1 Lehrerfortbildung Juli 2011 Schülerversuch Geninduktion am Beispiel des lac-Operons von E.coli...

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Lehrerfortbildung Juli 2011

Schülerversuch Geninduktionam Beispiel des lac-Operons von E.coli

Prof. Dr. Andreas Beyer

cand. stud. Yvonne Floer

cand. stud. Karina van den Broek

Ein Schul-tauglicher Versuch zur Untersuchung genetischer Regulation bei Bakterien: – Induktion und Repression –

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RNA

-Pol

Das lac-Operon

lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs

trans-Ac

lac-Permease

ßGalLac tose

Gal

Glc+

lacZ,Y,A-mRNA

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RNA

-Pol

RNA

-Pol

Das lac-Operon: Der Repressor

lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs

lacI TermPromotor

trans-Ac

lac-Permease

ßGal

lacZ,Y,A-mRNA

LacR

lacI-mRNA

6

RNA

-Pol

RNA

-Pol

Das lac-Operon: Der Repressor

lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs

lacI TermPromotor

trans-Ac

lac-Permease

ßGal

lacZ,Y,A-mRNA

LacR

lacI-mRNA Lac tose

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RNA

-Pol

RNA

-Pol

RNA

-Pol

Das lac-Operon: Glc-Repression

lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs

cAMP-RP TermPromotor

trans-Ac

lac-Permease

ßGal

lacZ,Y,A-mRNA

CRP-mRNA

LacRLac tose

CRP

cAMP

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Regulation des lac-Operons

• negatives Regulations-Element im Promotor:lacR bindet an Operator blockiert Transkription in Abwesenheit vom LaktoseInduktor Laktose bindet an lacR LacR kann nicht mehr binden, Transkription ist entblockt

• positives Regulations Element im Promotor:aAMP-CRP komplex bindet an CRP-Bindestelle Transcriptionslevel wird erheblich gesteigert

(Mechanismus der Katabolit-Repression)

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Regulation des lac-Operons

lac-Operon

lacZ lacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs

LacR

Lac tose

XXCRP cAMP

++ ++

Transkription des lac-Operons

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Das Versuchsprinzip

lacZ ß-Gaslactosidase als Reporter:Quantifizierung des Aktivitätsstatus‘ des lac-Operons

über Aktivitätsmessung der ß-Gal. via Chromogen:

proportionale Umsetzung von oNPG durch das Enzym

Quelle: chemgapedia

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Zeit t in Minuten

Ext

ink

tion

Vorversuch: Wachstumskinetik

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Vorversuch: Wachstumskinetik

Glycerin verworfen

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Setup des Versuchs• E.coli H3000: intaktes lac-Operon• Sicherheitsstamm (keine S-Stufe!)• frische Übernacht-Kultur Standard-Medium LB• 1:5 Verdünnung mit div. C-Quellen (Kinetik über 1h):

- nur LB- Glucose- Laktose- Glucose + Laktose

• Zentrifugation, Zellaufschluss• Zugabe von oNPG definierte Zeit Stopp• optische Auswertung (semiquantitativ)• Analyse: Korrelation mit den C-Quellen

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Setup des Versuchs

1:5 Verdünnung bei t=0

E.coli H3000: frische Übernacht-Kultur

(Standard-Medium LB)

nur LB …+Glc …+Lact …+Glc +Lakt

Probennahme alle 20min

Zellaufschluss (Lysozym)

Farb-test

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Ergebnis

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semiquantitative Auswertung

(Semi-)Quantifizierung mit Photoshop