Probenarten - · Analogieerklärungen zur Extraktion, Einführung der HETP als chromatographische Kenngröße

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1

AC – BPBS 1

Probenarten

Feststoff

Aerosol

Emulsion

Flüssigkeitstropfen feste Teilchen

Gas

Flüssigkeit

Homo- und Heterogenes Stoffgemisch

(2 unmischbare Flüssigkeiten)

Suspension (unlöslicher Feststoff in Flüssigkeit)

?

HS 2008

AC – BPBS 2

Ziel der Probenaufbereitung

“Original” zu behalten “Kontaminieren” zu vermeiden

Kost- und Zeitaufwand zu beachten

“geeignete Konzentration” zu halten

HS 2008

“In Lösung” zu bringen

“Störende” abzutrennen

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AC – BPBS 3

Probenaufbereitung

Feststoff

Aerosol

Emulsion

Suspension

Flüssigkeitstropfen feste Teilchen

Gas

Flüssigkeit

(unlöslicher Feststoff in Flüssigkeit)

Homo- und Heterogenes Stoffgemisch

(2 unmischbare Flüssigkeiten) LLE, SPE, SPM, SPME

Extraktion

Batch-E Soxhlet-E Soxtec-E Ultraschall-E MAE, ASE SPE, SWE

Adsorption Filtration GC

HPLC EP

mit

MS NMR IR UV

Löslich oder unlöslich

Aufkonzentrierung Vortrennung und Anreicherung Probenarten

Messung

HS 2008

?

Aufreinigung

HS 2008 AC – BPBS 4

in gasförmiger, flüssiger oder feste Form

Anreicherung Verdünnung

aus fester Matrix von störenden Substanzen

“Analytenproben”

in Lösung

von unlöslichem Polymer/Teer von störenden Substanzen

Analyten

abtrennen

Analytenproben

Unlösliche, Farbstoff, “störende” Substanzen

Chromatographische Methode

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Praktische Beispiele: Blut-, Urin- und Erdprobe


Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

?

mp: 109 °C bp: 260 °C

Extraktion (Analyten von Beimengen abtrennen) mit

Batch-E Soxhlet-E Soxtec-E Ultraschall-E MAE, ASE SPE, SWE

Dekantieren oder abfiltrieren Einengen Aufreinigung

Filtration Säulenchromatographie, HPLC

Einengen => Probe ––––> Analyse

Getrocknet Zerrieben Wiegen


Bestandteile einer Säulenchromatographie

ElutionsLM

Säule

Glaswolle

Kieselgel

Sand

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Illustrationen aus Tswetts erster Publikation

Entwicklung der ersten chromatographischen Technik durch Mikhail Semenovich Tswett im Jahr 1903 (Trennung verschiedener Chlorophylle aus Blättern an Calciumcarbonat)

Mikhail Semenovich Tswett

Chromatographie: chroma Farbe graphein schreiben


Geschichte der Chromatographie

  1903 Tswett: Arbeiten zur Trennung von Chlorophyll mittels Adsorptionschromatographie - Namensgebung für die Methode

  1938 Iszmailov und Schraiber: Grundlagen der DC

  1938 Kuhn: Nobelpreis 1938 für seine Anwendung der Tswett'schen Adsorptionschromatographie an Carotinoiden und Vitaminen

  1940 Martin und Synge: Nobelpreis 1952 für Arbeiten zur Verteilungschromatographie, theoretische Grundlagen durch Analogieerklärungen zur Extraktion, Einführung der HETP als chromatographische Kenngröße

  1951 Erster Gaschromatograph von Martin und James

  1956 van-Deemter-Gleichung von der Gruppe Klingenberg (Shell)

  1965 Stahl: Einzug der DC in die chemische Analytik

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Analytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungs-

wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

Theoretische Grundlagen

529-1041-00 G HS2008


Trennmethoden auf Unterschied in Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften

Typen von Trennmethoden: Klassifizierung

Beweglichkeit in Einzelphase

Gleichgewicht & Beweglichkeit

Eindring- geschwindigkeit

1 2 1 2 + + + 1

2 m

S

Verteilung

Adsorption/Desorption

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Fundmentale Konzepte Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften

Mobile Phase: gasförmig, flüssig Stationäre Phase: flüssig, fest

  Verteilungsgleichgewicht (flüssige stationäre Phase)

  Adsorption/Desorption Gleichgewicht (feste stationäre Phase)

Zwischen beiden Phasen:

1

2 m

S

Verteilungs gleichgewicht

Adsorption/Desorption

2. Phase

1. Phase

2. Phase

1. Phase

[A]m

[A]s

Verteilung Adsorption/Desorption

Beweglichkeit


Übersicht Trennmethoden Zweite Phase

gasförmig fluid flüssig fest

gasförmig thermische Diffusion

Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GC)

Gas-Adsorptions-Chromatographie

fluid Fluid-Flüssigkeits-Chromatographie

Fluid-Adsorptions-Chromatographie

flüssig Destillation Flotation

Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie (LC, HPLC) Dialyse Flüssig-Flüssig-Extraktion

Ultrafiltration

Flüssigkeits- Adsorptions-Chromatographie Ionenaustausch Ausfällen Kristallisieren

Abscheiden (Zonenelektrophorese)

Erste Phase

fest Sublimation Fluid-Fest-Extraktion

Flüssig-Fest-Extraktion

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Übersicht Chromatographische Methoden Gas Überkritisches Fluid Flüssigkeit MP

flüssig SP

Form

Adsorbens Gebundene

Phase

SFC GSC GLC

fest

Säule Säule

Molekularsieb Adsorbens

flüssig fest flüssig fest

Säule Säule Säule Säule Säule Säule planar

LLC

Adsorbens Gebundene Phase

Harz Gel

planar

TLC LSC BPC SEC IEC

GC LC/TLC/HPLC


Übersicht Chromatographische Methoden Chemische Trennmethode beruht auf

chemische Eigenschaften von der zu trennenden Substanzen.

Physikalische Trennverfahren basiert an kinetische oder Gleichwichts–eigenschaften von

der zu trennenden Substanzen.

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Trennsäule – Hauptteil


Theoretische Grundlagen zum Chromatographie •  Anschauliches Prinzip

–  Nernst-Verteilung –  Craig-Verteilung

•  Einflussfaktoren –  Retentionszeit (tM, tR und tR’) –  Retentionsfaktor (k) oder Kapazitätsfaktor (k) –  Trennfaktor (α) –  Phasenverhältnis (β)

•  Klassische Theorie: (HETP) •  Auflösung (R)

•  Kinetische Theorie: Van-Deemter-Gleichung •  Optimieren einer Chromatographie •  Quantitative Methoden

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Verteilungskoeffizient K

€

K =A[ ]stationärA[ ]mobil

[A]m

[A]s

Mobile Phase

Stationäre Phase

Nernst-Verteilung

einstufig


Craig-Veteilung K = 1

27.3% K = 1 80% K = 9

1.

2.

3.

9.

K = 0.1 80%

0.4% 3.1% 10.9% 21.9% 0 10 200

10

20

30

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Prinzip der Chromatographie

stationäre Phase (flüssig oder fest)

mobile Phase (gas oder flüssig) Probe

tR

Transport durch mobile Phase

Alle chromatographischen Verfahren basieren auf einer wiederholten Einstellung des Gleichgewichts in mobiler und stationärer Phase und Transport durch MP.

Stoffaustausch HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate)

Wand aus “fused silica” mit Polyimid-beschichtung Flüssigkeitsfilm


Ein Chromatogramm

Mobile Phase

A + B

B

A

A B

tM tA tB

BA

Mobile Phase

Stationäre Phase

Stoffgemisch

M

€

KA =A[ ]SA[ ]M

€

KM = 0KA < KB

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Retentionszeit

tR Retentionszeit

€

v = LtR

;

Durchschnittlich linear Geschwindigkeit

€

u =LtM

tN = j • tR’ (in GC, j Kompressionskorrektorfaktor); tR’ (in LC))

tR’ reduzierte retentionszeit

tM Totzeit


Kapazitäts- / Retentionsfaktor k

Kapazitätsfaktor

€

k =tR − tMtM

=tR'

tMk zwischen 1 – 5, < 1 zu schnell ohne Trennung > 20 unerträglich langsam

€

v = u cMVM

cMVM + csVs

= u 1

1+csVs

cMVM

= u 1

1+ K Vs

VM

€

k = K Vs

VM

€

v = u 11+ k

€

LtR

=LtM

11+ k€

v = LtR

;

€

u =LtM

oder Retentionsfaktor k

Siehe R. Kellner, et al., S 526-8

Migrationsrate eines Analytes:

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Trennfaktor und Phasenverhältnis

€

α =KB

KA

€

α =kBkA

€

α =tR'( )BtR'( )A

Phasenverhältnis β

€

β =VGVS

=dc4d f

GC

€

β =VM

VSLC

Volumen der Gasphase

Volumen der Stationären Phase

Durchflussvolumen

Innendurchmesser der Kapillarsäule

Filmdicke der stationären Phase

€

VGVS

VM

dcd f

Trennfaktor α

norm

ierte

Sig

nalh

öhe h

tM

tA

tB

ZeitwA wB

B

A

€

tA'

€

tB'


Klassische Theorie

0.0

1.0

norm

ierte

Sig

nalh

öhe h

0.607

wb = 4σ

2σ0.500

0.134

0.882

4σ

wh = 2.354σ

σ

x

€

y = y0 ⋅ e−x 2

2σ 2

Idealer gaussförmiger Peak und daraus ableitbare Parameter: wb = Basisbreite, wh = Peakbreite in halber Peakhöhe, σ = Standardabweichung.

2 Abweichungsfälle:

•  Fronting •  Tailing

€

w = 2w12

= 4σ

€

σ 2 =w2

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Varianz σ2 (ein Mass für die Breite des Peaks)

Idealer gaussförmiger Peak Peakbasisbreite und Standardabweichung

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Chromatographische Trennprinzipien

Physikalische Trennverfahren basiert an kinetische oder Gleichwichts–eigenschaften von

der zu trennenden Substanzen.


Wiederholte Extraktion K = 1

27.3% K = 1 80% K = 9

1.

2.

3.

9.

K = 0.1 80%

0.4% 3.1% 10.9% 21.9% 0 10 200

10

20

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K bestimmt Elutionsreihe Mobile Phase

A + B

B

A

A B

tM tA tB

BA

Mobile Phase

Stationäre Phase

Stoffgemisch

M

€

KA =A[ ]SA[ ]M

€

KM = 0KA < KB

Einflussfaktoren


norm

ierte

Sig

nalh

öhe h

tM

tA

tB

ZeitwA wB

B

A

€

tA'

€

tB'

€

K =A[ ]stationärA[ ]mobil

€

β =VM

VS

€

k = K Vs

VM

€

k =tR − tMtM

=tR'

tM

€

α =KB

KA

€

α =kBkA

€

α =tR'( )BtR'( )A

Phasenverhältnis

Analyt / Phasen

Säulenkapazität

Retentionsfaktor

Trennfaktor

tM, tA oder t’A

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Klassische Theorie

0.0

1.0

norm

ierte

Sig

nalh

öhe h

0.607

wb = 4σ

2σ0.500

0.134

0.882

4σ

wh = 2.354σ

σ

x

€

y = y0 ⋅ e−x 2

2σ 2

wb = Basisbreite σ = Standardabweichung

€

w = 2w12

= 4σ

€

σ 2 =w2

16

Varianz σ2 (ein Mass für die Breite des Peaks)

Idealer gaussförmiger Peak


Anzahl theoretischen Böden (N)

€

N =tR2

σ 2 =16 tRw

2

Anzahl theoretischen Böden (N) definiert als:

w: die Basispeakbreite tR: die Retentionszeit σ: die Standardabweichung

der Peakbreite L: die Säulenlänge (m) H: die Bodenhöhe (mm)

€

H =L16

wtR

2

€

N = Neff ⋅k +1k

2

=tR'

σ

2

⋅k +1k

2

Effektive Bodenzahl

HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate) tR

€

N =LH

HETP

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Auflösung R – Trennleistung

€

R =tB − tAwB + wA

2

=2(tB − tA )wB + wA

wenn wB ≈ wA:

€

R =tB − tAwB

€

R =tB − tAtB

⋅N4

€

R =kB − kA1+ kB

⋅N4

€

R =α −1α

⋅

kB1+ kB

⋅N4

€

N =16 ⋅ tRw

2

€

tR = tR' + tM

k = tR'

tM

€

α = kB kA

Retentionsfaktor

Trennfaktor

Bodenzahl norm

ierte

Sig

nalh

öhe h

tM

tA

tB

ZeitwA wB

B

A

€

tA'

€

tB'

€

tR =16R2H

u⋅

αα −1

⋅1+ kB( )3

kB2


Die chromatographische Auflösung

€

R =2 ⋅ Δt

wB + wA

< 1 keine Trennung

= 1 gute Trennung aber mit wenig Überlagerung

= 2 komplette Trennung

? ×

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Zusammenfassung (1)

€

K =A[ ]SA[ ]M

€

v = LtR

€

u =LtM

€

k = K Vs

VM

€

k =tR − tMtM

=tR'

tM

€

α =KB

KA

€

α =kBkA

€

α =(tR' )B(tR' )A

€

N =LH

=tR2

σ 2 =16 tRw

2

€

tR' = tR − tM

Trennfaktor / Selektivätsfaktor

Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor

Retentionszeit / Geschwindigkeit

Verteilungskoeffizient

Auflösung

€

H =L16

wtR

2

Bodenzahl und Bodenhöhe

€

R =tB − tAwB + wA

2

=2(tB − tA )wB + wA

€

R =α −1α

⋅

kB1+ kB

⋅N4

€

tR =16R2H

u⋅

αα −1

⋅1+ kB( )3

kB2


Aufgabe 1 zur Chromatographie

Mit einer 12,5cm langen Säule wurden in der HPLC-Anlage die Stoffe Benzen und Toluen getrennt. Benzen hatte sein Peakmaximum nach 7,3min und Toluen nach 8,4min. Eine nicht retardierte Substanz hatte eine Retentionszeit von 2,1min. Die Basispeakbreite des Benzenpeaks war 0,74min, die des Toluen 0,87min. Das Volumen der stationären Phase ist mit 0,137mL und das der mobilen Phase mit 1,43mL angegeben.

1. Berechnen Sie das Phasenverhältnis in der Säule! 2. Wie groß sind die Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktoren) für beide Stoffe? 3. Wie lauten die Verteilungskoeffizienten für beide Stoffe? 4. Errechnen Sie den Trennfaktor (Selektivitätsfaktor)! 5. Wie groß ist die theoretische Bodenzahl für Toluen? 6. Berechnen Sie die Bodenhöhe für Toluen! 7. Welche Auflösung haben die Peaks? 8. Wie lang muss die Säule sein, die man für eine optimale Auflösung von 1,5 nutzen

müsste? 9. Wie lang ist die Retentionszeit des Toluen bei dieser Säulenlänge?

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Kinetische Theorie van Deemter Gleichung für Peakverbreiternde Prozesse

A: die eddy Diffusion B: die longitudinale Diffusion C: die Masstransfer zwischen den zwei Phasen u: Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase €

H = A +Bu

+ C ⋅ u

€

€

DM

€

DS

€

dD

€

df

€

td

€

dc

Diffusionskoeffizient in mobilen Phase

Diffusionskoeffizient in stationären Phase

Durchmesser der Packungsmaterialien

Filmdicke der flüssigstationären Phase

Desorptionsgeschwindigkeit des Analyts

Säuleninnendurchmesser

Säule

Analyt

MP/SP

€

H =L16

wtR

2


Eddy Diffusion

A Term: die eddy Diffusion

(diese tritt nur bei gepackten Säulen auf) €

H = A +Bu

+ C ⋅ u

Wegen Umwanderung der Molekül durch die Partikel des Packungs-materials legen die Analyten unterschiedliche Weglängen zurück.

Ausmass Homogenität

Dichte

€

A = 2 ⋅ λ ⋅ dpdp Teilchendurchmesser λ Packungsfaktor

1 2

1 2

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Longitudinale Diffusion

B Term: die longitudinale Diffusion

€

H = A +Bu

+ C ⋅ u

€

Bu

=2kDDM

uDM: Diffusionskoeffizienten in der mobilen Phase, kD: Labyrinthfaktor, constant

In GC: B Term => einen entscheidenden Beitrag zu Peakverbreiterung leistet,

insbesondere bei niedrigen u.

In der LC kann der B-Term wegen der sehr kleinen DM-Werte ignoriert werden.


Massentransfer-Effekte

C Term: die Masstransfer zwischen den zwei Phasen

€

CM ⋅ u =f (dp

2,dc2)u

DM

In der mobilen Phase In HPLC, klein DM => grosse CM

€

C ⋅ u = CS ⋅ u + CM ⋅ u

Gleichgewichtseinstellung zwischen S/M Phasen benötigt Zeit => da die mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand nicht vollständig einstellen => Zunahme der Höhe eines theoretischen Boden (HETP)

€

H = A +Bu

+ C ⋅ u

€

CS ⋅ u =qk ⋅ d f

2 ⋅ u(1+ k)2 ⋅DS

€

CS ⋅ u =2td ⋅ k ⋅ u(1+ k)2

Gleichgewichts einstellung

In flüssigstationären Phase Filmdicke df und DS

In feststationären Phase sehr klein Desorptions-geschwindigkeit td ≈0 HETP

u

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Minimum kinetischer Bodenhöhe

Minimaler H-Wert

Theo

retis

che

Bod

enhö

he H

€

H = 2λ ⋅ dp +2kD ⋅DM

u+ u ⋅

f (dp2,dc

2)DM

+q ⋅ k ⋅ d f

2

(1+ k)2DS

oder 2td ⋅ k(1+ k)2

optimale u

Minimum H

1.  Kapillarsäulen A = 0 2.  Optimale u => Minimum

der Terme B und C 3.  Dünne L-Filmdicke


Optimierung eines Chromatogramms

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Optimierungsfaktoren

•  System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität) •  Analyteneigenschaften •  Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur- und LM-Gradienten)

€

α =KB

KA

€

k = K Vs

VM €

N =LH

€

H = A +Bu

+ C ⋅ uSP und Analyten Ideal: k = 5 - 10

Analyten SP und MP Temperatur

Säulenlänge Bodenhöhe

stark beinflusst durch u, D, df und dp

€

R =α −1α

⋅

k21+ k2

⋅N4

€

tR =16RS

2Hu

⋅α

α −1

⋅1+ k2( )3

k22

Kurze Retentionszeit tR’ genügende Auflösung R

idealer Peakform (schmal wb und symmetrisch)


Einfluss der Korngrösse und der Kornoberfläche

Bei gleicher Korngrösse führt eine unregelmäßigere und porösere Kornoberfläche zu breiteren Peaks (schlechtere Auflösung)

Bei kugelförmigem Packungsmaterial geringer Porösität erhält man bei kleinerer Korngrösse eine schmalere Peaks

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Optimierung einer Chromatographie

unvollständige Auflösung

k erhöhen

N erhöhen

α erhöhen


Auflösung R vs α, k und N

€

R =α −1α

⋅

k21+ k2

⋅N4

N

α

k

R = 1.5

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Auflösung und Retentionszeit vs Retentionsfaktor

€

tR =16RS

2Hu

⋅α

α −1

⋅1+ k2( )3

k22

Retentionsfaktor k

Auflösung R

Retentionszeit tR

€

RS =α −1α

⋅

k21+ k2

⋅N4

k = 1 – 5


Peakformen

Peaksymmetrie

Überlagerung und Reinheit Auflösung Trennleistung

Tailing Fronting

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Efficient Separation in Short Time

1.  Solid stationary phase with small particle size (dp) or a thin coating (df) of a stationary liquid film

2.  Homogenous packing (λ) of the stationary phase using packing materials with a narrow size distribution

3.  A small column diameter (dc), which over time has led to columns getting increasingly narrower

4.  Large diffusion coefficients (DS) in the stationary phase and small diffusion coefficients in the mobile phase. In GC, diffusion coefficients (DM) in the mobile phase can be distinctly reduced by working at lower temperatures (T).

€

H = A +Bu

+ C ⋅ uA Low plate height reached, H(u) function proceed as smoothly as possible, since high separation rates can then be guaranteed without losing efficiency. Low Hmin value and smooth H(u) curves can be obtained by:

Since the diffusion coefficients vary with molecular size, the broadening of a peak also depends on the relative molar mass. Small molar masses favor column efficiency. The molar masses are, however, determined by the substances to be separated, so that they cannot be freely selected.


Informationsgewinns aus einem Chromatogramm

Chromatogramm einer Probe

Qualitativ Quantitativ

Strukturaufklärung Identifizierung mit bekanntem Stoff

Kalibrieren Kopplung mit IR, UV/Vis, NMR, MS

Peakzuordnung Fragmentierung

Spektrendatenbank

Retentionszeiten Retentionsindizes

selektiver Detektor

mit externem Standard mit internem Standard

Standardaddition

Mengenbestimmung

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Identifizierung Peaks im Chromatogramm Um eine bekannte Substanz im Chromatogramm wieder zu finden

Identizierung einer Verbindung über Vergleichsstoffe

Vergleichsstoffe

Probe X

A B C

  Probe mit 3 verschiedenen Vergleichsstoffe mischern

  Eine Chromatographie durchführen (3 Chromatogramm)

  Chromatographieren mit anderem Eluenten   Chromatographieren mit anderer stationärer

Phase   Chromatographieren mit anderem T-program

A+X B+X C+X Wenn Peaksübereinstimmung zwischen Probe und eine Vergleichsstoff gefunden wird, wird die Probe identifiziert


Peak-Identifizierung durch Retentionsindices

€

I =100 ⋅ (y − x)log(tPr obe / ty )log(ty / tx )

+100x

x – C-Anzahl des Gliedes mit der Retentionszeit vor der Probe

y – C-Anzahl des Gliedes mit der Retentionszeit nach der Probe

t – Retentionszeiten Log(tR) vs NC-atome

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Normierungsverfahren

Geeignet für Homologe und die ungefähre Zusammensetzung

No tR A A-% 1 0,78 374 18,79 2 1,06 8 0,40 3 1,57 1 0,05 4 1,68 34 1,71 5 1,92 128 6,43 6 2,29 98 4,93 7 2,63 46 2,31 8 2,87 246 12,36 9 3,56 36 1,81 10 4,02 840 42,21 11 4,25 1 0,05 12 6,43 164 8,24 13 7,28 14 0,70

€

Ci,% =Ai

Aii=1

n∑

⋅100 A – Peakfläche Ci,% – Konzentration Analyt i i – Analyt i


Peakhöhe oder Peakfläche?

Bei gut aufgelösten Peaks ist die Peakhöhe zur Konzentration des Analyten proportional.

Bei gut aufgelösten Peaks ist die Peakfläche zur Konzentration des Analyten proportional.

Im Gegensatz zur Peakhöhe liefert die Peakfläche auch bei unsymmetrischen Peaks genaue Ergebnisse.

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Bestimmung der Peakflächen

€

A = 12 ⋅ h ⋅ wb

€

wb

€

A = 12 ⋅ h ⋅ (w15% + w85%)

€

w15%

€

w85%

Integrieren durch Software mithilfe personaler Erfahrung


Quantitative Analyse um die Menge des identifiertes Analyts zu bestimmen

Lineares Ansprechen des Detektors auf zu erwartenden Konzentrationsbereich

für den Analyten

€

Re sponsei =Signali

Konzentration

Kalibrierung mit externer Standardlösung (identisch wie Analyt) Kalibrierung mit interner Standardlösung (sehr ähnlich wie Analyt) Kalibrierung mit interner Standardaddition (identisch wie Analyt)

Gleiches LM-Gemisch, nicht überladen, selbe Operationsbedingung wie Fliessrate, T-Program oder LM-Gradient, eindeutige Peakerfassung und keine Peaküberlagerung

€

Ax = fx ⋅ X[ ]

€

fx =Ax

X[ ]

€

X[ ] =Ax

fx

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Kalibrierung mit externem Standard

Vom zu bestimmenden Stoff (Analyt) werden bekannte, verschieden konzentrierte Lösungen, Gasmischungen, Pasten oder Feststoffmischungen hergestellt, die als Standardproben dienen. Sie werden vermessen und zur Aufstellung der Kalibrierfunktion genutzt. Der Analytgehalt der Proben wird dann unter denselben Bedingungen wie die Standards gemessen und errechnet.

€

A = A0 + f ⋅Cs tan dard

f: Steigung

A


Quantifizierung mit einem externen Standard Der externe Standard bekannter Konzentration wird gemessen: Cs, ys Die Probe unbekannter Konzentration wird gemessen: yx Berechnung des Analytgehaltes über Verhältnisgleichun: Cx

€

Cx =yxys⋅Cs

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Interner Standard – Eine Beispiel

[KS] A[KS] [IS] A[IS] A[KS]/A[IS] KS 0 0 5 293 0

“ 4 212 5 307 0.690

“ 8 443 5 310 1.429

“ 12 650 5 309 2.103

“ 16 844 5 306 2.760

Probe ? 567 5 248 2.295

N

N N

N

O

O

CH3

CH3

H3CN

N N

HN

O

O

CH3

H3C

Coffein Theophyllin

Externer Standard Interner Standard €

AAnalyt

AIntS

= b + a ⋅CAnalyt

Interner Standard, der dem Analyten meist chemisch ähnlich, aber nicht mit ihm identisch ist.

2.295

100 mg⋅L–1 Coffein in Wasser 100 mg⋅L–1 Theophyllin in Wasser Probe: Extrakt aus 1 g Teepulver in 25 ml Theophyllin (500 mg⋅L–1), 100fach verdünnen

33 mg⋅g–1 Coffein im Teepulver


Standardaddition mit internem Standard

€

AP

AP +IS

=CP

CP + CIS

€

AP +IS = AP ⋅ (1+CIS

CP

)

AP – Peakfläche der Probe AP+IS – Peakfläche der Probe und Standardzusatz CP – [C] des Analyten in der Probe CIS – [C] des Analyten aus Zusatz

€

CIS = 0,

€

AP +IS = AP

€

AP +IS = 0,

€

CpC(internStandard)

Peakfläche

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Zusammenfassung – Quantitative

Kalibrierung mit internem Standard

Kalibrierung mit externem Standard

Kalibrierung mit Standardaddition

identisch mit Analyt Analytenstandardlösung

sehr ähnlich wie Analyt Analytenstandardlösung (Viele systematische Fehler wie Verluste bei Anreicherung, Wäge- und Volumenfehler zu vermeiden)

identisch mit Analyt Analytenstandardlösung

€

AAnalyt

AIntS

= b + a ⋅CAnalyt

€

AP

AP +IS

=CP

CP + CIS

€

A = A0 + f ⋅Cs tan dard

ENDE

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Probenarten - · Analogieerklärungen zur Extraktion, Einführung der HETP als chromatographische Kenngröße