1 Aktuelle Aspekte der Zöliakie Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie...

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Aktuelle Aspekte der Zöliakie

Herbert Wieser

Deutsche Forschungsanstaltfür Lebensmittelchemie

Lichtenbergstr. 4, 85748 Garching

in Zusammenarbeit mit der

Europäischen Arbeitsgruppe für die Prolaminanalyse und -toxizität

und den

Partnern des BMBF-Leitprojekts „Zöliakie“

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Definition

Zöliakie = Einheimische Sprue = Glutensensitive Enteropathie:

Lebenslange Intoleranz gegenüber Speicherproteinen (Gluten) aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer (?), die mit einer schweren Schädigung der Dünndarmschleimhaut (Zottenatrophie) einhergeht und zur Malabsorption von essentiellen Nährstoffen führt

Darmzottennormal zöliakiegeschädigt

3

Symptome/Therapie

Häufige Symptome

Durchfälle Anämien

Erbrechen Avitaminosen

Leibblähungen Knochenschmerzen

Blässe Osteoporose

Gedeihstörungen Muskelschwund

Wesensveränderung Gewichtsverlust

Lebenslange strikte „glutenfreie Diät“

= keine Produkte aus Weizen, Roggen,

Gerste und Hafer außer reiner Stärke

(Tägliche Aufnahme von Gluten < 20 mg)

Therapie

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Chronik der Zöliakie

200 a.d. Patienten mit chronischem Durchfall = „koiliakos“

1888 Beschreibung der Zöliakie, Behandlung durch Diät

Toxische Wirkung von „Gluten“ „glutenfreie Diät“1950

1959

1960

1961

1970/71

1984/88

1997

Peptisch-tryptisches Glutenhydrolysat = toxisch

Zöliakie und Einheimische Sprue = identische Krankheit

Diagnose durch Dünndarmbiopsie

Toxizitätsprüfung von Proteinen (in-vivo, in-vitro)

Strukturaufklärung toxischer Peptide

Gewebetransglutaminase = Autoantigen

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Diagnose

Empfehlungen der ESPGAN

1970

Symptome

1. Biopsie

Atrophie

glutenfreie Kost

keine Beschwerden

glutenhaltige Kost

3. Biopsie

Atrophie

Diagnose „Zöliakie“

1990

Symptome

1. Biopsie

Atrophie

glutenfreie Kost

Diagnose „Zöliakie“

IgA anti-Gliadin +

IgA anti-TG +

2. Biopsie

Regeneration

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Aktuelle Aspekte

• Häufigkeit

• Antigen „Gluten“

• Autoantigen „Transglutaminase“

• Mechanismus

• Analytik

• Toxische Strukturen

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Häufigkeit

1 : 200

Eisberg-Modell nach Logan (1991)

Familien = 1 : 10, weiblich: männlich = 2:1

Genetische Disposition (HLA-DQ2) = 1 : 5

1) Diagnostizierte Zöliakie

2) Nicht-diagnostizierte Zöliakie (flache Mukosa)

3) „Latente“ Zöliakie (normale Mukosa, erhöhte Ig-Werte)

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Klassifizierung der Getreidemehlproteine

Weizenprolamine = GLIADINE

Weizengluteline = GLUTENINE

Gliadine + Glutenine = GLUTEN (Kleber)

Stoffwechselproteine Speicherproteine

wasserlöslich salzlöslich alkohollöslich unlöslich

ALBUMINE GLOBULINE PROLAMINE GLUTELINE

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Aminosäurezusammensetzung der Prolamine

mol-% (Ausschnitt)

(Wieser et al., 1980)

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Homologe Gruppen der Speicherproteine

Gruppe Mrx10-3 Weizen Roggen Gerste

HMW 67-88 HMW-Glutenine (G) HMW-Secaline (G) D-Hordeine (G)

MMW 34-55 -Gliadine (P) -Secaline (P) C-Hordeine (P)

LMW 28-39(70)

-Gliadine (P)-Gliadine (P)LMW-Glutenine (G)

--40k-Secaline (P)-75k-Secaline (G)

--Hordeine (P)

B-Hordeine (G)

HMW = hochmolekular (P) = ProlamineMMW = mittelmolekular (G) = GlutelineLMW = niedermolekular

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2-Dimensionales Modell eines -Gliadins

HA

II

VV

NH

IA

L

H H H Q Q Q Q Q Q P S

S

Q

VS

YQ

QP

QE

QY

PS

GQ

VS

FQ

SS

QQ

NP

QA

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SV

Q

PQQLPQFQEI

R

NL

AL

QT

LP

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QC

S

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PI

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LQ

Q

C

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YI

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YC

CL

QQ

LQ

QY

SS

QQ

LVQS

SAH

AI

NQ

QL

V

VD

R C

TT

I

A P F GI

FGS

TN

R

120 15

015

1

241

163 24

925

0

262

200

H

M

P

P

Q

Q Q

QM

L

Q

Q

P

Q E

QL

QPP V

VR

V

PV

QQ

PF

QG Q FE

PP

PY

PQ QH

PF

PQ QS

PY

PQ

PQ

PF

PP Q L

PY

TQ PQ

PF

PQ

QP

Y PP

Q

Q PQ

PY

Q PQ

PQ

I QS Q AQ Q Q QQ Q QQ Q T QL Q LI Q QQ IL

Q PN

SQ

QP

Q

Q

(Müller, Wieser 1997)

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Toxizität der Kleberproteine

-/+

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Toxizität von Hafer

1995 Finnische Studie(Janutuinen et al.)

92 Zöliakiekranke, 6-12 Monate

45: ca. 50 g Hafer pro Tag

47: 0 g Hafer pro Tag

Biopsie

Ergebnis: nicht toxisch !

1996 Irische Studie I(Srinivasan et al.)

10 Zöliakiekranke, 3 Monate

50 g Hafer (Kölln) pro Tag

Biopsie, immunol. Unters.

Ergebnis: nicht toxisch !

2003 Norwegische Studie(Lundin et al.)

19 Zöliakiekranke, 3 Monate

50 g Hafer pro Tag

Biopsie, immunol. Unters.

Ergebnis:

1 Patient: Villusatrophie

5 Patienten: -Interferonanstieg

2003 Irische Studie II(Kilmartin et al.)

17 Zöliakiekranke

Gewebekultur-Test

PT-Avenin, PT-Gliadinimmunol. Untersuchung

Ergebnis: nicht toxisch !

Bis 1995 umstritten

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Autoantigen Gewebetransglutaminase (tTG)

tTG2) R-CO-NH2 + H2O R-CO-OH + NH3

tTG1) R-CO-NH2 + H2N-tTG R-CO-NH-tTG + NH3

LQLQPFPQPQLPY

LQLQPFPELPY

LQLQPFPQLPY

H2N-tTG

(Fleckenstein et al., 2004; Wieser et al., 2004)

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Hypothesen zum MechanismusEnzymdefekte (Peptidasemangel)

Lektinartige ReaktionenAdenovirus-12-Infektion

Primäre (Auto-) Immunreaktionen(Glutenpeptide/ Transglutaminase)

(Schuppan, Dieterich, 1999)

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Ausgangslage

A. CODEX STAN 118-1981:

Bestimmung des N-Gehaltes (Kjeldahl)

Grenzwert: 0,05 % N in der TM

B. Draft Revised Standard (2000)

Extraktion mit 60 %igem Ethanol ELISA

Grenzwert: 20 mg Gluten/kg TM (von Natur aus „glutenfrei“)

200 mg Gluten/kg TM („glutenfrei“ gemacht)

Gluten = 2 x Prolamin

C. Codex Food Labelling Standard (2006 ?)

Gluten = Allergen; Grenzwert 0

Prolaminstandard, Antikörper, erhitzte Lebensmittel, Hydrolysate

Probleme

Analytik „Gluten“

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ELISA-Kit „Gluten“ (Skerritt u. Hill, 1991)

Kalibrierkurven für Gliadine verschiedener Weizenarten(Wieser, Seilmeier, 1999)

18

Herstellung eines Gliadinstandards

Weizenkörner

Lipide

AlbumineGlobuline

Rohgliadin

Gliadin

Standard

vermahlen, entfetten

Salzextraktion

60 % Ethanol

Ultrafiltration,Lyophilisation

Chemische CharakterisierungZertifizierung (IRMM)

500 g

(E. Berghofer, Wien; R. van Eckert, Graz; H. Wieser, Garching)

30 kg

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Herstellung eines Antikörpers/ELISA

Immunogen: Roggenprolamine (Secaline)

Antikörper: monoklonal (R5)

ELISA: Sandwich (R5 + R5-Meerrettichperoxidase)

Spezifität: Gliadin, Secalin, Hordein (kein Avenin !)Epitop: - QQPFP -

Nachweisgrenze: 3,2 µg Prolamin /kg

Wiederholbarkeit: 7,7 %

Reproduzierbarkeit: 8,1 %

(Valdes et al., 2003)

20

Analyse von erhitzten Produkten (1)Einfluss von 2-Mercaptoethanol auf die

Kalibrierkurve des Gliadinstandards im R5-ELISA

(Garcia et al., im Druck)

21

Analyse von erhitzten Produkten (2)

60 % EtOH 2-ME + GUA

M = Mehl = 100 %

Wiederfindung von Gliadin in erhitzten Weizenteigen

°C °C

22

Analyse von erhitzten Produkten (3)

Probe Zusatz Gliadina Gliadin (EtOH) Gliadin (2-ME+GUA)

mg/kg mg/kg % mg/kg %

Maisbrotb Nr.

1 145,0 57,5 40 144,5 100

2 65,5 21,0 32 61,0 93

3 156,0 48,0 31 153,5 98

4 107,0 35,5 33 100,0 93

5 80,5 27,5 34 76,5 95

6 27,0 12,0 44 26,0 96

7 34,5 13,0 38 32,5 94

8 140,0 54,5 39 127,5 91

9 0,0 <1,5 - <1,5 -

10 0,0 <1,5 - <1,5 -a Gliadinstandard IRMM-480; Angaben entsprechen Gliadinprotein (= 86,4 % der Substanz).b Aus 10 g Mehl hergestellt und 10 min bei 240 °C verbacken.

Wiederfindung von Gliadin in Maisbrot

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Zusammenfassung Analytik

• Mit dem monoklonalen Antikörper R5 werden die Prolamine von Weizen, Roggen und Gerste mit hoher Spezifität und

Empfindlichkeit quantitativ erfasst.

• Der kombinierte Einsatz von 2-Mercaptoethanol und Guanidin erlaubt die vollständige Extraktion der Prolamine auch aus

erhitzten Produkten; die Effizienz des Antikörpers wird durch das Extraktionsmittel nicht beeinträchtigt.

• In naher Zukunft wird ein zertifizierter Gliadinstandard zur Verfügung stehen.

• Das entwickelte ELISA-System wurde in einem internationalen Ringtest erfolgreich getestet und vom „Codex Commitee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS)“ anerkannt. Seit kurzem sind kommerzielle Testkits erhältlich.

• Haferprolamine und Weizenglutenine werden nicht erfasst.

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BMBF - Ideenwettbewerb

BMBF - Leitprojekt

Entwicklung von

Weizen-, Roggen-,

und Gerstenproteinen

ohne Zöliakietoxizität

und deren Verwendung zur

Herstellung von Lebensmitteln

(http://vvgvg.org)

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Ziele

• Aufklärung toxischer Proteinstrukturen

• Eliminierung toxischer Strukturen durch Gentechnologie

• Produktion von zöliakieverträglichem, transgenem Weizen

• Produktion von backfähigem, transgenem Mais

• Produktion von zöliakieverträglichem Gluten durch transgene Hefe

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Partner

Wissenschaft Universität Hamburg

Institut für Allgemeine Botanik und Botanischer Garten(H. Lörz, D. Becker)

Technische Universität BerlinFachbereich für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie(U. Stahl, F. Meuser)

St. Thomas´ Hospital, LondonRayne Institute(P.J. Ciclitira)

Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie, GarchingArbeitskreis Getreideproteine(H. Wieser)

Industrie Hauptsponsoren: Monsanto, Uniferm, Puratos, Bake Mark Verein zur Förderung und Verwertung von gentechnisch verbesserten

Getreideprodukten

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Teilprojekte Garching/London

• Identifizierung und Modifizierung toxischer Epitopeaus Gliadinen Immunmodulation ?

• Toxizitätsprüfung von Gluteninen Einsatz in glutenfreien Backwaren ?

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Toxizitätstests

In-vivo-Test (Instillation in den Dünndarm) 500 – 1000 mg

In-vitro-Test (Gewebekultur-Test) 1 mg

In-vitro-Test (Stimulation der T-Lymphozyten) 0,2 mg

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Zöliakieaktivität synthetischer Gliadinpeptide

(in vivo, Sturgess et al., 1994; in vitro, Shidrawi et al., 1995)

(in vivo, Marsh et al., 1995; in vitro, Maiuri et al., 1996)

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Stimulation der T-Lymphozyten durch Gliadinpeptide

Zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten (in-vitro) durch Peptide aus -Gliadinen (57-68, 62-75) nach Desamidierung von Q65 E65 durch Transglutaminase

( 57 - 68 )

( Arentz-Hansen et al., 2000 )

( 62 - 75 )L Q P F P Q P E L P Y

P Q P E L P PY Q P Q L P Y

Q

! Kein Nachweis, dass diese Peptide in-vivo die Darmschleimhaut schädigen

! Keine systematische Untersuchung, welche Aminosäuren außer E65 für die stimulierende Wirkung essentiell sind

(Arentz-Hansen et al., 2000)

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Methoden (1)

Gliadinhydrolysat

Extraktion von Gliadin aus Weizenmehl der Sorte „Rektor“ mit 60 % (v/v) Ethanol

Partialhydrolyse von Gliadin mit trägergebundenem Pepsin und Trypsin( PT-Gliadin)

Synthetische Peptide

Gerät: Peptidsynthesizer (Applied Biosystems 431A)

Programm: Fmoc-Chemie, Small-Scale-Synthese (1 mmol/Aminosäure)

Reinigung: 1) C18-Kieselgel (25-40 µm), Glassäule 3 x 30 cm, ca. 20 °C2) C18-Kieselgel (5 µm), Stahlsäule 0,46 x 24 cm, 50 °C

Reinheitsprüfung: RP-HPLC an C18-Kieselgel

Identitätsprüfung: Massenspektrometrie (ESI-MS)

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Methoden (2)

Immunologische Untersuchungen

T-Lymphozyten: Isolierung von gliadinsensitiven T-Zelllinien und -klonen von ZöliakiepatientenStimulation: PT-Gliadin + Antigen-präsentierende Zellen (APC)Inkubation: T-Zellen + APC + Peptid (3,7 µmol/L) + 3H-Thymidin (18-48 h, 37 °C)Messung: Radioaktivität (cpm) cpm mit Peptid Stimulationsindex = SI > 2,0 = signifikante Wirkung

cpm ohne PeptidZytokine: ELISA

Toxikologische UntersuchungenPersonen: 4 erwachsene Zöliakiepatienten unter glutenfreier KostInstillation: 1 g PT-Gliadin, 100 bzw. 20 mg Peptid, gelöst in Wasser, 2 hBiopsie: Gewebeentnahme mit Quinton-Kapsel nach 0, 2, 4 und 6 hMessung: Enterozytenhöhe (ECH), Villushöhe (VH), Kryptentiefe (CD), Anzahl intraepithelialer Lymphozyten (IEL)

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Gewebeentnahme

Zellhöhe

IntraepithelialeLymphozyten

Villus-höhe

Krypten-tiefe

(Messung an mind. 10 Villi)

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Peptide

Toxikologische Untersuchung

G8 (-Gliadin 56-75)

C1 (ß-Casein 53-72)

Immunologische Untersuchung

G9 (-Gliadin 56-75, E65)

G5 (-Gliadin 56-68, E65)

G4 (-Gliadin 62-75, E65)

Peptides for T-Cell Stimulation

56 - 75, E 65 ) L PQ L Q P F Q P L P Y P Q P Q L P YG 9 E

56 - 68, E 65 )G 5

62 - 68, E 65 )G 4

G 4 - A 1

G 4 - A 2

G 4 - A 3

G 4 - A 5

G 4 - A 6

G 4 - A 7

G 4 - A 8

G 4 - A 9

G 4 - A 10

G 4 - A 11

G 4 - A 12

G 4 - A 13

G 4 - A 14

A

L PQ L Q P F Q P L P YE

P Q P L P Y P Q P Q L P YE

Q P L P Y P Q P Q L P YE

P P L P Y P Q P Q L P YE

P Q L P Y P Q P Q L P YE

P Q P P Y P Q P Q L P YE

P Q P L Y P Q P Q L P YE

P Q P L P P Q P Q L P YE

P Q P L P Y Q P Q L P YE

P Q P L P Y P P Q L P YE

P Q P L P Y P Q Q L P YE

P Q P L P Y P Q P L P YE

P Q P L P Y P Q P Q P YE

P Q P L P Y P Q P Q L YE

P Q P L P Y P Q P Q L PE

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

Peptides for T-Cell Stimulation

56 - 75, E 65 ) L PQ L Q P F Q P L P Y P Q P Q L P YG 9 E

56 - 68, E 65 )G 5

62 - 68, E 65 )G 4

G 4 - A 1

G 4 - A 2

G 4 - A 3

G 4 - A 5

G 4 - A 6

G 4 - A 7

G 4 - A 8

G 4 - A 9

G 4 - A 10

G 4 - A 11

G 4 - A 12

G 4 - A 13

G 4 - A 14

A

L PQ L Q P F Q P L P YE

P Q P L P Y P Q P Q L P YE

Q P L P Y P Q P Q L P YE

P P L P Y P Q P Q L P YE

P Q L P Y P Q P Q L P YE

P Q P P Y P Q P Q L P YE

P Q P L Y P Q P Q L P YE

P Q P L P P Q P Q L P YE

P Q P L P Y Q P Q L P YE

P Q P L P Y P P Q L P YE

P Q P L P Y P Q Q L P YE

P Q P L P Y P Q P L P YE

P Q P L P Y P Q P Q P YE

P Q P L P Y P Q P Q L YE

P Q P L P Y P Q P Q L PE

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

Peptides for T-Cell Stimulation

56 - 75, E 65 ) L PQ L Q P F Q P L P Y P Q P Q L P YG 9 E

56 - 68, E 65 )G 5

62 - 68, E 65 )G 4

G 4 - A 1

G 4 - A 2

G 4 - A 3

G 4 - A 5

G 4 - A 6

G 4 - A 7

G 4 - A 8

G 4 - A 9

G 4 - A 10

G 4 - A 11

G 4 - A 12

G 4 - A 13

G 4 - A 14

A

L PQ L Q P F Q P L P YE

P Q P L P Y P Q P Q L P YE

Q P L P Y P Q P Q L P YE

P P L P Y P Q P Q L P YE

P Q L P Y P Q P Q L P YE

P Q P P Y P Q P Q L P YE

P Q P L Y P Q P Q L P YE

P Q P L P P Q P Q L P YE

P Q P L P Y Q P Q L P YE

P Q P L P Y P P Q L P YE

P Q P L P Y P Q Q L P YE

P Q P L P Y P Q P L P YE

P Q P L P Y P Q P Q P YE

P Q P L P Y P Q P Q L YE

P Q P L P Y P Q P Q L PE

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

35

Toxikologische Untersuchung (1)

Enterozytenhöhe (ECH)(0 h vs. 4 h)

0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 40 4 0 4PTG G8 C1 PTG C1 PTG G8 C1 PTG C1

ECHPatient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4

G8 G8

******

******

****** ***

***

n.s

.

n.s

.

n.s

.

n.s.

PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle)

G8 = Gliadinpeptid 56-75

C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle)

36

Toxikologische Untersuchung (2)

Villushöhe/Kryptentiefe (VH/CD)(0 h vs. 4 h)

PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle)

G8 = Gliadinpeptid 56-75

C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle)

0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 40 4 0 4PTG G8 C1 PTG C1 PTG G8 C1 PTG C1

VH/CD

Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4

G8 G8

2.0

1.5

1.0

0.5

*** ***

******

******

******

n.s.

n.s.

n.s. n.

s.

37

Toxikologische Untersuchung (3)

Anzahl der Lymphozyten (IEL)(0 h vs. 4 h)

0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 40 4 0 4PTG G8 C1 PTG G8 C1 PTG G8 C1 PTG G8 C1

IEL Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4

PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle)

G8 = Gliadinpeptid 56-75

C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle)

38

Immunologische Untersuchung (1)

Peptid SI IFNG9 ( 56-75) 60 1100G5 ( 56-68) 11 130G4 ( 62-75) 49 380

Peptid SI IFNG9 ( 56-75) 25 410G5 ( 56-68) 5 37G4 ( 62-75) 22 33

Peptid SI IFNG9 ( 56-75) 27 430G5 ( 56-68) 12 220G4 ( 62-75) 27 410

T-Zellklon Nr. 6

T-Zellklon Nr. 8

T-Zellklon Nr. 9

Sl = Stimulationsindex, IFN = -Interferon (pg/mL)

39

Immunologische Untersuchung (2)

Peptide

G 4 - A 1

G 4 - A 2

G 4 - A 3

G 4 - A 5

G 4 - A 6

G 4 - A 7

G 4 - A 8

G 4 - A 9

G 4 - A 10

G 4 - A 11

G 4 - A 12

G 4 - A 13

G 4 - A 14

A Q P L P Y P Q P Q L P YE

P P L P Y P Q P Q L P YE

P Q L P Y P Q P Q L P YE

P Q P P Y P Q P Q L P YE

P Q P L Y P Q P Q L P YE

P Q P L P P Q P Q L P YE

P Q P L P Y Q P Q L P YE

P Q P L P Y P P Q L P YE

P Q P L P Y P Q Q L P YE

P Q P L P Y P Q P L P YE

P Q P L P Y P Q P Q P YE

P Q P L P Y P Q P Q L YE

P Q P L P Y P Q P Q L PE

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

(-)--

-

--

-

--

+

++

+

SI/IFN

40

Immunologische Untersuchung (3)

+

+

+

+

+

+

-

-

Peptide SI/IFN

41

Zusammenfassung Toxikologie/Immunologie

Die in-vivo-Toxizitätsprüfung an vier erwachsenen Zöliakiepatienten hat gezeigt, dass das Peptid G8 ( 56-75) eine signifikante zöliakiespezifische Schädigung der Dünndarmschleimhaut hervorruft.

Die immunologischen Untersuchungen haben ergeben, dass das an Position 65 desamidierte Peptid G8 (G9) eine zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten bewirkt. Für die Wirkung des Peptids sind die Positionen 62-71 essentiell.

P Q P L P Y P PE Q

42

Peptidbindungsstellen

43

Toxizitätsprüfung der HMW-Glutenine

1Dx5

1Dy10

90 785827

Bauplan

A B C

105 585

627A B C

Wiederkehrende Sequenzen

44

Preparation of Crude HMW Subunits

Flour (Rektor)

50 % 2-PrOH

(3x, RT)

Extract Residue

50 % 2-PrOH + DTE + Tris-HCl

(2x, 60 °C)

Extract Residue

Solubles Precipitate

washing, freeze-drying

HMW subunits

1Dx5 29.4 %1Bx7 36.7 %1By9 11.9 %1Dy10 22.0 %

acetone

45

RP-HPLC of Glutenin Fractions

Total glutenin subunits Crude HMW subunits

HMW 20 %

HMW 90 %

46

Characterisation of Purified HMW Subunits

RP-HPLC SDS-PAGE

47

ELISA-Result

Antibody Gliadin

R5 (Mendez et al., Madrid)a) Sandwichb) Competitive

0.09 %0.16 %

W6/8 (Ellis et al., London) 0.18 %

48

Peptic Tryptic Digest of HMW Subunits

Control of hydrolysis by RP-HPLC on C18 silica gel

1. HMW subunits (400 mg) + agarose-bound pepsin (1600 U) + HCl (pH 2, 20 mL)37 °C, 2 h – centrifugation

2. Supernatant +NaOH ( pH 7.8) + agarose-bound trypsin (10 U) 37 °C, 2 h+ HCl ( pH 7.0) – centrifugation – lyophilisation of supernatant

49

Stimulationstest an T-Lymphozyten

Patient FFIII HMW HMWtTGZB 11,1 2,6 1,4JB 6,2 2,0 2,0JD 3,7 3,4 3,3YR 12,5 1,0 3,0SB 1,3 3,1 1,3BL 90,0 12,1 7,7TS 6,1 3,7 3,9MH 4,3 0,3 0,2EL 11,9 1,5 2,2LN 4,0 1,0 1,1MT 67,0 Nd 4,2CM 11,0 3,5 5,2NL 21,5 1,0 0,7LB 3,4 1,0 1,0 13/14 7/13 8/14

Angegeben ist der Stimulationsindex (SI);SI>2 = signifikante Wirkung; Nd = nicht bestimmt.

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Ergebnisse ECH

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Ergebnisse VH/CD

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Ergebnisse IEL

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Zusammenfassung HMW-Glutenine

Die immunologischen und toxikologischen Untersuchungen haben ergeben, dass ein Gemisch aus den HMW-Untereinheiten Nr. 5, 7, 9 und 10 zöliakiespezifische Reaktionen hervorruft. Aus den Ergebnissen geht nicht hervor, welche der vier Untereinheiten zöliakieaktiv ist.

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Ausblick

Isolierung und Testung einzelner rekombinanter HMW-Untereinheiten aus transgenem Mais und transgener Hefe

Mais(Uni Hamburg)

Hefe(TU Berlin)

1Dy10 1Dx5

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Danksagung

Prolamin Working Group

Paul J. Ciclitira, LondonRenate van Eckert, GrazConleth Feighery, DublinEnrique Mendez, Madrid

BMBF-Projekt

Dirk Becker, HamburgPaul J. Ciclitira, LondonErika Hinzmann, BerlinFriedrich Meuser, Berlin

DFA

Wolfgang Engel, Ursula Schützler, Sibylle Suckart

Bundesministerium für Bildung und Forschung

Verein zur Förderung und Verwertung von

gentechnisch verbesserten Getreideprodukten