Biochemisches Praktikum für Biologen Institut für Biochemie Peter Friedhoff

Biochemisches Praktikum für Biologen

Institut für BiochemiePeter Friedhoff

Organisationsstufen in der Zelle

Bestandteile einer E. coli Zelle

Bestandteile einer E. coli Zelle

Proteinaufreinigung

Funktion bekannt – Protein unbekanntWelches Protein ist für eine bestimmte Funktion verantwortlich?

Protein bekannt – Funktion unbekanntWelche Funktion hat ein bestimmtes Protein?

Aufreinigung von Proteinen

Proteineigenschaften

Stabilität

Löslichkeit

Ladung

Hydrophobizität

Größe/Form/Masse

spezifische Interaktionen

(Affinität)

Verfahren

Zellaufschluß

Pufferbedingungen

Zentrifugation

Fällung

Dialyse

Säulenchromatographie

Charakterisierung von Proteinen

Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)

Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)

Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)

Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)

Edman-Sequenzierung (Sequenz)

Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

Aufreinigungsprotokoll von Proteinen

Aufreinigung von Rattenleber Glucokinase

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Zentrifugation

Dialyse

Dialysemembran lässt nur kleine Moleküle hindurch(z.B. Mr < 5000)

Makromoleküle werden zurückgehalten

Anwendung: Pufferwechsel

Säulenchromatographie

Substanzen gelöste in mobiler Phase durchlaufen eine stationäre Phase.

Wechselwirkung (Verteilung oder Adsorption) mit der Matrix bestimmen die Wanderungsge-schwindigkeit der gelösten Teilchen.

Ionenaustauschchromatographie

Kationenaustausch- stationäre Phase

Anionz.B. MonoS (-CH2SO3

-) oder CM-Cellulose (-COO-) mobile Phase Kation

Anionenaustausch- stationäre Phase

Kationz.B. MonoQ (-CH2N+(CH3)3) oder DEAE-Sepharose (-CH2N+H(CH3)2) mobile Phase Anion

Gelfiltration oder Größenauschlußchromatographie

Affinitätschromatographie

Protein (mobile Phase) bindet mit hoher Affinität und Selektivität an immobilisierten Liganden (stationäre Phase)

Elution erfolgt z.B. mit freiem Liganden (Kompetition)

Affinitätschromatographie

Affinitäts-tag Matrix

Antigen Antikörper (immobiliert)

6His (His6-tag) Ni-NTA

Strep-tag II (Peptid) Streptactin (Streptavidin-Derivat)

Glutathion-S-Transferase Glutathion-Sepharose

Calmodulin-Bindungs-Peptid Calmodulin-Affinitätsmatrix

Maltose-Bindungs-Protein Amylose-Matrix

Glucose-Bindungsprotein

Glucose-Bindungsprotein bindet an immobilisierte Glucose

Elution durch (freie) Glucose, die Glucose-Bindungsprotein von der Matrix ablöst (kompetitive Elution)

Ni-NTA-Affinitätschromatographie

Protein mit Histin-Affinitätstag bindet an immobilisierte Ni2+-Ionen

Elution erfolgt durch Imidazol das mit dem Protein um die Bindung an Ni2+-Ionen konkurriert.

Komplex aus His und Ni2+-NTA

Charakterisierung von Proteinen

Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)

Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)

Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)

Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)

Edman-Sequenzierung (Sequenz)

Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Schematische Darstellung einer Protein-Aufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-PAGE

Isoelektrische Fokussierung/ 2-D Gelelektrophorese

2-D Gelelektrophorese

Western-Blotting

Western-Blotting

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Ionisierungsverfahren für Massenspektrometrie

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Massenspektrometrieexakte Bestimmung von Peptid/Proteinmassen

Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie

SDS-Gel oder 2D-Gel

Bande/Spot ausschneiden

Tryptischer Verdau der Proteine

Bestimmung der Peptidmassen

Peptid-Fingerabdruck

Datenbanksuche nach Proteinen mit

identischem Peptid-Fingerabdruck

Protein-SequenzierungEdman-Abbau

Affinitätschromatographie/Elektrophorese

Ziel des Versuchs Aufreinigung eines rekombinantes Proteins

exprimiert in Escherichia coli über Affinitätschromatographie

Verfolgung der Aufreinigung mittels Fluoreszenz

Analyse der Aufreinigung mittels SDS-Gelelektrophorese

Untersuchung zur Thermostabilität des Proteins aufgrund seiner Fluoreszenz im nativen Zustand

Grün-fluoreszierendes Protein (GFP)

Die biolumineszierende Qualle Aequorea victoria produziert Licht, wenn

Energie des Ca2+-aktivierten Photoproteins

Aequorin auf das Grün-fluoreszierende

Protein (GFP) übertragen wird

GFP-Chromophor

Chromophor entsteht nach oxidativer Zyklisierung des Tripeptids Ser-Tyr-Gly

Der GFP-Chromophor fluoresziert nur, wenn es im nativ gefalteten Protein vorliegt

In vivo Fluoreszenz mittels GFP

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