- 1/12 0,7 s

freigegebener Messwert

Bewertungsalgorithmus: Laboranalytik

Innerhalb des

Referenzbereichs

Verlaufs-kontrolle

Krankheits-bezug

ja nein

Bezug zu Vorwerten

Normal-wert

ja nein

Klinisch-relevant

Klinisch-nichtrelevant

ja nein

180.000/µl

Beispiel: Thrombzytenzahl

Referenzbereich:150.000 – 300.000/µL

Verlaufs-kontrolle

Krankheits-bezug

ja nein

Bezug zu Vorwerten

Normal-wert

ja nein

Klinisch-relevant

Klinisch-nichtrelevant

ja nein

Beispiel: Thrombozytenzahl

Klinischer Verlauf:- Beginn Heparintherapie vor 5 Tagen

Ausgangswert: 290.000/µl

Aktueller Messwert: 180.000/µl

Bewertung: V. a. relative Thrombozytopenie

- Allgemeine Aspekte

- Spezielle Aspekte

Hämostasediagnostik