Chromatographische Trennverfahren Forschungszentrum caesar SimuLab Stefan Hartmann Reihe...

ChromatographischeTrennverfahren

Forschungszentrum caesar

SimuLab

Stefan Hartmann

Reihe ExperimentalkurseKurs 1: HPLC-Messungen

Was ist Chromatographie?Unter dem Begriff Chromatographie werden physikalische Methoden zusammengefasst, bei denen eine

Stofftrennung

durch

Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) und

einer sich bewegenden (mobilen) Phase

erfolgt.

Phase: ein in sich homogener, d.h. physikalisch gleichartiger Bereich (können auch Gemische sein)

Die Chromatographie ist also eine Trenntechnik.

Andere Trenntechniken (z.B.):

• Filtration

• Zentrifugation (Trennung durch unterschiedliche Dichte)

• Elektrophorese (Trennung durch unterschiedliche „elektrophoretische Mobilität“, viele phys.-chem. Faktoren)

Chromatographische Techniken:Ein erster Überblick

Papier-Chromatographie

Dünnschicht-Chromatographie

Säulen-Chromatographie

Gel-Chromatographie (Molekularsieb)

Extraktions-Chromatographie

Gas-Chromatographie

Phasenstationär / mobil Technik

fest / flüssig

flüssig / flüssig

flüssig / gasförmig

HPLC

Grundprinzip bei allen Techniken

Die einzelnen Bestandteile eines Stoffes verteilen sich auf Grund ihrer unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften, wie z.B.

• Löslichkeit,• Siedetemperatur,• Adsorptionsverhalten,• Größe,• Polarität, …

unterschiedlich zwischen stationärer und mobiler Phase.

Die mobile Phase bewegt sich an der stationären Phase vorbei und nimmt die Stoffe unterschiedlich schnell mit.

© www.med4you.atstationäre Phase

mobile Phase

Grundprinzip

Einteilung nach dem Ziel

• Analytische Chromatographie:

Nachweis von Stoffen und deren Konzentrationen • Präparative Chromatographie:

Isolierung von Stoffen zur weiteren Verwendung

Mechanismen in der Chromatographie

• Molekularsieb• Adsorptionsphänomene• Verteilungsphänomene (Löslichkeit)• Ionen-Austausch• Affinitätsphänomene

Häufig wirken bei einer bestimmten Chromatographie mehrere dieser Mechanismen.

Das Molekularsieb

stationäre Phase: löchrige, porentragende Oberfläche

Anwendung: Gel-Chromatographie mit AgaroseTrennung von Proteingemischen nach Größe

Adsorptionsphänomene

Adsorption: Reversible Fixierung eines Substrats auf einer Oberfläche durch elektronische Wechselwirkungen

Anwendung: in nahezu allen chromatographischen Trennverfahren (auch in der HPLC)

Rund um die Adsorption

Nicht zu verwechseln mit Absorption:Aufnahme von Materie durch einen Körper

Chemisorption: kovalente oder ionische Bindung zwischen Substrat und Oberfläche

Physisorption: schwache elektronische Wechselwirkungen zwischen Substrat und Oberfläche(z.B. WBBen, van-der-Waals-Kräfte)

Quarz

WBB

Rund um die Adsorption (Forts.)

Je größer die Oberfläche des Adsorptionsmittels,desto größer ist auch die Adsorptionskapazität, d.h. je mehr Stoff kann bei gleicher Masse adsorbiert werden.

In der HPLC ist der Zerteilungsgrad besonders klein!

Das Lösemittel läuft nur sehr langsam durch die SäuleSehr hoher Druck (~ 200 bar) notwendig!

Im Vergleich:

Verteilungsphänomene (Löslichkeit)

Unterschiedliche Löslichkeit von Stoffen in zwei Flüssigkeiten (oder einem Gas und einer Flüssigkeit)

• Anwendung: kommt in nahezu allen chromatographischen Trennverfahren zum Tragen, vor allem in der Papier- und Dünnschichtchromatographie

Ionen-Austausch

Hier Kationen-Austausch-Chromatographie: die in der mobilen Phase befindlichen Kationen (grau) konkurrieren mit den verschiedenen Kationen der Probe um die negativ geladenen Bindungsstellen der stationären Phase

Anwendung: auch in der HPLC

Affinitätsphänomene

Schlüssel-Schloss-Prinzip

Anwendung: Wird im Routinelabor eher selten eingesetzt (höchstens in der präparativen Chromatographie), kann aber z.B. zum Nachweis von Anti-körpern mit Hilfe von Teststreifen dienen (Wechselwirkung Antigen-Antikörper)

Geschichte der Chromatographie

Ferdinand Friedlieb Runge,deutscher Chemiker (1794-1867)

Rotweinfleck auf einem Leinentuch

Zunächst: rein ästhetische Motivation

Runge sah sich als „Künstler der anorganischen Moleküle“.

Auftropfen einer Lösung auf Saugpapier

Dies war der Beginn der

Papierchromatographie• Variante der Verteilungschromatographie• stationäre Phase: Cellulose • mobile Phase (Laufmittel): Lösemittel• Fluss durch Kapillarkräfte • Adsorption der Farbstoffe an der Cellulosefaser

Je besser sich ein Farbstoff in demLaufmittel löst, desto weiter wird erin der mobilen Phase transportiert.

Trennung farbloser Substanzen durch Anfärben,

Spektroskopie oder Fluoreszenz.

Wichtig: Wahl des richtigen Laufmittels

Auftrennung von Filzschreibefarben in unterschiedlich polaren Laufmitteln

deutliche Unterschiede in der Trennleistung!

Entdecker der Chromatographieals wissenschaftliches Trennverfahren

Mikhail Semenovich Tswett(russischer Botaniker, 1872-1919)

„Adsorptionsanalyse und chromatographische Methoden.Anwendung auf die Chemie desChlorophylls.“ (1906 veröffentlicht)

Tswett filtrierte Extrakt aus Blättern über fein gepulvertes Calciumcarbonat und trennte dadurch die Blattfarbstoffe (Chlorophyll, Carotinoide) verschiedener Pflanzen.

Chromatographie: chromatos = Farbe, graphein = schreiben

Dies war die erste wissenschaftliche

Säulenchromatographie• stationäre Phase: z.B. Kieselgel, Cellulose, Aluminiumoxid, Calciumcarbonat

• mobile Phase (Laufmittel, Elutionsmittel): Lösemittel, häufig unpolar (z.B. Benzin)

• das Laufmittel kann während der Trennung kontinuierlich verändert werden (Gradientenelution, z.B. über pH-Wert)

• Fluss durch Schwerkraft

• Eluat tritt unten aus der Säule aus und kann detektiert werden

• High-Tech-Variante: HPLC (große stationäre Oberfläche, hoher Druck nötig)

Säulenchromatographie (Forts.)

• Retentionszeiten: Durchlaufszeiten der einzelnen Substanzen durch die Säule (vom Startpunkt bis zum Peakmaximum)• Die Peakfläche ist proportional zur Stoffmenge der entsprechenden Substanz• Nur wenn deutliche Abstände zwischen den Peaks erkennbar sind, wurde das Stoffgemisch wirklich getrennt

Dünnschicht-Chromatographie

• verdrängte die Papierchromatographie, die heutzutage nur noch für Demonstrationszwecke eingesetzt wird (schnellere und bessere Trennung)

• erstmals 1938 verwendet

• stationäre Phase: häufig Kieselgel oder Aluminiumoxid (sehr resistent)

• effektiv: Trennung von polaren und unpolaren Substanzen

Trennung von Alanin, Glycin und Valin in unpolarem Lösungsmittel

und Kieselgel (polar) als stationärer Phase

Rf – Wert (retarding-front)

b

aR f

b

a Laufstrecke der Substanz

Laufstrecke des Lösungsmittels

Weitere Entwicklungen

• Gaschromatographie

• Weiterentwicklungen der Säulenchromatographie (HPLC)

• …

Quellen

• http://www.chemieunterricht.de

• http://www.med4you.at