Absorptionsflammenspektrometrische Analysen mit Mikroliter-Proben

Aus der Abteilung fiir medizinische Physik an tier Universit~its-I-Iau~klinik Giel]en

Absorptionsflammenspektrometrisehe Analysen mit Mikroliter-Proben ~

Von

W. Lang und R. Herrmann

Mit 3 Abbildungen

(Eingegangen am 10. Juni 1963)

1. Einleitung

Flammenspekt rometr i sche Analysen nach der Emissions- oder Absorl0tionsmethode erfordern fiblicherweise eine Probenmenge yon mindestens einem 1/2 m]. Steht yon vornhere in nu r eine Probenmenge yon etwa l m l zur Verftigung (wie des z. B. bei Serumanalysen der Fal l ist), so ist mi t den bisherigen Methoden eine wesentliehe vorhergehende Anreicherung yon Spurenelementen in der Probe nich~ mSglich. Wir wollen daher eine Methode besehreiben, mi t der m a n die benStigte Probenmenge pro Analyse drastisch senken kann.

Will man mit kleineren Probenmengen ohne EinbuBe an Naehweis- empfindlichkeit Analysen durchfiihren, mul3 man die Messung innerhalb eines kih'zeren Zeitraumes vornehrnen, als dies iiblicherweise der Fall ist. Bei Verwendung yon Indirektzerstiiubern betr~gt erfahrungsgem/~B der Zeit- raum zwischen dam Beginn der Zerst~ubung des Analysengutes mid dam Erreichen einer quasistation~ren Atomkonzentration des Analysenelementes in der laminaren Flamme mindestens 1 Sekunde. Unterstellt man, dab des Anzeigegerat eine RC-Konstante unterhalb einer Sekunde hat, und daI3 fiir das Ablesen des MeBwertes am Anzeigeinstrument weitere 2 Sekunden notwendig sind, so folgt daraus, dab man irn Interesse einer sicheren Analyse bei Indirektzerst/iubern mindestens 3 Sekunden lang des Analysengut zerst/iuben muB. Die hier ftir besonders gfins~ig liegende Verh~ltnisse vor- genommene Absch~tzung der ben6tigten Zerstg~ubungsdauer und damit des Substanzbedarfs kann in praxi um ein Vielfaches h6her liegen. Aus diesen Grtinden haben wit fiir unsere Untersuehung ausschliei31ich Direkt- zerst~iuber verwendet, well bei diesen die Einstellzeit wesentlich niedriger liegt (s. unten).

* Untersti i tzt mit Mitteln der Deutsehen Forschungsgemeinsehaft.

Lang, Herrmann: Flammenspektrome~r. AnMysen mit Mikroligerproben 873

Mel3zeiten tmterhalb 1 Sekunde lassen ohne besondere Maf3nahmen eine siehere direkte Ablesung des Mel3wertes nicht zu. Zur dokumentarisehen Erfassung des Mel3ergebnisses sind fiir den vorliegenden Zweek die handels- iibliehen Liniensehreiber nieht geeigne~, da ihre Einstellzeit einige Zehntel- sekunden oder mehr betr/~gt, hingegen erweisen sieh Lieh~strahl.- oder Fltissigkei~sstrahloseillographen als zweekm/il~ig.

Im folgenden werden naeh der Beschreibung der benutzten MeB- anordnung die Mel3ergebnisse mitgeteilt beztiglich der rclativen Schwan- kung des Photostromes, der Einstellzeit der quasistationi~ren Atom- konzentration in der Flamme, der ben6tigten Probenmenge pro Analyse und die erreichten relativen und absoluten unteren Naehweisgrenzen.

2. Experimentelle lnordnung Ffir die Voruntersuchungen und die anschlieBenden praktischen

Anwendungen haben wir folgende experimentelle Anordnung verwen~et: Die jeweilige Spektrallampe (Osram-Lampen ffir die Elemente Na, K und Hilger & Watts-Hohlkathodenlampen ffir die Elemente Cu und Fe) wird mit Hilfe zweier Quarz-Sammellinsen auf den Eintrittsspalt des Quarzprismen-Monochromators ,,Uvispec" der Firma Hilger & Watts im Verh/iltnis 1 :1 abgebildet. Die (turbulente) Wasserstoff-Pregluft- flamme eines selbstgefertigten Direktzerst/~ubers 3 befindet sich im an- n/~hernd parallelen Lichtbiindel der Spektrallampe zwischen den beiden Sammellinsen. Damit der MeSstrahl nur den Mittelteil der Flamme mit der gr6gten Atomkonzentration durchsetzt, ist eine Rechteckblende zwischen der ersten Sammellinse und der Flamme angebracht. Damit die Eigenemission der Flamme den Megwert nicht f/~lscht, wird das Licht der Spektrallampe vor dem Durchqueren der Flamme mittels eines rotierenden Sektors mit 75 Hz moduliert. Im Monochromator wird die Analysenlinie yon benachbarten Linien isoliert und der Photostrom des SEV in einem Niederfrequenzverst/~rker mit l~C-Kopplung verstgrkt. Die Endstufe des Verst~rkers ist zur Anpassung an den Schleifenoscillo- graphen als Kathodenfolgerstufe ausgehildet. Als Lichtstrahloscillograph wird aus dem Elektrokardiographen ,,Triplex Super" der Firma J/~rnhs Elektriska A.-B., Stockholm, ein Schleifenschwinger und die zugeh6rige Registriereinrichtung (ohne den eingebauten Verst/~rker) henutzt. Die Papierbreite betr/~gt 10 cm, der Papiervorschub 7 cm/sek. Das nicht gleichgerichtete, 75-Hz-modulierte Signal stellt zugleich Zeitmarken dar, denn der rotierende Sektor wird durch einen Synchronmotor angetrieben.

3. Mel3ergebnisse 1. Relative Schwankung des Photostromes

Mit der geschilderten Anordnung wurde zun/ichst gepriift, ob die relativen Schwankungen des Signals fiberhaupt eine quantitative Analyse zulassen.

Mikrochim. Act~ 1963]5--6 57

874 W. Lang und I~. Herrmann: [Mih'ochim. Acts

Abb. 1 zeigt Ausschnit~e aus einem sotchen Registriersvreifen. Ira Teilbild a ist der S~rahlengang abgedeckt. Die registricrten Schwan-

kungen werden durch mechanische Erschfltterungen des Schleifenoscillo- graphen (Papierablauf) und den Rausch des SEV (1 P 28, mit 95 V pro Dynodenstufe betrieben) verursacht. Diese Schwankungen sind einer 50-Hz- Einstreuung (pick up) iiberlagert.

Im Tcilbild b ist der Strahlengang freigegeben, der rotierende Sektor und die Flamme sind noch nicht in Betrieb. Auf den SEV fallt das Gleichlicht der Fe-Linie 248,3 nm. Die Stromstarke der Hohlkathodenlampe betr/~gt 74 mA, die Bandbreite 0,2 nm. Wegen der RC-Kopplung des Vcrstarkers werden nur die Schwankungen bzw. der Rausch registriert, nicht aber der Pho~ostrom des Gleichlichtes.

Abb. 1. E r m i t t l u n g der Schwankungsursaehen des Photos t romes (Ordinate) in Abhangigke i t yon der Zeit (Abszisse). Zu beachten ist, da~ wegen der Verwendung eines Wechse l s t romvers tg rkers ohne ansehliel]ende Gleichriehtung alas Signal in den einzelnen Teilbildern ,,symmetriseh" zur (horizontalen)

hrul]inie der Schwingung liegt. Weitere Er l~uterungen s. Tex t

Teilbild c zeigt die Wiederholung von b, jedoch jetzt mi~ dem rotierenden Scktor in Betrieb, das Signal ist 75-Hz-moduliert. (Die bei etwa 70% der Maximalamplitude symmetrisch zur Nullinie auftretenden Punkte in dieser und in den folgenden Registrierkurven sind auf die RC-Zeit eines Phasenschiebers ira NF-Verst~irker zurflckzufiihren, der einen Dachabfall yon Rechteck- schwingungen auf zirka 70% verursacht.)

Im Teilbild d kommen zu den Schwankungen der Kurve cnoch diejenigen der turbulen~en H2-Prel31uftflamme, zun~ichst ohne Zerstgubung einer Blind-, Eich- oder Analysenl6sung.

Teilbild s zeigt die Wiederholung yon d, jedoch mit anschlief~ender Zerst/~ubung einer wal3rigen EisenchloridlSstmg (40/~g/ml).

Die hier pr imgr interessierende Frage ist die, welcher Schw~nkungs- antei l der F l amme zuzuschreiben ist insbesondere w~hrend des Zer- st~tubens der AnalysenlSsung. Wir setzen deshalb die relative Schwankung des Photostromes in Teilbild c (Flamme noch nicht geztindet) rechnerisch willkiir]ich g]eich 1, da mun diese Schwankungen durch sehmalbandige

1963/5--6] Flammenspektrometrische Analysen mit Mikroliterproben 875

Verst/irkung und Beseitigung des pick up weiter vermindern kann. Der yon der Flamme verurs~chte Schw~nkungsanteil (ohne Zerst/iubung) m~cht dann den Faktor 1,4 aus und erhSht sich auf das 2,6fache wi~hrend der Zerst~ubung der AnalysenlSsung, wenn man sich - - wie vereinbart - - in beiden Fi~llen auf Kurve c bezieht.

Abb. 2, Einstellzeit der quasistation~ren Atomkonzentration des Analysenelementes inl MeBvolumen der Flamme. In der Abbildung nicht eingezeichnet: Die Ordinate stellt den Photostrom bzw. die Durchliissigkeit der Flamme dar. Abszisse ist die Zeit. Die ~odulationsfrequenz betr~gt 75 ~Iz,

zerst/inbt wird eine w~tl3rige EisenlSsung

2. Einstellzeit der quasistation5ren Atomkonzentration in der Flamme

Eine wesentliche Voraussetzung fiir flammenphotometrische Analysen an Mikroliterproben ohne Anwendung eines Leitlinienverfahrens besteh~ darin, dab sich in mSglichst kurzer Zeit nach dem Beginn der Zerst/~ubung eine quasistation/~re Atomkonzentr~tion des AnMysenelementes im Mel]volumen der Flamme einsteHt. Zur Ermittlung der Einstellzeit wurde die l%egistrierkurve in Abb. 2 ~ufgenommen.

Zerst~ubt wurde eine Fe-L5sung, die Modulationsfrequenz betrug wiederum 75 Hz. Man erkennt, dM3 die Einstellzeit der quasist~tion~ren Atomkonzentration innerhMb yon ein bis zwei Schwingungen erfolgt, also zwischen 13 und 27 ms betr/~gt. Die ,,Selbstreinigung" des Zer- st~ubers und der Flamme nach Unterbrechung der Zerst/~ubung ]iegt

57*

876 W. Lang und R. Herrmann: [Mikrochim. Acta

erwartungsgemgB sehr viel h6her (hier bei ungef~Lhr 500 ms) und ist ebenso wie die Einstellzeit nicht nur abh~ngig yon der Geometrie des Zerst/~ubers und dessen Betriebsdaten, sondern auch noch abhgngig yon der Konzentration.

3. BenStigte Probenmengen pro Analyse

Die hier verwendete Zerst~uber-Brenner-Kombination hat unter den gew~hlten Betriebsbedingungen eine Durchf]uf3menge (wiil3riger) Analysen- ISsung von 1,5 ml/min bzw. 25#l/sek. Wie oben bereits erws betr/~gt die Einstellzeit der quasistation/~ren Atomkonzentration in der Flamme unter den hier vorliegenden Betriebsbedingungen rund 30 ms. Fordert man fiir eine sichere Analyse eine zus~tzliche Zerstgubungszeit von zehn

Abb. 3. Drei Diagrammausschnitte aus Registrierstreifen, welche die Durchlfissigkeitsiinderung der Flamme mit dem Beginn der Zerst~ubung yon 10-Mikroliter-Proben zeigen. Das Einsetzen der Absorption ist jeweils mit einem PfeiI markiert. (Die Diagrammausschnitte stellen ]eweils eine H~lfte

des symmetrischen Signals in Abh~ingigkeit yon der Zei~ dar.)

75-Hz-Schwingungen, so kommt man uuf eine erforderliche Zersts zeit yon rund 160 ms pro Analyse. Demnuch wiirde die minimale Proben- menge pro Messung 4 #] betragen. In Wirk]ichkeit liegt diese minimale Grenze hier fast um den Faktor 3 hSher, denn die Hauptschwierigkeit bei Analysen an so kleinen Probenmengen mit dem verwendeten Zerst/~uber besteht darin, yon Probe zu Probe in definierter Weise die/~l-Proben der Ansaugkapillare zuzufiihren.

Nach unseren Erfahrungen bieten Proben bis herab zu 20#1 (auf Uhrgl~Lschen aus Kunststoff) diesbeziiglich keinerlei Schwierigkeiten. Nach einiger ~Tbung lassen sich mit unserer Anordnung auch noch 10-#l- Proben ver~rbeiten. Einige Beispiele yon Diagrammausschnitten zeigt Abb. 3. Fiir die Aufnahme dieser Kurven wurden jeweils 10-#l-Proben einer Cu-L5sung (20/~g/ml, 75 Vol.-~o Aceton) mit der Kupfer-Resonanz- linie 324,8 nm (Bandbreite 0,6 nm, Stromst~rke der Cu-Hohlkathoden- lampe 20 mA) gemessen.

1963/5--6] Fl~mmenspektrometrische Analysen mit Mikroliterproben 877

4. Untere Nachweisgrenze

Die unteren Nachweisgrenzen fiir die Elemente Na, K, Cu, Fe haben wir zun~chst mit der in Abschnitt 2 beschriebenen Anordnung ermittelt und dann mit den unteren Naehweisgrenzen verglichen, die man mit der gleiehen Anordnung im Gleich]ieht-Aussehlagverfahren erhi~lt. (Im letztgenannten Falle wurde ftir die Anzeige des nichtmodulierten Signals der Sehleifenoscillograph durch ein Spiegelgalvanometer mit 200 mm Skalenl~nge ersetzt.)

Der Vergleich ergab, daI3 bis herab zu 10-/~l-I)roben fiir eine gegebene Konzentration des Analysenelementes die Absorption bzw. die Extinktion unter sonst gleichen Bedingungen (Lampenstrom, Durehflul3mengen, Bandbreite) erwartungsgem~13 ftir beide Methoden gleieh ist. Trotzdem ist die (relative) untere Naehweisgrenze ffir die ttl-Methode etwa um den Faktor 4 schteehter als ftir die ml-Methode. Der Grund dafiir liegt einerseits in der geringen Papierbreite des verwendeten Liehtstrahl- oscillographen und anderseits in der versehiedenen l%C-Zeit der beiden Mel3anordnungen, die ffir das Gleiehliehtausschlagverfahren zu 4 Sekunden gew~hlt wurde. Infolge der grSl3eren zeitliehen AuflSsung tri t t bei der #l-Methode der ,,Sehroteffekt" des Analysengutes in der Flamme [das heiitt, die trSpfchenweise Einbringung des Aerosols in die Flamme ver- ursaeht statistisehe Sehwankungen des Signals (vgl. 1)] sehr vim sti~rker in Erseheinung als bei grSBeren t%C-Konstanten des Anzeigeger~tes.

Die absoluten unteren Naehweisgrenzen hingegen, also das Produkt aus der relativen unteren Nachweisgrenze und der benStigten Proben- menge pro Analyse (hier 10/~l), liegen ffir die #l-Methode wesentlich fiber denen der ml-Methode. Unter der Annahme, dal3 ffir ein gegebenes Analysengut ffinf Einzelmessungen an dieser Probe durchgefiihrt werden sollen, braueht man im Falle der/~l-Methode insgesamt 50#1 Proben- 15sung. Ffir die ml-~ethode mul~ man mindestens 5 ml fiir die Durch- ffihrung der gefordert~en ffinf Messungen fordern, da sonst wegen des abnehmenden Flfissigkeitsspiegels im Probenbeh~lter w~hrend der Zer- st~ubung die Meltwerte mit einem methodischen Fehler behaftet sind (vgl. ~). Unter diesen Annahmen erh~It man ffir unsere beiden beschrie- benen MeBanordnungen (ml-Methode bzw./~l-Methode) ffir die/~l-Methode zwar eine um den Faktor 4 schleehtere relative untere Naehweisgrenze, hingegen liegt die absolute untere Nachweisgrenze um den Faktor 25 fiber der ml-Methode. In Tabelle 1 sind die relativen und absoluten unteren Nachweisgrenzen fiir vier Elemente (jeweils in w~tl3riger LSsung mit 75 Vol.-% Aeeton) nach unserem #l-Verfahren zusammengestellt. Als Probenmengen wurden 10#l angesetzt.

Es sei nochmals betont, dal3 bei diesen Messungen die eingangs erw~hnte MeBanordnung ohne besondere MaBnahmen zur Verl~ngerung

878 W, Lang und R. Hen'mann: [lV[ikrochim. Aeta

des Absorptionsweges in der Flamme verwendet wurde. Mit Hilfe einer Whiteschen Spiegelanordnung beispielsweise lassen sieh die angegebenen

relativen und absoluten unteren

Tabelle 1. R e l a t i v e und abso lu t e un t e r e N a c h w e i s g r e n z e n der

# l -Methode

Elemen t c [gg/ml] m [ttg]

H a

K Cu Fe

0,8 1,5 9

16

0,008 0,015 0,04 0,2

Naehweisgrenzen etwa um den Faktor 3 verbessern.

Aus den angefiihrten MeBergeb- nissen geht hervor, dab je naeh der geforderten Genauigkeit ftir die Analyse eine Ausgangsproben- menge yon 1 ml z.B. dureh ein Extraktionsverfahren um das 100- fache (bis auf 10#1) angereiehert werden kann. Weitere Verbesserun-

gende r Methode sind durch geeignete Dimensionierung des verwendeten Zerst~ubers, verbesserte Probenzuffihrnng zur Ansaugkapillare, gr61~ere Papierbreite, schmalbandige Verst~rkung und grSBere Absorptionswege mSglich. IJber pr~ktische Anwendungen dieser Methode wird an anderer Stelle berichtet.

Zusammenfassung

Es wird besehrieben, wie man unter Verwendung einer Zerst/iuber- Brenner-Kombination und eines Lichtstrahloseillographen die benStigte Probenmenge fiir flammenphotometrisehe Emissions- oder Absorptions- analysen drastisch senken kann, um eine vorherige Anreieherung des Analysengutes bei kleinen Probenmengen zu erm6glichen. Dazu werden im einzelnen die MeBergebnisse mitgeteilt beztiglich der relativen Sehwan- kung des Photostromes, der Einstellzeit der quasistation~ren Atom- konzentration in der Flamme, der benStigten Probenmenge pro Analyse und die erreichten relativen und absoluten unteren Nachweisgrenzen.

Summary

A method is given by which a preliminary enrichment of the analytically essential material is accomplished so that the amount of sample needed for a flame-photometric determination may be drastically reduced. This is accomplished by using an atomizer-burner combination and a light ray oscillograph. The data regarding the relative fluctuation of the photoflame, the weight of the sample required per analysis and the relative and absolute lower detection limits reached are given in detail.

R~sum@ On d6erit l'emploi d'un syst6me pulv6riseur-brfileur et d'un oscillographe

permettant de diminuer consid6rablement la quantit4 de prise d'essai n4ces- saire pour les analyses par photomdtrie de flamme en dmission ou en absorp- tion, ee qui rend possible l'enrichissement prdable du produit ~ analyser darts le cas de petites prises d'essai. On communique en ddtail les r6sultats

1963/5--6] Flammenspektrometrische Analysen mit Mikroliterproben 879

d'analyse concernant la variation relative du courant photo6lectrique, la dur6e d'~tablissement de la concentration atomique quasi-stationnaire dans la flamme, la prise d'essai n6cessaire par analyse et les l imites de dilution inf~rieures atteintes en valeur absolue et en valeur relative.

Literatur

1 C. Th. J . A lkemade , A Contribution to the ]Development and Under- standing of Flame Photometry. Diss. Utrecht, 1954.

2 R. H e r r m a n n und C. Th . J . Allcemade, Flammenphotometrie, 2. Aufl. Berlin: Springer-Verlag. 1960.

a R. Her , 'mann u n d H. Schellhorn, Z. angew. Physik 7, 572 (1955).