Biochemisches Praktikum für Biologen

Institut für BiochemiePeter Friedhoff

Organisationsstufen in der Zelle

Bestandteile einer E. coli Zelle

Bestandteile einer E. coli Zelle

Proteinaufreinigung

Funktion bekannt – Protein unbekanntWelches Protein ist für eine bestimmte Funktion verantwortlich?

Protein bekannt – Funktion unbekanntWelche Funktion hat ein bestimmtes Protein?

Aufreinigung von Proteinen

Proteineigenschaften

Stabilität

Löslichkeit

Ladung

Hydrophobizität

Größe/Form/Masse

spezifische Interaktionen

(Affinität)

Verfahren

Zellaufschluß

Pufferbedingungen

Zentrifugation

Fällung

Dialyse

Säulenchromatographie

Charakterisierung von Proteinen

Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)

Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)

Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)

Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)

Edman-Sequenzierung (Sequenz)

Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

Aufreinigungsprotokoll von Proteinen

Aufreinigung von Rattenleber Glucokinase

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Zentrifugation

Dialyse

Dialysemembran lässt nur kleine Moleküle hindurch(z.B. Mr < 5000)

Makromoleküle werden zurückgehalten

Anwendung: Pufferwechsel

Säulenchromatographie

Substanzen gelöste in mobiler Phase durchlaufen eine stationäre Phase.

Wechselwirkung (Verteilung oder Adsorption) mit der Matrix bestimmen die Wanderungsge-schwindigkeit der gelösten Teilchen.

Ionenaustauschchromatographie

Kationenaustausch- stationäre Phase

Anionz.B. MonoS (-CH2SO3

-) oder CM-Cellulose (-COO-) mobile Phase Kation

Anionenaustausch- stationäre Phase

Kationz.B. MonoQ (-CH2N+(CH3)3) oder DEAE-Sepharose (-CH2N+H(CH3)2) mobile Phase Anion

Gelfiltration oder Größenauschlußchromatographie

Affinitätschromatographie

Protein (mobile Phase) bindet mit hoher Affinität und Selektivität an immobilisierten Liganden (stationäre Phase)

Elution erfolgt z.B. mit freiem Liganden (Kompetition)

Affinitätschromatographie

Affinitäts-tag Matrix

Antigen Antikörper (immobiliert)

6His (His6-tag) Ni-NTA

Strep-tag II (Peptid) Streptactin (Streptavidin-Derivat)

Glutathion-S-Transferase Glutathion-Sepharose

Calmodulin-Bindungs-Peptid Calmodulin-Affinitätsmatrix

Maltose-Bindungs-Protein Amylose-Matrix

Glucose-Bindungsprotein

Glucose-Bindungsprotein bindet an immobilisierte Glucose

Elution durch (freie) Glucose, die Glucose-Bindungsprotein von der Matrix ablöst (kompetitive Elution)

Ni-NTA-Affinitätschromatographie

Protein mit Histin-Affinitätstag bindet an immobilisierte Ni2+-Ionen

Elution erfolgt durch Imidazol das mit dem Protein um die Bindung an Ni2+-Ionen konkurriert.

Komplex aus His und Ni2+-NTA

Charakterisierung von Proteinen

Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)

Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)

Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)

Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)

Edman-Sequenzierung (Sequenz)

Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Schematische Darstellung einer Protein-Aufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-PAGE

Isoelektrische Fokussierung/ 2-D Gelelektrophorese

2-D Gelelektrophorese

Western-Blotting

Western-Blotting

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Ionisierungsverfahren für Massenspektrometrie

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Massenspektrometrieexakte Bestimmung von Peptid/Proteinmassen

Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie

SDS-Gel oder 2D-Gel

Bande/Spot ausschneiden

Tryptischer Verdau der Proteine

Bestimmung der Peptidmassen

Peptid-Fingerabdruck

Datenbanksuche nach Proteinen mit

identischem Peptid-Fingerabdruck

Protein-SequenzierungEdman-Abbau

Affinitätschromatographie/Elektrophorese

Ziel des Versuchs Aufreinigung eines rekombinantes Proteins

exprimiert in Escherichia coli über Affinitätschromatographie

Verfolgung der Aufreinigung mittels Fluoreszenz

Analyse der Aufreinigung mittels SDS-Gelelektrophorese

Untersuchung zur Thermostabilität des Proteins aufgrund seiner Fluoreszenz im nativen Zustand

Grün-fluoreszierendes Protein (GFP)

Die biolumineszierende Qualle Aequorea victoria produziert Licht, wenn

Energie des Ca2+-aktivierten Photoproteins

Aequorin auf das Grün-fluoreszierende

Protein (GFP) übertragen wird

GFP-Chromophor

Chromophor entsteht nach oxidativer Zyklisierung des Tripeptids Ser-Tyr-Gly

Der GFP-Chromophor fluoresziert nur, wenn es im nativ gefalteten Protein vorliegt

In vivo Fluoreszenz mittels GFP

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